СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ КОНСТРУКЦИИ, НАЦЕЛЕННОЙ НА HER2, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61K47/50 A61P35/00 A61P1/16 C07K16/46 C07K16/30 C12N15/13 

[0001] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который будет представлен через EFS-Web и, таким образом, полностью включен в данное описание посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 31 мая 2019 г., называется ZWI063sequencelisting.txt и имеет размер 99000 байт.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Онкологическое заболевание желчных протоков (ОЗЖП), включая онкологическое заболевание желчного пузыря и холангиокарциному, является редким злокачественным новообразованием с неблагоприятным прогнозом. По оценкам, ежегодная заболеваемость в США составляет 10650 случаев (Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics, 2014. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2014; 64 (1): 9-29). Большинство ОЗЖП диагностируются на поздней стадии, и только около 25% из них операбельные. Общая 5-летняя выживаемость составляет менее чем 10% (Anderson CD, Pinson CW, Berlin J, Chari RS. Diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma. Oncologist. 2004; 9 (1): 43-57; de Groen PC, Gores GJ, LaRusso NF, Gunderson LL, Nagorney DM. Biliary Tract Cancers. N Engl J Med. 1999; 341 (18): 1368-78). HER2 сверхэкспрессируется в 3-25% случаев онкологических заболеваний желчных протоков (Benavides М, Anton A, Gallego J, Gomez MA, Jimenez-Gordo A, La Casta A, et al. Biliary tract cancers: SEOM clinical guidelines. Clinical and Translational Oncology. 2015; 17 (12): 982-7).

[0003] Варианты лечения первой линии для неоперабельных ОЗЖП включают системную химиотерапию (гемцитабин плюс цисплатин, которая улучшает общую выживаемость по сравнению с одним гемцитабином [11,7 месяца против 8,1 месяца, соответственно]). Альтернативные способы лечения первой линии включают пембролизумаб для опухолей MSI-H/dMMR, химиолучевую терапию на основе фтор пиримидина, лучевую терапию без дополнительной химиотерапии, экспериментальные препараты или оптимальную поддерживающую терапию. Отсутствуют подтверждающие доказательства в отношении химиотерапии второй линии в ОЗЖП, и рекомендуются клинические испытания (Руководство по клинической практике Национальной всеобщей онкологической сети: Гепатобилиарный рак. Версия 2.2019).

[0004] Остается потребность в лечении онкологического заболевания желчных протоков.

[0005] В международной патентной публикации №WO2015/077891 описаны биспецифические антитела к HER2, направленные против двух различных эпитопов HER2 в ECD4 и ECD2, тех же эпитопов, с которыми связываются трастузумаб и пертузумаб.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В данном документе описаны способы применения биспецифической антигенсвязывающей конструкции, нацеленной на HER2, для лечения онкологического заболевания желчных протоков. В одном из аспектов данного раскрытия предлагается способ лечения субъекта с онкологическим заболеванием желчных протоков (ОЗЖП), включающий введение субъекту эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС).

[0007] В некоторых вариантах реализации, ОЗЖП является операбельным, частично операбельным или неоперабельным.

[0008] В некоторых вариантах реализации, ОЗЖП является ОЗЖП на поздней стадии.

[0009] В некоторых вариантах реализации, ОЗЖП представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖП, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ) и с амплифицированным геном HER2.

[0010] В некоторых вариантах реализации ОЗЖП представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖП, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и с не амплифицированным геном HER2.

[0011] В некоторых вариантах реализации, ОЗЖП представляет собой онкологическое заболевание желчного пузыря.

[0012] В некоторых вариантах реализации, ОЗЖП представляет собой холангиокарциному (ССА).

[0013] В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, тяжелую цепь Н2 и легкую цепь L1, причем: а) тяжелая цепь HI содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41; b) тяжелая цепь H2 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72; и с) тяжелая цепь L1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29.

[0014] В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, тяжелую цепь Н2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и легкую цепь L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[0015] В некоторых вариантах реализации, эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 10 мг/кг раз в неделю.

[0016] В некоторых вариантах реализации, эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20 мг/кг раз в две недели.

[0017] В некоторых вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 30 мг/кг раз в три недели.

[0018] В некоторых вариантах реализации, введение биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 субъекту приводит к полному ответу (CR), частичному ответу (PR) или стабилизации заболевания (SD) у субъекта.

[0019] В некоторых вариантах реализации, степень контроля заболевания в группе субъектов, получавших биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, составляет более чем 60%, 70% или 80%.

[0020] В некоторых вариантах реализации, частота общего ответа в группе субъектов, получавших биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, составляет более 50%, 60%, 70% или 80%.

[0021] В некоторых вариантах реализации, биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят после по меньшей мере одной, двух или трех терапий первой линии.

[0022] В некоторых вариантах реализации, биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве монотерапии первой линии.

[0023] В некоторых вариантах реализации, биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве адъювантной терапии или неоадъювантной терапии.

[0024] В некоторых вариантах реализации, биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят вместе с одним или более химиотерапевтическими агентами.

[0025] В некоторых вариантах реализации, один или более химиотерапевтических агентов представляют собой гемцитабин и/или цисплатин.

[0026] В другом аспекте данного изобретения предлагается применение биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС) в приготовлении лекарственного средства для лечения онкологического заболевания желчных протоков (ОЗЖП).

[0027] В еще одном аспекте данного изобретения предлагается применение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС для лечения ОЗЖП у субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0028] На Фиг. 1 представлено изображение типовой биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 в формате Fab/scFv.

[0029] На Фиг. 2 продемонстрирована продолжительность лечения и максимальное уменьшение суммы диаметров (SOD) у субъектов, имеющих ОЗЖП и получавших v10000.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0030] В данном документе описан способ лечения онкологического заболевания желчных протоков (ОЗЖП) у субъекта, включающий введение пациенту биспецифической антигенсвязывающей конструкции, нацеленной на HER2. В некоторых вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция, нацеленная на HER2, связана с аналогом ауристатина (в данном документе она называется конъюгат антитело-лекарственное средство или КАЛС). В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция, нацеленная на HER2, может использоваться в способе лечения онкологического заболевания желчного пузыря или холангиокарциномы. В других вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция, нацеленная на HER2, при введении субъекту с ОЗЖП может приводить к уменьшению размера опухолей или поражений у субъекта. В других вариантах реализации, введение биспецифической антигенсвязывающей конструкции, нацеленной на HER2, может привести к полному ответу (CR), частичному ответу (PR) или стабилизации заболевания (SD) у субъекта, как измерено в соответствии с рекомендациями RECIST 1.1.

[0031] В данном документе также описан способ лечения ОЗЖП, включающий введение субъекту биспецифической антигенсвязывающей конструкции, нацеленной на HER2, в сочетании с одним или более химиотерапевтическими агентами.

Определения

[0032] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники.

[0033] Как используется в данном документе, термин «около» относится к приблизительно +/-10% вариации от данного значения, если не указано иное. Следует понимать, что такое изменение всегда включается в любое данное значение, предоставленное в данном документе, независимо от того, упоминается ли оно конкретно.

[0034] Использование слова в единственном числе при применении в сочетании с термином «содержащий» может означать «один», но в некоторых вариантах реализации оно также соответствует значению «один или более», «по меньшей мере один» или «один или более одного».

[0035] Используемые в данном документе термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий» и их грамматические вариации являются включающими или открытыми, и не исключают дополнительных, неперечисленных элементов и/или этапов способа. Термин «по существу состоящий из», при использовании в данном документе в связи с композицией, применением или способом, отмечает возможно присутствующие дополнительные элементы и/или этапы способа, но такие дополнения фактически не влияют на стиль, которым перечисляются композиция, способ или применяемые функции. Термин «состоящий из», при использовании в данном документе в связи с композицией, применением или способом, исключает наличие дополнительных элементов и/или этапов способа. Композиция, применение или способ, описанные в данном документе как включающие определенные элементы и/или этапы, в некоторых вариантах осуществления, также могут по существу состоять из таких элементов и/или этапов, а в других вариантах реализации состоят из таких элементов и/или этапов, независимо от конкретного упоминания в этих вариантах реализации.

[0036] Предполагается, что любой вариант реализации, обсуждаемый в данном документе, может быть реализован в отношении любого способа, применения или композиции, раскрытых в данном документе.

[0037] Признаки, структуры и/или характеристики, описанные в связи с раскрытым в данном документе варианте реализации, могут быть объединены с особенностями, признаками и/или характеристиками, описанными в связи с другим вариантом реализации, раскрытым в данном документе любым подходящим способом, для обеспечения одного или более дополнительных вариантов реализации.

[0038] Также следует понимать, что положительное перечисление признака в одном варианте реализации служит основанием для исключения признака в альтернативном варианте реализации. Например, если перечень вариаций представлен для данного варианта реализации или пункта формулы, следует понимать, что один или более вариантов могут быть удалены из этого перечня, а сокращенный перечень может образовывать альтернативный вариант реализации, независимо от того, отмечается ли конкретно такой альтернативный вариант реализации или нет.

Биспецифические антигенсвязывающие конструкции, которые связывают HER2

[0039] Биспецифические антигенсвязывающие конструкции, которые связывают HER2 (также называемые биспецифическими антигенсвязывающими конструкциями к HER2), описаны ниже.

[0040] Термин «антигенсвязывающая конструкция» относится к агенту, например, полипептиду или полипептидному комплексу, способному связываться с антигеном. В некоторых аспектах антигенсвязывающая конструкция представляет собой полипептид, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном. Антигенсвязывающая конструкция может быть мономером, димером, мультимером, белком, пептидом, или белковым или пептидным комплексом; антителом, фрагментом антитела или его антигенсвязывающим фрагментом; scFv и т.п. Антигенсвязывающая конструкция может быть полипептидной конструкцией, которая является моноспецифической, биспецифической или мультиспецифической. В некоторых аспектах антигенсвязывающая конструкция может включать, например, один или более антигенсвязывающих компонентов (например, Fab или scFv), связанных с одним или более Fc. Дополнительные примеры антигенсвязывающих конструкций описаны ниже и представлены в примерах.

[0041] Термин «биспецифический» предназначен для включения любого агента, например, антигенсвязывающей конструкции, которая имеет два антигенсвязывающих фрагмента (например, антигенсвязывающие полипептидные конструкции), каждый из которых обладает уникальной специфичностью связывания. Например, первый антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом на первом антигене, а второй антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом на втором антигене. Термин «бипаратопный», как используется в данном документе, относится к биспецифическому антителу, в котором первый антигенсвязывающий фрагмент и второй антигенсвязывающий фрагмент связываются с разными эпитопами на одном и том же антигене. Бипаратопное биспецифическое антитело может связываться с двумя эпитопами на одной и той же молекуле антигена или может связываться с эпитопами двух разных молекул антигена.

[0042] Моноспецифическая антигенсвязывающая конструкция относится к антигенсвязывающей конструкции с одной специфичностью связывания. Другими словами, оба антигенсвязывающих фрагмента связываются с одним и тем же эпитопом на одном и том же антигене. Примеры моноспецифических антигенсвязывающих конструкций включают трастузумаб и пертузумаб, которые связываются с HER2.

[0043] Антигенсвязывающая конструкция может представлять собой антитело или его антигенсвязывающую часть. В контексте данного описания термин «антитело» или «иммуноглобулин» относится к полипептиду, по существу кодируемому геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина или их фрагментами, которые специфически связывают и распознают аналит (например, антиген). Распознанные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю, а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируют на каппа или лямбда. «Класс» антитела или иммуноглобулина относится к типу константного домена или константной области, содержащейся в его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

[0044] Структурная единица типового иммуноглобулина (антитела) состоит из двух пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну «легкую» (около 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (около 50-70 кДа). N-концевой домен каждой цепи определяет вариабельную область от около 100 до 110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Термины вариабельная легкая цепь (VL) и вариабельная тяжелая цепь (VH) относятся к этим доменам легкой и тяжелой цепи соответственно. Тяжелая цепь IgG1 состоит из доменов VH, CH1, СН2 и СН3 соответственно от N до С-конца. Легкая цепь состоит из доменов VL и CL от N до С-конца. Тяжелая цепь IgG1 содержит шарнир между доменами СН1 и СН2. В некоторых вариантах реализации, иммуноглобулиновые конструкции содержат по меньшей мере один иммуноглобулиновый домен из IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, связанный с терапевтическим полипептидом. В некоторых вариантах реализации, домен иммуноглобулина, обнаруженный в антигенсвязывающей конструкции, представленной в данном документе, происходит из конструкции на основе иммуноглобулина, такой как диатело или нанотело, или происходит из нее. В некоторых вариантах реализации иммуноглобулиновые конструкции, описанные в настоящем документе, содержат по меньшей мере один иммуноглобулиновый домен из антитела, состоящего только из тяжелой цепи, такого как верблюжье антитело. В некоторых вариантах реализации, иммуноглобулиновые конструкции, представленные в данном документе, содержат по меньшей мере один иммуноглобулиновый домен из антитела млекопитающего, такого как антитело быка, антитело человека, антитело верблюда, антитело мыши или любое химерное антитело.

[0045] «Область, определяющая комплементарность» или «CDR» представляет собой аминокислотную последовательность, которая способствует антигенсвязывающей специфичности и аффинности. «Каркасные» области (FR) могут способствовать поддержанию надлежащей конформации CDR, для содействия связыванию между антигенсвязывающей областью и антигеном. Структурно каркасные области могут располагаться в антителах между CDR. Вариабельные области, как правило, демонстрируют ту же общую структуру областей относительно консервативного каркаса (FR), соединенных посредством трех гипервариабельных областей, также известных как CDR. CDR вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи обычно выравниваются по каркасным областям, которые могут обеспечивать связывание с конкретным эпитопом. От N-конца до С-конца вариабельные домены как легкой, так и тяжелой цепи обычно включают домены FR¹, CDR¹, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Назначение аминокислот для каждого домена обычно соответствует определениям Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), если не указано иное. Обычно в вариабельной части иммуноглобулина существуют три области CDR тяжелой цепи и три области CDR легкой цепи. Три CDR тяжелой цепи обозначаются в данном документе как CDRH1, CDRH2 и CDRH3, тогда как три CDR легкой цепи обозначаются как CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Таким образом, «CDR» в контексте настоящего описания могут относиться ко всем трем CDR тяжелой цепи, или ко всем трем CDR легкой цепи, (или как ко всем CDR тяжелой цепи, так и ко всем CDR легкой цепи, в случае необходимости). CDR обеспечивают большинство контактных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом. Часто для связывания антигена требуются три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен может придавать антигену специфичность связывания. Кроме того, как известно в данной области техники, в некоторых случаях связывание антигена также может происходить посредством комбинации минимум одной или более CDR, выбранных из доменов VH и/или VL, например CDRH3.

[0046] Широко используется ряд различных определений последовательностей CDR, включая те, которые описаны Kabat et al. (1983, Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 369-847, Bethesda, MD), Chothia et al. (1987, J Mol Biol, 196: 901-917), а также определения IMGT, AbM (University of Bath) и Contact (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745). В качестве примера определения CDR согласно Kabat, Chothia, IMGT, AbM и Contact представлены в таблице 1 ниже. Соответственно, как будет очевидно специалисту в данной области техники, точная нумерация и размещение CDR могут отличаться в зависимости от используемой системы нумерации. Однако следует понимать, что раскрытие в данном документе VH включает раскрытие связанных (присущих) CDR тяжелой цепи (HCDR), как определено любой из известных систем нумерации. Аналогичным образом, описание в данном документе VL включает раскрытие связанных (присущих) CDR легкой цепи (LCDR), как определено любой из известных систем нумерации.

[0047] Как используется в данном документе, термин «одноцепочечный» относится к молекуле, содержащей аминокислотные мономеры, линейно связанные пептидными связями. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций представляет собой одноцепочечную молекулу Fv (scFv). Как описано более подробно в данном документе, scFv имеет вариабельный домен легкой цепи (VL), соединенный от своего С-конца с N-концом вариабельного домена тяжелой цепи (VH) полипептидной цепью. Альтернативно, scFv может представлять собой полипептидную цепь, в которой С-концевой конец VH соединен с N-концевым концом VL полипептидной цепью.

Антигенсвязывающая полипептидная конструкция

[0048] Биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 включает две антигенсвязывающие полипептидные конструкции, каждая из которых связывается с конкретным доменом или эпитопом HER2. В одном варианте реализации, каждая конструкция антигенсвязывающего полипептида связывается с внеклеточным доменом HER2, например, ECD2 или ECD4. Конструкция антигенсвязывающего полипептида может быть, например, Fab или scFv, в зависимости от применения.

[0049] Формат биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 определяет функциональные характеристики биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2. В одном варианте реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 имеет формат scFv-Fab (т.е. одна антигенсвязывающая полипептидная конструкция представляет собой scFv, а другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция представляет собой Fab, также называемый форматом Fab-scFv). В другом варианте реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 имеет формат scFv-scFv (т.е. обе конструкции антигенсвязывающего полипептида представляют собой scFv).

[0050] «Фрагмент Fab» (также называемый как антигенсвязывающий фрагмент) содержит константный домен (CL) легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи наряду с вариабельными доменами VL и VH соответственно на легкой и тяжелой цепях. Вариабельные домены содержат определяющую комплементарность петли (CDR, также называемую гипервариабельная область), которые вовлечены в связывании антигена. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена СН1 тяжелой цепи, в том числе одного или более цистеинов из шарнирной области антитела.

[0051] Термины «одноцепочечные Fv» или «scFv» включают домены VH и VL антитела, причем эти домены находятся в одной полипептидной цепи. В одном варианте реализации, полипептидру дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, дающий возможность scFv образовываться требуемой структуре для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Фрагменты scFv антитела HER2 описаны в WO 93/16185; патенте США №5571894; и патенте США №5587458.

Формат и функция антигенсвязывающих конструкций

[0052] В данном документе представлены биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, содержащие две конструкции антигенсвязывающего полипептида, первая из которых специфически связывается с HER2 ECD2, а вторая из которых специфически связывается с HER2 ECD4. Формат биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 таков, что по меньшей мере один из первого или второго антигенсвязывающего полипептида представляет собой scFv. Формат биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 может быть scFv-scFv или Fab-scFv, или scFv-Fab (первое - антигенсвязывающая полипептидная конструкция - второе антигенсвязывающий полипептид соответственно).

[0053] В некоторых вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 проявляют противоопухолевую активность in vitro, такую как (i) способность ингибировать рост онкологических клеток как в присутствии, так и в отсутствие стимуляции эпидермальным фактором роста или херегулином, (ii) способность интернализоваться в онкологических клетках (посредством связывания с антигеном HER2 и вызывая его интернализацию) и (iii) способность опосредовать направленное антителами уничтожение эффекторных клеток (ADCC). Эти активности in vitro наблюдаются как с голой биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2, так и с биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2, конъюгированной с аналогом ауристатина, и при различных уровнях экспрессии HER2 (1+, 2+ и 3+).

[0054] Формат (scFv/scFv, scFv/Fab или Fab/Fab) биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2 важен для определения их функционального профиля, как описано в международной патентной публикации № WO 2015/077891. В некоторых вариантах реализации, связывающие конструкции к HER2, демонстрируют повышенную способность к интернализации экспрессирующими HER2 опухолевыми клетками по сравнению с контрольной антигенсвязывающей конструкцией, в которой конструкции полипептидов, связывающих ECD2 и ECD4, являются Fab. Предполагается, что степень интернализации биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2 может быть дополнительно улучшена путем увеличения сродства одной или обеих антигенсвязывающих полипептидных конструкций к ECD2 или ECD4. В одном варианте реализации, в котором ЕСD2-связывающий полипептид представляет собой Fab, а ЕСD4-связывающий полипептид представляет собой scFv, конструкция интернализуется в большей степени по сравнению с конструкциями эквивалентной аффинности, которые имеют формат Fab/Fab, и интернализуется в той же степени, что и конструкции с эквивалентной аффинностью, которые имеют формат scFv/scFv, опухолевыми клетками с высокой и низкой экспрессией HER2. Варианты реализации, которые легко интернализуются, являются хорошими кандидатами для конъюгатов антитело-лекарственное средство, которые требуют интернализации опухолевой клеткой для осуществления уничтожения. Напротив, в некоторых вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, которые не так легко интернализуются, демонстрируют повышенную эффективность в уничтожении ADCC опухолевых клеток, которые экспрессируют низкие уровни HER2, по сравнению с конструкциями с эквивалентной аффинностью, которые имеют формат Fab/Fab. В одном варианте реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, имеющая формат Fab/scFv, более эффективна в уничтожении ADCC опухолевых клеток, экспрессирующих низкие уровни HER2 (HER2 0-1+ или чем конструкция к HER2, имеющая формат Fab/Fab, которая, в свою очередь, более эффективна, чем биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, имеющая формат scFv/scFv. Повышенная активность ADCC в некоторых вариантах реализации может быть обусловлена 1) их повышенной способностью активно связывать клетки с низкой плотностью рецептора HER2 на поверхности клетки и впоследствии кластеризовать рецептор HER2 на поверхности клетки-мишени и опосредовать опосредованное клетками уничтожение; и/или 2) их повышенной способностью оставаться на поверхности клетки (а не вызывать интернализацию); следовательно, они более доступны для опосредованного клетками уничтожения эффекторов.

HER2

[0055] Описанные в данном документе биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 содержат конструкции антигенсвязывающего полипептида, которые связываются с ECD2 и ECD4 HER2.

[0056] Выражения «ErbB2» и «HER2» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (номер доступа в Genbank X03363). Термины «erbB2» и «neu» относятся к гену, кодирующему белок ErbВ2 человека, р185 или p185neu относятся к белковому продукту гена neu.

[0057] HER2 представляет собой рецептор HER. «Рецептор HER» представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу, которая принадлежит к семейству рецепторов эпидермального фактора роста человека (HER) и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4. Рецептор HER обычно включает внеклеточный домен, который может связывать лиганд HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; и карбоксильный-концевой домен передачи сигнала, содержащий несколько тирозиновых остатков, которые могут фосфорилироваться. Под «лигандом HER» подразумевается полипептид, который связывается с рецептором HER и/или активирует его.

[0058] Внеклеточный (экто) домен HER2 включает четыре домена: Домен I (ECD1, аминокислотные остатки около 1-195), Домен II (ECD2, аминокислотные остатки около 196-319), Домен III (ECD3, аминокислотные остатки около 320-488) и Домен IV (ECD4, аминокислотные остатки около 489-630) (нумерация остатков без сигнального пептида). См. Garrett et al. Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature All: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004), Tse et al. Cancer Treat Rev. 2012 Apr; 38 (2): 133-42 (2012), или Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Set. 90: 1746-1750 (1993).

[0059] Последовательность HER2 следующая; границы ECD представляют собой Домен I: 1-165; Домен II: 166-322; Домен III: 323-488; Домен IV: 489-607.

[0060] «Эпитоп 2С4» представляет собой область внеклеточного домена HER2, с которой связывается антитело 2С4. Эпитоп 2С4 содержит остатки из домена II внеклеточного домена HER2. 2С4 и пертузумаб связываются с внеклеточным доменом HER2 на стыке доменов I, II и III. Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004). Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом 2С4, может быть проведен рутинный эпитоп перекрестный конкурентный анализ, такой как описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). В качестве альтернативы можно выполнить картирование эпитопа, чтобы оценить, связывается ли антитело с эпитопом 2С4 HER2 с использованием методов, известных в данной области, и/или можно изучить структуру антитело-HER2 (Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004)), чтобы увидеть, какой домен(ы) HER2 связывается/связываются антителом.

[0061] «Эпитоп 4D5» представляет собой область внеклеточного домена HER2, с которой связываются антитело 4D5 (АТСС CRL 10463) и трастузумаб. Этот эпитоп расположен рядом с трансмембранным доменом HER2 и находится в пределах домена IV HER2. Для скрининга антител, которые связываются с эпитопом 4D5, может быть проведен рутинный эпитоп перекрестный конкурентный анализ, такой как описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). В качестве альтернативы может быть выполнено картирование эпитопа, чтобы оценить, связывается ли антитело с эпитопом 4D5 HER2 (например, с любым одним или более остатками в области от около 529 до около 625 остатка включительно, см. Фиг. 1 патентной публикации США №2006/0018899).

[0062] «Специфически связывает», «специфически связывающий» или «селективно связывающий» означает, что связывание селективно для антигена и может быть отделено от нежелательных или не специфических взаимодействий. Способность биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 связываться со специфической антигенной детерминантой может быть измерена либо с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), либо другими методами, известными специалисту в данной области техники, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (анализируется на приборе BIAcore) (Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)) и традиционными анализами связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). В одном варианте реализации, степень связывания антигенсвязывающего фрагмента с неродственным белком составляет менее около 10% связывания биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 с антигеном, как измерено, например, с помощью ППР. В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, которая связывается с антигеном, или антигенсвязывающая молекула, содержащая данный антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу диссоциации (K_D)<1 мкМ, <100 нМ, <10 нМ, <1 нМ, <0,1 нМ, <0,01 нМ или <0,001 нМ (например, 10^~8 М или менее, например, от 10^~8 М до 10¹³ М, например, от 10⁹ М до 10¹³ М).

[0063] Термин «херегулин» (HRG), при использовании в данном документе, относится к полипептиду, кодируемому продуктом гена херегулина, как раскрыто в патенте США №5641869 или Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993). Примеры херегулинов включают херегулин-α, херегулин-β2, херегулин-β2 и херегулин-β3 (Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); и патент США №5641869); фактор дифференцировки neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); активность, индуцирующий рецептор ацетилхолина (ARIA) (Falls et al. Cell 72: 801-815 (1993)); глиальный фактор роста (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)); фактор, производный от сенсорных и моторных нейронов (SMDF) (Но et al. J. Biol. Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-херегулин (Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)). Термин включает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотной последовательности полипептида HRG с нативной последовательностью, такие как его фрагмент EGF-подобного домена (например, HRGβ1 177-244).

[0064] «Активация HER» или «активация HER2» относится к активации или фосфорилированию любого одного или более рецепторов HER или рецепторов HER2. Как правило, активация HER приводит к сигнальной трансдукции (например, вызванной внутриклеточным киназным доменом рецептора HER, фосфорилирующим остатки тирозина в рецепторе HER или полипептиде-субстрате). Активация HER может быть опосредована связыванием лиганда HER с димером HER, содержащим интересующий рецептор HER. Связывание лиганда HER с димером HER может активировать киназный домен одного или более рецепторов HER в димере и, таким образом, приводить к фосфорилированию остатков тирозина в одном или более рецепторах HER и/или фосфорилированию остатков тирозина в дополнительных полипептидах-субстратах, таких как внутриклеточные киназы Akt или МАРК.

[0065] «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, грызуна) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентные антитела), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области не относящегося к человеку вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющий желаемую специфичность, сродство и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, отсутствующие в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антитела. В общем, гуманизированное антитело будет включать практически все из, по меньшей мере, одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или практически все FR являются последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации, см. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Fc биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2.

[0066] В некоторых вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, содержат Fc, например, димерный Fc.

[0067] Термин «Fc-домен» или «Fc-область» в данном документе используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой EU-индексом, описанной в работе Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Термин «полипептид Fc» димерного Fc в контексте данного документа относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный домен Fc, то есть полипептиду, содержащему С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, способные к стабильной самоассоциации. Например, полипептид Fc димерного Fc IgG содержит последовательность константных доменов СН2 IgG и СН3 IgG.

[0068] Домен Fc содержит либо домен СН3, либо домены СН3 и СН2. Домен СН3 включает две последовательности СН3, по одной от каждого из двух полипептидов Fc димерного Fc. Домен СН2 содержит две последовательности СН2, по одной из каждого из двух полипептидов Fc димерного Fc.

[0069] В некоторых аспектах Fc содержит по меньшей мере одну или две последовательности СН3. В некоторых аспектах Fc связан с помощью одного или более линкеров или без них, с первой антигенсвязывающей полипептидной конструкцией и второй антигенсвязывающей полипептидной конструкцией. В некоторых аспектах Fc представляет собой Fc человека. В некоторых аспектах Fc представляет собой IgG или Fc IgG1 человека. В некоторых аспектах Fc представляет собой гетеродимерный Fc. В некоторых аспектах Fc содержит по меньшей мере одну или две последовательности СН2.

[0070] В некоторых аспектах Fc содержит одну или более модификаций по меньшей мере в одной из последовательностей СН3. В некоторых аспектах Fc содержит одну или более модификаций по меньшей мере в одной из последовательностей СН2. В некоторых аспектах Fc представляет собой единичный полипептид. В некоторых аспектах Fc представляет собой несколько пептидов, например, два полипептида.

[0071] В некоторых аспектах Fc представляет собой Fc, описанный в патентных заявках РСТ/СА 2011/001238, поданных 4 ноября 2011 г., или РСТ/СА 2012/050780, поданных 2 ноября 2012 г., полное раскрытие каждой из которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

Модифицированные домены СН3

[0072] В некоторых аспектах описанная в данном документе биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит гетеродимерный Fc, содержащий модифицированный домен СН3, который был асимметрично модифицирован. Гетеродимерный Fc может содержать два полипептида константного домена тяжелой цепи: первый полипептид Fc и второй полипептид Fc, которые могут использоваться взаимозаменяемо при условии, что Fc включает один первый полипептид Fc и один второй полипептид Fc. Обычно первый полипептид Fc содержит первую последовательность СН3, а второй полипептид Fc содержит вторую последовательность СН3.

[0073] Две последовательности СН3, которые содержат одну или более модификаций аминокислот, введенных асимметричным образом, когда две последовательности СН3 димеризуются, обычно скорее приводят к образованию гетеродимерного Fc, чем к гомодимерного. Используемый в данном документе термин «асимметричные аминокислотные модификации» относится к любой модификации, в которой аминокислота в конкретном положении в первой последовательности СН3 отличается от аминокислоты во второй последовательности СН3 в том же положении, а первая и вторая последовательности СН3 предпочтительно спаривать с образованием гетеродимера, а не гомодимера. Эта гетер од имеризация может возникать в результате модификации только одной из двух аминокислот в том же соответствующем положении аминокислоты на каждой последовательности, или же модификации обеих аминокислот на каждой последовательности в том же соответствующем положении на каждой из первой и второй последовательностях СН3. Первая и вторая последовательность СН3 гетеродимерного Fc может содержать одну или более модификаций асимметричной аминокислоты.

[0074] В таблице 2 предложена аминокислотная последовательность из последовательности Fc IgG1 человека, соответствующая аминокислотам от 231 до 447 полноразмерной тяжелой цепи IgG1 человека. Последовательность СН3 содержит аминокислоты 341-447 полноразмерной тяжелой цепи IgG1 человека.

[0075] Как правило, Fc может содержать две непрерывные последовательности тяжелой цепи (А и В), которые способны димеризоваться. В некоторых аспектах, одна или обе последовательностей Fc, включают одну или более мутаций или модификаций в следующих местах: L351, F405, Y407, Т366, K392, Т394, Т350, S400 и/или N390 с использованием нумерации EU. В некоторых аспектах Fc включает вариантную последовательность, показанную в Таблице 2. В некоторых аспектах Fc содержит мутацию А-В Варианта 1. В некоторых аспектах Fc содержит мутацию А-В Варианта 2. В некоторых аспектах Fc содержит мутацию А-В Варианта 3. В некоторых аспектах Fc содержит мутацию А-В Варианта 4. В некоторых аспектах Fc содержит мутацию А-В Варианта 5.

[0076] Первая и вторая последовательности СН3 могут содержать аминокислотные мутации, как описано в данном документе, со ссылкой на аминокислоты с 231 по 447 тяжелой цепи полноразмерного IgG1 человека. В одном варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислоты в положении Т394. В одном варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей одну или более модификаций аминокислот, выбранных из L351Y, F405A и Y407V, и второй последовательностью СН3, содержащей одну или более модификаций аминокислот, выбранных из T366L, T366I, K392L, K392М и T394W.

[0077] В одном варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях L351, F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях Т366, K392 и Т394, и одна из первой или второй последовательностей СН3 дополнительно содержит модификации аминокислоты в положении Q347, а другая последовательность СН3 дополнительно содержит модификацию аминокислоты в положении K360. В другом варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях L351, F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях Т366, K392 и Т394, причем одна из первой или второй последовательностей СН3 дополнительно содержит модификацию аминокислоты в положении Q347, а другая последовательность СН3 дополнительно одержит модификацию аминокислоты в положении KЗ60, и одна или обе из указанных последовательностей СН3 дополнительно содержит модификацию аминокислоты T350V.

[0078] В одном варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях L351, F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях Т366, K392 и Т394, и одна из указанных первой и второй последовательностей СН3 дополнительно содержит модификацию аминокислоты D399R или D399K, а другая последовательность СН3 содержит одну или более из Т411Е, T411D, K409Е, K409D, K392Е и K392D. В другом варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях L351, F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях Т366, K392 и Т394, причем одна из указанных первой и второй последовательностей СН3 дополнительно содержит модификацию аминокислот D399R или D399K, а другая последовательность СН3 содержит одну или более из Т411E, Т411D, K409Е, K409D, K392Е и K392D, и одна или обе из указанных последовательностей СН3 дополнительно содержат модификацию аминокислоты T350V.

[0079] В одном варианте реализации гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3 с первой последовательностью СН3, содержащей модификации аминокислот в положениях L351, F405 и Y407, и второй последовательностью СН3, содержащей модификации в положениях Т366, K392 и Т394, причем одна или обе из указанных последовательностей СН3 дополнительно содержат модификацию аминокислоты T350V.

[0080] В одном варианте реализации, гетеродимерный Fc содержит модифицированный домен СН3, содержащий следующие модификации аминокислот, где «А» представляет собой модификации аминокислот первой последовательности СН3, а «В» представляет собой модификации аминокислот второй последовательности СН3: A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392М_T394W, A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392M_T394W, A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V и/или B:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W.

[0081] Одна или более модификаций асимметричной аминокислоты могут способствовать образованию гетеродимерного Fc, в котором гетеродимерный домен СН3 обладает стабильностью, сравнимой с гомодимерным доменом СН3 дикого типа. В одном варианте реализации, одна или более асимметричных модификаций аминокислот способствуют образованию гетеродимерного домена Fc, в котором гетеродимерный домен Fc обладает стабильностью, сравнимой с гомодимерным доменом Fc дикого типа. В одном варианте реализации, одна или более модификаций асимметричной аминокислоты способствуют образованию гетеродимерного домена Fc, в котором гетеродимерный домен Fc обладает стабильностью, наблюдаемой посредством температуры плавления (Tm) в исследовании дифференциальной сканирующей калориметрии, и где температура плавления находится в пределах 4°С от температуры, наблюдаемой для соответствующего симметричного гомодимерного домена Fc дикого типа. В некоторых аспектах Fc включает одну или более модификаций по меньшей мере в одной из последовательностей СН3, которые способствуют образованию гетеродимерного Fc со стабильностью, сравнимой со стабильностью гомодимерного Fc дикого типа.

Типовые биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2

[0082] В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER.2 представляет собой одно из бипаратопных антител, описанных в публикации заявки на патент США №2016/0289335 или в международной патентной публикации № WO 2015/077891. В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 представляет собой одну из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717 (см. Таблицы 3, 4, 5 и Таблицы последовательностей). В некоторых вариантах реализации одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VH и последовательность VL из ЕСD2-связывающего плеча одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER.2 содержит последовательность VH и последовательность VL из ЕСD2-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательность VH и последовательность VL из ECD4-связывающего плеча одного из антител v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717.

[0083] В некоторых вариантах реализации одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность CDR из ЕСD2-связывающего плеча одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательности CDR из ECD2-связывающего плеча одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, и другая антигенсвязывающая полипептидная конструкция содержит последовательности CDR из ЕСD4-связывающего плеча одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717.

[0084] Специалист в данной области техники поймет, что может вводиться ограниченное количество аминокислотных замен в последовательности CDR или в последовательности VH или VL известных антител без того, чтобы антитело теряло свою способность связывать свою мишень. Возможные аминокислотные замены могут быть идентифицированы компьютерным моделированием или известными в данной области методами, такими как сканирование аланином, при этом полученные варианты тестируются на активность связывания стандартными методами. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит набор CDR (т.е. CDR¹, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR¹, CDR2 и CDR3 легкой цепи), который обладает 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичностью последовательностей с набором CDR из ЕСD2-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит вариант этих последовательностей CDR, содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен среди шести CDR (т.е. CDR могут быть модифицированы путем включения до 10 аминокислотных замен, при этом может быть модифицирована любая комбинация CDR), например от 1 до 7 аминокислотных замен, от 1 до 5 аминокислотных замен, от 1 до 4 аминокислотных замен, от 1 до 3 аминокислотных замен, от 1 до 2 аминокислотных замен или 1 аминокислотная замена среди CDR, причем вариант сохраняет способность связывать ECD2. Обычно такие аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит набор CDR (т.е. CDR¹, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR¹, CDR2 и CDR3 легкой цепи), на 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичный набору CDR из ЕСD2-связывающего плеча из антитела v10000, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2.

[0085] В некоторых вариантах реализации одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VH, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VH из ECD2-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VL, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VL из ЕСD2-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2.

[0086] В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VH, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VH из ECD2-связывающего плеча из антитела v 10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VL, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VL из ЕСD2-связывающего плеча из антитела v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD2.

[0087] В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит набор CDR (т.е. CDR¹, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR¹, CDR2 и CDR3 легкой цепи), на 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичный набору CDR из ECD-4-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 или v6717, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит вариант этих последовательностей CDR, содержащий от 1 до 10 аминокислотных замен среди шести CDR (т.е. CDR могут быть модифицированы путем включения до 10 аминокислотных замен, при этом может быть модифицирована любая комбинация CDR), например от 1 до 7 аминокислотных замен, от 1 до 5 аминокислотных замен, от 1 до 4 аминокислотных замен, от 1 до 3 аминокислотных замен, от 1 до 2 аминокислотных замен или 1 аминокислотная замена среди CDR, причем вариант сохраняет способность связывать ECD4. Обычно такие аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены. Соответственно, в некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит набор CDR (т.е. CDR¹, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, и CDR¹, CDR2 и CDR3 легкой цепи), на 90% или более, 95% или более, 98% или более, 99% или более, или 100% идентичный набору CDR из ЕСD4-связывающего плеча из v 10000, причем эта антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4.

[0088] В некоторых вариантах реализации одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VH, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VH из ECD4-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v1000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VL, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VL из ЕСD4-связывающего плеча из одного из v5019, v5020, v7091, v1000, v6902, v6903 или v6717, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4.

[0089] В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VH, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VH из ECD4-связывающего плеча из одного из v10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4. В некоторых вариантах реализации, одна из антигенсвязывающих полипептидных конструкций биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 содержит последовательность VL, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичную последовательности VL из ЕСD4-связывающего плеча из антитела v 10000, причем антигенсвязывающая полипептидная конструкция сохраняет способность к связыванию ECD4.

Получение биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2

[0090] Биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США №4816567 или международной патентной публикации № WO 2015/077891.

[0091] В одном варианте реализации, предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER.2, описанную в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 (например, легкую и/или тяжелую цепи антигенсвязывающей конструкции). В дополнительном варианте реализации предложен один или более векторов (например, векторов экспрессии), содержащих такую нуклеиновую кислоту. Как известно в данной области техники, поскольку многие аминокислоты кодируются более чем одним кодоном, несколько нуклеиновых кислот могут кодировать простую полипептидную последовательность. Типовая нуклеиновая кислота представлена в данном документе для каждого полипептида биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2; однако понятно, что другие нуклеиновые кислоты могут быть использованы для получения описанной в данном документе биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2.

[0092] В некоторых вариантах реализации, нуклеиновая кислота содержится в мультицистронном векторе. В дополнительном варианте реализации, предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте реализации, клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антигенсвязывающей полипептидной конструкции, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антигенсвязывающей полипептидной конструкции, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антигенсвязывающей полипептидной конструкции. В одном варианте реализации, клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (СНО) или эмбриональной клеткой почки человека (НЕK), или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20). В одном варианте реализации предложен способ получения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, и необязательно выделение биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 из клетки-хозяина (или среды для культивирования клеток-хозяев).

[0093] Для получения рекомбинантной биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 нуклеиновую кислоту, кодирующую биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, например, как описано выше, выделяют и вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессия в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделять и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2).

[0094] Термин «в значительной степени очищенный» относится к конструкции, описанной в данном документе, или ее варианту, который может быть по существу или практически свободен от компонентов, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с белком, обнаруживаемым в его естественной среде, т.е. нативной клетке, или клетка-хозяин в случае рекомбинантно полученной биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, которая в некоторых вариантах реализации практически не содержит клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем около 30%, менее чем около 25%, менее чем около 20%, менее чем около 15%, менее чем около 10%, менее чем около 5%, менее чем около 4%, менее чем около 3%, менее чем около 2% или менее чем около 1% (по сухой массе) загрязняющего белка. Если биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 рекомбинантно продуцируется клетками-хозяевами, то в некоторых вариантах реализации белок составляет около 30%, около 25%, около 20%, около 15%, около 10%, около 5%, около 4%, около 3%, около 2% или около 1%, или менее сухой массы клеток. Если биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 рекомбинантно продуцируется клетками-хозяевами, то в некоторых вариантах реализации белок присутствует в культуральной среде в количестве около 5 г/л, около 4 г/л, около 3 г/л, около 2 г/л, около 1 г/л, около 750 мг/л, около 500 мг/л, около 250 мг/л, около 100 мг/л, около 50 мг/л, около 10 мг/л, или около 1 мг/л или менее сухой массы клеток. В некоторых вариантах реализации, термин «практически очищенный» биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, полученная способами, описанными в данном документе обладает уровнем чистоты по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, конкретно уровень чистоты составляет по меньшей мере около 75%, 80%, 85%, а конкретнее уровень чистоты составляет по меньшей мере около 90%, уровень чистоты составляет по меньшей мере около 95%, уровнем чистоты по меньшей мере около 99% или более, при определении соответствующими методами, такими как ДСН/ПААГ-анализ, ОФ-ВЭЖХ, ЭХ и капиллярный электрофорез.

[0095] Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе.

[0096] Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» или «клетка-хозяин» относится к клетке, которая включает экзогенный полинуклеотид, независимо от примененного для вставки метода, например прямое поглощение, трансдукция, f-спаривание или других методов, известных в данной области техники для создания рекомбинантных клеток-хозяев. Экзогенный полинуклеотид может сохраняться в виде неинтегрированного вектора, например плазмиды, или, альтернативно, может быть интегрирован в геном хозяина.

[0097] Как используется в данном документе, термин «эукариот» относится к организмам, принадлежащим филогенетическому домену Еucary, таким как животные (включающие, но ограничивающиеся ими, млекопитающие, насекомые, рептилии, птицы и т.д.), реснитчатые, растения (включающие, но ограничивающиеся ими, однодольные, двудольные, водоросли и т.д.), грибы, дрожжи, жгутиковые, микроспоридии, протесты и т.п.

[0098] Как используется в данном документе термин «прокариот» относится к прокариотическим организмам. Например, неэукариотический организм может принадлежать филогенетическому домену Eubacteria (включая, но ограничиваясь Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, и т.п.) или филогенетическому домену Archaea (включая, но ограничиваясь, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, такой как Haloferax volcanii и Halobacterium species NRC-1, Archaeoglobus fui gidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, и т.п.).

[0099] Например, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 может продуцироваться в бактериях, в частности когда не нужны гликозилирование и эффекторная функция Fc. Для экспрессии фрагментов биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 и полипептидов в бактериях см., например, патент США №№5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 может быть выделена из бактериальной биомассы в растворимую фракцию, а затем ее можно подвергать дальнейшей очистке.

[00100] Помимо прокариот в качестве хозяев, подходящих для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включающие штаммы грибов и дрожжей с «гуманизированными» путями гликозилирования, которые позволяют продуцировать биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gemgross, Nat. Biotech. 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24: 210-215 (2006).

[00101] Клетки-хозяев а, подходящие для экспрессии гликозилиро ванных биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2, также можно получать из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в комбинации с клетками насекомых, в частности для трансфекции клеток Spodopterafrugiperda.

[00102] Культуры растительных клеток также можно использовать в качестве хозяев. См., например, патент США №5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (где описана технология PLANTIBODIES™ для продукции антигенсвязывающих конструкций в трансгенных растениях).

[00103] В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. К другим примерам используемых линий клеток млекопитающих в качестве клеток-хозяев относятся линия клеток CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7); линия эмбриональных клеток почки человека (клетки 293 или 293, которые описаны, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (ВНK); клетки сертоли мыши (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, как описано, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); клетки MRC 5; и клетки FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки СНО DHFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); и линии миеломных клеток, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для получения антигенсвязывающих конструкций, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003).

[00104] В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, продуцируют в стабильных клетках млекопитающих способом, включающим: трансфекцию по меньшей мере одной стабильной клетки млекопитающих: нуклеиновой кислотой, кодирующей биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 в предварительно заданном соотношении; и экспрессию данной нуклеиновой кислоты в по меньшей мере одной клетке млекопитающих. В некоторых вариантах реализации, предварительно заданное соотношение нуклеиновой кислоты определяют в экспериментах по временной трансфекции для определения относительного соотношения входящих нуклеиновых кислот, которое приводит к наибольшему процентному содержанию биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 в экспрессированном продукте.

[00105] В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 продуцируется в стабильных клетках млекопитающих, где продукт экспрессии по меньшей мере одной стабильной клетки млекопитающего содержит больший процент желаемой гликозилированной биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, как по сравнению с мономерными полипептидами тяжелой или легкой цепи или другими антителами. В некоторых вариантах реализации, идентификация гликозилированной биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 осуществляется с помощью одного или обоих методов жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

[00106] Если необходимо, после экспрессии можно очищать или выделять биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2. Белки можно выделять или очищать различными способами, известными специалистам в данной области. Стандартные методы очистки включают хроматографические методы, включая ионный обмен, гидрофобное взаимодействие, аффинность, разделение по размерам или гель-фильтрацию, а также обращенно-фазовую очистку, проводимую при атмосферном давлении или при высоком давлении с использованием таких систем, как ЖХБР и ВЭЖХ. Методы очистки также включают электрофоретические, иммунологические методики, методики осаждения, диализа и хроматофокусирования. Применимы также методики ультрафильтрации и диафильтрации в сочетании с концентрированием белков. Как хорошо известно в данной области техники, множество природных белков связывают Fc и антитела, и такие белки можно использовать для очистки биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2, описанных в данном документе. Например, бактериальные белки А и G связываются с Fc-областью. Аналогичным образом бактериальный белок L связывается с Fab-областью некоторых антител. Очистка часто может быть осуществлена с помощью конкретного партнера по слиянию. Например, антитела можно очищать, используя смолу с глутатионом, если применяется GST-гибридизация, аффинную хроматографию с Ni⁺², если применяется His-тэг, или иммобилизированное антитело к flag, если применяется flag-тэг. Для получения общего руководства по подходящим методикам очистки, см., например, Protein Purification: Principles and Practice, 3^rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, включенную во всей своей полноте посредством ссылки. Степень необходимой очистки будет зависеть от применения биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2. В некоторых случаях очистка не требуется.

[00107] В некоторых вариантах реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 очищают с использованием анионообменной хроматографии, включая, но не ограничиваясь, хроматографию на колонках с Q-сефарозой, DEAE-сефарозой, poros HQ, poros DEAF, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q и DEAE, Fractogel Q и DEAE.

[00108] В конкретных вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, описанная в данном документе, очищается с использованием катионообменной хроматографии, включая, но не ограничиваясь, на колонках с SP-сефарозой, СМ-сефарозой, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Resource/Source S и CM, Fractogel S и CM, и их эквивалентах и аналогах.

[00109] Кроме того, описанные в данном документе, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 могут быть химически синтезированы с использованием методов, известных в данной области техники (например, см. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y and Hunkapiller et al., Nature, 310: 105-111 (1984)). Например, полипептид, соответствующий фрагменту полипептида, можно синтезировать с использованием синтезатора пептидов. Кроме того, при желании неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть введены в качестве замены или добавления в полипептидную последовательность. Неклассические аминокислоты включают, но не ограничиваются ими, D-изомеры обычных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, альфа-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, γ-Abu, ε-Ahx, 6-аминогексановую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутил глицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как β-метиламинокислоты, Сα-метиламинокислоты, Nα-метиламинокислоты и в целом аналоги аминокислот. Кроме того, аминокислота может быть D (правовращающей) или L (левовращающей).

Посттрансляционные модификации:

[00110] В некоторых вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, могут быть различным образом модифицированы во время или после трансляции.

[00111] Термин «модифицированный», используемый в данном документе относится к любому изменению, выполненному в данном полипептиде, такому как изменение длины полипептида, аминокислотной последовательности, химической структуры, котрансляционной модификации или посттрансляционной модификации полипептида. Термин «(модифицированный)» означает, что обсуждаемые полипептиды необязательно модифицированы, то есть полипептиды биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 могут быть модифицированы или немодифицированы.

[00112] Термин «посттрансляционно модифицированный» относится к любой модификации природной или искусственной аминокислоты, которая происходит с такой аминокислотой после ее включения в полипептидную цепь. Данный термин охватывает, только в качестве примера, котрансляционные модификации in vivo, котрансляционные модификации in vitro (такие как в бесклеточной системе трансляции), посттрансляционные модификации in vivo и посттрансляционные модификации in vitro.

[00113] В некоторых вариантах реализации, модификация представляет собой по меньшей мере одно из: гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления и связывания с молекулой антитела или биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2 или другим клеточным лигандом. В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 химически модифицирована известными методиками, включая, но не ограничиваясь ними, специфическое химическое расщепление цианобромидом, трипсином, химотрипсином, папаином, протеазой V8, NaBH₄; ацетилирование, формилирование, окисление, восстановление; и метаболический синтез в присутствии туникамицина.

[00114] Дополнительные посттрансляционные модификации биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2 включают, например, N-связанные или О-связанные углеводные цепи, процессинг N-терминальных или С-терминальных концов), присоединение химических фрагментов к аминокислотному скелету, химические модификации N-связанных или О-связанных углеводных цепей и добавление или удаление N-терминального остатка метионина в результате экспрессии прокариотической клетки. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, модифицированы выявляемой меткой, такой как ферментная, флуоресцентная, изотопная или аффинная метка, для обеспечения обнаружения и выделения данного белка. В некоторых вариантах реализации, примеры подходящих ферментативных меток включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозид азу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп, включают стрептавидинбиотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры пригодного радиоактивного вещества включают йод, углерод, серу, тритий, индий, технеций, таллий, галлий, палладий, молибден, ксенон, фтор.

[00115] В конкретных вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, присоединены к макроциклическим хелатирующим веществам, которые ассоциированы с ионами радиоактивных металлов.

[00116] В некоторых вариантах реализации, биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, модифицированы либо естественными процессами, такими как посттрансляционный процессинг, либо методами химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации, один и тот же самый тип модификации в той или иной степени может присутствовать на нескольких сайтах данного полипептида. В некоторых вариантах реализации, полипептиды из биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2, описанных в данном документе, являются разветвленными, например, в результате убиквитинирования, а в некоторых вариантах реализации являются циклическими, с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды являются результатом естественных процессов посттрансляции или получены синтетическими методами. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового компонента, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное транспортной РНК присоединение аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование. (См., например, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., Т.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, В.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)).

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (КАЛС)

[00117] Некоторые варианты реализации относятся к способу лечения ОЗЖП с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС), содержащего биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, конъюгированную с аналогом ауристатина при низком среднем соотношении лекарственного средства к антителу (DAR). «Низкое среднее значение DAR» в контексте данного описания относится к среднему значению DAR<3,9. В частности, в описанных способах используются КАЛС, содержащие биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, конъюгированную с аналогом ауристатина, имеющим среднее значение DAR около 2,5 или менее, например, от около 1,8 до 2,5. В некоторых вариантах реализации, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, включенная в КАЛС, представляет собой V10000.

[00118] В некоторых вариантах реализации, аналог ауристатина, содержащийся в КАЛС для использования в способах, описанных в данном документе, может быть аналогом ауристатина, описанным в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082. В некоторых вариантах реализации, аналог ауристатина, содержащийся в КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, представляет собой соединение общей формулы (I):

где R¹ выбран из:

[00119] В некоторых вариантах реализации, в соединениях формулы (I) R¹ представляет собой:

[00120] В некоторых вариантах реализации, в соединениях формулы (I) R¹ представляет собой:

[00121] В некоторых вариантах реализации, в соединениях Формулы (I) R¹ представляет собой:

[00122] В некоторых вариантах реализации, соединение Формулы (I) выбрано из:

[00123] Соединения общей формулы (I) могут получать по протоколам стандартного органического синтеза из коммерчески доступных исходных веществ. Примерные способы синтеза представлены в международной публикации патентной заявки № WO 2016/041082.

[00124] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, включает биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, конъюгированную с аналогом ауристатина (токсин) посредством линкера (L), в котором линкер-токсин имеет общую формулу (II):

где:

R¹ выбран из:

L представляет собой расщепляемый линкер, и

представляет собой точку присоединения линкер-токсина к биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2.

[00125] В некоторых вариантах реализации, в линкер-токсине общей формулы (II) R¹ представляет собой:

[00126] В некоторых вариантах реализации, в линкер-токсине общей формулы (II) R¹ представляет собой:

[00127] В некоторых вариантах реализации, в линкер-токсине формулы (II) R¹ представляет собой:

[00128] В некоторых вариантах реализации, в линкер-токсине общей формулы (II) L представляет собой пептид-содержащий линкер.

[00129] В некоторых вариантах реализации, в линкер-токсине общей формулы (II) L представляет собой линкер, расщепляемый протеазой.

[00130] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, включает биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, конъюгированную с аналогом ауристатина (токсином) через линкер (L), и имеет общую формулу (III):

где:

R¹ и L являются такими, как определено для общей формулы (II);

n представляет собой среднее соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) и составляет менее чем 3,9, а Аb представляет собой биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2.

[00131] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) R¹ представляет собой:

[00132] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) R¹ представляет собой:

[00133] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) R¹ представляет собой:

[00134] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) L представляет собой линкер, содержащий пептид.

[00135] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III), L представляет собой линкер, содержащий пептид.

[00136] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) значение n составляет от 0,5 до 3,8.

[00137] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) n составляет от около 1,0 до 3,8, от около 1,0 до 3,5, от около 1,0 до 3,0 или от около 1,0 до 2,5.

[00138] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) n составляет от около 1,5 до 3,8, от около 1,5 до 3,5, от около 1,5 до 3,0 или от около 1,5 до 2,5.

[00139] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) значение n составляет от около 1,8 до 2,8 или от около 1,8 до 2,5.

[00140] В некоторых вариантах реализации, в КАЛС общей формулы (III) Аb представляет собой V10000.

[00141] Подразумеваются также комбинации любого из предыдущих вариантов реализации для КАЛС общей формулы (III), и каждая комбинация образует отдельный вариант для целей данного раскрытия.

[00142] В описанных в данном документе КАЛС биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 связана линкером с аналогом ауристатина (токсин). Линкеры представляют собой бифункциональные или многофункциональные фрагменты, способные связывать одну или более молекул токсина с антителом. Бифункциональный (или моновалентный) линкер связывает одно лекарственное вещество с одним сайтом на антителе, тогда как мультифункциональный (или поливалентный) линкер связывает более одной молекулы токсина с одним сайтом на антителе. Линкеры, способные связывать одну молекулу токсина с более чем одним сайтом на антителе, также могут рассматриваться как многофункциональные.

[00143] Присоединение линкера с антителом могут выполнять различными путями, такими как посредством поверхностных лизинов на антителе, восстановительного сочетания с окисленными углеводами на антителе, или посредством цистеиновых остатков на антителе, освобожденных с помощью восстановления межцепочечных дисульфидных связей. В альтернативном варианте для обеспечения сайт-специфической конъюгации присоединение линкера к антителу могут достигать модификацией антитела таким образом, чтобы включать дополнительные цистеиновые остатки (см., например, патенты США №7521541; 8455622 и 9000130) или не встречающиеся в природе аминокислоты, которые предоставляют реакционноспособные группы прикрепления, такие как селенометионин, п-ацетилфенилаланин, формилглицин или п-азидометил-L-фенилаланин (см., например, Hofer et al., Biochemistry, 48: 12047-12057 (2009); Axup et al., PNAS, 109: 16101-16106 (2012); Wu et al., PNAS, 106: 3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25: 351-361 (2014)), чтобы обеспечить возможность сайт-специфического конъюгирования.

[00144] Линкеры включают функциональную группу, способную взаимодействовать с целевой группой или группой на антителе, и одну или более функциональных групп, способных взаимодействовать с целевой группой на токсине. Подходящие функциональные группы известны в данной области техники и включают те, которые описаны, например, в Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press).

[00145] К неограничивающим примерам функциональных групп для взаимодействия со свободными цистеинами или тиолами относятся малеимид, галогенацетамид, галогенацетил, активированные сложные эфиры, такие как сукцинимидные сложные эфиры, 4-нитрофенильные сложные эфиры, пентафторфенильные сложные эфиры, тетрафторфенильные сложные эфиры, ангидриды, хлорангидриды кислот, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. В этом контексте также полезны «самостабилизирующиеся» малеимиды, как описано в Lyon et al., Nat. Biotechnol., 32: 1059-1062 (2014).

[00146] К неограничивающим примерам функциональных групп для взаимодействия с поверхностными лизинами на антителе или свободными аминами на токсине, относятся активированные сложные эфиры, такие как N-гидроксисукцинамидные сложные эфиры (NHS), сульфо-NHS сложные эфиры, имидные сложные эфиры, такие как реагент Траута, изотиоцианаты, альдегиды и ангидриды кислот, такие как ангидрид диэтиленетриаминпентауксусной кислоты (DTPA). Другие примеры включают сукцинимидо-1,1,3,3-тетра-метилурония тетрафторборат (TSTU) и бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат (РуВОР).

[00147] Неограничивающие примеры функциональных групп, способных взаимодействовать с электрофильной группой на антителе или токсине (такой как, альдегидная или кетон-карбонильная группа), включают гидразид, оксим, амино, гидразин, тиосемикарбазон, карбоксилат гидразина и арилгидразид.

[00148] Другие линкеры включают те, которые имеют функциональную группу, позволяющую соединять два межцепочечных цистеина на антителе, такую как линкер ThioBridge™ linker (Badescu et ai., Bioconjug. Chem., 25: 1124-1136 (2014)), линкер дитиомалеимид (DTM) (Behrens et al., Mol. Pharm., 12: 3986-3998 (2015)), линкер на основе дитиоарил(ТСЕР)пиридазиндиона (Lee et al., Chem. Sci., 7: 799-802 (2016)), линкер на основе дибромпиридазиндиона (Maruani et al., Nat. Commun., 6: 6645 (2015)) и другие, известные в данной области техники.

[00149] Линкер может содержать различные линкерные компоненты. Как правило, линкер будет содержать два или более линкерных компонентов. Примерные линкерные компоненты включают функциональные группы для приведения в контакт с антителом, функциональными группами для проведения реакции с токсином, удлиняющими вставками, пептидными компонентами, саморасщепляющимися группами, самоудаляющимися группами, гидрофильными фрагментами и т.п. Различные линкерные компоненты известны в данной области техники, некоторые из них описаны ниже.

[00150] Некоторые полезные линкерные компоненты могут быть получены из различных коммерческих источников, таких как Pierce Biotechnology, Inc. (теперь Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) и Molecular Biosciences Inc. (Боулдер, Колорадо), или могут быть синтезированы в соответствии с процедурами, описанными в данной области техники (см., например, Toki et al., J. Org. Chem., 67: 1866-1872 (2002); Dubowchik, et al., Tetrahedron Letters, 38: 5257-60 (1997); Walker, M.A., J. Org. Chem., 60: 5352-5355 (1995); Frisch, et al., Bioconjugate Chem., 7: 180-186 (1996); патенты США №№6214345 и 7553816 и публикация международной патентной заявки № WO 02/088172).

[00151] Линкер, используемый в описанных в данном документе КАЛС, представляет собой расщепляемый линкер. Расщепляемый линкер обычно подвержен расщеплению во внутриклеточных условиях, например, посредством лизосомных процессов. Примеры включают линкеры, которые являются чувствительными к протеазе, чувствительными к кислоте, чувствительными к восстановлению или фотолабильными.

[00152] Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, линкеры, содержащие пептидный компонент, который содержит две или более аминокислот, и является расщепляемым внутриклеточной протеазой, такой как лизосомная протеаза или эндосомная протеаза. Пептидный компонент может включать аминокислотные остатки, которые встречаются естественным образом и/или минорные аминокислоты и/или не встречающиеся в природе аналоги аминокислот, такие как цитруллин. Пептидные компоненты могут быть сконструированы и оптимизированы для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например опухоле-ассоциированной протеазой, катепсином В, С или D, или плазминовой протеазой.

[00153] В некоторых вариантах реализации, линкер, включенный в состав КАЛС, может представлять собой дипептид-содержащий линкер, такой как линкер, содержащий валин-цитруллин (Val-Cit) или фенилаланин-лизин (Phe-Lys). Другие примеры подходящих дипептидов для включения в линкеры охватывают Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-homoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, He-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me₃Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys и Met-(D)Lys. Расщепляемые линкеры могут также включать более длинные пептидные компоненты, такие как трипептиды, тетрапептиды или пентапептиды. Примеры охватывают, но не ограничиваются ими, трипептиды Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys и (D)Ala-Phe-Lys, и тетрапептиды Gly-Phe-Leu-Gly и Ala-Leu-Ala-Leu.

[00154] Дополнительные примеры расщепляемых линкеров включают дисульфид-содержащие линкеры, такие как, например, N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPBD) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат (сульфо-SPBD). Дисульфид со держащие линкеры могут необязательно включать дополнительные группы для обеспечения стерических препятствий рядом с дисульфидной связью, чтобы улучшить внеклеточную стабильность линкера, например, включение геминальной диметильной группы. Другие подходящие линкеры включают линкеры, гидролизуемые при определенном рН или в пределах диапазона рН, такие как гидразоновые линкеры. Могут также использоваться линкеры, содержащие комбинации этих функциональных групп, например, в данной области техники известны линкеры, содержащие как гидразон, так и дисульфид.

[00155] Дополнительный пример расщепляемого линкера представляет собой линкер, содержащий β-глюкуронид, который является расщепляемым β-глюкуронидазой, ферментом, находящимся в лизосомах и промежуточной ткани опухолей (см., например, De Graaf et al., Curr. Pharm. Des., 8: 1391-1403 (2002)).

[00156] Расщепляемые линкеры необязательно могут дополнительно включать один или более дополнительных компонентов, таких как саморасщепляющиеся и само-удаляющиеся группы, удлиняющие вставки или гидрофильные фрагменты.

[00157] Саморасщепляющиеся и само-удаляющиеся группы, которые находят применение в линкерах включают, например, группы п-аминобензилоксикарбонила (РАВС) и п-аминобензильного простого эфира (РАВЕ), и метилированный этилендиамин (MED). Другие примеры саморасщепляющихся групп включают, но не ограничиваются ими, ароматические соединения, которые по электронной конфигурации являются сходными с группами РАВС или РАВЕ, такие как гетероциклические производные, например производные 2-аминоимидазол-5-метанола, описанные в патенте США №7375078. Другие примеры включают группы, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 2: 223-227 (1995)) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 55: 5867-5877 (1990)).

[00158] Удлиняющие вставки, которые могут находить применение в линкерах для КАЛС, включают, например, алкиленовые группы и удлиняющие вставки на основе алифатических кислот, дикислот, аминов или диаминов, таких как дигликолят, малонат, капроат и капроамид. Другие удлиняющие вставки включают, например, удлиняющие вставки на основе глицина, полиэтиленгликольные (ПЭГ) удлиняющие вставки и монометоксиполиэтиленгликольные (мПЭГ) удлиняющие вставки. ПЭГ и мПЭГ удлиняющие вставки также функционируют как гидрофильные фрагменты.

[00159] В некоторых вариантах реализации, линкер, содержащийся в КАЛС для применения в описанных в данном документе способах, представляет собой линкеры на основе пептидов, имеющих общую формулу (IV):

где:

Z представляет собой функциональную группу, способную взаимодействовать с целевой группой на биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2;

Str представляет собой удлиняющую вставку;

AA₁ и АА₂ каждый независимо представляет собой аминокислоту, причем AA₁-[AA₂]_m образует сайт расщепления протеазой;

X представляет собой саморасщепляющуюся группу;

D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина;

s равно 0 или 1;

m представляет собой целое число от 1 до 4, и

о равно 0, 1 или 2.

[00160] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) Z представляет собой:

[00161] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV)Str выбран из:

где:

R представляет собой Н или С1-С6 алкил;

р представляет собой целое число от 2 до 10, и

q представляет собой целое число от 1 до 10.

[00162] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV)Str представляет собой:

где р и q такие, как определено выше.

[00163] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV)Str представляет собой:

где р представляет собой целое число от 2 до 6, и

q представляет собой целое число от 2 до 8.

[00164] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV), AA₁-[AA₂]_m выбран из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, lie-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me₃Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu- Gly и Ala-Leu-Ala-Leu.

[00165] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) m равно 1 (т.е. AA₁-[AA₂]_m представляет собой дипептид).

[00166] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) AA₁-[AA₂]_m представляет собой дипептид, выбранный из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit и Trp-Cit.

[00167] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) m равно 1, 2 или 3.

[00168] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) s равно 1.

[00169] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV) о равно 0.

[00170] В некоторых вариантах реализации, в общей формуле (IV):

Z представляет собой

Str представляет собой где р является целым числом от 2 и 6, и q представляет собой целое число от 2 до 8;

m равно 1 и AA₁-[AA₂]_m является дипептидом, выбранным из Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit и Trp-Cit;

s равно 1, a

о равно 0.

[00171] В некоторых вариантах реализации, линкер, включенный в КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, имеет общую формулу (V):

где:

A-S- представляет собой точку присоединения к биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2;

Y представляет собой один или более дополнительных линкерных компонентов, или отсутствует, и

D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина.

[00172] В некоторых вариантах реализации, линкер, включенный в КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, имеет общую формулу (VI):

где:

A-S- представляет собой точку присоединения к биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2;

Y представляет собой один или более дополнительных линкерных компонентов, или отсутствует, и

D представляет собой точку присоединения к аналогу ауристатина.

[00173] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержит аналог ауристатина общей формулы (I), конъюгированный с v10000 при низком среднем DAR через линкер, имеющий общую формулу (IV), (V) или (VI).

[00174] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержит v10000, конъюгированное при низком среднем DAR с линкерным токсином общей формулы (II), в которой линкер (L) имеет общую формулу (IV), (V) или (VI).

[00175] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержит v 10000 и имеет общую формулу (III), показанную выше, в которой линкер (L) имеет общую формулу (IV), (V) или (VI).

[00176] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержит аналог ауристатина, конъюгированный с v10000 при низком среднем DAR через линкер, имеющий общую формулу (IV), (V) или (VI), в которых аналог ауристатина представляет собой Соединение 16, Соединение 17 или Соединение 18.

[00177] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержит линкер-токсин, имеющий структуру:

где A-S- представляет собой точку присоединения к биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2.

Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство

[00178] КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, могут получать одним из нескольких путей, известных в данной области техники, применяя реакции органической химии, условия и реагенты, известные специалистам в данной области техники (см., например Bioconjugate Techniques (G.T. Hermanson, 2013, Academic Press, и примеры, представленные в данном документе). Например, конъюгирования можно достигать (1) реакцией нуклеофильной группы или электрофильной группы антитела с бифункциональным линкером с образованием промежуточного соединения антитело-линкер Ab-L посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с активированным аналогом ауристатина (D), или (2) реакцией нуклеофильной группы или электрофильной группы аналога ауристатина с линкером с образованием линкер-токсина D-L посредством ковалентной связи, с последующей реакцией с нуклеофильной группой или электрофильной группой антитела.

[00179] Как описано выше, для получения КАЛС могут конъюгировать аналоги ауристатина посредством соответствующего линкера с различными группами на антителе. Например, конъюгирование может происходить через поверхностные лизины, через окисленные углеводы или через остатки цистеина, которые высвобождаются за счет восстановления одной или более межцепочечных дисульфидных связей. В альтернативном варианте антитело могут модифицировать для включения дополнительных цистеиновых остатков или не встречающихся в природе аминокислот, которые предоставляют реакционноспособные группы прикрепления, такие как селенометионин, п-ацетилфенилаланин, формилглицин или п-азидометил-L-фенилаланин. Такие модификации хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США №7521541; 8455622 и 9000130; Holer et,. al., Biochemistry, 48: 12047-12057 (2009); Axup et. al., PNAS, 109: 16101-16106 (2012); Wu et ai., PNAS, 106: 3000-3005 (2009); Zimmerman et al., Bioconj. Chem., 25: 351-361 (2014)).

[00180] В некоторых вариантах реализации, КАЛС для применения в способах, описанных в данном документе, содержат аналог ауристатина, конъюгированный через соответствующий линкер с остатками цистеина на биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, которые были высвобождены путем восстановления одной или более межцепочечных дисульфидных связей.

[00181] В описанных в данном документе КАЛС биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 конъюгирована с токсином посредством линкера при низком значении среднего соотношения лекарственное средство к антителу (DAR), конкретно среднее DAR меньше 3,9, но больше 0,5; например, в некоторых вариантах реализации, от около 1,5 до около 2,5.

[00182] В данной области техники известны различные способы получения КАЛС с низким значением среднего DAR (см., например, обзор McCombs and Owen, The AAPS Journal, 17(2): 339-351 (2015) и ссылки в нем; Boutureira & Bemardes, Chem. Rev., 115: 2174-2195 (2015)).

[00183] Например, для конъюгации с остатками цистеина может быть проведено частичное восстановление межцепочечных дисульфидных связей антитела с последующей конъюгацией с линкер-токсином. Частичное восстановление может быть достигнуто ограничением количества восстановительного агента, применяемого в реакции восстановления (см., например, Lyon et al., Methods in Enzymology, 502: 123-138 (2012) и примеры в ней, и примеры, представленные в данном документе). Подходящими восстановительными агентами являются известные в данной области техники вещества и включают, например, дитиотреитол (DTT), трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), 2-меркаптоэтанол, цистеамин и ряд водорастворимых фосфинов. В альтернативном варианте или в дополнение, могут применяться меньшие эквиваленты линкер-токсина для получения низкого значения среднего DAR.

[00184] В альтернативном варианте, могут применять сконструированное антитело, в котором один или более цистеиновых остатков, которые образуют межцепочечные дисульфидные связи, заменяют сериновым остатком, что приводит к получению меньшего количества доступных для конъюгации цистеиновых остатков (см. McDonagh et al., Protein Eng. Des. Sel. PEDS, 19 (7): 299-307). Затем сконструированное антитело может быть обработано восстанавливающим агентом и сконъюгировано с линкер-токсином.

[00185] Другой подход заключается в применении бис-тиольного линкера, который соединяет два цистеина, которые, в обычной ситуации, образуют межцепочечную дисульфидную связь. Использование бис-тиолового линкера, несущего только одну молекулу токсина, приведет к образованию КАЛС с максимальным значением DAR4 для полноразмерного антитела, если все четыре межцепочечные дисульфидные связи будут восстановлены и заменены бис-тиольным линкером. Частичное восстановление межцепочечных дисульфидных связей и/или меньшие эквиваленты линкера могут применять в сочетании с бис-тиольным линкером с целью дополнительного уменьшения DAR. В данной области техники известны различные бис-тиольные линкеры (см., например, Badescu et al., Bioconjug. Chem., 25 (6): 1124-1136 (2014); Behrens et al., Mol. Pharm., 12: 3986-3998 (2015); Lee et ai., Chem. Sci., 7: 799-802 (2016); Maruani et ai., Nat. Commun., 6: 6645 (2015)).

[00186] Подходы с цистеиновой инженерией также могут применять для создания КАЛС с низким значением среднего DAR. В таких подходах привлекают конструирование доступных для растворителя цистеинов в антителе с целью обеспечения сайт-специфической группы прикрепления для конъюгации. Для введения цистеинового остатка было выявлено ряд подходящих сайтов на структуре IgG, и они включают те, которые описаны в Junutula, et. al., J. Immunol Methods, 332 (1-2): 41-52 (2008); Junutula, et al., Nat. Biotechnol., 26 (8), 925-932 (2008), и в патенте США №9315581; 9000130; 8455622; 8507654 и 7521541.

[00187] КАЛС с низкими значениями средних DAR также могут получать путем конъюгирования лизина с использованием ограниченных количеств активированного линкер-токсина. Могут также применять селективную реакцию N-концевых аминокислот антитела. Например, N-концевой серии может быть окислен до альдегида с помощью перйодата, затем проведена реакция с линкер-токсином (см., например, Thompson, et al., Bioconjug. Chem., 26 (10): 2085-2096 (2015)). Сходным образом, N-концевые цистеиновые остатки могут селективно взаимодействовать с альдегидами с получением тиазолидонов (см., например, Bernardes, et al., Nature Protocols, 8: 2079-2089).

[00188] Дополнительные подходы включают конструирование антитела с включением одной или более не встречающихся в природе аминокислот, таких как п-ацетилфенилаланин (pAcPhe) или селеноцистеин (Sec). Кето-группа в pAcPhe может реагировать с линкер-токсином, содержащим концевой алкоксиамин или гидразид с образованием оксимной или гидразоновой связи (см., например, Axup, et al., PNAS USA, 109: 16101-16106 (2012)). Sec-содержащие антитела могут взаимодействовать с содержащими малеимид- или йодацетамид линкер-токсинами с образованием селеноэфирного конъюгата (см., например, Hofer, et al., Biochemistry, 48: 12047-12057 (2009)).

[00189] Антитела также могут конструировать так, чтобы включать пептидные маркеры, распознаваемые определенными ферментами для обеспечения фермент-катализируемой конъюгации. Например, Sortase-A (SortA) распознает последовательность LPXTG. Этот пентапептид могут вводить в N- или С-конец антитела для обеспечения SortA-опосредованного конъюгирования (см., например, публикацию патентной заявки США №2016/0136298; Kornberger and Skerra, mAbs, 6 (2): 354-366 (2014)). Трансглутаминазы также применяли для создания КАЛС DAR2 путем использования антител, которые были дегликолизированы в положении N297 (которое предоставляет Q295 для ферментативной конъюгации), или путем конструирования антител для включения «глутаминовой метки» (LLQG) (Jeger, et. al., Angew. Chem., 49: 9995-9997 (2010); Strop, et al., Chem. Biol., 20 (2): 161-167 (2013)). В другом подходе формилглициновый остаток могут вводить в антитело путем конструирования соответствующей консенсусной последовательности в антителе и коэкспрессии сконструированого антитела с формилглицин-образующим ферментом (FGE). Альдегидную функциональную группу введенного формилглицина затем можно использовать в качестве группы прикрепления для конъюгирования токсина (см., например, Drake, et al., Bioconjug. Chem., 25 (7): 1331-1341 (2014)).

[00190] Другой подход, примененный для создания КАЛС DAR2 представляет собой конъюгирование линкер-токсина с нативными углеводами, находящимися на гликолизилированных антителах. Конъюгирование с гликозилированными антителами могут обеспечивать, например, окислением перйодатом концевых углеводных остатков с образованием альдегидов, которые затем могут конъюгироваться с соответствующим линкер-токсином, или путем подходов глико-конструирования, в которых нативные углеводы модифицируют концевыми остатками сиаловых кислот, которые затем окисляют с образованием альдегидов для конъюгации с линкер-токсином (Zhou, et al., Bioconjug. Chem., 25 (3): 510-520 (2014)).

[00191] Сообщалось также о применении перекрестного связывания под действием УФ для конъюгации активных фрагментов с антителами. В этом методе используется нуклеотид-связывающий сайт (NBS) для сайт-специфической ковалентной функционализации антитела с помощью реакционноспособных тиольных фрагментов. Применяли конъюгированный вариант цистеина, индол-3-масляную кислоту (IBA), для сайт-специфического фотоперекрестного связывания реакционноспособного тиольного фрагмента с антителом в NBS. Затем тиольный фрагмент могут использовать для конъюгирования линкер-токсина, содержащего тиольную реакционноспособную группу (Alves, et. al., Bioconjug. Chem., 25 (7): 1198-1202 (2014)).

[00192] Альтернативно, КАЛС с низким средним значением DAR могут быть выделены из препарата КАЛС, содержащего смесь типов DAR, с использованием методов хроматографического разделения, таких как хроматография гидрофобного взаимодействия (см., например, Hamblett, et al., Clin. Cancer Res., 10: 7063-7070 (2004); Sun, et. al., Bioconj Chem., 28: 1371-81 (2017); публикация патентной заявки США №2014/0286968).

[00193] КАЛС с низким средним значением DAR также могут быть созданы путем добавления неконъюгированного (т.е. DAR0) антитела к препаратам КАЛС, имеющим среднее значение DAR>3,9. Как известно в данной области техники, большинство способов конъюгирования приводит к КАЛС, который включает различные типы DAR, при этом указанное DAR является средним значением по отдельным типам DAR. В некоторых вариантах реализации, КАЛС, которые, которые содержат некоторую долю типов DAR0, могут обладать преимуществом. В некоторых вариантах реализации, КАЛС для использования в способах, описанных в данном документе, со средним DAR менее 3,9 включает по меньшей мере 5% типов DAR0. В некоторых вариантах реализации, КАЛС для использования в способах, описанных в данном документе, включает по меньшей мере 10% типов DAR0, например, по меньшей мере 15% типов DAR0 или по меньшей мере 20% типов DAR0. В некоторых вариантах реализации, КАЛС для использования в способах, описанных в данном документе, включает от около 5% до около 50% типов DAR0, например, от около 10% до около 50% типов DAR0, от около 10% до около 40%, или от около 10% до около 30% типов DAR0.

[00194] Среднее DAR для КАЛС могут определять стандартными методиками, такими как УФ/ВС спектроскопический анализ, методики на основе ИФА, хроматографические методики, такие как хроматография гидрофобных взаимодействий (ХГВ), масс-спектрометрия (МС) UV-MALDI и МС MALDI-TOF. Кроме того, распределение форм со связанными лекарственными веществами (например, фракция типов DAR0, DAR1, DAR2 и т.д.) также могут анализировать различными методиками, известными в данной области техники, включая МС (в сопровождении стадии хроматографического разделения или без нее), хроматографию гидрофобных взаимодействий, обращенно-фазовую ВЭЖХ или гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (IEF) (см., например, Sun et. al., Bioconj Chem., 28: 1371-81 (2017); Wakankar et al., mAbs, 3: 161-172 (2011)).

[00195] В некоторых вариантах реализации, среднее DAR КАЛС определяют методиками хроматографии гидрофобных взаимодействий (ХГВ).

[00196] После конъюгирования КАЛС могут быть очищены и отделены от неконъюгированных реагентов и/или любых агрегатов конъюгатов способами очистки, известными в данной области техники. Такие методы включают, помимо прочего, эксклюзионную хроматографию по размеру (ЭХ), хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ), ионообменную хроматографию, хроматофокусирование, ультрафильтрацию, центробежную ультрафильтрацию и их комбинации.

Фармацевтические композиции

[00197] В данном документе также предложены фармацевтические композиции, содержащие описанную в данном документе биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2. Фармацевтические композиции содержат биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 и фармацевтически приемлемый носитель.

[00198] Термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобренный регуляторным ведомством Федерального правительства или правительством штата, или приведенный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения для животных, а более конкретно для человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или носителю, с которыми вводится данное терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая нефтяные масла, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В некоторых аспектах носитель может быть искусственным носителем, не обнаруженным в природе. Когда фармацевтическую композицию используют внутривенно, в качестве носителя может использоваться вода. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерин, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если желательно, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для поддержания рН. Данные композиции могут находиться в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими агентами и носителями, такими как триглицериды. Композиции для перорального применения, могут содержать стандартные носители, такие как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтической степени чистоты и т.д. Примеры подходящих носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для правильного введения пациенту. Композиция должна соответствовать способу введения.

[00199] В некоторых вариантах реализации, композиция, содержащая биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2, составляется в соответствии с обычными процедурами как фармацевтическая композиция, приспособленная для внутривенного введения человеку. Обычно композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Когда существуют необходимости, композиция может также содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты в единичную дозированную форму вводятся по отдельности или смешанными вместе, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества действующего вещества. Когда предполагается введение композиции путем инфузии, ее можно наливать в бутылку для инфузий, содержащую воду или солевой раствор фармацевтического качества. Когда композицию вводят путем инъекции, то может прилагаться ампула стерильной воды для инъекций или солевой раствор, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

[00200] В некоторых вариантах реализации, описанные в данном документе композиции составлены в виде нейтральных веществ или в форме солей. Фармацевтически приемлемые соли включают сформированные такими анионами, как образованные из хлористоводородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, виннокислой кислот и т.п., и сформированные такими катионами, как образованные из натрия, калия, аммония, кальция, изопропиламина гидрооксида железа, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.

Способы лечения онкологического заболевания желчных протоков (ОЗЖП)

[00201] В данном документе описаны способы лечения онкологического заболевания желчных протоков (ОЗЖП), включающие введение субъекту, имеющему ОЗЖП, биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС, как описано в данном документе, в количестве, эффективном для лечения, предотвращения или облегчения этого заболевания или расстройства. В конкретных вариантах реализации способов, описанных в данном документе, биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 представляет собой v 10000. В других конкретных вариантах реализации способов, описанных в данном документе, КАЛС v10000 связан с аналогом ауристатина.

[00202] «Расстройство» или «заболевание» относится к любому состоянию, при котором будет полезно лечение биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2 или способом, описанным в данном документе. Оно включает хронические и острые расстройства или заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому заболеванию. В вариантах реализации, описанных в данном документе, расстройство или заболевание представляет собой онкологическое заболевание желчных протоков, более подробно описанное ниже.

[00203] Термин «субъект» или «пациент» относится к животному, в некоторых вариантах реализации, млекопитающему, которое представляет собой объект лечения, наблюдения или эксперимента. Животное может быть человеком, не являющимся человеком приматом, домашним животным (например, собаки, кошки и т.п.), сельскохозяйственным животным (например, коровы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторным животным (например, крысы, мыши, морские свинки и т.п.).

[00204] Термин «млекопитающее», используемый в данном документе включает, но не ограничивается людьми, не являющимися человеком приматами, собаками, кошками, мышами, крупным рогатым скотом, лошадьми и свиньями.

[00205] Термин «лечение», как он используется в данном документе относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное течение чего либо у индивидуума или клетки, подвергаемых лечению, и может проводиться в случае клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но не ограничиваются ими, предотвращение рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или паллиативное улучшение болезненного состояния, и ремиссия или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС могут использоваться для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС могут использоваться для задержки развития ОЗЖП. В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, КАЛС и способы, описанные в данном документе, могут влиять на ингибирование роста опухоли/ОЗЖП. В другом варианте реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для замедления прогрессирования ОЗЖП.

[00206] Термин «эффективное количество», как он используется в данном документе, относится к тому количеству вводимой биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, которое будет достигать цели изложенного способа, например, облегчать до некоторой степени один или более симптомов заболевания, состояния или расстройства, которое лечат. Количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, которое будет эффективным при лечении или ингибировании заболевания или нарушения, можно определить стандартными клиническими методами. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, чтобы помочь определить оптимальные диапазоны доз. Точная доза, которую следует использовать в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности ОЗЖП и должна определяться в соответствии с суждением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-ответ, полученных из in vitro тест-систем или на моделях животных.

[00207] Термины «терапия первой линии», «лечение первой линии» или «первичная терапия», как они используются в данном документе, представляет собой схему лечения, которая обычно принимается в качестве начального лечения пациента, принимая во внимание тип и стадию онкологического заболевания. Термин «терапия второй линии» или «лечение второй линии» означает схему лечения, которую обычно применяют, если терапия первой линии не обеспечивает желаемой эффективности.

[00208] Термин «неоадъювантная терапия», как он используется в данном документе, относится к лечению, проводимому в качестве первой стадии для уменьшения опухоли перед основным лечением, обычно хирургическим. Примеры неоадъювантной терапии включают, помимо прочего, химиотерапию, лучевую терапию и гормональную терапию. Неоадъювантную терапию можно рассматривать как терапию первой линии.

[00209] Термин «адъювантная терапия», как он используется в данном документе, относится к дополнительному лечению онкологического заболевания, проводимому после лечения первой линии для снижения риска рецидива онкологического заболевания. Адъювантная терапия может включать, помимо прочего, химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, таргетную терапию (обычно низкомолекулярные лекарственные средства или антитела, которые нацелены на определенные типы онкологических клеток, а не нормальных клеток) или биологическую терапию (например, вакцины, цитокины, антитела или генная терапия, например).

[00210] Термин «онкологическое заболевание на поздней стадии», как он используется в данном документе, представляет собой онкологическое заболевание, которое развилось до такой степени, что его невозможно безопасно удалить или при котором излечение или длительная ремиссия крайне маловероятны. Онкологическое заболевание прогрессирует из-за того, что оно растет рядом со структурами, препятствующими его удалению, или распространяется от того места, где оно возникло, пересекая линии тканей или в другие части тела, такие как лимфатические узлы или другие органы. Онкологические заболевания на поздней стадии могут быть локально распространенными, что означает, что они распространились за пределы органа первичного очага, но еще не распространились на вторичные участки. Онкологические заболевания на поздней стадии также могут быть метастатическими, что означает, что раковые клетки распространились из того места, где началось онкологическое заболевание (первичный очаг), в другие более отдаленные части тела (вторичные участки).

[00211] Термин «операбельное онкологическое заболевание», как он используется в данном документе, это онкологическое заболевание, которое можно лечить хирургическим путем. Термин «неоперабельное онкологическое заболевание», как он используется в данном документе, это онкологическое заболевание, которое нельзя лечить хирургическим путем обычно потому, что онкологическое заболевание распространилось на ткани, окружающие основную опухоль. Некоторые виды онкологического заболевания могут быть оценены практикующим врачом как «частично операбельные» в зависимости от степени распространения на окружающие ткани.

[00212] Биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться субъекту известными способами. Известны различные системы доставки, которые могут использоваться для введения состава биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, описанного в данном документе, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретро вирусного или другого вектора и т.д. Способы введения включают, но не ограничиваются ими, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 или КАЛС можно вводить любым удобным путем, например, инфузией или болюсной инъекцией, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой и кишки и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, в некоторых вариантах реализации может быть желательно ввести описанные в данном документе биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая внутрижелудочковые и интратекальные инъекции; внутрижелудочковой инъекции может способствовать внутрижелудочковый катетер, например, прикрепленный к резервуару, такому как резервуар Ommaya. Также можно использовать легочное введение, например, с помощью ингалятора или распылителя, а также состава с аэрозольным агентом. В конкретных вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться внутривенно (в/в).

[00213] В конкретном варианте реализации может быть желательным введение биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2 или КАЛС, описанных в данном документе, локально в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, не ограничиваясь, местной инфузией во время операции, местного применения, например, в сочетании с повязкой на рану после операции, путем инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория, или посредством имплантата, при этом указанный имплант представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая мембраны, такие как сиалластические мембраны или волокна. Предпочтительно, при введении белка, такого как биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, необходимо соблюдать осторожность при использовании материалов, в которых этот белок не абсорбируется.

[00214] В другом варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER.2 или КАЛС могут быть доставлены в везикуле, в частности в липосоме (см. Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; см. в целом там же).

[00215] В еще одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС могут быть доставлены в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте реализации может использоваться насос (см. Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). В другом варианте реализации можно использовать полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); см. также Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). В еще одном варианте реализации система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, что требует лишь части системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

[00216] Биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС можно вводить отдельно или в сочетании с другими видами лечения (например, лучевой терапией, химиотерапией, гормональной терапией, иммунотерапией и противоопухолевыми средствами). Как правило, предпочтительным является введение продуктов видового происхождения или видовой реактивности (в случае антител) того же вида, что и у пациента. Таким образом, в одном варианте реализации человеческие или гуманизированные биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, производные фрагментов, аналоги или нуклеиновые кислоты вводят пациенту-человеку для терапии или профилактики.

[00217] Онкологические заболевания желчных протоков (ОЗЖП, также называемые «желчными онкологическими заболеваниями») включают онкологическое заболевание желчного пузыря, ампулярную карциному, холангиокарциному и аденокарциному пузырного протока. Холангиокарциному (ССА) также можно классифицировать как внутрипеченочную или внепеченочную ССА. В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС могут использоваться в способе лечения ОЗЖП. В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС, описанные в данном документе, могут использоваться в способе лечения неоперабельного ОЗЖП на поздней стадии. В других вариантах реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС, описанные в данном документе, могут использоваться в способе лечения онкологического заболевания желчного пузыря, ампулярной карциномы, холангиокарциномы или аденокарциномы пузырного протока. В других вариантах реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС, описанные в данном документе, могут использоваться в способе лечения внутрипеченочной ССА или внепеченочной ССА.

[00218] В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС могут использоваться для лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, который демонстрирует экспрессию, амплификацию или активацию HER2. ОЗЖП, которое «демонстрирует экспрессию, амплификацию или активацию HER2», представляет собой ОЗЖП, которое в диагностическом тесте экспрессирует (включая сверхэкспрессию) рецептор HER2, имеет амплифицированный ген HER2 и/или иным образом демонстрирует активацию или фосфорилирование рецептора HER2.

[00219] ОЗЖП, которое «демонстрирует активацию HER2», представляет собой ОЗЖП, которое в диагностическом тесте демонстрирует активацию или фосфорилирование рецептора HER2. Такую активацию можно определить напрямую (например, путем измерения фосфорилирования HER2 с помощью ИФА) или косвенно (например, путем определения профиля экспрессии генов). В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС можно использовать для лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, которое демонстрирует экспрессию HER2.

[00220] ОЗЖП с «сверхэкспрессией или амплификацией рецептора HER2» представляет собой ОЗЖП, которое имеет значительно более высокие уровни белка или гена рецептора HER2 по сравнению с доброкачественной клеткой того же типа ткани. Такая сверхэкспрессия может быть вызвана амплификацией гена или повышенной транскрипцией или трансляцией. Сверхэкспрессию или амплификацию рецептора HER2 можно определить в диагностическом или прогностическом анализе путем оценки повышенных уровней белка HER2, присутствующего на поверхности клетки (например, с помощью иммуногистохимического анализа; ИГХ). В одном варианте реализации сверхэкспрессия HER2 может быть проанализирована с помощью ИГХ, например, с использованием HERCEPTEST® (Dako). Залитые в парафин срезы ткани из биопсии опухоли могут быть подвергнуты анализу ИГХ и соответствуют следующим критериям интенсивности окрашивания белка HER2:

Оценка 0: окрашивание не наблюдается или окрашивание мембран наблюдается менее чем в 10% опухолевых клеток.

Оценка 1+: слабое/едва заметное окрашивание мембран обнаруживается более чем в 10% опухолевых клеток. Клетки окрашиваются только в части своей мембраны.

Оценка 2+: полное окрашивание мембраны от слабого до умеренного наблюдается более чем в 10% опухолевых клеток.

Оценка 3+: полное окрашивание мембраны от умеренного до сильного наблюдается более чем в 10% опухолевых клеток.

[00221] Те опухоли с оценкой 0 или 1+ для оценки сверхэкспрессии HER2 могут быть охарактеризованы как не сверхэкспрессирующие HER2, тогда как опухоли с оценками 2+ или 3+ могут быть охарактеризованы как сверхэкспрессирующие HER2. В одном варианте реализации биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 или КАЛС можно использовать для лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, которое демонстрирует сверхэкспрессию и/или амплификацию HER2.

[00222] Альтернативно или дополнительно, можно измерить уровни HER2-кодирующей нуклеиновой кислоты в клетке, например, посредством гибридизации in situ (ISH), включая флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH; см. WО 98/45479, опубликованную в октябре 1998 г.) и хромогенную гибридизацию in situ (CISH; см., например, Tanner et al., Am. J. Pathol. 157 (5): 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26: (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)), саузерн-блоттинг, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как количественная ПЦР в реальном времени (кРВ-ПЦР) или секвенирование следующего поколения (NGS). Об оценке амплификации гена HER2 с помощью этих методов обычно сообщают как о положительной (+) или отрицательной (-), например, FISH+ для онкологических заболеваний, амплифицирующих ген HER2, или FISH-для онкологических заболеваний, не амплифицирующих ген HER2. Об оценке амплификации гена HER2 с помощью NGS можно также сообщить относительно количества копий гена HER2. В нормальных клетках имеется две копии гена HER2. Соответственно, онкологическое заболевание можно рассматривать как онкологическое заболевание амплифицирующее ген HER2, если он имеет более двух копий гена HER2.

[00223] В данном документе описаны способы лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, который демонстрирует экспрессию, амплификацию или активацию HER2, включающие введение субъекту эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, амплифицирующее ген HER2 3+. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения ОЗЖП, амплифицирующего ген HER2 2+. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения ОЗЖП, амплифицирующего ген HER2 1+. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения ОЗЖП, оцениваемого как HER2 3+, без амплификации гена HER2. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения ОЗЖП, оцениваемого как HER2 2+, без амплификации гена HER2. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться для лечения ОЗЖП, оцениваемого как HER2 1+, без амплификации гена HER2.

[00224] В некоторых вариантах реализации изобретения субъект, которого лечат, может не иметь предварительного лечения от ОЗЖП, и биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС вводится в качестве лечения первой линии. В некоторых вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может использоваться в качестве адъювантной или неоадъювантной терапии для лечения субъектов, страдающих операбельным или частично операбельным онкологическим заболеванием. В других вариантах реализации субъект, которого лечат, мог пройти один или более предшествующих курсов лечения ОЗЖП, и биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС вводится в качестве лечения второй линии. Один или более предшествующих методов лечения ОЗЖП могут включать лечение, выбранное из системной химиотерапии, такой как только гемцитабин или химиотерапевтическое лекарственное средство на основе платины, химиотерапии на основе фторпиримидина, лучевой терапии без дополнительной химиотерапии, антитела (включая, но не ограничиваясь ими, нацеленные антитела к HER2) и исследуемых агентов (т.е. тех, которые в настоящее время проходят клинические испытания, но еще не одобрены FDA). Химиотерапевтические агенты на основе платины могут включать цисплатин или оксалиплатин. В одном варианте реализации системная химиотерапия включает гемцитабин с цисплатином или гемцитабин с оксалиплатином.

[00225] Примеры эффективных количеств биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС, которые можно вводить субъекту с ОЗЖП, могут составлять от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела субъекта. В некоторых вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС вводится в дозировке 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг массы тела.

[00226] В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 вводится раз в неделю, раз в две недели (Q2W), раз в три недели (Q3W) или раз в 4 недели (Q4W). Примеры эффективных количеств для введения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 раз в неделю находятся в диапазоне от около 1 мг/кг до около 30 мг/кг. Примеры эффективных количеств для введения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 раз в две недели находятся в диапазоне от около 10 мг/кг до около 50 мг/кг. Примеры эффективных количеств для введения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 раз в три недели находятся в диапазоне от около 15 мг/кг до около 50 мг/кг. Примеры эффективных количеств для введения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 раз в четыре недели находятся в диапазоне от около 40 мг/кг до около 70 мг/кг.

[00227] В некоторых вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 5, 10 или 15 мг/кг в неделю. В некоторых вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 10 мг/кг в неделю. В некоторых вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20, 25 или 30 мг/кг раз в две недели. В других вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20 мг/кг раз в две недели. В альтернативных вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20 мг/кг раз в три недели. В других вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 30 мг/кг раз в три недели. В дополнительных вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 40 мг/кг раз в четыре недели. В некоторых вариантах реализации эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет начальную дозу 20, 25 или 30 мг/кг с последующей более низкой дозой биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2.

[00228] Как известно в данной области техники, КАЛС можно вводить субъектам в дозах, которые ниже, чем дозы, используемые для биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2. В некоторых вариантах реализации КАЛС, описанный в данном документе (т.е. биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2, связанная с аналогом ауристатина), вводят раз в неделю, раз в две недели (Q2W), раз в три недели (Q3W) или раз в 4 недели (Q4W). В некоторых вариантах реализации эффективное количество КАЛС, которое можно вводить субъекту с ОЗЖП, составляет от около 1 до около 15 мг/кг раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели.

[00229] Как указано выше, в конкретных вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться внутривенно. В одном варианте реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 может вводиться путем внутривенной инфузии в 0,9% физиологическом растворе в течение 120-150 минут. В одном варианте реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 может вводиться путем внутривенной инфузии в 0,9% физиологическом растворе в течение 90 минут. В одном варианте реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 может вводиться путем внутривенной инфузии в 0,9% физиологическом растворе в течение 60 минут. В связанных вариантах реализации скорость инфузии не может превышать 250 мл физиологического раствора в час.

[00230] В данном документе также предложены способы лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, включающие введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС в сочетании с дополнительными противоопухолевыми методами лечения. Дополнительные противоопухолевые методы лечения могут быть выбраны из одного или более видов лечения ОЗЖП, включая системную химиотерапию, такую как гемцитабин отдельно или с химиотерапевтическим лекарственным средством на основе платины, химиолучевую терапию на основе фтор пиримидина, лучевую терапию без дополнительной химиотерапии и исследуемые агенты (т.е. те, которые в настоящее время проходят клинические испытания, но которые еще не были одобрены FDA). В одном варианте реализации способ лечения субъекта, имеющего ОЗЖП, включает введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС в сочетании с гемцитабином и цисплатином или в сочетании с гемцитабином и оксалиплатином. В одном варианте реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться вместе с фторпиримидиновым лекарственным средством и лекарственным средством на основе платины. Примеры фторпиримидиновых лекарственных средств включают, но не ограничиваются ими, фторурацил (5-FU), капецитабин или гемцитабин. Примеры лекарственных средств на основе платины включают, но не ограничиваются ими, цисплатин или оксалиплатин. В других вариантах реализации биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться вместе с 5-FU, оксалиплатином и лейковорином. В других вариантах реализации, где субъект имеет ОЗЖП, который представляет собой MSI-H/dMMR (высокие уровни нестабильности микросателлитов/недостаточное восстановление несоответствия), биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС может вводиться в сочетании с ингибитором иммунной контрольной точки, такие как антитело к PD1 пембролизумаб (Keytruda™) или антитело к PD-L1 атезолизумаб (TECENTRIQ®).

[00231] Дополнительные противоопухолевые методы лечения ОЗЖП известны в данной области техники, как описано в Таблице 2 Simile et al. (2019) Medicina 55: 42. Специалист в данной области техники сможет определить, какое из этих методов лечения можно вводить в сочетании с биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2 или КАЛС, описанными в данном документе.

[00232] Дополнительные противоопухолевые методы лечения, описанные в предыдущих параграфах, можно вводить одновременно с биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2 или КАЛС, или их можно вводить последовательно.

[00233] В некоторых вариантах реализации изобретения, результатом введения эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 субъекту, имеющему ОЗЖП, является уменьшение поражения (поражений), ингибирование роста очагов поражения, увеличение времени до прогрессирование поражения, продление безрецидивной выживаемости субъекта, уменьшение метастаз, увеличение выживаемости без прогрессирования субъекта, или увеличение общей выживаемости субъекта, или увеличение общей выживаемости группы субъектов, получающих лечение. В родственных вариантах реализации изобретения результатом введения субъекту эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 является частичный ответ (PR) или стабилизация заболевания (SD) у субъекта, как измерено с помощью пересмотренными критериями оценки ответа в Руководстве по солидным опухолям (RECIST) (версия 1.1) [Eur J Са 45: 228-247, 2009]. У субъектов, страдающих метастатическим заболеванием и либо CR, либо PR, также может быть измерена продолжительность ответа.

[00234] Используемый в данном документе термин «прогрессирующее заболевание» (PD) относится к появлению одного или более новых поражений и/или однозначному прогрессированию существующих нецелевых поражений. Диагноз PD может быть объявлен на основании «однозначного прогрессирования» в случаях, когда общая опухолевая нагрузка увеличивается настолько значительно, что требуется изменение терапии; в большинстве случаев умеренного увеличения размера одного или более нецелевых очагов недостаточно для квалификации (особенно при наличии SD или PR при целевом заболевании).

[00235] Термин «частичный ответ» (PR), как он используется в данном документе, относится к уменьшению суммы диаметров целевых поражений (включая короткие оси любых целевых лимфатических узлов) по меньшей мере на 30%, принимая в качестве ссылки базовый суммарный диаметр.

[00236] Термин «полный ответ» (CR), как он используется в данном документе, относится к исчезновению всех нецелевых поражений, нормализации уровня опухолевых маркеров (если опухолевые маркеры измерены и изначально превышают верхний предел нормы, они должны нормализоваться, чтобы у пациента был полный клинический ответ). Все лимфатические узлы должны быть <10 мм (короткая ось).

[00237] Термин «стабильное заболевание» (SD), как он используется в данном документе, не относится ни к достаточному уменьшению размера, чтобы квалифицировать PR, ни к достаточному увеличению, чтобы квалифицировать PD, принимая в качестве эталона наименьший суммарный диаметр с момента начала лечения.

[00238] Термин «частота объективного ответа» (ЧОО), как он используется в данном документе, представляет собой долю всех рандомизированных пациентов, которые получали любое количество исследуемого лекарства с PR или CR в соответствии с RECIST v 1.1 с начала лечения до прогрессирования заболевания/рецидив (принимая в качестве эталона для PD самые маленькие измерения, зарегистрированные с момента начала лечения).

[00239] Термин «общая выживаемость» (OS), как он используется в данном документе, относится ко времени от даты рандомизации до даты смерти от любой причины.

[00240] Термин «выживаемость без прогрессирования» (PFS), как он используется в данном документе, относится к пациенту, остающемуся живым без прогрессирования или ухудшения онкологического заболевания. В одном варианте реализации PFS определяется как время от рандомизации в исследовании до первой рентгенологической документации объективного прогрессирования, как определено RECIST (версия 1.1), или смерти по любой причине. Пациенты, которые умирают без предшествующего прогрессирования, будут считаться прогрессивными в день их смерти. Пациенты, у которых не было прогресса или которые были потеряны для последующего наблюдения, будут подвергнуты цензуре в день их последней радиографической оценки опухоли.

[00241] Термин «выживаемость без болезни» (DFS), как он используется в данном документе, относится к промежутку времени после окончания первичного лечения онкологического заболевания, в течение которого пациент выживает без каких-либо признаков или симптомов этого онкологического заболевания. DFS также может называться «безрецидивной выживаемостью» (RFS).

[00242] Термин «время до прогрессирования» (ТТР), как он используется в данном документе, относится к промежутку времени от даты постановки диагноза или начала лечения онкологического заболевания до того момента, пока онкологическое заболевание не начнет ухудшаться или распространяться на другие части тела.

[00243] Термин «скорость контроля заболевания» (DCR), как он используется в данном документе, относится к отсутствию прогрессирования заболевания и его скорости. Он относится к группе пациентов с лучшим общим ответом, классифицированным как CR, PR или SD (в частности, за исключением пациентов с PD), где лучший общий ответ представляет собой лучший ответ, зарегистрированный от начала лечения до PD.

[00244] Термин «продолжительность общего ответа» (DOR), как он используется в данном документе, относится к периоду, измеренному с момента, когда критерии измерения выполнены для полного или частичного ответа (в зависимости от того, какой статус записан первым) до первой даты, которая повторяется или прогрессирующее заболевание объективно документируется с использованием минимальных измерений, зарегистрированных с момента начала лечения.

[00245] В некоторых вариантах реализации изобретения результатом введения эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъекту, имеющему ОЗЖП, является повышение скорости контроля заболевания (DCR) в группе субъектов. DCR может быть полезным для измерения эффективности методов лечения, которые имеют опухолестатические эффекты, а не опухолеуничтожающие эффекты. DCR рассчитывается как процент пациентов, у которых ОЗЖП демонстрирует CR, PR или SD после лечения биспецифической конструкцией к HER2 или КАЛС. В одном варианте реализации введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъектам приводит к DCR более чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. В других вариантах реализации введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъектам приводит к DCR более чем 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%.

[00246] PFS (выживаемость без прогрессирования) и ORR (частота общего ответа) также могут использоваться для определения эффективности биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС и измеряются в соответствии с пересмотренными руководящими принципами RECIST 1.1, упомянутыми выше. PFS определяется как время от рандомизации до объективного прогрессирования опухоли или смерти. ORR определяется как доля субъектов, имеющих ОЗЖП, у которых наблюдается частичный или полный ответ на терапию биспецифической антигенсвязывающей конструкцией к HER2 или КАЛС.ORR может использоваться как мера противоопухолевой активности лекарственного средства. В некоторых вариантах реализации изобретения результатом введения эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъекту, имеющему ОЗЖП, является увеличение выживаемости без прогрессирования (PFS) в группе субъектов. В некоторых вариантах реализации изобретения результатом введения эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъекту, имеющему ОЗЖП, является увеличение частоты общего ответа (ORR). В одном варианте реализации введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъектам приводит к ORR более чем 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. В еще одном варианте реализации введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС субъектам приводит к ORR более чем 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%.

[00247] Общая выживаемость, время до прогрессирования, продолжительность ответа (DOR) (также могут использоваться для определения эффективности биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС.

[00248] Когда биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 или КАЛС вводится в качестве адъювантной или неоадъювантной терапии, выживаемость без заболевания также может быть измерена для определения эффективности терапии. Наборы и готовые изделия

[00249] В данном документе также описаны наборы, содержащие одну или более биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2 или КАЛС. Отдельные компоненты набора будут упакованы в отдельные контейнеры и, вместе с такими контейнерами, может предоставляться листок-вкладыш в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем листок-вкладыш отражает одобрение агентством производства, использования или продажи. Набор может необязательно содержать инструкции или инструкции, описывающие способ применения или схему введения для биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС.

[00250] Когда один или более компонентов набора предоставляются в виде растворов, например водного раствора или стерильного водного раствора, контейнерное средство само по себе может представлять собой ингалятор, шприц, пипетку, глазную капельницу или другое подобное устройство, из которого раствор можно вводить субъекту или наносить и смешивать с другими компонентами набора.

[00251] Компоненты набора также могут быть предоставлены в высушенной или лиофилизированной форме, и набор может дополнительно содержать подходящий растворитель для восстановления лиофилизированных компонентов. Независимо от количества или типа контейнеров описанные в данном документе наборы также могут содержать инструмент для помощи при введении композиции пациенту. Такой инструмент может представлять собой ингалятор, устройство для назального спрея, шприц, пипетку, пинцет, мерную ложку, глазную капельницу или аналогичное утвержденное с медицинской точки зрения средство доставки.

[00252] В другом аспекте, описанном в данном документе, предоставляется готовое изделие, содержащее материалы, полезные для лечения, профилактики и/или диагностики ОЗЖП. Изделие включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или связанный с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть сформированы из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией, эффективна для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую можно пробить иглой для подкожных инъекций). Этикетка или листок-вкладыш указывает, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем композиция содержит биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 или КАЛС, описанную в данном документе; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, при этом композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие этого варианта реализации, описанное в данном документе, может дополнительно содержать листок-вкладышу, указывающий, что композиции можно использовать для лечения ОЗЖП. Альтернативно или дополнительно изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Полипептиды и полинуклеотиды

[00253] Биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2, описанные в данном документе, содержат по меньшей мере один полипептид. Также описаны полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, описанные в данном документе. Биспецифические антигенсвязывающие конструкции к HER2 обычно выделяют.

[00254] Термин «выделенный», как он используется в данном документе, означает агент (например, полипептид или полинуклеотид), который был идентифицирован, отделен и/или выделен из компонента его естественной среды для культивирования клеток. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому применению биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Термин «выделенный» также относится к агенту, который был произведен синтетически, например, в результате вмешательства человека.

[00255] Термины «полипептид», «пептид» и «белок», как они используются в данном документе, взаимозаменяемы для обозначения полимера из аминокислотных остатков. То есть описание, направленное на полипептид, в равной степени применимо к описанию пептида и описанию белка, и наоборот. Эти термины применимы к встречающимся в природе аминокислотным полимерам, а также к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой неприродную аминокислоту. Используемые в данном документе термины охватывают аминокислотные цепи любой длины, включая полноразмерные белки, в которых аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями.

[00256] Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и не встречающимся в природе аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые действуют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Естественно кодируемые аминокислоты представляют собой 20 распространенных аминокислот (аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пралин, серии, триптофан, тирозин и валин) и пирролизин и селеноцистеин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и встречающиеся в природе аминокислоты, т.е. атом углерода, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, такие как гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина, метилсульфоний метионин. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (такие как норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Ссылка на аминокислоту включает, например, встречающиеся в природе протеогенные L-аминокислоты; D-аминокислоты, химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; встречающиеся в природе непротеогенные аминокислоты, такие как β-аланин, орнитин и т.д.; и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами, которые, как известно в данной области техники, являются характеристиками аминокислот. Примеры неприродных аминокислот включают, но не ограничиваются ими, ос-метиламинокислоты (например, α-диметилаланин), D-аминокислоты, гистидин-подобные аминокислоты (например, 2-аминогистидин, β-гидрокси-гистидин, гомогистидин), аминокислоты, имеющие дополнительный метилен в боковой цепи («гомо» аминокислоты), и аминокислоты, в которых функциональная группа карбоновой кислоты в боковой цепи заменена на группу сульфоновой кислоты (например, цистеиновая кислота). Включение неприродных аминокислот, включая синтетические неприродные аминокислоты, замещенные аминокислоты или одну или более D-аминокислот, в описанные в данном документе белки может быть выгодным по ряду различных способов. Пептиды, содержащие D-аминокислоту и т.д., демонстрируют повышенную стабильность in vitro или in vivo по сравнению с аналогами, содержащими L-аминокислоту. Таким образом, создание пептидов и т.д., включающих D-аминокислоты, может быть особенно полезным, когда желательна или требуется более высокая внутриклеточная стабильность. Более конкретно, D-пептиды и т.д. устойчивы к эндогенным пептидазам и протеазам, тем самым обеспечивая улучшенную биодоступность молекулы и увеличенное время жизни in vivo, когда такие свойства желательны. Кроме того, D-пептиды и т.д. не могут эффективно обрабатываться для П-ограниченного представления главного комплекса гистосовместимости классу Т-хелперных клеток и, следовательно, с меньшей вероятностью вызывают гуморальные иммунные ответы во всем организме.

[00257] Аминокислоты могут обозначаться в данном документе либо их общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUРАС-IUВ. Нуклеотиды также могут обозначаться их общепринятыми однобуквенными кодами.

[00258] В данном документе также описаны полинуклеотиды, кодирующие полипептиды биспецифических антигенсвязывающих конструкций к HER2. Термин «полинуклеотид» или «нуклеотидная последовательность» предназначен для обозначения последовательного участка из двух или более нуклеотидных молекул. Нуклеотидная последовательность может иметь геномное, кДНК, РНК, полусинтетическое или синтетическое происхождение или любую их комбинацию.

[00259] Термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеотидам, дезоксирибонуклеозидам, рибонуклеозидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если не указано иное, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, аналогичные свойствам эталонной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются аналогично природным нуклеотидам. Если специально не ограничено иное, термин также относится к аналогам олигонуклеотидов, включая PNA (пептид о нуклеиновую кислоту), аналоги ДНК, используемые в антисмысловой технологии (фосфоротиоаты, фосфороамидаты и т.п.). Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также неявно включает ее консервативно модифицированные варианты (включая, но не ограничиваясь, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов могут быть достигнуты путем создания последовательностей, в которых третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов заменено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

[00260] «Консервативно модифицированные варианты» применимы к последовательностям как аминокислот, так и нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, «консервативно модифицированные варианты» относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, по существу идентичным последовательностям. Из-за вырожденности генетического кода большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется кодоном, этот кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновой кислоты представляют собой «молчащие вариации», которые представляют собой один из видов консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты в данном документе, которая кодирует полипептид, также описывает все возможные молчащие изменения нуклеиновой кислоты. Специалист в данной области техники поймет, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (кроме AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован для получения функционально идентичной молекулы. Соответственно, каждый молчащий вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, неявно присутствует в каждой описанной последовательности.

[00261] Что касается аминокислотных последовательностей, специалист в данной области техники поймет, что отдельные замены, делеции или добавления к последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшое процентное содержание аминокислот в кодируемой последовательности представляет собой «консервативно модифицированный вариант», причем изменение приводит к делеции аминокислоты, добавлению аминокислоты или замене аминокислоты на химически подобную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, содержащие функционально подобные аминокислоты, известны специалистам в данной области техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют и не исключают описанные в данном документе полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели.

[00262] Таблицы консервативных замен, содержащие функционально подобные аминокислоты, известны специалистам в данной области техники. Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серии (S), треонин (Т); и 8) цистеин (С), метионин (М) (см., например, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993).

[00263] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или одинаковые подпоследовательности. Последовательности являются «практически идентичными», если они имеют процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов (т.е. идентичность около 60%, около 65%, около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90% или около 95% идентичности в указанной области) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или обозначенной области, как измерено с использованием одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей (или других алгоритмов, доступных специалистам в данной области техники) или ручным выравниванием и визуальным осмотром. Это определение также относится к дополнению тестовой последовательности. Идентичность может существовать в области длиной не менее 50 аминокислот или нуклеотидов, или в области длиной 75-100 аминокислот или нуклеотидов, или, если не указано иное, во всей последовательности полинуклеотида или полипептида. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, описанный в данном документе, включая гомологи из других видов, кроме человека, может быть получен способом, включающим стадии скрининга библиотеки в строгих условиях гибридизации с меченым зондом, имеющим описанную в данном документе полинуклеотидную последовательность или ее фрагмент, и выделение полноразмерной кДНК и геномных клонов, содержащих указанную полинуклеотидную последовательность. Такие методы гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники.

[00264] Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность используется как эталонная последовательность, с которой сравниваются тестовые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестовая и эталонная последовательности вводятся в компьютер, при необходимости указываются координаты подпоследовательности и указываются параметры программы алгоритма последовательности. Можно использовать параметры программы по умолчанию или указать альтернативные параметры. Затем алгоритм сравнения последовательностей вычисляет процент идентичностей последовательностей для тестовых последовательностей относительно эталонной последовательности на основе параметров программы.

[00265] Термин «окно сравнения», как он используется в данном документе, включает ссылку на сегмент любого из числа смежных позиций, выбранных из группы, состоящей из от 20 до 600, обычно от около 50 до около 200, более обычно от около 100 до около 150, в которых последовательность может быть сравнена с эталонной последовательностью с таким же количеством смежных положений после того, как две последовательности оптимально выровнены. Способы выравнивания последовательностей для сравнения известны специалистам в данной области техники. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, в том числе, но не ограничиваясь этим, с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, с помощью алгоритма выравнивания гомологии Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, методом поиска сходства Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, путем компьютеризированной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) или путем ручного выравнивания и визуального контроля (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).

[00266] Одним из примеров алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации, доступный в интернете по адресу ncbi.nlm.nih.gov. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину (W), равную 11, математическое ожидание (Е) или 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует по умолчанию длину 3 и математическое ожидание (Е) 10, а также матрицу оценки BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) выравнивания (В) из 50, ожидание (Е) из 10, М=5, N=-4 и сравнение обеих цепей. Алгоритм BLAST обычно выполняется с выключенным фильтром «низкой сложности».

[00267] Алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787). Одной мерой сходства, обеспечиваемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), которая обеспечивает указание вероятности того, что совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями может произойти случайно. Например, нуклеиновая кислота считается подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты с эталонной нуклеиновой кислотой составляет менее чем около 0,2, или менее чем около 0,01, или менее чем около 0,001.

[00268] Фраза «селективно (или конкретно) гибридизируется с» относится к связыванию, дуплексированию или гибридизации молекулы только с конкретной нуклеотидной последовательностью в жестких условиях гибридизации, когда эта последовательность присутствует в сложной смеси (включая, но не ограничиваясь, к, общая клеточная или библиотечная ДНК или РНК).

[00269] Фраза «жесткие условия гибридизации» относится к гибридизации последовательностей ДНК, РНК или других нуклеиновых кислот или их комбинаций в условиях низкой ионной силы и высокой температуры, как известно в данной области техники. Как правило, в жестких условиях зонд будет гибридизоваться со своей подпоследовательностью-мишенью в сложной смеси нуклеиновых кислот (включая, помимо прочего, общую клеточную или библиотечную ДНК или РНК), но не будет гибридизоваться с другими последовательностями в сложной смеси. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).

[00270] Термины «сконструировать, сконстрированный, конструировать», как используются в данном документе, включают любые манипуляции с пептидным остовом или посттрансляционные модификации встречающегося в природе или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Конструирование включает модификации аминокислотной последовательности, паттерна гликозилирования или группы боковой цепи отдельных аминокислот, а также комбинации этих подходов. Сконструированные белки экспрессируются и производятся стандартными методами молекулярной биологии.

[00271] Под «изолированной молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом» подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была выделена из своего природного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, считается изолированным. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотид а включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяев ах, или очищенные (частично или в основном) полинуклеотиды в растворе. Изолированный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или в хромосомном местоположении, которое отличается от ее естественного хромосомного местоположения. Изолированные молекулы РНК включают транскрипты РНК in vivo или in vitro, а также формы с положительной и отрицательной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, описанные в данном документе, дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим путем, например, с помощью ПЦР или химического синтеза. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота в некоторых вариантах реализации включают регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.

[00272] Термин «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР», как он используется в данном документе, обычно относится к способу амплификации желаемой нуклеотидной последовательности in vitro, как описано, например, в патенте США №4683195. Как правило, метод ПЦР включает повторяющиеся циклы синтеза удлинения праймера с использованием олигонуклеотидных праймеров, способных гибридизоваться преимущественно с матричной нуклеиновой кислотой.

[00273] Под нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% «идентичную» эталонной нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, подразумевается, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной нуклеотидной последовательности. Другими словами, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную эталонной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другим нуклеотидом, или количество нуклеотидов до 5% всех нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут происходить в 5'-или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, с введением либо индивидуально среди остатков в эталонной последовательности, либо в одной или более смежных группах в эталонной последовательности. На практике, является ли какая-либо конкретная полинуклеотидная последовательность идентичной на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, можно определить обычным образом, используя известные компьютерные программы, такие как описанные выше для полипептидов (например, ALIGN-2).

[00274] Производное или вариант полипептида, как говорят, разделяют «гомологию» или являются «гомологичными» с пептидом, если аминокислотные последовательности производного или варианта идентичны на по меньшей мере 50% последовательности 100 аминокислот из исходного пептида. В некоторых вариантах реализации производное или вариант на по меньшей мере 75% идентичны либо пептиду, либо фрагменту пептида, имеющего такое же количество аминокислотных остатков, что и производное.. В некоторых вариантах реализации производное или вариант на по меньшей мере 85% идентичны либо пептиду, либо фрагменту пептида, имеющего такое же количество аминокислотных остатков, что и производное. В некоторых вариантах реализации аминокислотная последовательность на по меньшей мере 90% идентична пептиду или фрагменту пептида, имеющего такое же количество аминокислотных остатков, что и производное. В некоторых вариантах реализации аминокислотная последовательность на по меньшей мере 95% идентична пептиду или фрагменту пептида, имеющего такое же количество аминокислотных остатков, что и производное. В некоторых вариантах реализации производное или вариант на по меньшей мере 99% идентичны либо пептиду, либо фрагменту пептида, имеющего такое же количество аминокислотных остатков, что и производное.

[00275] Термин «модифицированный», как он используется в данном документе, относится к любым изменениям, внесенным в данный полипептид, таким как изменения длины полипептида, аминокислотной последовательности, химической структуры, котрансляционной модификации или посттрансляционной модификации полипептида. Термин «(модифицированный)» означает, что обсуждаемые полипептиды необязательно модифицированы, то есть обсуждаемые полипептиды могут быть модифицированными или немодифицированными.

[00276] В некоторых аспектах биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентична релевантной аминокислотной последовательности или ее фрагменту, приведенным в таблице(ах) или инвентарных номерах, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах выделенная биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который на по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или на 100% идентичный соответствующей нуклеотидной последовательности или ее фрагменту, приведенным в таблице(ах) или инвентарных номерах, раскрытых в данном документе.

[00277] Следует понимать, что раскрытие не ограничивается конкретными протоколами; клеточные линии, конструкции и реагенты, описанные в данном документе, могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема изобретения.

[00278] Все публикации и патенты, упомянутые в данном документе, включены в данный документ в качестве ссылки с целью описания и раскрытия, например, конструкций и методологий, которые описаны в публикациях, которые могут быть использованы в связи с описанными в данном документе конструкциями. Обсуждаемые в данном документе публикации предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что изобретатели не имеют права датировать такое раскрытие задним числом на основании предшествующего изобретения или по любой другой причине.

ПРИМЕРЫ

[00279] Ниже приведены примеры конкретных вариантов получения и использования биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 и КАЛС, описанных в данном документе. Примеры предлагаются только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема раскрытия. Были предприняты усилия для обеспечения точности используемых чисел (например, количества, температуры и т.д.), но, конечно, следует допустить некоторую экспериментальную ошибку и отклонение.

[00280] Описанные в данном документе конструкции и способы могут быть получены и осуществлены с использованием, если не указано иное, общепринятых методов химии белков, биохимии, методов рекомбинантной ДНК и фармакологии в пределах квалификации в данной области техники. Такие методы полностью объяснены в литературе. См., например, Т.Е. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sxmdberg Advanced Organic Chemistry 3^rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B (1992).

Пример 1: Описание и получение варианта 10000 (v10000)

[00281] v10000 представляет собой гуманизированное биспецифическое антитело, которое распознает 2 неперекрывающихся эпитопа ECD антигена HER2 человека. IgG1-подобная область Fc v 10000 содержит комплементарные мутации в каждом домене СН3, которые придают предпочтительное спаривание для образования гетеродимерной молекулы и, соответственно, препятствуют образованию гомодимеров. На Фиг. 1 представлено представление формата v10000, где тяжелая цепь А и легкая цепь А' образуют связывающую часть ECD2 антитела, а тяжелая цепь В включает scFv, который образует связывающую часть ECD4 антитела. Вариант 10000 содержит тяжелую цепь H1 (соответствует тяжелой цепи А на Фиг. 1), содержащую последовательность SEQ ID NO: 36, тяжелую цепь Н2 (соответствует тяжелой цепи В на Фиг. 1), содержащую последовательность SEQ ID NO: 63, и легкую цепь L1 (соответствует легкой цепи А'), содержащую последовательность SEQ ID NO: 24. Способы получения v10000 подробно описаны в международной патентной публикации № WO 2015/077891.

[00282] v10000 получили согласно соответствующим нормативным требованиям для испытаний на людях и составили в концентрации 15 мг/мл в биосовместимом водном буфере для внутривенной инфузии при температуре окружающей среды, v 10000 поставляли во флаконе, содержащем 300 мг v10000 в 20 мл буфера. Флаконы с v10000 отправляли замороженными и хранили при -20°С (+/-5°С) до использования. Перед использованием флаконы размораживали при температуре окружающей среды. Размороженные растворы во флаконах хранили до 24 часов при температуре окружающей среды или до 72 часов в условиях охлаждения (от 2°С до 8°С) и использовали до истечения указанного срока годности.

Пример 2: Фаза I клинических испытаний v10000 у пациентов с местным на поздней стадии (неоперабельным) и/или метастатическим онкологическим заболеванием, экспрессирующим HER2

[00283] Это продолжающееся первое исследование на людях по изучению безопасности, переносимости, фармакокинетики (ФК) и предварительной противораковой активности монотерапии v10000 у пациентов с местным на поздней стадии (неоперабельным) и/или метастатическим онкологическим заболеванием, экспрессирующим рецептор эпидермального фактора роста человека 2 HER2.

[00284] Часть 1 исследования представляла собой повышение дозы 3+3, в результате чего было определено 20 мг/кг одного агента Q2W в качестве рекомендуемой дозы (RD). Часть 2 до сих пор проходит и проводится оценка RD v10000 у дополнительных пациентов, включая пациентов с ОХЖП с высоким уровнем HER2. Подходящие пациенты в частях 1 и 2 должны иметь прогрессирование заболевания после всех видов лечения, которые, как известно, приносят клиническую пользу. Опухолевые ответы оценивались исследователем согласно RECIST v1. 1 Q8W.

Цели

[00285] Основной целью Части 1 клинического испытания было определение MTD (максимально переносимая доза), OBD (оптимальная биологическая доза) или RD монотерапии v10000. Второстепенными целями Части 1 клинического исследования были: (1) охарактеризовать безопасность и переносимость v10000; (2) охарактеризовать ФК профиль v10000 в сыворотке; и (3) изучить потенциальные противоопухолевые эффекты v10000 у подходящих пациентов с HER2-экспрессирующими онкологическим заболеванием.

[00286] Основной целью части 2 исследования было охарактеризовать безопасность и переносимость монотерапии v10000 при определенных типах опухолей. Второстепенными целями Части 2 клинического исследования были (1) охарактеризовать ФК профиль монотерапии v10000 в сыворотке и (2) изучить потенциальные противоопухолевые эффекты v10000 при MTD, OBD или RD у подходящих пациентов с выбранными с местными на поздней стадии (неоперабельными) и/или метастатическими HER2-экспрессирующими онкологическими заболеваниями.

Пациенты

[00287] В исследование были включены пациенты мужского и женского пола>18 лет с показателями ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 0 или 1 и ожидаемой продолжительностью жизни не менее 3 месяцев, по мнению клинического исследователя.

[00288] В Части 1 когорты 1-3 включали пациентов местным на поздней стадии (неоперабельным) и/или метастатическим НЕR2-экспрессирующим онкологическим заболеванием (HER2 1+, 2+ или 3+ по ИГХ) (включая, но не ограничиваясь, онкологическое заболевание молочной железы, онкологическое заболевание желудка, онкологическое заболевание яичников, колоректальное онкологическое заболевание и немелкоклеточный рак легких), которые прогрессировали после приема всех известных терапевтических методов лечения. Когорты 4-6 включали пациентов с онкологическим заболеванием молочной железы HER2 ИГХ 2+/FISH- или гастроэзофагеальной аденокарциномой (GEA); пациентов с онкологическим заболеванием молочной железы HER2 ИГХ 3+ или HER2 ИГХ 2+/FISH + или GEA. Когорты 4-6 также включали пациентов с любым другим онкологическим заболеванием HER2 ИГХ 3+ или FISH +, у которых онкологическое заболевание сверхэкспрессировало HER2 (3+ по ИГХ) или онкологическое заболевание молочной железы HER2-2+ и FISH+ должно было прогрессировать после предшествующего лечения трастузумабом, пертузумабом и T-DM1; причем онкологическое заболевание сверхэкспрессировавшее HER2 (3+ по ИГХ) или HER2-2+ и FISH+GEA должно было прогрессировать после предшествующего лечения трастузумабом; при этом пациенты с колоректальным онкологическим заболеванием относились к KRAS дикого типа; или при этом пациенты с НМРЛ были отрицательными по ALK дикого типа, EGFR дикого типа и слиянию ROS1, как определено стандартными методами. Когорта 7 была включена в выбранные центры и включала пациентов с онкологическим заболеванием молочной железы HER2 ИГХ 3+, HER2 ИГХ 2+/FISH+ или HER2 ИГХ 2+/FISH-.

[00289] В Части 2 расширение когорты с использованием v10000, вводимого в MTD, OBD или RD из Части 1 исследования, включало местное на поздней стадии (неоперабельное) и/или метастатическое онкологическое заболевание, которое прогрессировало после получения всех видов лечения, которые, как известно, приносят клиническую пользу (если не соответствует критериям для получения специальной терапии) следующим образом:

Когорта 1: HER2 ИГХ 2+/FISH- онкологическое заболевание молочной железы.

Когорта 2: HER2 ИГХ 3+ или HER2 ИГХ 2+/FISH+онкологическое заболевание молочной железы.

Когорта 3: HER2 ИГХ 2+/FISH-GEA.

Когорта 4: HER2 ИГХ 3+ или HER2 ИГХ 2+/FISH+GEA.

Когорта 5: Любое другое онкологическое заболевание HER2 ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+, включая следующие:

Когорта 5а: HER2 ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+GI (желудочно-кишечное) онкологическое заболевание, кроме GEA, при этом пациенты с колоректальным онкологическим заболеванием относились к KRAS дикого типа.

Когорта 5b: Любые другие типы солидных опухолей HER2 ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+, которые не являются онкологическим заболеванием молочной железы или желудочно-кишечного тракта, причем пациенты с НМРЛ должны иметь ALK дикого типа, EGFR дикого типа и слияние ROS1, как определено стандартными методами. Пациенты с онкологическим заболеванием яичников должны относиться к KRAS дикого типа.

[00290] Дополнительные критерии для пациентов в Частях 1 и 2 включали: (1) онкологическое заболевание молочной железы HER2 ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+ должно прогрессировать после предшествующего лечения трастузумабом, пертузумабом и T-DM1; (2) HER2 ИГХ 3+ или ИГХ 2+/FISH+GEA должно прогрессировать после предшествующего лечения трастузумабом; (3) пациенты с колоректальным онкологическим заболеванием должны иметь белок крысиной саркомой Кирстен (KRAS) дикого типа; и (4) пациенты с НМРЛ должны иметь киназу анапластической лимфомы (ALK) дикого типа, EGFR дикого типа и отрицательную по слиянию рецепторную тирозинкиназу (ROS1), как определено стандартными методами.

[00291] Пациенты исключались из исследования, если применялись 1 или более из следующих критериев:

1. Лечение экспериментальными методами лечения в течение 4 недель до первой дозы v10000.

2. Лечение другими видами противоопухолевой терапии, не указанными иначе, в течение 4 недель до дозирования v10000.

3. Лечение антрациклинами в течение 90 дней до первой дозы v10000 или общей пожизненной дозой, превышающей 300 мг/м² адриамицина или его эквивалента.

4. Лечение трастузумабом, пертузумабом, лапатинибом или T-DM1 в течение 3 недель до первой дозы v10000.

5. Нелеченные метастазы в головной мозг (допускаются пациенты с пролеченными метастазами в головной мозг, которые не принимают стероиды и стабильны в течение как минимум 1 месяца на момент скрининга). Перед началом лечения все пациенты с онкологическим заболеванием груди должны пройти обследование. Пациенты, у которых обнаружены нелеченые метастазы в головной мозг, могут быть повторно обследованы после соответствующей терапии.

6. Клинически оцениваемая лептоменингеальная болезнь (LMD). Если LMD была зарегистрирована рентгенологически на исходной МРТ, но исследователь не подозревает о ней клинически, пациент имеет право на участие в исследовании, если у него нет неврологических симптомов LMD, как это задокументировано исследователем.

7. Серьезное хирургическое вмешательство или лучевая терапия в течение 3 недель до первой дозы v10000.

8. Беременные или кормящие женщины.

9. Опасная для жизни гиперчувствительность к моноклональным антителам или рекомбинантным белкам или вспомогательным веществам в лекарственной форме в анамнезе.

10. Любое другое онкологическое заболевание в течение 3 лет до первой дозировки v10000, за исключением контралатерального онкологического заболевания молочной железы, адекватно пролеченного онкологического заболевания шейки матки in situ, или адекватно пролеченного базальноклеточного или плоскоклеточного онкологического заболевания кожи, или любого другого онкологического заболевания, которое прошло курс лечения, с одобрения медицинского наблюдателя спонсора.

11. Острое или хроническое неконтролируемое заболевание почек, панкреатит или заболевание печени (за исключением пациентов с синдромом Жильбера, бессимптомными желчными камнями, метастазами в печени или стабильным хроническим заболеванием печени по оценке исследователя).

12. Периферическая невропатия: >Степень 2 NCI-CTCAE, версия 4.03, 14 июля 2010 г.

13. Клинически значимое интерстициальное заболевание легких.

14. Несоблюдение лечебных режимов в анамнезе.

15. Нежелание или неспособность соблюдать протокол.

16. Известный активный гепатит В или С или известная инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

17. Использование кортикостероидов в дозах, эквивалентных >15 мг преднизона в день в течение 2 недель после первого введения v10000, если иное не одобрено медицинским наблюдателем исследования.

18. QTc Фредериция (QTcF) >450 мс.

19. Наличие какой-либо токсичности, связанной с предшествующим лечением онкологического заболевания, которая не разрешилась до <1 степени, за следующими исключениями: алопеция; невропатия (которая должна разрешиться до <2 степени); и застойная сердечная недостаточность (ЗСН), которая должна была быть <1 степени тяжести на момент возникновения и должна была полностью исчезнуть.

20. Наличие клинически значимого сердечного заболевания, такого как желудочковая аритмия, требующая лечения, неконтролируемая гипертензия или наличие в анамнезе симптоматической ЗСН.

21. Наличие инфаркта миокарда или нестабильной стенокардии в течение 6 месяцев до первой дозы v10000.

Лечение

[00292] v10000 в качестве единственного агента (монотерапия) вводили внутривенно (в/В) в частях 1 и 2. v10000 вводили внутривенно инфузией в 0,9% физиологическом растворе в течение 120-150 минут. Если для конкретного пациента первые 2 введенные дозы хорошо переносились, продолжительность инфузии для этого пациента могла быть уменьшена до 90 минут. Если следующие 2 дозы переносятся хорошо, продолжительность инфузии может быть уменьшена до 60 минут. Скорость инфузии не превышала 250 мл 0,9% физиологического раствора в час.(Пример: Если доза v10000 разводится в пакете с физиологическим раствором объемом 250 мл, инфузию следует вводить в течение по меньшей мере 60 минут. Если доза v10000 была разбавлена в пакете объемом 500 мл, инфузию следует вводить в течение по меньшей мере 120 минут.) Дозировка исследуемого лекарственного средства рассчитывалась на основе массы тела пациента в 1 день 1 цикла. Доза пересчитывалась только при изменении массы тела на 10% по сравнению с оценкой в 1 день 1 цикла.

[00293] В Части 1 уровни доз для увеличения дозы составляли 5, 10 и 15 мг/кг, вводимые один раз в неделю (QW). Также оценивалось дозирование раз в две недели (Q2W). Уровни доз для дозирования Q2W составляли 20, 25 или 30 мг/кг. При дозировании Q2W могла использоваться начальная загрузочная доза (не превышающая 20, 25 или 30 мг/кг) с последующим введением v10000 на более низком уровне дозы, как рекомендовано SMC. Кроме того, изучали дозировку 30 мг/кг раз в 3 недели (Q3W).

[00294] Уровень дозы для Части 2 был MTD, OBD или RD, как определено в Части 1. MTD определяется как наивысший уровень дозы, при котором не более 1 из 6 пациентов испытывали DLT в течение первых 4 недель лечения. OBD определяется как доза v10000, которая приводит к концентрации v10000 в сыворотке крови (через 7 дней после введения дозы), которая как минимум в 10 раз превышает максимальную связывающую способность v10000 на клеточной линии, представляющей гистологию опухоли HER2-3+. RD определяется как любая другая дозировка, не превышающая MTD. Основываясь на результатах Части 1, RD 20 мг/кг Q2W использовали для лечения большинства пациентов в Части 2. Некоторых пациентов лечили 10 мг/кг раз в неделю.

[00295] Пациенты участвовали как минимум в 2 циклах по 3 или 4 недели каждый в зависимости от части, когорты или TG, в которые был включен пациент. Лечение могло продолжаться в течение дополнительных циклов до тех пор, пока не было доказательств клинического прогрессирования, неприемлемой токсичности или признаков прогрессирующего заболевания, как это определено в RECIST версии 1.1. Клиническое прогрессирование, определяемое как ухудшение или повторное появление ранее существовавших симптомов, связанных с основным онкологическим заболеванием, или появление новых симптомов, которые нельзя отнести к токсичности исследуемого лекарственного средства или альтернативным причинам. Пациенты, которые, по мнению клинического исследователя, продемонстрировали постоянную клиническую пользу, несмотря на радиологическое прогрессирование, могли продолжать получать лечение после обсуждения и одобрения медицинского наблюдателя спонсора. Что касается Части 3, пациенты могли продолжать получать лечение v10000, если химиотерапия была прекращена из-за токсичности, не связанной с v10000. Пациенты, прекратившие лечение v10000 по любой причине, были исключены из исследования.

Оценка эффективности

[00296] Показатели противоопухолевой активности оценивали на основе оценок ответа, сделанных в соответствии с новыми международными критериями, предложенными в пересмотренном руководстве «Критерии оценки ответа при лечении солидных опухолей (RECIST)» (версия 1.1) [Eur J Са 45: 228-247, 2009]. В критериях RECIST версии 1.1 используются изменения наибольшего диаметра (одномерное измерение) опухолевых поражений и наименьшего диаметра в случае злокачественных новообразований лимфатических узлов. Клинический ответ CR, PR, SD или прогрессирующего заболевания (PD) определялся исследователем при каждой оценке. PD включал прогрессирующее заболевание согласно RECIST версии 1.1 и клиническое прогрессирование заболевания на одного исследователя. Клиническое прогрессирование, определяемое как ухудшение или повторное появление ранее существовавших симптомов, связанных с основным онкологическим заболеванием, или появление новых симптомов, которые нельзя отнести к токсичности исследуемого лекарственного средства или альтернативным причинам.

[00297] Частота объективного ответа (ORR) определяется как процент пациентов, у которых есть по меньшей мере 1 общий ответ при лечении опухоли либо CR, либо PR до появления каких-либо признаков прогрессирования, как определено в RECIST версии 1.1. Считается, что пациент достиг контроля над заболеванием, если у него есть ответ опухоли CR, PR или SD в соответствии с критериями RECIST версии 1.1. Скорость контроля заболевания будет оцениваться каждые 8 недель после начала терапии v10000. Время PFS определяется как время от первой дозы v10000 до даты документально подтвержденного прогрессирования заболевания согласно RECIST версии 1.1, клинического прогрессирования или смерти по любой причине. Пациенты, которые живы и не прогрессировали на момент анализа, будут подвергнуты цензуре во время их последней оценки опухоли, которая была CR, PR или SD.

[00298] Ответы опухоли оценивали на основе компьютерной томографии и/или МРТ (с использованием той же методологии для каждого сканирования одного и того же пациента) грудной клетки, брюшной полости и таза плюс дополнительные области с известным или предполагаемым поражением опухолью (например, мозг, конечности).

[00299] Объективные ответы и прогрессирование опухоли оценивали локально. Отсканированные изображения были собраны для всех субъектов для централизованного обзора, выполняемого по усмотрению спонсора. При принятии всех решений, связанных с лечением, использовались местные оценки.

[00300] Для некоторых пациентов объем опухоли можно рассчитать централизованно.

Побочные эффекты

[00301] НЯ (нежелательное явление) определяется как любое неблагоприятное медицинское происшествие у пациента в клиническом исследовании, которому вводили лекарственный продукт, которое не обязательно имеет причинно-следственную связь с этим лечением. Следовательно, НЯ может быть любым неблагоприятным и непреднамеренным признаком (включая аномальные лабораторные данные), симптомом или заболеванием, временно связанным с использованием лекарственного (исследуемого) продукта, независимо от того, связано оно с лекарственным (исследуемым) продуктом или нет. Это включает обострение ранее существовавших состояний или событий, интеркуррентных заболеваний, лекарственного взаимодействия или значительное ухудшение исследуемого показания, которое не зарегистрировано в других разделах CRF при конкретных оценках эффективности. Оценку безопасности проводили на основе версии 4.03 NCI-CTCAE от 14 июля 2010 г.

Предварительные результаты:

[00302] По состоянию на июнь 2018 года у одного пациента с онкологическим заболеванием желчного пузыря лечение v10000 привело к около 40% снижению суммы наибольших диаметров (SLD) в целевых поражениях. Позже у этого пациента наблюдалось уменьшение целевых поражений на около 50%, измеренное с помощью SOD (сумма диаметров).

[00303] По состоянию на ноябрь 2018 г. у одного пациента с ССА наблюдалось уменьшение целевых поражений на около 40% после лечения v 10000, как измерено с помощью SOD.

Промежуточные результаты:

[00304] По состоянию на 22 апреля 2019 г. 89 пациентов по всем показаниям были зарегистрированы и лечились одним агентом v10000 в частях 1 и 2 v10000 (23 в части 1 и 66 в части 2) (Таблица С). Оцениваемые типы опухолей включали онкологическое заболевание молочной железы (n=42), желудочно-пищеводное онкологическое заболевание (n=20), колоректальное онкологическое заболевание (n=11), онкологическое заболевание желчевыводящих путей (n=6) и другие виды онкологического заболевания (n=10). Среди пациентов с ОЗЖП среднее количество ранее получавших системные схемы составляло 4 (диапазон 1-8), включая трастузумаб у одного пациента.

[00305] В частях 1 и 2 исследования большинство НЯ имели степень тяжести 1 или 2 (Таблица D). Связанные с v10000 НЯ 3 степени включали утомляемость (n=3, в том числе одно событие, описанное как SAE), диарею (n=2), артралгию (n=1) и гипофосфатемию (n=1).

[00306] Предварительные данные об эффективности для пациентов с ОЗЖП представлены в Таблице Е, Таблице F и на Фиг. 2.

[00307] Эти данные показывают, что v10000 продемонстрировал уровень контроля заболевания у пациентов с HER2 3+или FISH+ОЗЖП, равный 83,3%, и ORR 66,7%.

Пример 3: Получение Линкер-Токсина 001

[00308] Линкер-токсин 001 получали, как описано ниже. Линкер-токсин 001 также может быть получен, как описано в публикации международной патентной заявки № WO 2016/041082.

А. Этил (2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропаноат (Соединение 1)

[00309] К перемешиваемому раствору (2R,3R)-3-((S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропановой кислоты (Boc-Dap-OH, 4,31 г, 15,0 ммоль) в абсолютном этаноле (27,0 мл) при 0°С по каплям добавляли тионилхлорид (3,0 мл). Полученному раствору давали нагреться до комнатной температуры и за ходом реакции следили с помощью ВЭЖХ-МС. Через 18 ч оставшегося исходного материала не обнаруживали, и раствор концентрировали досуха при пониженном давлении. Полученное масло суспендировали в толуоле (10 мл) и концентрировали при пониженном давлении два раза, затем суспендировали в диэтиловом эфире (5 мл) и концентрировали при пониженном давлении два раза с получением белой твердой пены (3,78 г, количественный выход %). МС m/z набл.=216,5 (М+1).

В. (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептан о в ая кислота (Соединение 3)

[00310] Соединение 2 получали, как описано в публикации международной патентной заявки № WO 2016/041082.

[00311] К перемешиваемому раствору Соединения 2 (6,965 г, 14,14 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5,0 мл). Завершение реакции контролировали с помощью ВЭЖХ-МС, и через 40 часов исходного материала не наблюдали. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, выпаривали вместе с толуолом (2×10 мл) и дихлорметаном (2×10 мл) с получением пенистого белого твердого вещества (6,2 г, количественный выход с остаточной ТФК). Этот материал растворяли в 200 мл горячей смеси EtOAc : гексан (1:3) и давали остыть до комнатной температуры. При охлаждении образовывался осадок, а также небольшие кристаллы. Добавляли 5 мл EtOAc и суспензию снова нагревали до полного растворения осадка. Дополнительные кристаллы образовывались при охлаждении до комнатной температуры, и колбу помещали на ночь при -30°С. На следующее утро маточный раствор декантировали, кристаллы промывали 2×50 мл гексана и сушили в высоком вакууме. Получали 5,67 г кристаллического продукта. МС m/г набл.=405,7 (М+1).

С. Этил (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноат (Соединение 4)

[00312] К перемешиваемому раствору Соединения 3 (6,711 г, 15,37 ммоль, 1,025 эквивалента) в смеси дихлорметана (5,0 мл) и N,N-диметилформамида (5,0 мл) при комнатной температуре добавляли HATU (5,732 г, 15,07 ммоль, 1,005 экв.) и N,N-диизопропилэтиламин (7,84 мл, 3 экв.). После перемешивания в течение 30 минут при комнатной температуре раствор Соединения 1 (3,776 г, 15,00 ммоль, 1,0 экв.) в смеси дихлорметана (1,0 мл) и N; N-диметилформамид (1,0 мл), добавляли по каплям, промывали остаточное Соединение 1 дополнительными 3 мл смеси 1:1 дихлорметан: N,N-диметилформамид. За реакцией следили с помощью ВЭЖХ-МС, и через 15 минут присутствия исходного Соединения 1 не наблюдали. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, разбавляли этил ацетатом (~125 мл) и органическую фазу экстрагировали 1 М НСl (2×50 мл), 1×дH₂O (1×50 мл), насыщенным NaHCO₃ (3×50 мл), насыщенным водным раствором хлорида натрия (25 мл). Кислый и основной водные слои промывали 25 мл EtOAc. Затем все органические фазы объединяли и сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали с получением красного масла. Остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана (-10 мл), загружали на колонку с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 360 г (Isolera™ Flash System; Biotage AB, Швеция) для очистки (20-100% EtOAc в смеси изомеров гексана более 10 объемов колонки). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, получая 7,9 г пенистого белого твердого вещества. Загрязненные фракции подвергали второй очистке на колонке с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 100 г и объединяли с чистым продуктом, чтобы выделить белое твердое пенообразное вещество (8,390 г, 88,3%). МС m/z набл.=634,7 (М+1).

D. (2R,3R-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((бензилокси)кар6онил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метбилгентаноил)пирроладин-2-ил)-3-метокси-2-метбилпропановая кислота (Соединение 5)

[00313] К перемешиваемому раствору Соединения 4 (8,390 г, 13,24 ммоль) в 1,4-диоксане (158 мл) добавляли Н₂О (39,7 мл) и моногидрат гидроксида лития (1 M в Н₂О, 39,7 мл, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 4°С и следили с помощью ВЭЖХ-МС за исчезновением исходного материала, что занимало 3 дня, пока не оставались только следы Соединения 4. В ходе реакции новый продукт, соответствующий потере метанола (β-элиминирование, <2%), образовался в небольших процентах в дополнение к желаемому материалу. Реакционную смесь подкисляли добавлением 1 М водной НСl (50 мл) и концентрировали при пониженном давлении для удаления диокеана. Оставшуюся реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (4×50 мл), и органическую фазу объединяли, промывали насыщенным водным раствор ом хлорида натрия (15 мл+2 мл 2 М HCl), сушили над MgSO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, чтобы получить светлое окрашенное масло. Масло повторно растворяли в диэтиловом эфире (~50 мл) и концентрировали при пониженном давлении (3х), чтобы облегчить удаление остаточного ди океана, с получением указанного в заголовке продукта в виде густого масла (7,81 г выход 97% с небольшим количеством остаточного ди океана и Соединения 4). МС m/z набл.=606,7 (М+1).

E. Бензил ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфонамидо)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (Соединение 7)

[00314] Соединенне 6 получали, как описано в публикации международной патентной заявки № WO 2016/041082).

[00315] К перемешиваемому раствору Соединения 5 (7,12 г, 11,754 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли 2,2,2-трифтор-N-(4-сульфамоилфенил)ацетамид (Соединение 6, 4,095 г, 1,3 экв. растворенного в 3 мл ДМФА), N,N-диметилпиридин (1,867 г, 1,3 экв.) и N,N-диметилформамид (1,5 мл) с получением светло-желтой суспензии. Дальнейшее добавление 5 мл ДМФА не привело к осветлению раствора. N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида гидрохлорид (EDCI) (2,817 г, 1,25 экв.) добавляли одной порцией и реакцию контролировали с помощью ВЭЖХ-МС. Через 48 часов реакция больше не прогрессировала, и дополнительно добавляли 400 мг EDCI. Через 18 часов оставшегося исходного материала не наблюдали, и реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением желтого масла. Масло растворяли в эти л ацетате (~150 мл) и 1 М HCl (20 мл), и органическую фазу промывали холодной 2 М HCl (2×10 мл), насыщенным NаНСО₃ (1×10 мл), насыщенным водным раствором хлорида натрия (20 мл +5 мл 2 М HCl). Кислые и основные водные фракции экстрагировали EtOAc (1×20 мл), все органические фракции объединяли, сушили над MgSO₄ и концентрировали при пониженном давлении с получением маслянистого сырого твердого вещества (13 г). Остаток растворяли в дихлорметане (~10 мл), загружали на колонку с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 360 г и очищали в градиенте 10-100% EtOAc (2% АсОН) в смеси изомеров гексана более 12 объемов колонки с плато в 3 объема колонки при 50% EtOAc. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали при пониженном давлении, растворяли и концентрировали из толуола (2×10 мл) и диэтилового эфира (2×10 мл) с получением желаемого продукта, 7,1 г, в виде твердой пены белого цвета.

Загрязненные фракции подвергали повторной очистке в условиях меньшего градиента, используя колонку с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 100 г на приборе Isolera™. Все чистые фракции объединяли, чтобы выделить чистый продукт в виде твердой пены белого цвета (8,60 г, 86%). МС m/z набл.=856,7 (М+1).

F. (S)-2-амино-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфонамидо)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептон-4-ил)-N,3-диметилбутанамид (Соединение 7а)

[00316] Соединение 7 (3,71 г, 4,33 ммоль) растворяли в 10% N (N-диметилформамид в этилацетате (30 мл)) в круглодонной колбе, содержащей магнитную мешалку и снабженную 3-ходовым переходником для газовой линии. Сосуд дважды откачивали при пониженном давлении и заполняли газообразным азотом. Одной порцией добавляли 10% палладий на угле (0,461 г, 0,1 экв.), к колбе прикрепляли 3-ходовой адаптер, к адаптеру присоединяли шар с водородом, и сосуд дважды откачивали при пониженном давлении и заполняли водородом. Реакционной смеси давали возможность перемешиваться в течение 2 дней, в течение которых водородный шар время от времени перезаполняли. Через около 48 часов анализ ВЭЖХ-МС показал, что исходного материала не осталось. Реакционную смесь разбавляли метанолом (20 мл) и фильтровали через слой целита. Целит промывали метанолом (2×50 мл). Все фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении, полученное масло растворяли и концентрировали из дихлорметана. После сушки при пониженном давлении указанное в заголовке соединение выделяли в виде бесцветного порошка (3,10 г, 99%). МС m/z набл.=722,6 (М+1).

G. (S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((4-(2,2,2-трифторацетамидо)фенил)сульфонамидо)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид (Соединение 8)

[00317] К перемешиваемому раствору N,N-(L)-диметилвалина (1,696 г, 9,35 ммоль) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли HATU (3,216 г, 8,46 ммоль) и диизопропилэтиламин (3,10 мл, 17,8 ммоль). Через 5 минут образовывался прозрачный желтый раствор. Перемешивание продолжали в течение дополнительных 10 минут, затем добавляли Соединение 7а (3,213 г, 4,45 ммоль) одной порцией. После дополнительного 1 часа перемешивания ВЭЖХ-МС показала, что остались следовые количества Соединения 7а, и реакцию продолжали в течение 16 часов. Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, разбавляли этилацетатом (120 мл) и 40 мл 1:1 NaHCO₃ (насыщ.): 5% LiCl и переносили в делительную воронку. Водный слой удаляли, а органическую фазу промывали LiCl (1×20 мл), NаНСО₃ (насыщ., 2×20 мл). Водные слои объединяли и экстрагировали EtOAc (3×50 мл). Органические слои объединяли и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (1×20 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением масла с ДМФА, которое концентрировали с помощью роторного испарителя для удаления остаточного ДМФА, получая 7 г сырого масла соломенного цвета. Масло растворяли в минимальном количестве 10% метанола в дихлорметане (~11 мл) и загружали на колонку с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 360 г для очистки (2-20% МеОН в СН₂Сl₃ более 15 объемов колонки, продукт элюируется при около 10-13%). Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветной пены. Загрязненные фракции объединяли, упаривали и подвергали повторной очистке на колонке с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 100 г на приборе Isolera™ и объединяли с чистым продуктом из первой колонки с получением бесцветной твердой пены (3,78 г). МС m/z набл.=850,6 (М+1).

Н. (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-аминофенил)сульфонамидо)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метбил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамид (Соединение 9)

[00318] К перемешиваемому раствору Соединения 8 (0,980 г, 1,154 ммоль) в 1,4-диоксане (15 мл) добавляли воду (3,5 мл) и 1 М моногидрат гидр оксида лития (3 экв., 3,46 мл). Полученной легкой суспензии давали возможность перемешиваться при 4°С и исчезновение исходного материала контролировали с помощью ВЭЖХ-МС. Когда конверсия была завершена (~5 дней), реакцию нейтрализовали 3,46 мл 1 М HCl и концентрировали при пониженном давлении для удаления диоксана. Полученную водную фазу разбавляли 60 мл EtOAc и 5 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, затем экстрагировали этилацетатом (2×30 мл). Органические фракции объединяли, сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества желто-коричнев ого цвета (0,930 г). Rf=0,5 (8% MeОН в CH₂Cl₂). МС m/z набл.=753,7 (М+1).

I. 2,3,5,6-тетрафторфенил 3-(2-(2-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси)этокси)этокси)пропаноит (Соединение 15)

[00319] В высушенную коническую колбу на 50 мл помещали 3-(2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)этокси)пропаловую кислоту (Соединение 14, 1,000 г, 4,52 ммоль) и малеиновый ангидрид (0,443 г, 4,52 ммоль) растворяли в безводном N,N-диметилформамиде (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов в атмосфере N₂, после чего ее охлаждали до 0°С и по каплям добавляли син-коллидин (1,263 мл, 2,1 экв.). В отдельной высушенной конической колбе на 50 мл растворяли тетрафторфенол (3,002 г, 4 экв.) в безводном N,N-диметилформамиде (10 мл). Колбу охлаждали до 0°С на ледяной бане и по каплям добавляли трифторуксусный ангидрид (2,548 мл, 4 экв.). Колбу перемешивали в течение 15 минут, после чего по каплям добавляли син-ко ллидин (2,407 мл, 4 экв.). Колбе давали возможность перемешиваться еще 15 минут, а затем содержимое добавляли по каплям в первую колбу с помощью шприца. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и продолжали перемешивание в атмосфере N₂. За реакцией следили с помощью ВЭЖХ-МС за исчезновением исходного материала. Через 6 дней реакция была завершена с полным исчезновением Соединения 14, осталось только Соединение 15 и небольшое количество (~5%) промежуточного бис-TFP малеинового амида. Реакционную смесь переносили в делительную воронку, разбавляли диэтиловым эфиром (75 мл) и промывали 5% LiCl (1×20 мл), 1 М HCl (2×20 мл), насыщ. NaHCO₃ (5×20 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (1×20 мл). Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и упаривали, получая коричневое сырое масло с остаточным содержанием ДМФА. Неочищенное масло растворяли в 8 мл ДМФА; Н₂О+0,1% ТФК (1:1), загружали на 60 г колонку Biotage® SNAP Ultra С18 (Biotage AB, Упсала, Швеция) и очищали линейным градиентом 30-100% ACN/H₂O+0,1% ТФК в течение 8 объемов колонки. Чистые фракции объединяли и разбавляли насыщенным водным раствором хлорида натрия (20 мл), затем экстрагировали Еt₂О 3 раза по 50 мл. Объединенные органические слои сушили над MgSO₄, фильтровали и упаривали, получая светло-желтое масло (1,34 г, выход 66%).

J. Трет-бутил ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метбилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)сульфамоил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метбил-1-оксобутан-2-ил)карбамат (Соединение 12)

[00320] Соединение 11 получали, как описано в публикации международной патентной заявки № WO 2016/041082.

[00321] В пустую колбу грушевидной формы на 25 мл добавляли Соединение 11 (1,342 г, 3,58 ммоль, 3,0 экв.), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (0,664 г, 3,46 ммоль, 2,9 эквив) и 7-гидроксиазабензотриазол (НОАТ) (0,472 г, 3,46 ммоль, 2,9 экв.). Эти твердые вещества растворяли в смеси N,N-диметилформамида (0,5 мл) и дихлорметана (4,5 мл) при перемешивании при комнатной температуре в течение 30 минут. Отдельно Соединение 9 (0,900 г, 1,20 ммоль) растворяли в смеси N,N-диметилформамида (0,2 мл) и дихлорметана (1,8 мл) и добавляли в грушевидную колбу, промывая дихлорметаном (1,0 мл). Скорость перемешивания увеличивали до 1000 об/мин, создавая вихрь. В течение 2 минут после добавления Соединения 9 хлорид меди (II) (0,514 г, 3,83 ммоль, 3,2 экв.) добавляли одной порцией непосредственно в центр вихря через узкую воронку для порошка. Первоначально светло-желтый раствор превратился в темно-коричневую суспензию, которая за 10 минут превратилась в темно-зеленую суспензию. Завершение реакции контролировали с помощью ВЭЖХ-МС, и не наблюдалось никаких изменений в ходе реакции между образцами, взятыми через 30 минут и 1 час (завершение ~95%). Реакционной смеси давали перемешиваться в течение ночи при комнатной температуре, затем к перемешиваемой суспензии добавляли 2-(2-аминоэтиламино)этанол (0,483 мл, 4,781 ммоль, 4 экв.), EtOAc (10 мл) и дH₂O (5 мл), при этом цвет суспензии изменился на темно-синий. Суспензию интенсивно перемешивали в течение 4 часов, пока взвешенные твердые частицы постепенно растворялись в двухфазной смеси. Эту смесь переносили в делительную воронку и разбавляли EtOAc (100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), и водный слой экстрагировали 10% IpOH/EtOAc (4×50 мл). Органические слои объединяли и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над Na₂SO₄ и упаривали с получением неочищенного твердого вещества бледно-голубого цвета. Это неочищенное твердое вещество растворяли в смеси метанола (0,5 мл) и дихлорметана (6 мл) и очищали на колонке с силикагелем Biotage® SNAP Ultra 100 г (2-20% МеОН в CH₂Cl₂ в течение более чем 10 объемов колонки, с плато на протяжении 8 объемов колонки при 20% МеОН). Продукт элюировался в виде широкого пика после 1-2 объемов колонки при ~20% МеОН в СН₂Сl₂. Фракции, содержащие желаемый материал, объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (1,105 г, 83%). МС m/z набл.=555,9 ((М+2)/2), 1109,8 (М+1).

K. (S)-2-((S)-2-амино-3-метбилбутанамидо)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)сульфамоил)фенил)-5-уреидопентанамид (Соединение 13)

[00322] К раствору Соединения 12 (0,926 г, 0,834 ммоль) добавляли смесь дихлорметана (10 мл) и трифторуксусной кислоты (2,0 мл). За реакцией следили с помощью ВЭЖХ-МС за исчезновением исходного материала (~ 45 минут). Реакционную смесь упаривали совместно с ацетонитрилом (2×10 мл) и дихлорметаном (2×10 мл) при пониженном давлении для удаления избытка трифторуксусной кислоты. Полученный остаток растворяли в минимальном количестве дихлорметана и метанола (3:1, об./об., ~2 мл) и добавляли к перемешиваемому раствору диэтилового эфира (200 мл) и гексана (100 мл) по каплям с помощью пипетки, с получением суспензии из легких белых твердых частиц. Твердые вещества фильтровали и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде белого порошка в виде трифторацетатной соли (1,04 г, количественный выход с некоторыми остаточными растворителями). МС m/z набл.=505,8 ((М+2)/2).

L. (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метбилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метбилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метбилпропаноил)сульфамоил)фенил)-2-((S)-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-14-изопропил-12-оксо-3,6,9-триокса-13-азапентадеканамидо)-5-уреидопентанамид (Линкер-Токсин 001)

[00323] К перемешиваемому раствору Соединения 13 (0,722 г, 0,584 ммоль) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли Соединение 15 (0,314 г, 1,2 экв.) и диизопропилэтиламин (0,305 мл, 3,0 экв.). Анализ ВЭЖХ-МС через 2 часа показал, что исходного материала не осталось. Реакционную смесь подкисляли ТФК (300 мкл), а затем разбавляли дН2O+0,1% ТФК (9 мл). Полученный раствор загружали на колонку 120 г Biotage® SNAP Ultra C18 (Biotage, Упсала, Швеция) и очищали в градиенте ACN/H₂O+0,1% ТФК: 20-60% ACN в течение более 10 объемов колонки, 60-100% ACN в течение более 5 объемов колонки. Продукт элюировался при около 40% ACN. Чистые фракции, идентифицированные с помощью ЖХМС, объединяли и лиофилизировали. Белый твердый порошок извлекали из лиофилизатора Лиофилизацию повторяли при более высокой концентрации (приблизительно 50 мг/мл в 2:1 H₂O/ACN) во флаконе для получения более плотного лиофилизировэнного твердого вещества с меньшим количеством флокулянтов (754,2 мг, 91%). МС m/z набл.=647,4 ((М+2)/2), 1292,8 (М+1).

Пример 4: Получение v10000, конъютированного с Линкер-Токсином 001

[00324] рН раствора (13 8,9 мл) антитела v10000 (2,0 г) в 10 мМ ацетате натрия, 9% (мас./об.) сахарозе, доводили до рН 4,5 добавлением 200 мМ Na₂HPO₄, рН 8,9 (15,4 мл). После добавления раствора DTPA (44 мл в ФСБ, рН 7,4, конечная концентрация 1,0 мМ) инициировали восстановление межцепочечных дисульфидов путем добавления 10 мМ водного раствора ТСЕР (1,68 мл, 1,05 экв.). Через 90 минут при 37°С реакционную смесь охлаждали на льду перед добавлением избытка Линкер-Токсина 001 (4,81 мл; 6 экв.) в виде 20 мМ исходного раствора в ДМСО. Реакцию конъюгирования останавливали через 90 минут добавлением избытка 20 мМ раствора N-ацетилцистеина (4,81 мл; 6 экв.).

[00325] Раствор полученного конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС) очищали с помощью 9-15 диаобъемов 10 мМ ацетата натрия, 9% (мас./об.) сахарозы, рН 4,5 на приборе для фильтрования с тангенциальным потоком Millipore Labscale™ с использованием модуля ультрафильтрования Pellicon® XL (Ultracel® 30 кДа 0,005 м²; Millipore Sigma). Элюированный КАЛС стерильно фильтровали (0,22 мкм). КАЛС, полученные в небольшом масштабе, очищали на колонках MWCO Zeba™ 40 кДа (ThermoFisher Scientific, Волтам, Массачусетс), предварительно обработанных либо ФСБ, либо 10 мМ ацетатом натрия, 9% (мас./об.) сахарозой, рН 4,5.

[00326] После очистки концентрацию КАЛС определяли с помощью анализа ВСА со ссылкой на стандартную кривую, построенную для v10000. Альтернативно, концентрации оценивали путем измерения поглощения при 280 нм (ε=195065 М^-1 см^-1).

[00327] Образцы КАЛС оценивали по невосстановленному и восстановленному SDS-PAGE. Никаких посторонних полос не наблюдалось.

[00328] Антитело и КАЛС анализировали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) для оценки отношения лекарственное средство/антитело (DAR). Хроматографию проводили на колонке Proteomix® HIC Ethyl (7,8×50 мм, 5 мкм) (Sepax Technologies Inc., Ньюарк, Делавэр) с использованием градиента от 80% MP А/20% МРВ до 35% МРА/65% МРВ в течение 13,5 мин при скорости потока 1 мл/мин (МРА=1,5 М (NH₄)₂SО₄, 25 мМ Na_xPО₄ и МРВ=75% 25 мМ Na_xPО₄, 25% изопропанол).

[00329] Среднее отношение лекарственного средства к антителу (DAR) КАЛС может варьироваться в зависимости от количества дисульфидных связей, высвобождаемых во время восстановления антитела. Одна реакция конъюгирования, которая дает КАЛС с конкретным средним DAR, включает смесь видов. Для v 10000, конъюгированного с Линкер-Токсином 001, приводила к смеси четырех видов: неконъюгированное антитело, КАЛС с DAR, равным 2, КАЛС с DAR, равным 4, и КАЛС с DAR, равным 6.

[00330] Результаты HIC показали, что КАЛС, содержащий v 10000, конъюгированный с Линкер-Токсином 001, имел среднее DAR 2,07. Индивидуальные вклады видов DAR0, DAR2, DAR4 и DAR6 в среднее DAR очищенного КАЛС оценивали путем интегрирования хроматограммы ВЭЖХ-HIC. Каждый пик на хроматограмме HIC выделяли препаративной хроматографией, а идентичность пика проверяли с помощью ЖХ-МС. Процентное содержание отдельных видов DAR для каждого варианта (как определено HIC) показано в Таблице G.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗАЙМВОРКС БИОФАРМАСЬЮТИКАЛС ИНК.

<120> СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ

КОНСТРУКЦИИ,

НАЦЕЛЕННОЙ НА HER2, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ

ЖЕЛЧНЫХ ПРОТОКОВ

<130> ZYME063WO

<160> 72

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 607

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HER2

<400> 1

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser

1 5 10 15

Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln

20 25 30

Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser

35 40 45

Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile

50 55 60

Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val

65 70 75 80

Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp

85 90 95

Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro

100 105 110

Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys

115 120 125

Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr

130 135 140

Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr

145 150 155 160

Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met

165 170 175

Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser

180 185 190

Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro

195 200 205

Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

210 215 220

Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

225 230 235 240

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr

245 250 255

Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser

260 265 270

Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser

275 280 285

Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp

290 295 300

Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys

305 310 315 320

Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser

325 330 335

Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu

340 345 350

Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala

355 360 365

Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile

370 375 380

Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu

385 390 395 400

Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn

405 410 415

Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly

420 425 430

Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His

435 440 445

Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe

450 455 460

Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp

465 470 475 480

Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly

485 490 495

His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe

500 505 510

Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu

515 520 525

Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu

530 535 540

Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp

545 550 555 560

Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala

565 570 575

Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp

580 585 590

Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn

595 600 605

<210> 2

<211> 217

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Человеческий IgG1 Fc

<400> 2

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 3

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3468 Полный

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 4

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3468 Полный

<400> 4

gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg

60

tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca

120

cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac

180

aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat

240

ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg

300

gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc

360

tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga

420

actgcagccc tgggctgtct ggtgaagggc tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg

480

aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgaa gtcaagcggg

540

ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat

600

atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag

660

tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca

720

agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa

780

gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac

840

gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt

900

acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag

960

tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag

1020

gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg

1080

acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct

1140

gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg

1200

gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag

1260

caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag

1320

aagtcactgt cactgtcacc aggg

1344

<210> 5

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3468 VH

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057,3317 CDRH1, клон H2 3468,3041 CDRH1

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057,3317 CDRH3, клон H2 3468,3041 CDRH3

<400> 7

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057,3317 CDRH2, клон H2 3468,3041 CDRH2

<400> 8

Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 9

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Kлон L2 1811 полный

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 10

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Kлон L2 1811 полный

<400> 10

gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc

60

atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca

120

ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct

180

agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct

240

gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccatatac ctttggccag

300

gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct

360

tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac

420

cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag

480

gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact

540

ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg

600

ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt

642

<210> 11

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L2 1811 VL

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны L2 1811, 3904 CDRL1 и клон H1 3317 CDRL1

<400> 12

Gln Asp Val Ser Ile Gly

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны L3 1811, 3904 CDRL3 и клон H1 3317 CDRL3

<400> 13

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 14

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны L2 1811, 3904 CDRL2 и клон H1 3317 CDRL2

<400> 14

Ser Ala Ser

1

<210> 15

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5034 полный

<400> 15

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

1 5 10 15

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

20 25 30

Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

35 40 45

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100 105 110

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 16

<211> 666

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5034 полный

<400> 16

gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc

60

gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca

120

gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca

180

ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca

240

ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat

300

accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct

360

ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg

420

gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac

480

gctctgcaga gtggcaacag ccaggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact

540

tatagtctgt caagcaccct gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat

600

gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg

660

gagtgc

666

<210> 17

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5034 VL

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 полный

<400> 18

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro

1 5 10 15

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg

20 25 30

Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

35 40 45

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

100 105 110

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Lys Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 19

<211> 666

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 полный

<400> 19

gactacaaag acgacgatga caaagatatc cagatgaccc agtcccctag ctccctgtcc

60

gcttctgtgg gcgatagggt cactattacc tgccgcgcat ctcaggacgt gaacaccgca

120

gtcgcctggt accagcagaa gcctgggaaa gctccaaagc tgctgatcta cagtgcatca

180

ttcctgtatt caggagtgcc cagccggttt agcggcagca gatctggcac cgatttcaca

240

ctgactattt ctagtctgca gcctgaggac tttgccacat actattgcca gcagcactat

300

accacacccc ctactttcgg ccaggggacc aaagtggaga tcaagcgaac tgtggccgct

360

ccaagtgtct tcatttttcc acccagcgat gaaagactga agtccggcac agcttctgtg

420

gtctgtctgc tgaacaattt ttaccccaga gaggccaaag tgcagtggaa ggtcgacaac

480

gctctgcaga gtggcaacag caaggagagc gtgacagaac aggattccaa agactctact

540

tatagtctgt caagcagact gacactgagc aaggcagact acgaaaagca taaagtgtat

600

gcctgtgagg tcacacatca ggggctgtca tcaccagtca ccaaatcatt caatcggggg

660

gagtgc

666

<210> 20

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 VL

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 CDRL1

<400> 21

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 CDRL3

<400> 22

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 23

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 5037 CDRL2

<400> 23

Ser Ala Ser

1

<210> 24

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 полный

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 полный

<400> 25

gatattcaga tgacccagtc cccaagctcc ctgagtgcct cagtgggcga ccgagtcacc

60

atcacatgca aggcttccca ggatgtgtct attggagtcg catggtacca gcagaagcca

120

ggcaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctacc ggtataccgg cgtgccctct

180

agattctctg gcagtgggtc aggaacagac tttactctga ccatctctag tctgcagcct

240

gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag tactatatct acccagccac ctttggccag

300

gggacaaaag tggagatcaa gaggactgtg gccgctccct ccgtcttcat ttttccccct

360

tctgacgaac agctgaaaag tggcacagcc agcgtggtct gtctgctgaa caatttctac

420

cctcgcgaag ccaaagtgca gtggaaggtc gataacgctc tgcagagcgg caacagccag

480

gagtctgtga ctgaacagga cagtaaagat tcaacctata gcctgtcaag cacactgact

540

ctgagcaagg cagactacga gaagcacaaa gtgtatgcct gcgaagtcac acatcagggg

600

ctgtcctctc ctgtgactaa gagctttaac agaggagagt gt

642

<210> 26

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 VL

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 CDRL1

<400> 27

Gln Asp Val Ser Ile Gly

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 CDRL3

<400> 28

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Ala Thr

1 5

<210> 29

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L1 3382 CDRL2

<400> 29

Ser Ala Ser

1

<210> 30

<211> 449

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5065 полный

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 31

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5065 полный

<400> 31

gaggtgcagc tggtcgaaag cggaggagga ctggtgcagc caggagggtc actgcgactg

60

agctgcgcag cttccggctt caacatcaag gacacctaca ttcactgggt ccgccaggct

120

cctggaaaag gcctggagtg ggtggcacga atctatccaa ctaatggata cacccggtat

180

gccgactccg tgaagggccg gttcaccatt tctgcagata caagtaaaaa cactgcctac

240

ctgcagatga acagcctgcg agccgaagat acagccgtgt actattgcag ccgatgggga

300

ggcgacggct tctacgctat ggattattgg gggcagggaa ccctggtcac agtgagctcc

360

gcatcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggccccct ctagtaaatc cacctctggg

420

ggaacagcag ccctgggatg tgaggtgacc gactacttcc cagagcccgt cactgtgagc

480

tggaactccg gcgccctgac atctggggtc catacttttc ctgctgtgct gcagtcaagc

540

ggcctgtaca gcctgtcctc tgtggtcact gtgccaagtt caagcctggg gactcagacc

600

tatatctgca acgtgaatca caagccatcc aataccaaag tcgacaagaa agtggaaccc

660

aagtcttgtg ataaaacaca tacttgcccc ccttgtcctg caccagagct gctgggagga

720

ccaagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgattag taggactcca

780

gaagtcacct gcgtggtcgt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg

840

tacgtggatg gcgtcgaggt gcataatgcc aagacaaaac ccagggagga acagtacaac

900

tccacttatc gcgtcgtgtc tgtcctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag

960

gagtataagt gcaaagtgag caataaggct ctgcccgcac ctatcgagaa aacaatttcc

1020

aaggctaaag ggcagcctag agaaccacag gtgtacgtgt accctccatc tagggacgag

1080

ctgaccaaga accaggtcag tctgacatgt ctggtgaaag ggttctatcc cagcgatatc

1140

gcagtggagt gggaatccaa tggacagcct gagaacaatt acaagaccac accccctgtg

1200

ctggactctg atggaagttt cgccctggtg agtaagctga ccgtcgataa atcacggtgg

1260

cagcagggca acgtgttcag ctgttcagtg atgcacgaag cactgcacaa ccactacacc

1320

cagaaaagcc tgtccctgtc ccccggc

1347

<210> 32

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5065 VH

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H1 5065, 719 CDRH1 и клон H2 720 CDRH1

<400> 33

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 34

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H1 5065, 719 CDRH3 и клон H2 720 CDRH3

<400> 34

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 35

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H1 5065, 719 CDRH2 и клон H2 720 CDRH2

<400> 35

Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 36

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 полный

<400> 36

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 37

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 полный

<400> 37

gaggtgcagc tggtggaatc aggagggggc ctggtgcagc ccggagggtc tctgcgactg

60

tcatgtgccg cttctgggtt cactttcgca gactacacaa tggattgggt gcgacaggcc

120

cccggaaagg gactggagtg ggtgggcgat gtcaacccta attctggcgg gagtatctac

180

aaccagcggt tcaaggggag attcactttt tcagtggaca gaagcaaaaa caccctgtat

240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaagat accgctgtct actattgcgc tcgcaatctg

300

ggccccagtt tctactttga ctattggggg cagggaaccc tggtgacagt cagctccgct

360

agcactaagg ggccttccgt gtttccactg gctccctcta gtaaatccac ctctggaggc

420

acagctgcac tgggatgtct ggtgaaggat tacttccctg aaccagtcac agtgagttgg

480

aactcagggg ctctgacaag tggagtccat acttttcccg cagtgctgca gtcaagcgga

540

ctgtactccc tgtcctctgt ggtcaccgtg cctagttcaa gcctgggcac ccagacatat

600

atctgcaacg tgaatcacaa gccatcaaat acaaaagtcg acaagaaagt ggagcccaag

660

agctgtgata aaactcatac ctgcccacct tgtccggcgc cagaactgct gggaggacca

720

agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gacaccctga tgatttcccg gactcctgag

780

gtcacctgcg tggtcgtgga cgtgtctcac gaggaccccg aagtcaagtt caactggtac

840

gtggatggcg tcgaagtgca taatgccaag accaaacccc gggaggaaca gtacaactct

900

acctatagag tcgtgagtgt cctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa tgggaaggag

960

tataagtgta aagtgagcaa caaagccctg cccgccccaa tcgaaaaaac aatctctaaa

1020

gcaaaaggac agcctcgcga accacaggtc tacgtctacc ccccatcaag agatgaactg

1080

acaaaaaatc aggtctctct gacatgcctg gtcaaaggat tctacccttc cgacatcgcc

1140

gtggagtggg aaagtaacgg ccagcccgag aacaattaca agaccacacc ccctgtcctg

1200

gactctgatg ggagtttcgc tctggtgtca aagctgaccg tcgataaaag ccggtggcag

1260

cagggcaatg tgtttagctg ctccgtcatg cacgaagccc tgcacaatca ctacacacag

1320

aagtccctga gcctgagccc tggc

1344

<210> 38

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 VH

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 CDRH1

<400> 39

Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr

1 5

<210> 40

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 CDRH3

<400> 40

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 6586 CDRH2

<400> 41

Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 42

<211> 226

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L2 3904 полный

<400> 42

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Gly Ser Asp Ile Gln Met

1 5 10 15

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

20 25 30

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr

35 40 45

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser

50 55 60

Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

65 70 75 80

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

85 90 95

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

115 120 125

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

130 135 140

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

145 150 155 160

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu Glu Ser Val Thr

165 170 175

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Glu

180 185 190

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

195 200 205

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

210 215 220

Glu Cys

225

<210> 43

<211> 678

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L2 3904 полный

<400> 43

tatccctacg atgtgcctga ctacgctact ggctccgata tccagatgac ccagtctcca

60

agctccctga gtgcatcagt gggggaccga gtcaccatca catgcaaggc ttcccaggat

120

gtgtctattg gagtcgcatg gtaccagcag aagccaggca aagcacccaa gctgctgatc

180

tacagcgcct cctaccggta tactggggtg ccttccagat tctctggcag tgggtcagga

240

accgacttta ctctgaccat ctctagtctg cagcccgagg atttcgccac ctactattgc

300

cagcagtact atatctaccc ttataccttt ggccagggga caaaagtgga gatcaagagg

360

acagtggccg ctccaagtgt cttcattttt cccccttccg acgaagagct gaaaagtgga

420

actgcttcag tggtctgtct gctgaacaat ttctaccccc gcgaagccaa agtgcagtgg

480

aaggtcgata acgctctgca gagcggcaat tccgaggagt ctgtgacaga acaggacagt

540

aaagattcaa cttatagcct gtcaagcaca ctggagctgt ctaaggcaga ctacgagaag

600

cacaaagtgt atgcctgcga agtcacccat caggggctgt cctctcccgt gacaaagagc

660

tttaacagag gagagtgt

678

<210> 44

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон L2 3904 VL

<400> 44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 481

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 719 полный

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

245 250 255

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

275 280 285

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

290 295 300

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

305 310 315 320

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

325 330 335

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

340 345 350

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

370 375 380

Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

385 390 395 400

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

405 410 415

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

420 425 430

Asp Glu Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

435 440 445

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

450 455 460

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475 480

Lys

<210> 46

<211> 1443

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 719 полный

<400> 46

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca

180

aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct

240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa

300

gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt

360

ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag

420

cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat

480

atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc

540

acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac

600

acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt

660

tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg

720

accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc

780

cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag

840

ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg

900

tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat

960

gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg

1020

accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag

1080

gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc

1140

caggtgtaca catacccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgaca

1200

tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag

1260

ccagagaaca attacaagac cacacctcca gtgctggacg aggatggcag cttcgccctg

1320

gtgtccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca

1380

gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc

1440

aaa

1443

<210> 47

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 719 VL

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 719 VH

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 49

<211> 481

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 720 полный

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

245 250 255

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

275 280 285

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

290 295 300

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

305 310 315 320

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

325 330 335

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

340 345 350

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

370 375 380

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ile

385 390 395 400

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

405 410 415

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Arg Tyr Met Thr Trp Pro Pro Val Leu

420 425 430

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

435 440 445

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

450 455 460

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475 480

Lys

<210> 50

<211> 1443

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 720 полный

<400> 50

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgcc gggcaagtca ggacgttaac accgctgtag cttggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagctcct gatctattct gcatcctttt tgtacagtgg ggtcccatca

180

aggttcagtg gcagtcgatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct

240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattacacta ccccacccac tttcggccaa

300

gggaccaaag tggagatcaa aggtggttct ggtggtggtt ctggtggtgg ttctggtggt

360

ggttctggtg gtggttctgg tgaagtgcag ctggtggagt ctgggggagg cttggtacag

420

cctggcgggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaacattaa agatacttat

480

atccactggg tccggcaagc tccagggaag ggcctggagt gggtcgcacg tatttatccc

540

acaaatggtt acacacggta tgcggactct gtgaagggcc gattcaccat ctccgcagac

600

acttccaaga acaccgcgta tctgcaaatg aacagtctga gagctgagga cacggccgtt

660

tattactgtt caagatgggg cggagacggt ttctacgcta tggactactg gggccaaggg

720

accctggtca ccgtctcctc agccgccgag cccaagagca gcgataagac ccacacctgc

780

cctccctgtc cagctccaga actgctggga ggacctagcg tgttcctgtt tccccctaag

840

ccaaaagaca ctctgatgat ttccaggact cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg

900

tctcacgagg accccgaagt gaagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga agtgcataat

960

gctaagacaa aaccaagaga ggaacagtac aactccactt atcgcgtcgt gagcgtgctg

1020

accgtgctgc accaggactg gctgaacggg aaggagtata agtgcaaagt cagtaataag

1080

gccctgcctg ctccaatcga aaaaaccatc tctaaggcca aaggccagcc aagggagccc

1140

caggtgtaca cactgccacc cagcagagac gaactgacca agaaccaggt gtccctgatc

1200

tgtctggtga aaggcttcta tcctagtgat attgctgtgg agtgggaatc aaatggacag

1260

ccagagaaca gatacatgac ctggcctcca gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg

1320

tattccaagc tgacagtgga taaatctcga tggcagcagg ggaacgtgtt tagttgttca

1380

gtgatgcatg aagccctgca caatcattac actcagaaga gcctgtccct gtctcccggc

1440

aaa

1443

<210> 51

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 720 VL

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 720 VH

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 53

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3041 полный

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 54

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3042 полный

<400> 54

gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg

60

tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca

120

cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac

180

aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat

240

ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg

300

gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc

360

tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga

420

actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg

480

aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg

540

ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat

600

atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag

660

tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca

720

agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa

780

gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac

840

gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt

900

acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag

960

tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag

1020

gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgctgc ctccatcaag ggatgagctg

1080

acaaagaacc aggtcagcct gctgtgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct

1140

gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattacc tgacctggcc ccctgtgctg

1200

gactcagatg gcagcttctt tctgtatagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag

1260

caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag

1320

aagtcactgt cactgtcacc aggg

1344

<210> 55

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 3041 VH

<400> 55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057 полный

<400> 56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

340 345 350

Tyr Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 57

<211> 1344

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057 полный

<400> 57

gaagtgcagc tggtcgaatc tggaggagga ctggtgcagc caggagggtc cctgcgcctg

60

tcttgcgccg ctagtggctt cacttttacc gactacacca tggattgggt gcgacaggca

120

cctggaaagg gcctggagtg ggtcgccgat gtgaacccaa atagcggagg ctccatctac

180

aaccagcggt tcaagggccg gttcaccctg tcagtggacc ggagcaaaaa caccctgtat

240

ctgcagatga atagcctgcg agccgaagat actgctgtgt actattgcgc ccggaatctg

300

gggccctcct tctactttga ctattggggg cagggaactc tggtcaccgt gagctccgcc

360

tccaccaagg gaccttctgt gttcccactg gctccctcta gtaaatccac atctggggga

420

actgcagccc tgggctgtct ggtgaaggac tacttcccag agcccgtcac agtgtcttgg

480

aacagtggcg ctctgacttc tggggtccac acctttcctg cagtgctgca gtcaagcggg

540

ctgtacagcc tgtcctctgt ggtcaccgtg ccaagttcaa gcctgggaac acagacttat

600

atctgcaacg tgaatcacaa gccatccaat acaaaagtcg acaagaaagt ggaacccaag

660

tcttgtgata aaacccatac atgcccccct tgtcctgcac cagagctgct gggaggacca

720

agcgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa gatacactga tgattagtag gaccccagaa

780

gtcacatgcg tggtcgtgga cgtgagccac gaggaccccg aagtcaagtt taactggtac

840

gtggacggcg tcgaggtgca taatgccaag actaaaccca gggaggaaca gtacaacagt

900

acctatcgcg tcgtgtcagt cctgacagtg ctgcatcagg attggctgaa cgggaaagag

960

tataagtgca aagtgagcaa taaggctctg cccgcaccta tcgagaaaac aatttccaag

1020

gcaaaaggac agcctagaga accacaggtg tacgtgtatc ctccatcaag ggatgagctg

1080

acaaagaacc aggtcagcct gacttgtctg gtgaaaggat tctatccctc tgacattgct

1140

gtggagtggg aaagtaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc ccctgtgctg

1200

gactcagatg gcagcttcgc gctggtgagc aagctgaccg tcgacaaatc ccggtggcag

1260

caggggaatg tgtttagttg ttcagtcatg cacgaggcac tgcacaacca ttacacccag

1320

aagtcactgt cactgtcacc aggg

1344

<210> 58

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3057 VH

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 475

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3317 полный

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn

165 170 175

Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu

180 185 190

Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro

210 215 220

Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp

370 375 380

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 60

<211> 1425

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3317 полный

<400> 60

gacattcaga tgacccagag ccctagctcc ctgagtgcct cagtcgggga cagggtgact

60

atcacctgca aggcttcaca ggatgtcagc attggcgtgg catggtacca gcagaagcca

120

gggaaagcac ccaagctgct gatctatagc gcctcctaca ggtatacagg cgtgccatcc

180

cgcttctctg gcagtgggtc aggaactgac tttacactga ctatttctag tctgcagccc

240

gaagatttcg ccacatacta ttgccagcag tactatatct acccttatac ttttggccag

300

gggaccaaag tggagattaa gggcggagga ggctccggag gaggagggtc tggaggagga

360

ggaagtgagg tccagctggt ggaatctgga ggaggactgg tgcagccagg agggtccctg

420

aggctgtctt gtgccgctag tggcttcacc tttacagact acacaatgga ttgggtgcgc

480

caggcaccag gaaagggact ggaatgggtc gctgatgtga accctaatag cggaggctcc

540

atctacaacc agcggttcaa aggacggttc accctgtcag tggaccggag caagaacacc

600

ctgtatctgc agatgaacag cctgagagcc gaggatactg ctgtgtacta ttgcgccagg

660

aatctgggcc caagcttcta ctttgactat tgggggcagg gaacactggt cactgtgtca

720

agcgcagccg aacccaaatc ctctgataag actcacacct gcccaccttg tccagctcca

780

gagctgctgg gaggacctag cgtgttcctg tttccaccca agccaaaaga cactctgatg

840

atttctagaa cccctgaagt gacatgtgtg gtcgtggacg tcagtcacga ggaccccgaa

900

gtcaaattca actggtacgt ggatggcgtc gaggtgcata atgccaagac caaaccccga

960

gaggaacagt acaactcaac ctatcgggtc gtgagcgtcc tgacagtgct gcatcaggac

1020

tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaaa gtgagcaaca aggctctgcc tgcaccaatc

1080

gagaagacca tttccaaggc taaagggcag ccccgcgaac ctcaggtcta cgtgtatcct

1140

ccaagccgag atgagctgac aaaaaaccag gtctccctga cttgtctggt gaagggattt

1200

tacccaagtg acatcgcagt ggagtgggaa tcaaatggcc agcccgaaaa caattataag

1260

accacacccc ctgtgctgga ctctgatggg agtttcgcac tggtctccaa actgaccgtg

1320

gacaagtctc ggtggcagca gggaaacgtc tttagctgtt ccgtgatgca cgaggccctg

1380

cacaatcatt acacacagaa atctctgagt ctgtcacctg gcaag

1425

<210> 61

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3317 VL

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 3317 VH

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 480

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 5244 полный

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

145 150 155 160

Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser

210 215 220

Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys

245 250 255

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

275 280 285

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

290 295 300

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

305 310 315 320

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

325 330 335

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

340 345 350

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

355 360 365

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val

370 375 380

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu

385 390 395 400

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

405 410 415

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu

420 425 430

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

435 440 445

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

450 455 460

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

465 470 475 480

<210> 64

<211> 1440

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 5244 полный

<400> 64

gacattcaga tgacacagag ccccagctcc ctgagtgctt cagtcggcga cagggtgact

60

atcacctgcc gcgcatccca ggatgtcaac accgctgtgg catggtacca gcagaagcct

120

ggaaaagccc caaagctgct gatctacagc gcttccttcc tgtattctgg cgtgccaagt

180

cggttttctg gaagtagatc aggcactgac ttcacactga ctatctctag tctgcagccc

240

gaagattttg ccacctacta ttgccagcag cactatacca caccccctac attcggacag

300

ggcactaaag tggagattaa gggcgggtca ggcggaggga gcggaggagg gtccggagga

360

gggtctggag gagggagtgg agaggtccag ctggtggaat ctggaggagg actggtgcag

420

cctggaggct cactgcgact gagctgtgcc gcttccggct ttaacatcaa agacacatac

480

attcattggg tcaggcaggc accagggaag ggactggaat gggtggcccg catctatccc

540

acaaatgggt acactcgata tgccgacagc gtgaaaggac ggtttaccat ttctgctgat

600

accagtaaga acacagcata cctgcagatg aacagcctgc gcgcagagga tacagccgtg

660

tactattgca gtcgatgggg gggagacggc ttctacgcca tggattattg gggccagggg

720

actctggtca ccgtgtcaag cgcagccgaa cctaaatcct ctgacaagac ccacacatgc

780

ccaccctgtc ctgctccaga gctgctggga ggaccatccg tgttcctgtt tcctccaaag

840

cctaaagata cactgatgat tagccgcact cccgaagtca cctgtgtggt cgtggacgtg

900

tcccacgagg accccgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtcga ggtgcataat

960

gccaagacta aaccaagaga ggaacagtac aattcaacct atagggtcgt gagcgtcctg

1020

acagtgctgc atcaggattg gctgaacggc aaggagtata agtgcaaagt gtctaacaag

1080

gccctgcccg ctcctatcga gaagactatt agcaaggcaa aagggcagcc acgggaaccc

1140

caggtctacg tgctgccccc tagcagagac gagctgacca aaaaccaggt ctccctgctg

1200

tgtctggtga agggctttta tcctagtgat atcgctgtgg agtgggaatc aaatgggcag

1260

ccagaaaaca attacctgac atggccaccc gtgctggaca gcgatgggtc cttctttctg

1320

tattccaaac tgactgtgga caagtctaga tggcagcagg gaaacgtctt cagctgttcc

1380

gtgatgcacg aggccctgca caatcattac acccagaagt ctctgagtct gtcacccggc

1440

<210> 65

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 5244 VL

<400> 65

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 66

<211> 120

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H2 5244 VH

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H2 5244,720 CDRL1 и клон L1 5034 CDRL1 и клон H1 719

CDRL1

<400> 67

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 68

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H2 5244,720 CDRL2 и клон L1 5034 CDRL2 и клон H1 719

CDRL2

<400> 68

Ser Ala Ser

1

<210> 69

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клоны H2 5244,720 CDRL3 и клон L1 5034 CDRL3 и клон H1 719

CDRL3

<400> 69

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 70

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5244 CDRH1

<400> 70

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5244 CDRH2

<400> 71

Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 72

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Клон H1 5244 CDRH3

<400> 72

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии и гепатологии, включает способ лечения субъекта с онкологическим заболеванием желчевыводящей системы (ОЗЖС). Субъекту осуществляют введение эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или конъюгат антитело-лекарственного средства (КАЛС). Биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, тяжелую цепь H2 и легкую цепь L1, причем: a) тяжелая цепь Н1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41; b) тяжелая цепь H2 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72; и c) легкая цепь L1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29. Лекарственное средство в КАЛС содержит ауристатин или его аналог. Группа заявленных изобретений также включает применение биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС при приготовлении лекарственного средства для лечения ОЗЖС. Способ обеспечивает возможность лечения ОЗЖС у пациента за счет применения биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или КАЛС, содержащих заявленные нуклеотидные последовательности. 2 н. и 32 з.п. ф-лы, 2 ил., 12 табл., 4 пр.

1. Способ лечения субъекта с онкологическим заболеванием желчевыводящей системы (ОЗЖС), включающий введение субъекту эффективного количества биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС), причем биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, тяжелую цепь H2 и легкую цепь L1, причем: a) тяжелая цепь Н1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41; b) тяжелая цепь H2 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72; и c) легкая цепь L1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; и причем лекарственное средство в КАЛС содержит ауристатин или его аналог.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОЗЖС является операбельным, частично операбельным или неоперабельным.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ОЗЖС является ОЗЖС на поздней стадии.

4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что ОЗЖС представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖС, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и с амплифицированным геном HER2.

5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что ОЗЖС представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖС, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и с не амплифицированным геном HER2.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что ОЗЖС представляет собой онкологическое заболевание желчного пузыря.

7. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что ОЗЖС представляет собой холангиокарциному (CCA).

8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, тяжелую цепь H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и легкую цепь L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 10 мг/кг в неделю.

10. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20 мг/кг каждые две недели.

11. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 30 мг/кг каждые три недели.

12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что введение субъекту биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 приводит к полному ответу (CR), частичному ответу (PR) или стабилизации заболевания (SD) у субъекта.

13. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят после по меньшей мере одной, двух или трех терапий первой линии.

14. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве монотерапии первой линии.

15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве адъювантной терапии или неоадъювантной терапии.

16. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят вместе с одним или более химиотерапевтическими агентами.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что один или более химиотерапевтических агентов представляют собой гемцитабин и/или цисплатин.

18. Применение биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 или конъюгата антитело-лекарственное средство (КАЛС) при приготовлении лекарственного средства для лечения онкологического заболевания желчевыводящей системы (ОЗЖС), причем биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, тяжелую цепь H2 и легкую цепь L1, причем: a) тяжелая цепь Н1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41; b) тяжелая цепь H2 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 72; и c) легкая цепь L1 содержит последовательности CDR SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29; и причем лекарственное средство в КАЛС содержит ауристатин или его аналог.

19. Применение по п. 18, отличающееся тем, что ОЗЖС является операбельным, частично операбельным или неоперабельным.

20. Применение по п. 18, отличающееся тем, что ОЗЖС является ОЗЖС на поздней стадии.

21. Применение по любому из пп. 18-20, отличающееся тем, что ОЗЖС представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖС, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и с амплифицированным геном HER2.

22. Применение по любому из пп. 18-20, отличающееся тем, что ОЗЖС представляет собой HER2 3+, HER2 2+ или HER2 1+ ОЗЖС, как измерено с помощью иммуногистохимии (ИГХ), и с не амплифицированным геном HER2.

23. Применение по любому из пп. 18-22, отличающееся тем, что ОЗЖС представляет собой онкологическое заболевание желчного пузыря.

24. Применение по любому из пп. 18-22, отличающееся тем, что ОЗЖС представляет собой холангиокарциному (CCA).

25. Применение по любому из пп. 18-24, отличающееся тем, что биспецифическая антигенсвязывающая конструкция к HER2 содержит тяжелую цепь H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, тяжелую цепь H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и легкую цепь L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

26. Применение по любому из пп. 18-25, отличающееся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 10 мг/кг в неделю.

27. Применение по любому из пп. 18-25, отличающееся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 20 мг/кг каждые две недели.

28. Применение по любому из пп. 18-25, отличающееся тем, что эффективное количество биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 составляет 30 мг/кг каждые три недели.

29. Применение по любому из пп. 18-28, отличающееся тем, что введение субъекту биспецифической антигенсвязывающей конструкции к HER2 приводит к полному ответу (CR), частичному ответу (PR) или стабилизации заболевания (SD) у субъекта.

30. Применение по любому из пп. 18-28, отличающееся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят после по меньшей мере одной, двух или трех терапий первой линии.

31. Применение по любому из пп. 18-28, отличающееся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве монотерапии первой линии.

32. Применение по любому из пп. 18-31, отличающееся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят в качестве адъювантной терапии или неоадъювантной терапии.

33. Применение по любому из пп. 18-31, отличающееся тем, что биспецифическую антигенсвязывающую конструкцию к HER2 вводят вместе с одним или более химиотерапевтическими агентами.

34. Применение по п. 33, отличающееся тем, что один или более химиотерапевтических агентов представляют собой гемцитабин и/или цисплатин.