ТКАНЕИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ СЕРДЕЧНОЙ ТКАНИ Российский патент 2020 года по МПК A61F2/00 B82B1/00 A61P9/00 

Предлагаемое изобретение относится к области создания конструкций медицинского назначения из биологических материалов и может применяться для регенерации сердечной ткани.

Известна искусственная мышца (ИМ) из композиционного материала в составе различных полимеров (нейлон, полиэтилен, полиорганосилоксан и др.) и нитей интерметаллида (Ni-Ti - нитинол) [1]. Такая ИМ работает при нагреве и охлаждении полимера и имеет замедленное действие и гистерезисы. Возможно, такие материалы перспективны к применению в робототехнике и неинвазивном протезировании, но в инвазивной имплантации они неприемлемы ввиду опасности перегрева окружающих тканей и низкой степени биосовместимости.

Известна конструкция из различных биосовместных полимерных нановолокон с диаметрами в диапазоне 100-1000 нм. В частности, предложены биодеградируемые биосовместимые полимеры, содержащие матрицы из полиуретана, или коллагена, или хитозана, или гиалуроновой кислоты, а также их смеси или смеси их сополимеров [2]. Из нановолокон образуют вязаную сетку, тканую сетку или нетканые сплошные слои, предназначенные для регенерации связок, сухожилий или других тканей. Однако в предложенных материалах не предусмотрена их электрическая проводимость, из чего следует, что они непригодны в качестве сердечной заплаты для регенеризации сердечной ткани, так как для этого необходимо определенное значение электрической проводимости.

Известны проводящие полиуретановые эластомеры, содержащие многочисленые добавки, в том числе олигомер анилина [3]. Хотя предложенные эластомеры и являются биодеградируемым материалом, последняя добавка сильно уменьшает его степень биосовместимости. Также эластомеры имеют недостатки: малую удельную проводимость ≤0,1 См/м, высокие значения модуля упругости 3-16 МПа, сильные гистерезисы при многократной деформации в области растяжения ≥10%.

В работе [4] предложена заплата для сердечной ткани, содержащая покрытие из восстановленного оксида графена (ОГ). Слои из оксида графена наносились на заплату из коллагена, в результате чего улучшались механические и электрические свойства заплаты: прочность на разрыв достигала 1,1 МПа, а электропроводность σ≈4⋅10^-4 См/м при концентрациях ОГ 800 мкг/мл. Достигнутое значение электропроводности недостаточно для электростимуляции предложенной заплаты, так как натуральная сердечная ткань имеет σ≥10^-1 См/м [5].

Известны инженерные искусственные пластыри для ускорения регенерации сердца в инфарктных тканях миокарда [6]. Пластырь представляет собой нановолокнистый каркас из полиэтилентерефталата с добавками из оксида графена концентрацией 0,05 мас. % и имеет модуль Юнга 30-60 МПа и максимальную σ~1,3⋅10^-4 См/м. Предлагается использовать данный пластырь для улучшения прикрепления и пролиферации сердечных клеток. Очевидно, что такой пластырь сильно отличается параметрами от натуральной сердечной ткани (модуль Юнга <1 МПа и σ≥10^-1 См/м [5]) и не может полноценно выполнять ее функции.

Известна 3D структура (пластырь), функционализированная клинически значимыми дозами лекарства аденозина, позволяющая контролировать доставку препарата в сердце свиньи в режиме in vivo [7]. Предложенный пластырь не способствует хоть частичному выполнению функций поврежденной сердечной ткани, в частности, участию в механической силовой деформации сердца, а выполняет функцию доставки лекарств к поврежденной части сердечной ткани.

3D биопечать позволила создать пластырь, содержащий клеточные сфероиды, созданные из плюрипотентных кардиомиоцитов человека, которые были получены из стволовых клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток [8]. Через четыре недели после операции показатели выживаемости составили 100% и 83% в экспериментальной и контрольной группах соответственно. В последнем случае пластырь не использовался. Электрогардиография показала тенденцию улучшения сердечной функции в экспериментальной группе. Поскольку количество испытуемых было мало (n=4) и время испытаний было небольшим, о долгосрочной эффективности данного пластыря говорить не представляется возможным.

Аналогичные многочисленные пластыри для лечения сердечно-сосудистых заболеваний описаны в работах [9, 10].

Полимерный материал, в составе которого присутствуют альбумин, поликапролактон, желатин, полимолочная кислота и гликолевая кислота, децеллюлярный внеклеточный матрикс и разные комбинации из них, оказался подобен натуральной мышечной ткани [11]. Согласно опытам in vitro, данный материал, на котором культировались желудочковые кардиомиоциты новорожденных крыс, реагировал на электростимуляцию: сжимался и разжимался при подаче сигнала стимуляции частотой 1 Гц. Однако процесс приготовления предложенного материала сложен, и его прочностные характеристики не исследованы.

Наиболее близок к предлагаемому изобретению патент «Искусственная мышца для сердечной ткани», содержащий композитный биосовместимый наноматериал в составе бычьего сывороточного альбумина (БСА) и многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ) [12]. Композитный наноматериал содержит повышенное количество нанотрубок, то есть их концентрация С ~10 мас. % МУНТ. Это обеспечивает высокую удельную электрическую проводимость до σ ~500 См/м, но снижает степень биосовместимости и эластичности. Однако натуральная сердечная ткань имеет σ ~0,1-1 См/м, и для ее регенерации не требуется применять заплату, имеющую значение удельной электрической проводимости на два порядка выше, как предложено в прототипе [12]. Одновременно при концентрациях нанотрубок σ ~10 мас. % МУНТ, композитный наноматериал БСА/МУНТ становится прочным с высоким значением молуля упругости Е>10 МПа. Следовательно, и он непримлем в качестве заплаты сердечней ткани, так как значение Е значительно превосходит модуль упругости натуральной сердечной ткани <0.5 МПа [5].

Задача предлагаемого изобретения состоит в улучшениях биосовместимости материалов и удельной электропроводимости биосовместимого композиционного наноматериала, предназначенного для регенерации сердечной ткани. Эти требования выполняются благодаря тому, что добавка коллагена улучшает упругость и эластичность композитного материала, а добавка скуцината хитозана активизирует рост клеток на его поверхности.

Поставленная задача решается использованием тканеинженерной конструкции (ТИК) для регенерации сердечной мышцы, включающей электропроводящий слой композиционного наноматериала из бычьего сывороточного альбумина (БСА) и наполнителя из одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ), содержащей конструкцию из слоев с общей толщины 0,3-0,5 мм в составе бычьего сывороточного альбумина, в которую дополнительно входят слои коллагена (КЛ) и скуцинат хитозана (СХ). ТИК для регенерации сердечной мышцы имеет квадрато-образные ячейки с размерами сторон 50-200 мкм.

На слое в составе СХ и небольшой концентрации ОУНТ активизируются клетки сердечней ткани, что является важным компонентом ТИК композитного наноматериала.

В композитном наноматериале БСА/ОУНТ увеличины: твердость H_v, прочность на разрыв (предел прочности) T_s, Е и σ достигли высоких значений за счет механических и электрических свойств углеродных нанотрубок. Например, твердость (H_v ~350 МПа) и прочность на разрыв (~50 МПа) в композите из БСА и МУНТ в 6 раз и более выше, чем в чистом альбумине [13, 14]. Поэтому такой композитный наноматериал является хрупким и слаборастягивающимся, т.е. он имеет недостаточную эластичность для сердечней ткани. В предложенном изобретении этот недостаток устраняется использованием коллагеновой добавки в композитном материале и уменьшением концентрации ОУНТ.

Действительно, коллаген представляют собой свитые спиралевидные волокна. Под действием нагрузки они вначале распрямляются, а затем удлиняются до ε ~10-20%. При растягивания их T_s и Е достигают 10⁹ Па и 10⁸ Па, соответственно [15]. В состоянии распрямления параметры T_s и Е на 3-4 порядка меньше, чем в режиме растягивания. Таким образом, коллаген может иметь низкие T_s и Е, приемлемое относительное удлинение, которые сопостовимы к механическим параметрам натуральной сердечной ткани. Эти свойства коллагена также передаются слоям композитов из БСА и ОУНТ, СХЗ и ОУНТ, между которыми помещается слой композита из КГ и ОУНТ. Именно: улучшаются механические свойства так, что ТИК виде наноматериала становится достаточно прочным, упругим и эластичным (Е≤10⁵ Па) до значений, необходимых для сердечной ткани.

Для упрочнения ТИК нецелесообразно использовать большую концентрацию ОУНТ, так как эту функцию в композитном наноматериале БСА/КЛ/СХ/ОУНТ значительной степени будет выполнять коллаген. Следовательно, уменьшение концентрации углеродных нанотрубок повышает степень биосовместимости ТИК, и одновременно увеличивает его эластичность.

Для слоя композитного наноматериала БСА/КЛ/СХЗ/ОУНТ в качестве ТИК оптимальной толщиной является 0,3-0,5 мм. Значение объясняется следующим. Развиваемая сердечной мышцей сила, которая может действовать на ТИК виде заплаты сердечной ткани, ориентировочно считается 20 Н. Для заплаты виде полосы допускаем ее ориентировочные параметры: ширину w=20 мм, длину 50 мм, толщину d и относительное удлинение 10%, т.е. ε=0,1. Тогда при толщинах слоя d=0,3-0,5 мм его прочность легко выдерживает силовую нагрузку от сердца, и его эластичность (величина Е) близко к значению Е натуральной сердечной ткани.

Предложенная ТИК представляет собой слой (заплату), накладываемый на место, где повреждена сердечная ткань. На фиг. 1 показан эскиз слоя ТИК, где 1 - предметное стекло (подложка), 2- слой СХ/ОУНТ, 3 - слой КЛ/ОУНТ, 4 - слой БСА/ОУНТ.

В процессе приготовления ТИК использовалась лазерная установка, эскизная схема которой приведена на фиг. 2, где 5 - компьютер с монитором, 6 - блок управления осью z, 7 - лазер, 8 - оптоволокно, 9 - гальванометрический сканатор, 10 - собирающая линза, 11 - образец, 12 - система термостабилизации.

На фиг. 3 показаны изображения типичных образцов ТИК.

На фиг. 4 представлены картинки внутренной структуры типичной ТИК.

На фиг. 5 представлены результаты роста клеток фибробластов, кардиомиоцитов и клеток эндотелия, нанесенных на изготовленные сплошные слои ТИК со стороны слоя СХ.

Установка, блок-схема которой приведена на фиг. 2, позволяет по заданному алгоритму облучать образец в непрерывном режиме, или перемещать лазерный луч над образцом для образования слоя с ячейкообразной структурой. При этом под влиянием лазерного излучения происходит отверждение дисперсии, электромагнитное поле лазерного излучения ориентирует нанотрубки в прочный пористый каркас, обернутый компонентами наноматериала матрицы. Траектория движения лазерного луча выбирается в виде продольных и поперечных параллельных линий, что позволяло абляцию наноматериала и создание слоя с ячейкоклеточной структурой.

Установка для изготовления образцов включает в себя систему управления, позиционирования лазерного луча и термоконтроля. Сканаторная головка соединялась с линейным позиционером, который, в свою очередь, устанавливался на раму модуля позиционирования с помощью рельс, что позволяет изменять координату по оси z. Компьютер позволяет задать алгоритм приготовления слоя: мощность и режим (импульсный, непрерывный) излучения лазера, управление системой термоконтроля. Система термоконтроля реализована с использованием непрерывного измерения температуры посредством ИК-датчика и динамического регулирования мощности лазерного излучения в случае отклонения значения температуры от заданного. Благодаря этому можно проконтролировать температуру изготовления слоя в зависимости от используемых дисперсий и не допустить их перегрева. На мониторе отражаются заданные параметры процесса образования слоя на подложке.

Пример 1.

Для создания ТИК в начале приготавливались водные дисперсии в составе следующих компонентов: одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) марки ОУНТ 90А (длина - 0,3-0,8 мкм, диаметр - 1,4-1,6 нм), белки бычьего сывороточного альбумина в виде лиофилизата 99,9% чистоты, коллаген в виде 2%-й суспензии в воде, а также скуцинат хитозана в виде порошка. Были изготовлены водные дисперсии нанотрубок с каждым из органических компонентов. Для получения равномерно взвешенной жидкости проводилась ее обработка в магнитной и ультразвукой мешалках различной мощности. Концентрации компонентов в водных дисперсиях были: 25 мас. % БСА/0,001 мас. % ОУНТ; 1 мас. % КЛ/0,001 мас. % ОУНТ; 2 мас. % СХ/0,001 мас. ОУНТ.

В водную дисперсию 2 мас. % СХТ/0,001 мае.ОУНТ в течение 10 с опускается (окунается) подложка, в частности, предметное стекло с размером 24 мм×72 мм. На подложке осаждается тонкая пленка (образец) данной дисперсии. В дальнейшем образец подвергается лазерному облучению. Схема лазерной установки приведена на фиг. 2.

Алгоритм приготовления был таким, что температура слоя удерживалась на уровне 45°С.Это позволяло предотвратить денатурацию образованного слоя. При этом мощность излучения регулировалась в интервале 1-6 Вт, длина вольны генерации 810 нм, режим непрерывный, а время облучения 10-15 с. После первого облучения и высыхания слоя, образец снова окунается в дисперсии, и цикл приготовления слоя повторяется. При числе циклов около 50-100 на подложке получался слой композиционного наноматериала СХ/ОУНТ толщиной 0,15-0,2 мм, и процесс приготовления завершается. В дальнейшем на этот же слой (образец) сверху наносился слой толщиной 0,15-0,2 мм из дисперсии КЛ/ОУНТ как аналогичным образом наносился слой из водной дисперсии СХ/ОУНТ. На следующем этапе, на этом же образце, подобно предыдущим процессам приготовления, появлялся слой толщиной 0,15-0,2 мм из дисперсии БСА/ОУНТ.

ТИК имеет квадрато-образные ячейки с размерами сторон 50-200 мкм. В слое тканеинженерной конструкции ячейки образуются под действием лазерного излучения, имеющего следующие параметры: мощность 1-6 Вт, длина вольны генерации 810 нм, непрерывный режим работы. Тканеинженерная конструкция содержит слой толщиной 0,15-0,20 мм в составе: 25 мас. % бычий сывороточный альбумин, 0,001 мас. % одностенные углеродные нанотрубки, остальное - вода, т.е. слой БСА/ОУНТ. Тканеинженерная конструкция содержит слои толщиной 0,15-0,20 мм в составе: 1 мас. % коллаген, 0,001 масс. % одностенные углеродные нанотрубки, остальная - вода, т.е. слой КЛ/ОУНТ. Тканеинженерная содержит слои хитозана и одностенные углеродные нанотрубки в качестве подложки толщиной 0,05-0,10 мм в составе: 2 мас. % хитозан, 0,001 масс. % одностенные углеродные нанотрубки, остальная - вода, т.е. слой СХТ/ОУНТ.

На фиг. 3 показаны изображения типичных образцов ТИК. На одной стороне стеклянной подложки слою придавалась форма, приближенная к квадрату со стороной ~20 мм. В дальнейшем на подложке под действием лазерного излучения образовались ячейки в форме клеток с размером сторон ~50-250 мкм, которые показаны на фиг. 4. Установка лазерного облучения управляется по специальному компьютерному алгоритму (мощность, позиционирование лазерного луча относительно образца) и реализуется ячейковая структура в ТИК. При этом высокая мощность лазера используется таким образом, что происходила абляция материала ТИК, и на этих местах образовались ячейки. После завершения процесса приготовления слой ТИК от подложки отделялся. В частности, слой медленно поднимается со стеклянной подложки при помощи скальпеля. Подъем начинается от краев слоя. На фиг. 4, а приведенная ТИК ячейка имеет размер -50 мкм, а на при на фиг. 4, б - ~200 мкм. Ячейковая структура способствует пролиферации клеток в ТИК, что в свою очередь способствует регенерации сердечной ткани на ней. Следует отметить, что ячейковая структура слоев ТИК подобна порам в материале, и их поверхностная плотность больше 50-60%. Этот показатель способствует активному заселению клеток в ячейках и ускоренному процессу регенерацию новой ткани.

Таким образом, конечный образец ТИК представляет собой слой толщиной 0,3-0,5 мм, содержащий три подслоя из следующих композитных наноматериалов: БСА/ОУНТ, КЛ/ОУНТ и СХ/ОУНТ.

В таб. 1 приведены типичные значения удельной электропроводимости σ для некоторых слоев ТИК. Для них величины σ определялись с учетом их геометрических размеров и сопротивления. В сплошных слоях ТИК σ более высокие, чем в слоях с ячейками, что связано с их геометрией.

Высокая степень биосовместимости предложенных слоев ТИК обусловлена содержанием низкой концентрации углеродных нанотрубок в (~0,001 мас. %) в матрице из биологических материалов (БСА, КГ, СХ), а также их многослойной конструкцией. Подслои в слое ТИК способствуют и служат следующему (см. фиг. 1): СХ/ОУНТ - максимальной пролиферации клеток сердечной ткани, КЛ/ОУНТ - максимальной упругости и эластичности заплаты. БСА/ОУНТ - основной биологический материал в заплате сердечной ткани, в котором матрица БСА имеет концентрацию >95 мас. %. На фиг. 5 представлены результаты роста клеток фибробластов, кардиомиоцитов и клеток эндотелия, нанесенных на изготовленные сплошные слои ТИК со стороны слоя СХ. Здесь же представлены результаты роста тех же клеток, но на подложках покровного стекла (контрольные образцы). Приведенные изображения флуоресцентной микроскопии соответствуют разным клеткам: фибробластам (а, б), кардиомиоцитам (в, г) и эндотелиальным клеткам (д, е). Рисунки (б, г, е) соответствуют контрольным образцам. Спустя 72 часа клетки покрывают всю доступную поверхность слоя ТИК и покровное стекло таким образом, как показано на фиг. 5.

Известно, что кардиомиоциты в живом сердце способны передавать электрические импульсы и синхронно сокращаться, поэтому рост количества клеток и их близкое расположение предпочтительно для образования большого количества щелевых контактов и связей между ними. Это означает, что будет поддерживаться сократительная функция новообразованной сердечной ткани на слое ТИК. Необходимо отметить, что слой ТИК по всей толщине и объему содержит ОУНТ, и поэтому он всюду может пропускать электрические сигналы. Следовательно, электрические импульсы, исходящие от клеток, тоже будут пронизывать слой ТИК, и он синхронно с клетками будет выполнять сократительную функцию, т.е. будет происходить регенерации сердечной ткани.

Таким образом, поставленная задача выполнена: получен наноматериал повышенной степени биосовместимости в виде слоя в составе из трех биологических материалов в качестве матрицы и небольшого количества (~0,001 мас. %) одностенных углеродных нанотрубок как наполнителя. Предложенный материал в виде слоя тканеинженерной конструкции имеет достаточные степень биосовместимости и электропроводности, перспективен в качестве заплаты сердечной ткани и выполнения функции натуральной сердечной ткани, т.е. данный материал будет регенерировать сердечную ткань.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Патент РФ 2563815.

2. Патент США US 20050112349.

3. Патент США US 20190031813.

4. Norahan М Н, PourmokhtariM,. Saeb М R, and et al. (2019) "Electroactive cardiac patch containing reduced graphene oxide with potential antibacterial properties," Materials Science and Engineering: C, vol.104, 109921 (11pp). https://doi.org/10.1016/i.msec.2019.109921.

5. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М.: Техносфера. 2007. - 304 с.

6. Ghasemi A, Imami R, Yousefzadeh М, Bonakdar S, and Fakhrzadeh Н (2019) "Studying the Potential Application of Electrospun Polyethylene Terephthalate/Graphene Oxide Nanofibers as Electroconductive Cardiac Patch," Macromol. Mater. Eng., vol. 304, 1900187 (13 pp). https://doi.org/10.1002/mame.201900187.

7. Cristallini C, Vaccari G, Barbani N, and et al. (2019) "Cardioprotection of PLGA/gelatine cardiac atches functionalised with adenosine in a large animal model of ischaemia and reperfusion injury: A feasibility study," Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, vol. 13(7), pp. 1253-1264. https://doi.org/10.1002/term.2875.

8. Yeung E, Fukunishi T, Bai Y, Bedja D, Pitaktong I, Mattson G, Jeyaram A, Lui C, Ong С S, Inoue T, and Matsushita H (2019) "Cardiac regeneration using human-induced pluripotent stem cell-derived biomaterial-free 3D-bioprinted cardiac patch in vivo," J. Tissue Eng. Regen. Med., pp. 1-9. https://doi.org/10.1002/term.2954.

9. Streeter В W, and Davis M E (2019) "Therapeutic Cardiac Patches for Repairing the Myocardium," Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 1144, pp. 1-24. Cell Biology and Translational Medicine, Volume 5.

10. Bejleri D, Streeter В W, Nachlas A L Y, et al. (2018) "A Bioprinted Cardiac Patch Composed of Cardiac Specific Extracellular Matrix and Progenitor Cells for Heart Repair,"Advanced Healthcare Materials, vol. 7(23), 1800672. https://doi.org/10.1002/adhm.201800672.

11. Патент США US 20160270729

12. Патент РФ №2675062 (прототип)

13. Герасименко А.Ю., Ичкитидзе Л.П., Подгаецкий В.М., Селищев С.В. (2015) «Механические свойства объемного композитного наноматериала с матрицей из альбумина,» Сборник трудов XII Российско-китайского Симпозиума «Новые материалы». Под общей редакцией академика РАН К.А. Солнцева. В 2-х томах, М.: Интерконтакт Наука, - 906 с. ISBN 975-5-902063-53-7. С. 216-220.

14. Ichkitidze L Р, Gerasimenko AYu, Podgaetsky VM, Selishchev SV, Dudin AA, and Pavlov A A (2018) "Electrical conductivity of the nanocomposite layers for biomedical systems", Materials Physics and Mechanics, vol. 37(2), pp. 140-145.

15. Потехина Ю.П. (2016) «Структура и функции коллагена,» Рос. остеопат. журн., №1-2 (32-33), с. 87-89.

Изобретение относится к медицине и касается тканеинженерной конструкции для регенерации сердечной мышцы, включающей электропроводящий слой композиционного наноматериала из бычьего сывороточного альбумина и наполнителя из одностенных углеродных нанотрубок, содержащей конструкцию из слоев с общей толщины 0,3-0,5 мм в составе бычьего сывороточного альбумина, в которую дополнительно входят слои коллагена и сукцинат хитозана. Изобретение обеспечивает улучшение биосовместимости материалов и повышение функциональной возможности электропроводящего биосовместимого композиционного наноматериала для регенерации сердечной ткани. 1 з.п. ф-лы, 1 пр., 5 ил., 1 табл.

1. Тканеинженерная конструкция для регенерации сердечной мышцы, включающая электропроводящий слой композиционного наноматериала из бычьего сывороточного альбумина и наполнителя из одностенных углеродных нанотрубок, отличающаяся тем, что содержит конструкцию из слоев с общей толщины 0,3-0,5 мм в составе бычьего сывороточного альбумина, в которую дополнительно входят слои коллагена и сукцинат хитозана.

2. Тканеинженерная конструкция для регенерации сердечной мышцы по п. 1, отличающаяся тем, что имеет квадратообразные ячейки с размерами сторон 50-200 мкм.