АНТИТЕЛА ПРОТИВ БЕЛКА-1 ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ (PD-1) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2020 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 C12N15/63 C12N5/10 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается антител против белка-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1), либо их антигенсвязывающих фрагментов, кодирующих их нуклеиновых кислот, векторов, содержащих эти нуклеиновые кислоты, выделенных клеток, трансформированных этими векторами, способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов и содержащих их композиций для профилактики или лечения рака.

Уровень техники

Химиотерапевтические противораковые препараты первого поколения и целевые противораковые препараты второго поколения, которые широко применяются в настоящее время, имеют проблемы с побочными эффектами из-за токсичности противораковых средств, высокого риска лекарственной устойчивости и ограниченности в том, что их можно назначать только пациентам, имеющим специфические генные мутации. Иммунные противораковые препараты (иммуноонкологические средства), которые называют “противораковыми препаратами третьего поколения”, преодолевают эти проблемы, действуя на сигнальные пути иммунных клеток и активируя их, тем самым атакуя раковые клетки и обеспечивая при этом терапевтические эффекты. В отличие от традиционных противораковых препаратов, иммунные противораковые препараты могут применяться при различных заболеваниях, включая рак, с тем чтобы лечить заболевания с помощью иммунной системы человека, причем отмечается, что они вызывают меньше побочных эффектов, чем традиционные противораковые препараты.

PD-1 (также известный как “CD279”) представляет собой рецепторный белок в 55 кД, связанный с семейством костимулирующих/ингибирующих рецепторов CD28/CTLA4 (Blank et al., 2005 Cancer Immunol Immunother. 54: 307-314).

Его характеристики изучают на мышах и людях путем клонирования гена и кДНК, кодирующей PD-1 (Ishida et al., 1992 EMBO J. 11: 3887-3395; Shinohara et al., 1994 Genomics 23: 704-706). Полноразмерный PD-1 содержит 288 аминокислотных остатков (номер доступа в NCBI: NP_005009). Внеклеточный домен состоит из аминокислотных остатков 1-167, а цитоплазматический С-концевой участок содержит аминокислотные остатки 191-288, которые содержат два гипотетических иммунорегуляторных мотива, а именно ингибиторный мотив иммунорецептора на основе тирозина (ITIM; Vivier et al. al., 1997 Immunol Today 18: 286-291) и мотив тирозинового переключателя иммунорецептора (ITSM; Chemnitz et al., 2004 J Immunol 173: 945-954).

К настоящему времени известно, что с PD-1 специфически взаимодействуют два родственных по последовательности лиганда, PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC), вызывая внутриклеточную передачу сигналов и ингибируя опосредованную CD3 и CD28 активацию Т-клеток (Riley, 2009 Immunol Rev. 229: 114-125), которая в конечном счете регулирует активность Т-клеток, например, снижает секрецию других факторов роста и цитокинов, а также рост клеток и секрецию IL-2 и IFN-γ.

Экспрессия PD-1 часто встречается в таких иммунных клетках, как T-клетки, B-клетки, мононуклеары и клетки естественных киллеров (NK), но почти не экспрессируется в других тканях человека типа мышц, эпителия и нервной ткани. Кроме того, высокие уровни экспрессии PD-1 часто связаны с активностью иммунных клеток. Например, при активации T-клеточной линии Jurkat человека с помощью PHA (фитогемагглютинина) или TPA (12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата) усиливается экспрессия PD-1, как это видно при Вестерн-блоттинге. Такое же явление наблюдалось на стимулированных Т- и В-лимфоцитах мыши и первичных Т-клетках CD4+ человека при стимуляции антителом против CD3. Повышение экспрессии PD-1 вызывает стимуляцию эффекторных Т-клеток и ведет активированные эффекторные Т-клетки в направлении истощенной и пониженной иммунной активации. Таким образом, опосредованные PD-1 ингибиторные сигналы играют ключевую роль в иммунотолерантности.

Повышение экспрессии PD-1 в инфильтрирующих опухоли лимфоцитах (TILs) и экспрессии лигандов PD-1 в опухолевых клетках отмечалось при различных раковых заболеваниях и отмечалось и в других типах тканей и органов, включая легкие, печень, желудок, молочные железы, яичники, поджелудочную железу, меланоциты и пищевод. Чаще всего экспрессия PD-1 и PD-L1 при таких раковых заболеваниях связана с плохим прогнозом по выживаемости пациентов. Важность сигнального пути PD-1 по регуляции иммунной системы для устранения рака или толерантности к раку была более подробно описана на трансгенных мышах, у которых при нокауте генов PD-1 ингибируется рост клеток раковых ксенотрансплантатов.

Повышающая регуляция сигнализации PD-1 приводит к иммуннотолерантной пролиферации рака, а также к вирусным инфекциям и метастазированию у человека. Пандемический вирус гепатита B, HBV и HCV индуцируют гиперэкспрессию лигандов PD-1 в гепатоцитах и активируют сигнализацию PD-1 в эффекторных T-клетках, что ведет к истощению T-клеток и толерантности к вирусной инфекции. Точно так же ВИЧ-инфекция зачастую избегает иммунной системы человека по аналогичному механизму. Сигнализацию PD-1 можно терапевтически модулировать при помощи антагонистических молекул с тем, чтобы иммунные клетки могли излечиться от толерантности и реактивироваться для устранения рака и хронических вирусных инфекций.

Ниволумаб и пембролизумаб, которые являются моноклональными антителами, известны как лекарственные средства, нацеленные на PD-1, и применяются в качестве терапевтических средств при злокачественной меланоме и немелкоклеточном раке легких. Однако сообщалось, что эти препараты ложатся огромным финансовым бременем на пациентов из-за высокой стоимости, и требуется их точная проверка. Следовательно, существует острая потребность в разработке новых терапевтических средств, нацеленных на PD-1, которые могут преодолеть ограниченность традиционных препаратов.

На этом техническом фоне авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для лечения рака, которые специфически связываются с PD-1. В результате они разработали антитела против PD-1, которые связываются с высоким сродством с PD-1, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут значительно ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1, и тем самым совершили настоящее изобретение.

Сущность изобретения

Техническая проблема

Итак, одной из целей настоящего изобретения является получение новых антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов.

Другой целью настоящего изобретения является получение нуклеиновых кислот, кодирующих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Другой целью настоящего изобретения является создание вектора, включающего нуклеиновую кислоту, рекомбинантной клетки, в которую вводится вектор, и способ ее получения.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих эти антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Техническое решение

В соответствии с настоящим изобретением, вышеуказанные и другие цели могут быть достигнуты путем получения антител, связывающихся с PD-1, либо их антиген-связывающего фрагмента, содержащих: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие данные антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены экспрессионные векторы, содержащие данные нуклеиновые кислоты.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены клетки, трансформированные данным экспрессионный вектором.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрен способ получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающий (a) культивирование клеток и (b) извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предусмотрены композиции для профилактики или лечения рака, содержащие в качестве активного ингредиента данные антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Краткое описание фигур

Вышеуказанные и другие цели, особенности и другие преимущества настоящего изобретения станут более понятными из следующего подробного описания в сочетании с прилагаемыми чертежами.

На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма экспрессионного PD-1 вектора, содержащего Fc человека или Fc мыши, слитый с его карбоксильным концом.

На фиг. 2A-D представлены результаты по очистке белка PD-1, а именно:

на фиг. 2A представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-hFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;

на фиг. 2B представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя;

на фиг. 2C представлены результаты по идентификации белка в отношении PD1-mFc в 10% геле SDS-PAGE в восстановительных (RE) и невосстановительных (NR) условиях;

на фиг. 2D представлены результаты по SEC-HPLC в G-3000 SWXL при скорости потока 1 мл/мин с использованием PBS в качестве рабочего растворителя.

На фиг. 3 представлена способность антител к связыванию с PD-1 в зависимости от количества раундов пэннинга.

На фиг. 4 представлены результаты по ELISA для измерения способности монофагов к связыванию с PD1-His.

На фиг. 5 представлены результаты анализа SDS-PAGE для определения чистоты антител к PD-1.

На фиг. 6 представлены результаты по оценке эффективности антител к PD-1 in vitro.

На фиг. 7 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности антител к PD-1 in vitro.

На фиг. 8 представлена способность антител к зависимому от концентрации связыванию с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, на основании средней интенсивности флуоресценции (MFI).

На фиг. 9 представлены результаты по измерению кинетики связывания между PD1-hFc и антителами 45D6 и 49A2 к PD1.

На фиг. 10 представлены результаты скрининга при оптимизации моноклонов.

На фиг. 11 представлен сравнительный анализ степени экспрессии между антителами к PD1 и исходным антителом.

На фиг. 12 представлены результаты по оценке эффективности in vitro в отношении антител к PD1 по настоящему изобретению.

На фиг. 13 представлены результаты по оценке зависимой от концентрации эффективности in vitro антител к PD1 по настоящему изобретению.

На фиг. 14 представлены результаты по идентификации моноклональных антител в отношении связывания выбранных вариантов антител к PD1 с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.

На фиг. 15 представлены результаты по измерению способности выбранных вариантов антител к PD1 к связыванию с PD-1, экспрессированным на клеточной поверхности.

На фиг. 16 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении ингибирующей активности выбранных антител по предотвращению образования комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2.

На фиг. 17 представлены результаты по измерению кинетики связывания между белком PD1-hFc и антителами 45D6, 49A2 и 49A2 (2B9).

На фиг. 18 представлена схематическая диаграмма мутантов PD1.

На фиг. 19 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных фагов к связыванию с мутантами PD-1, причем при снижении способности к связыванию уменьшается и соответствующая величина.

На фиг. 20 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении способности выбранных антител к связыванию с мутантами PD-1.

На фиг. 21 представлены результаты по идентификации при иммуноадсорбции фермента в отношении специфичности связывания.

На фиг. 22 представлены результаты по сравнению продуктивности после краткосрочной экспрессии в клетках HEK293.

На фиг. 23 представлены результаты по идентификации в отношении повышения активности под действием моноклональных антител к PD1 при гетерогенной MLR (реакции смешанных лимфоцитов).

Раскрытие сущности изобретения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такие же значения, как те, которые известны специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая здесь номенклатура хорошо известна в данной области, обычно она и применяется.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающий фрагмент, содержащее: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 1-30, CDR2 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 31-56, и CDR3 тяжелой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 57-79; и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 198-222, CDR2 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 223-241, и CDR3 легкой цепи, включающего последовательность на 90% или более идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 242-269.

Авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки антител для химиотерапии, связывающихся с PD-1, который, как известно, экспрессируется при различных формах рака. В результате авторы изобретения получили антитела против PD-1, которые связываются с PD-1 с высоким сродством, используя технологию фагового дисплея, и обнаружили, что такие антитела против PD-1 могут ингибировать активность PD-1.

В настоящем изобретении понятие “белок-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1)” означает сигнальный белок, который функционирует для регуляции активации и функций Т-клеток. При связывании PD-1 из Т-клеток со своим лигандом PD-L1, который экспрессируется в раковых клетках, в микроокружении опухоли активируется сигнальный путь PD-1, который затем индуцирует инактивацию Т-клеток. Это явление встречается при различных формах рака, как-то злокачественной меланоме, немелкоклеточном раке легких и раке почек.

В настоящем изобретении термин “антитело” означает антитело против PD-1, которое специфически связывается с PD-1. В рамки настоящего изобретения входят не только полные антитела, специфически связывающиеся с PD-1, но также и антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела.

Полное антитело означает структуру, содержащую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, причем каждая легкая цепь связана с соответствующей тяжелой цепью дисульфидной связью. Константная область тяжелой цепи бывает типа гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε) и подразделяется на гамма-1 (γ1), гамма-2 (γ2), гамма-3 (γ3), гамма-4 (γ4), альфа-1 (α1) и альфа-2 (α2). Константная область легкой цепи бывает типа каппа (κ) и лямбда (λ).

Антигенсвязывающий фрагмент антитела или же фрагмент антитела означает такой фрагмент, который по меньшей мере обладает способностью к связыванию антигена, и охватывает Fab, F(ab′), F(ab′)₂ и Fv. Из всех фрагментов антител Fab означает структуру, включающую вариабельную область каждой из тяжелых и легких цепей, константный домен легкой цепи и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт. Fab′ отличается от Fab тем, что он дополнительно включает шарнирный участок, содержащий по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена С_Н1 тяжелой цепи. F(ab′)₂ образуется по дисульфидной связи между остатками цистеина в шарнирном участке Fab′. Fv – минимальный фрагмент антитела, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, а рекомбинантная технология получения Fv изложена в таких международных публикациях PCT, как WO 88/01649, WO 88/06630, WO 88/07085, WO 88/07086 и WO 88/09344. Двухцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связаны нековалентной связью, а одноцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи обычно связаны ковалентной связью через пептидный линкер или непосредственно связаны на С-конце, образуя димероподобную структуру типа двухцепочечного Fv. Такие фрагменты антител могут быть получены с помощью протеаз (например, Fabs могут быть получены путем рестрикционного расщепления всего антитела папаином, а F(ab′)₂-фрагмент может быть получен путем рестрикционного расщепления всего антитела пепсином), а также могут быть получены методами генетической рекомбинации.

В одном воплощении антитело по настоящему изобретению представлено в виде Fv (к примеру, scFv), Fab или полного антитела. Кроме того, константная область тяжелой цепи может быть выбрана из изотипов, состоящих из гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) или эпсилон (ε). Например, константная область может быть типа гамма-1 (IgG1), гамма-3 (IgG3) или гамма-4 (IgG4). Константная область легкой цепи может быть типа каппа или лямбда.

В настоящем изобретении термин “тяжелая цепь” охватывает как полноразмерную тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен (V_H), аминокислотная последовательность которого содержит достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и три константных домена (С_Н1, С_Н2 и С_Н3), так и её фрагмент. В настоящем изобретении термин “легкая цепь” охватывает как полноразмерную легкую цепь, которая включает вариабельный домен (V_L), содержащий аминокислотную последовательность, содержащую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к антигену, и константный домен (C_L), так и её фрагменты.

Антитела по настоящему изобретению включают, без ограничения, моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизованные антитела, химерные антитела, короткоцепочечные Fv (scFv), короткоцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab′)-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFVs), антиидиотипические (анти-Id) антитела или же эпитоп-связывающие фрагменты таких антител и т.п.

Моноклональные антитела означают одинаковые антитела, исключая возможные природные мутации, причем антитела получены из популяции практически однородных антител, то есть каждое антитело, составляющее эту популяцию, может присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела очень специфичны и вырабатываются против одного антигенного сайта.

Нечеловеческие (например, мышиные) антитела “гуманизованной” формы представляют собой химерные антитела, содержащие минимальную последовательность, происходящую не из иммуноглобулина человека. В большинстве случаев гуманизованные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитела-реципиенты), у которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены на остатки из гипервариабельной области другого вида, чем человек (донора), как-то мыши, крысы, кролика или приматов, отличных от человека, обладающие требуемой специфичностью, сродством и способностью.

Термин “человеческое антитело” обозначает молекулы, происходящие из иммуноглобулина человека, у которых все аминокислотные последовательности, составляющие антитело, включая определяющие комплементарность участки и структурные участки, состоят из иммуноглобулина человека.

Некоторые части тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичны или гомологичны соответствующей последовательности у антител, происходящих из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальные части включают “химерные” антитела (иммуноглобулины), которые идентичны или гомологичны соответствующим последовательностям у антител, происходящих из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, проявляющие требуемую биологическую активность.

В настоящем изобретении термин “вариабельный домен антитела” относится к областям легкой и тяжелой цепи молекул антител, включающим аминокислотные последовательности определяющих комплементарность участков (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасной области (FR). V_H означает вариабельный домен тяжелой цепи. V_L означает вариабельный домен легкой цепи.

Термин “определяющий комплементарность участок” (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3) относится к таким аминокислотным остаткам вариабельного домена антител, которые необходимы для связывания антигена. Каждый вариабельный домен обычно содержит три участка CDR, обозначаемые как CDR1, CDR2 и CDR3.

В настоящем изобретении антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую:

CDR1 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-30;

CDR2 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 31-56; и

CDR3 тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 57-79;

а также вариабельную область легкой цепи, включающую:

CDR1 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 198-222;

CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 223-241; и

CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 242-269.

В частности, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 59;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 60;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 61;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 9, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 40 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 70;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 41 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 71;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 12, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 43 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 73;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 45 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 75;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 48 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 78;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 79; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57.

Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты содержат:

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 198, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 223 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 242;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 199, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 224 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 243;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 200, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 225 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 244;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 235 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 255;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 212, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 236 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 256;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 214, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 237 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 258;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 216, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 260;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 261;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 262;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 219, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 241 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 263;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 222, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 268; или

вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 269.

А конкретно антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 2, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 33 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 201, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 226 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 245;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 34 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 202, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 227 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 246;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 35 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 203, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 228 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 247;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 5, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 36 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 65, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 204, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 229 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 248;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 37 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 66, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 206, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 231 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 250;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 32 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 67, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 207, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 232 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 251;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 208, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 38 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 68, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 209, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 233 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 253;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 39 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 69, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 210, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 234 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 254;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 11, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 42 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 72, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 213, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 3 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 44 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 74, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 211, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 238 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 259;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 15, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 46 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 76, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 217, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 239 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 336; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 8, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 47 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 77, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337.

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела далее подвергаются скринингу по процедуре оптимизации, причем антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по изобретению могут содержать следующие вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи:

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 18, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 50 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 218, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 240 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 337;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 20, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 52 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 264;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 265;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 22, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 53 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 23, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 49 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 17, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 54 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 249;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 24, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 55 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 21, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 51 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 221, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 266;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 215, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 56 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 257;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 26, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 27, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 28, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252;

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 29, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 205, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 252; или

вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 30, CDR2 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 31 и CDR3 тяжелой цепи по SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи по SEQ ID NO: 220, CDR2 легкой цепи по SEQ ID NO: 230 и CDR3 легкой цепи по SEQ ID NO: 267.

Термин “каркасный участок” (FR) относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно содержит четыре FR, обозначаемых как FR1, FR2, FR3 и FR4.

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

FR1 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 80-95;

FR2 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 96-113;

FR3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 114-134; и

FR4 вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 135-145.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать:

FR1 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 270-294;

FR2 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 295-315;

FR3 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 316-355; и

FR4 вариабельной области легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 356-367.

Фрагмент “Fv” представляет собой фрагмент антитела, содержащий полные сайты распознавания и связывания антител. Такая область включает димер, к примеру, scFv, который состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, весьма крепко связанных ковалентно друг с другом.

“Fab”-фрагмент содержит вариабельный и константный домены легкой цепи и вариабельный и первый константный домен (C_H1) тяжелой цепи. F(ab′)2-фрагмент антител обычно включает пару Fab-фрагментов, ковалентно связанных через шарнирный цистеин, расположенный между ними вблизи карбоксильного конца.

“Одноцепочечный Fv” или “scFv”-фрагмент антитела включает домены V_H и V_L антитела, причем эти домены присутствуют в виде одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменом V_H и доменом V_L для того, чтобы scFv образовывал структуру, необходимую для связывания антигена.

Антитела к PD-1 являются моновалентными или бивалентными и включают в себя короткие или двойные цепи. Функционально, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10^-5 M до 10^-12 M. К примеру, сродство связывания антител к PD-1 составляет от 10^-6 M до 10^-12 M, от 10^-7 M до 10^-12 M, от 10^-8 M до 10^-12 M, от 10^-9 M до 10^-12 M, от 10^-5 M до 10^-11 M, от 10^-6 M до 10^-11 M, от 10^-7 M до 10^-11 M, от 10^-8 M до 10^-11 M, от 10^-9 M до 10^-11 M, от 10^-10 M до 10^-11 M, от 10^-5 M до 10^-10 M, от 10^-6 M до 10^-10 M, от 10^-7 M до 10^-10 M, от 10^-8 M до 10^-10 M, от 10^-9 M to 10^-10 M, от 10^-5 M to 10^-9 M, от 10^-6 M до 10^-9 M, от 10^-7 M to 10^-9 M, 10^-8 M до 10^-9 M, 10^-5 M до 10^-8 M, 10^-6 M до 10^-8 M, от 10^-7 M до 10^-8 M, от 10^-5 M до 10^-7 M, от 10^-6 M до 10^-7 M или от 10^-5 M до 10^-6 M.

Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 146-193. Антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 146-193. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 163, 165, 166, 168, 169 или 171-188.

Кроме того, антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность, которая на 90% или больше идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. Антитело, связывающееся с PD-1, либо его антигенсвязывающий фрагмент может содержать вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs: 368-420. В одном воплощении настоящего изобретения антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371-380, 383, 385, 386, 388, 389 или 391-415.

В одном конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 151 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 371;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 152 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 372;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 153 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 373;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 154 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 374;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;

вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 156 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 376;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 157 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 377;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 159 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 379;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 160 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 380;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 163 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 383;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 166 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 386;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 168 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 388;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 169 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 389;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 172 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 392;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 173 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 393;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 174 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 394;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 177 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 397;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 398;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 179 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 399;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 180 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 400;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 402;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 403;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 404;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 406;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 407;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 408;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 182 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 409;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 183 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 410;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 184 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 411;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 185 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 412;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 186 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 413;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 187 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 414; или

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 188 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 415.

В другом конкретном воплощении настоящего изобретения антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты могут включать в себя:

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 155 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 375;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 158 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 378;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 165 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 385;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 171 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 391;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 175 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 395;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 176 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 396;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 178 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 398;

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 401; или

вариабельную область тяжелой цепи по SEQ ID NO: 181 и вариабельную область легкой цепи по SEQ ID NO: 405.

Часть, представленная X или Xaa в последовательности по настоящему изобретению, означает неопределенную аминокислоту и указывает, что здесь может находиться любая аминокислота.

“Фаговый дисплей” представляет собой метод выставления мутантных полипептидов в виде слитых белков с по меньшей мере частью белка оболочки, к примеру, на поверхности частиц фага, к примеру, филаментного фага. Полезность фагового дисплея состоит в быстрой и эффективной классификации тех последовательностей, которые связываются с целевыми антигенами с высоким сродством, в больших библиотеках рандомизованных мутантов белка. Выставление пептидов и библиотек белков на фагах применяется для скрининга миллионов полипептидов с тем, чтобы идентифицировать полипептиды с определенными свойствами связывания.

Технология фагового дисплея оказалась мощным инструментом для создания и скрининга новых белков, связывающихся с определенными лигандами (например, антигенами). По технологии фагового дисплея можно создавать большие библиотеки мутантов белка и быстро классифицировать последовательности, связывающиеся с целевыми антигенами с высоким сродством. Нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантные полипептиды, сливают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белки оболочки вируса, например, белки гена III или белки гена VIII. Разработана монофазная система фагового дисплея, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или полипептид, сливается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей часть белка гена III. В монофазной системе дисплея слитый ген экспрессируется на низком уровне, также экспрессируется белок гена III дикого типа, при этом сохраняется инфекционность частиц.

При разработке библиотек антител типа фагового дисплея важно продемонстрировать экспрессию пептидов на поверхности филаментного фага и экспрессию функциональных фрагментов антител в периферической цитоплазме E. coli. Библиотеки антител либо антигенсвязывающих полипептидов получают рядом методов, к примеру, путем модификации одного гена при вставке случайной последовательности ДНК или клонирования последовательности родственного гена. Библиотеки можно подвергать скринингу на экспрессию антител или антигенсвязывающих белков с требуемыми характеристиками.

Технология фагового дисплея имеет ряд преимуществ перед стандартными гибридомными и рекомбинантными методами получения антител с нужными характеристиками. Этот метод обеспечивает получение больших библиотек антител с разнообразными последовательностями за короткое время без использования животных. Для получения гибридом и получения гуманизованных антител может потребоваться время в несколько месяцев. Кроме того, поскольку иммунитет не требуется, то фаговые библиотеки антител могут вырабатывать антитела против антигенов, которые являются токсичными или обладают слабой антигенностью. Фаговые библиотеки антител также можно использовать для получения и идентификации новых терапевтических антител.

Можно использовать методы получения человеческих антител от неиммунизованных людей, из гаметных последовательностей или Ig-репертуаров наивных В-клеток, которых иммунизировали с помощью библиотек фагового дисплея. Можно использовать различные лимфатические ткани для получения библиотек нативных или неиммуногенных антигенсвязывающих полипептидов.

Для выделения новых терапевтических антител важны методы идентификации и выделения антител с высоким сродством из библиотек фагового дисплея. Выделение антител с высоким сродством из библиотек может зависеть от размера библиотеки, эффективности продукции в бактериальных клетках и разнообразия библиотек. Размер библиотек уменьшается при неэффективной укладке антител или антигенсвязывающих белков и неэффективной продукции из-за присутствия стоп-кодона. Экспрессия в бактериальных клетках может ингибироваться при неправильной укладке антител или антигенсвязывающего домена. Экспрессия может быть улучшена путем попеременного мутирования остатков на поверхности границ вариабельных/константных областей или выбранных остатков CDR. Последовательность каркасной области является тем элементом, который обеспечивает надлежащую укладку при получении фаговых библиотек антител в бактериальных клетках.

При выделении антител с высоким сродством важно создавать разнообразные библиотеки антител или антигенсвязывающих белков. Участки CDR3, как оказалось, зачастую участвуют в связывании антигена. Поскольку участки CDR3 в тяжелой цепи значительно различаются по размерам, последовательности и структурно-пространственной морфологии, то с их помощью можно получать разнообразные библиотеки.

Кроме того, можно создавать разнообразие путем рандомизации участков CDR у вариабельных тяжелых и легких цепей, используя все 20 аминокислот в каждом положении. Использование всех 20 аминокислот ведет к получению последовательностей антител с повышенным разнообразием и повышенной вероятностью выявления новых антител.

Антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению могут включать в себя описанные здесь последовательности антител против PD-1 по настоящему изобретению, а также их биологические эквиваленты, если только эти антитела или фрагменты антител могут специфически распознавать PD-1. Например, в аминокислотной последовательности антитела могут производиться дополнительные вариации с тем, чтобы еще больше улучшить сродство связывания и/или другие биологические свойства антитела. Такие вариации включают, к примеру, делеции, вставки и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела. Такие вариации аминокислот проводятся на основании относительного сходства (идентичности) заместителей в боковой цепи аминокислот типа гидрофобности, гидрофильности, заряда или размера. Анализ размеров, формы и типа заместителей в боковой цепи аминокислот показывает, что аргинин, лизин и гистидин являются положительно заряженными остатками, аланин, глицин и серин имеют близкие размеры, а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют близкие формы. Так, исходя из этих соображений, аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; фенилаланин, триптофан и тирозин считаются биологически функционально эквивалентными.

В другом аспекте настоящее изобретение касается нуклеиновых кислот, кодирующих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты.

Антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены рекомбинантным способом путем выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело либо его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицирующийся вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или дальнейшей экспрессии. Исходя из этого, в другом аспекте настоящее изобретение касается векторов, содержащих нуклеиновые кислоты.

Термин “нуклеиновая кислота” служит для обозначения молекул ДНК (гДНК и кДНК) и РНК, а нуклеотиды, которые являются основными составляющими единицами нуклеиновой кислоты, включают как нуклеотиды природного происхождения, так и их аналоги, у которых модифицированы молекулы сахаридов или оснований. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению, может варьироваться. Такие вариации включают добавление, делеции или неконсервативные либо консервативные замены нуклеотидов.

Аминокислотная последовательность антител или их антигенсвязывающих фрагмента либо кодирующей их нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также может включать в себя последовательности, проявляющие существенную идентичность с последовательностью, приведенной в соответствующем SEQ ID NO. Термин “последовательность, проявляющая существенную идентичность” означает такую последовательность, которая проявляет идентичность по меньшей мере на 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, 96% и более, 97% и более, 98% и более или 99% и более при совмещении последовательности по настоящему изобретению таким образом, чтобы она как можно больше соответствовала какой-либо другой последовательности, и анализе совмещенных последовательностей с помощью алгоритма, который обычно используется в данной области.

Исходя из этого, антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут проявлять идентичность последовательности на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и больше. Такая идентичность определяется путем сравнения и/или совмещения последовательностей методами, известными в данной области. Например, степень идентичности последовательности нуклеиновой кислоты или белка по настоящему изобретению можно определить с помощью алгоритма сравнения последовательностей (т.е. BLAST или BLAST 2.0), совмещения вручную или визуального осмотра.

ДНК, кодирующая антитело, может быть легко выделена или синтезирована по стандартной методике (например, с помощью олигонуклеотидного зонда, специфически связывающегося с ДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела). Доступны различные векторы. Компоненты векторов обычно включают, без ограничения, один или несколько из следующих компонентов: сигнальные последовательности, точки начала репликации, один или несколько маркерных генов, элементы энхансеров, промоторы и последовательности терминации транскрипции.

В настоящем изобретении термин “вектор” означает средство для экспрессии целевых генов в клетках хозяина и включает: плазмидные векторы; космидные векторы; и вирусные векторы, как-то бактериофаговые векторы, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и аденоассоциированные вирусные векторы. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в векторе, оперативно связана с промотором.

Термин “оперативно связанный” означает функциональную связь между последовательностью, регулирующей экспрессию нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью или набором сайтов связывания регуляторов транскрипции), и другой последовательностью нуклеиновой кислоты, которая регулируется при транскрипции и/или трансляции последовательности нуклеиновой кислоты.

При использовании в качестве хозяина прокариотических клеток вектор обычно содержит сильный промотор, способный осуществлять транскрипцию (как-то промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp или промотор T7), сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Кроме того, к примеру, при использовании в качестве хозяина эукариотических клеток вектор содержит промотор (например, промотор металлотионеина, промотор β-актина, промотор гемоглобина человека или промотор мышечного креатина человека), полученный из генома клеток млекопитающих, промотор, происходящий из вируса животных, как-то поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса коровьей оспы, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), tk-промотор HSV, промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор LTR ВИЧ, промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барра (EBV) и промотор вируса саркомы Рауса (RSV), а также обычно содержит последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.

Необязательно вектор может быть слит с другой последовательностью для облегчения очистки экспрессируемых из него антител. Последовательности для слияния включают, к примеру, глутатион-S-трансферазу (Pharmacia, USA), мальтозосвязывающий белок (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6xHis (гексагистидин; Quiagen, USA) и др.

Векторы содержат гены устойчивости к антибиотикам, обычно используемые в данной области в качестве отборочных маркеров, примеры которых включают гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.

В другом аспекте настоящее изобретение касается клеток, трансформированных вышеупомянутыми векторами. Клетки, используемые для получения антител по настоящему изобретению, могут представлять собой прокариотические клетки, дрожжевые клетки или высшие эукариотические клетки, без ограничения.

Можно использовать штаммы из рода Bacillus типа Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus tuligensis, Streptomyces, Pseudomonas (к примеру, Pseudomonas putida) и такие прокариотические клетки хозяина, как Proteus mirabilis и Staphylococcus (к примеру, Staphylococcus carnosus).

Наибольший интерес представляют клетки животных, а примеры полезных линий клеток хозяина включают, без ограничения, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S или HT1080.

В другом аспекте настоящее изобретение касается способа получения антител либо их антигенсвязывающих фрагментов, включающего: (a) культивирование клетки; и (b) выделение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов из культивированной клетки.

Клетки можно культивировать в различных средах. В качестве культуральной среды можно использовать любые коммерчески доступные среды без ограничения. Все другие необходимые добавки, хорошо известные специалистам в данной области, могут быть включены в соответствующих концентрациях. Условия культивирования типа температуры и pH уже использовались с выбранными для экспрессии клетками хозяина и должны быть известны специалистам в данной области.

В настоящем изобретении термин “трансформация” означает введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок, в клетки хозяина с тем, чтобы кодируемый нуклеиновой кислотой белок мог экспрессироваться в клетках хозяина. Трансформирующая нуклеиновая кислота охватывает и трансформирующую нуклеиновую кислоту, вставленную и встроившуюся в хромосому клетки хозяина, так и трансформирующую нуклеиновую кислоту, расположенную вне хромосом, если только она может экспрессироваться в клетках хозяина. Кроме того, нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Нуклеиновая кислота может быть введена в любой форме, если только она может вводиться в клетки хозяина и экспрессироваться в них. Например, нуклеиновая кислота может быть введена в клетки хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, содержащую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно включает промотор, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции, которые функционально связаны с нуклеиновой кислотой. Экспрессионной кассета может иметь вид экспрессионного вектора, обеспечивающего саморепликацию. Нуклеиновая кислота также может быть введена в клетки хозяина в своем собственном виде и функционально связана с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетках хозяина.

Извлечение антител либо их антигенсвязывающих фрагментов может проводиться, к примеру, путем центрифугирования или ультрафильтрации для удаления примесей и очистки полученного препарата, к примеру, методом аффинной хроматографии. Можно использовать и другие методы очистки типа анионообменной или катионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, хроматографии на гидроксиапатите и др.

В другом аспекте настоящее изобретение касается получение композиций для профилактики или лечения рака, содержащих антитела либо их антигенсвязывающие фрагменты в качестве активного ингредиента.

Настоящим изобретением предусмотрены, к примеру, композиции для профилактики или лечения рака, содержащие: (a) фармацевтически эффективное количество антитела к PD-1 или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению; и (b) фармацевтически приемлемый носитель. Настоящим изобретением также предусмотрен способ профилактики или лечения рака, включающий введение антител к PD-1 либо их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению в эффективном количестве, необходимом для пациента.

В настоящем изобретении рак предпочтительно выбирают из группы, состоящей из меланомы, рака легких, рака печени, глиоцитомы, рака яичников, рака толстой кишки, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, рака почек, рака желудка, рака молочной железы, метастатического рака, лимфомы Ходжкина, рака простаты и рака поджелудочной железы, не ограничиваясь этим.

В настоящем изобретении термин “лечение” означает подавление или облегчение рака либо вызванного им одного или нескольких симптомов, а также предотвращение прогрессирования рака или такое лечение рака, которое нормализирует симптомы заболевания, путем введения композиции, а термин “предотвращение” означает любое действие, которое тормозит или замедляет прогрессирование рака путем введения композиции. В настоящем изобретении профилактика или лечение рака происходит путем связывания между антителом, полученным по настоящему изобретению, и PD-1. Антитело, которое связывается с PD-1, значительно ингибирует активность PD-1, тем самым вызывая предотвращение или лечение рака.

Термин “фармацевтически приемлемый носитель” в настоящем изобретении означает такой носитель или разбавитель, который не нарушает биологическую активность или свойства вводимого соединения и не вызывает раздражения в организме. Для композиций, составленных в виде жидких растворов, приемлемыми фармацевтическими носителями являются стерилизованные и биосовместимые, а их примеры включают солевые растворы, стерильную воду, раствор Рингера, забуференные солевые растворы, растворы для инъекций с альбумином, растворы декстрозы, растворы мальтодекстрина, глицерин, этанол и смеси одного или нескольких из них. При необходимости можно добавлять и другие стандартные добавки типа антиоксидантов, буферов и бактериостатических средств. Кроме того, при составлении растворов для инъекций типа водных растворов, суспензий и эмульсий, пилюль, капсул, гранул или таблеток можно еще добавлять разбавители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, связующие и смазывающие вещества.

Композиции для профилактики или лечения рака, содержащие антитела и фармацевтически приемлемый носитель, можно вносить в лекарственные формы, содержащие их в качестве активного ингредиента, в виде препаратов для перорального или парентерального введения. Фармацевтические формы могут включать препараты, подходящие для перорального, ректального, назального, местного (в том числе защечного и подъязычного), подкожного, вагинального или парентерального (в том числе внутримышечного, подкожного и внутривенного) введения либо ингаляции или инсуффляции.

Примеры лекарственных форм для перорального введения, содержащих композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, включают таблетки, пастилки, леденцы, водные или масляные суспензии, готовые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или эликсиры. Для получения таких форм, как таблетки и капсулы, можно включать связующие вещества, такие как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин, эксципиенты типа дикальцийфосфата, разрыхлители типа кукурузного или картофельного крахмала, смазывающие вещества типа стеарата кальция, стеарилфумарата натрия или полиэтиленгликолевого воска, а капсульные формы могут дополнительно содержать жидкий носитель типа жирного масла, в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам.

Примеры форм для парентерального введения, содержащих композиции настоящего изобретения в качестве активного ингредиента, включают формы для инъекций типа подкожных инъекций, внутривенных инъекций или внутримышечных инъекций, свечи или формы для распыления типа аэрозолей, вдыхаемых через дыхательный аппарат. Для получения форм для инъекций можно смешивать композиции настоящего изобретения в воде со стабилизаторами или буферами для приготовления растворов или суспензий, а растворы или суспензии можно составлять для введения на основе ампул или флаконов. Для введения в виде свечей можно составлять композиции для ректального введения типа свечей или препаратов для клизмы, содержащих стандартную основу для свечей типа масла какао или других глицеридов. Для распылительных форм типа аэрозолей можно вводить добавки типа вытеснителей с тем, чтобы диспергировался воднодисперсный концентрат или влажный порошок.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способы профилактики или лечения рака, включающие введение композиций для предотвращения или лечения рака, содержащих антитела.

В настоящем изобретении термин “введение” означает введение пациентам фармацевтических композиций по настоящему изобретению любым подходящим способом. Способы введения композиций настоящего изобретения могут быть любыми, включая пероральное или парентеральное введение. В частности, фармацевтические композиции можно вводить стандартным способом типа перорального, ректального, местного, внутривенного, внутрибрюшинного, внутримышечного, внутриартериального, трансдермального, интраназального, ингаляционного, глазного или интрадермального введения.

Способ лечения по настоящему изобретению включает введение фармацевтически эффективного количества композиции для профилактики или лечения рака по настоящему изобретению. Специалистам в данной области должно быть известно, что подходящая общая суточная доза может быть определена по суждению медицинского специалиста. Конкретное терапевтически эффективное количество для определенного пациента предпочтительно зависит от многих факторов, включая тип и степень достигаемой реакции, а также от присутствия других используемых средств, конкретной композиции и возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты пациента, времени введения, способа введения и скорости выведения композиции, продолжительности лечения и препаратов, используемых в сочетании или одновременно с данной композицией, и других подобных факторов, хорошо известных в области фармацевтики. Поэтому эффективное количество композиции для профилактики или лечения рака, которое подходит для цели настоящего изобретения, предпочтительно определяется с учетом вышеприведенных факторов.

Кроме того, способ лечения по настоящему изобретению может применяться к любым животным, у которых могут возникать такие заболевания, как опухоли и неоваскуляризация вследствие чрезмерной активности PD-1, причем животные включают людей и приматов, а также домашний скот типа коров, свиней, овец, лошадей, собак и кошек.

В другом аспекте настоящее изобретение касается композиций для диагностики рака, содержащих антитела к PD-1 либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение касается способа диагностики рака путем обработки антителами к PD-1 либо их антигенсвязывающими фрагментами по настоящему изобретению.

Рак можно диагностировать путем измерения уровня экспрессии PD-1 в образцах с помощью антител к PD-1 по настоящему изобретению. Уровень экспрессии может быть измерен стандартным методом иммуноанализа, включая, без ограничения, методы радиоиммуноанализа, радиоиммунопреципитации, иммунопреципитации, иммуногистохимического окрашивания, иммуноферментного анализа (ELISA), ELISA с захватом, анализа ингибирования или конкуренции, сэндвич-анализа, проточной цитометрии, иммунофлуоресцентного окрашивания и иммуноаффинной очистки с помощью антител к PD-1.

Рак можно диагностировать путем анализа интенсивности конечного сигнала в процессе иммуноанализа. А именно, рак диагностируется тогда, когда в биологическом образце сильно экспрессируется белок маркера по настоящему изобретению, при этом сигнал от биологического образца будет более сильным, чем у нормального биологического образца (к примеру, нормальной ткани желудка, крови, плазмы или сыворотки).

В другом аспекте настоящее изобретение касается наборов для диагностики рака, содержащих композиции для диагностики рака. Наборы по настоящему изобретению содержат антитела к PD-1 по настоящему изобретению, а рак диагностируется путем анализа сигнала, возникающего при реакции между образцом и антителом. Сигналы могут включать, без ограничения, конъюгированные с антителами ферменты типа щелочной фосфатазы, β-галактозидазы, пероксидазы хрена, люциферазы или цитохрома P450. В том случае, когда в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, в качестве субстрата для фермента используется хромогенный субстрат реакции, как-то бромхлориндолфосфат (BCIP), нитросиний тетразолий (NBT), нафтол-AS-B1-фосфат или ECF (для усиления хемифлуоресценции), а при использовании пероксидазы хрена используется такой субстрат, как хлорнафтол, аминоэтилкарбазол, диаминобензидин, D-люциферин, люцигенин (бис-N-метилакридиния нитрат), бензиловый эфир резоруфина, люминол, реагент Amplex Red (10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин), HYR (п-фенилендиамин-HCl и пирокатехол), TMB (тетраметилбензидин), ABTS (2,2′-азин-ди[3-этилбензтиазолинсульфонат]), о-фенилендиамин (OPD) и нафтол/пиронин, глюкозооксидаза, t-NBT (нитросиний тетразолий) или m-PMS (феназин метосульфат), но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Кроме того, набор по настоящему изобретению также может включать метку для генерирования детектируемого сигнала, а метка может означать химическое вещество (например, биотин), фермент (щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза хрена или цитохром P450), радиоактивное вещество (типа ¹⁴C, ¹²⁵I, ³²P и ³⁵S), флуоресцентное вещество (типа флуоресцеина), люминесцентное вещество, хемилюминесцентное вещество и FRET (флуоресцентно-резонансный перенос энергии), без ограничения.

Измерение активности фермента, используемого для диагностики рака или измерения сигнала, может проводиться различными способами, известными в данной области. Таким образом, можно качественно или количественно анализировать экспрессию PD-1.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с привлечением примеров. Однако специалистам в данной области должно быть ясно, что эти примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1. Экспрессия и очистка антигена PD-1

1. Получение векторов для экспрессии белка PD-1

Для клонирования PD-1 проводили амплификацию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью праймеров для PD1, содержащих сайты для рестрикционного фермента SfiI на 5′- и 3′-концах (таблица 1), с тем чтобы получить только внеклеточный домен, используя библиотеки кДНК в клетах Jurkat (Stratagene, USA). Амплифицированный продукт ПЦР получали путем слияния Fc человека (SEQ ID NO: 196) и Fc мыши (SEQ ID NO: 197) с карбоксильным концом с помощью вектора N293F (фиг. 1).

Таблица 1

Название Последовательность 5′−>3′ SEQ ID NO: PD1-F CCAGGATGGTTCTTAGACTCCCC 194 PD1-R CACCAGGGTTTGGAACTGGC 195

2. Экспрессия и очистка антигена PD-1

Для того, чтобы экспрессировать антиген в клетках животных, клетки HEK293F трансфецировали плазмидной ДНК. Готовили реакционный раствор полиплекса для трансфекции путем смешивания 25 мкг плазмидной ДНК с 3 мл экспрессионной среды Freestyle 293, а затем в полученную смесь добавляли 2 мг/мл PET (полиэтиленимин, PolyplusA-transfection, USA) и опять перемешивали. Реакционный раствор полиплекса инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем культивировали в 40 мл культуральной среды при концентрации 1×10⁶ клеток/мл в течение 24 часов при 37°C и 8% CO₂ при 120 об/мин. Через 24 часа после трансфекции добавляли Soytone (BD, USA) в качестве добавки до конечной концентрации 10 г/л. Антитела получали в системе краткосрочной экспрессии в клетках HEK293F в течение 7 дней. Для выделения антигена из культурального раствора проводили аффинную хроматографию. Получали супернатант центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин для удаления клеток и обломков клеток из культуральной среды, извлеченной на 7-й день. Супернатант подвергали реакции с промытой DPBS агарозной смолой с рекомбинантным белком A при 4°C в течение 16 часов.

При использовании агарозной смолы с рекомбинантным белком A для проведения первичной очистки белок элюировали 0,1 М глицином и нейтрализировали 500 мкл 1М трис-HCl. После первичной очистки белок подвергали вторичной очистке методом гель-фильтрационной хроматографии на Superdex 200 (1,5 см ×100 см).

Чистоту очищенного белка определяли методом SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии [TSK-GEL G-3000 SWXL для эксклюзионной хроматографии (SEC) (Tosoh)].

В результате было установлено, что очищенный белок PD1 имеет чистоту в 95% или больше, как видно из фиг. 2А–2D.

Пример 2. Скрининг человеческих антител против PD-1

1. Подготовка антигенов

В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные в примере 1, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.

2. Биопэннинг (просеивание)

Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10¹⁰, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.

Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Проводили второй и третий раунд пэннинга, используя фаги, амплифицированные в первом раунде пэннинга, таким же образом, как описано выше, за исключением того, что увеличилось только количество стадий промывки PBST.

В результате, как видно из таблицы 2, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при третьем раунде пэннинга, намного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.

Таблица 2

Раунд пэннинга Количество фагов на входе Количество фагов на выходе 1 2,0×10¹³ 3,6×10⁷ 2 1,2×10¹³ 7,0×10⁷ 3 2,0×10¹³ 2,0×10⁹

3. Полифаговый ELISA

Проводили полифаговый ELISA (иммуноферментный анализ) для изучения специфичности к антигенам у пула положительных к поли-scFv-фагам антител, полученных при каждом раунде процесса пэннинга в Примере 2.

Исходные клетки, замороженные после каждого из трех раундов пэннинга, вносили в среду, содержащую 5 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали при 37°C в течение 2-3 часов (OD₆₀₀ = 0,5-0,7). Клетки инфицировали фагом-помощником M1 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 ч. Культивируемые клетки центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин, 4°С), а супернатанты переносили в новые пробирки (поли-scFv-фаги от каждого из трех пэннингов). На 96-луночных иммунопланшетах (NUNC 439454) фиксировали по два вида антигенов при плотности 100 нг на лунку в буфере для покрытия при 4°C в течение 16 часов, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока.

Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, в каждую лунку добавляли по 100 мкл поли-scFv-фагов от каждого из трех пэннингов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Каждую лунку снова промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP (Amersham, 27-9421-01) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки PBS/T растворяли таблетки OPD (Sigma, 8787-TAB) в буфере PC и полученный раствор добавляли в лунки по 100 мкл на лунку, индуцируя развитие окраски в течение 10 мин. Затем измеряли поглощение при 490 нм на спектрофотометре (Molecular Devices).

Результаты представлены на фиг. 3. Как видно из фиг. 3, анализ по ELISA показал, что у третьих поли-scFv-фагов повышается способность к связыванию с двумя антигенами PD-1.

4. Скрининг положительных фагов

Колонии, полученные из группы поликлональных фаговых антител (из третьего пэннинга) с высокой способностью к связыванию, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, и добавляли в среду, содержащую 1 мл 2 х YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl2, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 100 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате, как видно из фиг. 4, было получено в общей сложности несколько десятков одиночных фаговых клонов для PD1 в виде моноклонов с высокой способностью к связыванию с каждым антигеном.

5. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител

Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V_H и V_L у выбранных антител и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 15 видов фаговых антител, специфичных к PD1, которые приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики моноклонов PD1

Название клона V_H Идентичность V_L Идентичность Группа Ниволумаб VH3-33 91,80% L6 98,90% Пембролизумаб VH1-2 79,60% L25 80,80% PD1-29A2 VH3-9 91,80% V2-17 86,50% 1 PD1-29H3 VH3-9 90,80% V1-11 88,50% 2 PD1-31F3 VH1-69 92,90% V1-13 93,90% 3 PD1-32A6 VH1-69 87,80% L5 91,60% 4 PD1-41C9 VH3-30 95,80% O1 92,10% 5 PD1-42G4 VH3-11 93,80% O2 93,80% 6 PD1-44B5 VH3-30 99,00% V1-16 85,60% 7 PD1-45D6 VH3-30 95,80% O1 93,10% 8 PD1-45F1 VH1-46 91,80% V2-13 93,80% 9 PD1-45F4 VH3-9 90,80% V2-1 77,70% 10 PD1-48A9 VH1-69 79,60% O1 96,00% 11 PD1-49B9 VH3-9 88,70% V1-2 93,90% 12 PD1-49A2 VH3-30 97,90% O1 93,10% 13 PD1-51D9 VH1-3 82,70% A3 94,00% 14 PD1-52E8 VH3-9 91,80% V2-17 90,50% 15

Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 4 и 5.

Таблица 4. Вариабельные области тяжелой цепи у клонов PD1

Название FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 PD1-45D6 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-49A2 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGRGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 115 58 136 PD1-27A12 QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS GFTFNDYA MHWVRQ VPGKGLE WVSG ISWNSGRI VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARSQQQ ILDY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 81 2 98 33 116 59 137 PD1-27B1 QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS GFTFNDYA MHWVRQ VPGKGLE WVSG ISWNSGRI VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARSIRQI LDY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 82 2 98 33 116 60 137 PD1-28D12 QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS GFTFNDYA MHWVRQ VPGKGLE WVSG ISWNSGRI VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARSLPXS RSRLDV WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 81 2 98 33 116 61 137 PD1-29A2 QVQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS GFTFNDYA MHWVRQ VPGKGLE WVSG ISWNSGRI VYADSMKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARAXTS PLDMSL DY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 81 2 98 33 116 62 137 PD1-29H3 QMQLVESG GNLVQPGRS LRLSCAAS GFTFDDYG MHWVRQ APGKGLE WVSS ISWNSGTI GYADSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR SEDTAVYYC ARLLHQ MNEHEF MDV WGQGTT VTVSS SEQ ID NO: 83 3 99 34 117 63 138 PD1-31F3 QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS GGTFSSYA ISWVRQA PGQGLEW MGG IIPLFSTA HSAQKFQGRVTITAD ESSSTAYMELSSLRSE DTAVYYC AKHKGL PFDWSP DGFDT WGQGT MVTVSS SEQ ID NO: 84 4 100 35 118 64 139 PD1-32A6 QVQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS GDTFTRNA VSWVRQA PGEGLEW MAD IIPIFGSA NYAQKFQGRLTLTA DVSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC ARTIEGA FDI WGQGT MVTVSS SEQ ID NO: 84 5 101 36 119 65 139 PD1-41C9 QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNRLR SEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL ITVSS SEQ ID NO: 85 1 97 32 120 58 140 PD1-42G4 QVQLVESG GGLVKPGGS LRLSCAAS GFTFSDYY MSWIRQA PGKGLEW VSD ISASGNSI YYADSVKRRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC VTSGPFGEFRN WGLGTL VTVSS SEQ ID NO: 82 6 102 37 121 66 141 PD1-44B5 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARLMHT FSVQYF LDV WGQGTT VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 114 67 138 PD1-45D6 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45F1 QVQLVQSG AEVKKPGAS VKLSCKAS GYTFNSYY VHWVRQ APGQGLE WMGI INPSDGSA TYAQKFQGRVTMTS DTSTSSVYMELSSLR SEDTAVYYC ARDGNY YDSRGY YYDTFDM WGQGTL ITVSS SEQ ID NO: 86 7 103 38 122 68 140 PD1-45F4 QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS GFTFDDYA MHWVRQ APGQGLE WVSG ISWNSNNI KYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARGALTPLDV WGQGTP VTVSS SEQ ID NO: 87 8 104 39 123 69 142 PD1-47B8 QMQLVQSG AEVKKPGAS VKVSCKAS GYTFTSYD INWVRQA SGQAPEW MGW LHADSGKT GYAQTFQGRVTMTR DTSIDTAYLELSSLRS EDTAVYYC ARGTHWLDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 88 9 105 40 124 70 137 PD1-48A6 QVQLVQSG GGLIQPGGSL RLSCAAS GFTVSRNS MNWVRQ TPGKGPE WVSL IFSGGTTK YKDSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCA AREEQF LIALAGR YFDY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 89 10 106 41 125 71 138 PD1-48A9 QMQLVQSG AEVKKPGSS VKVSCKAS GDTFTRYI INWVRQA PGQGLEW MGR VIPTLGLT TYAQNFQDTVTIIAD KSTNTAYMELKNLRS EDTAVYYC ARGYGS GAFDI WGQGT MITVSS SEQ ID NO: 90 11 107 42 126 72 143 PD1-48G6 QMQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSHYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSKI YYADSVKGRFTVSR DNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYC ARIGYK DAFDI WGQGT MVTVSS SEQ ID NO: 85 12 97 43 127 73 139 PD1-49A2 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NPKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGRGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 115 58 136 PD1-49B9 QMQLVESG GGLVQPGRS LRLSCAAS GFTFEDYA MHWVRQ PPGKGLE WVSS ISWNSHNI AYADSVKGRFTISRD NSKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC STSGLGVHA WGQGT MVTVSS SEQ ID NO: 87 13 108 44 128 74 139 PD1-51A6 QVQLVESG GGLVQPGGS LRLSCAAS GLSFSSYW MTWVRQ APGKGLE WVAN IKQDGSEK YYVDSVKGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARDSFG GHLDL WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 91 14 109 45 129 75 137 PD1-51D9 QVQLVESG AEVKKPGAS VKLSCKAS GYTFSSYW MHWVRQ APGQRLE WMGE INPGNGHT NYNEKFKSRVTITVD KSASTAYMELSSLRS EDTAVYYC AREGDG SYWGYFDS WGQGTP ITVSS SEQ ID NO: 92 15 110 46 130 76 144 PD1-52E8 QVQLVQSG GNLVQPGRS LRLSCAAS GFTFDDYA MHWVRQ APGKGLE WVSG ISWNSGTP GYADSVQGRFTISRD NAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARGHNY LDSSYYDY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 93 8 111 47 131 77 137 PD1-62E1 QVQLVESG GDLVKPGRS LRLSCTGS GFTFGDHP LTWVRQI PGKGLEW VGF IRSKAYGE TTEYAASVKGRFTIS RDDSKSIAYLQMNSL RAEDTAVY ASVSYC SGGSCY QGTFDY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 94 16 112 48 132 78 137 PD1-72D10 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 114 58 137 PD1-74A11 QVQLVQSG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC ARTTFDY WGQGTL ITVSS SEQ ID NO: 95 1 97 32 114 79 140 PD1-75C10 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 114 57 135 PD1-74A01 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRS EDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 133 57 135 PD1-74H12 QVQLVESG GGVVQPGRS LRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGSNK YYADSVKGRFTISRD NSKNMLYLEMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 32 134 57 135

Таблица 5. Вариабельные области легкой цепи у клонов PD1

Название FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 PD1-27A12 DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS RDISRW LAWYQQKP GEAPKLLIY GAS SLRSGVSSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED FATYFC QQGKSF PYT FGQGTK VDIK SEQ ID NO: 270 198 295 223 316 242 356 PD1-27B1 DIVMTQTPLS SPVTLGQPAS ISCRSS QSLVH LNWFHQRP GQPPRLLIH KIS NRVSGVPDRFSGSG AGTDFTLKISRVEA EDVGVYYC MQSTQF PYT FGQGTK VDIK SEQ ID NO: 271 199 296 224 317 243 356 PD1-28D12 DIQMTQSPSS VSASLGDRV TITCRAS QAISNW LTWYQQKP GKAPKLLIY ATS SLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPED VATYYC QQTDSF PLT FGGGTK VDIK SEQ ID NO: 272 200 297 225 318 244 357 PD1-29A2 SYELTQSPSV SMSPGQTARI TCSGD ALSKQY ASWYQLKP GQAPVVVMY KDT ERPSGIPDRFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DGADYYC QSITDKS GTDVI FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 273 201 298 226 319 245 358 PD1-29H3 QLVLTQPSS MSEAPGQRV TISCSGG TSNIGTNA VNWYQQPP GKAPTLLIY YDD RLTSGVSDRFSGSK SGTSASLAISRLQSE DEADYYC AAWDDS LNGWV FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 274 202 299 227 320 246 358 PD1-31F3 QFVLTQPPSV SGAPGQRVII SCTGS SSNIGAGYD VHWYQQLP GTAPKVLIY GNS DRPSGVPDRFSASK SATSASLAITGLQA EDEADYYC QSYDSS LSGYV FGTGTK VTVL SEQ ID NO: 275 203 300 228 321 247 359 PD1-32A6 DIQMTQSPSS VSASVGDRV TITCRAS QGIVSW LAWYQQKP GKAPRLLIY RAS DLETGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DVATYYC QQADSF PLT FGGGTK VEIK SEQ ID NO: 270 204 301 229 322 248 360 PD1-41C9 DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDSE DGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC LQRMGF PYT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 323 249 361 PD1-42G4 DIQMTQSPSS LSASVGDRV TTTCRAS QGISSY LAWYQQKP GKAPKLLIY AAS TLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPE DFATYFC QQSYTSPRT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 277 206 303 231 324 250 361 PD1-44B5 QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS TFNIGTTT VNWYQRLP GTAPKLLIY NYD QRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAISGLQSE DEADYYC AAWDDS LNAWL FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 278 207 304 232 325 251 358 PD1-45D6 DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDSD DGKTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS YRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC MQRVEF PFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 276 208 302 230 326 252 361 PD1-45F1 SYELTQDPA VSVALGQTV RITCQGD SLRTYY ASWYQQKP GQAPILVIY GKN NRPSGIPDRFSGSSS GNTASLTITAAQAE DEADYYC NSRDSS GKSLV FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 279 209 305 233 327 253 358 PD1-45F4 SYELTQAPSL SVSPGQTANI ICSGD NLRTKY VSWYQQKP GQSPLLVIY QDT RRPSGIPARFSGSNS GNTATLTISGTQTR DESTYYC MTWDV DTTSMI FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 280 210 306 234 328 254 358 PD1-47B8 QSALTQPASV SGSPGQSITIS CTGT SSDVGG YNY VSWYQQHP GKAPKLMIY DVS KRPSGVSNRFSGSK SGNTASLTISGLQA EDEADYYC SSFTSSSTVV FGGGTK LTVL SEQ ID NO: 281 211 307 235 329 255 358 PD1-48A6 QFVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGS RSNFGA GHD VHWCQQLP GTAPKLLIY GNN NRPSGVPDRFSGSK SGTSASLAITGLQA EDEAEYYC QSYDSSLSAWG VRRRDQ ADRP SEQ ID NO: 282 212 308 236 330 256 362 PD1-48A9 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS HDGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC MQRIDFPYT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 283 213 302 230 331 257 363 PD1-48G6 NFMLTQPPST SGTPGQRVTI SCSGR SSNIGINT VTWYQQLP GTAPKVLMY RDD QRPSGVPDRFSGSR SGISASLAISGLQSE DEADYYC ASWDDTLNGWV FGGGTKLTVL SEQ ID NO: 284 214 309 237 332 258 358 PD1-49A2 DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDSD DGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC LQRMGFPYT FGQGTKVEIK SEQ ID NO: 285 215 302 230 333 249 363 PD1-49B9 QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGT SSDVGG YNY VSWYQQHP GKAPKLMIY EVS KRPSGVPDRFSGSK SGNTASLTVSGLQP EDEADYYC SSFARNSNYV FGTGTKVTVL SEQ ID NO: 286 211 307 238 334 259 359 PD1-51A6 DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSS QSLLYIDGETY LFWYLQKP GQSPQLLIY EVS SRFSGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC MQGIHLPLT FGQGTRLEIK SEQ ID NO: 287 216 310 238 335 260 364 PD1-51D9 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLHS NGNNY LDWYLQKP GQSPQLLIY LGS YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC MQGLQIPST FGPGTKVDIK SEQ ID NO: 283 217 302 239 336 261 365 PD1-52E8 SYELTQPLSL SVAPGQTARI TCSGD ALSKEY SYWYQQKP GQAPVLVMY KDS ERPSGIPERFSGSSS GTTVTLTISGVQAE DEADYYC QSVDSSDTSVV FGGGTKLTVL SEQ ID NO: 288 218 311 240 337 262 358 PD1-62E1 DIQMTQSPAI LSLSPGERAT LSCRAS QSVTSD VAWYQHIR GQAPRLLIY DAS NRASGIPARFSGGG SGTEFTLTISSLEPE DFAVYYC QQYNNWPLT FGGGTKVEIK SEQ ID NO: 289 219 312 241 338 263 360 PD1-72D10 DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 333 252 366 PD1-74A11 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDSDDGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAAEDVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTKVDIK SEQ ID NO: 283 215 302 230 353 252 356 PD1-75C10 DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKITRVEA EDVGVYYC MQRIEFPYT FGQGTKLEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 354 264 366 PD1-74A01 DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDR GGGHTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRKEFPLT FGPGTKLEIK SEQ ID NO: 283 222 302 230 333 268 367 PD1-74H12 DIVMTQTPLS LSVTPGEPAS ISCRSS QSLLDSD DGNTY LDWYLQKP GQSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGRG SHTDFTLTISSVEAE DVGVYYC MQRIHFPLT FGQGTRLEIK SEQ ID NO: 294 220 302 230 355 269 364

Пример 3. Получение человеческих антител к PD-1

1. Преобразование из формата scFv в формат IgG

Для перевода выбранных 15 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.

После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).

В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 15 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител 15 клонов, приведенных в таблице 3. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).

2. Получение человеческих антител

Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 15 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка (фиг. 5).

В результате, как видно из фиг. 5, в невосстановительных условиях все 15 антител детектировались при молекулярной массе 150 кДа и больше, а в качестве контрольного антитела был получен ниволумаб.

Пример 4. Характеристики моноклональных антител к PD-1

1. Оценка активности антител

Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 16 видов антител к PD-1, включая контрольное антитело, определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 41C9, 45D6 и 49A2 проявляли активность, близкую контрольному антителу (фиг. 6).

Для измерения активности антител 41C9, 45D6 и 49A2 к PD-1 в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC₅₀ (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, а значения EC₅₀ по способности к восстановлению ингибирования in vitro представлены на фиг. 7.

2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам

Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 150 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS.

Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10⁶ клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA). При этом все три антитела к PD-1 специфически связывались, а их способность к связыванию определяли по константе равновесной диссоциации (K_d), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6.

В результате, как видно из фиг. 8, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции).

3. Скрининг положительных фаговых антител со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2

Проводили дополнительный скрининг антител на близость к 45D6 и 49A2, наряду с 41C9, которые проявляли отличную активность и способность к связыванию при анализе методом FACS.

Антитела со сходной последовательностью с PD1-45D6 и 49A2 подвергали дальнейшему скринингу по той же методике, что и в Примере 2. Их характеристики приведены ниже в таблице 6.

Таблица 6. Характеристики проходивших дополнительный скрининг клонов антител, близких к 45D6 и 49A2

Название клона V_H Идентичность V_L Идентичность Группа PD1-72D10 VH3-30 96,90% O1 94,10% 1 PD1-74A11 VH3-30 97,96% O1 95,05% 2 PD1-75C10 VH3-30 96,94% O1 95,05% 3 PD1-74A01 VH3-30 95,92% O1 92,08% 4 PD1-74H12 VH3-30 94,90% O1 92,08% 5

4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36

Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали его буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).

Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.

Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K_D) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 45D6 и 49A2 проявляли значения K_D 0,001 нМ и 0,019 нМ, соответственно, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 9).

Пример 5. Оптимизация антител PD1-45D6 и 49A2

1. Получение библиотек для оптимизации антител PD1-45D6 и 49A2

Для оптимизации антител получали новые библиотеки с перетасовкой LC путем иммобилизации тяжелой цепи и введения пула 10⁵-10⁶ легких цепей (LC) от фирмы Ybiologics, Inc. Также проводили оптимизацию антител следующими тремя способами: перетасовки LC; базовой упаковки + перетасовки LC, включая сравнительный анализ остатков в структурно важных сайтах типа гидрофобной сердцевины тяжелых цепей, открытых остатков, кластеров зарядов, солевых мостиков, мутационное превращение их в консервативные остатки, а затем проведение перетасовки LC; и горячих точек CDR + перетасовки LC в случае ДНК вариабельных областей антител, включая случайный мутагенез мутационных горячих точек, которые часто могут мутировать в процессе созревания сродства in vivo, а затем проведение перетасовки LC.

Для получения библиотек с перетасовкой LC расщепляли гены LC антител 45D6 и 49A2 с помощью BstXI и затем использовали их в качестве векторов, а библиотечные пулы фирмы Ybiologics, Inc. расщепляли с помощью BstXI и использовали в качестве вставок. После лигирования с помощью лигазы проводили трансформацию клеток методом электропорации. Библиотеки антител получали, собирая трансформированные клетки на квадратной пластине. При этом получали библиотеки с разнообразием в 1,5×10⁷. Результаты анализа последовательностей показали, что все последовательности HC были идентичными, а последовательности LC отличались друг от друга.

Чтобы получить библиотеки упаковки ядра + перестановки LC, сайты каркаса (FR) антител 45D6 и 49A2 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, гены LC были разрезаны BstX I и затем использованы в качестве векторов, а пулы библиотеки принадлежащие Ybiologics, Inc. были вырезаны с помощью BstX I, а затем использованы в качестве вставок. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате были получены библиотеки с разнообразием 8,4х10⁶. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, а последовательности LC отличались друг от друга.

Для получения библиотек ядра горячей точки + тасования LC сайты каркаса (FR) антител 45D6 были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, библиотеки с горячими точками в CDR1 были вырезаны с помощью Sfi I и использованы в качестве вставок, а пулы библиотек, принадлежащие Ybiologics, Inc., разрезали с помощью Sfi I и затем использовали в качестве векторов. После лигирования с лигазой трансформацию осуществляли с использованием клеток для электропорационной трансформации. Библиотеки антител были получены путем сбора трансформированных клеток на квадратной пластине. В результате было получено около 5,6х10⁶ различных библиотек. Результат анализа последовательностей показал, что сайты FR HC были заменены консервативными аминокислотными последовательностями, последовательности горячих точек CDR1 были мутированы случайным образом, а последовательности LC отличались друг от друга.

Пример 6. Скрининг человеческих антител к PD-1

1. Подготовка антигенов

В качестве белковых антигенов PD1-hFc и PD1-mFc, полученные на фирме Ybiologics, Inc, и PD1-his (кат. № 10377-H08H), приобретенный у Sino Biological Inc., фиксировали в дозе 50 мкг на иммуносорбционных пробирках, а затем блокировали.

2. Биопэннинг (просеивание)

Получали фаговую библиотеку человеческих антител путем инфицирования бактерий библиотекой scFv человека с разнообразием в 2,7×10¹⁰, а затем культивирования при 30°C в течение 16 ч. Культуральный раствор после культивирования центрифугировали, а супернатант концентрировали с помощью PEG и затем растворяли в буфере PBS для получения библиотеки человеческих антител. Фаговую библиотеку человеческих антител вносили в иммунологическую пробирку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. После отмывки 1 раз PBS/T и 1 раз PBS элюировались только scFv-фаги, специфически связавшиеся с антигеном.

Элюированными фагами опять инфицировали E. coli и проводили амплификацию (процесс пэннинга), получая пул положительных фагов. Для оптимизации антител проводили только первый раунд пэннинга. В результате, как видно из таблицы 7, оказалось, что количество фагов, связавшихся с антигеном (на выходе) при первом раунде пэннинга, немного повысилось по сравнению с количеством фагов на входе.

Таблица 7. Сравнение титра антител при оптимизационном пэннинге

Образец Количество фагов на входе Количество фагов на выходе 45D6 (LS) 1,3×10¹³ 2,8×10⁷ 45D6 (базовая упаковка + LS) 1,1×10¹³ 4,8×10⁷ 45D6 (горячие точки в CDR + LS) 1,1×10¹³ 3,6×10⁶ 49A2 (LS) 1,3×10¹³ 1,8×10⁷ 49A2 (горячие точки в CDR + LS) 1,1×10¹³ 1,6×10⁶

3. Скрининг положительных фагов

Колонии, полученные при пэннинге, культивировали в 96-луночном планшете с глубокими лунками на 1 мл (Bioneer, 90030) при 37°C в течение 16 часов. По 100-200 мкл выращенных при этом клеток вносили в среду, содержащую 1 мл 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, до значения OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали в глубоком 96-луночном планшете при 37°C в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ IPTG при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем каждую лунку блокировали раствором PBS с 4% обезжиренного молока. В каждую лунку вносили по 1 мкл моноклонального scFv-фага (100 scFv-фагов) после промывки 0,2 мл PBS/T и культивирования в течение 16 часов и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате были получены одиночные фаговые клоны с более высокой способностью к связыванию с каждым антигеном, чем у исходных антител (49A2 или 45D6), а результаты представлены на фиг. 10.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей положительных фаговых антител

Из отобранных одиночных клонов выделяли ДНК с помощью набора для очистки ДНК (Qiagen, Germany) и заказывали анализ последовательностей этих ДНК (Solgent). Исходя из результатов анализа последовательностей, идентифицировали участки CDR из V_H и V_L у выбранных антител, и исследовали сходство (идентичность) между этими антителами и группами гаметных антител с помощью программы Ig BLAST на веб-сайте NCBI по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/. В результате было получено 25 видов фаговых антител (49A2: 10 видов, 45D6: 15 видов) с более высокой способностью к связыванию, чем у исходных антител, а результаты приведены ниже в таблице 8.

Таблица 8. Характеристики моноклонов PD1 от вариантов антител, отобранных при оптимизации

Название клона V_H Идентичность V_L Идентичность Группа PD1-49A2(A/1B2) VH3-30 92,86% O1 93,07% 1 PD1-49A2(A/1D11) VH3-30 91,84% O1 97,03% 2 PD1-49A2(A/1F12) VH3-30 92,86% O1 93,07% 3 PD1-49A2(A/1H4) VH3-30 92,86% O1 92,08% 4 PD1-49A2(A/1H8) VH3-30 92,86% O1 90,10% 5 PD1-49A2(A/2A6) VH3-30 91,84% O1 89,11% 6 PD1-49A2(A/2A11) VH3-30 93,88% O1 90,10% 7 PD1-49A2(A/2B9) VH3-30 92,86% O1 93,07% 8 PD1-49A2(A/2B10) VH3-30 93,88% O1 95,05% 9 PD1-45D6(A/3D2) VH3-30 93,88% O1 94,06% 10 PD1-45D6(A/3G1) VH3-30 93,88% O1 95,05% 11 PD1-45D6(A/3H4) VH3-30 93,88% O1 93,07% 12 PD1-45D6(A/3H6) VH3-30 93,88% O1 95,05% 13 PD1-45D6(A/3H7) VH3-30 93,88% O1 92,08% 14 PD1-45D6(A/4C1) VH3-30 94,90% O1 96,04% 15 PD1-45D6(A/4C9) VH3-30 94,90% O1 93,07% 16 PD1-45D6(A/4D4) VH3-30 94,90% O1 92,08% 17 PD1-45D6(A/4H6) VH3-30 94,90% O1 95,05% 18 PD1-49A2(A/2D7) VH3-30 92,86% O1 95,05% 19 PD1-45D6(A/5A6) VH3-30 91,84% O1 96,04% 20 PD1-45D6(A/5B2) VH3-30 93,88% O1 94,06% 21 PD1-45D6(A/5B5) VH3-30 92,86% O1 92,08% 22 PD1-45D6(A/5B12) VH3-30 93,88% O1 94,06% 23 PD1-45D6(A/5C8) VH3-30 92,86% O1 95,05% 24 PD1-45D6(A/5H9) VH3-30 92,86% O1 94,06% 25

Антитела, включая последовательности участков CDR и FR тяжелой и легкой цепи выбранных антител, а также содержащие их вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи, представлены ниже в таблицах 9 и 10.

Таблица 9. Вариабельные области тяжелой цепи у человеческих антител PD1

Название FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 PD1-49A2 (A/1B2) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFLRYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGQDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGRGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 17 97 49 114 58 136 PD1-49A2 (A/1D11) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFKNNA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGRHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 18 97 50 114 58 137 PD1-49A2 (A/1F12) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFRNYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGQHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WSQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 19 97 51 114 58 145 PD1-49A2 (A/1H4) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFPIYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGAHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 20 97 52 114 58 137 PD1-49A2 (A/1H8) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFKTYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGQHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 21 97 51 114 58 137 PD1-49A2 (A/2A6) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFKYYA MHWVRQ APGKGLE WVTV ISYDGQYK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 22 113 53 114 58 137 PD1-49A2 (A/2A11) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFRSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGQDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 23 97 49 114 58 137 PD1-49A2 (A/2B9) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFLRYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGRYK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 17 97 54 114 58 137 PD1-49A2 (A/2B10) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFLVYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGSHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 24 97 55 114 58 137 PD1-49A2 (A/2D7) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFKTYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGQHK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC TTTTFDS WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 21 97 51 114 58 137 PD1-45D6 (A/3D2) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45D6 (A/3G1) QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45D6 (A/3H4) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45D6 (A/3H6) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45D6 (A/3H7) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ VPGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGSQ VTVSS SEQ ID NO: 80 1 96 31 114 57 135 PD1-45D6 (A/4C1) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/4C9) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/4D4) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/4H6) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSSYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 1 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/5A6) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFRLYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISHDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 25 97 56 114 57 137 PD1-45D6 (A/5B2) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSFYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 26 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/5B5) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFRTYA MHWVRQ APGKGLEWVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 27 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/5B12) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFSVYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 28 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/5C8) QVQLVESG GGVVQPGRSLRLSCAAS GFTFMRYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 29 97 31 114 57 137 PD1-45D6 (A/5H9) QVQLVESG GGVVQPGRSL RLSCAAS GFTFWTYA MHWVRQ APGKGLE WVAV ISYDGNDK YYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYC VPTTFEY WGQGTL VTVSS SEQ ID NO: 80 30 97 31 114 57 137

Таблица 10. Вариабельные области легкой цепи у человеческих антител PD1

Название FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 PD1-49A2 (A/1B2) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 283 220 302 230 339 252 366 PD1-49A2 (A/1D11) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS YRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC MQRVEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 283 215 302 230 340 252 366 PD1-49A2 (A/1F12) DIVMTQTPHS LPVTPGEPASISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC MQRIEFPYT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 290 205 302 230 341 264 366 PD1-49A2 (A/1H4) DIVMTQSPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC MQRVEFPYT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 291 205 302 230 342 265 361 PD1-49A2 (A/1H8) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLD RDGGHTY VDWYLQKPG QSPRLLIY TLS HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGLYYC MQRIEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 283 221 313 230 343 266 363 PD1-49A2 (A/2A6) DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQRPG QSPQLLIY TLS HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 276 205 314 230 344 252 363 PD1-49A2 (A/2A11) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPRLLIY TLS HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC LQRMGFPYT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 283 215 315 230 345 249 366 PD1-49A2 (A/2B9) DIVMTQTPLS LPVTPGEAASISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC MQRRDFPFT FGQGTK VDIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 346 267 356 PD1-49A2 (A/2B10) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGLYYC MQRVEFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 283 220 302 230 323 252 361 PD1-49A2 (A/2D7) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLD RDGGHTY VDWYLQKPG QSPRLLIY TLS HRALGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DNVGLYYC MQRIEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 283 221 313 230 347 266 363 PD1-45D6 (A/3D2) DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 333 252 363 PD1-45D6 (A/3G1) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC MQRVEFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 283 205 302 230 346 252 361 PD1-45D6 (A/3H4) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DSGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 283 215 302 230 348 252 361 PD1-45D6 (A/3H6) DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC MQRVEFPFT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 349 252 366 PD1-45D6 (A/3H7) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPGRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 283 220 302 230 344 252 366 PD1-45D6 (A/4C1) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 283 220 302 230 333 252 361 PD1-45D6 (A/4C9) DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVAA EDVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 350 252 366 PD1-45D6 (A/4D4) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTEFNLRISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK VDIK SEQ ID NO: 283 205 302 230 339 252 356 PD1-45D6 (A/4H6) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLFDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGLYYC MQRVEFPFT FGQGTK LEIK SEQ ID NO: 283 215 302 230 331 252 366 PD1-45D6 (A/5A6) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC MQRIDFPYT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 283 205 302 230 349 257 361 PD1-45D6 (A/5B2) DIVMTQTPLS PPVTPGEPASI SCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC MQRRDFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 292 220 302 230 346 267 361 PD1-45D6 (A/5B5) DIVMTQTPLS LPVMPGEAA SISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEA DDVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 293 205 302 230 351 252 363 PD1-45D6 (A/5B12) DIVMTQTPLS LPVTPGEAAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGIYYC MQRVEFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 276 205 302 230 333 252 363 PD1-45D6 (A/5C8) DIVMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS EDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVPDRFSGSG SGTDFTLKISRVEAE DVGVYYC MQRVEFPFT FGQGTK LDIK SEQ ID NO: 285 205 302 230 349 252 361 PD1-45D6 (A/5H9) DIVMTQTPLS LPVTPGEPAS ISCRSS QSLLDS DDGNTY LDWYLQKPG QSPQLLIY TLS HRASGVSDRFSGSG SGTDFTLEISRVEAE DVGVYYC MQRRDFPFT FGQGTK VEIK SEQ ID NO: 283 220 302 230 352 267 363

Пример 7. Получение человеческих антител к PD-1

1. Преобразование из формата scFv в формат IgG

Для перевода выбранных 25 видов моноклональных фаговых антител к PD1 из фагов в целый IgG-вектор проводили ПЦР (iCycler iQ, BioRad) на тяжелых и легких цепях. В результате получали тяжелые и легкие цепи, а векторы и тяжелые и легкие цепи каждого из клонов разрезали (расщепляли) рестрикционными ферментами. Из каждого вектора и тяжелой цепи выделяли ДНК с помощью набора для экстракции ДНК из геля (Qiagen). Проводили лигирование путем смешивания 1 мкл (10 нг) вектора, 15 мкл (100-200 нг) тяжелой цепи, 2 мкл 10-кратного буфера, 1 мкл лигазы (1 ед./мкл) и дистиллированной воды, а затем инкубации смеси при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Полученную смесь вводили в трансформируемые клетки (компетентные клетки, XL1-blue), помещали клетки на лед на 5 мин и подвергали их тепловому шоку при 42°C в течение 90 сек.

После теплового шока к клеткам добавляли 1 мл среды, а затем культивировали клетки при 37°C в течение 1 часа, рассеивали шпателем по чашке с LB Amp и инкубировали при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом колонии инокулировали в 5 мл среды LB Amp, культивировали при 37°C в течение 16 часов и проводили выделение ДНК с помощью набора DNA-prep (Nuclogen). Заказывали анализ последовательностей полученных ДНК (Solgent).

В результате было подтверждено, что последовательности тяжелых цепей и легких цепей у 25 клонов для PD1, переведенных в целые IgG, соответствуют последовательностям фаговых антител. Для трансфекции в клетки HEK293F тяжелые и легкие цепи соответствующих клонов, переведенных в целые IgG, культивировали в 100 мл среды LB Amp и выделяли ДНК с помощью набора Midi-prep (QIAgen).

2. Получение человеческих антител

Клонированные векторы pNATVH и pNATVL в соотношении 6:4 совместно трансфецировали в клетки HEK293F, на 7-й день собирали супернатанты, удаляли клетки и обломки клеток центрифугированием и через фильтры на 0,22 мкм, а супернатанты собирали и подвергали аффинной хроматографии на белке A для очистки IgG-антител. Антитела после очистки проводили через глициновый буфер и заменяли буфер таким образом, чтобы конечным буфером при ресуспендировании был PBS. Проводили количественное определение очищенных антител методом BCA и Nanodrop, а затем каждое из 25 видов антител наносили в дозе 5 мкг в восстановительных и невосстановительных условиях и анализировали методом SDS-PAGE для определения чистоты и подвижности очищенного белка. Кроме того, некоторые из супернатантов наносили на SDS-PAGE для сравнения скорости экспрессии с исходным антителом, причем большинство антител экспрессировались сильнее, чем исходное антитело, а результаты представлены на фиг. 11.

Пример 8. Характеристики моноклональных антител к PD-1

1. Оценка активности антител

Проводили тестирование выбранных антител на активность с помощью набора для биоанализа блокировки PD1/PD-L1 (Promega, J1250). В 96-луночный планшет высеивали клетки линии CHO с высокой экспрессией PD-L1, культивировали в течение 16 часов или дольше, обрабатывали каждым антителом в серийном разведении при постоянной концентрации, а затем культивировали вместе с клетками линии Jurkat с высокой экспрессией PD-1 человека в течение 6 часов. Определяли степень восстановления ингибирования у антител на спектрофотометре (SpectraMax M5, Molecular Devices, USA) по интенсивности люминесценции, возникающей при расщеплении субстрата люциферазой. Активность 24 видов антител к PD-1 определяли по значениям для восстановления пониженного сигнала при образовании комплекса PD-1/PD-L1, причем 45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2 и 45D6-5B5 из числа антител 45D6 и 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6 и 49A2-2B9 из числа антител 49A2 проявляли большую активность, чем исходное антитело, близкую к активности контрольного антитела (фиг. 12).

Для измерения активности 8 видов антител к PD-1 (45D6-3D2, 45D6-3H7, 45D6-5B2, 45D6-5B5, 49A2-1B2, 49A2-1H8, 49A2-2A6, 49A2-2B9) в зависимости от концентрации делали серийные разведения и опять проводили биоанализ блокирования PD1/PD-L1 по восстановлению пониженного сигнала зависимым от концентрации образом. Степень восстановления выражали в виде EC₅₀ (эффективная концентрация mAb при 50%-м уровне восстановления сигнала) при анализе с помощью Graphpad Prism6, причем 49A2-1B2 проявляло наибольшую способность к восстановлению ингибирования in vitro по значению EC₅₀ (фиг. 13, таблица 11).

Таблица 11. Активность моноклонов PD1 от выбранных вариантов антител

Антитело EC₅₀ [нM] Антитело EC₅₀ [нM] PD-1-41C9 3,91 PD-1-49A2 3,78 PD-1-45D6 2,00 PD-1-49A2-A-1B2 1,30 PD-1-45D6-A-3D2 2,16 PD-1-49A2-A-1D11 2,89 PD-1-45D6-A-3G1 0,98 PD-1-49A2-A-1F12 1,03 PD-1-45D6-A-3H4 1,67 PD-1-49A2-A-1H4 0,84 PD-1-45D6-A-3H6 1,49 PD-1-49A2-A-1H8 1,21 PD-1-45D6-A-3H7 1,98 PD-1-49A2-A-2A11 0,79 PD-1-45D6-A-4C1 1,76 PD-1-49A2-A-2A6 1,51 PD-1-45D6-A-4C9 2,72 PD-1-49A2-A-2B10 0,65 PD-1-45D6-A-4D4 1,74 PD-1-49A2-A-2B9 1,23 PD-1-45D6-A-4H6 1,19 PD-1-51D9 ~4,695 PD-1-45D6-A-5A6 0,92 PD-1-52E8 8,43 PD-1-45D6-A-5B12 0,80 PD-1-62E1 2,73 PD-1-45D6-A-5B2 1,48 PD1-72D10 1,21 PD-1-45D6-A-5B5 1,68 PD1-74A11 1,31 PD-1-45D6-A-5C8 1,44 PD1-75C10 0,81 PD-1-45D6-A-5H9 2,00 PD1-74A01 1,01 PD-1-48A9 8,64 PD1-74H12 0,98

2. Сродство антител к PD1 к гиперэкспрессированным клеткам

Обращаясь к пулам трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1, клетки HEK293E трансформировали плазмидой pcDNA3.1, содержащей PD-1 человека (NM_005018.2) или PD-L1 человека (NM_014143.2), и проводили скрининг в селективной среде, содержащей 400 мкг/мл зеоцина (#R25001, Thermo Fisher). Каждый пул клеток идентифицировали и отбирали методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с помощью антитела против PD-1 (#557860, BD) и использовали для таких функциональных анализов, как анализ связывания по FACS или анализ конкуренции по FACS. Из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией PD-1 человека отбирали образцы по 0,5-1×10⁶ клеток, готовили серийные разведения антител при постоянной степени разведения и проводили реакцию с полученными клетками при 4°C в течение 20 мин. Затем клетки трижды промывали PBS (#LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной телячьей сыворотки, и проводили реакцию при 4°C в течение 20 мин с антителом против IgG человека (#FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин-изотиоцианат). Клетки опять промывали так же, как описано выше, а затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащем 2% FBS (#26140-079, Thermo Fisher), и проводили проточную цитометрию на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences, USA).

От 0,5 до 1 × 10⁶ клеток на каждый образец получали из пулов трансформированных клеток с высокой экспрессией человеческого PD-1, и антитела серийно разводили с постоянной скоростью разведения и реагировали с полученными клетками при 4°С в течение 20 минут. Затем клетки трижды промывали PBS (# LB001-02, Welgene), содержащим 2% фетальной бычьей сыворотки, и подвергали реакции при 4°С в течение 20 минут с антителом против человеческого IgG (# FI-3000, Vectorlabs), конъюгированным с флуоресцентным веществом FITC (флуоресцеин изотиоцианат). Затем клетки подвергали тому же процессу промывания, что и выше, и затем суспендировали в 0,5 мл PBS, содержащий 2% FBS (# 26140-079, Thermo Fisher), с помощью проточного цитометра FACSCanto II (BD Biosciences, США) в качестве проточного цитометра. Определяли способность к связыванию по константе равновесной диссоциации (K_d), полученной через функцию анализа Graphpad Prism6. При этом, как видно из фиг. 15, способность к связыванию у антител при зависимом от концентрации связывании с PD-1 человека, гиперэкспрессированным на клеточной поверхности, можно определять по MFI (средней интенсивности флуоресценции). Как видно из фиг. 14 и 15, антитела, за исключением 49A2 (исходное 49A2), проявляли близкие способности к связыванию.

3. Способность антител ингибировать образование комплекса PD-1/PD-L1 или PD-1/PD-L2 при иммуноадсорбции фермента

В лунки 96-луночного иммунопланшета (#439454, Thermo) вносили PD-1-Fc (S1420, Y-Biologics) или PD-L2-Fc (#10292-H02H, Sino) человека, а затем трижды промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (#P9416, Sigma-Aldrich), после чего оставляли на 1 час при комнатной температуре в чистящем растворе, содержащем 4% обезжиренного молока (#232120, Becton, Dickinson and Company), для блокировки неспецифического связывания. В то же время проводили реакции человеческих PD-L1-His (S1479, Y-Biologics) или PD-1-His (S1352, Y-Biologics) с серийными разведениями антител при постоянной степени разведения при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего оставляли в том же микропланшете при комнатной температуре на 1 час. Затем полученные продукты промывали так же, как и выше, в лунки микропланшета добавляли антитело против биотина-His (#MA1-21315-BTIN, Thermo) в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, затем добавляли антитело против стрептавидина с поли-HRP (#21140, Pierce) в разведении 1:5000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промывали таким же образом. К продуктам реакции добавляли 100 мкл раствора субстрата TMB (#T0440, Sigma-Aldrich), заслоняли от света и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавляли 50 мкл 2,5 М серной кислоты (#S1478, Samchun) для остановки реакции и измеряли поглощение при 450 нм на спектрофотометре GM3000 (Glomax^® Discover System, Promega). Результаты представлены на фиг. 16.

4. Сродство антител к PD1 на приборе ProteOn XPR36

Использовали прибор ProteOn XPR36 (BioRad). На приборе устанавливали сенсорный чип GLC (BioRad) и промывали буфером PBST, а поверхность карбоксиметилдекстрана активировали смесью растворов EDC и сульфо-NHS. На сенсорный чип GLC наносили и иммобилизировали PD1-hFc, растворенный при концентрации 5 мкг/мл в буферном растворе 10 мМ ацетата натрия (pH 5,0).

Для того, чтобы дезактивировать активированные карбоксильные группы, не прореагировавшие с белком PD1, пропускали 1М этаноламин и вводили 10 мМ глицина (рН 2,0) с тем, чтобы смыть белки, не связавшиеся с сенсорным чипом. Затем регистрировали данные для сенсограммы при связывании и диссоциации по времени, пропуская антитела со скоростью подачи 30 мкл/мин (от 30 нМ до 0,123 нМ) в течение 10 мин с помощью буфера PBST.

Рассчитывали равновесные константы диссоциации (K_D) путем нанесения на график и аппроксимации данных по сенсограмме в состоянии равновесия в зависимости от концентрации. При этом 49A2 (2B9) проявляло значение K_D 0,001 нМ, что указывает на высокое сродство к антигену PD1 (фиг. 17).

Сродство других антител к белку PD-1 человека, сродство к белку PD-1 обезьян и сродство к белку PD-1 крыс представлены в таблице 12-14.

Таблица 12. Кинетика связывания между белком PD-1 человека и выбранными антителами

Антитело K_D (M) K_a (1/Ms) K_d (1/s) PD1-49A2 2,371×10^-10 3,953×10⁵ 9,372×10^-5 PD1-49A2-1H8 1,245×10^-11 2,201×10⁵ 2,741×10^-6 PD1-49A2-1B2 1,659×10^-10 3,853×10⁵ 6,390×10^-5 PD1-49A2-2A6 6,907×10^-11 3,101×10⁵ 2,142×10^-5 PD1-49A2-2B9 1,0×10^-12 3,774×10⁵ 1,00×10^-7 PD1-45D6 1,0×10^-12 2,701×10⁵ 1,07×10^-7 PD1-45D6-3D2 1,0×10^-12 1,810×10⁵ 1,00×10^-7 PD1-45D6-3H7 2,530×10^-11 3,076×10⁵ 7,781×10^-6 PD1-45D6-5B2 5,818×10^-11 3,315×10⁵ 1,928×10^-5 PD1-45D6-5B5 4,773×10^-11 2,960×10⁵ 1,413×10^-5

Таблица 13. Кинетика связывания между белком PD-1 обезьяны и выбранными антителами

Антитело K_D (M) K_a (1/Ms) K_d (1/s) PD-1-49A2 1,0×10^-12 1,683×10⁵ 1,0×10^-7 PD-1-49A2-2B9 1,0×10^-12 1,853×10⁵ 1,0×10^-7 PD-1-45D6 1,0×10^-12 1,535×10⁵ 1,0×10^-7 PD-1-45D6-5B2 1,0×10^-12 2,078×10⁵ 1,0×10^-7

Таблица 14. Кинетика связывания между белком PD-1 крысы и выбранными антителами

Антитело K_D (M) K_a (1/Ms) K_d (1/s) PD-1-49A2-2B9 4,231×10^-9 1,478×10⁵ 6,252×10^-4 PD-1-45D6 2,391×10^-9 5,544×10⁴ 1,326×10^-4 PD-1-45D6-5B2 4,590×10^-9 1,879×10⁵ 8,626×10^-4

Пример 9. Определение эпитопов у моноклональных антител к PD-1

Моноклональные scFv-фаги, связывающиеся с антигеном PD1, культивировали в среде, содержащей 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, при 37°C в течение 16 часов. Полученные при этом клетки вносили в среду, содержащую 2×YTCM, 2% глюкозы и 5 мМ MgCl₂, при OD₆₀₀ = 0,1, а затем культивировали при 37°С в течение 2-3 часов до OD₆₀₀ = 0,5-0,7. Клетки инфицировали фагом-помощником M1 при MOI 1:20 и культивировали в среде, содержащей 2×YTCMK, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ IPTG, при 30°C в течение 16 часов.

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага (по 100 scFv-фагов) после культивирования в течение 16 часов, в дозе 100 мкл и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против M13-HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что выбранные одиночные клоны scFv-фагов, контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляли разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 19).

На 96-луночных иммунопланшетах фиксировали антиген PD1 дикого типа (WT) или некоторые варианты (фиг. 18) при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 ч, а затем блокировали лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Каждую лунку промывали 0,2 мл PBS/T, а затем вносили одиночный клон scFv-фага после культивирования в течение 16 ч в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, добавляли вторичное антитело против Fab в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что контрольный scFv-фаг и варианты PD-1 проявляют разные характеристики связывания, следовательно, они содержат разные эпитопы (фиг. 20).

Пример 10. Специфическое связывание исходного антитела к PD-1

Для определения способности к связыванию у исходного антитела к PD1 и контрольного антитела (ниволумаб) с другими антигенами, чем антиген PD1 (таблица 15), на 96-луночных иммунопланшетах фиксировали около 90 неспецифических антигенов при плотности 100 нг на лунку при 4°C в течение 16 часов и блокировали соответствующие лунки раствором PBS с 4% обезжиренного молока. Лунки промывали 0,2 мл PBS/T, а затем в каждую лунку вносили исходное антитело и контрольное антитело в дозе 100 мкл (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки опять промывали 4 раза по 0,2 мл PBS/T, а затем добавляли вторичное антитело против каппа с HRP в разведении 1:2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки 0,2 мл PBS/T проводили развитие окраски и измеряли поглощение при 490 нм.

В результате оказалось, что и контрольное антитело, и исходное антитело специфически связываются только с антигеном PD1 и не связываются с неспецифическими антигенами (фиг. 21).

Пример 11. Сравнение продуктивности в системе краткосрочной экспрессии моноклональных антител к PD1

Как оказалось, оптимизированные антитела обладают сравнительно однородной и высокой продуктивностью благодаря превосходным физическим свойствам при получении и очистке в системе краткосрочной экспрессии. Некоторые антитела обладают большей продуктивностью, чем обычные коммерчески доступные антитела (фиг. 22).

Пример 12. Повышение активности под действием моноклональных антител к PD1 при аллогенной реакции MLR

Смешивали Т-клетки с происходящими из моноцитов дендритными клетками, выделенными от разных людей, в соотношении 1:10 и культивировали в течение 5 дней, а затем измеряли количество γ-интерферона в культуральной среде. При этом культуральные среды, содержащие исходные антитела 45D6 и 49A2, проявляли зависимое от концентрации повышение количества γ-интерферона (фиг. 23).

Пример 13. Испытание моноклональных антител к PD1 на термостабильность

Белок антител разводили в DPBS до 3 мкМ, отбирали 45 мкл и смешивали с 5 мкл 200-кратного красителя Sypro Orange (#S6650, Thermo), а затем по 50 мкл вносили в пробирки для qPCR (#B77009, B57651, Bioplastics). Проводили количественный ПЦР (qPCR) в реальном времени на установке BioRad CFX96. Условия qPCR задавали следующим образом: реакция при 25°C в течение 30 сек, повышение температуры на 1°C вплоть до 99°C и в то же время реакция при каждой температуре в течение 1 мин, а затем заключительная реакция при 25°C в течение 10 сек. В качестве константы, характеризующей разупорядочение структуры антител, использовали Tm (температура плавления). Результаты представлены ниже в таблице 16.

Таблица 16

Образец Tm Пембролизумаб 63 Опдиво 64 45D6 63 49A2 63 49A2-2B9 64

Промышленная применимость

Новые антитела, связывающиеся с PD-1, либо их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут связываться с PD-1 и ингибировать активность PD-1, поэтому они применимы для разработки иммунотерапевтических средств от различных заболеваний, связанных с PD-1.

Хотя конкретные конфигурации настоящего изобретения были описаны подробно, однако специалистам в данной области должно быть ясно, что данное описание приводится в качестве предпочтительных воплощений для иллюстративных целей и не должно рассматриваться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и её эквивалентами.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Y-BIOLOGICS INC.

<120> NOVEL ANTIBODY AGAINST PROGRAMMED CELL DEATH PROTEIN (PD-1), AND

USE THEREOF

<130> PF-B2149

<140> PCT/KR2017/008494

<141> 2017-08-07

<150> KR10-2016-0100210

<151> 2016-08-05

<160> 420

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 4

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 5

Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn Ala

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 8

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 10

Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Ser

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 11

Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr Ile

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Ala

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr Ala

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 14

Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 15

Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Gly Asp His Pro

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 17

Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr Ala

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 18

Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn Ala

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 19

Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr Ala

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr Ala

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 21

Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr Ala

1 5

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 22

Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr Ala

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 23

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 24

Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr Ala

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 25

Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr Ala

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 26

Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr Ala

1 5

<210> 27

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 27

Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr Ala

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Ala

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 29

Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr Ala

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 30

Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr Ala

1 5

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 31

Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys

1 5

<210> 32

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 32

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 33

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 34

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile

1 5

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 35

Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 36

Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala

1 5

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 37

Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 38

Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala

1 5

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 39

Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 40

Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr

1 5

<210> 41

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 41

Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 42

Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr

1 5

<210> 43

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 43

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile

1 5

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 44

Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile

1 5

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 45

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 46

Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 47

Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 48

Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 49

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 50

Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys

1 5

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 51

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 52

Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 53

Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys

1 5

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 54

Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 55

Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys

1 5

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 56

Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys

1 5

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 57

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr

1 5

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 58

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser

1 5

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 59

Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 60

Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 61

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 61

Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val

1 5 10

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 62

Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 63

Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 64

Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp

1 5 10 15

Thr

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 65

Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 66

Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn

1 5 10

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 67

Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val

1 5 10 15

<210> 68

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 68

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

1 5 10 15

Phe Asp Met

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 69

Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val

1 5 10

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 70

Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser

1 5

<210> 71

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 71

Ala Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 72

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 73

Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 74

Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala

1 5

<210> 75

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 75

Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 76

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 76

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser

1 5 10

<210> 77

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 77

Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 78

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 78

Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly Thr Phe

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 79

Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 80

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 81

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 82

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 82

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 83

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 83

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 84

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 85

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 85

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 86

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 86

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 87

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 87

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 88

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 88

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 89

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 89

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 90

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 90

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 91

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 92

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 93

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 94

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 95

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 96

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 96

Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 97

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 97

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 98

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 98

Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 99

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 99

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 100

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 100

Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 101

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 101

Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 102

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 102

Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Asp

<210> 103

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 103

Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Ile

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 104

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 105

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Trp

<210> 106

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 106

Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Leu

<210> 107

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 107

Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 108

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 108

Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 109

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10 15

Asn

<210> 110

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 110

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly

1 5 10 15

Glu

<210> 111

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 111

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly

<210> 112

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 112

Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

1 5 10 15

Phe

<210> 113

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 113

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr

1 5 10 15

Val

<210> 114

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 114

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 115

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 115

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 116

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 116

Val Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 117

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 117

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 118

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 118

His Ser Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 119

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 119

Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val

1 5 10 15

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 120

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 120

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 121

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 121

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 122

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 122

Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr

1 5 10 15

Ser Thr Ser Ser Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 123

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 123

Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 124

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 124

Gly Tyr Ala Gln Thr Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr

1 5 10 15

Ser Ile Asp Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 125

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 125

Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

35

<210> 126

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 126

Thr Tyr Ala Gln Asn Phe Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys

1 5 10 15

Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 127

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 127

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 128

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 128

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 129

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 129

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 130

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 130

Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys

1 5 10 15

Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 131

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 131

Gly Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 132

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 132

Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

1 5 10 15

Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

20 25 30

Glu Asp Thr Ala Val Tyr

35

<210> 133

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 133

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 134

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 134

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Met Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 135

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 135

Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 136

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 136

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 137

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 137

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 138

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 138

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 139

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 139

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 140

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 140

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 141

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 141

Trp Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 142

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 142

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 143

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 143

Trp Gly Gln Gly Thr Met Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 144

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 144

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 145

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 145

Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 146

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 146

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 147

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 148

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 148

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gln Gln Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 149

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 149

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ile Arg Gln Ile Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 150

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 150

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Pro Xaa Ser Arg Ser Arg Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 151

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 151

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Val Tyr Ala Asp Ser Met

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Xaa Thr Ser Pro Leu Asp Met Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 152

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 152

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Leu His Gln Met Asn Glu His Glu Phe Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 153

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 153

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Leu Phe Ser Thr Ala His Ser Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys His Lys Gly Leu Pro Phe Asp Trp Ser Pro Asp Gly Phe Asp

100 105 110

Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 154

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 154

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Asn

20 25 30

Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Asp Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ala Asp Val Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ile Glu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 155

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 155

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 156

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 156

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Thr Ser Gly Pro Phe Gly Glu Phe Arg Asn Trp Gly Leu Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 157

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 157

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Met His Thr Phe Ser Val Gln Tyr Phe Leu Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 158

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 158

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 159

<211> 126

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Ser Tyr

20 25 30

Tyr Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Ser Ser Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Tyr Tyr Tyr Asp Thr

100 105 110

Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 160

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 160

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ala Leu Thr Pro Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Pro

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 161

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 161

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Ala Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Leu His Ala Asp Ser Gly Lys Thr Gly Tyr Ala Gln Thr Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr His Trp Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 162

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 162

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Phe Ser Gly Gly Thr Thr Lys Tyr Lys Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Glu Gln Phe Leu Ile Ala Leu Ala Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 163

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 163

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Ile Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Ile Pro Thr Leu Gly Leu Thr Thr Tyr Ala Gln Asn Phe

50 55 60

Gln Asp Thr Val Thr Ile Ile Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Ile Thr Val Ser Ser

115

<210> 164

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 164

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Gly Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 165

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 165

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 166

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 166

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Trp Asn Ser His Asn Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Thr Ser Gly Leu Gly Val His Ala Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 167

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 167

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Phe Gly Gly His Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 168

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 168

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Asp Gly Ser Tyr Trp Gly Tyr Phe Asp Ser Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Pro Ile Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 169

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 169

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asn Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly His Asn Tyr Leu Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 170

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 170

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp His

20 25 30

Pro Leu Thr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Glu Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ser Val Ser Tyr Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Gln Gly

100 105 110

Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 171

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 171

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 172

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 172

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asn Asn

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 173

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 173

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 174

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 174

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Ile Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ala His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 175

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 175

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 176

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 176

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Tyr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 177

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 177

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 178

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 178

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 179

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 179

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Val Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 180

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 180

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Gln His Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 181

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 181

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 182

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 182

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 183

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 183

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser His Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 184

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 184

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Phe Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 185

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 185

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 186

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 186

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 187

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 187

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Arg Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 188

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 188

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 189

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 189

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Thr Thr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 190

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 190

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 191

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 191

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 192

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 192

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 193

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 193

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Pro Thr Thr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 194

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 194

ccaggatggt tcttagactc ccc 23

<210> 195

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 195

caccagggtt tggaactggc 20

<210> 196

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 196

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 197

<211> 233

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 197

Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro

1 5 10 15

Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe

50 55 60

Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu

65 70 75 80

Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

85 90 95

Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys

100 105 110

Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser

115 120 125

Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro

145 150 155 160

Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn

165 170 175

Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met

180 185 190

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser

195 200 205

Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

225 230

<210> 198

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 198

Arg Asp Ile Ser Arg Trp

1 5

<210> 199

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 199

Gln Ser Leu Val His

1 5

<210> 200

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 200

Gln Ala Ile Ser Asn Trp

1 5

<210> 201

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 201

Ala Leu Ser Lys Gln Tyr

1 5

<210> 202

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 202

Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn Ala

1 5

<210> 203

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 203

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 204

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 204

Gln Gly Ile Val Ser Trp

1 5

<210> 205

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 205

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 206

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 206

Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 207

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 207

Thr Phe Asn Ile Gly Thr Thr Thr

1 5

<210> 208

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 208

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 209

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 209

Ser Leu Arg Thr Tyr Tyr

1 5

<210> 210

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 210

Asn Leu Arg Thr Lys Tyr

1 5

<210> 211

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 211

Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 212

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 212

Arg Ser Asn Phe Gly Ala Gly His Asp

1 5

<210> 213

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 213

Gln Ser Leu Leu Asp Ser His Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 214

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 214

Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Thr

1 5

<210> 215

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 215

Gln Ser Leu Phe Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 216

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 216

Gln Ser Leu Leu Tyr Ile Asp Gly Glu Thr Tyr

1 5 10

<210> 217

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 217

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Asn Tyr

1 5 10

<210> 218

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 218

Ala Leu Ser Lys Glu Tyr

1 5

<210> 219

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 219

Gln Ser Val Thr Ser Asp

1 5

<210> 220

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 220

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 221

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 221

Gln Ser Leu Leu Asp Arg Asp Gly Gly His Thr Tyr

1 5 10

<210> 222

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 222

Gln Ser Leu Leu Asp Arg Gly Gly Gly His Thr Tyr

1 5 10

<210> 223

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 223

Gly Ala Ser

1

<210> 224

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 224

Lys Ile Ser

1

<210> 225

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 225

Ala Thr Ser

1

<210> 226

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 226

Lys Asp Thr

1

<210> 227

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 227

Tyr Asp Asp

1

<210> 228

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 228

Gly Asn Ser

1

<210> 229

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 229

Arg Ala Ser

1

<210> 230

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 230

Thr Leu Ser

1

<210> 231

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 231

Ala Ala Ser

1

<210> 232

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 232

Asn Tyr Asp

1

<210> 233

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 233

Gly Lys Asn

1

<210> 234

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 234

Gln Asp Thr

1

<210> 235

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 235

Asp Val Ser

1

<210> 236

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 236

Gly Asn Asn

1

<210> 237

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 237

Arg Asp Asp

1

<210> 238

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 238

Glu Val Ser

1

<210> 239

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 239

Leu Gly Ser

1

<210> 240

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 240

Lys Asp Ser

1

<210> 241

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 241

Asp Ala Ser

1

<210> 242

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 242

Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 243

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 243

Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 244

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 244

Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 245

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 245

Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr Asp Val Ile

1 5 10

<210> 246

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 246

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val

1 5 10

<210> 247

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 247

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 248

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 248

Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 249

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 249

Leu Gln Arg Met Gly Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 250

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 250

Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Arg Thr

1 5

<210> 251

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 251

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Trp Leu

1 5 10

<210> 252

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 252

Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 253

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 253

Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ser Leu Val

1 5 10

<210> 254

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 254

Met Thr Trp Asp Val Asp Thr Thr Ser Met Ile

1 5 10

<210> 255

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 255

Ser Ser Phe Thr Ser Ser Ser Thr Val Val

1 5 10

<210> 256

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 256

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Gly

1 5 10

<210> 257

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 257

Met Gln Arg Ile Asp Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 258

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 258

Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Asn Gly Trp Val

1 5 10

<210> 259

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 259

Ser Ser Phe Ala Arg Asn Ser Asn Tyr Val

1 5 10

<210> 260

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 260

Met Gln Gly Ile His Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 261

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 261

Met Gln Gly Leu Gln Ile Pro Ser Thr

1 5

<210> 262

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 262

Gln Ser Val Asp Ser Ser Asp Thr Ser Val Val

1 5 10

<210> 263

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 263

Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 264

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 264

Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 265

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 265

Met Gln Arg Val Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 266

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 266

Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 267

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 267

Met Gln Arg Arg Asp Phe Pro Phe Thr

1 5

<210> 268

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 268

Met Gln Arg Lys Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 269

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 269

Met Gln Arg Ile His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 270

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 270

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 271

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 271

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 272

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 272

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 273

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 273

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 274

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 274

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly

20 25

<210> 275

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 275

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 276

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 276

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 277

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 277

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 278

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> QFVLTQSPSA SGTPGQNIVI SCSAS

<400> 278

Gln Phe Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Asn Ile Val Ile Ser Cys Ser Ala Ser

20 25

<210> 279

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 279

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp

20 25

<210> 280

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 280

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Asn Ile Ile Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 281

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 281

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr

20 25

<210> 282

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 282

Gln Phe Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser

20 25

<210> 283

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 283

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 284

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 284

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Arg

20 25

<210> 285

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 285

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 286

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 286

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr

20 25

<210> 287

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 287

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser

20 25

<210> 288

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 288

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Leu Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp

20 25

<210> 289

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 289

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

20 25

<210> 290

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 290

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro His Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 291

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 291

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 292

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 292

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Pro Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 293

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 293

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Met Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 294

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 294

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser

20 25

<210> 295

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 295

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 296

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 296

Leu Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

His

<210> 297

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 297

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 298

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 298

Ala Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 299

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 299

Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 300

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 300

Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 301

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 301

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 302

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 302

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 303

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 303

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 304

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 304

Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 305

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 305

Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 306

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 306

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Leu Leu Val Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 307

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 307

Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 308

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 308

Val His Trp Cys Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 309

Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 310

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 310

Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 311

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 311

Ser Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Met

1 5 10 15

Tyr

<210> 312

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 312

Val Ala Trp Tyr Gln His Ile Arg Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 313

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 313

Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 314

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 314

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 315

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 315

Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

1 5 10 15

Tyr

<210> 316

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 316

Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 317

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 317

Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 318

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 318

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 319

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 319

Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Gly Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 320

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 320

Arg Leu Thr Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Arg Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 321

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 321

Asp Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 322

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 322

Asp Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 323

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 323

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 324

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 324

Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Tyr Phe Cys

35

<210> 325

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 325

Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 326

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 326

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 327

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 327

Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 328

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 328

Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Thr Arg Asp Glu Ser

20 25 30

Thr Tyr Tyr Cys

35

<210> 329

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 329

Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 330

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 330

Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Glu Tyr Tyr Cys

35

<210> 331

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 331

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 332

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 332

Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly

1 5 10 15

Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 333

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 333

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 334

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 334

Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

1 5 10 15

Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 335

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 335

Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 336

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 336

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 337

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 337

Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala

20 25 30

Asp Tyr Tyr Cys

35

<210> 338

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 338

Asn Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 339

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 339

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 340

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 340

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 341

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 341

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 342

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 342

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 343

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 343

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 344

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 344

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Glu Phe Asn Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 345

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 345

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 346

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 346

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 347

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 347

His Arg Ala Leu Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asn Val Gly

20 25 30

Leu Tyr Tyr Cys

35

<210> 348

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 348

His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ser Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 349

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 349

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 350

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 350

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 351

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 351

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 352

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 352

His Arg Ala Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 353

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 353

Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Ile Tyr Tyr Cys

35

<210> 354

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 354

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 355

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 355

His Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser His

1 5 10 15

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 356

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 356

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 357

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 357

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 358

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 358

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210> 359

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 359

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

1 5 10

<210> 360

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 360

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 361

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 361

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 362

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 362

Val Arg Arg Arg Asp Gln Ala Asp Arg Pro

1 5 10

<210> 363

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 363

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 364

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 364

Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 365

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 365

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210> 366

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 366

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 367

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 367

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 368

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 368

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Arg Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 369

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 369

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Leu

20 25 30

Asn Trp Phe His Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile His

35 40 45

Lys Ile Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Thr Gln Phe Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 370

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 370

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Ser Asn Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asp Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 371

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 371

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Met Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ser Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Gly Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ile Thr Asp Lys Ser Gly Thr

85 90 95

Asp Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 372

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial Sequence

<400> 372

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Met Ser Glu Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Lys Ala Pro Thr Leu Leu

35 40 45