Штамм Amycolatopsis rifamycinica - продуцент антибиотика тетраценомицина Х Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 C12R1/01 

Область техники

Изобретение относится к микробной биотехнологии, микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма вида Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086, продуцирующего тетраценомицин X - ароматический поликетидный антибиотик из группы тетраценомицинов (производных 5,12-нафтаценхинона).

Изобретение может быть использовано для получения антибиотика тетраценомицина X, обладающего специфической активностью в отношении определенных линий опухолевых клеток. Его практическое применение возможно при разработке препаратов для химиотерапии онкологических заболеваний.

Уровень техники

Тетраценомицины - представляют собой сравнительно небольшую группу веществ, продуцируемых представителями некоторых родов актинобактерий (Streptomyces, Nocardia, Saccharothrix), уникальных как благодаря их молекулярной структуре, так и биологической активности, в частности, как противоопухолевых агентов.

Тетраценомицины представляют собой не только антибактериальные антибиотики, но и вещества, обладающие значительной противоопухолевой активностью. Именно со способностью тетраценомицина X проявлять цитотоксический эффект в отношении многих видов раковых клеток (X. Qiao, М. Gan, Ch. Wang, В. Liu, Y. Shang, Y. Li and Sh. Chen. Tetracenomycin X exerts antitumour activity in lung cancer cells through the downregulation of cyclin Dl. Mar. Drugs 2019, 17(1), 63) связаны значительные перспективы данного вещества для медицины.

Высокая биологическая активность этих соединений объясняется способностью к интеркаляции антрахинонового фрагмента хромофора в клеточную ДНК, что приводит к ингибированию матричных функций нуклеиновых кислот, вследствие чего также ингибируется пролиферация клеток (Горностаев Л.М., Арнольд Е.В., Лаврикова Т.И., Руковец Т.А., Талдыкина Д.С., Халявина Ю.Г., Штиль А.А. Полициклические хиноидные соединения в качестве противоопухолевых препаратов. Сибирское медицинское обозрение. 2017;(6): 21-31. DOI: 10.20333/2500136-2017-6-21-31).

В основе химического строения тетраценомицинов лежит конденсированная четырехчленная циклическая структура - тетрациклин (1).

Тетраценомицин С (PubChem CID: 73632) был первым веществом из этой группы, впервые открытым в 1979 (Weber, W.; Zahner Н., Siebers J., Schroder К. & Zeeck A.: Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen. 175 Mitteilung. Tetracenomycin C. Arch. Microbiol. 121: 111-116, 1979), а затем повторно в 1984 (Ye, Y.; H. Zhang, S. Xu, C. Zhang & C. Zai: Studies on the antibiotic H-881. Kangshengsu 9: 28-32,1984).

Позднее группой исследователей из Австралии был обнаружен 12а-о-метилированный эфир тетраценомицина С, названный тетраценомицином X (Anderson, М. G.; С.L.-Y. Khoo & R. W. Rickards: Oxidation processes in the biosynthesis of the tetracenomycin and elloramycin antibiotics. J. Antibiotics 42: 640-643, 1989). Новое вещество, выделенное из культуральной жидкости актинобактерии Nocardia medirerranea NT 19 - штамма, известного еще с 1972, благодаря способности синтезировать антибиотик рифамицин SV (Birner, J.; P.R. Hodgson, W.R. Lane & E.H. Baxter. (1972). An Australian isolate of Nocardia mediterranea producing rifamycin SV. J. Antibiotics 25: 356-359; P.R. Hodgson, W.R. Lane &E.H. Baxter: An Australian isolate of Nocardia mediterranea producing rifamycin SV. J. Antibiotics 25: 356-359, 1972), - обладало значительной антагонистической активностью в отношении грамположительных бактерий (Khoo, С.L.-Y.: Structural and biosynthetic studies of the antibiotics tetracenomycin X and streptonigrin. Ph. D. Thesis, Australian National Univ., 1988).

По данным китайских исследователей тетраценомицин X, выделенный из культуральной жидкости актинобактерии Saccharothrix sp.10-10, показал умеренную антибактериальную активность против лекарственно-устойчивых патогенных штаммов, включая метициллин-устойчивые стафилококки (MRSA) и ванкомицин-устойчивые энтерококки (VRE), причем минимальная ингибирующая концентрация (МИК) составила от 32 до 64 мкг/мл. Кроме того, тетраценомицин X проявил значительное цитотоксическое действие в отношении клеточных линий человека, включая HL60 (лейкемия), HepG2 (карцинома печени), и MCF-7 (аденокарциномы молочной железы), причем концентрация 50%-ого ингибирования (IC50) составила 5,1, 9,7 и 18.0 мкм/л, соответственно (Liu, В.; Tan, Y.; Gan, M.; Zhou, H.; Wang, Y.; Ping, Y.; Li, В.; Yang, Z.; Xiao, C. Identification of tetracenomycin X from a marine-derived Saccharothrix sp.guided by genes sequence analysis. Acta Pharm. Sin. 2014, 49, 230-236).

Последние исследования показали, что тетраценомицин X обладает высокой селективной анти-пролиферационной активностью в отношении клеток рака легких, при этом не ингибируя здоровые клетки (Qiao X., Gan М., Wang Ch., Liu В., Shang Y., Li Y. and Chen Sh. (2019). Tetracenomycin X exerts antitumour activity in lung cancer cells through the downregulation of cyclin D1. Mar. Drugs. 17(1), 63.).

Таким образом, тетраценомицин X обладает значительным потенциалом, чтобы стать антимитотическим препаратом для лечения рака легких.

Известны несколько продуцентов тетраценомицина X, принадлежащие к различным родам актинобактерий:

Nocardia mediterranea NT 19 (Khoo, С.L.-Y.: Structural and biosynthetic studies of the antibiotics tetracenomycin X and streptonigrin. Ph. D. Thesis, Australian National Univ., 1988);

Saccharothrix sp.10-10 (Liu, В.; Tan, Y.; Gan, M.; Zhou, H.; Wang, Y.; Ping, Y.; Li, В.; Yang, Z.; Xiao, C. Identification of tetracenomycin X from a marine-derived Saccharothrix sp. guided by genes sequence analysis. Acta Pharm. Sin. 2014, 49, 230-236).

Однако, к серьезным недостаткам выше указанных штаммов, как продуцентов тетраценомицина X, можно отнести то, что в процессе ферментации в составе культуральной жидкости обеих культур образуется спектр веществ (принадлежащих к группам тетраценомицинов и эллорамицинов), зачастую сходных по структуре, при том, что собственно тетраценомицин X не является среди них доминирующим - менее 18% (Liu, В., Li, J., Chen, М., Нао, X., Cao, F., Tan, Y., … Gan, М. (2018). Seco-Tetracenomycins from the Marine-Derived Actinomycete Saccharothrix sp. 10-10. Marine Drugs, 16(10), 345. https://doi.org/10.3390/mdl6100345). Тем самым, для выделения непосредственно тетраценомина X требуется и больший объем ферментационной жидкости, и сложная многоступенчатая система очистки, позволяющая получить не более, чем 12 мг антибиотика из литра культуральной жидкости.

В продуктах биосинтеза исследованного нами штамма Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086 был обнаружен только тетраценомин X, как единственный представитель группы тетраценомицинов (количество примесей, в зависимости от условий культивирования, не превышает 0,5%).

Технической проблемой является отсутствие бактериальных штаммов, способных продуцировать ферментативную жидкость с высоким содержанием тетраценомицина X.

Данная техническая проблема решается заявляемым штаммом Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение бактериального штамма Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086, способного продуцировать ферментационную жидкость с высоким содержанием антибиотика - не менее 15 мг/л.

Штамм Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 был выделен при поверхностном посеве на среду, содержащую пропионат натрия (М490, HiMediaLab), из гомогенизата рабочих особей муравьев Camponotus vagus. Образцы гнездового материала и живые особи муравьев-древоточцев Camponotus vagus были отобраны в Рязанской области (Касимовский район, 55.011389 N, 41.730789 Е) в августе 2015 года.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д.1) под регистрационным номером Ас-2086.

Идентификация штамма Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 основывалась на анализе данных секвенирования нуклеотидной последовательности гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базу GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Данный подход в настоящее время считается безусловно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода.

Штамм Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 характеризуется культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, согласующимися с таковыми, приведенными для представителей данного таксона (Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria, 2015, DOI: 10.1002/9781118960608).

Культурально-морфологические признаки

Культуральные и морфологические характеристики штамма Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 описаны на спектре твердых питательных сред (Табл. 1), рекомендуемых для фенотипического описания актиномицетов (Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука. 1983. 248 с.).

Диаметр воздушного мицелия 0,48 мкм, мицелий стерильный или несет длинные цепочки гладких вытянутых спор.

Хемотаксономические признаки

Гидролизаты целых клеток Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086 содержат мезо-изомер 2,6-диаминопимелиновой кислоты, а в качестве диагностических сахаров - арабинозу и галактозу, при этом - не содержат миколовых кислот.

В качестве фосфолипидов встречаются фосфатидилэтаноламин или фосфатидилметилэтаноламин.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет в аэробных условиях, в диапазоне температур от +15 до +35°С, с оптимумом роста при 28±2°С.

Растет в диапазоне рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН всех используемых сред составляет 8,0-8,5.

В качестве источника углерода утилизирует глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, глицерин, слабо сахарозу. Не использует лактозу, мальтозу, раффинозу, инулин, сорбит, крахмал. Хитин гидролизует.

В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты.

Образует антибиотик тетраценомицин X, активный в отношении грамположительных бактерий.

Штамм Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086 не патогенен.

Хранение и поддержание жизнеспособности штамма

Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 2-3 недели в пробирки со скошенным агаром, содержащим глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт, микроэлементы.

Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -70°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-7 дней, разлив культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов, соблюдая условия стерильности.

Пример. Штамм Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 культивируют в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина - 2 г, дрожжевой экстракт - 2 г, NaCl - 6 г, вода - 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводят стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь раскапывают по криопробиркам и помещают на хранение при температуре -70°С.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показано антагонистическое действие, оказываемое на репортерную систему JW5503 Δ tolC -pDualrep2: ферментативной жидкостью Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 (5), фракциями в 50% (1), 45% (2), 40% (3), в 60% (4) растворах ацетонитрила и очищенного антибиотика (6). В качестве референсных антибиотиков использованы левофлоксацин (Lev) и эритромицин (Ery).

На фиг. 2 представлены результаты масс-спектрометрического обнаружения тетраценомицина X в культуральной жидкости Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086: изолированный спектральный пик, соответствующий точной моноизотопной массе тетраценомицина X (очищенное и сконцентрированное вещество).

На фиг. 3 представлен спектр оптического поглощения тетраценомицина X в ультрафиолетовой и видимой областях (в ацетонитриле в присутствии 0,1% НСООН).

Осуществление изобретения

Выделение и культивирование Amycolatopsis rifamycinica ВКПМ А23 Ас-2086

Для исследования отбирали по 4 взрослых особи Camponotus vagus, усыпляли эфиром и перетирали вручную в ступке со стерильным песком и 20 мл стерильной воды в течение трех минут. Полученные гомогенизаты муравьев обрабатывали на шейкере «Multi Reax» (Heidolph, Германия) 10 минут при 2000 об./мин и затем 10-кратно разводили стерильной водопроводной водой. Посев производили на питательную среду следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,5; NaH₂PO₄ - 0,7; KNO₃ - 0,1; NaCl - 0,3; MgSO₄×7H₂O - 0,1; СаСО₃ - 0,02; FeSO₄×7H_2O - 0,002; ZnSO₄×7H₂O - 0,002; MnSO₄×7H₂O - 0,002; пропионат натрия - 0,2; агар - 20 (MacFaddin J.F. (1985). "Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria". Vol.I. Williams and Wilkins. Baltimore). Для ограничения роста грибов и грамотрицательных бактерий в среды перед разливом добавляли нистатин (250 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) соответственно. Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение двух недель.

Выросшие колонии мицелиальных прокариот выделяли в отдельные изоляты, среди которых проводился скриннинг за антагонистическую активность в отношении репортерного штамма JW5503 ΔtolC -pDualrep2 (Osterman I.A., Komarova E.S., Shiryaev D.I., Korniltsev I.A., Khven I.M., Lukyanov D., Tashlitsky V.N., Serebryakova M.V., Efremenkova O.V., Ivanenkov Y.A., Sergiev P.V., and Dontsova O.A. Sorting out antibiotics' mechanisms of action: a double fluorescent protein reporter for high throughput screening of ribosome and dna biosynthesis inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2016. pp. AAC.02117-16. doi: 10.1128/AAC.02117-16). Таким образом, был выявлен штамм А₂₃, вызывавший повреждение механизмов синтеза белка у репортерной системы.

Получение тетраценомицина X с использованием нового штамма-продуцента

Пример 1.

Культивирование штамма-продуцента. Клетки Amycolatopsis rifamycinica А₂₃ ВКПМ Ас-2086 выращивают в 100 мл жидкой питательной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 10, пептон - 10, дрожжевой экстракт - 2, гидролизат казеина - 2, NaCl - 6,0, вода - остальное (рН после автоклавирования при 0,5 атм составляет 6,5). Культивирование производится в 250 мл конических колбах при 28°С и перемешивании на орбитальном шейкере в течение 3-4 суток. Полученную культуральную жидкость с клетками продуцента в концентрации 10⁶ кл/мл используют как посевной материал, засевая им (объем внесения 5-10%) конические колбы общим объемом 750 мл, содержащие 100-150 мл жидкой питательной среды выше приведенного состава. Засеянные колбы в течение 2-3 суток выдерживают на шейкере, а затем продолжают инкубирование в статических условиях при 28°С до 21 суток.

К концу ферментации содержание тетраценомицина X в культуральной жидкости составляет до 20 мг/л.

По окончании срока ферментации культуральную жидкость сливают из колб и фильтруют сначала через стерильные бумажные фильтры "белая лента", а затем под вакуумом через мембранные фильтры Millipore (Merk) с диаметром пор 0,45 мкм.

Подготовка хроматографической колонки. Сорбент LPS-500H (сополимер дивинилбензола/гидрофильного мономера) помещают в колонку для твердофазной экстракции, заливают 10% (v/v) раствором ацетонитрила в воде, закрывают колонку парафином, взбалтывают. После чего колонку открывают с обоих концов и последовательно промывают растворами ацетонитрила с концентрациями 10% и 50%, а затем трижды - дистиллированной водой. Данная процедура применяется для гарантированной очистки сорбента от посторонних соединений.

Идентификация и выделение тетраценомицина X из культуральной жидкости

Профильтрованную культуральную жидкость Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086 наносят на хроматографическую колонку с вышеуказанным сорбентом. После нанесения всей культуральной жидкости на колонку, ее промывают дистилированной водой, а затем элюируют 50% (v/v) раствором ацетонитрила в воде.

Фракция, экстрагированная 50% раствором ацетонила, демонстрирует наибольшую антагонистическую активность в диапазоне концентраций экстрагента от 10 до 70% по объему (фиг. 1).

Полученный элюат разделяют при помощи высокоэффективной хроматографии высокого давления и подвергают концентрированию на роторном испарителе. Идентификация активного вещества проводилась методом хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения LS-ESI-qTof (Agilent 6520) (фиг. 2).

В соответствии с точной молекулярной массой (486.116 г/моль) был определен атомарный состав и молекулярная формула активного вещества, а с помощью открытой базы данных METLIN (https://metlin.scripps.edu) проведена его идентификация. Время удержания на гидрофобной колонке (оценочная гидрофобность) и оптический спектр поглощения (фиг. 3) использованы в качестве данных, подтверждающих масс-спектрометрическую идентификацию.

UV/Vis H2O нормализованные максимумы поглощения 289 nm (100%), 389 nm (33%), 408 nm (35%) (фиг. 3.).

HPLC-ESI-HRMS С₂₄Н₂₂О₁₁ (моноизотопная масса 486.1162): m/z рассчитано для [М+Н+]: 485,10893, найдено 485,1099. В качестве подтверждающего детектирован образовавшийся димер [2М-Н]- (фиг. 2).

Таким образом, установлено, что фракция, полученная экстракцией 50% v/v раствором ацетонила из культуральной жидкости Amycolatopsis rifamycinica А23 ВКПМ Ас-2086, нарушает синтез белка у репортерного штамма JW5503 ΔtolC -pDualrep2 (Osterman et al., 2016), и представлена на 99,5% антибиотиком тетраценомицином X.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Amycolatopsis rifamycinica, обладающий способностью продуцировать тетраценомицин Х, депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Ас-2086. Изобретение обеспечивает получение культуральной жидкости с повышенным содержанием тетраценомицина Х. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Штамм Amycolatopsis rifamycinica A₂₃ ВКПМ Ac-2086 - продуцент антибиотика тетраценомицина X.