КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C12N5/783 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композиции для культивирования Т-клеток и к способу культивирования регуляторных Т-кпеток с ее применением.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Т-клетки играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Т-клетки отличаются от других лимфоцитов, включая В-клетки, рецепторами на поверхности Т-клеток, такими как рецепторы Т-кпеток (TCR). Кроме того, Т-клетки включают разные типы Т-клеток, такие как хелперные Т-клетки (ТН-клетки), цитотоксические Т-клетки (ТС-кпетки или CTL), Т-клетки памяти (ТМ-клетки), включающие центральные Т-клетки памяти (ТСМ-клетки) и эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ-клетки), Т-клетки-природные киллеры (NKT-клетки), гамма дельта Т-клетки (γδ Т-клетки) и регуляторные Т-клетки (Treg-клетки).

Среди них регуляторные Т-клетки (Treg) представляют собой Т-клетки, которые действуют для подавления иммунного ответа других клеток. Например, Treg-клетки действуют для подавления опосредованного Т-клетками иммунитета во время иммунного ответа и для подавления аутореактивных Т-клеток, которые избежали отрицательного отбора в тимусе. Treg-клетки, главным образом, могут классифицироваться на природные регуляторные Т-клетки (nTreg) и индуцированные регуляторные Т-клетки (iTreg). Природные регуляторные Т-клетки, известные как CD4+CD25+FoxP3+ регуляторные Т-клетки, развиваются в тимусе. Индуцированные регуляторные Т-клетки имеют целый ряд общих характеристик со встречающимися в природе Treg-клетками, но характеристика превращения из CD4+CD25-FoxP3- Т-клеток в CD4+CD25+FoxP3+ регуляторные Т-клетки известна как репрезентативное отличие.

Активно проводили исследования по важности регуляторных Т-клеток как таковых в связи с заболеванием, вызванным нарушениями в разных аутоиммунных системах. С момента введения и первого предложения Gershon идеи Т-клеток-супрессоров (R K Gershon and K Kondo, immunology, 1970, 18: 723-37) в начале 1970 гг. были проведены исследования во многих областях иммунологии для выяснения биологических свойств и функций регуляторных Т-клеток. В частности, с момента предложения в 1995 г. Sakaguchi того, что CD25 может функционировать в качестве важного фенотипического маркера для встречающихся в природе регуляторных Т-клеток CD4+ (S Sakaguchi et, al., J Immunol, 1995, 155: 1151-1164), проводили исследования, сосредоточенные на роли и важности регуляторных Т-клеток в индуцировании периферческой толерантности каутоантигенам.

Известно, что регуляторные Т-клетки способны секретировать IL-10 (интерлейкин-10), TGF-β (трансформирующий фактор роста-бета), IL-35 или тому подобные, известные в качестве иммунодепрессивных цитокинов (Н Nishikawa et, al., Int. J. Cancer, 2010, 127: 759-767). Провели исследование, которое подтверждает то, что регуляторные Т-клетки, которые секретируют иммунодепрессивные цитокины, могут секретировать IL-10 или тому подобные с индукцией антигенспецифичных Т-клеток, которые вызывают аутоиммунное заболевание в иммунотолерантных антигенпрезентирующих клетках, индуцируя, посредством этого, иммунологическую толерантность.

Применения регуляторных клеток как таковых для лечения аутоиммунного заболевания широко известно, но конкретные способы, которые могут амплифицировать кпетки-природные киллеры для их эффективного применения, до сих пор недостаточны.

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Соответственно, авторы настоящего изобретения исследовали способ эффективного культивирования регуляторных Т-клеток и, в результате, выяснили то, что новый димер слитого белка, содержащий белок IL-2 и белок CD80 в одной молекуле, может эффективно пролиферировать регуляторные Т-клетки, и осуществили настоящее изобретение.

Решение проблемы

Для достижения приведенной выше цели согласно типичному воплощению композиция или среда для культивирования регуляторных Т-клеток содержит, в качестве активного ингредиента, слитый белок-димер, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент.

Согласно другому типичному воплощению предложен способ культивирования регуляторных Т-клеток с использованием димера слитого белка, содержащего белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент.

Согласно еще одному другому типичному воплощению фармацевтическая композиция содержит, в качестве активного ингредиента, регуляторные Т-клетки, культивируемые в среде, содержащей димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент.

Эффект изобретения

Культуральная композиция согласно настоящему изобретению может не только эффективно пролиферировать Т-клетки, но, в частности, эффективно пролиферировать регуляторные Т-клетки. В частности, подтвердили то, что жизнеспособность регуляторных Т-клеток значимо возрастала по сравнению с традиционно используемым способом культивирования с IL-2. Также подтвердили то, что у полученных регуляторных Т-кпеток увеличвался уровень экспрессии Foxp3+. Следовательно, данный способ пролиферации можно использовать в области клеточной терапии с использованием регуляторных Т-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Типичные воплощения могут быть поняты с большими подробностями из следующего описания, взятого в сочетании с сопровождающими графическими материалами, в которых:

ФИГ. 1А представляет собой схематическую диаграмму димера слитого белка, используемого в настоящем изобретении;

На ФИГ. 1В показано изображение геля SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), подтверждающее полученный димер слитого белка (GI-101);

На ФИГ. 1С показано содержание димера слитого белка (GI-101) согласно поглощению;

На ФИГ. 1D показан анализ гель-фильтрацией (SEC) полученного димера слитого белка (GI-101);

На ФИГ. 2А показано изображение геля SDS-PAGE, подтверждающее полученный димер слитого белка hCD80-Fc;

На ФИГ. 2В показан анализ гель-фильтрацией (SEC) полученного димера слитого белка hCD80-Fc;

На ФИГ. 3А показано изображение геля SDS-PAGE, подтверждающее полученный димер слитого белка Fc-IL2v2;

На ФИГ. 3В показан анализ гель-фильтрацией (SEC) полученного димера слитого белка Fc-IL2v2;

На ФИГ. 3С показано изображение геля SDS-PAGE, подтверждающее полученный димер слитого белка Fc-IL2wt;

На ФИГ. 3D показан анализ гель-фильтрацией (SEC) полученного димера слитого белка Fc-IL2wt;

На ФИГ. 4А показано изображение геля SDS-PAGE, подтверждающее полученный димер слитого белка hCD80-Fc-IL2wt;

На ФИГ. 4В показан анализ гель-фильтрацией (SEC) полученного димера слитого белка hCD80-Fc-IL2wt;

На ФИГ. 5 показана схематическая диаграмма способа культивирования Treg-клеток с использованием димера слитого белка;

На ФИГ. 6 показано число регуляторных Т-клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPMI1640;

На ФИГ. 7 показана жизнеспособность регуляторных Т-кпеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPMI1640;

На ФИГ. 8 показано число регуляторных Т-клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS;

На ФИГ. 9 показана жизнеспособность регуляторных Т-кпеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS;

На ФИГ. 10 показана способность к секреции IL-10 регуляторных Т-клеток, культивируемых с использованием композиции, содержащей среду RPMI1640;

На ФИГ. 11 показана способность к секреции IL-10 регуляторных Т-клеток, культивируемых с использованием композиции, содержащей среду TexMACS;

На ФИГ. 12А и 12В показано число пролиферировавших регуляторных Т-клеток при культивировании в композиции, содержащей среду RPMI1640, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 13А и 13В показана жизнеспособность регуляторных Т-клеток при культивировании в композиции, содержащей среду RPMH640, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 14А и 14В показано число регуляторных Т-клеток при культивировании в композиции, содержащей среду TexMACS, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 15А и 15В показана жизнеспособность регуляторных Т-клеток при культивировании в композиции, содержащей среду TexMACS, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 16А-16С показаны результаты анализа FACS (флуоресцентная сортировка клеток) свойств клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPMI1640, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 17А-17С показано число регуляторных Т-клеток, экспрессирующих Foxp3, при культивировании в композиции, содержащей среду RPMH640, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 18А-18С показаны результаты анализа FACS свойств клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 19А-19С показано число регуляторных Т-клеток, экспрессирующих Foxp3, при культивировании в композиции, содержащей среду TexMACS, в оптимизированном способе;

На ФИГ. 20 показана способность к секреции IL-10 регуляторных Т-кпеток при культивировании в композиции, содержащей среду RPMH640, в оптимизированном способе; и

На ФИГ. 21 показана способность к секреции IL-10 регуляторных Т-кпеток при культивировании в композиции, содержащей среду TexMACS.

Наилучший способ осуществления изобретения

Композиция и среда для пролиферации регуляторных Т-клеток

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена композиция для пролиферации регуляторных Т-клеток, содержащая, в качестве активного ингредиента, димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент.Кроме того, предложена культуральная среда для регуляторных Т-клеток, содержащая димер слитого белка в качестве активного ингредиента.

Среда пролиферации регуляторных Т-кпеток может представлять собой среду, в которой димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент, добавляют в среду для культивирования Т-клеток. В данном случае культуральная среда Т-клеток может содержать любой компонент, выбранный из группы, состоящей из аминокислот, Сахаров, неорганических солей и витаминов. Предпочтительно культуральная среда Т-кпеток может содержать любую аминокислоту, любой сахар, любую неорганическую соль и любой витамин. Кроме того, данная среда может дополнительно содержать фетальную телячью сыворотку (FBS), гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), белки, углеводы, меркаптоэтанол и факторы роста. Также культуральная среда регуляторных Т-клеток может дополнительно содержать ретиноевую кислоту. В одном воплощении среда пролиферации регуляторных Т-клеток может может содержать базовые компоненты, описанные в следующих Таблице 3 или Таблице 4.

Термин «культуральная среда клеток» в том виде, как он используется в данном документе, означает среду, используемую для культивирования клеток, в частности, регуляторных Т-клеток, и, более конкретно, означает среду для культивирования CD4+CD25+CD127- клеток. Она содержит компоненты, требующиеся клетками для роста и выживания клеток in vitro, или содержит компоненты, которые помогают росту и выживанию клеток. В частности, данные компоненты могут представлять собой витамины, незаменимые или заменимые аминокислоты и микроэлементы. Данная среда может представлять собой среду, используемую для культивирования клеток, предпочтительно эукариотических клеток, наиболее предпочтительно регуляторных Т-клеток и намного более предпочтительно Т-клеток CD4+CD25+CD127- или Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+.

Культуральная среда клеток согласно настоящему изобретению содержит любой аминокислотный компонент, любой витаминный компонент, любой компонент в виде неорганической соли, любой другой компонент и очищенную воду, где:

a) аминокислотный компонент представляет собой по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-валина, L-лейцина, L-изолейцина, L-треонина, L-серина, L-цистеина, L-метионина, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-лизина, L-аргинина, L-гистидина, L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана, L-пролина, β-аланина, γ-аминомасляной кислоты, орнитина, цитруллина, гомосерина, трийодтиронина, тироксина и диоксифенилаланина или их комбинации, и предпочтительно по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из глицина, L-аланина, L-аргинина, L-цистеина, L-глутамина, L-гистидина, L-лизина, L-метионина, L-пролина, L-серина, L-треонина и L-валина или их комбинации;

b) витаминный компонент представляет собой по меньшей мере один витамин, выбранный из группы, состоящей из биотина, кальция D-пантотената, фолиевой кислоты, ниацинамида, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, витамина В12, холина хлорида, i-инозита и аскорбиновой кислоты или их комбинации, и предпочтительно по меньшей мере один витамин, выбранный из группы, состоящей из i-инозита, тиамина гидрохлорида, ниацинамида и пиридоксина гидрохлорида или их комбинации;

c) компонент в виде неорганической соли представляет собой по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида кальция (CaCl₂) (безводный), сульфата меди пентагидрата (CuSO₄-5H₂O), сульфата железа (II) гептагидрата (FeSO₄-7H₂O), хлорида магния (безводный), сульфата магния (MgSO₄) (безводный), хлорида калия (KCl), хлорида натрия (NaCl), динатрия гидрофосфата (Na₂HPO₄), натрия дигидрофосфата моногидрата (NaH₂PO₄-H₂O), сульфата цинка гептагидрата (ZnSO₄-7H₂O), нитрата железа (III) нонагидрата (Fe(NO₃)₃⋅9H₂O) и гидрокарбоната натрия (NaHCO₃) или их комбинации, и предпочтительно по меньшей мере одну неорганическую соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида натрия (NaCl), гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), хлорида калия (KCl), хлорида кальция (CaCl₂) (безводный) и натрия дигидрофосфата моногидрата (NaH₂PO₄-H₂O) или их комбинации;

d) другой компонент представляет собой по меньшей мере один другой компонент, выбранный из группы, состоящей из D-глюкозы (декстрозы), пирувата натрия, гипоксантина Na, тимидина, линолевой кислоты, липоевой кислоты, аденозина, цитидина, гуанозина, уридина, 2'-дезоксиаденозина, 2'-дезоксицитидина HCl и 2'-дезоксигуанозина или их комбинации, и он предпочтительно может представлять собой пируват натрия; и

e) очищенная вода используется для растворения аминокислот, витаминов, неорганических солей и других компонентов, и может быть получена посредством одного или более чем одного способа дистилляции, или очищена через фильтр.

Кроме того, культуральная среда клеток согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать факторы роста или цитокины. Данный фактор роста может представлять собой IGF (инсулиноподобный фактор роста), bFGF (основной фактор роста фибробластов), TGF (трансформирующий фактор роста), HGF (фактор роста гепатоцитов), EGF (эпидермальный фактор роста), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PDGF (фактор роста тромбоцитов) или тому подобный, один или по меньшей мере два из них, но не ограничиваясь ими. Цитокин может представлять собой IL-1 (интерлейкин-1), IL-4, IL-6, IFN-γ (интерферон-гамма), IL-10, IL-17 или тому подобные, один или по меньшей мере два из них, но не ограничиваясь ими.

Термин «Т-клетка» в том виде, как он используется в данном документе, относится к одному из лимфоцитов, ответственных за антигенспецифичный адаптивный иммунитет. Т-клетки классифицируются на нативные Т-клетки, которые еще не встретили антиген, и зрелые Т-клетки, и Т-клетки памяти, которые встречали антиген. При этом зрелые эффекторные Т-клетки содержат Т-клетки-хелперы, цитотоксические Т-клетки и Т-клетки-природные киллеры.

Термин «Т-клетка-хелпер или Th клетка» в том виде, как он используется в данном документе, относится к клетке, которая стимулирует гуморальный иммунитет посредством осуществления регуляции дифференциации и активации других лейкоцитов. Она также называется Т-клетка CD4+, так как она имеет белок CD4 на поверхности клетки. Т-клетки-хелперы могут быть дополнительно классифицированы на Th1, Th2, Th17 и Treg согласно их детальным функциям. Клетки Th1 секретируют интерферон-гамма (IFN-γ) и фактор некроза опухолей бета (TNF-β), индуцируя, посредством этого, слияние эндосом и лизосом с образованием эндолизосом внутри макрофагов. Тем временем, клетки Th2 секретируют несколько типов интерлейкина (IL), обеспечивая дифференциацию В-клеток в плазматические клетки. Клетки Th17 секретируют интерлейкин-17 (IL-17) для рекрутирования нейтрофилов.

Термин «регуляторная Т-клетки (Treg)» в том виде, как он используется в данном документе, включает природные регуляторные Т-клетки (nTreg) или индуцированные регуляторные Т-клетки (iTreg). Регуляторные Т-клетки в данном документе включают Т-клетки CD4+CD25+, Т-клетки CD4+CD25+CD127 низкая - или Т-клетки CD4+CD25+Foxp3+. Регуляторные Т-клетки поддерживают иммунный гомеостаз и блокируют аутоиммунный ответ и тому подобное посредством ингибирования иммунного ответа.

Термин «цитотоксическая Т-клетка» в том виде, как он используется в данном документе, относится к клетке, которая умерщвляет инфицированные вирусом клетки или опухолевые клетки или тому подобное посредством осуществления секреции цитотоксичных веществ, таких как гранзим или перфорин. Она также называется Т-клетка CD8, так как она имеет белок CD8 на поверхности клетки. В отличие от хелперных Т-клеток она устраняет вирус и раковые клетки опосредованием клеточного иммунитета.

Термин «Т-кпетка-природный киллер» в том виде, как он используется в данном документе, относится к одной из эффекторных Т-клеток, которая распостранена в малой доле по сравнению с Т-клетками-хелперами и цитотоксическими Т-клетками. Т-клетки-природные киллеры имеют такие же рецепторы Т-клеток (TCR) на поверхности клеток, что и Т-клетки, но также имеют специфичные для клетки-природного киллера молекулы, такие как NK1.1. Т-клетки-природные киллеры секретируют гамма-интерферон, интерлейкин-4 или тому подобные для регуляции иммунного ответа.

Термин «Т-клетка памяти» в том виде, как он используется в данном документе, относится к Т-клетке, которая имеет потенциальную способность функционировать в качестве эффекторной Т-клетки, так как она распознала антиген и выжила в течение длительного времени после процессов дифференциации и отбора, и позднее, при повторном вторжении антигена, быстро активируется. Наивные Т-клетки дифференцируются в активированные клетки посредством распознавания антигена, или эффекторные Т-клетки дифференцируются в долгоживущие Т-клетки памяти посредством влияния интерлейкина-7 и интерлейкина-15.

В данном случае димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент, может содержаться в культуральной среде в количестве от 1 нМ до 2000 нМ. Кроме того, данный димер может содержаться в количестве от 1 нМ до 1000 нМ или от 1 нМ до 500 нМ. Кроме того, данный димер может содержаться в количестве от 2 нМ до 300 нМ, от 5 нМ до 100 нМ, от 10 нМ до 80 нМ, от 20 нМ до 70 нМ или от 40 нМ до 50 нМ. В частности, слитый белок-димер может содержаться в среде в количестве 1 нМ, 3,2 нМ, 10 нМ или 50 нМ.

Димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент

Термин «IL-2» или «интерлейкин-2» в том виде, как он используется в данном документе, если не утверждается иное, относится к любому IL-2 дикого типа, полученному из любого источника-позвоночного, включая млекопитающих, например, приматов (таких как человек) и грызунов (таких как мыши и крысы). IL-2 может быть получен из животных клеток и также включает IL-2, полученный из рекомбинантных клеток, способных к продукции IL-2. Кроме того, IL-2 может представлять собой IL-2 дикого типа или его вариант.

В настоящем описании изобретения IL-2 или его вариант могут быть совместно выражены термином «белок IL-2» или «полипептид IL-2». IL-2, белок IL-2, полипептид IL-2 и вариант IL-2 специфично связываются, например, с рецептором IL-2. Это специфичное связывание может быть идентифицировано способами, известными специалистам в данной области.

Одно воплощение IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Здесь IL-2 также может находиться в зрелой форме. В частности, зрелый IL-2 может не содержать сигнальную последовательность и может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Здесь IL-2 может использоваться согласно конфигурации, охватывающей фрагмент IL-2 дикого типа, в котором усечена часть N-конца или С-конца IL-2 дикого типа.

Кроме того, данный фрагмент IL-2 может находиться в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 смежных аминокислот усечены с N-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Кроме того, фрагмент IL-2 может находиться в форме, в которой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 смежных аминокислот усечены с С-конца белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36.

Термин «вариант IL-2» в том виде, как он используется в данном документе, относится к форме, в которой часть аминокислот в полноразмерном IL-2 или вышеописанном фрагменте IL-2 заменена. То есть, вариант IL-2 может иметь отличную аминокислотную последоватеьность от IL-2 дикого типа или его фрагмента. Однако вариант IL-2 может иметь эквивалентную или аналогичную активность относительно IL-2 дикого типа. Здесь «активность IL-2» может, например, относиться к специфичному связыванию с рецептором IL-2, причем данное специфичное связывание можно измерять способами, известными специалистам в данной области.

В частности, вариант IL-2 можно получать заменой части аминокислот в IL-2 дикого типа. Одно воплощение варианта IL-2, полученного аминокислотной заменой, может быть получено заменой по меньшей мере одной из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой по меньшей мере одной из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой или 72-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой. Кроме того, когда IL-2 находится в форме, в которой часть N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 усечена, аминокислота в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, может быть заменена другой аминокислотой. Например, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, его вариант IL-2 может быть получен заменой по меньшей мере одной из 58-ой, 62-ой, 65-ой, 81-ой или 92-ой аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 другой аминокислотой. Данные аминокислотные остатки соответствуют 38-му, 42-му, 45-му, 61-му и 72-му аминокислотному остатку в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 соответственно. Согласно одному воплощению могут быть заменены одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот, при условии, что такой вариант IL-2 сохраняет активность IL-2. Согласно другому воплощению могут быть заменены от одной до пяти аминокислот.

В одном воплощении вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 42-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 45-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 45-ой и 61-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 45-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 38-ой, 42-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменой 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может находится в форме, в которой заменяются пять аминокислот. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменой каждой из 38-ой, 42-ой, 45-ой, 61-ой и 72-ой аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой.

Здесь «другая аминокислота», вводимая заменой, может представлять собой любую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Однако относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота не может быть заменена аргинином, 42-ая аминокислота не может быть заменена фенилаланином, 45-ая аминокислота не может быть заменена тирозином, 61-ая аминокислота не может быть заменена глутаминовой кислотой, и 72-ая аминокислота не может быть заменена лейцином.

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота - аргинин - может быть заменена аминокислотой, отличной от аргинина. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 38-ая аминокислота - аргинин - может быть заменена аланином (R38A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 42-ая аминокислота - фенилаланин - может быть заменена другой аминокислотой, чем фенилаланин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 42-ая аминокислота - фенилаланин - может быть заменена аланином (F42A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 45-ая аминокислота - тирозин - может быть заменена другой аминокислотой, чем тирозин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 45-ая аминокислота - тирозин - может быть заменена аланином (Y45A).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 61-ая аминокислота - глутаминовая кислота -может быть заменена другой аминокислотой, чем глутаминовая кислота. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 61-ая аминокислота -глутаминовая кислота - может быть заменена аргинином (E61R).

Относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 72-ая аминокислота - лейцин - может быть заменена другой аминокислотой, чем лейцин. Предпочтительно относительно аминокислотной замены для варианта IL-2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 72-ая аминокислота - лейцин - может быть заменена глицином (L72G).

В частности, вариант IL-2 может быть получен по меньшей мере одной заменой, выбранной из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен аминокислотными заменами в двух, трех, четырех или пяти положениях среди положений, выбранных в группе, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и F42A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменяются три аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и Y45A. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может находиться в форме, в которой заменяются четыре аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, Y45A, E61R и L72G. Кроме того, в одном воплощении вариант IL-2 может быть получен заменами F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может быть получен заменами R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Предпочтительно одно воплощение варианта IL-2 может содержать замену, которая представляет собой любую замену, выбранную из следующих комбинаций замен (a)-(d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G

Здесь, когда IL-2 имеет аминокислотную замену SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, даже когда IL-2 представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 22, 23 или 24.

Кроме того, вариант IL-2 может отличаться наличием низкой токсичности in vivo. Здесь низкая токсичность in vivo может представлять собой побочный эффект, вызванный связыванием IL-2 с альфа цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα). Были разработаны разные варианты IL-2 для уменьшения интенсивности побочного эффекта, вызванного связыванием IL-2 с IL-2Rα, и такие варианты IL-2 могут представлять собой варианты, раскрытые в патенте США №5229109 и корейском патенте №1667096. В частности, варианты IL-2, описанные в настоящей заявке, имеют низкую аффинность связывания в отношении альфа цепи рецептора IL-2 (IL-2Rα) и, таким образом, имеют более низкую токсичность in vivo, чем IL-2 дикого типа.

Термин «CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, также именуемый «В7-1», относится к мембранному белку, присутствующему в дендритных клетках, активированных В-клетках и моноцитах. CD80 предоставляет костимулирующие сигналы, важные для активации и выживания Т-клеток. CD80 известен в качестве лиганда двух разных белков - CD28 и CTLA-4, присутствующих на поверхности Т-клеток. CD80 состоит из 288 аминокислот и может, в частности, иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Кроме того, термин «белок CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к полноразмерному CD80 или к фрагменту CD80.

Термин «фрагмент CD80» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к усеченной форме CD80. Кроме того, фрагмент CD80 может представлять собой внеклеточный домен CD80. Одно воплощение фрагмента CD80 может быть получено устранением 1-ой-34-ой аминокислот с N-конца, которые представляют собой сигнальную последовательность CD80. В частности, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 288-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 242-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 232-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 35-ой - 139-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. Кроме того, одно воплощение фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из 142-ой - 242-ой аминокислот в SEQ ID NO: 11. В одном воплощении фрагмент CD80 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Кроме того, белок IL-2 и белок CD80 могут присоединяться друг к другу через линкер или носитель. В частности, IL-2 или его вариант и CD80 (В7-1) или его фрагмент могут присоединяться друг к другу через линкер или носитель. В настоящем описании термины «линкер» и «носитель» могут использоваться взаимозаменяемо.

Линкер связывает два белка. Одно воплощение линкера может содержать от 1 до 50 аминокислот, альбумин или его фрагмент, домен Fc иммуноглобулина или тому подобное. Здесь домен Fc иммуноглобулина относится к белку, который содержит константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Данный иммуноглобулин может представлять собой IgG, IgA, IgE, IgD или IgM и предпочтительно может представлять собой IgG4. Здесь домен Fc иммуноглобулина G4 дикого типа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Кроме того, домен Fc иммуноглобулина может представлять собой вариант домена Fc, а также домен Fc дикого типа. Кроме того, термин «вариант домена Fc» в том виде, как он используется в данном документе, может относиться к форме, которая отличается от домена Fc дикого типа в показателях картины гликозилирования, имеет высокое гликозилирование по сравнению с доменом Fc дикого типа или имеет низкое гликозилирование по сравнению с доменом Fc дикого типа, или представляет собой дегликозилированную форму. Кроме того, в данный документ включается негликозилированный домен Fc. Домен Fc или его вариант может быть адаптирован для наличия скорректированного числа сиаловых кислот, фукозилирований или гликозилирований посредством культуральных условий или генетических манипуляций с хозяином.

Кроме того, гликозилирование домена Fc иммуноглобулина может быть модифицировано традиционными способами, такими как химические способы, ферментативные способы и способы генной инженерии с использованием микроорганизмов. Кроме того, вариант домена Fc может находиться в смешанной форме соответствующих областей Fc иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgE, IgD и IgM. Кроме того, вариант домена Fc может находиться в форме, в которой некоторые аминокислоты домена Fc заменяются другими аминокислотами. Одно воплощение варианта домена Fc может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Данный слитый белок может иметь структуру, в которой с использованием домена Fc в качестве линкера (или носителя) белок CD80 и белок IL-2 или белок IL-2 и белок CD80 связываются с N-концом и С-концом линкера или носителя соответственно (Фиг. 1А). Связь между N-концом или С-концом домена Fc и CD-80 или IL-2 возможно может достигаться посредством линкерного пептида.

В частности, слитый белок может состоять из следующей структурной формулы (I) или (II):

Здесь в структурных формулах (I) и (II)

N' представляет собой N-конец слитого белка,

С представляет собой С-конец слитого белка,

X представляет собой белок CD80,

Y представляет собой белок IL-2,

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры и

n и m каждый независимо равен 0 или 1.

Предпочтительно данный слитый белок может состоять из структурной формулы (I). Белок IL-2 является таким, как описано выше. Кроме того, белок CD80 является таким, как описано выше. Согласно одному воплощению белок IL-2 может представлять собой вариант IL-2 с одной-пятью аминокислотными заменами по сравнению с IL-2 дикого типа. Белок CD80 может представлять собой фрагмент, полученный усечением вплоть до примерно 34 смежных аминокислотных остатков от N-конца или С-конца CD80 дикого типа. В качестве альтернативы, белок CD может представлять собой внеклеточный иммуноглобулиноподобный домен, имеющий активность связывания с рецепторами поверхности Т-клеток CTLA-4 и CD28.

В частности, данный слитый белок может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Согласно другому воплощению данный слитый белок содержит полипептид, имеющий идентичность последовательности 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Здесь идентичность представляет собой, например, процент гомологии и может определяться посредством программы для сравнения гомологии, такой как программа BlastN Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Пептидный линкер (1) может содержаться между белком CD80 и доменом Fc. Пептидный линкер (1) может состоять из 5-80 смежных аминокислот, 20-60 смежных аминокислот, 25-50 смежных аминокислот или 30-40 смежных аминокислот. В одном воплощении пептидный линкер (1) может состоять из 30 аминокислот. Кроме того, пептидный линкер (1) может содержать по меньшей мере один цистеин. В частности, пептидный линкер (1) может содержать один, два или три цистеина. Кроме того, пептидный линкер (1) может происходить из шарнира иммуноглобулина. В одном воплощении пептидный линкер (1) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Пептидный линкер (2) может состоять из 1-50 смежных аминокислот, 3-30 смежных аминокислот или 5-15 смежных аминокислот. В одном воплощении пептидный линкер (2) может представлять собой (G4S)_n (где n представляет собой целое число от 1 до 10). Здесь в (G4S)_n n может быть равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном воплощении пептидный линкер (2) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен димер, полученный связыванием двух слитых белков, каждый из которых содержит белок IL-2 и белок CD80. Слитый белок, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент, является таким, как описано выше.

Здесь связывание между слитыми белками, составляющими данный димер, может достигаться посредством дисульфидной связи, образованной цистеинами, присутствующими в линкере, но не ограничиваясь ей. Слитые белки, составляющие димер, могут быть одинаковыми или отличающимися друг от друга слитыми белками. Предпочтительно данный димер может представлять собой гомодимер. Одним воплощением слитого белка, составляющего димер, может быть белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Способ культивирования регуляторной Т-клетки

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ культивирования регуляторных Т-клеток, включающий культивирование Т-клеток CD4+CD25+CD127- в среде, содержащей димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент.

В настоящее время Т-клетки CD4+CD25+CD127- можно получать из клеток крови. В настоящее время Т-клетки CD4+CD25+CD127- могут быть выделены из одноядерных клеток периферической крови (РВМС). В качестве альтернативы, Т-клетки CD4+CD25+CD127- можно получать посредством осуществления специфичной пролиферации Т-клеток CD4+CD25+CD127- из клеток крови. В качестве альтернативы, Т-клетки CD4+CD25+CD127- можно получать из клеток CD4+ после удаления РВМС от Т-клеток CD4-. Кроме того, Т-клетки CD4+ могут быть выделены с использованием антител против CD4, и в одном воплощении они были выделены с использованием шариков, с которыми связываются антитела против CD4. Кроме того, Т-клетки CD25+ могут быть выделены с использованием антител против CD25+. В частности, регуляторные Т-клетки могут быть выделены посредством выделения Т-клеток CD4+, CD25+ и CD127-.

Среда может представлять собой традиционно используемую среду. Предпочтительно она может представлять собой среду, оптимизированную для Т-клеток CD4+CD25+CD127-. В конкретном воплощении она может представлять собой среду, в которой FBS, HEPES, L-глутамин и 2-меркаптоэтанол добавлены в среду RPMI1640 или в среду TexMACS, как раскрыто в Таблицах 3 и 4. Кроме того, данная среда может дополнительно содержать ретиноевую кислоту. Кроме того, данная среда может дополнительно содержать пенициллин и/или стерптомицин.

При этом регуляторные Т-клетки CD4+ можно культивировать в среде в течение 1-30 суток или 2-20 суток. Кроме того, они могут культивироваться в течение 3-10 суток или 4-6 суток.

Тем временем, Т-клетки CD4+CD25+CD127- могут быть получены посредством стадии культивирования Т-клеток CD4+ или стадии культивирования Т-клеток CD25+.

В настоящее время Т-клетки CD4+ и Т-клетки CD25+ могут быть получены из клеток крови соответственно. В настоящее время Т-клетки CD4+ и Т-клетки CD25+ могут быть выделены из одноядерных клеток периферической крови (РВМС) или могут быть получены из клеток крови посредством осуществления специфичной пролиферации Т-клеток CD4+ или Т-клеток CD25+ соответственно. В качестве альтернативы, Т-клетки CD4+ или Т-клетки CD25+ могут быть получены после удаления Т-клеток CD4- или Т-клеток CD25- от РВМС. Кроме того, Т-клетки CD4+ могут быть выделены с использованием антител против CD4, и в одном воплощении они могут быть выделены с использованием шариков, с которыми связываются антитела против CD4. Кроме того, Т-клетки CD25+ могут быть выделены с использованием антител против CD25+. В частности, регуляторные Т-клетки могут быть выделены посредством осуществления выделения Т-клеток CD4+, CD25+ и CD127- из Т-клеток CD4+ или Т-клеток CD25+.

Полученные регуляторные Т-клетки и их применение

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены регуляторные Т-клетки, полученные данным способом культивирования.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция для лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, содержащая регуляторные Т-клетки, полученные вышеописанным способом, в качестве активного ингредиента.

В настоящее время регуляторные Т-клетки, полученные данным способом культивирования, могут иметь повышенное количество экспрессии Foxp3+. Термин «Foxp3» в том виде, как он используется в данном документе, относится к белку, также именуемому скурфин. Данный белок представляет собой белок, участвующий в пути регуляторного механизма регуляторных Т-клеток и известен как маркер регуляторных Т-клеток. Предпочтительно регуляторные Т-клетки, полученные выше, могут представлять собой Т-клетки CD4+CD25+CD127-Foxp3+.

Термин «заболевание, опосредованное регуляторными Т-клетками» в том виде, как он используется в данном документе, относится к заболеванию, индуцированному ненормальностью или недостаточностью регуляторных Т-клеток, и может конкретно характеризоваться как воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание.

Конкретное воплощение настоящего изобретения может отличаться тем, что данное воспалительное заболевание представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, фибромиозита, склеродермии, анкилозирующего спондилита, болезни Бехчета, автозного стоматита, синдрома Гийена-Барре, гнездной алопеции, полимиозита, болезни Крона, колита, узелкового полиартериита, рецидивирующего полихондрита и аутоиммунной тромбоцитопении. Кроме того, конкретное воплощение настоящего изобретения может отличаться тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системного склероза, инсулинозависимого юношеского диабета, вызванного антителами против клеток поджелудочной железы, гнездной алопеции, псориаза, пузырчатки, астмы, молочницы полости рта, хронического тиреоидита, некоторой приобретенной апластической анемии, первичного цирроза, язвенного колита, болезни Бехчета, болезни Крона, силикоза, асбестоза, IgA нефропатии, постстрептококкового гломерулонефрита, синдрома Шегрена, синдрома Гийена-Барре, полимиозита, множественного миозита, рассеянного склероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного энцефаломиелита, тяжелой миастении, гипертиреоза Грейвса, узелкового полиартериита, анкилозирующего спондилита, фибромиалгии, височного артериита, болезни Вильсона, синдрома Фанкони, множественной миеломы и системной красной волчанки.

Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или добавку, или тому подобное. Например, она может содержать стерильную воду, нормальный физиологический раствор, традиционный буфер (например, на основе фосфорной кислоты, лимонной кислоты и другой органической кислоты), стабилизатор, соль, антиоксидант, поверхностно-активное вещество, суспендирующий агент, изотоничный агент или консервант. Кроме того, она может содержать органическое вещество, такое как биополимер, и неорганическое вещество, такое как гидроксиапатит, в частности, коллагеновую матрицу, полимер полимолочной кислоты или ее сополимер, полимер полиэтиленгликоля или его сополимер, его химическое производное и их смесь, но не ограничиваясь ими. Примеры стабилизатора могут включать декстран 40, метил целлюлозу, желатин, сульфит натрия, метасульфат натрия или тому подобные. Примеры антиоксиданта могут включать хелатор, такой как эриторбовая кислота, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферилацеат, L-аскорбиновой кислоты пальмитат, L-аскорбиновой кислоты стеарат, гидросульфит натрия, сульфит натрия, триамил галловой кислоты, пропил галловой кислоты или натрий этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), пирофосфат натрия, метафосфат натрия и тому подобные. Примеры суспендирующего агента могут включать метилцеллюлозу, полисорбат 80, гидроксиэтилцеллюлозу, аравийскую камедь, трагакантовую камедь, натрий карбоксиметилцеллюлозу, полиоксиэтилена сорбитана монолаурат и тому подобные. Примеры изотоничного агента могут включать D-маннит и сорбит. Примеры консерванта могут включать метилпараоксибензоат, этилпараоксибензоат, сорбиновую кислоту, фенол, крезол, хлоркрезол или тому подобные.

Способ лечения с использованием полученных регуляторных Т-клеток

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, включающий введение регуляторных Т-клеток индивидууму, имеющему заболевание, опосредованное регуляторными Т-клетками. В настоящее время регуляторные Т-клетки и заболевание, опосредованное регуляторными Т-клетками, являются такими, как описано выше.

Согласно еще одному другому аспекту настоящего изобретения предложено применение регуляторных Т-клеток для лечения заболевния, опосредованного регуляторными Т-клетками.

Способ осуществления данного изобретения

Ниже настоящее изобретение будет более подробно описано посредством следующих примеров. Однако следующие примеры предназначены только для осуществления иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничивается ими.

Пример получения 1. Получение варианта hCD80-Fc-IL-2 (2М): GI-101

Для того, чтобы получать слитый белок, содержащий фрагмент человеческого CD80, домен Fc и вариант IL-2, синтезировали полинукпеотид, содержащий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, связанный с линкером (SEQ ID NO: 3), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M), в котором заменены две аминокислоты (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), в данном порядке от N-конца посредством службы синтеза генов GeneArt Invitrogen Thermo Fisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, данный вектор вводили в клетки СНО (яйцеклетки китайского хомяка) (EXPI-СНО™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 9. После введения вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин и 8% СО₂ в течение 7 суток и затем отбирали для очистки слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «GI-101)).

Очистку проводили с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался при условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения в сборную пробирку 20% 1 М Tris-HCl с рН 9 отбирали слитый белок. Отобранный слитый белок диализировали в буфер PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в течение 16 часов для замены буфера.

Затем измеряли поглощение при длине волны 280 нм с течением времени посредством применения гель-фильтрации с колонкой TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) при восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим для подтверждения его чистоты (ФИГ. 1В). Подтвердили то, что слитый белок содержался в концентрации 2,78 мг/мл при выявлении с использованием NanoDrop (ФИГ. 1С). Также результат, проанализированный с использованием гель-фильтрации, является таким, как показано на ФИГ. 1D.

Пример получения 2. Получение димера варианта Fc-IL-2 (2М): Fc-IL-2v2

Для того, чтобы получить слитый белок, содержащий домен Fc и вариант IL-2, синтезировали полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 45), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), шарнир Ig (SEQ ID NO: 38), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2М), в котором заменяются две аминокислоты (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), в данном порядке от N-конца посредством службы синтеза генов GeneArt Invitrogen ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, данный вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 44. После введения данного вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин и 8% СО₂ в течение 7 суток и затем отбирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «Fc-IL2v2».

Очистку и отбор данного слитого белка проводили таким же способом, как и в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE при восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим с подтверждением его чистоты (ФИГ. 3А). В результате, подтвердили то, что слитый белок образует димер. Также результат, проанализированный с использованием гель-фильтрации, является таким, как показано на ФИГ. 3В.

Пример получения 3. Получение димера Fc-IL-2: Fc-IL-2wt

Для того, чтобы получить слитый белок, содержащий домен Fc и IL-2 дикого типа, синтезировали полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 43), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), шарнир Ig (SEQ ID NO: 38), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 10), в данном порядке от N-конца посредством службы синтеза генов GeneArt Invitrogen Thermo Fisher Scientific inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, данный вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 42. После введения вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин и 8% СО₂ в течение 7 суток и затем отбирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «Fc-IL2wt».

Очистку и отбор данного слитого белка проводили таким же способом, как и в Примере получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE при восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим с подтверждением его чистоты (ФИГ. 3С). В результате, подтвердили то, что слитый белок образует димер. Также результат, проанализированный с использованием гель-фильтрации, является таким, как показано на ФИГ. 3D.

Пример получения 4. Получение димера hCD80-Fc-IL-2 дикого типа: hCD80-Fc-IL-2wt

Для того, чтобы получать слитый белок, содержащий фрагмент человеческого CD80, домен Fc и белок IL-2 дикого типа, синтезировали полинуклеотид, содержащий нукпеотидную последовательность (SEQ ID NO: 41), кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, связанный с линкером (SEQ ID NO: 3), домен Fc (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и IL-2 дикого типа (SEQ ID NO: 10) в данном порядке от N-конца, посредством службы синтеза генов GeneArt Invitrogen ThermoFisher Scientific Inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, данный вектор вводили в клетки СНО (EXPI-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 46. После введения вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин и 8% СО₂ в течение 7 суток и затем отбирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «hCD80-Fc-IL2wt».

Очистку проводили с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался при условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения в сборную пробирку 20% 1 М Tris-HCl с рН 9 отбирали слитый белок. Отобранный слитый белок диализировали в буфер PBS в течение 16 часов для замены буфера.

Затем измеряли поглощение при длине волны 280 нм с течением времени посредством применения гель-фильтрации с колонкой TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE при восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим с подтверждением его чистоты (ФИГ. 4А). В результате подтвердили то, что данный слитый белок образует димер. Также результат, проанализированный с использованием гель-фильтрации, является таким, как показано на ФИГ. 4В.

Пример получения 5. Получение димера hCD80-Fc: hCD80-Fc

Для того, чтобы получить слитый белок, содержащий фрагмент человеческого CD80 и домен Fc, синтезировали полинуклеотид (SEQ ID NO: 39), содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок, содержащий сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнир Ig, связанный с линкером (SEQ ID NO: 3), и домен Fc (SEQ ID NO: 4) в данном порядке от N-конца, посредством службы синтеза генов GeneArt invitrogen ThermoFisher Scientific inc. и клонировали в вектор pcDNA3_4. Кроме того, данный вектор вводили в клетки СНО (EXPi-CHO™) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 40. После введения вектора культуральный раствор культивировали в окружающей среде с 37°С, 125 об./мин и 8% СО₂ в течение 7 суток и затем отбирали для очистки димера слитого белка. Очищенный димер слитого белка называли «hCD80-Fc».

Очистку проводили с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался при условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl и рН 7,4. Затем его элюировали 100 мМ NaCl и 100 мМ уксусной кислотой при рН 3. После помещения в сборную пробирку 20% 1 М Tris-HCl с рН 9 отбирали слитый белок. Отобранный слитый белок диализировали в буфер PBS в течение 16 часов для замены буфера.

Затем измеряли поглощение при длине волны 280 нм с течением времени посредством применения гель-фильтрации с колонкой TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) с получением высокой концентрации слитого белка. При этом выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE при восстанавливающих (R) или невосстанавливающих (NR) условиях и окрашивали кумасси синим с подтверждением его чистоты (ФИГ. 2А). В результате подтвердили то, что данный слитый белок образует димер. Также результат, проанализированный с использованием гель-фильтрации, является таким, как показано на ФИГ. 2В.

Пример получения 1. Культуральная композиция для культивирования регуляторных Т-клеток

Пример получения 1.1. Культуральная композиция клеток CD4+

Культуральную среду клеток CD4+ получали в виде следующей композиции. При этом получали среду из основных компонентов, и затем перед применением добавляли дополнительные компоненты Gl-101, Gl-101WT, hCD80-Fc, Fc-IL-2v2 или Fc-IL-2wt.

Пример получения 1.2. Культуральная композиция клеток CD4+CD25+CD127-

Культуральную композицию клеток CD4+CD25+CD127- получали следующим образом.

Пример 1. Определение уровня пролиферации регуляторных Т-клеток посредством димера слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80

Пример 1.1. Получение шариков для стимулирования пролиферации регуляторных Т-клеток

Для того, чтобы стимулировать пролиферацию регуляторных Т-клеток в выделенных клетках CD4+, получали шарики для стимулирования пролиферации регуляторных Т-клеток с использованием набора MACS GMP ExpAct Treg (кат. №:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Giadbach, Германия). В частности, реактив в наборе MACS GMP ExpAct Treg, который содержит шарики для стимулирования пролиферации регуляторных Т-клеток, переносили в новую пробирку, давали данной пробирке находиться на магните в течение 1 минуты, и затем супернатант удаляли для отделения шариков. При этом использовали 1 мкл реактива в наборе MACS GMP ExpAct Treg на 2×10⁵ клеток. После выделения шариков добавляли от 0,5 мл до 1 мл культуральной композиции клеток CD4+ в Таблице 1 или Таблице 2, которая не содержит какой-либо дополнительный компонент (содержащей только основные компоненты), для ресуспендирования шариков.

Пример 1.2. Выделение Т-клеток CD4+

Измеряли число приобретенных РВМС (Кат. №: SER-PBMC-200-F) (Zen-Bio. Inc, NC 27709, США). Затем их центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Затем, после удаления буферного раствора супернатанта, добавляли 80 мкл буфера MAC на 1×10⁷ клеток для ресуспендирования клеточных осадков. Затем дозировали 20 мкл микрошариков CD4 (кат. №130-045-101) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) на 1×10⁷ клеток, постукивали и достаточно перемешивали. Затем проводили взаимодействие при 4°С-8°С в течение 15 минут.

Для промывки добавляли 10 мл буфера MAC и затем центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Затем после удаления супернатанта добавляли 500 мкл буфера MAC на 1×10⁸ клеток для ресуспендирования клеточных осадков. Затем готовили колонку LS, и затем пропускали 3 мл буфера MAC. Полученную выше суспензию клеток пропускали через колонку LS (кат. №130-042-401) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). 3 мл буфера MAC пропускали 3 раза таким образом, что клетки, присоединенные к колонке LS, могли быть в достаточной степени промыты. Затем после снятие колонки LS с магнитного столика добавляли 3 мл буфера MACS и прилагали давление поршнем для выделения клеток CD4+. Затем осуществляли центрифугирование при 300 g в течение 5 минут. Затем супернатант удаляли, и затем измеряли число клеток.

Кроме того, культуральный раствор регуляторных Т-клеток, содержащий шарики, полученные в Примере 1.1, инокулировали на Т-клетки CD4+, выделенные выше.

Пример 1.3. Культура Т-клеток CD4+

В 6-луночном планшете клетки CD4+, полученные в Примере 1.2, высевали в концентрации 1×10⁷ клеток/мл, и клетки CD4+ культивировали при условиях культуральной композиции клеток в Таблице 1 или Таблице 2, соответственно, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_WT (50 нМ), димер CD80-Fc (50 нМ) + димер Fc-IL-2-2v2 (50 нМ) или димер CD80-Fc (50 нМ) + димер Fc-IL-2wt (50 нМ) в качестве добавок. При демонстрировании клетками в 6-луночном планшете больше, чем 80%-ной конфлюентности их субкультивировали во флаконе 25Т. При демонстрировании клетками во флаконе 25Т больше, чем 80%-ной конфлюентности их субкультивировали во флаконе 75Т. Наконец, при демонстрировании клетками во флаконе 75Т больше, чем 80%-ной конфлюентности их отбирали.

Пример 1.4. Выделение клеток CD4+CD25+CD127-

Клетки CD4+, выделенные в Примере 1.3, центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Кроме того, удаляли супернатант. Добавляли 1 мл блокирующего Fc реактива (biolegend, кат. №422302), разведенного в буфере FACS до 1:200, и оставляли на льду на 10 минут, и затем добавляли 50 мкл CD4-Pacific Blue (BioLegend, кат. №317429), 50 мкл CD25-PE/Cy7 (BioLegend, кат. №356108) и 50 мкл CD127-PE (BD, кат. №557938) и оставляли на льду на 20 минут. Затем дополнительно добавляли 4 мл буфера FACS и центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем, после удаления супернатанта, добавляли 3 мл буфера FACS и центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем удаляли супернатант, и добавляли 3 мл буфера FACS для ресуспендирования клеток. Наконец, клетки CD4+CD25+CD127- выделяли с использованием BD FACS Aria.

Пример 1.5. Культивирование клеток CD4+CD25+CD127-

Клетки CD4+CD25+CD127-, выделенные в Примере 1.4, высевали в концентрации 3×10⁵ клеток/мл в 48-луночный планшет, и в то же самое время выделяли шарики из 1 мкл набора MACS GMP ExpAct Treg (кат. №:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) на 2×10⁶ клеток для стимулирования пролиферации регуляторных Т-клеток, как в Примере 1.1. Выделенные шарики ресуспендировали в культуральной композиции клеток (от 0,5 мл до 1 мл) в Таблице 3 или Таблице 4 (содержащей только базовые компоненты), которая не содержит какой-либо дополнительный компонент, и затем добавляли в луночный планшет, в который высевали клетки CD4+CD25+CD127-, полученные в Примере 1.4. Затем клетки CD4+CD25+CD127- культивировали при условиях культуральной композиции клеток в Таблице 3 или Таблице 4, соответственно, содержащей GI-101 (50 нМ), GI-101_WT (50 нМ), CD80-Fc (50 нМ) + Fc-IL-2-2v2 (50 нМ) или CD80-Fc (50 нМ) + Fc-IL-2wt (50 нМ) в качестве добавки.

В культуре при демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 48-луночном планшете их субкультивировали в 24-луночном планшете. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 24-луночном планшете их субкультивировали в 12-луночном планшете. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 12-луночном планшете их субкультивировали в 6-луночном планшете. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 6-луночном планшете их субкультивировали в 25Т флаконе. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 25Т флаконе их субкультивировали в 75Т флаконе. Наконец, клетки отбирали, когда они демонстрировали больше, чем 80%-ную конфлюентность после субкультивирования в 75Т флаконе.

В результате, результаты пролиферации регуляторных Т-клеток в композиции культуральной среды для регуляторных Т-клеток, содержащей среду RPMI1640, являются такими, как показано в Таблице 5 и на ФИГ. 6, и жизнеспособности клеток являются такими, как показано в Таблице 6 и на ФИГ. 7. Кроме того, результаты пролиферации регуляторных Т-клеток в культуральной композиции, содержащей среду TexMACS, показаны в Таблице 7 и на ФИГ. 8, и жизнеспособности клеток показаны в Таблице 8 и на ФИГ. 9.

Пример 1.6. Определение секреторных способностей иммунодепрессивных цитокинов: интерлейкин-10

Для того, чтобы оценить секреторные способности IL-10 регуляторных Т-клеток, полученных в Примере 1,5, данные клетки культивировали таким образом, что число клеток корректировали до 1×10⁶ клеток/мл, и затем получали супернатант культуры для анализа посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Во-первых, 100 мкл инкубационного буфера набора ELISA для человеческого IL-10 (Invitrogen, кат. № KAC1321) дозировали в каждый микропланшет, и затем добавляли для дозирования 100 мкл калибровки, контроля или образца супернатанта культуры регуляторных Т-клеток соответственно. Затем данные микропланшеты покрывали клейкой пленкой и осуществляли взаимодействие со встряхиванием при 700 об./мин при комнатной температуре (от 18°С до 25°С) в течение 2 часов на шейкере. Затем ряды микролунок 3 раза промывали примерно 150 мкл промывочного буфера на лунку.

После промывки добавляли 100 мкл разбавителя образцов. Затем добавляли 50 мкл антитела против IL-10, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена), и затем осуществляли взаимодействие со встряхиванием при 700 об./мин при комнатной температуре в течение 2 часов, с последующей промывкой 3 раза с использованием примерно 150 мкл промывочного буфера на лунку. После промывки добавляли 100 мкл ТМВ (тетраметилбензидин) и затем осуществляли взаимодействие при комнатной температуре в течение 15 минут, с последующим завершением реакции посредством добавления 100 мкл останавливающего раствора. Затем значения флуоресценции каждой микролунки измеряли при 450 нм.

В результате, секреторные способности интерлейкина-10 клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPMH640, являются такими, как показано на ФИГ. 10, и секреторные способности интерлейкина-10 клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS, являются такими, как показано на ФИГ. 11. На ФИГ. 10 и 11 подтверждено, что интерлейкин-10 высоко экспрессировался в регуляторных Т-клетках, культивируемых в культуральной композиции, содержащей GI-101.

Пример 2. Определение пролиферации регуляторных Т-клеток посредством GH01 в оптимизированном способе культивирования

Пример 2.1. Выделение Т-клеток CD4+

Измеряли число приобретенных РВМС (Кат. №: SER-PBMC-200-F) (Zen-Bio Inc, NC 27709, США). Затем их центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Затем, после удаления буферного раствора супернатанта, добавляли 80 мкл буфера MAC на 1×10⁷ клеток для ресуспендирования клеточных осадков. Затем дозировали 20 мкл микрошариков CD4 (кат. №130-045-101) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) на 1×10⁷ клеток, постукивали и достаточно перемешивали. Затем проводили взаимодействие при 4°С-8°С в течение 15 минут.

Для промывки добавляли 10 мл буфера MAC и затем центрифугировали при 300 g в течение 10 минут. Затем после удаления супернатанта добавляли 500 мкл буфера MAC на 1×10⁸ клеток для ресуспендирования клеточных осадков. Затем готовили колонку LS, и затем пропускали 3 мл буфера MAC. Полученную выше суспензию клеток пропускали через колонку LS (кат. №130-042-401) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). 3 мл буфера MAC пропускали 3 раза таким образом, что клетки, присоединенные к колонке LS, могли быть в достаточной степени промыты. Затем после снятие колонки LS с магнитного столика добавляли 3 мл буфера MAC и прилагали давление поршнем для выделения клеток CD4+. Затем осуществляли центрифугирование при 300 g в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант удаляли, и измеряли число клеток.

Для того, чтобы стимулировать пролиферацию регуляторных Т-клеток в выделенных клетках CD4+ добавляли от 0,5 мл до 1 мл культуральных композиций клеток CD4+ в Таблице 1 или Таблице 2 (содержащих только базовые компоненты), которые не содержат какого-либо дополнительного компонента, для ресуспендирования шариков, которые выделяли и готовили как в Примере 1.1, и это инокулировали в клетки CD4+, выделенные из РВМС.

Пример 2.2. Культивирование Т-клеток CD4+

В 6-луночном планшете клетки CD4+, полученные в Примере 2.1, высевали в концентрации 1×10⁷ клеток/мл и культивировали при условиях композиции культуры клеток в Таблице 1 или Таблице 2, соответственно, содержащей GI-101 (3,2 нМ/50 нМ), GI-101_WT (3,2 нМ/50 нМ), димер CD80-Fc (3,2 нМ/50 нМ) + димер Fc-IL-2v2 (3,2 нМ/50 нМ) или димер CD80-Fc (3,2 нМ/50 нМ) + димер Fc-IL-2wt (3,2 нМ/50 нМ) в качестве добавки. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 6-луночном планшете их субкультивировали во флаконе 25Т. При демонстрировании клетками во флаконе 25Т больше, чем 80%-ной конфлюентности их субкультивировали во флаконе 75Т. Наконец, при демонстрировании клетками во флаконе 75Т больше, чем 80%-ной конфлюентности их отбирали.

Пример 2.3. Выделение Т-клеток CD4+CD25+CD127-

Клетки CD4+, выделенные в Примере 2.2, центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Кроме того, удаляли супернатант и добавляли 1 мл блокирующего Fc реактива (biolegend, кат. №422302), разведенного в буфере FACS до 1:200, с последующим оставлением на льду на 10 минут. Добавляли в образец 2 50 мкл CD4-Pacific Blue (BioLegend, кат. №317429), 50 мкл CD25-PE/Cy7 (BioLegend, кат. №356108) и 50 мкл CD127-PE (BD, кат. №557938) и оставляли на льду на 20 минут.

Затем дополнительно добавляли 4 мл буфера FACS и центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем удаляли супернатант и добавляли 3 мл буфера FACS, с последующим центрифугированием при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем удаляли супернатант, и добавляли 3 мл буфера FACS для ресуспендирования клеток. Наконец, клетки CD4+CD25+CD127- выделяли с использованием BD FACS Aria.

Пример 2.4. Культивирование Т-клеток CD4+CD25+CD127-

Все клетки CD4+CD25+CD127-, выделенные в Примере 2.3, высевали в 24-луночный планшет и, в то же самое время, для стимуляции пролиферации регуляторных Т-клеток, выделяли шарики из 1 мкл набора MACS GMP ExpAct Treg (кат. №:170-076-119) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия) на 2×10⁵ клеток, как и в Примере 2.1, и данные шарики ресуспендировали в культуральной композиции клеток (от 0,5 мл до 1 мл) в Таблице 3 или Таблице 4 (содержащей только базовые компоненты), которая не содержит какого-либо дополнительного компонента. Затем их добавляли в луночный планшет, в который были посеяны клетки CD4+CD25+CD127-.

Затем клетки CD4+CD25+CD127- культивировали при условиях культуральной композиции клеток в Таблице 3 или Таблице 4, соответственно, содержащей GI-101 (3,2 нМ/50 нМ), GI-101_WT (3,2 нМ/50 нМ), димер CD80-Fc (3,2 нМ/50 нМ) + димер Fc-IL-2v2 (3,2 нМ/50 нМ) или димер CD80-Fc (3,2 нМ/50 нМ) + Fc-IL-2wt (3,2 нМ/50 нМ) в качестве добавки. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 24-луночном планшете их субкультивировали в 12-луночном планшете. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 12-луночном планшете их субкультивировали в 6-луночном планшете. При демонстрировании клетками больше, чем 80%-ной конфлюентности в 6-луночном планшете их субкультивировали во флаконе 25Т. При демонстрировании клетками во флаконе 25Т больше, чем 80%-ной конфлюентности их субкультивировали во флаконе 75Т.

Для группы, обработанной 3,2 нМ добавок в Таблице 3 или Таблице 4, клетки наконец отбирали при демонстрировании ими больше, чем 80%-ной конфлюентности во флаконе 75Т. Для группы, обработанной 50 нМ добавок в Таблице 3 или Таблице 4, клетки наконец отбирали при демонстрировании ими больше, чем 80%-ной конфлюентности после субкультивирования во флаконе 175Т.

В результате, в культуральной композиции, содержащей среду RPMH640, результаты пролиферации клеток являются такими, как показано в Таблице 9, на ФИГ. 12А и ФИГ. 12В, и жизнеспособности клеток являются такими, как показано в Таблице 10, на ФИГ. 13А и ФИГ. 13В. Кроме того, в культуральной композиции, содержащей среду TexMACS, результаты пролиферации клеток показаны в Таблице 11, на ФИГ. 14А и ФИГ. 14В, и жизнеспособности клеток показаны в Таблице 12, на ФИГ. 15А и ФИГ. 15В.

Пример 2.5. Характеристика клеток

Клетки CD4+CD25+CD127-, выделенные в Примере 2.4, центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Кроме того, супернатант удаляли. Затем добавляли 100 мкл блокирующего Fc реактива (biolegend, кат. №422302), разведенного в буфере FACS до 1:200, оставляли на льду на 10 минут и дополнительно добавляли 2,5 мкл CD4-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, кат. №45-0048-42), 2,5 мкл CD25-APC/Cy7 (BD, кат. №557753) и 2,5 мкл CD127-бриллиантовый фиолетовый 785 (Biolegend, кат. №351330) и оставляли на льду на 20 минут.

Затем дополнительно добавляли 1 мл буфера FACS и центрифугировали при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Получали раствор смеси 1:3 концентрата фиксатора/пермеабилизатора и разбавителя фиксатора/пермеабилизатора, и 100 мкл добавляли после удаления супернатанта от клеток, полученных центрифугированием, и оставляли на льду на 30 минут. Затем дополнительно добавляли 1 мл буфера FACS, и дважды повторяли центрифугирование при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем удаляли супернатант, добавляли 100 мкл буфера FACS и 2,5 мкл Foxp3-Pacific Blue (Biolegend, кат. №320116) и оставляли на льду на 20 минут. Затем дополнительно добавляли 1 мл буфера FACS и центрифугирование при 1300 об./мин и 4°С в течение 5 минут. Затем удаляли супернатант и добавляли 200 мкл буфера FACS для ресуспендирования клеток. Наконец, клетки характеризовали с использованием оборудования Cytek Aurora.

В результате результаты анализа FACS свойств клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPIVH1640, являются такими, как показано на ФИГ. 16А-16С, и число Т-клеток, экспрессирующих CD4+CD25+Foxp3+, подтвержденное в приведенных выше культуральных условиях, является таким, как показано в Таблице 13 и на ФИГ. 17А-17С. Кроме того, результаты анализа FACS свойств клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS, являются такими, как показано на ФИГ. 18А-18С, и число Т-клеток, экспрессирующих CD4+CD25+Foxp3+, подтвержденное в приведенных выше культуральных условиях, является таким, как показано в Таблице 14 и на ФИГ. 19А-19С.

Пример 2.6. Определение секреторных способностей иммунодепрессивных цитокинов: интерлейкин-10

Для того, чтобы оценить секреторные способности IL-10 регуляторных Т-клеток, полученных в Примере 2.4, данные клетки культивировали таким образом, что число клеток корректировали до 1×10⁶ клеток/мл, и затем получали супернатант культуры для анализа посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Во-первых, 100 мкл инкубационного буфера набора ELiSA для человеческого IL-10 (Invitrogen, кат. № KAC1321) дозировали в каждый микропланшет, и затем добавляли для дозирования 100 мкл калибровки, контроля или образца культурального супернатанта регуляторных Т-клеток соответственно. Затем данные микропланшеты покрывали клейкой пленкой и осуществляли взаимодействие со встряхиванием при 700 об./мин при комнатной температуре (от 18°С до 25°С) в течение 2 часов на шейкере. Затем ряды микролунок 3 раза промывали примерно 150 мкл промывочного буфера на лунку.

После промывки добавляли 100 мкл разбавителя образцов. Затем добавляли 50 мкл антитела против IL-10, конъюгированного с HRP, и затем осуществляли взаимодействие со встряхиванием при 700 об./мин при комнатной температуре в течение 2 часов, с последующей промывкой 3 раза с использованием примерно 150 мкл промывочного буфера на лунку. После промывки добавляли 100 мкл ТМВ и затем осуществляли взаимодействие прикомнатной температуре в течение 15 минут, с последующим завершением реакции посредством добавления 100 мкл останавливающего раствора. Затем значения флуоресценции каждой микролунки измеряли при 450 нм.

В результате, секреторные способности интерлейкина-10 клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду RPMI1640, являются такими, как показано на ФИГ. 20, и секреторные способности интерлейкина-10 клеток, культивируемых в композиции, содержащей среду TexMACS, являются такими, как показано на ФИГ. 21. На ФИГ. 20 и 21 подтверждено, что интерлейкин-10 высоко экспрессировался в регуляторных Т-клетках, культивируемых в культуральной композиции, содержащей GI-101.

--->

 ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GI Cell, Inc.

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> SPO20-038-PCT-GIC

<150> KR 10-2019-0149779

<151> 2019-11-20

<150> KR 10-2020-0033229

<151> 2020-03-18

<160> 46

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 25

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид (TPA)

<400> 1

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 2

<211> 208

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hB7-1:35-242

<400> 2

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 3

<211> 30

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнир с линкером

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 216

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> fc иммуноглобулина

<400> 4

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 5

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> linker

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2M

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 617

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок, содержащий варианты IL-2 и фрагменты CD80

<400> 7

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu

20 25 30

Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu

35 40 45

Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val

50 55 60

Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser

115 120 125

Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr

210 215 220

Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

485 490 495

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe

515 520 525

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

530 535 540

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

545 550 555 560

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

565 570 575

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

580 585 590

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

595 600 605

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 8

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101)

<400> 8

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga

1857

<210> 9

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101)

<400> 9

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 10

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 11

<211> 288

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80

<400> 11

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 12

<211> 215

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированный Fc

<400> 12

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 13

<211> 306

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mCD80

<400> 13

Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe

1 5 10 15

Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser

20 25 30

Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp

35 40 45

Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser

50 55 60

Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val

65 70 75 80

Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu

85 90 95

Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser

100 105 110

Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr

115 120 125

Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp

130 135 140

Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr

145 150 155 160

Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe

165 170 175

Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile

180 185 190

Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp

195 200 205

Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly

210 215 220

Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp

225 230 235 240

Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly

245 250 255

Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys

260 265 270

Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn

275 280 285

Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val

290 295 300

Phe Leu

305

<210> 14

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101)

<400> 14

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg

120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa

180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag

240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc

300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag

360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag

420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct

480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt

540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc

600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt

660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc

720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca

780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag

840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa

900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag

960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg

1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg

1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt

1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg

1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag

1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct

1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg

1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt

1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg

1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc

1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag

1620

tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac

1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa

1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt

1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc

1848

<210> 15

<211> 616

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101)

<400> 15

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 16

<211> 1437

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C1)

<400> 16

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctaggtgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc cctgggc

1437

<210> 17

<211> 454

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101C1)

<400> 17

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

450

<210> 18

<211> 1176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C2)

<400> 18

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccatctc acgccgctga gtctaagtac ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca

120

gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg

180

atctctcgga cccctgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag

240

gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga

300

gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat

360

tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc

420

gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct

480

ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc

540

tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag

600

accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg

660

gacaagtcta ggtggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg

720

cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gcggaggcgg aggatctgct

780

cctacctcca gctccaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc

840

cagatgatcc tgaatggcat caacaattac aagaacccca agctgaccgc catgctgacc

900

gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagag

960

gaactgaagc ccctggaaga agtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg

1020

cctagggacc tgatctccaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg ctccgagaca

1080

accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg

1140

atcaccttct gccagtccat catctccaca ctgacc

1176

<210> 19

<211> 367

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101C2)

<400> 19

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala

260 265 270

Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 20

<211> 1434

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101C1)

<400> 20

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg

120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa

180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag

240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc

300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag

360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag

420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct

480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt

540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc

600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt

660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc

720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca

780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag

840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa

900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag

960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg

1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg

1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt

1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg

1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag

1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct

1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg

1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtccct gggc

1434

<210> 21

<211> 478

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101C1)

<400> 21

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

465 470 475

<210> 22

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M45)

<400> 22

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 23

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M61)

<400> 23

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 24

<211> 133

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> варианты IL-2 (3M, M72)

<400> 24

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 25

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M45)

<400> 25

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

accgccatgc tgaccgctaa gttcgccatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c

1851

<210> 26

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M45)

<400> 26

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 27

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M61)

<400> 27

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aaagggaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c

1851

<210> 28

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M61)

<400> 28

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 29

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI102-M72)

<400> 29

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatggggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga

1857

<210> 30

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI102-M72)

<400> 30

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 31

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101w)

<400> 31

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c

1851

<210> 32

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101w)

<400> 32

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 33

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI102-M61)

<400> 33

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg

120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa

180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag

240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc

300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag

360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag

420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct

480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt

540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc

600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt

660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc

720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca

780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag

840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa

900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag

960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg

1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg

1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt

1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg

1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag

1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct

1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg

1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt

1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg

1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc

1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag

1620

tgcctggaaa gggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac

1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa

1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt

1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc

1848

<210> 34

<211> 616

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI102-M61)

<400> 34

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 35

<211> 153

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2 дикого типа

<400> 35

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 36

<211> 158

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL-2 с сигнальной последовательностью

<400> 36

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr

20 25 30

Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met

35 40 45

Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met

50 55 60

Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His

65 70 75 80

Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn

85 90 95

Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser

100 105 110

Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe

115 120 125

Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn

130 135 140

Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150 155

<210> 37

<211> 474

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность нуклеотидов, кодирующая IL-2 с сигнальной

последовательностью

<400> 37

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgcccc taccagctcc tctaccaaga aaacccagct ccagttggag

120

catctgctgc tggacctcca gatgattctg aacgggatca acaactataa gaaccccaag

180

ctgacccgca tgctgacctt taagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac

240

ctccagtgcc tggaagaaga actgaagccc ctggaagagg tgctgaatct ggcccagtcc

300

aagaacttcc acctgaggcc acgggacctg atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggaa

360

ctgaagggct ccgagacaac ctttatgtgc gagtacgccg acgagacagc caccatcgtg

420

gaatttctga accggtggat caccttctgc cagagcatca tctccacact gacc

474

<210> 38

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнир

<400> 38

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 39

<211> 1461

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие CD80-Fc белок

<400> 39

ggatccgcca ccatggatgc tatgctgaga ggcctgtgtt gcgtgctgct gctgtgtggc

60

gctgtgttcg tgtctccttc tcacgctgtg atccacgtga ccaaagaagt gaaagaggtc

120

gccacactgt cctgcggcca caacgtttca gtggaagaac tggcccagac caggatctac

180

tggcagaaag aaaagaaaat ggtgctgacc atgatgtccg gcgacatgaa catctggcct

240

gagtacaaga accggaccat cttcgacatc accaacaacc tgtccatcgt gattctggcc

300

ctgaggcctt ctgatgaggg cacctatgag tgcgtggtgc tgaagtacga gaaggacgcc

360

ttcaagcgcg agcacctggc tgaagtgaca ctgtccgtga aggccgactt tcccacacct

420

tccatctccg acttcgagat ccctacctcc aacatccggc ggatcatctg ttctacctct

480

ggcggctttc ctgagcctca cctgtcttgg ctggaaaacg gcgaggaact gaacgccatc

540

aacaccaccg tgtctcagga ccccgaaacc gagctgtacg ctgtgtcctc caagctggac

600

ttcaacatga ccaccaacca cagcttcatg tgcctgatta agtacggcca cctgagagtg

660

aaccagacct tcaactggaa caccaccaag caagagcact tccctgacaa tggatctggc

720

ggcggaggtt ctggcggagg tggaagcgga ggcggaggat ctgctgagtc taagtatggc

780

cctccttgtc ctccatgtcc tgctccagaa gctgctggcg gaccctctgt gttcctgttt

840

cctccaaagc ctaaggacca gctcatgatc tctcggacac ccgaagtgac ctgcgtggtg

900

gtggatgtgt ctcaagagga ccctgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa

960

gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta cagagtggtg

1020

tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg

1080

tccaacaagg gcctgccttc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggctaa gggccagcct

1140

agggaacccc aggtttacac cctgcctcca agccaagagg aaatgaccaa gaaccaggtg

1200

tccctgacct gcctggtcaa gggcttctac ccttccgaca ttgccgtgga atgggagtcc

1260

aatggccagc ctgagaacaa ctacaagacc acacctcctg tgctggactc cgacggctcc

1320

ttctttctgt actctcgcct gaccgtggac aagtctaggt ggcaagaggg caacgtgttc

1380

tcctgctctg tgctgcacga ggccctgcac aatcactaca cccagaagtc cctgtctctg

1440

tccctgggct gatgactcga g

1461

<210> 40

<211> 479

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80-Fc protein

<400> 40

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu

20 25 30

Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu

35 40 45

Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val

50 55 60

Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser

115 120 125

Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr

210 215 220

Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

465 470 475

<210> 41

<211> 1851

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (hCD80-Fc-IL2wt)

<400> 41

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc

120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa

180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac

240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct

300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag

360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac

420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct

480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg

540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc

600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc

660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct

720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct

780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct

840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct

900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc

960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc

1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc

1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag

1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc

1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct

1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac

1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg

1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt

1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat

1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg

1560

acccgcatgc tgacctttaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc

1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag

1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg

1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa

1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c

1851

<210> 42

<211> 367

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc-IL2wt

<400> 42

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

20 25 30

Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

35 40 45

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

85 90 95

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

100 105 110

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

115 120 125

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

130 135 140

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

145 150 155 160

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

180 185 190

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

195 200 205

Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser

225 230 235 240

Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln

245 250 255

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg

260 265 270

Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys

275 280 285

His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu

290 295 300

Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile

305 310 315 320

Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr

325 330 335

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu

340 345 350

Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

355 360 365

<210> 43

<211> 1176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc-IL2wt

<400> 43

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg

60

tctccttctc acgctgctga gtctaagtat ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca

120

gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg

180

atctctcgga cacccgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag

240

gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga

300

gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat

360

tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc

420

gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct

480

ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc

540

tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag

600

accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg

660

gacaagtcta gatggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg

720

cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gaggtggtgg cggttctgcc

780

cctaccagct cctctaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc

840

cagatgattc tgaacgggat caacaactat aagaacccca agctgacccg catgctgacc

900

tttaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagaa

960

gaactgaagc ccctggaaga ggtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg

1020

ccacgggacc tgatcagcaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaggg ctccgagaca

1080

acctttatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg

1140

atcaccttct gccagagcat catctccaca ctgacc

1176

<210> 44

<211> 392

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fc-IL2v2

<400> 44

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

20 25 30

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

35 40 45

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

50 55 60

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

65 70 75 80

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

85 90 95

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

100 105 110

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

115 120 125

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

130 135 140

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

145 150 155 160

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

165 170 175

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

180 185 190

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

195 200 205

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

210 215 220

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

225 230 235 240

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

260 265 270

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

275 280 285

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

290 295 300

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu

305 310 315 320

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

325 330 335

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

340 345 350

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

355 360 365

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

370 375 380

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

385 390

<210> 45

<211> 1200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие Fc-IL2v2

<400> 45

ggatccgcca ccatggatgc tatgctgaga ggcctgtgtt gcgtgctgct gctgtgtggc

60

gctgtgttcg tgtctccatc tcacgccgct gagtctaagt acggccctcc ttgtcctcca

120

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag

180

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa

240

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag

300

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg

360

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg

420

ccttccagca tcgaaaagac catctccaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt

480

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg

540

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag

600

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct

660

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg

720

cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggcggaggc

780

ggaggatctg ctcctacctc cagctccacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg

840

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc

900

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacctccag

960

tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac

1020

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa

1080

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt

1140

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagtcc atcatctcca cactgacctg atgactcgag

1200

1200

<210> 46

<211> 592

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80-Fc-IL2wt

<400> 46

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ культивирования регуляторных Т-клеток, включающий культивирование выделенных регуляторных Т-клеток в среде, содержащей димер слитого белка. Указанный димер слитого белка содержит белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент. Изобретение обеспечивает увеличение эффективности пролиферации и жизнеспособности полученных регуляторных Т-клеток Foxp3+. 8 з.п. ф-лы, 41 ил., 14 табл., 2 пр.

1. Способ культивирования регуляторных Т-клеток, включающий:

культивирование выделенных регуляторных Т-клеток в среде, содержащей димер слитого белка, содержащий белок IL-2 или его вариант и белок CD80 или его фрагмент,

где слитый белок характеризуется следующими структурными формулами (I) или (II):

N'-X-[линкер (1)]n-домен Fc-[линкер (2)]m-Y-C' – формула (I),

N'-Y-[линкер (1)]n-домен Fc-[линкер (2)]m-X-C' – формула (II),

где N' представляет собой N-конец слитого белка,

C' представляет собой С-конец слитого белка,

X представляет собой белок CD80 или его фрагмент,

Y представляет собой белок IL-2 или его вариант,

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры и

n и m каждый независимо равен 0 или 1,

при этом вариант белка IL-2 содержит замену 38-й и 42-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, при этом фрагмент белка CD80 содержит внеклеточный домен CD80.

2. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором регуляторные Т-клетки представляют собой Т-клетки CD4+CD25+CD127-.

3. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором культивирование осуществляют в течение 1-20 суток.

4. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 2, в котором Т-клетки CD4+CD25+CD127- получают культивированием Т-клеток CD4+ или культивированием Т-клеток CD25+.

5. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором белок IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.

6. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором вариант белка IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

7. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором CD80 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

8. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором вариант белка IL-2 содержит любую замену, выбранную из следующих комбинаций замен (а)-(d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A,

(b) R38A/F42A/Y45A,

(c) R38A/F42A/E61R,

(d) R38A/F42A/L72G.

9. Способ культивирования регуляторных Т-клеток по п. 1, в котором слитый белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30.