КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛИ Российский патент 2020 года по МПК A61K48/00 A61K38/17 A61K38/18 A61K38/20 A61K38/51 A61P29/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для облегчения или лечения боли и к способу облегчения или лечения боли с ее применением.

Уровень техники

Боль представляет переживание фактического или потенциального повреждения ткани или беспокоящие сенсорные ощущения и эмоциональные чувства, связанные с таким повреждением. Боль защищает области тела, которые подверглись повреждению во время заживления поврежденных тканей, от возможных потенциальных ситуаций, приводящих к повреждениям, и обеспечивает мотивацию, чтобы избежать подобных переживаний в будущем. Боль в значительной степени, постепенно ослабляется, когда устраняется причинный раздражитель, но иногда боль сохраняется, даже когда ткани зажили по мере исчезновения раздражителя, и повреждение явно зажило, или боль возникает в состоянии без наличия какого-либо раздражения, повреждения или заболевания.

Для лечения боли в основном широко применяются наркотические анальгетики, такие как морфин, который является алкалоидом опия, или ненаркотические анальгетики, такие как нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), содержащие активный ингредиент из ацетилсалициловой кислоты, ибупрофена или ацетаминофена.

Наркотические анальгетики обладают преимуществом, заключающимся в том, что они проявляют зависимость доза-эффект и высокую эффективность, но они могут привести к побочным эффектам со стороны нервной системы, и при длительном применении они могут привести к резистентности и физической зависимости, и боль может усилиться.

Если аспирин, ненаркотический анальгетик, имеющий в качестве активного ингредиента ацетилсалициловую кислоту, используется для обеспечения анальгетического действия, то его следует вводить в высокой дозе, по меньшей мере, 500 мг. Однако аспирин представляет собой нестероидный противовоспалительный анальгетик, блокирующий фермент циклооксигеназу-1 (COX-1), который способствует выработке простагландинов, которые защищают желудок, тем самым предотвращая нарушение слизистой оболочки желудка. Следовательно, желудок может быть легко поврежден желудочной кислотой и может возникнуть желудочно-кишечное кровотечение. Кроме того, ибупрофен также является нестероидным противовоспалительным анальгетиком, который может вызывать желудочные расстройства. Также в случае анальгетиков, содержащих ацетаминофен в качестве активного ингредиента, таких как тиленол, ацетаминофен в основном метаболизируется в печени, и может быть индуцировано повреждение печени.

Даже если вышеуказанные анальгетики эффективны на ранней стадии, то часто при длительном применении они становятся неэффективными за счет резистентности. В частности, в случае нейропатической боли существует проблема, заключающаяся в том, что боль не отвечает на максимальную дозу нестероидного противовоспалительного средства и, таким образом, его требуется вводить в высокой дозе в течение короткого периода времени.

Недавно были разработаны новые терапевтические агенты для лечения нейропатической боли, но они по-прежнему имеют побочные эффекты. Например, блокаторы натриевых каналов в основном находятся в форме небольших молекул и проявляют низкую селективность в отношении изоформ белков. Кроме того, они проявляют побочные эффекты, такие как токсичность для сердца и двигательные расстройства.

Следовательно, существует настоятельная необходимость в разработке нового анальгетика для нейропатической боли, который обладает высокой анальгетической эффективностью при одновременном снижении проявления побочных эффектов.

Техническая проблема

Следовательно, заявители настоящего изобретения попытались разработать новый анальгетик для нейропатической боли, проявляющий высокую анальгетическую эффективность даже в низких дозировках. В результате заявители настоящего изобретения обнаружили, что при использовании комбинации двух или более генов глутаматдекарбоксилазы, противовоспалительного цитокина и глиального нейротрофического фактора, можно значительно облегчить или лечить боль по сравнению с их применением по отдельности и завершили настоящее изобретение.

Решение проблемы

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для облегчения или лечения боли, содержащую два или более генов, выбранных из группы, состоящей из гена, кодирующего глутаматдекарбоксилазу (GAD), гена, кодирующего интерлейкин-10 (IL-10), и гена, кодирующего глиальный нейротрофический фактор (GDNF).

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ облегчения или лечения боли, включающий введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Преимущественные эффекты изобретения

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает два или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов, кодирующих GAD, IL-10 и GDNF. Следовательно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению проявляет высокую анальгетическую эффективность в дозировке ниже, чем при введении по отдельности, когда гены вводятся совместно, и, таким образом, обычные побочные эффекты и токсичность могут быть снижены. Следовательно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть пригодна для облегчения или лечения боли.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено схематическое изображение плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GAD65-modi, использованных для конструирования рекомбинантного аденоассоциированного вируса:

(а) представлено схематическое изображение pAAV-GAD65 и (b) представлено схематическое изображение pAAV-GAD65-modi.

На фиг.2 представлено схематическое изображение плазмиды pAAV-IL-10, использованной для конструирования рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

На фиг.3 представлено схематическое изображение плазмиды pAAV-GDNF, использованной для конструирования рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

На фиг.4 представлено схематическое изображение, показывающая плазмиду pAAV-GDNF-IL-10.

На фиг.5 показана экспрессия каждого введенного гена плазмидой pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF:

(а) показана экспрессия GAD65 плазмидой pAAV-GAD65; (b) показана экспрессия IL-10 плазмидой pAAV-IL-10; и (с) показана экспрессия GDNF плазмидой pAAV-GDNF.

На фиг.6 показана экспрессия гена GDNF и гена IL-10 плазмидой pAAV-GDNF-IL-10:

(а) показана экспрессия IL-10 плазмидой pAAV-GDNF-IL-10; и (b) показана экспрессия GDNF плазмидой pAAV-GDNF-IL-10.

На фиг.7 представлены результаты вестерн-блоттинга, показывающие экспрессию каждого белка после обработки клеток 293T или HeLa каждым рекомбинантным аденоассоциированным вирусом после конструирования рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, в которые были вставлены ген GAD65, ген IL-10 и ген GDNF соответственно:

(а) показана экспрессия GAD65 после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GAD65; (b) показана экспрессия GAD65 после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GAD65-modi; (c) показана экспрессия IL-10 после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-IL-10; и (d) показана экспрессия GDNF после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GDNF.

На фиг.8 показаны уровни экспрессии GABA, измеренные с использованием ELISA после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GAD65 или AAV-GAD65-modi:

(а) представлен график, показывающий уровень экспрессии GABA после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GAD65; и (b) представлен график, показывающий уровень экспрессии GABA после обработки клеток 293T или HeLa рекомбинантным аденоассоциированным вирусом AAV-GAD65-modi.

На фиг.9 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности и совместном введении вирусов AAV-GAD65 и AAV-GDNF или вирусов AAV-IL-10 и AAV-GDNF.

На фиг.10 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности и совместном введении вирусов AAV-GAD65 и AAV-IL-10.

На фиг. 11 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при совместном введении вирусов AAV-GAD65 и AAV-GDNF или вирусов AAV-IL-10 и AAV-GDNF и совместном введении всех вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF.

На фиг. 12 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности и совместном введении плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF или плазмид pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF.

На фиг. 13 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности и совместном введении всех плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF.

На фиг.14 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при совместном введении плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF или плазмид pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF и совместном введении всех плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF.

На фиг. 15 представлен график, показывающий результаты сравнения анальгетической эффективности при совместном введении вирусов AAV-GAD65-modi и AAV-GDNF-IL-10 и совместном введении всех вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF.

Наилучший способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для облегчения или лечения боли, содержащую два или более генов, выбранных из группы, состоящей из гена, кодирующего глутаматдекарбоксилазу (GAD), гена, кодирующего интерлейкин-10 (IL-10), и гена, кодирующего глиальный нейротрофический фактор (GDNF).

В одном варианте осуществления комбинация двух или более генов может представлять гены GAD и IL-10, GAD и GDNF, IL-10 и GDNF или GAD, IL-10 и GDNF.

Два или более генов, выбранных из группы, состоящей из гена, кодирующего GAD, гена, кодирующего IL-10, и гена, кодирующего GDNF, могут находиться в форме, будучи включенными в носитель. Здесь носителем может быть вирусный вектор или невирусный вектор, такой как плазмида, липосома и т. д. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой некоторые из генов находятся в вирусном векторе, и остальные гены находятся в невирусном векторе.

В одном варианте осуществления гены могут быть в форме, в которой ген GAD находится в вирусном векторе, и ген IL-10 находится в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой ген GAD находится в вирусном векторе, и ген GDNF находится в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой ген IL-10 находится в вирусном векторе, и ген GDNF находится в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой ген GAD находится в вирусном векторе, и гены IL-10 и GDNF находятся в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой гены GAD и IL-10 находятся в вирусном векторе, и ген GDNF находится в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой гены GAD и GDNF находятся в вирусном векторе, и ген IL-10 находится в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой ген IL-10 находится в вирусном векторе, и гены GAD и GDNF находятся в невирусном векторе. Кроме того, гены могут быть в форме, в которой гены IL-10 и GDNF находятся в вирусном векторе, и ген GAD находится в невирусном векторе. Также гены могут быть в форме, в которой ген GDNF находится в вирусном векторе, и гены GAD и IL-10 находятся в невирусном векторе.

Кроме того, ген может быть в форме, будучи операбельно связанным в векторе. В частности, ген может быть в форме, будучи операбельно связанным в вирусном векторе или невирусном векторе.

Вирусный вектор может представлять, по меньшей мере, один, выбранный из группы, состоящей из вектора на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), вируса простого герпеса, лентивируса, ретровируса, цитомегаловируса, бакуловируса, поксвируса и т.д. В частности, вирусный вектор может быть на основе аденоассоциированного вируса.

В одном варианте осуществления ген, кодирующий GAD, может находиться операбельно связанным в носителе 1 (например, первом векторе), и ген, кодирующий IL-10, может находиться операбельно связанным в носителе 2 (например, втором векторе), и ген, кодирующий GDNF, может находиться операбельно связанным в носителе 3 (например, в третьем векторе). Кроме того, один носитель может содержать два или более генов.

Невирусный вектор может представлять, по меньшей мере, один, выбранный из группы, состоящей из плазмиды, липосомы, катионного полимера, мицеллы, эмульсии и твердых липидных наночастиц.

Как здесь используется, термин «плазмида» относится к циклическому фрагменту ДНК, существующему отдельно от хромосомы бактерий. Плазмиды не имеют генов, необходимых для выживания бактерий, но содержат гены, необходимые для резистентности к некоторым антибиотикам и для обмена генами между бактериями. Кроме того, плазмиды могут реплицироваться независимо от хромосом и содержать селектируемые маркеры.

Как здесь используется, термин «липосома» относится к небольшой везикуле, полученной образованием бислоя за счет наличия гидрофильной части и гидрофобной части, когда молекула, имеющая как гидрофобную часть, так и гидрофильную часть, такая как фосфолипид, суспендируется в водном растворе. Липосома отделена от внешней оболочки мембраной, состоящей из липидного бислоя, и липосомы, содержащие ДНК, мРНК и т. д., можно использовать в качестве переносчиков генетической информации.

Как здесь используется, термин «катионный полимер» относится к катионному липиду или полимерному соединению, которое представляет собой вещество, образующее комплекс посредством ионной связи с анионной ДНК и доставляет ДНК в клетку.

Как здесь используется, термин «мицелла» относится к термодинамически стабильному коллоидному агрегату, образованному из молекул, состоящих из полярной группы и неполярной гидрофобной группы, таких как поверхностно-активные вещества и молекулы липидов, посредством ассоциации с помощью ван-дер-ваальсовых сил или тому подобное в растворе. Кроме того, мицеллы, содержащие ДНК, мРНК и тому подобное, можно использовать в качестве переносчиков генетической информации.

Как здесь используется, термин «эмульсия» означает, что, когда два раствора разных фаз смешиваются, то одна жидкость образует мелкие частицы и диспергируется в другой жидкости. ДНК, мРНК и тому подобное могут находиться в центре частицы в эмульсии, которую можно использовать в качестве переносчиков генетической информации.

Как здесь используется, термин «твердая липидная наночастица» относится к препарату в форме, в которой лекарственное средство содержится в микрочастице наноразмера, полученной из твердого липида вместо жидкого липида.

Носитель 1 (например, первый вектор), содержащий любой один ген, выбранный из группы, состоящей из генов GAD, IL-10 и GDNF, и носитель 2 (например, второй вектор), содержащий любой один ген, выбранный из группы оставшихся генов, не включенных в носитель 1 по настоящему изобретению, может иметь соотношение смешивания на основе титра вируса на единицу объема от 1:1 до 100 или от 1 до 100:1. В частности, соотношение смешивания на основе титра вируса на единицу объема носителя 1 и носителя 2 может составлять от 1:1 до 10 или от 1 до 10:1.

Носитель 1 (например, первый вектор), содержащий ген, кодирующий GAD, носитель 2 (например, второй вектор), содержащий ген, кодирующий IL-10, и носитель 3 (например, третий вектор), содержащий ген, кодирующий GDNF, по настоящему изобретению могут иметь соотношение смешивания на основе титра вируса на единицу объема от 1:0,1 до 10:0,1 до 10.

Как здесь используется, термин «операбельно связанный» означает, что введенный ген связан с регуляторной последовательностью таким образом, что экспрессия может иметь место в клетке-хозяине. Регуляторная последовательность представляет собой последовательность ДНК, которая регулирует экспрессию гена, и может включать разные регуляторные элементы, такие как промоторы и энхансеры, или сигнал полиаденилирования. Кроме того, регуляторная последовательность обеспечивает сайт связывания транскрипционного фактора, который контролирует экспрессию введенного гена, и может влиять на сложную структуру транскрипционным фактором для определения функции транскрипционного фактора.

Как здесь используется, термин «GAD» относится к ферменту, который катализирует декарбоксилирование глутамата с образованием GABA (гамма-аминомасляной кислоты). GAD может представлять GAD65 или GAD67. В частности, GAD65 может происходить от человека, крысы, собаки, кошки или лошади, не ограничиваясь этим. Ген, кодирующий GAD, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, 4, 32, 34 или 36.

Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 2 или 3, и может быть последовательностью мРНК, показанной в NCBI референсной последовательности NCBI:NM_000818.2. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, может представлять нуклеотидную последовательность, которая была кодон-оптимизирована, чтобы подходила для последовательности ДНК, показанной в SEQ ID NO: 5, или гена, кодирующего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4, который может быть последовательностью мРНК, показанной в NCBI референсной последовательности NCBI:NM_000817.2. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 33. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 34, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 35, и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 36, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 37.

Кроме того, ген, кодирующий GAD, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант GAD, который может сохранять активность GAD и продуцировать GABA. Вариант GAD включает все последовательности, которые сохраняют характеристики GAD в отношении продукции GABA. Несмотря на то, что она не ограничивается какой-либо одной последовательностью, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант GAD, предпочтительно может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, или 90% или более, с аминокислотной последовательностью GAD, описанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант GAD, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, или 90% или более с нуклеотидной последовательностью GAD, описанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

Термин «% гомологии последовательностей» определяется сравнением областей сравнения в состоянии, в котором две последовательности оптимально выровнены. Кроме того, некоторые из нуклеотидных последовательностей в областях сравнения могут включать добавления или делеции (т. е. гэпы) относительно референсной последовательности (без добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Как здесь используется, термин «IL-10» относится к противовоспалительному цитокину, относящемуся к цитокину II класса (Renauld, Nat. Rev. Immunol., 2003). IL-10 находится в форме гомодимера, состоящего из двух субъединиц, каждая из которых имеет длину из 178 аминокислот. Он также известен как фактор, ингибирующий синтез цитокинов (CSIF) у человека. IL-10 выполняет функцию ингибирования активности NK-клеток (естественных киллеров) в иммунном ответе и образует комплекс с рецептором IL-10, для участия в трансдукции сигналов. IL-10 может представлять белок, происходящий от человека, крысы, собаки, кошки или лошади, не ограничиваясь этим. Ген, кодирующий IL-10, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, 9, 38, 40 или 42.

В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 7 или 8, и может быть последовательностью мРНК, показанной в NCBI референсной последовательности NCBI:NM_012854.2. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 10 или 14, и может быть последовательностью мРНК, показанной в NCBI референсной последовательности NCBI:NM_000572.2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 38, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 39. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 40, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 41, и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 42, может представлять ДНК, показанную в SEQ ID NO: 43.

Кроме того, ген, кодирующий IL-10, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант IL-10, который сохраняет активность IL-10. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант IL-10, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более с аминокислотной последовательностью IL-10, показанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант IL-10, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более с нуклеотидной последовательностью IL-10, показанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

Как здесь используется, термин «GDNF» относится к белку, входящему в семейство лигандов GDNF. Семейство лигандов GDNF состоит из GDNF, нейротурина (NRTN), артемина (ARTN) и персефина (PSPN). Кроме того, GDNF представляет белок, который способствует выживаемости многих видов нейронов и передает сигналы через рецептор GFRα1. GDNF может представлять белок, происходящий от человека, крысы, собаки, кошки или лошади, не ограничиваясь этим. Ген, кодирующий GDNF, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11, 44, 46 или 48.

В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 12 или 13, и может быть последовательностью мРНК, показанной в NCBI референсной последовательности NCBI:NM_199231.2. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 44, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 45. Нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 46, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 47, и нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показанная в SEQ ID NO: 48, может представлять последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 49.

Кроме того, ген, кодирующий GDNF, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант GDNF, который сохраняет активность GDNF. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант GDNF, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, или 90% или более с аминокислотной последовательностью GDNF, показанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая вариант GDNF, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности, по меньшей мере, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более с нуклеотидной последовательностью GDNF, показанной выше, и наиболее предпочтительно, может представлять нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию последовательности на уровне 95% или более.

GABA, продукт гена GAD, обладает эффектом блокирования трансдукции болевых сигналов, но ее избыточные количества могут вызывать такие симптомы, как зуд, головокружение, сонливость и т. д., а также побочные эффекты, такие как увеличение частоты сердечных сокращений или частоты дыхательных движений (Longo, Am. Fam. Physician, 2000).

Известно, что IL-10 является цитокином, который проявляет противовоспалительное действие, но могут возникнуть побочные эффекты, такие как гриппоподобные симптомы и тому подобное (Friedrich, J. Invest. Dermatol., 2002).

Кроме того, известно, что экспрессия GDNF проявляет анальгетическую эффективность при различных болях, таких как нейропатическая боль и тому подобное, но сообщалось, что в экспериментах на обезьянах избыточное введение вызывало повреждение нейронов головного мозга (Hovland, Toxicol. Pathol., 2007).

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может проявлять анальгетическое действие с небольшим количеством генов или носителей, содержащих их. Композиция по настоящему изобретению состоит из вектора, содержащего ген, кодирующий GAD, вектора, содержащего ген, кодирующий противовоспалительный цитокин в нервных тканях, и/или вектора, содержащего ген, кодирующий GDNF. Посредством совместного введения веществ, обладающих различными механизмами анальгетического действия, можно достичь аналогичного или лучшего эффекта облегчения или лечения боли в более низкой дозировке, чем при введении по отдельности.

В частности, согласно настоящему изобретению, когда два или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов, кодирующих GAD65, IL-10 и GDNF, вводятся совместно, то возникает синергетический анальгетический эффект. Следовательно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть пригодна для облегчения или лечения боли.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения первый вектор, второй вектор и/или третий вектор могут представлять векторы на основе аденоассоциированного вируса. Аденоассоциированный вирус не ограничивается конкретным серотипом и предпочтительно может быть любым из AAV1-AAV9.

Боль может быть выбрана из группы, состоящей из ноцицептивной боли, психогенной боли, воспалительной боли, патологической боли, нейропатической боли, боли при раке, послеоперационной боли, боли при невралгии тройничного нерва, идиопатической боли, диабетической нейропатической боли или мигрени. В конкретном примере боль может представлять собой боль при пояснично-крестцовой радикулопатии (LSR).

Воспалительная боль относится к боли, связанной с повреждением тканей и инфильтрацией иммунных клеток. Кроме того, патологическая боль означает болезненное состояние, при котором боль вызвана повреждением нервной ткани или ее аномальной функцией. Кроме того, патологическая боль может быть дисфункциональной болью, такой как фибромиалгия, боль при синдроме раздраженного кишечника или головная боль напряжения.

Кроме того, боль может включать боль в спине, которая может быть анатомически различимой: боль в шее, боль в средней части спины, боль в нижней части спины или боль в копчике. Кроме того, боль может представлять, по меньшей мере, одну, выбранную из группы, состоящей из нейропатической боли, боли при раке, послеоперационной боли, боли при невралгии тройничного нерва, идиопатической боли, диабетической нейропатической боли или мигрени и тому подобного. В конкретном примере боль может представлять собой боль при пояснично-крестцовой радикулопатии.

Нейропатическая боль может быть вызвана повреждением или заболеванием, которое отрицательно влияет на соматосенсорную систему. Нейропатическая боль может представлять аномальное ощущение, называемое аллодинией и дизестезией. Кроме того, общие характеристики нейропатической боли включают чувство жара или холода, покалывание как булавками и иголками, онемение и зуд. Напротив, ноцицептивная боль часто проявляется в виде ноющей боли.

Кроме того, мигрень ассоциирована с рядом симптомов со стороны вегетативной нервной системы и является хроническим заболеванием, которое вызывает головные боли со степенью тяжести от незначительной до сильно выраженной. Известно, что мигрень связана с повышенной возбудимостью коры головного мозга и аномальной регуляцией болевых нейронов в ядре тройничного нерва ствола головного мозга (Noseda, Pain, 2013).

В частности, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать для облегчения или лечения нейропатической боли и хронической боли при раке.

Как здесь используется, термин «облегчение или лечение» означает любое действие, которое ослабляет или изменяет целебным образом болевые симптомы введением композиции по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать физиологически приемлемый носитель. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать подходящие эксципиенты и разбавители, обычно используемые в приготовлении фармацевтических композиций. Кроме того, композиции по настоящему изобретению можно использовать посредством их приготовления общими способами в виде оральных составов, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т. д., составов для наружного применения, суппозиториев или инъекционных составов. Конкретно, фармацевтическая композиция может быть в форме инъекционного препарата. В отношении подходящих составов, известных в данной области, то можно использовать составы, которые приведены в Remington's Pharmaceutical Science (1985).

Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать соль (хлорид натрия), лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т. д., в качестве носителей, эксципиентов и разбавителей. Для формуляции фармацевтической композиции по настоящему изобретению обычно можно использовать разбавители или эксципиенты, такие как наполнители, добавки, связующие вещества, увлажнители, дезинтегрирующие агенты, поверхностно-активные вещества и т.д.

Составы для парентерального введения могут включать стерильные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные составы и суппозитории. Пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и инъецируемый сложный эфир, такой как этилолеат и т. д., можно использовать для неводных растворов и суспензий. Витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерожелатин и т. д. можно использовать в качестве основы для суппозиториев.

Настоящее изобретение также относится к способу облегчения или лечения боли, включающему введение фармацевтической композиции, содержащей два или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов, кодирующих GAD, IL-10 и GDNF, субъекту, нуждающемуся в этом.

Боль представляет боль, аналогичную описанной выше в отношении фармацевтической композиции.

Субъектом может быть млекопитающее, включая человека, или клетка и/или ткань, выделенная из организма млекопитающего, включая человека. Как здесь используется, термин «животное, отличное от человека» предназначен для включения всех позвоночных животных, которые включают млекопитающих и животных, отличных от млекопитающих, таких как приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, земноводные, рептилии и т.д.

В отношении пути введения, дозы и кратности введения, то фармацевтическую композицию можно вводить субъекту различными путями и в различных дозах, в зависимости от состояния пациента и наличия или отсутствия побочных эффектов, и специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать диапазон оптимальных способов введения, доз и кратностей введения. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить в комбинации с другим лекарственным средством или физиологически активным веществом, о котором известно, что оно проявляет терапевтическую эффективность при расстройстве, которое лечат. Также фармацевтическая композиция может быть приготовлена в форме комбинированной композиции.

В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть обеспечена в форме состава для инъекции. Например, инъекции могут быть включать: подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию, эпидуральную инъекцию или интратекальную инъекцию и тому подобное. Конкретно, фармацевтическую композицию можно вводить посредством эпидуральной инъекции или интратекальной инъекции, и более конкретно, ее можно вводить посредством трансфораминальной эпидуральной инъекции или интратекальной инъекции.

Как здесь используется, термин «трансфораминальная эпидуральная инъекция» относится к способу введения лекарственного средства внутрь межпозвонкового отверстия, которое представляет пространство, где нервы выходят из спинного мозга через пространство между позвоночными вырезками и в пространство вне твердой мозговой оболочки, которая окружает спинной мозг и спинномозговые нервы. В одном варианте осуществления, если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена из вирусов, то лекарственное средство можно вводить внутрь межпозвонкового отверстия субъекта проведением терапии эпидуральной инъекцией.

Как здесь используется, термин «интратекальная инъекция» относится к способу введения путем инъекции лекарственного средства в пространство внутри твердой мозговой оболочки спинномозгового канала. В одном варианте осуществления, если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению приготовлена из плазмид, то лекарственное средство может быть введено внутрь спинномозгового канала субъекта проведением терапии интратекальной инъекцией.

В частности, если фармацевтическая композиция приготовлена из вирусных векторов, то ее можно вводить взрослому человеку в количестве от 1,0 × 10⁶ до 1,0 × 10¹⁴ vg. Кроме того, когда нужно вводить два типа вирусов, то каждый тип вирусов можно вводить в количестве от 5,0 × 10⁵ до 5,0 × 10¹³ vg. Если необходимо ввести три типа вирусов, то каждый тип вирусов можно вводить в количестве от 3,0 × 10⁵ до 3,0 × 10¹³ vg.

Кроме того, если фармацевтическая композиция приготовлена из невирусных векторов, то ее можно вводить взрослому человеку в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл. Также, если фармацевтическая композиция приготовлена из плазмидных векторов, то дозировка может составлять 0,1 мл, 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл или более, включая все значения и диапазоны между ними.

В отношении кратности введения вирусного вектора, то его можно вводить один или более раз, или от 1 до 10 раз. Также его можно вводить с интервалом от 1 суток до 1 месяца или от 1 месяца до 1 года в случае повторного введения. Кроме того, если фармацевтическая композиция приготовлена из невирусных векторов, то ее можно вводить 1 или более раз, или от 1 до 10 раз. Кроме того, ее можно вводить с интервалом от 12 до 24 ч или от 1 до 14 суток в случае многократного введения.

Настоящее изобретение относится к применению фармацевтической композиции по настоящему изобретению для облегчения или лечения боли.

Настоящее изобретение обеспечивает применение фармацевтической композиции по настоящему изобретению для получения терапевтического агента для облегчения или лечения боли.

Способы осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры. Однако следующие примеры приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Приготовление и анализ свойств рекомбинантного аденоассоциированного вируса

Аденоассоциированные вирусы, необходимые для настоящего изобретения, конструировали и получали на основе безхелперной системы AAV (Agilent).

Пример 1.1. Конструирование плазмиды pAAV-GAD65

Для конструирования плазмиды pAAV-GAD65, показанной на фиг. 1, промоторную область CMV в pJDK-rGAD65 (Lee, Gene Ther., 2005) амплифицировали с использованием ПЦР, и затем полученный продукт вводили в pGEM-T (Promega) для получения pGEM-Т-СMV. Последовательности праймеров, использованные для амплификации промотора CMV, являются следующими:

F-JDK (SEQ ID NO: 15): 5'-TTCGGCCGTCGAGGAGCTTGGCCCATTG-3'

R-JDK (SEQ ID NO: 16): 5'-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'.

В отношении гена GAD65, то ген с последовательностью, показанной SEQ ID NO: 3, конструировали кодон-оптимизацией, чтобы он подходил для человека, на основе человеческой GAD65 (NCBI NM_000818.2), показанной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и передавали в Bioneer для синтеза гена. Ген hGAD65, введенный в pGEM-T, обрабатывали NheI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 1,7 т.п.н. Затем его подвергали лигированию с фрагментом ДНК размером 3,7 т.п.н., полученным обработкой pGEM-T-CMV NheI и SalI, для завершения конструирования pGEM-T-CMV-hGAD65.

SV40pA амплифицировали проведением ПЦР с использованием pCI (Invitrogen) в качестве матрицы, и затем полученный продукт обрабатывали ClaI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 222 п.н. Фрагмент ДНК подвергали лигированию с фрагментом ДНК размером 5,4 т.п.н., полученным разрезанием pGEM-T-CMV-hGAD65 с использованием ClaI и SalI, с получением окончательной конструкции pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA. Последовательности праймеров, использованные для амплификации SV40pA, являются следующими:

F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'

R-SV40pA (SEQ ID NO: 18): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG-3'.

Для конструирования аденоассоциированного вирусного вектора ген резистентности к ампициллину в pAAV-MCS (Agilent) заменяли геном резистентности к канамицину. Ген резистентности к канамицину амплифицировали с помощью ПЦР с использованием pET-28 (а) (Novagen) в качестве матрицы. Амплифицированный ген резистентности к канамицину длиной 816 п.н. подвергали лигированию с pGEM-T для получения pGEM-T-Kan^'. Последовательности праймеров, использованные для амплификации гена резистентности к канамицину, являются следующими:

F-Kan (SEQ ID NO: 19): 5'-AGGCGCCATGAGCCATATTCAACGGGAA-3'

R-Kan (SEQ ID NO: 20): 5'-TTCATGATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'.

Для вставки гена резистентности к канамицину были соответственно созданы сайты узнавания рестриктаз SpeI и EcoRV мутагенезом выше и ниже гена резистентности к ампициллину в pAAV-MCS, и затем полученную конструкцию снова обрабатывали SpeI и EcoRV. Полученный продукт подвергали лигированию с фрагментом ДНК, полученным разрезанием ранее сконструированной pGEM-T-Kan^r с помощью NheI и EcoRV, с получением pAAV-MCS-Kan^r.

Сконструированную pAAV-MCS-Kan^r обрабатывали NotI и BamHI, и затем подвергали лигированию с фрагментом ДНК размером 2,7 т.п.н., полученным путем разрезания pGEM-T-CMV-hGAD65-SV40pA с помощью EagI и PvuI, с получением pssAAV-GAD65.

Для введения экспрессионной кассеты GAD65 в pVAX1 (Invitrogen), генерировали сайт узнавания рестриктазы BamHI мутагенезом ниже bGHpA. Затем полученный продукт разрезали с помощью MluI и NheI с получением фрагментов ДНК. Промоторные области LITR и CMV амплифицировали с помощью ПЦР с использованием pssaAV-GAD65 в качестве матрицы и клонировали в pGEM-T easy (Promega). Затем полученную конструкцию разрезали с помощью AscI и NheI и подвергали лигированию с предварительно приготовленным вектором pVAX1, для конструирования pVAX1-LITR-CMV. Последовательности праймеров, использованные для амплификации промоторной области LITR и CMV, являются следующими:

F-ITR (SEQ ID NO: 21): 5'-ATGGCGCGCCCCTGGCCTTTTGCTGGCC-3',

R-JDK (SEQ ID NO: 16): 5'-GACGTCGACCTAGCTAGCGAATTCGGGGCCGCGGAG-3'.

pVAX1-LITR-CMV снова разрезали NotI и NheI с получением фрагментов ДНК. PSSAAV-GAD65 разрезали EagI и NheI и подвергали лигированию с предварительно приготовленными фрагментами ДНК для конструирования pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA.

PVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA разрезали HpaI и BamHI с получением фрагментов ДНК. Кроме того, psA-SV40pA-RITR, которая ранее была получена амплификацией ПЦР с использованием pssaAV-GAD65 в качестве матрицы и клонированием в pGEM-T easy, обрабатывали HpaI и BamHI с получением фрагментов ДНК. Два фрагмента ДНК лигировали для завершения конструирования pVAX1-LITR-CMV-hGAD65-SV40pA-RITR (в дальнейшем сокращенно обозначенной как «pAAV-GAD65»). Последовательности праймеров, использованные для амплификации области SV40pA и RITR, являются следующими:

F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'

R-ITR (SEQ ID NO: 22): 5'-ATGGATCCGCTAGTAAATACCGCATCAG-3'.

Схематическое изображение плазмиды pAAV-GAD65 показано на фиг. 1.

Для конструирования модифицированной pAAV-GAD65 проводили следующую процедуру.

Сначала вектор разрезали Nhe1, и затем произвольную случайную нуклеотидную последовательность вставляли между CMV-промотором и геном GAD65 методом инфузии. Вставленные нуклеотидные последовательности являются следующими:

Scramble stuffer (SEQ ID NO: 29):

5'-GTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCC-3'

Stuffer_scramble_F (SEQ ID NO: 30):

5'-CTAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCC-3'

Stuffer_scramble_R (SEQ ID NO: 31):

5'-CTAGGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGAC-3'.

Затем нуклеотидную последовательность WPRE (Schambach, Gene Ther., 2006), из которой была удалена область Х-белка, которая может оказывать онкогенный эффект, амплифицировали с помощью ПЦР и вставляли в конец гена GAD65 с использованием рестриктаз Pac1 и Hpa1. В то же время некоторый участок SV40pA удаляли для получения модифицированной SV40pA. Последовательности праймеров, использованные для амплификации WPRE, являются следующими:

WPRE_Pac1_F (SEQ ID NO: 25):

5'-GGTGGTTTAATTAAAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTG-3'

WPRE_modi_Hpa1_R (SEQ ID NO: 26): 5'-GGTGGTGTTAACGACAACACCACGGAATTG-3'.

Окончательно модифицированная плазмида представляла pVAX1-LITR-CMV-scramble stuffer-hGAD65-WPRE (modi)-SV40pA (modi)-RITR (в дальнейшем сокращенно обозначенная как «pAAV-GAD65-modi»), и ее схематическое изображение приведено на фиг. 1.

Пример 1.2. Конструирование плазмиды pAAV-IL-10

Плазмиду pAAV-IL-10 конструировали аналогично способу, описанному в примере 1.1. В отношении гена крысиного IL-10, то ген, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 8, конструировали кодон-оптимизацией, чтобы он подходил для крыс, на основе человеческого IL-10 (NCBI NM-012854), представленного аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, и передавали в Bioneer для синтеза гена. Ген rIL-10 амплифицировали проведением ПЦР с использованием крысиного гена IL-10, вставленного в pGEM-T easy в качестве матрицы, и затем полученный продукт обрабатывали NheI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 0,5 т.п.н. Кроме того, PGEM-T-CMV обрабатывали NheI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 3,7 т.п.н. Два фрагмента ДНК лигировали с получением pGEM-T-CMV-rIL-10. Последовательности праймеров, использованные для амплификации rIL-10, являются следующими:

F-rIL-10 (SEQ ID NO: 23): 5'-CCGCTAGCGCCACCATGCCT-3'

R-rIL-10 (SEQ ID NO: 24): 5'-GACGTCGACGCCATCGATGGCTTAATTAATCAATTCTTC-3'.

В отношении SV40pA, то ген амплифицировали проведением ПЦР с использованием pCI в качестве матрицы, и затем обрабатывали NotI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 222 п.н. Кроме того, pGEM-T-CMV-rIL-10 обрабатывали ClaI и SalI с получением фрагмента ДНК размером 4,2 т.п.н. Два фрагмента ДНК лигировали для конструирования pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA. Последовательности праймеров, использованные для амплификации SV40pA, являются следующими:

F-SV40pA (SEQ ID NO: 17): 5'-CCATCGATCAGACATGATAAGATACATTGATGAG-3'

R-SV40pA (SEQ ID NO: 18): 5'-GACGTCGACGCGGCCGCTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG-3'.

pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA обрабатывали EagI с получением фрагмента ДНК размером 1,6 т.п.н. Кроме того, pAAV-MCS-Kan^r обрабатывали NotI и BamHI с получением фрагментов ДНК. Затем два фрагмента ДНК лигировали для конструирования pssAAV-CMV-rIL-10-SV40pA (далее сокращенно обозначенной как «pAAV-IL-10»). Схематическое изображение плазмиды pAAV-IL-10 приведено на фиг. 2.

Пример 1.3. Конструирование плазмиды pAAV-GDNF

В отношении гена человеческого GDNF, то ген, представленный SEQ ID NO: 13, конструировали кодон-оптимизацией, чтобы он подходил для человека, на основе человеческого GDNF (NCBI NM_199231.2), представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, и передавали в Bioneer для синтеза гена. Ген hGDNF, вставленный в плазмиду pGEM-B1, обрабатывали NheI и PacI с получением фрагмента ДНК размером примерно 0,6 т.п.н. Плазмиду pGEM-T-CMV-rIL-10-SV40pA обрабатывали NheI и PacI с получением фрагмента размером 2,8 т.п.н., из которого был удален ген rIL-10. Два фрагмента ДНК лигировали с получением плазмиды pGEM-T-CMV-hGDNF-SV40pA.

Затем полученную плазмиду pGEM-T-CMV-hGDNF-SV40pA обрабатывали EagI с получением фрагмента ДНК размером 1,5 т.п.н. Кроме того, pAAV-MCS-Kan^r обрабатывали NotI и BamHI с получением фрагмента ДНК размером 1,8 т.п.н. Два фрагмента ДНК лигировали для конструирования pssAAV-CMV-hGDNF-SV40pA-Kan^r (далее сокращенно обозначенной как «pAAV-GDNF»). Схематическое изображение плазмиды pAAV-GDNF приведено на фиг. 3.

Пример 1.4. Конструирование плазмиды pAAV-GDNF-IL-10

Промотор CAG (цитомегаловирусный энхансер, промотор гена β-актина курицы и поли(А)-сигнал гена β-глобина кролика) подвергали ПЦР-амплификации с использованием pAxCAwtit2, входящей в набор двойной экспрессии аденовируса (Takara), и обрабатывали ApaI и XbaI для повышения экспрессии, тем самым удаляя примерно 80% области β-актина курицы в промоторе CAG с получением короткого промотора CAG (sCAG) (Fagoe, Gene Ther., 2014). В отношении гена человеческого IL-10, то ген, кодирующий SEQ ID NO: 14, конструировали кодон-оптимизацией гена, кодирующего SEQ ID NO: 9, для того, чтобы он подходил для человека, и передавали в Bioneer для синтеза гена. Затем фрагмент ДНК поли(A)-сигнала гена бычьего гормона роста (bGH) получали с помощью ПЦР-амплификации. PVAX1/sCAG-hIL-10-bGHpA конструировали с использованием pVAX1 (Invitrogen) для включения промотора и поли(А)-сигнала гена человеческого IL-10.

Затем pVAX1/CMV-hGDNF-SV40pA получали аналогично способу, описанному в примере 1.1., с использованием гена человеческого GDNF из примера 1.3. Затем генную кассету SV40pA-hGDNF-CMV амплифицировали проведением ПЦР с использованием pVAX1/CMV-hGDNF-SV40pA в качестве матрицы и получали фрагмент ДНК размером 1,5 т.п.н. Последовательности праймеров, использованные для амплификации генной кассеты, являются следующими:

SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-F (SEQ ID NO: 27):

5'-CCTGCGGCCGGTCGACTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC-3'

SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-R (SEQ ID NO: 28):

5'-AATAATCAATGTCGACTCGAGGAGCTTGGCCCATT-3'

Затем pVAX1/sCAG-hIL-10-bGHpA обрабатывали SalI с получением фрагмента ДНК размером примерно 3,9 т.п.н., и фрагмент ДНК размером 1,5 т.п.н., описанный выше, вставляли в фрагмент ДНК размером 3,9 т.п.н., используя набор для клонирования ДНК In-Fusion HD (Clontech), с получением pVAX1/SV40pA-hGDNF-CMV-sCAG-hIL-10-bGHpA (в дальнейшем сокращенно обозначенной как «pAAV-GDNF-IL-10»). Плазмида pAAV-GDNF-IL-10 схематически показана на фиг.4.

Экспериментальный пример 1. Подтверждение экспрессии плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF и pAAV-GDNF-IL-10

Плазмидами pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF или pAAV-GDNF-IL-10, полученными соответственно в примерах 1.1.-1.4., трансфицировали клетки линии эмбриональной почки человека 293Т с использованием jetPRIME (Polyplus). Трансфицированные клетки культивировали в термостате при 37°С в течение 48 ч. Затем собирали клеточную культуральную среду или культивированные клетки. Клетки растворяли в растворителе, и полученные образцы обрабатывали каждым из антител к GAD65 (Merck Millipore), IL-10 (Santa Cruz) и GDNF (R & D systems) и подвергали анализу вестерн-блоттингом.

В частности, в случае pAAV-GAD65 клетки линии эмбриональной почки человека 293T обрабатывали 2 мкг плазмиды pAAV-GAD65 и культивировали в течение 48 ч. После этого культивированные клетки растворяли и экспрессию GAD65 в клетках подтверждали вестерн-блоттингом.

В случае плазмид pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF клетки линии эмбриональной почки человека 293Т обрабатывали 1 мкг плазмиды pAAV-IL-10 или плазмиды pAAV-GDNF и культивировали в течение 48 ч. После этого собирали культуральную среду и экспрессию IL-10 или GDNF в среде подтверждали вестерн-блоттингом.

В случае плазмиды pAAV-GDNF-IL-10 клетки линии эмбриональной почки человека 293Т обрабатывали 1 мкг плазмиды pAAV-GDNF-IL-10 и культивировали в течение 48 ч. После этого культивированные клетки растворяли и экспрессию внутриклеточных IL-10 и GDNF подтверждали вестерн-блоттингом.

В результате было подтверждено, что трансфицированные плазмиды pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF или pAAV-GDNF-IL-10 экспрессировались (фиг. 5 и 6).

Пример 2. Получение рекомбинантного аденоассоциированного вируса

Вирус AAV-IL-10, использованный в эксперименте, получали и очищали UNC Vector Core. Способ получения заключается в следующем. Клетки линии эмбриональной почки человека 293Т трансфицировали PVax-rIL-10, pHelper и pRC5. После этого полученный продукт подвергали очистке колоночной хроматографией для защиты вируса AAV5-IL-10. Титр продуцированного вируса измеряли с использованием кПЦР.

Вирусы AAV-GAD65 и AAV-GDNF получали и очищали KRcrogen. Способ получения заключается в следующем. AAV-трансгенами (плазмидами pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF) соответственно трансфицировали клетки линии эмбриональной почки человека 293Т с использованием кальций-фосфатного метода вместе с pHelper и pRC. В случае GAD65 использовали pRC5, введенную с капсидным геном серотипа 5. В случае GDNF использовали pRC1, введенную с капсидным геном AAV серотипа 1. Трансфицированные клетки культивировали в термостате при 37°С, и клетки собирали через 48 ч.

Затем выделяли и очищали только полосы, содержащие вирусы, методом высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия для защиты вирусов AAV5-GAD65 и AAV1-GDNF. Титры продуцированных вирусов измеряли с использованием кПЦР.

Вирус AAV-GDNF-IL-10 получали и очищали Cdmogen. Способ получения заключается в следующем. AAV-трансгеном (плазмидой pAAV-GDNF-IL-10) трансфицировали клетки линии эмбриональной почки человека 293Т с использованием кальций-фосфатного метода вместе с pHelper и pRC5. Трансфицированные клетки культивировали в термостате при 37°С, и клетки собирали через 48 ч.

Затем выделяли и очищали только полосы, содержащие вирусы, методом высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия для защиты вируса AAV5-GDNF-IL-10. Титр продуцированного вируса измеряли с использованием кПЦР.

Вирус AAV-GAD65-modi получали и очищали Cdmogen. Способ получения заключается в следующем. AAV-трансгеном (плазмидой pAAV-hGAD65-modi) трансфицировали клетки линии эмбриональной почки человека 293Т с использованием кальций-фосфатного метода вместе с pHelper и pRC5. Трансфицированные клетки культивировали в термостате при 37°С, и клетки собирали через 48 ч.

Затем выделяли и очищали только полосы, содержащие вирусы, методом высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия для защиты вируса AAV5-GAD65-modi. Титр продуцированного вируса измеряли с использованием _КПЦР.

Экспериментальный пример 2. Анализ свойств рекомбинантного аденоассоциированного вируса

Для изучения экспрессии белков рекомбинантного аденоассоциированного вируса, доставленного в клетку, клетки линии эмбриональной почки человека 293Т или клетки HeLa обрабатывали вирусами AAV-GAD65, AAV-GAD65-modi, AAV-IL-10 или AAV-GDNF, полученными, как описано выше, и экспрессию белков анализировали вестерн-блоттингом. В частности, клетки 293T или HeLa высевали из расчета 5 × 10⁵ клеток/лунку в 6-луночный планшет. На следующие сутки клетки соответственно обрабатывали 3 типами вирусов из расчета 10000 vg/лунку и затем культивировали в термостате при 37°С. Через 48 ч клетки собирали и растворяли в растворителе, и культуральную среду концентрировали с использованием системы Амикон (Merck Millipore). Затем полученные образцы соответственно обрабатывали антителами к GAD65 (Cell signaling), IL-10 (Santa Cruz) и GDNF (системы R & D) и подвергали анализу вестерн-блоттингом.

В результате было подтверждено, что каждый целевой белок экспрессировался в клеточном лизате клеток линии эмбриональной почки человека 293T или клеток линии HeLa, обработанных вирусами AAV-GAD65, AAV-GAD65-modi, AAV-IL-10 или AAV-GDNF (фиг. 7). Таким образом, было подтверждено, что аномалии в структурах и свойствах рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, использованных в эксперименте, отсутствовали.

Кроме того, для подтверждения того, что GAMA продуцируется вирусом AAV-GAD65 или AAV-GAD65-modi, культуральную среду клеток, обработанных вирусами AAV-GAD65 или AAV-GAD65-modi, собирали и подвергали анализу GABA ELISA (LDN). Для каждой экспериментальной группы готовили два идентичных образца по отдельности для проведения анализа, и гистограмма показывает значение для каждого образца.

В результате было подтверждено, что GABA секретируется в культуральную среду GAD65, введенной в клетки вирусом AAV-GAD65 или AAV-GAD65-modi (фиг. 8).

Экспериментальный пример 3. Сравнение анальгетической эффективности при введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности и совместном введении вирусов AAV-GAD65 и AAV-GDNF или AAV-IL-10 и AAV-GDNF

Экспериментальный пример 3.1. Подготовка образцов для введения

Вирусы, полученные в примере 2, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Вирусы AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF и AAV-GFP разводили в PBS с получением титров, показанных в таблице 1. Вирус AAV-GFP вводили в том же количестве, что и другие рекомбинантные аденоассоциированные вирусы. GFP представляет собой белок, не обладающий анальгетической эффективностью. Нужные вирусы смешивали в соответствии с титрами, указанными в таблице 1, и вводили в количестве 9,0 × 10⁸ vg/5 мкл на животное (vg: вирусный геном).

Таблица 1 Образцы Типы и титры вирусов AAV-GAD65 AAV-IL-10 AAV-GDNF AAV-GFP AAV-GFP - - - 9,0×10⁸
vg/5 мкл AAV-GAD65 9,0×10⁸
vg/5 мкл - - - AAV-IL-10 - 9,0×10⁸
vg/5 мкл - - AAV-GDNF - - 9,0×10⁸
vg/5 мкл - AAV-GAD65
+
AAV-GDNF 4,5×10⁸
vg/5 мкл - 4,5×10⁸
vg/5 мкл - AAV-IL-10
+
AAV-GDNF - 4,5×10⁸
vg/2,5 мкл 4,5×10⁸
vg/2,5 мкл -

Экспериментальный пример 3.2. Получение крыс с индуцированной нейропатической болью и введение образцов

Самцов крыс SD с массой 150-200 г подвергали ингаляционной анестезии. Затем верхнюю часть голени надрезали и, и оба конца общего малоберцового нерва и большеберцового нерва связывали, и узлы делали с интервалом от 0,5 до 1 см наложением шовного материала 7-0. Области между узлами двух нервных пучков разрезали ножницами, и место разреза зашивали. После этого крысам давали восстановиться от наркоза и возвращали в клетку. Через две недели проводили тест с волосками фон Фрея для исследования индукции боли, и затем соответственно вводили образцы, приготовленные в примере 2.1 (Decosterd, Pain, 2000).

Образцы вводили методом трансфораминальной эпидуральной инъекции в участок, смежный с ганглием дорсальных корешков (DRG). Крысу с индуцированной болью подвергали ингаляционной анестезии, и позвонки обнажали прямым надрезом на спине крысы на уровне поясничных позвонков от L3 до L5. На стороне открытого пространства делали видимым поперечный отросток L4, одна из проекций позвоночника. Крысу помещали в боковое положение, чтобы ее латеральная сторона была видна сверху, и было видно межпозвоночное отверстие L4.

Затем иглу, прикрепленную к катетеру, вводили в подготовленный образец, и шприц Гамильтона соединяли с противоположным концом катетера и вытягивали до отметки 5 мкл для введения образца в катетер. Шприц Гамильтона отсоединяли от катетера, и затем катетер фиксировали удерживанием на расстоянии 1 см от кончика иглы с помощью зажима Halsted-Mosquito. Затем, удерживая и вытягивая позвонок L4 вверх с помощью пинцета, кончик иглы, зафиксированный зажимом Halsted-Mosquito, другой рукой проводили вокруг межпозвонкового отверстия L4. Кончик иглы вводили в изогнутую область внутри межпозвонкового отверстия, пространство которого было закреплено. Затем удерживаемую иглу высвобождали.

После подтверждения того, что игла была зафиксирована, к катетеру, соединенному с противоположной стороной иглы, подсоединяли шприц на 1 мл. Осторожно нажимая на поршень шприца, образец медленно вводили вокруг ганглия дорсальных корешков крысы. После этого место разреза зашивали. Через 4 недели после введения образца наблюдали за болевыми реакциями с использованием теста с волосками фон Фрея.

Экспериментальный пример 3.3. Наблюдение за болевыми реакциями с использованием теста с волосками фон Фрея

Наблюдение за болевыми реакциями проводили с помощью теста с волосками фон Фрея. Метод заключается в том, чтобы рассчитать пороговое значение в соответствии с заранее определенным паттерном болевой реакции, с использованием набора из восьми волосков с массой 0,4; 0,6; 1; 2; 4; 6; 8 и 15 г.

Области, индуцирующие боль, исследовали по изменению положения от начального участка наружной части стопы до подушечки стопы, где генерировалась боль. Когда крысы внезапно отдергивали подушечку стопы и сжимали или облизывали подушечки стопы ртом при возникновении боли, то можно было обнаружить области, вызывающие боль. Если реакции имели место три или более раз, когда окружающую область пять раз прокалывали волоском на каждой стадии, то это рассматривалось в качестве проявления болевой реакции. Тестирование продолжали заменой волоска на следующей стадии. Таким образом, регистрировали болевой паттерн на каждой стадии.

Болевые паттерны регистрировали на основе таблицы паттернов, установленных S.R. Chaplan, и пороговые значения рассчитывали с использованием болевых паттернов (Chaplan, J. Neurosci. Methods, 1994). В отношении поведенческого анализа, то группы животных обследовались «вслепую» в течение определенного времени, и по меньшей, 3 эксперта проводили наблюдение, и результаты зарегистрированных паттернов статистически обрабатывали, чтобы провести анализ результатов по болевым реакциям.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда вирусы AAV-GAD65 и AAV-GDNF или AAV-IL-10 и AAV-GDNF комбинировали и вводили совместно по сравнению с введением вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности (фиг. 9).

Экспериментальный пример 4. Сравнение анальгетической эффективности при введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности и совместном введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF

Вирусы, полученные в примере 2, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Вирусы AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF и AAV-GFP разводили в PBS с получением титров, показанных в таблице 2. Вирус AAV-GFP вводили в том же количестве, что и другие рекомбинантные аденоассоциированные вирусы. GFP представляет собой белок, об анальгетической эффективности которого не сообщалось. Вирусы смешивали в соответствии с титрами, указанными в таблице 2, и вводили в количестве 9,0 × 10⁸ vg/5 мкл на животное.

Таблица 2 Образцы Типы и титры вирусов AAV-GAD65 AAV-IL-10 AAV-GDNF AAV-GFP AAV-GFP - - - 9,0×10⁸
vg/5 μl AAV-GAD65 9,0×10⁸
vg/5 мкл - - - AAV-IL-10 - 9,0×10⁸
vg/5 мкл - - AAV-GDNF - - 9,0×10⁸
vg/5 мкл - AAV-GAD65
+
AAV-IL-10
+
AAV-GDNF 3,0×10⁸
vg/5 мкл 3,0×10⁸
vg/5 мкл 3,0×10⁸
vg/5 мкл -

Животным, которых использовали в качестве модели боли, полученным аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.2, вводили образцы, приготовленные согласно титрам вирусов, указанным в таблице 2. Затем проводили тест с волосками фон Фрея аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.3., для наблюдения за болевыми реакциями.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда все вирусы AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF вводили совместно по сравнению с введением вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 или AAV-GDNF по отдельности (фиг. 10).

Экспериментальный пример 5. Сравнение анальгетической эффективности при совместном введении вирусов AAV-GAD65 и AAV-GDNF или вирусов AAV-IL-10 и AAV-GDNF и совместном введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF

Аденоассоциированные вирусы, полученные в примере 2, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Вирусы AAV-GAD65, AAV-IL-10, AAV-GDNF и AAV-GFP разводили в PBS для получения титров, указанных в таблице 3. AAV-GFP вводили в том же количестве, что и другие рекомбинантные аденоассоциированные вирусы. GFP представляет собой белок, который не обладает анальгетической эффективностью. Нужные вирусы смешивали в соответствии с титрами, указанными в таблице 3, и вводили в количестве 9,0 × 10⁸ vg/5 мкл на животное.

Таблица 3 Образцы Типы и титры вирусов AAV-GAD65 AAV-IL-10 AAV-GDNF AAV-GFP AAV-GFP - - - 9,0×10⁸
vg/5 мкл AAV-GAD65
+
AAV-GDNF 4,5×10⁸
vg/5 мкл - 4,5×10⁸
vg/5 мкл - AAV-IL-10
+
AAV-GDNF - 4,5×10⁸
vg/5 мкл 4,5×10⁸
vg/5 мкл - AAV-GAD65
+
AAV-IL-10
+
AAV-GDNF 3,0×10⁸
vg/5 мкл 3,0×10⁸
vg/5 мкл 3,0×10⁸
vg/5 мкл -

Животным, которых использовали в качестве модели боли, полученным аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.2, вводили образцы, приготовленные согласно титрам вирусов, указанным в таблице 3. Затем проводили тест с волосками фон Фрея аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.3., для наблюдения за болевыми реакциями.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда все вирусы AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF вводили совместно по сравнению с введением вирусов AAV-GAD65, AAV-IL -10 или AAV-GDNF по отдельности (фиг. 11).

Экспериментальный пример 6. Сравнение анальгетической эффективности при введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности и совместном введении плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF, или pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF

Экспериментальный пример 6.1. Подготовка образцов для введения

Плазмиды, полученные в примере 1, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Плазмиды pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF и pVAX1 разводили в Трис-ЭДТА буфере для получения концентраций, указанных в таблице 4. Плазмиду pVAX1 вводили в том же количестве, что и другие плазмиды. Сообщения о том, что плазмида pVAX1 обладает анальгетической эффективностью, отсутствуют. Нужные плазмиды смешивали в соответствии с содержанием, указанным в таблице 4, и вводили в количестве 30 мкг/50 мкл на животное.

Таблица 4 Образцы Типы и содержание плазмид pAAV-GAD65 pAAV-IL-10 pAAV-GDNF pVAX1 pVAX1 - - - 30 мкг/50 мкл pAAV-GAD65 30 мкг/50 мкл - - - pAAV-IL-10 - 30 мкг/50 мкл - - pAAV-GDNF - - 30 мкг/50 мкл - pAAV-GAD65
+
pAAV-GDNF 15 мкг/50 мкл - 15 мкг/50 мкл - pAAV-IL-10
+
pAAV-GDNF - 15 мкг/50 мкл 15 мкг/50 мкл -

Экспериментальный пример 6.2. Получение животной модели нейропатической боли и введение образцов

Самцов крыс SD с массой 150-200 г подвергали ингаляционной анестезии. Затем верхнюю часть голени надрезали и, и оба конца общего малоберцового нерва и большеберцового нерва связывали, и узлы делали с интервалом от 0,5 до 1 см наложением шовного материала 7-0. Области между узлами двух нервных пучков разрезали ножницами, и место разреза зашивали. После этого крысам давали восстановиться от наркоза и возвращали в клетку. Через две недели проводили тест с волосками фон Фрея для изучения индукции боли, и затем соответственно вводили образцы, приготовленные в примере 6.1 (Decosterd, Pain, 2000).

Образцы вводили методом интратекальной инъекции. Крысу с индуцированной болью подвергали ингаляционной анестезии, и позвонки обнажали прямым надрезом на спине крысы на уровне поясничного позвонка L5. Пробирку емкостью 50 мл помещали под крысу, чтобы расширить пространство между L5 и L6, и вставляли иглу размером 27 G × 13 мм. После этого шприц на 1 мл, заполненный 50 мкл образца, соединяли с иглой. Образец медленно вводили, слегка надавливая на поршень шприца. После этого разрез зашивали, и эту стадию завершали. Через один сутки после введения образцов наблюдали за болевыми реакциями с использованием теста с волосками фон Фрея.

Экспериментальный пример 6.3. Наблюдение за болевыми реакциями с помощью теста с волосками фон Фрея

Тест с волосками фон Фрея проводили аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.3. В результате было обнаружено, что анальгетический эффект был выше, когда плазмиды pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF или pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF вводили совместно по сравнению с введением плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности (фиг. 12).

Экспериментальный пример 7. Сравнение анальгетической эффективности при введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности и совместном введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF

Плазмиды, полученные в примере 1, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Плазмиды pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF и pVAX1 разводили в Трис-ЭДТА буфере для получения концентраций, указанных в таблице 5. Плазмиду pVAX1 вводили в том же количестве, что и другие плазмиды. Сообщения о том, что плазмида pVAX1 обладает анальгетической эффективностью, отсутствуют. Нужные плазмиды смешивали в соответствии с содержанием, указанным в таблице 5, и вводили в количестве 30 мкг/50 мкл на животное.

Таблица 5 Образцы Типы и содержание плазмид pAAV-GAD65 pAAV-IL-10 pAAV-GDNF pVAX1 pAAV-VAX1 - - - 30 мкг/50 мкл pAAV-GAD65 30 мкг/50 мкл - - - pAAV-IL-10 - 30 мкг/50 мкл - - pAAV-GDNF - - 30 мкг/50 мкл - pAAV-GAD65
+
pAAV-IL-10
+
pAAV-GDNF 10 мкг/50 мкл 10 мкг/50 мкл 10 мкг/50 мкл -

Животным, которых использовали в качестве модели боли, полученным аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 6.2, вводили образцы, приготовленные согласно титрам вирусов, указанным в таблице 5. Затем проводили тест с волосками фон Фрея аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.3., для наблюдения за болевыми реакциями.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда все плазмиды pAAV-GAD65, pAAV5-IL-10 и pAAV5-GDNF вводили совместно по сравнению с введением плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 или pAAV-GDNF по отдельности (фиг. 13).

Экспериментальный пример 8. Сравнение анальгетической эффективности при совместном введении плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF, или pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF и совместном введении плазмид pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF

Плазмиды, полученные в примере 1, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Плазмиды pAAV-GAD65, pAAV-IL-10, pAAV-GDNF и pVAX1 разводили в Трис-ЭДТА буфере для получения концентраций, указанных в таблице 6. Плазмиду pVAX1 вводили в той же концентрации и количестве, что и другие плазмиды. Сообщения о том, что плазмида pVAX1 обладает анальгетической эффективностью, отсутствуют. Нужные плазмиды смешивали в соответствии с содержанием, указанным в таблице 6, и вводили в количестве 30 мкг/50 мкл на животное.

Таблица 6 Образцы Типы и содержание плазмид pAAV-GAD65 pAAV-IL-10 pAAV-GDNF pVAX1 pVAX1 - - - 30 мкг/50 мкл pAAV-GAD65
+
pAAV-GDNF 15 мкг/50 мкл - 15 мкг/50 мкл - pAAV-IL-10
+
pAAV-GDNF - 15 мкг/50 мкл 15 мкг/50 мкг - pAAV-GAD65
+
pAAV-IL-10
+
pAAV-GDNF 10 мкг/50 мкл 10 мкг/50 мкл 10 мкг/50 мкл -

Животным, которых использовали в качестве модели боли, полученным аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 6.2, вводили образцы, приготовленные согласно титрам вирусов, указанным в таблице 6. Затем проводили тест с волосками фон Фрея аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 6.3., для наблюдения за болевыми реакциями.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда плазмиды pAAV-GAD65, pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF вводили совместно по сравнению с совместным введением плазмид pAAV-GAD65 и pAAV-GDNF или pAAV-IL-10 и pAAV-GDNF (фиг. 14).

Экспериментальный пример 9. Сравнение анальгетической эффективности при совместном введении вирусов AAV-GAD65-modi и AAV-GDNF-IL-10 и совместном введении вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF

Аденоассоциированные вирусы, полученные в примере 2, использовали для теста. За 30 мин до проведения эксперимента с введением животным реагенты, хранившиеся при -80°С, оттаивали при комнатной температуре и готовили перемешиванием на вортексе. Вирусы AAV-GAD65-modi, AAV-GDNF-IL-10, AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF разводили в PBS для получения титров, указанных в таблице 7. Нужные вирусы смешивали в соответствии с титрами, указанными в таблице 7, и вводили в количестве 1,0 × 10⁹ vg/5 мкл или 1,5 × 10⁹ vg/5 мкл на животное.

Таблица 7 Образцы Типы и титры вирусов AAV-GAD65-modi AAV-GDNF-IL-10 AAV-GAD65 AAV-IL-10 AAV-GDNF Контроль - - - - - AAV-GAD65-modi
+
AAV-GDNF-IL-10 5,0×10⁸
vg/5 мкл 5,0×10⁸
vg/5 мкл - - - AAV-GAD65
+
AAV-IL-10
+
AAV-GDNF - - 5,0×10⁸
vg/5 мкл 5,0×10⁸
vg/5 мкл 5,0×10⁸
vg/5 мкл

Животным, которых использовали в качестве модели боли, полученным аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.2, вводили образцы, приготовленные согласно титрам вирусов, указанным в таблице 7. Затем проводили тест с волосками фон Фрея аналогично методу, описанному в экспериментальном примере 3.3., для наблюдения за болевыми реакциями.

В результате было установлено, что анальгетический эффект был выше, когда вирусы AAV-GAD65-modi и AAV-GDNF-IL-10 вводили совместно по сравнению с совместным введением всех вирусов AAV-GAD65, AAV-IL-10 и AAV-GDNF (фиг. 15).

--->

Список последовательностей

<110> KOLON LIFE SCIENCE, INC.

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛИ

<130> PCB706093KLS/PCT

<150> KR 2016/0143519

<151> 2016-10-31

<160> 49

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 585

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Ser Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Pro

50 55 60

Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asp Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Ser Lys Val Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Asn Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Val Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 2

<211> 2824

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

gcggccgccc gcacttcccg cctctggctc gcccgaggac gcgctggcac gcctcccacc 60

ccctcactct gactccagct ggcgtgcatg gtctgcctcg catcctcacg actcagctcc 120

ctccctctct cgtgtttttt tcctccgccg ccccctcatt catccccact gggctccctt 180

tccctcaaat gctctggggc tctccgcgct ttcctgagtc cgggctccga ggacccttag 240

gtagtcccgg tctcttttaa agctccccgg cttccaaagg gttgccacgt ccctaaaccc 300

tgtctccagc tcgcatacac acacgcacag acacgcacgt tttctgttcc tgcgtgacac 360

ccgccctcgc cgctcggccc cgccggtccc cgcgcggtgc cctcctcccg ccacacgggc 420

acgcacgcgc gcgcagggcc aagcccgagg cagctcgccc gcagctcgca ctcgcaggcg 480

acctgctcca gtctccaaag ccgatggcat ctccgggctc tggcttttgg tctttcgggt 540

cggaagatgg ctctggggat tccgagaatc ccggcacagc gcgagcctgg tgccaagtgg 600

ctcagaagtt cacgggcggc atcggaaaca aactgtgcgc cctgctctac ggagacgccg 660

agaagccggc ggagagcggc gggagccaac ccccgcgggc cgccgcccgg aaggccgcct 720

gcgcctgcga ccagaagccc tgcagctgct ccaaagtgga tgtcaactac gcgtttctcc 780

atgcaacaga cctgctgccg gcgtgtgatg gagaaaggcc cactttggcg tttctgcaag 840

atgttatgaa cattttactt cagtatgtgg tgaaaagttt cgatagatca accaaagtga 900

ttgatttcca ttatcctaat gagcttctcc aagaatataa ttgggaattg gcagaccaac 960

cacaaaattt ggaggaaatt ttgatgcatt gccaaacaac tctaaaatat gcaattaaaa 1020

cagggcatcc tagatacttc aatcaacttt ctactggttt ggatatggtt ggattagcag 1080

cagactggct gacatcaaca gcaaatacta acatgttcac ctatgaaatt gctccagtat 1140

ttgtgctttt ggaatatgtc acactaaaga aaatgagaga aatcattggc tggccagggg 1200

gctctggcga tgggatattt tctcccggtg gcgccatatc taacatgtat gccatgatga 1260

tcgcacgctt taagatgttc ccagaagtca aggagaaagg aatggctgct cttcccaggc 1320

tcattgcctt cacgtctgaa catagtcatt tttctctcaa gaagggagct gcagccttag 1380

ggattggaac agacagcgtg attctgatta aatgtgatga gagagggaaa atgattccat 1440

ctgatcttga aagaaggatt cttgaagcca aacagaaagg gtttgttcct ttcctcgtga 1500

gtgccacagc tggaaccacc gtgtacggag catttgaccc cctcttagct gtcgctgaca 1560

tttgcaaaaa gtataagatc tggatgcatg tggatgcagc ttggggtggg ggattactga 1620

tgtcccgaaa acacaagtgg aaactgagtg gcgtggagag ggccaactct gtgacgtgga 1680

atccacacaa gatgatggga gtccctttgc agtgctctgc tctcctggtt agagaagagg 1740

gattgatgca gaattgcaac caaatgcatg cctcctacct ctttcagcaa gataaacatt 1800

atgacctgtc ctatgacact ggagacaagg ccttacagtg cggacgccac gttgatgttt 1860

ttaaactatg gctgatgtgg agggcaaagg ggactaccgg gtttgaagcg catgttgata 1920

aatgtttgga gttggcagag tatttataca acatcataaa aaaccgagaa ggatatgaga 1980

tggtgtttga tgggaagcct cagcacacaa atgtctgctt ctggtacatt cctccaagct 2040

tgcgtactct ggaagacaat gaagagagaa tgagtcgcct ctcgaaggtg gctccagtga 2100

ttaaagccag aatgatggag tatggaacca caatggtcag ctaccaaccc ttgggagaca 2160

aggtcaattt cttccgcatg gtcatctcaa acccagcggc aactcaccaa gacattgact 2220

tcctgattga agaaatagaa cgccttggac aagatttata ataaccttgc tcaccaagct 2280

gttccacttc tctagagaac atgccctcag ctaagccccc tactgagaaa cttcctttga 2340

gaattgtgcg acttcacaaa atgcaaggtg aacaccactt tgtctctgag aacagacgtt 2400

accaattatg gagtgtcacc agctgccaaa atcgtaggtg ttggctctgc tggtcactgg 2460

agtagttgct actcttcaga atatggacaa agaaggcaca ggtgtaaata tagtagcagg 2520

atgaggaacc tcaaactggg tatcattttg cacgtgctct tctgttctca aatgctaaat 2580

gcaaacactg tgtatttatt agttaggtgt gccaaactac cgttcccaaa ttggtgtttc 2640

tgaatgacat caacattccc ccaacattac tccattacta aagacagaaa aaaataaaaa 2700

cataaaatat acaaacatgt ggcaacctgt tcttcctacc aaatataaac ttgtgtatga 2760

tccaagtatt ttatctgtgt tgtctctcta aacccaaata aatgtgtaaa tgtggacaca 2820

tctc 2824

<210> 3

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированный ген человеческой GAD65

<400> 3

atggcatctc cgggctccgg cttttggtcc ttcgggtcgg aagatggctc aggggattcc 60

gagaatcccg gcacagcgcg ggcctggtgt caagtggctc agaagttcac gggcggcatc 120

ggaaacaaac tgtgtgccct gctctacggc gacgccgaga agcccgcaga gagcggcggg 180

agccaacccc cgcgggccgc cgcccggaag gccgcctgcg cctgtgacca gaagccctgc 240

tcatgcagca aggtagatgt caactacgcg tttctccatg ccacagatct gctgccggct 300

tgcgacggtg aaaggcccac tttggccttt ctgcaggatg ttatgaacat tctgctgcag 360

tacgtggtga aaagtttcga ccggtcaacc aaagtgatcg actttcacta tcctaatgaa 420

cttctccagg agtacaattg ggagctggct gaccagccac agaacctgga ggaaatcttg 480

atgcattgcc aaactactct aaaatatgca attaaaacag gccatcctag atacttcaac 540

cagctttcta ccggtttgga tatggtgggg ctggcagccg actggctgac atccaccgca 600

aataccaaca tgttcaccta tgagatcgct cctgtcttcg tgcttttgga atacgtcacc 660

ctaaagaaga tgcgtgaaat cattggctgg ccaggaggct ctggtgatgg tatattttct 720

cccggcggcg cgatctctaa catgtatgcc atgatgatcg cacgctttaa gatgttccca 780

gaagtcaagg agaaaggaat ggctgctctt cccaggctca ttgccttcac gagtgaacac 840

agtcactttt ccctcaagaa gggggctgcc gccttaggga tcggaacaga cagcgtgatt 900

ctgataaagt gcgacgagag agggaaaatg attccatctg atcttgagag aaggattctt 960

gaagccaaac agaaagggtt tgtccctttc ctcgtgagtg ccacagctgg aaccaccgtg 1020

tacggcgcat ttgaccccct cttagctgtc gcggatatat gtaagaagta taagatctgg 1080

atgcacgtgg atgctgcttg gggtggggga ttactgatgt ccaggaaaca caagtggaaa 1140

ctgtctggcg tggagcgcgc caacagcgtg acgtggaatc cacacaaaat gatgggagtc 1200

cctttgcagt gctctgctct cctggttcga gaagagggac tgatgcagaa ttgcaaccaa 1260

atgcatgcct cctacctctt tcagcaggat aaacattatg acctgtctta cgacactggt 1320

gacaaggccc tgcagtgtgg gcgccacgtt gatgtattca agctatggct gatgtggagg 1380

gcaaagggga ctaccggttt tgaagcccat gttgacaaat gtctggagtt ggcagagtat 1440

ttatacaata tcataaaaaa ccgagaagga tatgagatgg tgtttgatgg caagcctcag 1500

cacacaaatg tctgcttctg gtacatccct cccagcctac gtactctgga ggacaacgaa 1560

gagagaatga gtcgcctctc gaaggtggct ccagtgatta aagccagaat gatggagtat 1620

ggaaccacaa tggtcagcta ccaacccttg ggggacaagg taaatttctt ccgcatggtc 1680

atctcaaacc cagcggcaac tcaccaagac attgatttcc tgattgaaga gatcgagcgg 1740

ctcggccagg atctgtga 1758

<210> 4

<211> 594

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ala Ser Ser Thr Pro Ser Ser Ser Ala Thr Ser Ser Asn Ala Gly

1 5 10 15

Ala Asp Pro Asn Thr Thr Asn Leu Arg Pro Thr Thr Tyr Asp Thr Trp

20 25 30

Cys Gly Val Ala His Gly Cys Thr Arg Lys Leu Gly Leu Lys Ile Cys

35 40 45

Gly Phe Leu Gln Arg Thr Asn Ser Leu Glu Glu Lys Ser Arg Leu Val

50 55 60

Ser Ala Phe Lys Glu Arg Gln Ser Ser Lys Asn Leu Leu Ser Cys Glu

65 70 75 80

Asn Ser Asp Arg Asp Ala Arg Phe Arg Arg Thr Glu Thr Asp Phe Ser

85 90 95

Asn Leu Phe Ala Arg Asp Leu Leu Pro Ala Lys Asn Gly Glu Glu Gln

100 105 110

Thr Val Gln Phe Leu Leu Glu Val Val Asp Ile Leu Leu Asn Tyr Val

115 120 125

Arg Lys Thr Phe Asp Arg Ser Thr Lys Val Leu Asp Phe His His Pro

130 135 140

His Gln Leu Leu Glu Gly Met Glu Gly Phe Asn Leu Glu Leu Ser Asp

145 150 155 160

His Pro Glu Ser Leu Glu Gln Ile Leu Val Asp Cys Arg Asp Thr Leu

165 170 175

Lys Tyr Gly Val Arg Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gln Leu Ser

180 185 190

Thr Gly Leu Asp Ile Ile Gly Leu Ala Gly Glu Trp Leu Thr Ser Thr

195 200 205

Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu

210 215 220

Met Glu Gln Ile Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Val Gly Trp Ser

225 230 235 240

Ser Lys Asp Gly Asp Gly Ile Phe Ser Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn

245 250 255

Met Tyr Ser Ile Met Ala Ala Arg Tyr Lys Tyr Phe Pro Glu Val Lys

260 265 270

Thr Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Lys Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu

275 280 285

Gln Ser His Tyr Ser Ile Lys Lys Ala Gly Ala Ala Leu Gly Phe Gly

290 295 300

Thr Asp Asn Val Ile Leu Ile Lys Cys Asn Glu Arg Gly Lys Ile Ile

305 310 315 320

Pro Ala Asp Phe Glu Ala Lys Ile Leu Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr

325 330 335

Val Pro Phe Tyr Val Asn Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala

340 345 350

Phe Asp Pro Ile Gln Glu Ile Ala Asp Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Leu

355 360 365

Trp Leu His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg

370 375 380

Lys His Arg His Lys Leu Asn Gly Ile Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr

385 390 395 400

Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val Leu Leu Gln Cys Ser Ala Ile

405 410 415

Leu Val Lys Glu Lys Gly Ile Leu Gln Gly Cys Asn Gln Met Cys Ala

420 425 430

Gly Tyr Leu Phe Gln Pro Asp Lys Gln Tyr Asp Val Ser Tyr Asp Thr

435 440 445

Gly Asp Lys Ala Ile Gln Cys Gly Arg His Val Asp Ile Phe Lys Phe

450 455 460

Trp Leu Met Trp Lys Ala Lys Gly Thr Val Gly Phe Glu Asn Gln Ile

465 470 475 480

Asn Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr Leu Tyr Ala Lys Ile Lys Asn

485 490 495

Arg Glu Glu Phe Glu Met Val Phe Asn Gly Glu Pro Glu His Thr Asn

500 505 510

Val Cys Phe Trp Tyr Ile Pro Gln Ser Leu Arg Gly Val Pro Asp Ser

515 520 525

Pro Gln Arg Arg Glu Lys Leu His Lys Val Ala Pro Lys Ile Lys Ala

530 535 540

Leu Met Met Glu Ser Gly Thr Thr Met Val Gly Tyr Gln Pro Gln Gly

545 550 555 560

Asp Lys Ala Asn Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr

565 570 575

Gln Ser Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln

580 585 590

Asp Leu

<210> 5

<211> 1784

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

atggcgtctc gaccccatct tcgtccgcaa cctcctcgaa cgcgggagcg gaccccaata 60

ccactaacct gcgccccaca acgtacgata cctggtgcgg cgtggcccat ggatgcacca 120

gaaaactggg gctcaagatc tgcggcttct tgcaaaggac caacagcctg gaagagaaga 180

gtcgccttgt gagtgccttc aaggagaggc aatcctccaa gaacctgctt tcctgtgaaa 240

acagcgaccg ggatgcccgc ttccggcgca cagagactga cttctctaat ctgtttgcta 300

gagatctgct tccggctaag aacggtgagg agcaaaccgt gcaattcctc ctggaagtgg 360

tggacatact cctcaactat gtccgcaaga catttgatcg ctccaccaag gtgctggact 420

ttcatcaccc acaccagttg ctggaaggca tggagggctt caacttggag ctctctgacc 480

accccgagtc cctggagcag atcctggttg actgcagaga caccttgaag tatggggttc 540

gcacaggtca tcctcgattt ttcaaccagc tctccactgg attggatatt attggcctag 600

ctggagaatg gctgacatca acggccaata ccaacatgtt tacatatgaa attgcaccag 660

tgtttgtcct catggaacaa ataacactta agaagatgag agagatagtt ggatggtcaa 720

gtaaagatgg tgatgggata ttttctcctg ggggcgccat atccaacatg tacagcatca 780

tggctgctcg ctacaagtac ttcccggaag ttaagacaaa gggcatggcg gctgtgccta 840

aactggtcct cttcacctca gaacagagtc actattccat aaagaaagct ggggctgcac 900

ttggctttgg aactgacaat gtgattttga taaagtgcaa tgaaaggggg aaaataattc 960

cagctgattt tgaggcaaaa attcttgaag ccaaacagaa gggatatgtt cccttttatg 1020

tcaatgcaac tgctggcacg actgtttatg gagcttttga tccgatacaa gagattgcag 1080

atatatgtga gaaatataac ctttggttgc atgtcgatgc tgcctgggga ggtgggctgc 1140

tcatgtccag gaagcaccgc cataaactca acggcataga aagggccaac tcagtcacct 1200

ggaaccctca caagatgatg ggcgtgctgt tgcagtgctc tgccattctc gtcaaggaaa 1260

agggtatact ccaaggatgc aaccagatgt gtgcaggata cctcttccag ccagacaagc 1320

agtatgatgt ctcctacgac accggggaca aggcaattca gtgtggccgc cacgtggata 1380

tcttcaagtt ctggctgatg tggaaagcaa agggcacagt gggatttgaa aaccagatca 1440

acaaatgcct ggaactggct gaatacctct atgccaagat taaaaacaga gaagaatttg 1500

agatggtttt caatggcgag cctgagcaca caaacgtctg tttttggtat attccacaaa 1560

gcctcagggg tgtgccagac agccctcaac gacgggaaaa gctacacaag gtggctccaa 1620

aaatcaaagc cctgatgatg gagtcaggta cgaccatggt tggctaccag ccccaagggg 1680

acaaggccaa cttcttccgg atggtcatct ccaacccagc cgctacccag tctgacattg 1740

acttcctcat tgaggagata gaaagactgg gccaggatct gtaa 1784

<210> 6

<211> 178

<212> Белок

<213> rattus norvegicus

<400> 6

Met Pro Gly Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Leu Leu Leu Ala Gly Val

1 5 10 15

Lys Thr Ser Lys Gly His Ser Ile Arg Gly Asp Asn Asn Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Val Ser Gln Thr His Met Leu Arg Glu Leu Arg Ala Ala Phe

35 40 45

Ser Gln Val Lys Thr Phe Phe Gln Lys Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile

50 55 60

Leu Leu Thr Asp Ser Leu Leu Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Lys Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Trp Ile Gln Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Asp Phe Asn Lys Leu Gln Asp Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Val Thr Leu Lys Met

165 170 175

Lys Asn

<210> 7

<211> 682

<212> ДНК

<213> rattus norvegicus

<400> 7

catgcctggc tcagcactgc tatgttgcct gctcttactg gctggagtga agaccagcaa 60

aggccattcc atccggggtg acaataactg cacccacttc ccagtcagcc agacccacat 120

gctccgagag ctgagggctg ccttcagtca agtgaagact ttctttcaaa agaaggacca 180

gctggacaac atactgctga cagattcctt actgcaggac tttaagggtt acttgggttg 240

ccaagccttg tcagaaatga tcaagtttta cctggtagaa gtgatgcccc aggcagagaa 300

ccatggccca gaaatcaagg agcatttgaa ttccctggga gagaagctga agaccctctg 360

gatacagctg cgacgctgtc atcgatttct cccctgtgag aataaaagca aggcagtgga 420

gcaggtgaag aatgatttta ataagctcca agacaaaggt gtctacaagg ccatgaatga 480

gtttgacatc ttcatcaact gcatagaagc ctacgtgaca ctcaaaatga aaaattgaac 540

cacccggcat ctactggact gcaggacata aatagagctt ctaaatctga tccagagatc 600

ttagctaacg ggagcaactc cttggaaaac ctcgtttgta cctctctcca aaatatttat 660

tacctctgat acctcagttc cc 682

<210> 8

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированный ген крысиного IL-10

<400> 8

atgcctggct cagccctgct atgttgcctt ctcctgctgg cgggagtcaa gacaagcaag 60

ggccattcca tccggggaga taataactgc acccacttcc cagtctctca aacccacatg 120

ttgcgagagc tgagggctgc cttcagtcag gtgaagacgt tcttccagaa gaaggaccag 180

ctggacaaca ttctgctgac tgacagcctg ctgcaggatt tcaagggtta tttggggtgt 240

caagccctgt ctgaaatgat caagttttac ctggtagaag tgatgcccca ggcagagaat 300

catggccccg agatcaagga gcacctcaac tccctggggg agaagctgaa gaccctgtgg 360

attcagctga ggcgctgcca cagatttctc ccctgtgaaa acaagagcaa ggcagtggag 420

caggtgaaga acgattttaa taagctccag gacaagggcg tctacaaggc catgaacgag 480

ttcgacatct ttatcaactg catagaagct tacgttacac tcaagatgaa gaattga 537

<210> 9

<211> 178

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 9

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<210> 10

<211> 1600

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 10

aaaccacaag acagacttgc aaaagaaggc atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg 60

gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca ggccagggca cccagtctga gaacagctgc 120

acccacttcc caggcaacct gcctaacatg cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga 180

gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg 240

ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc caagccttgt ctgagatgat ccagttttac 300

ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac 360

tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt 420

ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa 480

gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag tttgacatct tcatcaacta catagaagcc 540

tacatgacaa tgaagatacg aaactgagac atcagggtgg cgactctata gactctagga 600

cataaattag aggtctccaa aatcggatct ggggctctgg gatagctgac ccagcccctt 660

gagaaacctt attgtacctc tcttatagaa tatttattac ctctgatacc tcaaccccca 720

tttctattta tttactgagc ttctctgtga acgatttaga aagaagccca atattataat 780

ttttttcaat atttattatt ttcacctgtt tttaagctgt ttccataggg tgacacacta 840

tggtatttga gtgttttaag ataaattata agttacataa gggaggaaaa aaaatgttct 900

ttggggagcc aacagaagct tccattccaa gcctgaccac gctttctagc tgttgagctg 960

ttttccctga cctccctcta atttatcttg tctctgggct tggggcttcc taactgctac 1020

aaatactctt aggaagagaa accagggagc ccctttgatg attaattcac cttccagtgt 1080

ctcggaggga ttcccctaac ctcattcccc aaccacttca ttcttgaaag ctgtggccag 1140

cttgttattt ataacaacct aaatttggtt ctaggccggg cgcggtggct cacgcctgta 1200

atcccagcac tttgggaggc tgaggcgggt ggatcacttg aggtcaggag ttcctaacca 1260

gcctggtcaa catggtgaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaattag ccgggcatgg 1320

tggcgcgcac ctgtaatccc agctacttgg gaggctgagg caagagaatt gcttgaaccc 1380

aggagatgga agttgcagtg agctgatatc atgcccctgt actccagcct gggtgacaga 1440

gcaagactct gtctcaaaaa ataaaaataa aaataaattt ggttctaata gaactcagtt 1500

ttaactagaa tttattcaat tcctctggga atgttacatt gtttgtctgt cttcatagca 1560

gattttaatt ttgaataaat aaatgtatct tattcacatc 1600

<210> 11

<211> 185

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro

20 25 30

Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg

35 40 45

Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu

50 55 60

Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys

65 70 75 80

Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala

85 90 95

Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr

115 120 125

Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val

130 135 140

Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp

145 150 155 160

Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys

165 170 175

His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

180 185

<210> 12

<211> 558

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 12

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc 60

ccgctgcccg ccgcaaatat gccagaggat tatcctgatc agttcgatga tgtcatggat 120

tttattcaag ccaccattaa aagactgaaa aggtcaccag ataaacaaat ggcagtgctt 180

cctagaagag agcggaatcg gcaggctgca gctgccaacc cagagaattc cagaggaaaa 240

ggtcggagag gccagagggg caaaaaccgg ggttgtgtct taactgcaat acatttaaat 300

gtcactgact tgggtctggg ctatgaaacc aaggaggaac tgatttttag gtactgcagc 360

ggctcttgcg atgcagctga gacaacgtac gacaaaatat tgaaaaactt atccagaaat 420

agaaggctgg tgagtgacaa agtagggcag gcatgttgca gacccatcgc ctttgatgat 480

gacctgtcgt ttttagatga taacctggtt taccatattc taagaaagca ttccgctaaa 540

aggtgtggat gtatctga 558

<210> 13

<211> 558

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированный ген человеческого GDNF

<400> 13

atgaaacttt gggacgtggt ggctgtctgc ctggtgctcc tccacaccgc cagtgcgttt 60

ccgctgcccg ccgctaacat gccagaggat tatcctgatc agttcgatga tgttatggac 120

ttcattcaag ccacaatcaa gcggctgaaa cgatcaccag ataaacagat ggcagtgctt 180

cctcgccgcg agcgtaatcg gcaggctgca gcagccaatc ccgagaattc ccgaggaaaa 240

gggcgcaggg gtcagagggg caagaaccgg gggtgtgtcc tgactgcaat acatttaaac 300

gtgactgact tgggtctggg ctatgagacc aaggaagaac tcattttcag gtactgcagc 360

ggctcttgcg atgccgcgga aacaacgtac gacaaaatct tgaagaacct ctccagaaac 420

agaaggctgg tgagtgacaa ggtaggacag gcctgttgca gacccatcgc ctttgacgac 480

gatctgagct ttctggatga caatctggtt taccacatcc tacggaagca ttctgctaaa 540

agatgtggat gtatttga 558

<210> 14

<211> 537

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированный ген человеческого IL-10

<400> 14

atgcacagct cagcactgct gtgctgcctg gtcctgctga caggggtgag ggcaagccca 60

ggccagggaa cccaatctga gaacagctgc acccacttcc ctggcaatct gcctaacatg 120

ctgcgcgacc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt ttttccagat gaaggatcag 180

ctggacaacc tgctgctgaa ggagtccctc ctggaggact ttaagggcta cctgggatgc 240

caggccctgt ctgagatgat ccaattctac ctggaagaag ttatgcccca ggctgagaac 300

caggacccag acattaaggc ccatgtcaac tccctggggg aaaatctgaa gaccctcagg 360

ctgcggctac ggcgctgtca ccgttttctg ccctgtgaga ataagagcaa ggctgtggag 420

caggtgaaga acgccttcaa taagctccag gagaagggta tctacaaagc gatgagtgaa 480

tttgatatct tcattaatta tatagaagct tatatgacaa tgaaaatcag aaactga 537

<210> 15

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для амплификации CMV промотора (F-JDK)

<400> 15

ttcggccgtc gaggagcttg gcccattg 28

<210> 16

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для амплификации CMV промотора (F-JDK)

<400> 16

gacgtcgacc tagctagcga attcggggcc gcggag 36

<210> 17

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для амплификации SV40pA промотора (F-SV40pA)

<400> 17

ccatcgatca gacatgataa gatacattga tgag 34

<210> 18

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для амплификации SV40pA промотора (R-SV40pA)

<400> 18

gacgtcgacg cggccgctac cacatttgta gaggttttac ttg 43

<210> 19

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для амплификации гена резистентности к канамицину (F-Kan)

<400> 19

aggcgccatg agccatattc aacgggaa 28

<210> 20

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для амплификации гена резистентности к канамицину (F-Kan)

<400> 20

ttcatgatta gaaaaactca tcgagcatc 29

<210> 21

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для амплификации LITR и CMV (F-ITR)

<400> 21

atggcgcgcc cctggccttt tgctggcc 28

<210> 22

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для амплификации SV40pA и RITR (R-ITR)

<400> 22

atggatccgc tagtaaatac cgcatcag 28

<210> 23

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для амплификации rIL-10 (F-rIL-10)

<400> 23

ccgctagcgc caccatgcct 20

<210> 24

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность<220>

<223> Обратный праймер для амплификации rIL-10 (R-rIL-10)

<400> 24

gacgtcgacg ccatcgatgg cttaattaat caattcttc 39

<210> 25

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для WPRE_Pac1_F

<400> 25

ggtggtttaa ttaaaatcaa cctctggatt acaaaatttg 40

<210> 26

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для WPRE_modi_Hpa1_R

<400> 26

ggtggtgtta acgacaacac cacggaattg 30

<210> 27

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-F

<400> 27

cctgcggccg gtcgactacc acatttgtag aggttttact tgc 43

<210> 28

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер для SV40-CMV-sCAG-bGHpA-Infu-R

<400> 28

aataatcaat gtcgactcga ggagcttggc ccatt 35

<210> 29

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность Stuffer scramble

<400> 29

gtcgacggta tcgataagct tgatatcgaa ttcctgcagc cc 42

<210> 30

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Stuffer_scramble_F

<400> 30

ctaggtcgac ggtatcgata agcttgatat cgaattcctg cagccc 46

<210> 31

<211> 46

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер для Stuffer_scramble_R

<400> 31

ctaggggctg caggaattcg atatcaagct tatcgatacc gtcgac 46

<210> 32

<211> 585

<212> Белок

<213> Canis lupus

<400> 32

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Pro Glu Asn Pro Ser Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Glu Pro Pro

50 55 60

Arg Ala Thr Ser Arg Lys Ala Ala Cys Ala Cys Asn Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Pro Lys Ala Glu Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Asp Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Leu Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Val Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Ser Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Ile Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Ser Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Val Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Asn Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 33

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Canis lupus

<400> 33

atggcatctc caggctctgg cttctggtcc ttcgggtctg aagatggctc cggggatccc 60

gagaacccca gcacagcgag agcctggtgt caggtggccc agaagttcac gggcggcatc 120

ggaaacaagc tgtgcgccct gctctacgga gatgccgaga agcccgcgga gagtggcggg 180

agcgagcccc cgcgcgccac ctccaggaag gccgcctgcg cttgtaatca gaagccttgc 240

agctgcccca aagcggaggt caactatgcg tttctacacg caacagacct gctgccagcc 300

tgtgatggag aaaggcccac gttggcgttt ctgcaagatg ttatggacat tttgcttcag 360

tatgttgtga aaagtttcga tagatcaacc aaagtgattg atttccatta ccctaatgag 420

ctccttcaag agtataactg ggaattggca gaccaaccac aaaatttgga ggaaattttg 480

atgcattgcc aaacgactct aaaatatgca attaaaacag ggcatcccag atatttcaat 540

cagctttcca ctggactgga tatggttgga ttagcagcag actggctgac atcaacagca 600

aacacaaaca tgttcaccta tgaaattgct ccagtatttg tgctcttgga atatgtcaca 660

ctaaagaaaa tgagagaaat cattggctgg ccgggaggct ctggcgatgg gatattttct 720

cctggtggcg ctatttctaa catgtatgcc atgctgatcg cacgctttaa gatgttccca 780

gaagtcaagg agaaaggaat ggctgcggtt cccaggctca ttgccttcac atctgagcat 840

agtcactttt ctctcaagaa gggagctgca gctttgggga ttggaacaga cagcgtgatt 900

ctgattaaat gtgatgagag ggggaaaatg gtcccatctg atcttgaaag aaggatcctt 960

gaagccaaac aaaaaggatt tgttcctttc cttgtgagcg ccacagctgg gaccaccgtg 1020

tatggagcat tcgaccccct cttagcagtt gctgacattt gtaaaaagta caagatctgg 1080

atgcatgtgg atgctgcttg gggtggggga ttactgatgt cccggaagca caaatggaag 1140

ctgagcggcg tggagagggc caactctgtg acatggaacc cacacaagat gatgggcgtc 1200

cctttacagt gctccgctct cctggttaga gaagagggat tgatgcagag ttgcaaccag 1260

atgcatgcct cctacctctt ccagcaagat aaacactatg acctgtccta tgatactggg 1320

gataaggcct tacagtgtgg acgccacgtt gatgttttta aattatggct aatgtggagg 1380

gcaaagggca ccactgggtt tgaagcacat attgataagt gcctggagct ggctgagtat 1440

ttatacagta tcataaaaaa ccgagaagga tacgaaatgg tgtttgatgg aaagcctcag 1500

cacacaaatg tctgcttctg gtacgtgcct ccaagtttgc gtgtcctgga agacaatgaa 1560

gagagaatga accgcctctc aaaggtggcc ccagtgatta aagcccgaat gatggagtat 1620

gggaccacaa tggtcagcta tcagcccttg ggagacaagg tcaatttctt ccgcatggtt 1680

atctcaaatc ccgcagcaac tcaccaagac atcgacttcc tgattgaaga aatagaacgc 1740

cttggacaag atttataa 1758

<210> 34

<211> 585

<212> Белок

<213> Felis catus

<400> 34

Met Ala Thr Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Pro Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ser Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly Ser Gln Pro Ala

50 55 60

Arg Ala Thr Ser Arg Lys Ala Thr Cys Ala Cys Asn Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Pro Lys Ala Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Gly Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Leu Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Ser Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Ile Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Val Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 35

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Felis catus

<400> 35

atggcaactc caggctcagg cttttggtcc ttcgggtctg aagatggctc cggggatccc 60

gagaaccccg gcacagcgag agcctggtgt caggtggccc agaagttcac gggcggcatc 120

ggaaacaagc tgtgcgccct gctctacggg gattcagaga agccggcaga gagtggaggg 180

agccagcccg cgcgggccac ctcccggaag gccacctgtg cctgtaacca gaagccttgc 240

agctgcccca aagcggatgt caactatgcg tttctacacg caacagacct gctgccagcc 300

tgtgatggag aaaggcccac tttggcgttt ctgcaagatg taatgggcat tttgcttcag 360

tatgtggtga aaagtttcga cagatcaacc aaagtgattg atttccatta ccctaatgag 420

ctcctgcaag agtataactg ggaattggca gaccaaccac aaaatttgga ggaaattttg 480

atgcattgcc aaacgactct aaaatatgca ataaaaacag ggcatcccag gtacttcaat 540

caactttcca cgggactgga tatggttgga ttagcagcag actggctgac atcaacagca 600

aacactaata tgttcaccta tgaaattgct ccagtatttg tgctcttgga atatgtcaca 660

ctgaaaaaaa tgagagaaat cattggctgg cctgggggct ccggcgatgg gatattttct 720

cctggtggcg ctatatctaa catgtatgcc atgctgattg cacgctttaa gatgttccca 780

gaagtcaagg agaaaggaat ggctgctgtt cccaggctca ttgccttcac atccgagcat 840

agtcattttt ctctcaagaa gggagctgca gctctgggga ttggaacaga cagcgtgatt 900

ctgattaaat gcgatgagag agggaaaatg atcccatctg atcttgaaag aaggatcctt 960

gaagccaaac agaaaggatt tgttcctttc cttgtgagtg ccacagctgg gaccactgtg 1020

tatggagcat ttgaccccct cttggcggtc gctgacattt gcaaaaagta caagatctgg 1080

atgcatgtgg atgcagcttg gggtggggga ttactgatgt cccggaaaca caagtggaaa 1140

ctgagcggcg tggagagggc caactctgtg acatggaacc cacacaagat gatgggcgtc 1200

cccttacagt gctctgctct cctggttaga gaagaggggt tgatgcagag ttgcaaccag 1260

atgcatgctt cctacctttt ccagcaagat aaacactacg acctgtccta cgacactgga 1320

gacaaggcct tacagtgtgg acgccatgtc gatgttttta aattatggct aatgtggagg 1380

gcaaagggca ccactgggtt tgaagcacat attgataagt gcttggagct ggcagaatat 1440

ttatacaata tcataaaaaa ccgagaagga tatgaaatgg tgtttgatgg aaagcctcag 1500

cacacaaatg tctgcttctg gtacgtgcct ccaagtttgc gagtcctgga agacaatgaa 1560

gagagaatga gccgcctctc aaaggtggcc ccagtgatta aagccagaat gatggagtat 1620

gggaccacaa tggtcagcta tcagcccttg ggagacaagg tcaatttctt ccgcatggtc 1680

atctcaaatc ccgcagcaac tcaccaagac attgacttcc tgattgaaga aatagaacgc 1740

cttggacaag atttataa 1758

<210> 36

<211> 585

<212> Белок

<213> Equus caballus

<400> 36

Met Ala Ser Pro Gly Ser Gly Phe Trp Ser Phe Gly Ser Glu Asp Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Pro Glu Asn Pro Gly Thr Ala Arg Ala Trp Cys Gln Val

20 25 30

Ala Gln Lys Phe Thr Gly Gly Ile Gly Asn Lys Leu Cys Ala Leu Leu

35 40 45

Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Ala Ala Glu Ser Gly Gly Ser Glu Pro Pro

50 55 60

Arg Ala Thr Ser Arg Lys Ala Ala Cys Ser Cys Asn Gln Lys Pro Cys

65 70 75 80

Ser Cys Ser Lys Ala Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp

85 90 95

Leu Leu Pro Ala Cys Asp Gly Glu Arg Pro Thr Leu Ala Phe Leu Gln

100 105 110

Asp Val Met Asp Ile Leu Leu Gln Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg

115 120 125

Ser Thr Lys Val Ile Asp Phe His Tyr Pro Asn Glu Leu Leu Gln Glu

130 135 140

Tyr Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gln Pro Gln Asn Leu Glu Glu Ile Leu

145 150 155 160

Met His Cys Gln Thr Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro

165 170 175

Arg Tyr Phe Asn Gln Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu Ala

180 185 190

Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu

195 200 205

Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met

210 215 220

Arg Glu Ile Ile Gly Trp Pro Gly Gly Ser Gly Asp Gly Ile Phe Ser

225 230 235 240

Pro Gly Gly Ala Ile Ser Asn Met Tyr Ala Met Leu Ile Ala Arg Phe

245 250 255

Lys Met Phe Pro Glu Val Lys Glu Lys Gly Met Ala Ala Val Pro Arg

260 265 270

Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser His Phe Ser Leu Lys Lys Gly

275 280 285

Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Arg Cys

290 295 300

Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu

305 310 315 320

Glu Ala Lys Gln Lys Gly Phe Val Pro Phe Leu Val Ser Ala Thr Ala

325 330 335

Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asp Pro Leu Leu Ala Val Ala Asp

340 345 350

Ile Cys Lys Lys Tyr Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly

355 360 365

Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys Leu Ser Gly Val

370 375 380

Glu Arg Ala Asn Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys Met Met Gly Val

385 390 395 400

Pro Leu Gln Cys Ser Ala Leu Leu Val Arg Glu Glu Gly Leu Met Gln

405 410 415

Ser Cys Asn Gln Met His Ala Ser Tyr Leu Phe Gln Gln Asp Lys His

420 425 430

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gln Cys Gly Arg

435 440 445

His Val Asp Val Phe Lys Leu Trp Leu Met Trp Arg Ala Lys Gly Thr

450 455 460

Thr Gly Phe Glu Ala His Ile Asp Lys Cys Leu Glu Leu Ala Glu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Asn Ile Ile Lys Asn Arg Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp

485 490 495

Gly Lys Pro Gln His Thr Asn Val Cys Phe Trp Tyr Val Pro Pro Ser

500 505 510

Leu Arg Val Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys

515 520 525

Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu Tyr Gly Thr Thr Met

530 535 540

Val Ser Tyr Gln Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn Phe Phe Arg Met Val

545 550 555 560

Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gln Asp Ile Asp Phe Leu Ile Glu

565 570 575

Glu Ile Glu Arg Leu Gly Gln Asp Leu

580 585

<210> 37

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Equus caballus

<400> 37

atggcatctc ccggctccgg cttttggtcc tttgggtctg aagatggctc cggggatccc 60

gagaaccctg gcacagcgag agcctggtgt caggtggccc agaagttcac cggcggcatc 120

ggaaacaagc tatgcgccct gctctacgga gacgccgaga aggcggcgga gagcggcggg 180

agcgagcccc cgcgggccac ctcccggaag gccgcctgct cctgcaacca gaagccctgc 240

agctgctcca aagccgatgt caactatgcg tttctacacg caacagactt gctgccagct 300

tgtgacggag aaagacccac tttggcgttt ctgcaagatg ttatggacat tttgcttcag 360

tatgtggtga aaagtttcga tagatcaacc aaagtgattg acttccatta ccctaatgag 420

ctccttcaag agtataattg ggaattggca gaccaaccac aaaatctgga ggaaattttg 480

atgcattgcc aaacaacttt aaaatatgca attaaaacag ggcatcctag atatttcaat 540

caactttcca ctggactgga tatggttgga ttagcagcag actggctgac atcaacagca 600

aacaccaaca tgttcaccta tgaaattgct ccagtattcg tgcttttgga atatgtcaca 660

ttaaagaaaa tgagagaaat cattggctgg ccaggaggct ctggcgatgg aatattttct 720

cctggtggcg ccatatctaa catgtatgcc atgctgattg cacgctttaa gatgttccca 780

gaagtcaagg agaaaggaat ggccgctgtt cccaggctca ttgccttcac gtctgagcat 840

agtcattttt ctctcaagaa gggagctgca gccttgggga ttggaacaga cagcgtaatt 900

ctgattagat gtgatgagag ggggaaaatg atcccatcgg atcttgaaag aagaatcctt 960

gaagccaaac aaaaaggatt tgtccctttt cttgtgagtg ccacggctgg gaccaccgtg 1020

tatggagcat tcgatcccct cttagctgtc gctgacattt gcaaaaagta caagatctgg 1080

atgcatgtgg atgcagcttg gggcggggga ttactgatgt cccggaaaca caagtggaaa 1140

ctgagtggcg tggagagggc caactctgtg acatggaatc cacacaagat gatgggtgtc 1200

cctttgcagt gctctgctct cctggttaga gaagagggat tgatgcagag ttgcaaccag 1260

atgcatgcct cctacctctt tcagcaagat aaacactatg acctgtccta tgacactgga 1320

gacaaggcct tgcagtgcgg acgccacgtg gatgttttta agttatggct catgtggagg 1380

gcaaagggaa caactgggtt tgaagcacat attgataagt gtttggagtt ggcggagtat 1440

ttatacaata tcataaaaaa ccgagaagga tatgaaatgg tgtttgacgg aaagcctcag 1500

cacaccaatg tctgcttctg gtatgtacct ccgagtctgc gtgttctaga agacaatgaa 1560

gagagaatga gccgcctctc aaaggtggcc ccggtgatta aagccagaat gatggagtat 1620

gggaccacaa tggtcagcta ccagcccttg ggagacaagg tcaatttctt ccgcatggtc 1680

atctcaaatc ccgcagcaac tcaccaagac attgacttcc tgattgaaga aatagaacgc 1740

cttggacaag atttataa 1758

<210> 38

<211> 181

<212> Белок

<213> Canis lupus

<400> 38

Met His Gly Ser Ala Leu Leu Cys Cys Cys Leu Val Leu Leu Ala Gly

1 5 10 15

Val Gly Ala Ser Arg His Gln Ser Thr Leu Leu Glu Asp Asp Cys Thr

20 25 30

His Phe Pro Ala Ser Leu Pro His Met Leu Arg Glu Leu Arg Ala Ala

35 40 45

Phe Gly Arg Val Lys Ile Phe Phe Gln Met Lys Asp Lys Leu Asp Asn

50 55 60

Ile Leu Leu Thr Gly Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Ser Tyr Leu Gly

65 70 75 80

Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met

85 90 95

Pro Arg Ala Glu Asn His Asp Pro Asp Ile Lys Asn His Val Asn Ser

100 105 110

Leu Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg

115 120 125

Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln

130 135 140

Val Lys Ser Ala Phe Ser Lys Leu Gln Glu Lys Gly Val Tyr Lys Ala

145 150 155 160

Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Thr Tyr Met Thr

165 170 175

Met Arg Met Lys Ile

180

<210> 39

<211> 546

<212> ДНК

<213> Canis lupus

<400> 39

atgcatggct cagcactgct ctgttgctgc ctggtcctcc tggccggggt gggagccagc 60

cgacaccaga gcaccctact tgaggacgac tgcacccact tcccagccag cctgccccac 120

atgctccgag agctccgagc tgccttcggg agggtgaaga tcttctttca aatgaaggac 180

aagctggaca acatactgct gaccgggtcc ctgctggagg actttaagag ttacctgggt 240

tgccaagccc tgtcggagat gatccagttt tacttggagg aggtgatgcc ccgggctgag 300

aaccacgacc cagacatcaa gaaccacgtg aactccctgg gagagaagct caagaccctc 360

aggctgagac tgaggctgcg acgctgtcac cgatttcttc cctgtgagaa taagagcaag 420

gcggtggagc aggtgaagag cgcatttagt aagctccagg agaaaggtgt ctacaaagcc 480

atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atagaaacct acatgacaat gaggatgaaa 540

atctga 546

<210> 40

<211> 178

<212> Белок

<213> Felis catus

<400> 40

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Phe Leu Val Phe Leu Ala Gly Val

1 5 10 15

Gly Ala Ser Arg His Gln Ser Thr Leu Ser Glu Asp Asn Cys Thr His

20 25 30

Phe Ser Val Ser Leu Pro His Met Leu Arg Glu Leu Arg Ala Ala Phe

35 40 45

Gly Lys Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu His Ser Ile

50 55 60

Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Glu Asp Pro Asp Ile Lys Gln His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Val Val Glu Gln Val Lys Ser

130 135 140

Thr Phe Ser Lys Leu Gln Glu Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Gly Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Met

165 170 175

Lys Ile

<210> 41

<211> 537

<212> ДНК

<213> Felis catus

<400> 41

atgcacagct cagcacttct gtgtttcctg gtcttcctgg ccggggtagg agccagccga 60

caccagagca ccctgtctga ggacaactgc acccacttct cagtcagcct gccccacatg 120

ctccgagagc tccgagctgc cttcggcaag gtgaagactt tctttcaaac caaggacgag 180

ctgcacagca tattgttgac caggtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240

caagccttgt ccgagatgat ccagttttat ttggaggagg tgatgcccca ggctgagaac 300

gaggacccag acatcaaaca gcacgtgaac tccctgggag aaaagctgaa gaccctccgg 360

ctgagactgc ggcgctgtca tcgatttctg ccctgtgaaa acaagagcaa ggtggtggag 420

caggtgaaga gtacctttag taagctccaa gagaaaggtg tctacaaagc catgggtgag 480

tttgacatct tcatcaacta catagaagct tacatgacaa tgaagatgaa aatctga 537

<210> 42

<211> 178

<212> Белок

<213> Equus caballus

<400> 42

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Tyr Leu Val Phe Leu Ala Gly Val

1 5 10 15

Gly Ala Ser Arg Asp Arg Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Thr Ser Leu Pro His Met Leu His Glu Leu Arg Ala Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Met

50 55 60

Leu Leu Asn Gly Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn His Gly Pro Asp Ile Lys Glu His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Arg Val Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser

130 135 140

Ala Phe Ser Lys Leu Gln Glu Lys Gly Val Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Thr Lys Met

165 170 175

Lys Asn

<210> 43

<211> 537

<212> ДНК

<213> Equus caballus

<400> 43

atgcacagct cagcactgct atgttacctg gtcttcctgg ccggggtggg agccagccga 60

gaccggggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caaccagcct gccccacatg 120

ctccatgagc tccgagccgc cttcagcagg gtgaagactt tctttcaaat gaaggaccag 180

ctggacaaca tgttgttgaa cgggtccctg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240

caagccttgt cggagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca ggctgagaac 300

cacggcccag acatcaagga gcacgtgaac tccctggggg aaaagctgaa gaccctccga 360

gtgaggctgc ggcgctgtca tcgatttctg ccctgtgaaa ataagagcaa ggcagtggag 420

caggtgaaga gtgccttcag taagctccaa gagaaaggtg tctacaaagc catgagtgag 480

tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tatatgacaa cgaagatgaa aaactga 537

<210> 44

<211> 185

<212> Белок

<213> Canis lupus

<400> 44

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Leu Pro Leu Pro Ala Ala Asn Val Pro Glu Asp Tyr Ser

20 25 30

Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Arg Arg

35 40 45

Leu Lys Arg Ser Pro Glu Lys Gln Met Ala Val Pro Ala Arg Arg Glu

50 55 60

Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Gly Pro Glu His Ser Arg Gly Lys

65 70 75 80

Gly Arg Arg Gly Pro Arg Gly Arg Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala

85 90 95

Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr

115 120 125

Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Ala

130 135 140

Ser Asp Lys Ala Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Tyr Asp Asp

145 150 155 160

Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys

165 170 175

His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

180 185

<210> 45

<211> 558

<212> ДНК

<213> Canis lupus

<400> 45

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccctc 60

ccgctgcccg ccgcaaacgt gccggaggac tattctgatc agtttgatga cgtcatggat 120

tttattcagg ccaccatcag aaggctgaaa aggtcacccg agaaacaaat ggccgtgcca 180

gcgagacgag agcggaatcg tcaggccgcg gccgccggcc cggaacattc cagggggaag 240

gggcggcgag gcccgagggg cagaaaccgg ggttgtgtct tgactgcgat acatttaaac 300

gtcactgacc tgggcttggg ctacgaaacc aaggaggaac tgatttttag gtactgcagc 360

ggctcctgcg acgcggccga gaccatgtac gacaaaatat taaaaaactt atccaaaagt 420

agaaggctgg cgagtgacaa agcagggcag gcttgctgca gacccatcgc ctacgatgac 480

gacctgtcgt ttttagatga caacctggtt taccatattc taagaaagca ttccgctaaa 540

aggtgtggat gtatctga 558

<210> 46

<211> 211

<212> Белок

<213> Felis catus

<400> 46

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro

20 25 30

Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val

50 55 60

Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Arg Arg Leu Lys Arg Ser Pro Glu

65 70 75 80

Lys Gln Met Ala Leu Pro Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg

100 105 110

Gly Arg Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr

115 120 125

Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr

130 135 140

Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp Lys Ile Leu

145 150 155 160

Lys Asn Leu Ser Lys Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln

165 170 175

Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Tyr Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp

180 185 190

Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys

195 200 205

Gly Cys Ile

210

<210> 47

<211> 636

<212> ДНК

<213> Felis catus

<400> 47

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc 60

ccgctgcccg ccggtaagag gcctcccgag gcgcccgccg aagaccgctc cctcggccgc 120

cgccgcgcgc ccttcgcgct gagcagtgac tcaaatatgc cagaggatta tcctgatcag 180

tttgacgacg tcatggattt tattcaagct accatcagaa gactgaaaag gtcacccgag 240

aaacaaatgg ccttgccgcc tagaagagag cggaatcggc aggcggcggc cgccaacccg 300

gagaattcca gagggaaagg tcggcgaggc cagaggggca gaaatcgggg ttgtgtctta 360

actgcgatac atttgaacgt caccgacctg ggtttgggct acgaaaccaa ggaggaactg 420

atttttaggt actgcagcgg ctcctgtgat gcagctgaga caatgtacga caaaatatta 480

aaaaacttat ccaaaaacag aaggctggtg agtgacaaag tcgggcaggc atgttgcaga 540

cccatcgcct atgacgacga cctgtcgttt ttagatgaca acctggttta ccatattcta 600

agaaagcatt ccgctaaaag gtgtggatgt atctga 636

<210> 48

<211> 185

<212> Белок

<213> Equus caballus

<400> 48

Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr

1 5 10 15

Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Ala Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro

20 25 30

Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg

35 40 45

Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu

50 55 60

Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Arg Lys

65 70 75 80

Gly Gln Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala

85 90 95

Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr

115 120 125

Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Lys Asn Arg Arg Leu Val

130 135 140

Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp

145 150 155 160

Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys

165 170 175

His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys Ile

180 185

<210> 49

<211> 558

<212> ДНК

<213> Equus caballus

<400> 49

atgaagttat gggatgtcgt ggctgtctgc ctggtgctgc tccacaccgc gtccgccttc 60

ccgctgcccg ccgcaaatat gccagaggat tatcctgatc agtttgatga tgtcatggat 120

tttattcaag ccaccattaa aagactgaaa aggtcaccag ataaacaaat ggcagtgctt 180

cctagaagag agcggaatcg gcaggctgca gctgccaacc cggagaattc cagaaggaaa 240

ggtcagcgag gccagagggg caaaaaccgg ggttgtgtct taaccgcgat acatttaaat 300

gtcactgact tgggtttggg ctacgaaacc aaggaggaac tgatttttag gtactgcagt 360

ggctcctgcg aggcagccga gacaatgtac gacaaaatat taaaaaactt atccaaaaat 420

agaaggctgg tgagtgacaa agtagggcag gcatgttgca gacccatcgc cttcgatgac 480

gacctgtcat ttttagatga taacttggtt taccatattc taagaaagca ttccgctaaa 540

aggtgtggat gtatctga 558

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генам, операбельно связанным в векторе, и может быть использовано в медицине для облегчения или лечения боли. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество двух или более генов, выбранных из группы, состоящей из гена, кодирующего глутаматдекарбоксилазу (GAD), гена, кодирующего интерлейкин-10 (IL-10), и гена, кодирующего глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Гены в композиции находятся в операбельном виде в векторе. Изобретение обеспечивает высокий анальгетический эффект при введении сочетания генов в дозировке ниже, чем при введении генов по отдельности, и, таким образом, обычные побочные эффекты и токсичность могут быть снижены. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 табл., 7 пр., 15 ил.

1. Фармацевтическая композиция для облегчения или лечения боли, содержащая эффективное количество двух или более генов, выбранных из группы, состоящей из гена, кодирующего глутаматдекарбоксилазу (GAD), гена, кодирующего интерлейкин-10 (IL-10), и гена, кодирующего глиальный нейротрофический фактор (GDNF), где ген находится в операбельном виде в векторе.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где вектор представляет, по меньшей мере, один вирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из вектора на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса простого герпеса, лентивируса, ретровируса и поксвируса.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где вектор представляет, по меньшей мере, один невирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из плазмиды, липосомы, катионного полимера, мицеллы, эмульсии и твердых липидных наночастиц.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, где GAD представляет GAD65 или GAD67.

5. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий GAD, представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 36.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий GAD, представляет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37.

7. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий IL-10, представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 42.

8. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий IL-10, представляет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 43.

9. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий GDNF, представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 48.

10. Фармацевтическая композиция по п.1, где ген, кодирующий GDNF, представляет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 49.

11. Фармацевтическая композиция по п.1, где боль представляет ноцицептивную боль, психогенную боль, воспалительную боль, патологическую боль, нейропатическую боль, боль при раке, послеоперационную боль, боль при невралгии тройничного нерва, идиопатическую боль, диабетическую нейропатическую боль или мигрень.

12. Фармацевтическая композиция по п.1, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит физиологически приемлемый носитель.

13. Фармацевтическая композиция по п.1, где фармацевтическая композиция представляет инъекционный препарат.

14. Способ облегчения или лечения боли, включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-13.

15. Способ по п.14, где введение представляет введение посредством эпидуральной инъекции или интратекальной инъекции.

16. Способ по п.14, где боль представляет ноцицептивную боль, психогенную боль, воспалительную боль, патологическую боль, нейропатическую боль, боль при раке, послеоперационную боль, боль при невралгии тройничного нерва, идиопатическую боль, диабетическую нейропатическую боль или мигрень.

17. Применение фармацевтической композиции по п.1 для облегчения или лечения боли.

18. Применение фармацевтической композиции по п.1 для получения терапевтического агента для облегчения или лечения боли.