Штамм Streptomyces iakyrus Pe6 ВКПМ Ас-2084 - продуцент антибиотика нибомицина Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A61P31/04 A61K31/496 C12R1/465 

Описание патента на изобретение RU2696029C1

Область техники

Изобретение относится к микробной биотехнологии, микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма вида Streptomyces iakyrus Ре6, продуцирующего нибомицин - редкий природный антибиотик азолохинолиновой группы, обладающий активностью против грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий и значительными перспективами для медицины.

Уровень техники

Впервые о выделении антибиотика нибомицина было сообщено еще в 1955 году (Strelitz F., Flon Н., Asheshov I.N. Nybomycin, a new antibiotic with antiphage and antibacterial properties. Proc Natl Acad Sci USA. 1955. Vol. 41, pp. 620-624), а спустя 15 лет обнаружены природные производные (Naganawa Н., Wakashiro Т., Yagi A., Kondo S., Takita Т., Hamada M., Maeda K., Umezawa H. Deoxynybomycin from Streptomyces. J. Antibiot. 1970. Vol. XXIII. N. 7, pp. 365-369), оценена возможность химического синтеза (Forbis R.M., Rinehart K.L. Nybomycin. VII. Preparative routes to nybomycin and deoxynybomycin. J. Amer. Chem. Soc. 1973. Vol. 95. No. 15, pp. 5003-5013) и затем проанализирована структура нибомицина (Nadzan A.M., Rinehart K.L. Nybomycin. 9. Synthetic and biosynthetic incorporation of 15N as a means of assigning the 13C nuclear magnetic resonance spectrum of nybomycin. J. Amer. Chem. Soc. 1977. Vol. 99. No. 14, pp. 4647-4654).

Несмотря на то, что данный антибиотик был открыт в начале эры антибиотиков, он не использовался в медицине и был надолго забыт. Однако в последние годы он был выделен заново, и было показано, что нибомицин и его производные обладают специфической активностью против грамположительных патогенных бактерий (в частности, Mycobacterium tuberculosis), а также против патогенов с множественной резистентностью к другим антибиотикам, например, MRSA (Hiramatsu К., Igarashi М., Morimoto Y., Baba Т., Umekita М., Akamatsu Y. Curing bacteria of antibiotic resistance: reverse antibiotics, a novel class of antibiotics in nature. International Journal of Antimicrobial Agents. 2012. June. Vol. 39, Is. 6, pp. 478-485). Кроме того, есть данные о том, что некоторые химические модификации могут повысить эффективность нибомицина, чтобы расширить спектр его действия также и для грамотрицательных патогенных бактерий (Richter M.F., Drown B.S., Riley A.R. et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 2017. 545(7654) pp. 299-304). Такие особенности делают нибомицин крайне перспективным веществом для дальнейшего исследования и использования в медицине.

В мировых коллекциях микроорганизмов продуценты нибомицина единичны и восходят к единственному штамму Streptomyces hyalinum n. sp. Hamada et Yokoyama, выделенному еще в 1970 году и получившему статус нового вида.

Из уровня техники известен единственный коллекционный штамм продуцент нибомицина - Streptomyces hyalinum АТСС 29817 (известный также как Streptomyces hyalinus NBRC 13850) (Sterlitz et al., 1955; Naganawa et al., 1970).

Однако, к недостаткам выше указанного штамма можно отнести то, что в ходе биосинтеза помимо собственно нибомицина образуется ряд его дериватов (до 5 разнообразных веществ), среди которых доля нибомицина не превышает 40%, что ведет к необходимости проведения сложной многоступенчатой системы очистки и концентрирования целевой субстанции. В продуктах биосинтеза исследованного нами штамма Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 был обнаружен только нибомицин, иных его дериватов выявлено не было, таким образом, данный штамм образует нибомицин в виде гомогенной, пригодной для выделения фракции.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного продуцировать ферментационную жидкость с высоким содержанием антибиотика (не менее 15 мг/л).

Штамм Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 был выделен при поверхностном посеве на среду, содержащую крахмал и нитрат (минеральный агар Гаузе 1), из гомогенизата рабочих особей муравьев Camponotus vagus. Образцы гнездового материала и живые особи муравьев-древоточцев Camponotus vagus были отобраны в Брянской области (государственный природный биосферный заповедник "Брянский лес", 52.440009 N, 34.126288 Е) в июле 2014 года.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером Ас-2084.

Идентификация штамма Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 основывалась на анализе данных секвенирования нуклеотидной последовательности гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базу GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Данный подход в настоящее время считается безусловно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода.

Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками:

Культурально-морфологические признаки

Штамм ВКПМ Ас-2084 при росте на спектре твердых питательных сред, рекомендуемых для фенотипического описания стрептомицетов (Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука. 1983. 248 с.) образует:

хорошо развитый воздушный мицелий светло-серого, серого, желтовато-серого или белого цвета;

спороносцы спиральные (S), споры с гладкой оболочкой;

зрелые спороносцы содержат 10-50 спор в цепочке;

субстратный мицелий буроватый, бурый, коричневый, темно-коричневый;

растворимый пигмент бурый, коричневый, темно-коричневый;

меланоидные пигменты образует.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм растет в аэробных условиях в диапазоне температур от +18 до +40°С, с оптимумом роста при 28±2°С.

Растет в диапазоне рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН всех используемых сред составляет 7,2-7,7.

В качестве источника углерода утилизирует глюкозу, фруктозу, рамнозу, инозит, сахарозу, глицерин. Не использует арабинозу, лактозу, ксилозу, маннит, сорбит, целлюлозу. Крахмал гидролизует.

В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты. Обладает протеолитической активностью. Желатину разжижает, молоко пептонизирует.

Образует антибиотик нибомицин, активный в отношении грамположительных бактерий. Штамм ВКПМ Ас-2084 не патогенен.

Таким образом, на основании филогенетического родства и фенотипических признаков выделенный штамм Ре6 был отнесен к виду Streptomyces iakyrus и депонирован в коллекцию ВКПМ под номером Ас-2084.

Хранение и поддержание жизнеспособности штамма

Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 2-3 недели на плотные питательные среды, например, следующего состава: овсяная мука - 20 г, агар - 20 г, раствор микроэлементов - 1 мл, агар - 20 г, вода дистиллированная - 1 л (Гаузе и др., 1983).

Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -70°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-7 дней, разлив культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов, соблюдая условия стерильности.

Пример. Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 культивируют в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина - 2 г, дрожжевой экстракт - 2 г, NaCl - 6 г, вода - 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводят стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь раскапывают по криопробиркам и помещают на хранение при температуре ниже -20°С.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлены результаты ВЭЖХ-анализа: фракция после XAD-2 (А), очищенное вещество с антибиотическим действием (В).

На фиг. 2 представлены фотографии, демонстрирующие антагонистическое действие, оказываемое на репортерную систему JW5503 Δ tolC -pDualrep2, исходного штамма Ре6 (G2), ферментативной жидкости Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 (Ре6 media), активной фракции в 20% ацетонитриле (Ре6 20% ACN fraction) и очищенного антибиотика нибомицина (Nyb pure). В качестве референсных антибиотиков использованы левофлоксацин (Lev) и эритромицин (Ery).

Осуществление изобретения

Выделение и культивирование Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084

Для исследования отбирали по 4 взрослых особи Camponotus vagus, усыпяли эфиром и перетирали вручную в ступке со стерильным песком и 20 мл стерильной воды в течение трех минут. Полученные гомогенизаты муравьев обрабатывали на шейкере «Multi Reax» (Heidolph, Германия) 10 минут при 2000 об./мин и затем 10-кратно разводили стерильной водопроводной водой. Посев производили на питательные среды следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20, К2НРО4 - 0,5, MgSO4×7H2O - 0,5, KNO3 - 1, NaCl - 0,5, FeSO4 - 0,01, агар - 20 (Гаузе и др., 1983). Для ограничения роста грибов и грамотрицательных бактерий в среды перед разливом добавляли нистатин (250 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) соответственно. Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение двух недель.

Выросшие колонии мицелиальных прокариот выделяли в отдельные изоляты, среди которых проводился скриннинг за антагонистическую активность в отношении репортерного штамма JW5503 Δ tolC -pDualrep2 (Osterman I.A., Komarova E.S., Shiryaev D.I., Korniltsev I.A., Khven I.M., Lukyanov D., Tashlitsky V.N., Serebryakova M.V., Efremenkova O.V., Ivanenkov Y.A., Sergiev P.V., and Dontsova O.A. Sorting out antibiotics' mechanisms of action: a double fluorescent protein reporter for high throughput screening of ribosome and dna biosynthesis inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2016. pp. AAC.02117-16. doi: 10.1128/AAC.02117-16). Таким образом, был выявлен штамм Ре6, вызывавший повреждение ДНК у репортерной системы.

Получение нибомицина с использованием нового штамма-продуцента

Клетки штамма-продуцента Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 выращивают на агаризованной среде Гаузе I, затем высевают в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): глюкоза - 10, пептон - 6,2, дрожжевой экстракт - 2, гидролизат казеина - 2, NaCl - 2,75, KNO3 - 0,06, Na2CO3 - 0,7, Na2S2O3 - 0,2 (рН после автоклавирования при 0,5 атм составляет 8,5). Культивирование производится при 28°С, аэрации и перемешивании на орбитальном шейкере в течении 7-9 суток. К концу ферментации содержание нибомицина в культуральной жидкости составляет до 25 мг/л.

По окончании срока ферментации культуральную жидкость сливают из колб и фильтруют сначала через стерильные бумажные фильтры "белая лента", а затем через мембранные фильтры Millipore (Merk) с диаметром пор 0,45 мкм.

Фильтрат наносят на хроматографическую колонку 1×15 см, наполненную сорбентом - стироловой/дивинилбензоловой полимерной смолой (XAD-2). Колонку предварительно промывают 50%, а затем 20% раствором ацетонитрила в воде и уравновешивают водой. После нанесения культуральной жидкости колонку элюируют градиентом 0 - 50% ацетонитрила с попутным сбором фракций. Активные фракции объединяют и концентрируют, а затем подвергают дополнительной очистке на ВЭЖХ С18 колонке в градиенте 10 - 40% ацетонитрила (фиг. 1). На всех этапах выделения контролируется антибиотическая активность выделяемых фракций (фиг. 2).

Методами УФ-спектрометрии и масспектрометрии было установлено, что полученная фракция, обладающая высокой ДНК-повреждающей активностью в отношении репортерного штамма JW5503 Δ tolC -pDualrep2 (Osterman et al., 2016), представлена на 89% антибиотиком нибомицином.

Похожие патенты RU2696029C1

название год авторы номер документа
Штамм Amycolatopsis rifamycinica - продуцент антибиотика тетраценомицина Х 2019
  • Бирюков Михаил Владимирович
  • Закалюкина Юлия Владимировна
  • Остерман Илья Андреевич
RU2724537C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИБОМИЦИНА 2018
  • Бирюков Михаил Владимирович
  • Закалюкина Юлия Владимировна
  • Остерман Илья Андреевич
RU2718802C1
Штамм Streptomyces mirabilis KB13 - продуцент дутомицина 2022
  • Закалюкина Юлия Владимировна
  • Белик Альбина Романовна
  • Буюклян Юлия Андреевна
  • Алферова Вера Александровна
  • Остерман Илья Андреевич
  • Бирюков Михаил Владимирович
RU2798195C1
Штамм Streptomyces rochei MP21 - продуцент антибиотика кирромицина 2022
  • Закалюкина Юлия Владимировна
  • Белик Альбина Романовна
  • Буюклян Юлия Андреевна
  • Алферова Вера Александровна
  • Остерман Илья Андреевич
  • Бирюков Михаил Владимирович
RU2798207C1
Штамм Streptomyces sp. YVZ013 - продуцент антибиотика поликетомицина 2023
  • Закалюкина Юлия Владимировна
  • Бирюков Михаил Владимирович
  • Буюклян Юлия Андреевна
  • Остерман Илья Андреевич
RU2813975C1
Штамм Streptomyces virginiae - продуцент вирджиниамицина и способ получения вирджиниамицина 2016
  • Джавахия Вахтанг Витальевич
  • Глаголева Елена Викторовна
  • Савушкин Вячеслав Алексеевич
  • Овчинников Александр Игоревич
  • Глаголев Владислав Игоревич
  • Савельева Вероника Владимировна
  • Попова Евгения Дмитриевна
  • Петухов Дмитрий Владимирович
  • Новак Никита Валерьевич
RU2637857C1
Штамм Streptomyces hygroscopicus 18 - продуцент нафтохиноновых антибиотиков - астолидов А и В с противогрибковой и цитотоксической активностью и способ их получения 2018
  • Тренин Алексей Сергеевич
  • Терехова Лариса Петровна
  • Бычкова Ольга Петровна
  • Синева Ольга Николаевна
  • Садыкова Вера Сергеевна
  • Коршун Владимир Аркадьевич
  • Прохоренко Игорь Адамович
  • Алферова Вера Александровна
  • Степашкина Елена Альбертовна
  • Тюрин Антон Павлович
  • Рогожин Евгений Александрович
  • Деженкова Любовь Георгиевна
  • Шувалов Максим Викторович
RU2681828C1
Штамм Streptomyces tendae - продуцент противобактериального антибиотика ИНА 5812 2019
  • Лапчинская Ольда Анастасьевна
  • Катруха Генрих Степанович
  • Погожева Валерия Владимировна
  • Филичева Валентина Андреевна
  • Харитонова Лидия Александровна
  • Лапчинская Мария Юльевна
  • Яковенко Алла Николаевна
  • Орлова Галина Ивановна
  • Куляева Валерия Викторовна
  • Пономаренко Валерий Иванович
  • Тюрин Антон Павлович
  • Коршун Владимир Аркадьевич
RU2710733C1
ШТАММ STREPTOMYCES VIRGINAE - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКА ВИРДЖИНИАМИЦИНА 1992
  • Звенигородский В.И.
  • Тяглов Б.В.
  • Владимирова Е.С.
  • Жданов В.Г.
RU2007458C1
Штамм Streptomyces olivaceiscleroticus - продуцент противоопухолевого антибиотика оливомицина 2021
  • Лапчинская Ольда Анастасьевна
  • Филичева Валентина Андреевна
  • Харитонова Лидия Александровна
  • Лапчинская Мария Юрьевна
  • Тевяшова Анна Николаевна
  • Олсуфьева Евгения Николаевна
  • Бычкова Елена Николаевна
  • Кисиль Ольга Валерьевна
  • Катруха Генрих Степанович
  • Щекотихин Андрей Егорович
RU2761482C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 696 029 C1

Реферат патента 2019 года Штамм Streptomyces iakyrus Pe6 ВКПМ Ас-2084 - продуцент антибиотика нибомицина

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм микроорганизма Streptomyces iakyrus Ре6, обладающий способностью продуцировать нибомицин, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером Ас-2084. Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ас-2084 может быть использован в качестве продуцента нибомицина. Изобретение позволяет повысить выход нибомицина. 2 ил., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 696 029 C1

Штамм Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 - продуцент нибомицина.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2019 года RU2696029C1

KEIICHI H., MASAYUKI I., et
al
Curing bacteria of antibiotic resistance: reverse antibiotics, a novel class of antibiotics in nature, International Journal of Antimicrobial Agents, 2012 (39), p
Двухколесный автомобиль для формовки кирпичей из разлитой по полю сушки торфяной массы 1923
  • Кирпичников В.Д.
  • Классон Р.Э.
SU478A1
JOSEPH A., POPE JR., et
al., Applications of thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and mass spectrometry in the fermentation and isolation of the antibiotic nybomycin, Journal of industrial microbiology, 1990, (6), p.61-69
ПОТОКОВОЕ ИНТЕРАКТИВНОЕ ВИДЕОКЛИЕНТСКОЕ УСТРОЙСТВО 2008
  • Перлман Стефен Г.
  • Ван Дер Лан Роджер
RU2500022C2
MASAYOSHI ARAI, KENTARO KAMIYA et.al., Anti- dormant mycobacterial activity and target analysis of nybomycin produced by a marine- derived Streptomyces sp., Bioorganic & Medical Chemistry, 2015, v
Прибор для равномерного смешения зерна и одновременного отбирания нескольких одинаковых по объему проб 1921
  • Игнатенко Ф.Я.
  • Смирнов Е.П.
SU23A1
Машина для центробежной отливки сосудов и др. металлических изделий 1926
  • Тихомиров П.Д.
SU3534A1
СПОСОБ АВТОМАТИЧЕСКОГО УПРАВЛЕНИЯ ЭКСТРУДЕРОМ 1997
  • Остриков А.Н.
  • Шевцов А.А.
  • Данченков А.А.
  • Абрамов О.В.
RU2130831C1
ТРЕНИН А.С., Методология поиска новых антибиотиков: Состояние и перспективы, Антибиотики и химиотерапия, 2015,Т
Способ получения молочной кислоты 1922
  • Шапошников В.Н.
SU60A1
Нивелир для отсчетов без перемещения наблюдателя при нивелировании из средины 1921
  • Орлов П.М.
SU34A1

RU 2 696 029 C1

Авторы

Бирюков Михаил Владимирович

Закалюкина Юлия Владимировна

Остерман Илья Андреевич

Даты

2019-07-30Публикация

2018-10-04Подача