АНТИТЕЛА, СПОСОБНЫЕ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ КАННАБИНОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ 1 (CB1) Российский патент 2020 года по МПК C07K16/00 G01N33/543 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, способным связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), а также к способам применения таких антител и антигенсвязывающих фрагментов.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0002] Содержимое текстового файла, представленного здесь в электронном виде, полностью включено в настоящее описание посредством ссылки: копия списка последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: 15-343-PRO_Seq_List_2015-09-30_ST25, дата регистрации: 30 сентября 2015 г, размер файла 803 кб).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Каннабиноидный рецептор 1 (CB1) является членом суперсемейства рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR). Рецептор CB1 экспрессируется в центральной нервной системе (ЦНС), легких, печени, жировой ткани и почках и участвует в развитии многих заболеваний человека, включающих, в числе прочих, ожирение, диабет, фиброз, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания, рак, боль, спастичность MS и глаукому. Более конкретно, показано, что активность рецептора CB1 выполняет вредную роль, например, при ожирении, диабете, фиброзе, заболеваниях печени, сердечно-сосудистых заболеваниях и раке; а при болях, спастичности MS и глаукоме она выполняет благоприятную роль.

[0004] В данной участки существует потребность в новых антагонистах и агонистах рецептора CB1, подходящих для применения в терапевтических целях, а также в качестве селективных связывающих средств для целей диагностики/визуализации. В частности, желательно получить соединение, специфичное к рецептору CB1, но не способное проникать в ЦНС, поскольку оно может уменьшить потенциальные опосредуемые ЦНС побочные эффекты модуляции рецептора CB1, такие как психиатрические неблагоприятные явления, связанные с обратным агонистом CB1, римонабантом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, способным связываться с каннабиноидным рецептором 1 (также называемым здесь "рецептор CB1" или "CB1"). В некоторых вариантах осуществления рецептор CB1 представляет собой человеческий рецептор CB1. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент распознает один или несколько внеклеточных эпитопов на рецепторе CB1. В некоторых вариантах воплощения описанные здесь антитела, связывающие рецептор CB1, и их фрагменты представляют собой функциональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты ингибируют или увеличивают сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты представляют собой антагонистические антитела, которые ингибируют сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты представляют собой агонистические антитела, которые усиливают сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты являются модуляторами сигнальной активности рецептора CB1, или аллостерическими модуляторами сигнальной активности рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты представляют собой селективные связывающие средства, не обладающие агонистической или антагонистической активностью. В некоторых вариантах осуществления антитела, связывающие CB1, или их фрагменты представляют собой селективные связывающие средства, не обладающие агонистической или антагонистической активностью, которые можно использовать для диагностики и/или визуализации.

[0006] Выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, в некоторых вариантах осуществления обладают по меньшей мере такой же активностью, как низкомолекулярные модуляторы рецептора CB1, такие как, например, AM6545, AM251 или римонабант. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты обладают способностью ингибировать или активировать рецептор CB1, которая по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз или, по меньшей мере, в 20 раз превышает способность малых молекул AM6545, AM251 или римонабанта. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты ингибируют передачу сигнала, опосредованную агонистом рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления ингибирование передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, измеряют путем определения уровней внутриклеточного цАМФ и/или последующего фосфорилирования ERK.

[0007] В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают преимуществом, которое заключается в снижении или отсутствии способности проникать в мозг. В некоторых вариантах осуществления способность выделенных антител и их антигенсвязывающих фрагментов проникать в мозг ниже, чем у низкомолекулярных агонистов или антагонистов рецептора CB1 (таких как AM6545, AM251 или римонабант). В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела, связывающие рецептор CB1, и их фрагменты обеспечивают терапевтическое улучшение при более низком уровне побочных эффектов со стороны центральной нервной системы по сравнению с низкомолекулярными агонистами или антагонистами рецептора CB1. Связанные с ЦНС побочные эффекты низкомолекулярного антагониста рецептора CB1 римонабанта включают тревогу, депрессию, возбуждение, расстройства пищевого поведения, раздражительность, агрессию и бессонницу (Moreira, 2009, Rev Bras Psiquiatr., 31 (2): 145-53).

[0008] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты получают в гибридомных клеточных линиях. В других вариантах осуществления описанные здесь выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты получают из библиотек фаговых дисплеев.

[0009] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают сродством к нативному человеческому рецептору CB1, которое находится, по меньшей мере, в нМ-диапазоне. Например, в некоторых вариантах осуществления сродство к рецептору CB1 составляет примерно 1 мкМ или менее, или примерно 750 нМ или менее, или примерно 500 нМ или менее, или примерно 250 нм или менее, или примерно 100 нМ или менее, или примерно 75 нМ или менее, или примерно 50 нМ или менее, или примерно 25 нМ или менее, или примерно 10 нМ или менее, или примерно 1 нМ или менее. В других вариантах осуществления описанные здесь выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают сродством к рецептору CB1, которое составляет примерно 15 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают сродством к человеческому рецептору CB1, которое составляет примерно от 0,01 нМ до 500 нМ, примерно от 0,02 нМ до 250 нМ, примерно от 0,02 до 200 нМ, примерно от 0,05 до 100 нМ, примерно от 0,05 до 50 нМ.

[0010] Выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения могут быть получены из любых видов, включающих, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, хомяков, морских свинок, приматов, лам или людей. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой мышиные антитела. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой химерные антитела. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой полностью человеческие антитела.

[0011] В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой описанные здесь гуманизированные или химерные антитела P1C4. В одном варианте осуществления гуманизированные антитела P1C4 выбраны из группы, состоящей из описанных здесь P1C4-H0, P1C4-H2 и P1C4-H4. В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат модификации Fc, которые приводят к уменьшению, ослаблению или устранению эффекторной функции антитела. В следующем варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты выбраны из группы, состоящей из гибрида P1C4-H0-IgG2-4, P1C4-H0-IgG2A330S/P331S, P1C4-H0-IgG4S228P, гибрида P1C4-H2-IgG2-4, P1C4-H2-IgG2A330S/P331S, P1C4-H2-IgG4S228P, гибрида P1C4-H4-IgG2-4, P1C4-H4-IgG2A330S/P331S, P1C4-H4-IgG4S228P.

[0012] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49 и 57. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50 и 58. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит константный участок тяжелой цепи, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO. 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51 и 59. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 и 60. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает вариабельный участок легкой цепи, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53 и 61. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54 и 62. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55 и 63. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, включает константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 и 64.

[0013] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7.

[0014] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0015] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15.

[0016] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

[0017] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 19; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 21; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 23.

[0018] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[0019] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 25; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 27; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 29; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 31.

[0020] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.

[0021] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 33; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 35; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 37; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 39.

[0022] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

[0023] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 41; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 43; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 45; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 47.

[0024] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

[0025] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 49; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 51; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 53; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 55.

[0026] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.

[0027] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 57; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 59; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 61; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 63.

[0028] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

[0029] В одном варианте осуществления изобретение предлагает выделенное антитело или его фрагмент, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-351.

[0030] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит определяющие комплементарность участки (CDR) тяжелой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR легкой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0031] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой гуманизированное антитело, содержащее определяющие комплементарность участки (CDR) тяжелой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой гуманизированное антитело, содержащее определяющие комплементарность участки (CDR) легкой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0032] В одном варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, состоит по существу из аминокислотной последовательности, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 339-341. В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-341. В следующем варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, состоит по существу из аминокислотной последовательности, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-341.

[0033] В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351. В следующем варианте осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, состоит по существу из аминокислотной последовательности, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351.

[0034] В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 337. В следующем варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, состоит по существу из аминокислотной последовательности, или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 337. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 338. В еще одном варианте осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, состоит по существу из аминокислотной последовательности, или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 338.

[0035] В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает гуманизированное выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связывать CB1. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 337 и вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 339. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 337 и вариабельной участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 340. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 337 и вариабельной участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 341. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит полноразмерную легкую цепь SEQ ID NO: 338 и полноразмерную тяжелую цепь, последовательность которой выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351.

[0036] В других вариантах осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 829, 830, 831 или 832. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 829, 830, 831 или 832 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 437.

[0037] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 352 (YYWMN). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR2 тяжелой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 353 (QIYPGDGETKY). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 354 (SHGNYLPY). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR1 легкой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 355 (SSYLH). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR2 легкой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 356 (STSNLAS). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR3 легкой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 357 (HQ YHRSPPTF).

[0038] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 352, 353 и 354 соответственно. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 355, 356 и 357 соответственно. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 и 357 соответственно. В еще одном варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент являются химерными или гуманизированными.

[0039] В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833. В других вариантах осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR2 легкой цепи, выбранный из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 694, 834 и 835. В других вариантах осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR3 легкой цепи, выбранный из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 779 и 836.

[0040] В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833, CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 694, и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 836.

[0041] В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833, CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 835, и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 836.

[0042] В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833, CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 694, и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357.

[0043] В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 833, CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 834, и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 779.

[0044] В другом варианте осуществления настоящего изобретения раскрывается выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способный связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 355 или 833; CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356, 694, 834 или 835; и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, 779 или 836.

[0045] Для специалист в данной области очевидно, что CDR тяжелых и легких цепей описанных здесь антител можно выбирать или смешивать и спаривать независимо, с получением антитела или его связывающего фрагмента, содержащего любые CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи; и любые CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи описанных здесь антител. Специалисту в данной области также известно, что вариабельные участки тяжелых и легких цепей описанных здесь антител можно выбирать или смешивать и спаривать независимо, с получением антитела или его связывающего фрагмента, содержащего любую тяжелую и легкую цепь описанных здесь антител.

[0046] В одном варианте осуществления описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой химерное антитело, или его фрагмент, содержащее CDR тяжелых и легких цепей, выбранные из описанных здесь CDR или консервативных вариантов описанных здесь CDR. В другом варианте осуществления описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой гуманизированное антитело, или его фрагмент, содержащее CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из описанных здесь CDR или консервативных вариантов описанных здесь CDR. В одном варианте осуществления предлагаемое здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, содержащую описанную здесь последовательность, или ее консервативный вариант. В одном варианте осуществления консервативные варианты по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичны описанной здесь стандартной последовательности. В одном варианте осуществления консервативные варианты содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных замен, вставок или делеций.

[0047] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает CB1 и выполняет эффекторную функцию на пониженном уровне. В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает CB1 и содержит одну или несколько модификаций в участке Fc. В следующем варианте осуществления антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает CB1 и содержит аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько мутаций в участке Fc. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит мутацию в положении 228, и/или 330, и/или 331. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит мутацию в положении 228 участка Fc, где Fc-участок относится к изотипу IgG4. В следующем варианте осуществления мутация представляет собой S228P. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит мутацию в положении 330, и/или в положении 331. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит мутацию в положении 330, и/или 331, где Fc-участок относится к изотипу IgG2. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит следующие мутации в участке Fc: A330S и P331S. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит Fc-участок, который представляет собой гибридный участок Fc. Например, в одном варианте осуществления участок Fc представляет собой гибридный участок Fc IgG2/IgG4, где CH1 и шарнирные участки получены из IgG2, а участки CH2 и CH3 получены из IgG4.

[0048] Таким образом, в одном варианте осуществления предлагаемое здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой химерное или гуманизированное антитело, или фрагмент, содержащий участки CDR тяжелых и легких цепей, выбранные из описанных здесь CDR или консервативных вариантов описанных здесь CDR, где выделенное антитело, или его фрагмент, содержит участок Fc, содержащий модификации, которые изменяют эффекторные функции антитела. Например, в одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR легкой и тяжелой цепи SEQ ID NO: 352-357, или их консервативные варианты, и дополнительно содержит гибридный участок Fc IgG2-IgG4, Fc-участок IgG2, содержащий аминокислотные мутации в положениях 330 и 331 (например, A330S и P331S), или Fc-участок IgG4, содержащий аминокислотную мутацию в положении 228 (например, S228P).

[0049] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связываться с CB1, где антитело, или его фрагмент, обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 70 нМ или менее, примерно 60 нМ или менее, примерно 50 нМ или менее, примерно 40 нМ или менее, примерно 30 нМ или менее, примерно 25 нМ или менее, примерно 20 нМ или менее, примерно 15 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 8 нМ или менее, примерно 6 нМ или менее, примерно 5 нМ или менее, примерно 4 нМ или менее, примерно 3 нМ или менее, примерно 2 нМ или менее, или примерно 1 нМ или менее. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу, или его фрагменту, способному связываться с CB1, где антитело или его фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd в диапазоне примерно от 1 нМ до 100 нМ, примерно от 2 нМ до 75 нМ, примерно от 3 нМ до 50 нМ, примерно от 4 нМ до 10 нМ, или обладает сродством к рецептору CB2, характеризующимся Kd примерно 50 нМ, или примерно 40 нМ, или примерно 30 нМ, или примерно 20 нМ, или примерно 10 нМ, или примерно 5 нМ, или примерно 4 нМ, или примерно 3 нМ, или примерно 2 нМ, или примерно 1 нМ.

[0050] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, активность которого по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере 13 раз, по меньшей мере в 14 раз, или по меньшей мере в 15 раз превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где активность антитела, или фрагмента, или римонабанта измеряют путем ингибирования передачи сигнала, опосредованной антагонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ. В следующем варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, являются гуманизированными.

[0051] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному гуманизированному антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связываться с CB1, где антитело или фрагмент обладает более высоким сродством и/или более высокой активностью, чем соответствующее негуманизированное или химерное антитело, где гуманизированное антитело, или его фрагмент, и соответствующее не гуманизированное или химерное антитело содержат одинаковые CDR тяжелых и легких цепей. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу, или его фрагменту, содержащему CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 и 357 соответственно, где гуманизированное антитело обладает более высоким сродством к рецептору CB1 и/или более высокой способностью ингибировать агонист рецептора CB1. В одном варианте осуществления активность описанных здесь гуманизированных антител и фрагментов превышает активность соответствующего не гуманизированного или химерного антитела по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В следующем варианте осуществления активность измеряют путем ингибирования продукции CB1-цАМФ.

[0052] Активность описанных здесь антител против рецептора CB1 можно измерить с помощью любого известного в данной области способа. Например, в одном варианте осуществления активность описанных здесь антител и фрагментов измеряют по уровню внутриклеточного цАМФ или по фосфорилированию ER. Например, активность можно измерить по уровню ингибирования продукции цАМФ с помощью функционального анализа цАМФ (Cisbio) или по ингибированию WIN55,212-индуцированного фосфорилирования ERK методом вестерн-блоттинга.

[0053] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному конкурировать с раскрытым здесь антителом, или его антигенсвязывающими фрагментами, за связывание с рецептором CB1. В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному специфически связываться по существу с тем же эпитопом рецептора CB1, что и описанные здесь антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Такие антитела можно идентифицировать с помощью обычных анализов конкурентного связывания. В некоторых вариантах осуществления конкуренцию измеряют методом ELISA, проточной цитометрии или поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

[0054] В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты конъюгируют с одним или несколькими средствами, выбранными из группы, включающей другое терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекулу иммуноадгезии и визуализирующее средство. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство выбирают из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0055] В одном аспекте изобретение предлагает способы модуляции сигнальной активности рецептора CB1, включающие приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с описанным здесь антителом или его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы приводят к ингибированию сигнальной активности рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления описанные способы приводят к повышению сигнальной активности рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления модуляция сигнальной активности рецептора CB1 является косвенной, например, модуляция под действием аллостерического модулятора. В некоторых вариантах осуществления модуляция сигнальной активности рецептора CB1 оказывает влияние на сигнальный путь, опосредуемый Galpha i/o, но не на сигнальный путь, опосредуемый бета-аррестином.

[0056] В одном аспекте изобретение предлагает способы лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическую или агонистическую активность в отношении рецептора CB1, у индивидуума, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение индивидууму описанного здесь антитела против рецептора CB1, или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления индивидуум является млекопитающим. В следующем варианте осуществления индивидуум является человеком. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляют собой ожирение, диабет, дислипидемию, метаболическое заболевание, фиброз, безалкогольный стеатогепатит (NASH), заболевание печени, первичный билиарный цирроз, заболевание почек, фиброз почек, хроническое заболевание почек, остеопороз, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, воспалительное заболевание, боль, спастичность MS и заболевание глаза, такое как глаукома. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой, например, ожирение, диабет, фиброз, заболевание печени, сердечно-сосудистое заболевание или рак, а предлагаемый способ приводит к ингибированию активности рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой, например, боль или глаукому, а предлагаемый способ приводит к активации или увеличению активности рецептора CB1.

[0057] В одном аспекте предложен способ детектирования рецептора CB1 в клетке, ткани или организме индивидуума, причем способ включает приведение клетки в контакт с описанным здесь антителом, связывающим рецептор CB1, или его антигенсвязывающим фрагментом. В одном варианте осуществления клетка находится в организме индивидуума. В другом варианте осуществления клетка находится в организме человека. В другом варианте осуществления уровень экспрессии рецептора CB1 на клетках коррелирует с болезненным состоянием. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способам применения антител и их фрагментов, способных специфически связываться с рецептором CB1, в качестве инструментов для диагностики и/или прогнозирования заболеваний человека. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам визуализации рецептора CB1, включающим применение описанных здесь антител против рецептора CB1 и их фрагментов. В одном варианте осуществления способ детекции рецептора CB1 включает применение описанного здесь антитела против рецептора CB1, способного селективно связывать рецептор CB1. В следующем варианте осуществления селективное антитело против рецептора CB1 или его фрагмент не обладает агонистической или антагонистической активностью. В другом варианте осуществления селективное антитело против рецептора CB1, или его фрагмент, не интернализуется. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностическим и визуализирующим способам, включающим применение антитела против рецептора CB1, или его фрагмента, конъюгированного с визуализирующим средством, таким как, например, радиоактивная метка, фермент, флуоресцентная метка, люминесцентная метка, биолюминесцентная метка, магнитную метку или биотин.

[0058] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, экспрессирующей выделенное антитело, или его фрагмент, способное специфически связываться с рецептором CB1. В другом варианте осуществления изобретение предлагает способ получения антитела, или его фрагмента, способного специфически связываться с рецептором CB1, причем способ включает иммунизацию млекопитающих очищенным рецептором CB1 или его антигенным фрагментом, комплексами CB1/липид, iCAPS рецептора CB1 и/или ДНК рецептора CB1. В следующем варианте осуществления иммунизированные млекопитающие представляют собой мышей. В другом варианте осуществления млекопитающих иммунизируют один, два, три, четыре, пять или более раз очищенным CB1 или его антигенным фрагментом, комплексом CB1/липид, iCAPS рецептора CB1 и/или ДНК рецептора CB1, и затем собирают клетки иммунизированных млекопитающих. В следующем варианте осуществления антитело, или его фрагмент, способное специфически связываться с рецептором CB1, получают из гибридомной линии клеток, содержащей клетки, полученные из иммунизированных млекопитающих. В другом варианте осуществления антитело, или его фрагмент, способное специфически связываться с рецептором CB1, получают из библиотеки фагового дисплея. В следующем варианте осуществления библиотеку фагового дисплея получают из клеток, выделенных из иммунизированных млекопитающих. В следующем варианте осуществления библиотеку фагового дисплея получают из наивных последовательностей человеческих иммуноглобулинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0059] На фигуре 1А приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание mAb P2A12 Bril (левый столбец), PA2LR3-P2D3 (средний столбец) или PA2R3-P1A7 (правый столбец) в концентрации 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с линией клеток Trex-CHO, несущих нативный человеческий CB1 (экспрессирующих нативный рецептор CB1, темно-серые линии), Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средне серые линии), или с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1B приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2R3-P1F1 (левый столбец), PA2LR3-P2E5 (средний столбец) или PA2LR3-P3B10 (правый столбец) в концентрации 300 нм (верхний ряд) или 30 нм (нижний ряд) с линией клеток Trex-CHO, несущих нативный CB1 (экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, темно-серые линии), Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средне-серые линии), или с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1, светло-серые линии). На фигуре 1С приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P3B8 (левый столбец) или PA2LR3-P1H4 (правый столбец) в концентрации 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с линией клеток Trex-CHO, несущих нативный человеческий CB1 (экспрессирующих нативный рецептор CB1, темно-серые линии), Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средне-серые линии), или с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1, светло-серые линии). На фигуре 1D приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P4B1 (левый столбец), PA2LR3-P4B5 (средний столбец) или PA2LR3-P4C6 (правый столбец) в концентрации 300 нм (верхний ряд) или 30 нм (нижний ряд) с линией клеток Trex-CHO, несущих нативный человеческий CB1 (экспрессирующих нативный рецептор CB1, темно-серые линии), Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средне-серые линии), или с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1, светло-серые линии). На фигуре 1E приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P4G10 (левый столбец) или PA2LR3-P6D7 (правый столбец) в концентрации 300 нм (верхний ряд) или 30 нм (нижний ряд) с линией клеток Trex-CHO, несущих нативный человеческий CB1 (экспрессирующих нативный рецептор CB1, темно-серые линии), Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средне-серые линии), или с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1, светло-серые линии). На фигуре 1F приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P1G6 (левый столбец), PA2LR3-P1H4 (средний столбец) или PA2LR3-P2B8 (правый столбец) с линией исходных клеток Trex-CHO (не экспрессирующих рецептор CB1, верхний ряд), с линией клеток Trex-CHO, несущих CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, средний ряд) или с линией клеток Trex-CHO A156 (экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, нижний ряд).

[0060] На фиг. 2 показана селективность двух антител против рецептора CB1, PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2, с которой они связываются с клетками, экспрессирующими CB1. На фиг. 2A (где изображено связывание PA13R3-P1C4) и на фиг. 2B (где изображено связывание 36E12B6C2) показано, что оба антитела связываются с A156 (экспрессирующими нативный человеческий рецептор CB1) и в еще большей степени с A56 (экспрессирующими на повышенном уровне рецептор CB1, содержащий мутацию T210A и замену ICL3 партнером по гибридизации), но не связываются с клетками СНО, не экспрессирующими рецептор CB1, клеточной линией, экспрессирующей CB2, или клеточной линией, экспрессирующей 5HT2b. Экспрессию CB2 (фиг. 2C) и 5HT2b (фиг. 2D) подтверждают в клеточных линиях, экспрессирующих CB2 и 5HT2b соответственно.

[0061] На фиг. 3 показаны результаты конкурентного анализа, позволяющие определить, связываются ли 36E12B6C2 и P1C4 с аналогичными эпитопами. Клетки Trex CHO A156, экспрессирующие нативный человеческий CB1, инкубируют с конкурирующими IgG (IgG или Fab PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2) и затем с окрашивающими IgG в разных концентрациях (300 нМ или 75 нМ P1C4, фиг. 3A, 80 нМ или 25 нМ 36E12B6C2, фиг. 3B).

[0062] На фиг. 4 показаны результаты функционального антагонистического анализа цАМФ. Антитела 36E12B2H8 (фиг. 4A) и PA13R3-P1C4 (фиг. 4B) проявляют такую же (36E12B2H8) или более высокую (PA13R3-P1C4) антагонистическую активность, что и используемые в качестве положительных контролей низкомолекулярные ингибиторы рецептора CB1 AM251 (фиг. 4C), SR141716A (римонабант) (фиг. 4D) и AM6545 (фиг. 4E). P2A12 и гибридому, продуцирующую изотип IgG, используют в качестве отрицательных контролей (фиг. 4F и 4G).

[0063] На фиг. 5А представлен ряд результатов вестерн-блоттинга, показывающих фосфорилированный ERK (pERK) и общий ERK в клетках Trex-CHO, экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, после экспрессии рецептора CB1 и обработки контрольным IgG, используемым в качестве положительного контроля низкомолекулярным AM6545, или полученными с использованием фагов mAb PA13R3-P1C4 или PA13R3-P1E4, с последующей обработкой агонистом рецептора CB1 WIN55212 в концентрации 100 нМ. Показаны результаты вестерн-блоттинга, полученные через 10 минут после активации WIN55212 (левые панели), или через 15 минут после активации WIN55212 (правые панели). На фиг. 5B представлен ряд результатов вестерн-блоттинга, показывающих pERK и общий ERK в клетках Trex-CHO, экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, после экспрессии рецептора CB1 и обработки контрольным IgG1, контрольным IgG2, WIN55212, AM6545 или гибридомным mAb 36E12B2E5, 36E12B6C2 или 36E12B2F2, с последующей активацией WIN55212.

[0064] На фиг. 6А показаны результаты функционального анализа цАМФ, проведенного в отсутствии CP55940 с целью оценки потенциальной агонистической активности PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 и PA2LR3-P6G6, по сравнению с контролями, изображенными на фиг. 6B: CP55940 (положительный контроль), P2A12 (отрицательный контроль) или PA2R3-P1A7 (отрицательный контроль). На фиг. 6С показаны результаты функционального анализа цАМФ, проведенного в присутствии CP55940 с целью оценки активности потенциального аллостерического модулятора PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 и PA2LR3-P6G6 по сравнению с контролями, изображенными на фиг. 6D: только CP55940 (положительный контроль), P2A12 (отрицательный контроль) или PA2R3-P1A7 (отрицательный контроль).

[0065] На фиг. 7 показаны результаты анализа цАМФ, проведенного с целью оценки активности обратного агониста или нейтрального антагониста PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2. AM6545 и SR141716A используют в качестве положительных контролей для нейтрального антагониста и обратного агониста соответственно.

[0066] На фиг. 8А показан анализ связывания iCAPS методом ELISA, с помощью которого оценивают связывание Fab (верхняя левая панель) или IgG (верхняя правая панель) 36E12B6C2 или Fab (нижняя левая панель) или Fab (нижняя правая панель) P1F7 с rBril-0918, пустыми iCAPS, iCAPS, которые не экспрессируют рецептор CB1 (h13h iCAPS), или iCAPS, которые экспрессируют человеческий рецептор CB1 (A138 iCAPS и A139 iCAPS). На фиг. 8В показан анализ связывания iCAPS методом ELISA, с помощью которого оценивают связывание Fab (верхняя левая панель) или IgG (верхняя правая панель) PA13R3-P1C4 или Fab (нижняя левая панель) или Fab (нижняя правая панель) P1F7 с rBril-0918, пустыми iCAPS, iCAPS, которые не экспрессируют рецептор CB1 (h13h iCAPS), или iCAPS, которые экспрессируют человеческий рецептор CB1 (A138 iCAPS и A139 iCAPS).

[0067] На фиг. 9А и 9В показана интернализация рецептора CB1 после обработки разными способами. На фиг. 9А показано, что антитела против CB1 не блокируют WIN55212-индуцированную интернализацию рецептора. Верхний ряд гистограмм на фиг. 9A показывает поверхностную экспрессию CB1 после обработки WIN55212 или контролем, или после предварительной обработки CB1-специфичным нейтральным антагонистом AM6545 и затем WIN55212. Средний и нижний ряды гистограмм на фиг. 9А демонстрируют поверхностную экспрессию CB1 после предварительной обработки антителами против CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6E12, PA2LR3-P6G7, PA3R3-P4D5, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 и PA2LR3-P4G10, или отрицательным контролем P2A12 с последующей обработкой WIN55212. На фиг.9В показано, что используемые отдельно антитела против CB1 не индуцируют интернализацию рецептора CB1. Верхний ряд гистограмм на фиг. 9В показывает поверхностную экспрессию CB1 после обработки WIN55212 или контролем, или после предварительной обработки CB1-специфичным нейтральным антагонистом AM6545 и затем WIN55212. Средний и нижний ряды гистограмм на фиг. 9В демонстрируют поверхностную экспрессию CB1 после обработки антителами против CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6B12, PA2LR3-P6G7, PA3R3-P4D5, PA2LR3- P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 и PA2LR3-P4G10, или отрицательным контролем P2A12.

[0068] На фиг. 10 показаны результаты функционального антагонистического анализа гуманизированных и химерных антител P1C4 путем определения цАМФ. Гуманизированное антитело P1C4-H0 обладает антагонистической активностью, подобной активности химерного антитела P1C4. Гуманизированные антитела P1C4-H4 и P1C4-H2 обладают антагонистической активностью, превышающей активность химерного антитела P1C4, или используемого в качестве положительного контроля низкомолекулярного ингибитора рецептора CB1 римонабанта.

[0069] На фиг. 11 показаны сродство связывания, перекрестная реакционноспособность и специфичность гуманизированных антител P1C4, измеренные методом проточной цитометрии. Гуманизированные антитела P1C4 P1C4-H2 и P1C4-H4 обладают превосходным сродством к клеткам, экспрессирующим нативный человеческий CB1 (фиг. 11A, верхняя панель), и к клеткам, экспрессирующим CB1 на повышенном уровне (фиг. 11A, нижняя панель), по сравнению с химерным антителом P1C4. Ни одно из химерных или гуманизированных антител не связывается с мышиными клетками, экспрессирующими мышиный CB1, исходными клетками TRex-CHO или клетками TRex-CHO, экспрессирующими человеческий CB2 (фиг. 11B).

[0070] На фиг. 12 показано сродство немеченого антитела P4B5 по сравнению с антителом P4B5, меченным Vivotag 680 XL, к CB1, присутствующему на клетках.

[0071] На фиг. 13А показаны результаты детекции меченого антитела P4B5 в сердце, легких, печени, почках, желудке, кишечнике и мочевом пузыре в моменты времени 0 ч, 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч (13A.1); и результаты детекции меченого антитела P4B5 в головном мозге в моменты времени 0 ч, 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч (13A.2). На фиг. 13В показаны результаты детекции меченого антитела в головном мозге, как в ткани, так и в крови (левая панель), и результаты детекции меченого антитела в головном мозге с вычитанием сигнала, полученного в крови (т.е. только ткань мозга; правая панель).

[0072] На фиг. 14 показаны профили SEC и результаты анализов SDS-PAGE для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4, экспрессированных в клетках 293 и CHO-K1. На фиг. 14А показаны профиль SEC (вверху) и результаты анализов SDS-PAGE (внизу) для одной из партий 293 FreeStyle. На фиг. 14B показаны профиль SEC (вверху) и результаты анализов SDS-PAGE (внизу) для одной из партий CHO-K1.

[0073] На фиг. 15 показаны функциональные анализы гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 по сравнению с исходными химерными mAb PA13R3-P1C4 и P2A12, которые представляют собой не специфичные к GPCR mAb, используемые в качестве отрицательного контроля изотипа IgG1.

[0074] На фиг. 16 показано сравнение активности гуманизированных вариантов P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 с римонабантом, AM6545 и антителом P2A12-IgG1, используемым в качестве отрицательного контроля, в клетках TRex-CHO CB1, стимулированных 1,5 мкМ форсколином (фиг. 16A), а также в клетках TRex-CHO CB1, стимулированных 5 мкМ форсколином (рис. 16B).

[0075] На фиг. 17 показано влияние повышающихся концентраций P1C4-h2-IgG4 на CP55940 (фиг. 17С). Также показаны графики Шильда для каждой обработки (фиг. 17В и 17D).

[0076] На фиг. 18А и 18В показаны результаты анализов активации ERK методом вестерн-блоттинга, которые проводят путем измерения способности гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 блокировать WIN55212-опосредованную активацию ERK.

[0077] На фиг. 19А показаны результаты исследования интернализации рецептора CB1 в использованием проточной цитометрии в разных условиях индукции, в отсутствии ингибитора (панель A), или в присутствии римонабанта (панель B) или гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 (панели C-G). На фиг. 19В показаны результаты того же анализа интернализации рецептора CB1, которые включают эффект P1C4-h2, клонированного в разных человеческих каркасных участках Fc IgG2 и IgG4.

[0078] На фиг. 20, A-D, показаны результаты проточной цитометрии, характеризующие связывание вариантов гуманизированного антитела PA13R3-P1C4 с клетками TRex-CHO, стабильно трансфицированными тетрациклин-индуцируемым человеческим CB1. На фиг.20, E-M, показана селективность связывания и перекрестная реакционноспособность гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 в отношении человеческого CB1 по сравнению с человеческим CB2 и мышиным CB1.

[0079] На фиг. 21 показаны результаты проточной цитометрии, характеризующие связывание антител (показанных вверху) с клетками, экспрессирующими разные конструкции CB1 (показанные слева).

[0080] На фиг. 22 показаны антитело-опосредованная цитотоксичность и комплемент-зависимая цитотоксичность гуманизированных вариантов P1C4 P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 в клетках Дауди. На рисунках 22A-C показаны эффекты вариантов P14C, определяемые в анализах антитело-опосредованной токсичности. На фиг. 22D показаны эффекты вариантов P14C, определяемые в анализах комплемент-зависимой цитотоксичности.

[0081] На фиг. 23 показаны результаты анализа методом вестерн-блоттинга, характеризующие распознавание денатурированного белка CB1 указанными первичными антителами P1C4 или контрольными антителами, а также вторичными антителами против человеческих (фиг. 23A) или против мышиных (рис. 23B) IgG. В качестве отрицательных контролей используют очищенные человеческие IgG с вторичным антителом против человеческих IgG (фиг. 23A, линия 1) и первичное мышиное антитело с вторичным антителом против кроличьих IgG (фиг. 23B, линия 11).

[0082] На фиг. 24 показаны результаты анализа связывания методом проточной цитометрии (фиг. 24А) и ингибирования продукции цАМФ (фиг. 24В), полученные путем инкубирования химерных и гуманизированных фрагментов Fab антител P1C4 с клетками, экспрессирующими рецептор CB1.

[0083] На фиг. 25 показано положительное CB1-специфическое окрашивание макрофагов, гепатоцитов и миофибробластов печени в образцах раннего NASH (левая панель), фиброза NASH (средняя панель) и позднего фиброза (правая панель).

[0084] На фиг. 26 показано, что при использовании нерелевантных антител определенного изотипа в клетках, полученных от нормального индивидуума (средняя панель), или индивидуума с фиброзом NASH (правая панель) окрашивание не наблюдается.

[0085] На фиг. 27 показано отсутствие CB1-специфического окрашивания в нормальных тканях.

[0086] На фиг. 28 показаны результаты анализа методом ОТ-ПЦР экспрессии проколлагена A1(I) в первичных звездчатых клетках печени, обработанных PBS, нефункциональным контрольным антителом и антителами P1C4-h2.

[0087] На фиг. 29 показаны результаты анализа методом ОТ-ПЦР уровней экспрессии TGFβ в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в указанных концентрациях, с использованием указанных контролей.

[0088] На фиг. 30 показаны результаты анализа методом ОТ-ПЦР уровней экспрессии TIMP1 в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в указанных концентрациях, с использованием указанных контролей.

[0089] На фиг. 31 показаны результаты анализа методом ОТ-ПЦР уровней экспрессии α-SMA в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в указанных концентрациях, с использованием указанных контролей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0090] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает антигенсвязывающие белки, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, способные селективно связываться с человеческим каннабиноидным рецептором 1 (CB1). Антитела и их фрагменты представляют собой функциональные антитела, которые способствуют или противодействуют активности рецептора CB1, или селективно распознают CB1, не проявляя агонистической или антагонистической активности.

[0091] Используемый здесь термин "антитело" относится к связывающим белкам, содержащим по меньшей мере один антигенсвязывающий домен, и охватывает фрагменты моноклональных антител и/или их варианты, включая рекомбинантные полипептиды, гибридные белки и иммуноконъюгаты. Таким образом, термины "антитело", "фрагмент антитела" и "вариант антитела" используются здесь как взаимозаменяемые. Примеры фрагментов антител настоящего изобретения включают, без ограничения, фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; фрагмент Fc, состоящий из доменов VH и CHI; фрагмент Fv, состоящий из VL и VH; фрагмент dAb, состоящий из домена VH; выделенные участки CDR; двухвалентный фрагмент F(ab')₂, содержащий два связанных фрагмента Fab; и одноцепочечные молекулы Fv (scFv). Описанные здесь антитела, связывающие рецептор CB1, можно получить от индивидуума любого вида, включающего, без ограничения, мышь, крысу, кролика, примата, ламу и человека. Антитела, связывающие рецептор CB1, могут представлять собой химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела.

[0092] Термин "полученный из", используемый здесь в применению к молекулам или полипептидам, родственным исходному антителу или другому связывающему белку, относится к молекулам или полипептидам, способным специфически связываться с тем же эпитопом, что и исходное антитело или другой связывающий белок.

[0093] Если специально не указано иное, ссылка на единственное число включает применение множественного числа. Если специально не указано иное, единственное число означает "по меньшей мере один". Если специально не указано иное, использование "или" означает "и/или". Значение фразы "по меньшей мере один" эквивалентно значению фразы "один или несколько". Кроме того, применение термина "включающий", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Если специально не указано иное, такие термины, как "элемент" или "компонент", включают как элементы и компоненты, содержащие одно составляющее, так и элементы или компоненты, содержащие несколько составляющих.

[0094] Описанные здесь антитела и антигенсвязывающие фрагменты являются специфичными к каннабиноидному рецептору 1 (CB1). Термин "специфичный к" означает, что антитела и их фрагменты связывают рецептор CB1 с большим сродством (то есть меньшим значением Kd, характеризующим сродство), чем любую другую мишень. Так, антитела и их фрагменты, способные селективно связываться с рецептором CB1, связывают рецептор CB1 с большим сродством (то есть с меньшим значением Kd, характеризующим сродство), чем любой другой каннабиноидный рецептор, или любой другой GPCR, или любую другую мишень. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов или вариантов к рецептору CB1, может находиться в диапазоне примерно от 0,01 нМ до 500 нМ, примерно от 0,02 нМ до 250 нМ, примерно от 0,02 до 200 нМ, примерно от 0,05 до 100 нМ, примерно от 0,05 до 50 нМ. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов или вариантов к рецептору CB1, может составлять примерно 500 нМ, примерно 250 нМ, примерно 200 нМ, примерно 150 нМ, примерно 100 нМ, примерно 75 нМ, примерно 50 нМ, примерно 25 нМ, примерно 10 нМ, примерно 5 нМ, примерно 1 нМ, примерно 500 пМ, примерно 250 пМ, примерно 100 пМ, примерно 50 пМ или примерно 10 пМ. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов к рецептору CB1, может составлять примерно 100 нМ или менее, примерно 75 нМ или менее, примерно 50 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 1 нМ или менее, примерно 500 пМ или менее, или примерно 100 пМ или менее.

[0095] Используемый здесь термин "агонист" относится к соединению, которое усиливает сигнальную активность другого соединения или рецепторного участка.

[0096] Используемый здесь термин "антагонист" относится к соединению, которое ингибирует, уменьшает или предотвращает сигнальную активность другого соединения в рецепторном участке, а в более широком смысле данный термин относится к соединению, которое уменьшает или предотвращает активацию и/или сигнальную активность рецептора.

[0097] "Аллостерический модулятор" представляет собой соединение, которое косвенно модулирует агонистические эффекты другого соединения. Например, аллостерический модулятор может косвенно модулировать агонистический эффект агониста рецептора путем индуцирования конформационного изменения в структуре белка. Аллостерические модуляторы могут быть положительными (усиливать агонистический эффект соединения-агониста) или отрицательными (уменьшать влияние агонистического соединения) модуляторами.

[0098] Используемые здесь термины "терапия" или "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам. Индивидуумом, нуждающимся в лечении, является индивидуум, у которого уже есть заболевание или расстройство, а также индивидуум, у которого может развиться заболевание или расстройство, и который может нуждаться в предотвращении, задержке или ослаблении заболевания или расстройства. Раскрытые здесь способы "лечения" включают введение индивидууму описанного здесь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, индивидууму, имеющему ассоциированное с CB1 заболевание или расстройство (например, фиброзное заболевание), или предрасположенному к такому заболеванию или расстройству, с целью предотвращения, излечения, задержки, уменьшения тяжести или улучшения одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства, или рецидивирующего заболевания или расстройства, или с целью продления жизни индивидуума до срока, превышающего ожидаемый в отсутствии такого лечения. Используемый здесь термин "индивидуум" относится к млекопитающему, такому как грызун, кошка, собака и примат. Предпочтительно индивидуум в соответствии с настоящим изобретением представляет собой человека.

[0099] Термин "терапевтически эффективное количество" в данном описании относится к количеству соединения или композиции, которое необходимо для обеспечения терапевтического и/или профилактического улучшения у индивидуума. Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от индивидуума и состояния заболевания, подлежащего лечению, массы и возраста индивидуума, тяжести заболевания, способа введения и т.п., и может быть легко определено специалистом в данной области. Дозы, используемые для введения, могут варьировать, например, примерно от 1 нг до 10000 мг, примерно от 1 мкг до 5000 мг, примерно от 1 мг до 1000 мг, примерно от 10 мг до 100 мг описанного здесь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Режимы дозирования можно корректировать, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ. Эффективное количество также представляет собой количество, при котором все токсичные или вредные эффекты (то есть побочные эффекты) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента минимизируются, или преобладают полезные эффекты.

I. Модифицированные антитела против CB1

[0100] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против рецептора CB1 могут содержать одну или несколько модификаций. Модифицированные формы описанных здесь антител против рецептора CB1 можно получить с помощью любых методов, известных в данной области. Не ограничивающие примеры модифицированных антител против рецептора CB1 описаны в заявке США № 14/774582, поданной 10 сентября 2015 г, международной заявке № PCT/US15/23108, поданной 27 марта 2015 г, международной заявке № PCT/CN2014/074199, поданной 27 марта 2014 г, и международной заявке № PCT/CN2014/081797, поданной 8 июля 2014 г, описания каждой из которых включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.

[0101] В некоторых вариантах осуществления антитела против рецептора CB1 и их фрагменты представляют собой конъюгаты, дополнительно содержащие средство, выбранное из группы, включающей дополнительное терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекулу иммуноадгезии и средство визуализации. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство представляет собой радиоактивную метку, выбранную из группы, состоящей из: ³H_, ¹⁴C_, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство или цитотоксическое средство выбрано из группы, включающей иммуносупрессорное средство, иммуностимулирующее средство, антиметаболит, алкилирующее средство, антибиотик, фактор роста, цитокин, антиангиогенное средство, антимитотическое средство, антрациклин, токсин и апоптотическое средство.

[0102] В одном варианте осуществления описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгируют с антагонистом CB1. Неограничивающие примеры известных антагонистов CB1 включают римонабант, таранабант, VD60, Isis-414930 Antisense CB1, JD5037, AM6545 и TM38837. В одном варианте осуществления описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгируют с римонабантом. В одном варианте осуществления выделенное антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, или его антигенсвязывающий фрагмент, является агонистом рецептора CB1. В другом варианте осуществления выделенное антитело, конъюгированное с цитотоксическим средством, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой нейтральное средство, связывающее рецептор CB1, которое обеспечивает интернализацию рецептора.

[0103] В другом аспекте описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгируют с химиотерапевтическим средством. "Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, имсульфан и пироссульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбокон, метудопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, такие как альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекана); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая синтетические аналоги адозелезина, карцелезина и бизелезина); криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые горчицы, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтаминоксида, мелфалан, новемчин, фенстерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихемицин, особенно калихемицин гамма 11 и калихемицин омега-11 (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарзиностатина и родственные хромофоры хромопротеиновых ендеиновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, автрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карбабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубицин (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептогнин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флуксуридин; андрогены, такие как каластоун, пропионат дромоностанола, эпитиотонол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; заменитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',22''-трихлортриэтиламин, трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин), уретан, виндезин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипроброман, гацитозин, арабинозид ("Ara-C"), циклофосфамид, тиотепа, таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), не содержащий кремофор ABRAXANE^TM, композиция паклитаксела, содержащая наночастицы на основе альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и TAXOTERE® доцетаксел (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France), хлорамбуцил, гемцитабин GEMZAR®, 6-тиогуанин, меркаптопурин, метотрексат, соединения платины, такие как цисплатин и карбоплатин, винбластин, платина, этопозид (VP-16), ифосфамид, митоксантрон; винкристин, винорелбин NAVELBINE®, новантрон, тенипозид, эдатрексат, дауномицин, аминоптерин, кселода, ибандронат, CPT-11, ингибитор топоизомеразы RFS 2000, дифторометилорнитин (DMFO), ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, капецитабин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные вышеперечисленных средств. Кроме того, данное определение охватывает ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб (Velcade), ингибиторы BCL-2, антагонисты IAP (например, имитаторы Smac/xIAP и ингибиторы cIAP, такие как определенные пептиды, пиридиновые соединения, такие как (S)-N-{6-бензо[1,3]диоксол-5-ил-1-[5-(4-фторбензоил)пиридин-3-илметил]-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил}-2-метиламинопропионамид, антисмысловая последовательность xIAP), ингибиторы HDAC (HDACI) и ингибиторы киназ (Sorafenib). В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированное с цитотоксическим средством, представляет собой агонист рецептора CB1.

[0104] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок конъюгируют непосредственно со средством. В других вариантах осуществления связывающий белок конъюгируют со средством через линкер. Подходящие линкеры включают, без ограничения, описанные здесь аминокислотные и полипептидные линкеры. Линкеры могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

[0105] В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты представляют собой биспецифические или бифункциональные антитела. Термин "биспецифические антитела" относится к молекулам, которые объединяют антигенсвязывающие участки двух антител внутри одной молекулы. Таким образом, биспецифическое антитело может одновременно связывать два разных антигена. Биспецифическое антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных участка связывания или эпитопа. Биспецифические антитела могут представлять собой моноклональные, предпочтительно человеческие или гуманизированные антитела, которые характеризуются специфичностью по меньшей мере к двум разным антигенам.

[0106] В одном варианте осуществления биспецифическое антитело, и/или его фрагмент, является специфичным к CB1 и второму целевому антигену. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело, и/или его фрагмент, является специфичным к CB1 и TGF-β, 2-AG, PDGF-β, IL-6, анандамиду (AEA) или LOXL-2.

[0107] Описанные здесь антитела и фрагменты могут связываться с одним или несколькими целевыми антигенами, выбранными из группы, состоящей из карбоангидразы IX, альфа-фетопротеина, а-актинина-4, А3, антигена, специфичного для антитела А33, АРТ-4, В7, Ва 733, BAGE, BrE3-антигена, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, C37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDK2A, CXCR4, специфичного для толстой кишки антигена p (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM1, CEACAM6, c-met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, Flt-1, Flt-3, рецептора фолата, антигена G250, GAGE, gp100, GROB, HLA-DR, HM1.24, человеческого хорионического гонадотропина (HCG) и его субъединиц, HER2/neu, HMGB-1, индуцируемого гипоксией фактора (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, Ia, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, инсулиноподобного фактора роста - 1 (IGF-1), антигена KC4, антигена KS-1, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, фактора, ингибирующего миграцию макрофагов (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, антиген, специфичный для антитела PAM-4, плацентарный фактор роста, p53, PLAGL2, простатическая кислая фосфатаза, PSA, PRAME, PSMA, PIGF, IGF, IGF-1R, IL-6, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, сурвивин, сурвивин-2B, TAC, TAG-72, тенасцин, рецепторы TRAIL, TNF-α, антиген Tn, антигены Томсона-Фредерика, антигены некроза опухолей, VEGFR, фибронектин ED-B, WT-1, антиген 17-1A, факторы комплемента C3, C3a, C3b, C5a, C5, маркер ангиогенеза, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, онкогенный маркер и онкогенный продукт (см., например, Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32; Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79; Novellino et al. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207).

[0108] Способы получения биспецифических антител хорошо известны. Традиционно способы рекомбинантного получения биспецифических антител включают совместную экспрессию двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют разную специфичность (Milstein et al., Nature, 305: 537 (1983)). Вследствие независимого расхождения генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из десяти разных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Выделение правильной молекулы обычно проводят методом многостадийной аффинной хроматографии. Аналогичные процедуры раскрыты в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J 10: 3655 (1991). Другие способы получения биспецифических антител описаны, например, в Kufer et al., Trends Biotech 22: 238-244, 2004.

[0109] Вариабельные домены антитела с целевой специфичностью связывания можно гибридизовать с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Предпочтительно проводят гибридизацию с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирного участка, участки C_H2 и C_H3. Он может включать первый константный участок тяжелой цепи (C_H1), содержащий участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий, по меньшей мере, в одном из гибридов. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, при необходимости, легкой цепи иммуноглобулина, вставляют в отдельные векторы экспрессии и совместно используют для трансформации подходящего организма-хозяина. Более подробное описание способов получения биспецифических антител можно найти, например, в Suresh et al., Meth Enzym 121: 210 (1986). Разработан ряд рекомбинантных способов, обеспечивающих эффективное получение биспецифических антител как в виде фрагментов антител (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66), так и в виде IgG полноразмерного формата (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).

[0110] Если не указано иное, для осуществления настоящего изобретения используют традиционные методы молекулярной биологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, хорошо известные в данной области и описанные, например, в Methods in Molecular Biology, Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Phage display: a laboratory manual (C. Barbas III et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); and Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).

[0111] В одном аспекте изобретение относится к способам получения описанных здесь антител и их фрагментов или вариантов, которые включают иммунизацию мышей иммуногеном рецептора CB1, таким как, например, ДНК рецептора CB1, белок рецептора CB1 или комплекс CB1/липид. В некоторых вариантах осуществления мышей иммунизируют 1, 2, 3, 4, 5 или более раз. В некоторых вариантах осуществления мышей иммунизируют, используя ДНК рецептора CB1, а ответ на рецептор CB1 усиливают путем дополнительной иммунизации с использованием ДНК рецептора CB1 и/или очищенного белка рецептора CB1, мембран, содержащих белок рецептора CB1, или iCAPS рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления клетки иммунизированных мышей используют для получения гибридомных и фаговых библиотек.

[0112] В некоторых вариантах осуществления антитела против рецептора CB1 получают путем выделения В-клеток из иммунизированных мышей и получения гибридомных клеток, продуцирующих антитела против рецептора CB1. Получение гибридом представляет собой метод, хорошо известный в данной области и включающий гибридизацию клеток, продуцирующих антитела, с миеломными или другими иммортализованными клетками, с получением гибридомной иммортализованной клеточной линии, продуцирующей антитела (см., например, Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495). Моноклональные антитела, продуцируемые клетками гибридомы, можно выделить из супернатанта с помощью традиционных методов очистки иммуноглобулинов, таких как осаждение, хроматография, ультрафильтрация, центрифугирование, гель-электрофорез и/или любой другой метод, известный в данной области. Супернатанты или выделенные моноклональные антитела можно тестировать на связывание с рецептором CB1 путем оценки связывания с мембранами, содержащими рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами. Например, супернатанты или выделенные моноклональные антитела можно тестировать на связывание с рецептором CB1 методом ELISA.

[0113] Другой аспект изобретения относится к способам получения описанных здесь антител и их фрагментов или вариантов, включающим применение фаговой библиотеки. Рекомбинантные способы получения антител с использованием технологии фагового дисплея известны в данной области (см., например, Winter et al. Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994), McCafferty et al. Nature 348: 552-553 (1990) и Clackson et al. Nature 352: 624 (1991)). В некоторых вариантах осуществления селезенки иммунизированных мышей используют для выделения набора антител против рецептора CB1 и затем формируют случайную комбинаторную библиотеку вариабельных генов, кодирующих указанные антитела. В некоторых вариантах осуществления для получения библиотеки фагового дисплея вместо клеток иммунизированных мышей используют гены вариабельных доменов тяжелых и легких цепей человеческих первичных лимфоцитов крови.

[0114] В некоторых вариантах осуществления фаговую библиотеку сортируют по связыванию фагов с рецептором CB1 с использованием по меньшей мере 3 циклов пэннинга, а затем способные к связыванию фаги подвергают скринингу на специфическое связывание с рецептором CB1 методом ELISA. Затем можно выбрать компоненты, способные к специфическому связыванию, и превратить их в полноразмерные антитела.

[0115] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела и фрагменты представляют собой химерные антитела или гуманизированные антитела. Способы получения химерных и гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Lo, Benny, K. C., editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004.

[0116] "Химерное антитело" представляет собой антитело, содержащее по меньшей мере часть вариабельного участка тяжелой цепи и по меньшей мере часть вариабельного участка легкой цепи, полученного из того же вида; и по меньшей мере часть константного участка, полученного из другого вида. Например, в одном варианте осуществления химерное антитело может содержать мышиные вариабельные участки и человеческий константный участок. "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело, содержащее участки, определяющие комплементарность (CDR), полученные из нечеловеческого антитела; и каркасные участки, а также константные участки, полученные из человеческого антитела.

[0117] Используемый здесь термин "CDR" или "участок, определяющий комплементарность", относится к несмежным антигенсвязывающим участкам, находящимся в вариабельном домене полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Данные конкретные участки описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), где определения включают перекрывающиеся аминокислотные остатки, или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Определение Kabat основано на вариабельности последовательности. Уникальная нумерация IMGT для всех V-участков IG и TR всех видов основана на высокой консервативности структуры вариабельного участка (Lefranc, Mp et al., Dev comp. Immunol. 27:55-77, 2003). Нумерация IMGT, установленная после выравнивания более 5000 последовательностей, учитывает и объединяет определения каркасного участка и CDR. Определение Chothia основано на расположении участков структурных петель. Определение контакта (MacCallum et al.) основано на анализе комплексных кристаллических структур и взаимодействий антитело-антиген. Аминокислотные остатки, составляющие CDR, определенные в соответствии с каждой из приведенных выше ссылок, приведены для сравнения. В одном раскрытом здесь варианте осуществления термин "CDR" относится к CDR, определенному по системе Kabat. В другом раскрытом здесь варианте осуществления CDR представляет собой CDR, определенный по системе IMGT.

[0118] CDR обычно играют важную роль в распознавании эпитопов и связывании антител. Однако можно внести изменения в остатки, составляющие CDR, не препятствуя способности антитела распознавать и связывать родственный эпитоп. Например, можно осуществить изменения, которые не влияют на распознавание эпитопов, но увеличивают сродство антитела к эпитопу. Проведено несколько исследований с целью изучения эффектов введения одного или нескольких аминокислотных изменений в разных положениях последовательности антитела на основе информации о первичной последовательности антитела и его свойствах, таких как связывание и уровень экспрессии (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254: 392-403, Rader et al, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95: 8910-8915, Vaughan et al, 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).

[0119] Таким образом, эквиваленты представляющего интерес антитела можно получить путем изменения последовательностей генов тяжелой и легкой цепей по участкам CDR1, CDR2 или CDR3, или по каркасным участкам с использованием таких методов, как олигонуклеотид-опосредованный направленный мутагенез, кассетный мутагенез, ПЦР с внесением ошибок, шаффлинг ДНК или использование штаммов-мутаторов E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16: 535-539, и Adey et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Путем изменения нуклеотидной последовательности первичного антитела можно получить антитела с повышенным сродством (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; и Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).

[0120] Например, описанные здесь антитела против CB1 могут содержать CDR, полученные из одного или нескольких мышиных антител, человеческий каркасный участок и человеческие константные участки. Таким образом, в одном варианте осуществления описанное здесь гуманизированное антитело связывается с тем же эпитопом на CB1, что и мышиное антитело, из которого получены CDR антитела. В данном описании приведены примеры гуманизированных антител. Другие гуманизированные антитела против CB1, содержащие описанные здесь CDR тяжелых и легких цепей, или их варианты, которые можно получить с использованием любой человеческой каркасной последовательности, также входят в объем настоящего изобретения. В одном варианте осуществления каркасные последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают каркасные последовательности, сходные по структуре с описанными здесь каркасными последовательностями. В некоторых вариантах осуществления человеческие каркасные участки выбирают на основе гомологии между исходным антителом и человеческими зародышевыми генами VH и VK. Выделенные каркасные участки в некоторых вариантах осуществления характеризуются наивысшей гомологией по отношению к генам VH и VK исходного антитела, кроме того, их можно спрогнозировать с помощью компьютерного моделирования или других средств, обеспечивающих поддержку структуры CDR, которая по результатам прогнозирования должна предоставляться исходным антителом.

[0121] Кроме того, можно осуществить модификации в каркасных участках с целью улучшения свойств описанных здесь антител. Такие дополнительные модификации каркасного участка могут включать химические модификации; точечные мутации для снижения иммуногенности или удаления Т-клеточных эпитопов; или обратные мутации с ведением остатков, присутствующих в исходной зародышевой последовательности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческий каркасный участок, на который привиты описанные здесь CDR, без дополнительных модификаций вариабельного участка. Гуманизированные антитела, которые не содержат обратную мутацию в человеческом каркасном участке, обозначают здесь H0 (например, P1C4-H0). В другом варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческий каркасный участок, на который привиты описанные здесь CDR, где аминокислоту в положении 27 и/или 28 каркасного участка 1 тяжелой цепи подвергают обратной мутации. В следующем варианте осуществления аминокислоту в положении 27 подвергают обратной мутации, заменяя Gly (G) на Tyr (Y); а аминокислоту в положении 28 подвергают обратной мутации, заменяя Thr (T) на Glu (E). Гуманизированные антитела, содержащие такие мутации в положениях 27 и 28, обозначаются здесь как "H2" или "H2 (YE)" (например, P1C4-H2 или P1C4-H2 (YE)). В другом варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческий каркасный участок и привитые на него описанные здесь CDR, где аминокислоту в положении 27 и/или 28 каркасного участка 1 тяжелой цепи и аминокислоту в положении 60 и/или 61 каркасного участка 3 тяжелой цепи подвергают обратной мутации. В следующем варианте осуществления аминокислоту в положении 27 подвергают обратной мутации, заменяя Gly (G) на Tyr (Y); аминокислоту в положении 28 подвергают обратной мутации, заменяя Thr (T) на Glu (E); аминокислоту в положении 60 подвергают обратной мутации, заменяя Ala (A) на Asn (N); и аминокислоту в положении 61 подвергают обратной мутации, заменяя Gln (Q) на Gly (G). Гуманизированные антитела, содержащие такие мутации в положениях 27, 28, 60 и 61, обозначаются здесь как "H4" или "H4 (YENG)" (например, P1C4-H4 или P1C4-H4 (YENG)). В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат модификации в каркасном участке, такие как обратные мутации в легкой цепи. Например, в одном варианте осуществления антитела содержат мутацию в положении 45 и/или 47 каркасного участка 2 легкой цепи. В следующем варианте осуществления в положении 45 аминокислоту Arg (R) заменяют на Lys (K), а в положении 47 аминокислоту Leu (L) заменяют на Trp (W). Настоящее изобретение также охватывает гуманизированные антитела, которые связываются с CB1 и содержат модификации в каркасном участке, соответствующие описанным здесь иллюстративным модификациям, в применении к любой подходящей каркасной последовательности, а также другие модификации каркасного участка, которые при прочих равных условиях улучшают свойства антител. Описанные здесь антитела против CB1 и их фрагменты могут принадлежать к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или к любому сочетанию указанных изотипов. Термин "изотип" относится к классу антител, кодируемому генами константных участков тяжелой цепи. Кроме того, константный участок тяжелой цепи может быть получен из любого вида, включающего, без ограничения, мышь, крысу, кролика, хомяка, морскую свинку, примата, ламу или человека. Например, в одном варианте осуществления антитела против CB1 настоящего изобретения и их фрагменты содержат константный участок Fc человеческого IgG1. В другом варианте осуществления антитела против CB1 и их фрагменты содержат константный участок Fc человеческого IgG2, человеческого IgG4, или гибрида IgG2-IgG4.

II. Эффекторные функции и модификации Fc

[0122] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам против CB1, содержащим варианты участков Fc. Участок Fc антитела представляет собой часть антитела, которая связывается с рецепторами Fcγ (FcγRs) и молекулой комплемента C1q. Участок Fc играет роль в опосредовании эффекторных функций антител. Термин "эффекторные функции", используемый здесь в применении к Fc антитела, относится к таким функциям антител, как, например, связывание с C1q; комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; опсонизация; трансцитоз; и понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток). Такие эффекторные функции, для проявления которых обычно требуется объединение участка Fc со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), можно оценить с помощью разных анализов, используемых в данной участки для определения таких эффекторных функций антитела. Варианты участков Fc представляют собой Fc-участки, которые содержат модификации, изменяющие эффекторные функции. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против CB1 содержат модификации в участках Fc, которые уменьшают, ослабляют или устраняют одну или несколько эффекторных функций. Например, в одном варианте осуществления раскрытые здесь антитела и фрагменты связывают CB1 и обладают пониженной, ослабленной или отсутствующей способностью к связыванию C1q, и/или активностью CDC, и/или активностью ADCC. Модификации Fc могут представлять собой аминокислотные вставки, делеции или замены, или химические модификации. Например, модификации участка Fc можно осуществлять с целью увеличения или уменьшения связывания комплемента; с целью увеличения или уменьшения антителозависимой клеточной цитотоксичности; или с целью модификации гликозилирования. Разные модификации Fc известны в данной области и описаны, например, в Labrijin et al., Nature Biotech 27(8):767-71 (2009); Idusogie, et al. J Immunol 2000; Greenwood et al Eur J Immunol 23:1098-104 (1993); Mueller et al. Mol Immunol 1997; 34:441-52; and Rother et al Nature Biotechnol 2007; 25:1256-64. Для изменения эффекторной функции описанных здесь примеров антител против CB1 можно использовать любые известные в данной области модификации Fc. Кроме того, с помощью рекомбинантных методов можно получить разные терапевтические антитела, которые содержат модификации участка Fc, влияющие на эффекторную функцию. Такие терапевтические антитела известны в данной области и включают, например, алемтузумаб, бенрализумаб, бевацизумаб, бимекизумаб, кантузумаб, треритузумаб, далотузумаб, эфализумаб, элотузумаб, энаватузумаб, энокизумаб, этилизумаб, фалеттузумаб, фиклатузумаб, имгатузумаб, итолизумаб, лизастузумаб, лигелизумаб, лоделсизумаб, лорвотузумаб, могамулизумаб, мотавизумаб, обинутузумаб, окаратузумаб, омализумаб, парсатузумаб, патеклизумаб, перакизумаб, пертузумаб, пидилизумаб, квилизумаб, ронтализумаб, софитузумаб, соланезумаб, сувизумаб, теплизумаб, тилдракизумаб, тоцилизумаб, трастузумаб, трастузумаба эмтансин, трегализумаб, ведолизумаб, ворсетузумаб, ворсетузумаба мафодотин, иттрий (90Y) кливатузумаба тетраксетан, анрукинзумаб, дацетузумаб, даклизумаб, этарацизумаб, милатузумаб, озанезумаб, пинатузумаба ведотин, полатузумаба ведотин, тигатузумаб, велтузумаб, абитузумаб, бокоцизумаб, демцизумаб, гевокизумаб, понезумаб, ралпанцизумаб, ромосозумаб, танезумаб, блосозумаб, концизумаб, кренезумаб, ибализумаб, иксекизумаб, лебрикизумаб, олокизумаб, пембролизумаб, симтузумаб, улокуплумаб, вателизумаб и самализумаб (см., например, SEQ ID NO: 358-432). Чтобы изменить эффекторную функцию, период полужизни или другие свойства описанных здесь антител против рецептора CB1, можно использовать любые известные в данной области модификации Fc.

[0123] В одном варианте осуществления антитело против CB1 проявляет пониженную эффекторную функцию. В следующем варианте осуществления антитело против CB1 содержит участок Fc IgG4, содержащий мутацию в положении 228. В следующем варианте осуществления в положении 228 аминокислоту серин (S) заменяют на пролин (P) (то есть S228P). В другом варианте осуществления антитело против CB1 проявляет пониженную эффекторную функцию и содержит участок Fc IgG2, содержащий мутацию в положении 330 и/или 331. В следующем варианте осуществления в положении 330 аминокислоту аланин (А) заменяют на серин (S), и/или в положении 331 аминокислоту пролин (P) заменяют на серин (S). В следующем варианте осуществления антитело против CB1 содержит домен Fc IgG2, содержащий и мутацию A330S, и мутацию P331S. В другом варианте осуществления антитело против CB1 содержит гибридный Fc-участок IgG2/IgG4. Например, в одном варианте осуществления антитело против CB1 содержит CH1 и шарнирный участок из IgG2, а участки CH2 и CH3 из IgG4.

[0124] Система конформационной презентации антигена (iCAPS). iCAPS обеспечивает презентацию очищенных, выделенных, конформационно корректных функциональных GPCR. Очищенные GPCR стабилизируются в липидных бислоях, окруженные белковым поясом.

[0125] В одном варианте осуществления изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую одно из описанных здесь антител и их антигенсвязывающих фрагментов или вариантов. В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает клетку-хозяина, трансформированную вектором. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является эукариотической клеткой. В других вариантах осуществления эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки простейшего, клетки животного, клетки растения и клетки грибка. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включающую, без ограничения, 293, COS, NS0 и CHO; или клетку грибка, такого как Saccharomyces cerevisiae; или клетку насекомого, такую как Sf9. В одном из вариантов осуществления изобретение предлагает способы получения описанных здесь антител и фрагментов или вариантов, включающие культивирование одной из указанных здесь клеток-хозяев в культуральной среде в условиях, достаточных для обеспечения продукции связывающего белка.

[0126] Примеры антител настоящего изобретения, связывающих рецептор CB1, приведены ниже в таблице 1. Другие примеры антител настоящего изобретения, связывающих рецептор CB1, определяются SEQ ID NO и приведены в списке последовательностей, показанном в таблице 2. Последовательности примеров гуманизированных антител настоящего изобретения, связывающих рецептор CB1, приведены в таблице 3 и таблице 35.

Таблица 1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой цепи и вариабельных участков легкой цепи типичных антител, связывающих рецептор CB1

Название Описание последовательности SEQ ID NO Последовательность PA13R3-P1C4 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 1 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGAAACTAAGTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTATATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCCCATGGTAACTACCTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 2 EVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGETKYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 3 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 4 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 5 GATATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 6 DIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPPTFGAGTKLELK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 7 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 8 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC 36E12B6C2 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 9 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCACCAGCCTAACGTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGGGGTAACCCCTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 10 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLQWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYFCARSGGNPFAFWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 11 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 12 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 13 GATATCCAGATGACACAGACTTCATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCTTCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCACATCAAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGACGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACGCTTCCGTGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 14 DIQMTQTSSSLSASLGDRVTFSCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVTSRFRGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGHTLPWSFGGGTKLEIK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 15 CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG Аминокислотная последовательность константного участка LC 16 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 36E12B6C2 (мышиная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 17 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCACCAGCCTAACGTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGGGGTAACCCCTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 18 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLQWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYFCARSGGNPFAFWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 19 GCTAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 20 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 21 GATATCCAGATGACACAGACTTCATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCTTCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCACATCAAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGACGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACGCTTCCGTGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 22 DIQMTQTSSSLSASLGDRVTFSCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVTSRFRGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGHTLPWSFGGGTKLEIK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 23 CGGGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG Аминокислотная последовательность константного участка LC 24 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC PA2LR3- P4B5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 25 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTATTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAGTGGAAGGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 26 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYSGRFKGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 27 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 28 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 29 GACATTGTTCTCAACCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAAATAAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 30 DIVLNQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLEIK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 31 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 32 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P2D3 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 33 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAGCTATTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 34 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGSYFAYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 35 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 36 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 37 GATATTGAGCTGGCCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTAGGGCAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCTCCTACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAAATAAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 38 DIELAQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRADFTLTIDPVEADDAATYYCLQYASSPPTFGAGTKLEIK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 39 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 40 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P4B1
(химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 41 GAGGTCCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTTGCATTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTTCAATGGAAAGTTCAAGGGTAGAGCCATACTGACTGCAGACATATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 42 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSNYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGRAILTADISSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 43 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 44 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 45 CAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 46 QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 47 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 48 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P6B12
(химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 49 GAGGTCCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 50 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFAYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 51 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 52 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 53 CAAATTGTACTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCCCTCGCGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 54 QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLAFGAGTKLELK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 55 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 56 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P6G7
(химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 57 GAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTTGCATTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTTCAATGGAAAGTTCAAGGGTAGAGCCATACTGACTGCAGACATATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 58 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSNYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGRAILTADISSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность константного участка HC 59 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислотная последовательность константного участка HC 60 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 61 GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCCGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACCTCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGCATCATCGTTCCCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 62 DIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQHHRSPPTFGAGTKLELK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 63 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислотная последовательность константного участка LC 64 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

Таблица 2. SEQ ID NO других антител, связывающих рецептор CB1

Название Описание последовательности SEQ ID NO PA2LR3-P1G6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 65 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 66 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 67 Аминокислотная последовательность константного участка HC 68 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 69 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 70 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 71 Аминокислотная последовательность константного участка LC 72 PA2LR3-P1H4 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 73 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 74 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 75 Аминокислотная последовательность константного участка HC 76 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 77 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 78 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 79 Аминокислотная последовательность константного участка LC 80 PA2LR3-P2B8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 81 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 82 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 83 Аминокислотная последовательность константного участка HC 84 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 85 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 86 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 87 Аминокислотная последовательность константного участка LC 88 PA2LR3-P2E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 89 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 90 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 91 Аминокислотная последовательность константного участка HC 92 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 93 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 94 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 95 Аминокислотная последовательность константного участка LC 96 PA2LR3-P3A8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 97 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 98 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 99 Аминокислотная последовательность константного участка HC 100 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 101 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 102 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 103 Аминокислотная последовательность константного участка LC 104 PA2LR3-P3B10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 105 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 106 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 107 Аминокислотная последовательность константного участка HC 108 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 109 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 110 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 111 Аминокислотная последовательность константного участка LC 112 PA2LR3-P3B8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 113 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 114 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 115 Аминокислотная последовательность константного участка HC 116 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 117 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 118 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 119 Аминокислотная последовательность константного участка LC 120 PA2LR3-P3F8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 121 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 122 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 123 Аминокислотная последовательность константного участка HC 124 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 125 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 126 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 127 Аминокислотная последовательность константного участка LC 128 PA2LR3-P4C6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 129 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 130 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 131 Аминокислотная последовательность константного участка HC 132 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 133 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 134 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 135 Аминокислотная последовательность константного участка LC 136 PA2LR3-P4G10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 137 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 138 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 139 Аминокислотная последовательность константного участка HC 140 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 141 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 142 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 143 Аминокислотная последовательность константного участка LC 144 PA2LR3-P5E7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 145 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 146 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 147 Аминокислотная последовательность константного участка HC 148 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 149 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 150 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 151 Аминокислотная последовательность константного участка LC 152 PA2LR3-P6D7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 153 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 154 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 155 Аминокислотная последовательность константного участка HC 156 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 157 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 158 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 159 Аминокислотная последовательность константного участка LC 160 PA2R3-P1A7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 161 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 162 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 163 Аминокислотная последовательность константного участка HC 164 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 165 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 166 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 167 Аминокислотная последовательность константного участка LC 168 PA2R3-P1F1 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 169 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 170 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 171 Аминокислотная последовательность константного участка HC 172 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 173 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 174 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 175 Аминокислотная последовательность константного участка LC 176 PA13R3-P3A7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 177 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 178 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 179 Аминокислотная последовательность константного участка HC 180 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 181 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 182 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 183 Аминокислотная последовательность константного участка LC 184 PA13R3-P3C3 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 185 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 186 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 187 Аминокислотная последовательность константного участка HC 188 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 189 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 190 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 191 Аминокислотная последовательность константного участка LC 192 PA13R3-P3D10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 193 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 194 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 195 Аминокислотная последовательность константного участка HC 196 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 197 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 198 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 199 Аминокислотная последовательность константного участка LC 200 PA13R3-P3D11 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 201 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 202 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 203 Аминокислотная последовательность константного участка HC 204 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 205 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 206 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 207 Аминокислотная последовательность константного участка LC 208 PA13R3-P3F6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 209 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 210 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 211 Аминокислотная последовательность константного участка HC 212 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 213 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 214 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 215 Аминокислотная последовательность константного участка LC 216 PA13R3-P4C4 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 217 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 218 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 219 Аминокислотная последовательность константного участка HC 220 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 221 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 222 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 223 Аминокислотная последовательность константного участка LC 224 PA13R3-P4F8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 225 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 226 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 227 Аминокислотная последовательность константного участка HC 228 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 229 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 230 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 231 Аминокислотная последовательность константного участка LC 232 PA13R3-P4G11 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 233 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 234 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 235 Аминокислотная последовательность константного участка HC 236 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 237 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 238 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 239 Аминокислотная последовательность константного участка LC 240 PA13R3-P4H10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 241 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 242 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 243 Аминокислотная последовательность константного участка HC 244 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 245 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 246 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 247 Аминокислотная последовательность константного участка LC 248 PA15R3-P3A6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 249 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 250 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 251 Аминокислотная последовательность константного участка HC 252 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 253 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 254 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 255 Аминокислотная последовательность константного участка LC 256 PA15R3-P3A7(химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 257 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 258 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 259 Аминокислотная последовательность константного участка HC 260 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 261 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 262 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 263 Аминокислотная последовательность константного участка LC 264 PA15R3-P3C9 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 265 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 266 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 267 Аминокислотная последовательность константного участка HC 268 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 269 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 270 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 271 Аминокислотная последовательность константного участка LC 272 PA16R3-P2G6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 273 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 274 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 275 Аминокислотная последовательность константного участка HC 276 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 277 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 278 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 279 Аминокислотная последовательность константного участка LC 280 PA16R3-P1A6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 281 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 282 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 283 Аминокислотная последовательность константного участка HC 284 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 285 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 286 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 287 Аминокислотная последовательность константного участка LC 288 PA16R3-P1B5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 289 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 290 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 291 Аминокислотная последовательность константного участка HC 292 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 293 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 294 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 295 Аминокислотная последовательность константного участка LC 296 PA16R3-P1E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 297 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 298 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 299 Аминокислотная последовательность константного участка HC 300 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 301 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 302 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 303 Аминокислотная последовательность константного участка LC 304 PA16R3-P1H5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 305 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 306 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 307 Аминокислотная последовательность константного участка HC 308 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 309 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 310 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 311 Аминокислотная последовательность константного участка LC 312 PA18R3-P1D8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 313 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 314 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 315 Аминокислотная последовательность константного участка HC 316 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 317 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 318 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 319 Аминокислотная последовательность константного участка LC 320 PA18R3-P1E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 321 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 322 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 323 Аминокислотная последовательность константного участка HC 324 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 325 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 326 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 327 Аминокислотная последовательность константного участка LC 328 PA18R3-P1H5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 329 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 330 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 331 Аминокислотная последовательность константного участка HC 332 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 333 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 334 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 335 Аминокислотная последовательность константного участка LC 336

Таблица 3. Последовательности типичных гуманизированных антител

Название/Описание последовательности SEQ ID NO Последовательность Гуманизированное P1C4, вариабельный участок легкой цепи 337 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIK Гуманизированное P1C4, полноразмерная легкая цепь 338 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Гуманизированное P1C4-H0, вариабельный участок тяжелой цепи 339 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Гуманизированное P1C4-H2, вариабельный участок тяжелой цепи 340 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Гуманизированное P1C4-H4, вариабельный участок тяжелой цепи 341 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Гуманизированное P1C4, константный участок тяжелой цепи 342 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H0, гибрид IgG2-4 343 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H0, IgG2A330S/P331S 344 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H0, IgG4S228P 345 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H2, гибрид IgG2-4 346 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H2, IgG2A330S/P331S 347 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H2, IgG4S228P 348 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H4, гибрид IgG2-4 349 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H4 IgG2A330S/P331S 350 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H4, IgG4S228P 351 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[0127] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против рецептора CB1 содержат описанные здесь последовательности, или их консервативные варианты. Используемый здесь термин "консервативные варианты" включает консервативные аминокислотные замены, вставки или делеции. Для специалиста в данной области очевидно, что консервативная аминокислотная замена представляет собой замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая имеет сходные структурные или химические свойства, такие как, например, подобная боковая цепь; кроме того консервативная аминокислотная замена, введение или делеция приводит к получению последовательности, которая сохраняет биологическую активность исходной последовательности. Типичные консервативные замены описаны в данной области, например, в Watson et al., Molecular Biology of Gene, Bengamin/Cummings Publication Company, 4^th Ed. (1987).

III. Способы лечения CB1-ассоциированных заболеваний

[0128] Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном описании, можно вводить индивидууму-человеку в терапевтических целях. В некоторых вариантах осуществления способы лечения включают введение индивидууму антител и связывающих фрагментов или их вариантов, раскрытых в данном описании.

[0129] В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способы лечения заболеваний, в которых мишенями предпочтительно являются периферические рецепторы CB1. "Периферические рецепторы CB1", как определено в данном описании, представляют собой рецепторы CB1, которые не локализуются в головном мозге или центральной нервной системе (например, периферически ограниченные рецепторы CB1). И наоборот, термин "глобальные рецепторы CB1" относится к рецепторам CB1 в любом месте тела, включая мозг и ЦНС.

[0130] В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для лечения разных заболеваний или расстройств, таких как, например, ожирение, диабет, дислипидемия, фиброз, безалкогольный стеатогепатит (NASH), заболевания печени, первичный билиарный цирроз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, боль, рассеянный склероз (MS), глаукома, воспалительные заболевания, нефропатии, остеопороз, нарушения обмена веществ, психические расстройства, неврологические расстройства, нейродегенеративные расстройства, репродуктивные расстройства, болезнь почек, фиброз почек, хроническое заболевание почек, атеросклероз, рак, кожные заболевания и др.

[0131] Показано, что сигнальный путь рецептора CB1 проявляет отрицательную активность, например, при ожирении, диабете, фиброзе, заболеваниях печени, сердечно-сосудистых заболеваниях и раке (Kunos et al., 2009, Trends Pharmacol Sci 30: 1-7). В одном аспекте антитела против CB1 или их фрагменты, раскрытые в данном описании, можно использовать в качестве антагонистов CB1. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения ассоциированных с CB1 заболеваний или расстройств путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько антител против CB1 или их антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данном описании. В некоторых вариантах осуществления антагонистические антитела рецептора CB1 и их фрагменты, раскрытые в данном описании, обеспечивают благоприятный эффект при использовании в способах лечения или профилактики ожирения, диабета, фиброза, заболеваний печени, сердечно-сосудистых заболеваний, зависимостей, таких как никотиновая зависимость или рак.

[0132] Безалкогольный стеатогепатит (NASH), также известный как безалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD), относится к накоплению стеатоза печени не вследствие избыточного потребления алкоголя. NASH представляет собой заболевание печени, характеризующееся воспалением печени с одновременным накоплением жира. NASH также часто встречается у людей с диабетом и ожирением и связан с метаболическим синдромом. NASH представляет собой прогрессирующую форму относительно доброкачественной безалкогольной жировой болезни печени, поскольку она может медленно ухудшаться, вызывая накопление фиброза в печени, что приводит к циррозу (обзор можно найти в Smith, et al., 2011, Crit Rev Clin Lab Sci., 48 (3): 97-l 13). В настоящее время нет конкретных способов лечения NASH.

[0133] В одном аспекте антитела против СВ1 или их фрагменты, раскрытые в данном описании, используют для лечения, профилактики, обнаружения или изучения фиброза. Несколько исследований на мышиных моделях подтвердили роль рецептора CB1 при фиброзе, включая фиброз печени. (См., Например, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2): 183-192; Tarn et al, 2010, J. Clin. Invest. 120(8): 2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19 (6): 900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68: 89-97). Периферийный CB1 был вовлечен в несколько механизмов, способствующих NASH и фиброзу печени, включая стеатоз (жировая печень), воспаление и повреждение печени (обзор Mallat et al., 2013, J Hepatology, 59 (4): 891-896). Было продемонстрировано, что CB1 регулируется в активированных клетках печени человека (HSC), которые опосредуют фиброз путем перехода в миофибробласты. (Teixeira-Clerc et al., 2006, Nature Med., 12 (6): 671-76). CB1 также участвует в диабетической нефропатии. Lin et al, 2014 J. Mol. Med. 92(7):779-92.)

[0134] Исследования на мышах с выключенными генами гепатоцит-специфичного CB1 и глобального CB1 указывают на главную роль CB1 в периферических клеточных типах (гепатоцитах), относящихся к нескольким метаболическим заболеваниям и расстройствам. На мышиной модели ожирения, вызванного диетой, как выключение глобального CB1 (CB1 -/-), так и гепатоцит-специфичного CB1 (LCB1 -/-) продемонстрировало снижение стеатоза (жировой печени) и увеличение функции печени, что продемонстрировало роль CB1 в отношении периферических клеток (гепатоцитов), связанных с неалкогольной патологией стеатогепатита (NASH), диабетом и патологией метаболического синдрома. (Osei-Hyiaman et al, 2008, J. Clin. Invest., 118 (9): 3160-3169; Liu et al, 2012, Gastroenterology, 142: 1218-1228). Селективный нокдаун CB1 с использованием специфической к макрофагу CB1-нокдауна миРНК (CB1R-GeRPs) предотвращает прогрессирующую гипергликемию и снижение инсулина плазмы и C-пептида у диабетических жирных крыс (ZDF) Цукера, которые являются общей моделью резистентности к инсулину T2D, гипергликемии и неудачи бета-клеток. (Jourdan et al., 2013, Nature Med. 19(9): 1132-1140). На мышиной модели вызванного алкоголем стеатоза печени как выключение глобального CB1 (CB1 -/-), так и гепатоцит-специфичного CB1 (LCB1 -/-) уменьшали стеатоз и повышали функцию печени, тем самым демонстрируя роль CB1 в периферических клетках (гепатоцитах), относящихся к патологии стеатоза. (Jeong, et al, 2008, Cell Metabolism, 7: 227-235). Было показано, что накопление липидов уменьшалось в эпидидимальных белых жировых клеточных линиях, полученных от мышей с выключенным CB1, по сравнению с контролем дикого типа (Wagner et al., 2011, Nutrition and Diabetes, 1: e16).

[0135] Исследования на разных моделях заболевания у мышей демонстрируют, что периферически ограниченные антагонисты рецепторов рецептора CB1 могут эффективно ингибировать прогрессирование фиброза печени. (См., Например, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2): 183-192; Tarn et al, 2010, J. Clin. Invest. 120(8): 2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19 (6): 900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68: 89-97.) Неограничивающие примеры известных антагонистов CB1 включают римонабант, таранабант, VD60, Isis-414930 антисмысловой CB1, JD5037, AM6545 и TM38837. Было показано, что антагонисты CB1, такие как римонабант, ингибируют клеточную пролиферацию и снижают экспрессию профибротического гена в первичных человеческих клетках печени (HSC), которые опосредуют фиброз путем перехода в миофибробласты (Patsenker et al., 2011, Mol Med., 17 (11-12): 1285-1294). Было показано, что на модели мышиного фиброза печени, основанной на CCl4, был продемонстрирован антагонист CB1, VD60 (3,4,22-3-деметоксикарбонил-3-гидроксиметил-4-деацетил-виндолин-3,4-тионокарбонат) для ингибирования продуцирования экспрессии профибротического гена (альфа-коллагена) и пролиферации в активированных клетках гепатоцеллюлозы (линия HSC LX-2), в то время как селективный CBI-агонист ACEA (N-(2-хлорэтил)-5Z, 8Z, l lZ, 14Z-эйкозатетранамид) предотвращал этот эффект (Wei Y и др., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2): 183-192). Было показано, что антагонист CB1 JD5037 нарушает индуцированное эндоканнабиноидом ингибирование сигнального пути инсулина. (Cinar et al., 2014, Hepatology, 59 (1) 143-153). Блокада CB1 с использованием римонабанта отменяет воспаление, вызванное нарушением поглощения глюкозы в адипоцитах, выделенных у крыс с высоким содержанием жиров (Miranville et al, 2010, Obesity 18: 2247-2254).

[0136] Исследования на людях также связывают периферические рецепторы CB1 с этиологией и прогрессированием заболевания. Например, регуляция CB1с повышением в печени пациентов с NASH и HCV коррелировала с выраженностью стеатоза и фиброза печени. (Auguet et al., 2014, BioMed Res. Intl. Vol. 2014, ID Article 502542). Кроме того, хронический агонизм CB1 (через употребление конопли) коррелировал с повышенной степенью стеатоза печени и фиброзом у пациентов с HCV. (Van der Poorten et al, 2010, PlosOne 5, el2841). Кроме того, было показано, что блокада CB1 у пациентов с ожирением улучшает стеатоз печени. (Despres et al., 2009, Arterioscler Thromb Vase Biol. 29:416-423).

[0137] Также признают, что влияние антагонизма CB1 отличается в зависимости от местоположения рецептора. Например, известно, что эффекты антагонизма CB1 специфичны для тканей, так как положительные кардиометаболические эффекты римонабанта, наблюдаемые у пациентов, не зависят от потери веса. (Pi-Sunyeret al, 2006, J Am Coll Cardio. 147: 362А). Кроме того, известно, что римонабант улучшает гликемический контроль у пациентов с диабетом типа 2 (см., Например, Hollander et al, 2010, Diabetes Care. 33 (3): 605-7), но этот эффект сопровождается значительными психическими побочными эффектами, придаваемыми рецепторами CB1, расположенными в ЦНС. (Kunos et al, 2009, Trends Pharmacol Sci 30: 1-7, Moreira et al, 2009, Rev Bras Psiquiatr. 31(2): 145-53; Pacher et al, 2013, FEBS J. 280 (9): 1918-1943.) Было показано, что антагонист рецептора CB1, римонабант, улучшает профиль нескольких метаболических факторов риска (включая уровни адипонектина) у пациентов с избыточным весом в соответствии с исследованием Rimonabant in Obesity-Lipids (RIO-Lipids). (См., Например, Despres et al, 2005, N Engl J Med, 353: 2121-2134).

[0138] Показано, что сигнальный путь рецептора CB1 проявляет благоприятную активность при боли, спастичности при РС и глаукоме, среди прочих. (Pacher et al, 2013, FEBS J. 280 (9): 1918-1943). В некоторых вариантах осуществления агонистические антитела рецептора CB1 и их фрагменты, раскрытые в данном описании, обеспечивают полезный эффект при использовании в качестве лечения или для предотвращения боли, спастичности при РС или глаукомы. Было продемонстрировано, что агонисты CB1 активируют синтез жирных кислот печени, глюконеогенез и другие метаболические пути. (См., Например, Osei-Hyiaman et al, 2005, J. Clin. Invest., 115 (5): 1298-1305; Chanda et al, 2012, JBC, 287 (45): 38041-38049).

[0139] Спастичность при рассеянном склерозе (РС) относится к ощущению жесткости и широкому спектру непроизвольных мышечных спазмов (длительных мышечных сокращений или внезапных движений). Спастичность является одним из наиболее распространенных симптомов РС и может варьироваться в зависимости от мягкой напряженности до болезненных, неконтролируемых спазмов конечностей. При отсутствии лечения спастичность может привести к серьезным осложнениям, включая контрактуры (замороженные или иммобилизованные суставы) и пролежни. Применяемые в настоящее время варианты лечения спастичности MS включают, например, баклофен, тизанидин, диазепам, дантролен, фенол. Было показано, что рецепторы CB1 опосредуют управление спастичностью на мышиной модели РС. (Pryce et al, 2007, Br J Pharmacol. 150(4): 519-525).

[0140] Активация рецепторов CB1 вызывает болеутоляющие эффекты у нескольких экспериментальных моделей боли, включающих висцеральную боль, возникающую из желудочно-кишечного тракта. Было показано, что агонисты CB1, такие как WIN55,212-2 и SAB-378, ингибируют болевые реакции на повторяющиеся болевые раздражители (Brusberg et al, 2009, J. Neuroscience, 29 (5): 1554-1564; Talwar et al., 2011, CNS Neurol Disord Drug Targets. 10(5):536-44.)

[0141] Специалист в данной области сможет путем обычного экспериментирования определить, какое эффективное, нетоксичное количество антитела (или другого терапевтического средства) может быть назначено для лечения ассоциированного с CB1 заболевания или расстройства. Например, терапевтически активное количество полипептида может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания (например, стадия I по сравнению с стадией IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, иммуносупрессивные состояния или заболевания) и масса индивидуума, и способность антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Режим дозирования можно скорректировать для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, несколько разделенных доз можно вводить ежедневно, или дозу можно пропорционально уменьшить, как указано, в зависимости от терапевтической ситуации. Однако обычно эффективная доза находится в интервале примерно от 0,05 до 100 миллиграммов на килограмм массы тела в день и в варианте осуществления примерно от 0,5 до 10 миллиграммов на килограмм массы тела в день.

[0142] В некоторых вариантах осуществления антитела против СВ1 и фрагменты, раскрытые в данном описании, используют в способах, использующих сочетанную терапию, при которой человеческие антитела вводят индивидууму вместе с другим терапевтическим средством, таким как одно или несколько дополнительных антител, которые связывают другие мишени (например, с антителами, которые связывают другие цитокины или молекулы клеточной поверхности). Поскольку избыточность сигнальных путей может привести к отсутствию ответа на одно антитело, были предложены разные стратегии сочетанной терапии с использованием антител, которые связываются с разными эпитопами или разными антигенами на одной и той же клетке-мишени. Сочетания, такие как сочетание антитела против CD20 и антитела против CD22 (Stein et al., Clin Cancer Res, 2004, 10: 2868-2878), антитела против CD20 и антитела против HLA-DR (Tobin et al., Leuk Lymphoma 2007, 48: 944-956), антитела против CD20 и антитела против TRAIL-R1 (Maddipatla et al., Clin Cancer Res 2007, 13: 4556-4564), антитела против IGF-1R и антитела против EGFR (Goetsche et al., Int J Cancer 2005, 113: 316 -328), антитела против IGF-1R и антитела против VEGF (Shang et al., Mol Cancer Ther 2008, 7: 2599-2608), или трастузумаба и пертузумаба, которые направлены на разные участки человеческого EGFR2 (Nahta et al., Cancer Res 2004, 64: 2343-2346), оценивают до клинических испытаний, с демонстрацией усиленной или синергической противоопухолевой активности in vitro и in vivo. В таких сочетанных терапиях преимущественно используют более низкие дозы вводимых терапевтических средств, что позволяет избежать возможных токсических эффектов или осложнений, связанных с различными монотерапиями.

[0143] Антитела и фрагменты, раскрытые в данном описании, можно вводить в сочетании с любым желаемым терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления раскрытые в данном описании антитела и фрагменты вводят в сочетании, например, с антителом против LOXL2, антителом против TGFβ, нинтаданибом, ингибитором тирозинкиназы, агонистом PPAR, агонистом фарнезоидного Х-рецептора (FXR), агонистом рецептора глюкагоноподобного пептида 1 или ингибитором каспазы.

IV. Фармацевтические композиции

[0144] В следующем аспекте изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие антитело против CB1 или его фрагмент.

[0145] Способы получения и введения индивидууму раскрытых в данном описании антител, или их фрагментов, хорошо известны специалистам в данной области или легко определяются ими. Раскрытые в данном описании антитела или их фрагменты можно вводить перорально, парентерально, путем ингаляции или местно. Используемый в данном описании термин "парентеральный" включает внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. В некоторых вариантах осуществления можно использовать внутривенные, внутриартериальные, подкожные и внутримышечные формы парентерального введения. Хотя все эти формы введения четко рассматриваются как находящиеся в рамках раскрытого в данном описании объема, формой для введения будет являться раствор для инъекций, в частности для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного введения. Как правило, фармацевтическая композиция, подходящая для инъекций, может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующее средство (например, человеческий альбумин) и т. д. Однако в других способах, совместимых с принципами настоящего изобретения, полипептиды могут доставляться непосредственно к участку неблагоприятной клеточной популяции, тем самым увеличивая воздействие терапевтического средства на пораженную ткань.

[0146] Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и буферную среду. В настоящем изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, 0,01-0,1 М (например, 0,05М) фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствор. Другие обычные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, растворы Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательные пополняющие вещества, электролитные пополнители, такие как пополнители на основе декстрозы Рингера и т. п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы и т.п. Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (где композиции растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей в той степени, в которой существует возможность введения через шприц. Она должен быть стабильной в условиях производства и хранения и в варианте осуществления будет консервироваться против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может являться растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и с использованием поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью разных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. В некоторые варианты осуществления в композицию включают изотонические средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Прлонгированное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто путем включения в состав средства, который задерживает всасывание, например моностеарат алюминия и желатин.

[0147] В любом случае стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения активного соединения (например, одного антитела или антитела в сочетании с другими активными средствами) в требуемом количестве в подходящем растворителе с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными в данном описании, по мере необходимости, с последующей фильтрующей стерилизацией. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способами получения могут быть вакуумная сушка и лиофилизация, что дает порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из ранее стерильно отфильтрованного раствора. Препараты для инъекций обрабатывают, заполняют в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или флаконы, и запечатывают в асептических условиях в соответствии со способами, известными в данной области. Кроме того, препараты могут быть упакованы и реализованы в виде набора, такого как описанные в находящихся на рассмотрении заявок США Сер. № 09/259,337 и США Сер. № 09/259,338, каждая из которых включена в настоящее описание посредством ссылки. Такие изделия в варианте осуществления имеют этикетки или вкладыши в упаковки, указывающие, что соответствующие композиции применимы для лечения индивидуума, страдающего от аутоиммунных или неопластических нарушений или предрасположенного к ним.

[0148] Эффективные дозы стабилизированных антител или их фрагментов, раскрытых в данном описании, для лечения вышеописанных состояний изменяются в зависимости от множества разных факторов, включающих способы введения, сайт-мишень, физиологическое состояние пациента, независимо от того, является ли пациент человеком или животным, других назначаемых препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, но также можно лечить млекопитающих, не являющихся людьми, включая трансгенных млекопитающих. Лекарственные дозы могут быть титрованы с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области, для оптимизации безопасности и эффективности.

[0149] Для пассивной иммунизации антителом, описанным в данном описании, дозировка может варьироваться, например, примерно от 0,0001 до 100 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг и т. д.) массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг или в конкретных вариантах осуществления по меньшей мере 1 мг/кг. Дозы, промежуточные в вышеуказанных интервалах, также должны находиться в пределах объема, раскрытого в данном описании.

[0150] Индивидуумам можно вводить такие дозы ежедневно, в чередующиеся дни, еженедельно или в соответствии с любым другим графиком, определяемым эмпирическим анализом. Примерное лечение включает введение нескольких доз в течение длительного периода, например, по меньшей мере, в течение шести месяцев. Дополнительные иллюстративные схемы лечения влекут за собой введение один раз в две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев. Примерные схемы дозирования включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в течение последовательных дней, 30 мг/кг в чередующиеся дни или 60 мг/кг в неделю. В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных антитела с разной специфичностью связывания, и в этом случае дозировка каждого вводимого антитела может находиться в пределах указанных интервалов.

[0151] Антитела или их фрагменты, раскрытые в данном описании, могут вводиться несколько раз. Интервалы между разовыми дозами могут быть, например, ежедневными, еженедельными, ежемесячными или ежегодными. Интервалы также могут быть нерегулярными, на что указывает измерение уровня полипептида или молекулы-мишени у пациента. В некоторых способах дозировка регулируется для достижения определенного содержания в плазме или антител токсинов, например, 1-1000 мкг/мл или 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитела или их фрагменты можно вводить в виде композиции с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируются в зависимости от периода полувыведения антитела у пациента. В целом, гуманизированные антитела показывают самый длинный период полувыведения, за которым следуют химерные антитела и нечеловеческие антитела. В одном варианте осуществления антитела или их фрагменты, раскрытые в данном описании, можно вводить в неконъюгированной форме. В другом варианте осуществления раскрытые в данном описании антитела можно вводить несколько раз в конъюгированной форме. В еще одном варианте осуществления антитела или их фрагменты, раскрытые в данном описании, можно вводить в неконъюгированной форме, затем в конъюгированной форме или наоборот.

[0152] Дозировка и частота введения могут варьироваться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях композиции, содержащие настоящие антитела или их смесь, вводят пациенту, который еще не находится в состоянии заболевания, для повышения устойчивости пациента. Такое количество определяется как "профилактическая эффективная доза". При таком использовании точные количества снова зависят от состояния здоровья пациента и общего иммунитета, но обычно варьируются от 0,1 до 25 мг на дозу, особенно от 0,5 до 2,5 мг на дозу. Относительно низкая доза вводится с относительно небольшими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение пожизненно.

[0153] В терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка (например, примерно от 1 до 400 мг/кг антитела на дозу, с дозами от 5 до 25 мг, которые чаще используются для радиоиммуноконъюгатов и более высоких доз для конъюгирования с молекулами типа цитотоксин-лекарственное средство) при относительно коротких интервалах, пока прогрессирование заболевания не будет снижено или прекращено, и, в конкретных вариантах осуществления, пока пациент не покажет частичное или полное улучшение симптомов заболевания. После этого пациенту можно вводить профилактический режим.

[0154] В одном варианте осуществления индивидуум может подвергаться лечению молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей описанный в данном описании полипептид (например, в векторе). Дозы для кодирующих полипептиды нуклеиновых кислот варьируются примерно от 10 до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30 до 300 мкг ДНК на пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируются от 10-100 или более, вирионов на дозу.

[0155] Терапевтические средства можно вводить парентеральным, местным, внутривенным, оральным, подкожным, внутриартериальным, внутричерепным, внутрибрюшинным, интраназальным или внутримышечным средствами для профилактического или терапевтического лечения. Внутримышечную инъекцию или внутривенную инфузию можно применять для введения описанного в данном описании антитела. В некоторых способах терапевтические антитела или их фрагменты вводят непосредственно в череп. В некоторых способах антитела или их фрагменты вводят в виде композиции или устройства с замедленным высвобождением, такого как устройство Medipad™.

[0156] Средства, раскрытые в данном описании, могут необязательно вводиться в комбинации с другими средствами, которые эффективны при лечении расстройства или состояния, нуждающегося в лечении (например, профилактическими или терапевтическими). Дополнительными средствами являются те, которые являются признанными в данной области и обычно вводятся для конкретного расстройства.

[0157] Несмотря на то, что при использовании ¹³¹I и ⁹⁰Y накоплен большой клинический опыт, в данной области известны и другие радиоактивные метки, которые использовались в аналогичных целях. Для визуализации используются другие радиоизотопы. Например, дополнительные радиоизотопы, которые совместимы с объемом настоящего изобретения, включают, без ограничения, ¹²³I, ¹²⁵1, ³²P, ⁵⁷Co, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁷⁷Br, ⁸¹Rb, ⁸¹Kr, ⁸⁷Sr, ¹¹³In, ¹²⁷Cs, ¹²⁹Cs, ¹³²I, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Pb, ²⁰⁶Bi, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁵³Sm, ¹⁸⁸Re, ¹⁹⁹Au, ²²⁵Ac, ²¹¹A ²¹³Bi. В этом отношении все альфа-, гамма- и бета-излучатели совместимы c настоящим изобретением. Кроме того, с учетом настоящего раскрытия, предусматривают, что специалист в данной области может легко определить, какие радионуклиды совместимы с выбранным курсом лечения без неоправданных экспериментов. С этой целью дополнительные радионуклиды, которые уже использовались в клинической диагностике, включают ¹²⁵I, ¹²³I, ⁹⁹Tc, ⁴³K, ⁵²Fe, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, а также ¹¹¹In. Антитела также метили множеством радионуклидов для потенциального использования в целевой иммунотерапии (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111, 1987). Эти радионуклиды включают ¹⁸⁸Re и ¹⁸⁶Re, а также ¹⁹⁹Au и ⁶⁷Cu, в меньшей степени. В патенте США № 5460785 приведены дополнительные данные, касающиеся таких радиоизотопов, и он включен в данное описание посредством ссылки.

[0158] Как обсуждалось ранее, антитела или их фрагменты, раскрытые в данном описании, можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения in vivo расстройств у млекопитающих. В этой связи будет понятно, что раскрытые антитела или их фрагменты будут составлены таким образом, чтобы облегчать введение и повышать стабильность активного средства. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат фармацевтически приемлемый нетоксичный стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и тому подобное. Для целей настоящей заявки фармацевтически эффективное количество антитела, описанного в данном описании, конъюгированного или неконъюгированного с терапевтическим средством, будет удерживаться в количестве, достаточном для достижения эффективного связывания с мишенью, и для достижения благоприятного воздействия, например, для улучшения симптомов заболевания или расстройства или обнаружения вещества или клетки. В случае опухолевых клеток полипептид в определенных вариантах осуществления способен взаимодействовать с выбранными иммунореактивными антигенами на неопластических или иммунореактивных клетках и обеспечивать увеличение смертности этих клеток. Конечно, фармацевтические композиции, раскрытые в данном описании, могут вводиться в виде разовой или множественной дозы для обеспечения фармацевтически эффективного количества полипептида.

[0159] В соответствии с объемом настоящего раскрытия раскрытые в данном описании антитела могут вводиться человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для получения терапевтического или профилактического эффекта. Раскрытые в данном описании полипептиды могут вводиться такому человеку или другому животному в обычной лекарственной форме, полученной путем комбинирования описанного в данном описании антитела с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными способами. Специалисту в данной области техники будет понятно, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя диктуется количеством активного ингредиента, с которым он должен быть объединен, способом введения и другими хорошо известными переменными. Специалисты в данной области техники также поймут, что смесь, содержащая один или несколько видов полипептидов в соответствии с настоящим изобретением, может оказаться особенно эффективной.

[0160] Также раскрыт в данном описании способ лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией CB1 или повышенной чувствительностью к CB1, включающий пероральное, парентеральное введение пациенту или другому индивидууму раствора для инъекций, введение посредством ингаляции или местно фармацевтически эффективного количества антитела против CB1.

[0161] Также в данном описании раскрыто применение фармацевтически эффективного количества антитела против СВ1 для изготовления лекарственного средства для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией CB1 или повышенной чувствительностью к CB1, включающее пероральное, парентеральное введение пациенту или другому индивидууму раствора для инъекций, введения посредством ингаляции или местно.

[0162] В некоторых вариантах осуществления раскрытые выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты имеют преимущество минимального проникновения в мозг. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их фрагменты проявляют высокую селективность к рецептору CB1 и не пересекают гематоэнцефалический барьер или не демонстрируют пониженного проникновения через гематоэнцефалический барьер относительно низкомолекулярных соединений, воздействующих на рецептор CB1, так что побочные эффекты в ЦНС сводятся к минимуму. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их фрагменты не проникают через гематоэнцефалический барьер или проявляют пониженное проникновение через гематоэнцефалический барьер относительно низкомолекулярных соединений, действующих на рецептор CB1, таких как римонабант, после внутривенной инъекции.

[0163] В одном варианте осуществления раскрытые в данном описании антитела и их антигенсвязывающие фрагменты или варианты можно вводить индивидууму по меньшей мере одним способом, выбранным из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутримышечного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутрицелиального, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутрикишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, интрапростатического, внутрилегочного, интраректального, внутрипочечного, внутриретинального, интраспинального, внутрисуставного, интраторакального, интратимпанального, внутриматочного, внутрипузырного, интравитреального, болюсного, субконъюнктивального, вагинального, ректального, буккального, подъязычного, интраназального и трансдермального способов введения.

[0164] Настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела и фрагменты, а также композиции, содержащие такие выделенные антитела, фрагменты и нуклеиновые кислоты. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие выделенные антитела или их фрагменты или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела или фрагменты, и дополнительно содержащие один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители включают, например, эксципиенты, разбавители, инкапсулирующие материалы, наполнители, буферы или другие средства.

ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ АСПЕКТОВ И ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0165] Разные раскрытые здесь аспекты и варианты их осуществления можно объединять друг с другом. Кроме того, любой из описанных выше аспектов и вариантов их осуществления можно объединить с любым из конкретных аспектов и вариантов осуществления, описанных ниже.

[0166] Ниже приведены некоторые конкретные аспекты и варианты осуществления, которые служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения:

[0167] 1. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, которое характеризуется значением Kd примерно 1 мкМ или менее.

[0168] 2. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, которое характеризуется значением Kd примерно 100 нМ или менее.

[0169] 3. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, которое характеризуется значением Kd примерно 10 нМ или менее.

[0170] 4. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, которое характеризуется значением Kd примерно 1 нМ или менее.

[0171] 5. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент связывается с внеклеточным эпитопом рецептора CB1.

[0172] 6. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент связывается с человеческим рецептором CB1.

[0173] 7. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент ингибирует сигнальную активность рецептора CB1.

[0174] 8. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнала, передаваемого рецептором CB1, которая по меньшей мере эквивалентна по величине активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0175] 9. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнала, передаваемого рецептором CB1, которая по меньшей мере в 3 раза превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0176] 10. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнала, передаваемого рецептором CB1, которая по меньшей мере эквивалентна по величине активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют путем ингибирования опосредованного агонистом рецептора CB1 фосфорилирования ERK.

[0177] 11. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнала, передаваемого рецептором CB1, которая по меньшей мере в 3 раза превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют путем ингибирования опосредованного агонистом рецептора CB1 фосфорилирования ERK.

[0178] 12. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент активирует рецептор CB1 или повышает его активность.

[0179] 13. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент представляет собой аллостерический модулятор рецептора CB1.

[0180] 14. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент представляет собой обратный агонист рецептора CB1.

[0181] 15. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент являются мышиными.

[0182] 16. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент являются химерными.

[0183] 17. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент являются гуманизированными.

[0184] 18. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент селективно связывают CB1.

[0185] 19. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело конъюгировано со средством, например, с другим терапевтическим средством, цитотоксическим средством, молекулой иммуноадгезии или визуализирующим средством.

[0186] 20. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где средство представляет собой другое терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекулу иммуноадгезии или визуализирующее средство.

[0187] 21. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 20, где терапевтическое средство представляет собой римонабант.

[0188] 22. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по по варианту осуществления 20, где визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0189] 23. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 18, где антитело не обладает агонистической или антагонистической активностью.

[0190] 24. Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное конкурировать за связывание с рецептором CB1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0191] 25. Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное специфически связываться по существу с тем же эпитопом рецептора CB1, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1.

[0192] 26. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где котором антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит: вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26; и вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0193] 27. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент содержит константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 12, 20 и 28, и константный участок легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 16, 24 и 32.

[0194] 28. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 и константный участок легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0195] 29. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

[0196] 30. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; константный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и константный участок легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[0197] 31. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; константный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 28; вариабельной участки легкой цепи SEQ ID NO: 30 и константный участок легкой цепи SEQ ID NO: 32.

[0198] 32. Способ оказания антагонистического воздействия на CB1, включающий приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с антителом или связывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0199] 33. Способ оказания агонистического воздействия на CB1, включающий приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с антителом или связывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0200] 34. Способ лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическое воздействие или агонистическое воздействие на рецептор CB1, у индивидуума, нуждающегося в этом, где способ включает введение индивидууму антитела или антигенсвязывающего фрагмента по варианту осуществления 1.

[0201] 35. Способ по варианту осуществления 34, где индивидуум представляет собой человека.

[0202] 36. Способ детекции CB1, включающий приведение клетки в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0203] 37. Способ по варианту осуществления 34, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, неалкогольного стеатогепатита (NASH), заболевания печени, первичного билиарного цирроза, почечного заболевания, фиброза почек, хронической болезни почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, рака и воспалительных заболеваний.

[0204] 38. Способ по варианту осуществления 34, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из боли, рассеянного склероза и глаукомы.

[0205] 39. Способ по варианту осуществления 37, где заболевание или расстройство представляет собой фиброз.

[0206] 40. Способ по варианту осуществления 37, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент оказывает антагонистическое воздействие на CB1.

[0207] 41. Способ по варианту осуществления 38, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент оказывает агонистическое воздействие на CB1.

[0208] 42. Способ диагностики заболевания или расстройства, связанного с CB1, где способ включает контактирование клетки с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0209] 43. Способ определения прогноза для индивидуума, у которого диагностировано заболевание или расстройство, связанное с CB1, где способ включает измерение экспрессии CB1 путем приведения клетки в контакт с антителом или его фрагментом по варианту осуществления 1.

[0210] 44. Способ по вариантам осуществления 42-43, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, NASH, заболевания печени, первичного билиарного цирроза, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака, воспалительного заболевания, боли, спастичности MS и глазных заболеваний, включащих глаукому.

[0211] 45. Способ по варианту осуществления 44, где заболевание или расстройство представляет собой фиброз.

[0212] 46. Способ по варианту осуществления 36, где выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгируют с визуализирующим средством.

[0213] 47. Способ по варианту осуществления 46, где визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0214] 48. Способ по вариантам осуществления 42-43, где клетка находится в организме индивидуума.

[0215] 49. Способ по варианту осуществления 48, где индивидуум представляет собой человека.

[0216] 50. Клетка-хозяин, экспрессирующая выделенное антитело или фрагмент по варианту осуществления 1.

[0217] 51. Способ получения антитела или его фрагмента, способного специфически связываться с CB1, где способ включает иммунизацию млекопитающих очищенным рецептором CB1, или его антигенным фрагментом, комплексами CB1/липид, и/или ДНК, кодирующей рецептор CB1.

[0218] 52. Способ по варианту осуществления 51, где антитело или его фрагмент получают из гибридомной клеточной линии, содержащей клетки, полученные из иммунизированных млекопитающих.

[0219] 53. Способ по варианту осуществления 51, где антитело или его фрагмент получают из фаговой библиотеки.

[0220] 54. Способ получения антитела или его фрагмента, способного специфически связываться с CB1, где способ включает получение фаговой библиотеки, содержащей вариабельные участки тяжелой и легкой цепей из человеческих первичных лимфоцитов крови, и пэннинг фаговой библиотеки на связывание с рецептором CB1.

[0221] 55. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 352, 353 и 354 соответственно.

[0222] 56. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи с последовательностями SEQ ID NO: 355, 356 и 357 соответственно.

[0223] 57. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичные аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 352, 353 и 354, соответственно.

[0224] 58. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% гомологичные аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 355, 356 и 357, соответственно.

[0225] 60. Антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное специфически связываться с тем же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из вариантов осуществления, перечисленных или раскрытых здесь.

[0226] 61. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит: CDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 443-463; CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 464-577, и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 578-625.

[0227] 61. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит: CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 626-661; CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 662-742, и CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 742-824.

[0228] 62. Выделенное антитело или его фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой гуманизированное антитело.

[0229] 63. Описанное здесь выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит участок Fc человеческого IgG1.

[0230] 64. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, по любого из предыдущих вариантов осуществления, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит модифицированный участок Fc.

[0231] 65. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 64, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит участок Fc, выбранный из группы, состоящей из гибрида IgG2/IgG4, IgG2, содержащего мутации A330S и P331S, и IgG4, содержащего мутацию S228P.

[0232] 66. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-341, и, необязательно, последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 337.

[0233] 67. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 66, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит константный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 342.

[0234] 68. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 66, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351, и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: ID NO: 338.

[0235] 69. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 341, и константный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 или SEQ ID NO: 435.

[0236] 70. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 340, и константный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 или SEQ ID NO: 435.

[0237] 71. Выделенное антитело, или его фрагмент, содержащее нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-351 и SEQ ID NO 436-824.

[0238] 72. Выделенное гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с CB1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 100 нМ или менее.

[0239] 73. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 72, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 5 нМ или менее.

[0240] 74. Выделенное гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с CB1, где антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере в 10 раз превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где активность измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0241] 75. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере в 5 раз превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где активность измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0242] 76. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере эквивалентна по величине активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0243] 77. Выделенное гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способное связываться с CB1, где антитело или фрагмент проявляют более высокую активность, чем соответствующее негуманизированное или химерное антитело, где гуманизированное антитело или фрагмент и соответствующие негуманизированное или химерное антитело содержат одинаковые CDR тяжелой и легкой цепи, и где активность измеряют путем ингибирования опосредованной агонистом рецептора CB1 передачи сигнала с помощью анализа цАМФ.

[0244] 78. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 77, где гуманизированное антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере в 2 раза превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0245] 79. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту 78, где гуманизированное антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере в 3 раза превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0246] 80. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 79, где гуманизированное антитело или фрагмент проявляет ингибирующую активность в отношении рецептора CB1, которая по меньшей мере в 5 раз превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0247] 81. Описанное здесь выделенное гуманизированное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или фрагмент обладают пониженной способностью проникать в мозг, или не способны проникать в мозг.

[0248] 82. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 81, где способность антитела или фрагмента проникать в мозг ниже, чем соответствующая способность низкомолекулярного агониста или антагониста рецептора CB1.

[0249] 83. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 81, где антитело или фрагмент оказывает более низкие побочные эффекты на центральную нервную систему (ЦНС), чем низкомолекулярный агонист или антагонист рецептора CB1.

[0250] 84. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 83, где низкомолекулярный агонист или антагонист рецептора CB1 представляет собой AM6545, AM251, таранабант или римонабант.

[0251] 85. Способ лечения заболевания или расстройства, реагирующего на антагонистическое или агонистическое воздействие на рецептор CB1, у индивидуума, нуждающегося в этом, где способ включает введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 55-84.

[0252] 86. Способ по варианту осуществления 85, где индивидуум представляет собой человека.

[0253] 87. Способ по варианту осуществления 85, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, NASH, заболевания печени, первичного билиарного цирроза, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака, воспалительного заболевания, боли, спастичности MS и глазных заболеваний, включая глаукому.

[0254] 88. Способ по варианту осуществления 85, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент обладают пониженной способностью проникать в мозг, или не способны проникать в мозг.

[0255] Хотя вышеприведенное изобретение описывается более подробно посредством иллюстрации и примера с целью облегчения понимания, для рядового специалиста в данной области будет очевидно, что некоторые изменения и модификации можно осуществить, не отступая от сущности или объема прилагаемой формулы изобретения. Нижеследующие примеры приведены только для иллюстрации, но не для ограничения. Для специалистов в данной области также будет очевидно, что существует ряд некритических параметров, которые можно изменять или модифицировать с получением практически аналогичных результатов.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Иммунизация мышей для получения антител против рецептора CB1

[0256] Последовательность кДНК и праймеры для клонирования человеческого рецептора CB1 получают на основе исходной последовательности ПабМед NCBI NM_001160258. Рецептор CB1 экспрессируют путем временной экспрессии с использованием липофектамина в клетках 293 или путем получения стабильных клеточных линий. Для получения стабильной клеточной линии pcDNA4/TO, конструкцию нативного полноразмерного человеческого рецептора CB1 трансфицируют в клетки Trex-CHO и Trex-293, индуцируемые тетрациклином. Клетки культивируют в присутствии антибиотиков зеоцина и бластицидина. Клоны, которые экспрессируют CB1 при индукции тетрациклином, идентифицируют методом FACS после окрашивания антителом против рецептора СВ1, R&D (Clone 368302). Получают мембраны и используют их для иммунизации либо непосредственно, либо после солюбилизации мембранных белков в детергенте с последующей очисткой с использованием талона. Очищенный рецептор CB1 стабилизируют в липидном бислое. Комплекс CB1/липид обозначают iCAPS рецептора CB1.

[0257] Мышей Balb/c иммунизируют в течение 2 циклов с использованием ДНК рецептора CB1 с последующей стимулирующей иммунизацией с использованием мембран рецептора CB1 или iCAPS рецептора CB1. Образцы крови берут до и после иммунизации, а сыворотку тестируют на связывание с мембранами, экспрессирующими рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами методом ELISA. После того, как мышиная сыворотка начинает давать положительный сигнал на мембраны, содержащие рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами, мышей умерщвляют, селезенки удаляют и используют для получения гибридом и фаговых библиотек.

Пример 2. Извлечение лимфоцитов, выделение B-клеток, гибридизация и отбор гибридом, связывающих рецептор CB1

[0258] Селезенки иммунизированных мышей удаляют и получают суспензии одиночных клеток. Для получения суспензий одиночных клеток селезенки переносят на сито, помещенное поверх 50 мл конической центрифужной пробирки, и поршень 3 мл шприца используют для измельчения клеток селезенки. Эритроциты лизируют ледяным буфером ACK в течение 10 мин, добавляют 5 мл DMEM и клетки центрифугируют. Эту стадию повторяют один раз, и клетки ресуспендируют до концентрации 2×10⁷/мл в среде DMEM.

[0259] Извлечение и получение клеток миеломы: клетки SP2/0 высевают при плотности приблизительно 5×10⁴ клеток/мл и пассируют каждые 2 дня. Перед слиянием клеток родительские клетки миеломы собирают путем центрифугирования в 50 мл конической центрифужной пробирке при комнатной температуре (КТ) при 500 g в течение 10 минут. Клетки промывают 3 раза, добавляя 30 мл бессывороточной среды и повторяют центрифугирование. Супернатант удаляют пипетированием и осадок клеток ресуспендируют в 25 мл среды и доводят до концентрации жизнеспособных клеток 2×10⁷/мл.

[0260] Слияние клеток: клетки миеломы и клетки селезенки смешивают в соотношении 1:5. Смесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут, а затем супернатант отбрасывают для получения клеточного осадка. Клеточную смесь промывают дважды рабочим буфером для гибридизации и центрифугируют с получением клеточного осадка. Клеточный осадок осторожно ресуспендируют в буфере для слияния до конечной концентрации клеток 8×10⁷/мл. В ванну с электродами добавляют клеточные смеси и проводят электрослияние. Клетки оставляют на 5 минут после слияния, промывают 1× средой DMEM, предварительно нагретую среду HAT добавляют к слитым клеткам до конечной концентрации 0,5×10⁶ B-клеток/мл. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета добавляют клеточную суспензию (5 × 10⁴ В-клеток). Средняя эффективность слияния составляет 1 гибридому/1×10⁴ В-клеток, поэтому протокол нацелен на 5 гибридом в каждой лунке.

[0261] Культура гибридомных клеток. Слитые гибридомные клетки культивируют в инкубаторе для культивирования клеток при 5% СО2, 37°С. Условия роста гибридомы проверяют ежедневно. Колонии обычно становятся видимыми через 5 дней. Среду заменяют свежей средой DMEM на 7-й день до положительного результата скрининга.

[0262] Положительный скрининг: через 7-9 дней после слияния клеток, когда колония становится больше, 100 мкл супернатанта из каждой лунки с гибридомой переносят в отдельную лунку нового 96-луночного планшета и анализируют методом ELISA с использованием белка CB1.

Пример 3. Получение и скрининг фаговых библиотек

[0263] Экстракция общей РНК: ткань селезенки собирают в раствор для стабилизации РНК. Небольшой фрагмент замороженной ткани (~ 30 мг) гомогенизируют в ступке, охлажденной жидким N2, и измельчают до мелкого порошка. Реагент TRIzol® добавляют при энергичном встряхивании вручную в течение 30 секунд. 1 мл переносят в 1,5 микроцентрифужные пробирки при комнатной температуре 2-3 мин и дают отстояться при комнатной температуре в течение нескольких минут. К смеси добавляют 0,2 мл хлороформа на 1 мкл раствора и энергично встряхивают вручную в течение 30 секунд. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и затем центрифугируют при 12000 g в течение 20 мин при 4°С. Водную фазу удаляют и переносят в новую пробирку. В пробирку добавляют равный объем изопропилового спирта и перемешивают в течение 30 секунд. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин смесь центрифугируют при 12000 g в течение 15 минут при 4°С. Осадок промывают добавлением 500 мкл 75% этанола и центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин при 4°С. Полученный осадок общей РНК сушат на воздухе и растворяют в 50 мкл воды без РНКазы на 1 мкг ожидаемой РНК.

OD измеряют при 260 нм и 280 нм для разведения образца РНК 1:10.

[0264] Получение кДНК: синтез первой нити кДНК проводят с помощью коммерческого набора (Invitrogen, Cat. No: 18080-051), вкратце, 20 мкг общей РНК смешивают с 5 мкМ олигонуклеотида (dT) 20 и 1 мМ dNTP в DEPC-обработанной воде в 40 мкл и инкубируют при 65°С в течение 5 мин, затем добавляют 80 мкл RT-буфера с 5 мМ MgCl2, 10 мкМ DTT, 16 единиц РНК-азы OUT и 80 единиц обратной транскриптазы Superscript III. Полученную смесь инкубируют при 50°С в течение 50 мин и инактивируют нагревом перед добавлением 4 мкл РНКазы Н для удаления остаточной РНК. кДНА используют для последующего построения библиотеки.

[0265] Химерную Fab-библиотеку создают следующим образом: вариабельные участки тяжелой цепи или легкой цепи амплифицируют с помощью праймеров, специфичных для тяжелых или легких цепей, представляющих несколько семейств зародышевых линий, описанных в Barbas et al, с использованием матрицы кДНК мыши, полученной выше. Константные участки тяжелой цепи и легкой цепи человека, CH1 и CL1, соответственно, амплифицируют из существующего клона pCOM3xTT. Вариабельный участок тяжелой цепи и константный участок соединяют друг с другом путем перекрывающейся ПЦР. Полученную тяжелую цепь и легкую цепь снова связывают путем перекрывания ПЦР, чтобы получить фрагмент ДНК химерной Fab-ДНК, который клонируют в модифицированный вектор pCOM3x в виде вставки Sfil-фрагмента путем лигирования. Лигированную библиотечную ДНК очищают и трансформируют в высокоэффективную компетентную клетку SS320. Количество полученных уникальных трансформантов было не менее 5 × 10⁷.

[0266] Для пэннинга фаговых библиотек фаговую библиотеку из иммунизированной мыши дважды вычитают в иммунопробирках Maxisorp (Thermo Scientific), покрытых пустым iCAPS, затем дважды вычитают Dynabeads MyOne Streptavidin Tl (Life Technologies), покрытые биотинилированным белком Bril. Все стадии вычитания продолжают в течение 30 минут. Между тем, биотинилированный рецептор CB1 iCAPS покрывают Dynabeads MyOne Strepavidin Tl (Life Technologies). Вычитаемый фаговый пул и CB1 iCAPS на шариках затем смешивают вместе с небиотинилированным белком Bril и пустым iCAPS для конкуренции и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре с вращением. Шарики отделяют от связующей смеси магнитом и промывают несколько раз, чтобы удалить несвязанный фаг (5 раз в 1-м цикле, по 10 раз в Цикле 2 и 3). Связанный фаг элюируют дважды глициновым буфером pH2,2 в течение 10 минут каждый. Элюаты объединяют, нейтрализуют с помощью Tris-HCl pH 8,0 и используют для инфицирования TGI-клеток для получения фага для следующего цикла пэннинга.

После 3 циклов пэннинга отдельные колонии собирают и подвергают скринингу с помощью моноклонального ELISA.

[0267] Для скрининга соединений, связывающих фаги, отдельные колонии TGI, инфицированные продуктом, полученным в результате пэннинга, собирают в 96-луночные планшеты, содержащие среду 2YT/карбенициллин/глюкоза, и встряхивают в течение ночи при 30°C. На следующий день небольшой объем насыщенной культуры переносят в свежую среду 2YT/карбенициллин/глюкоза и встряхивают при 37°C до достижения OD при 600 нм, равной 0,6-0,7. Затем культуру инфицируют K07-хелперным фагом. Зараженные клетки TGI цетрифугируют, повторно суспендируют в среде 2YT/карбенициллин/канамицин и встряхивают при 30°C в течение ночи. Между тем 96-луночные планшеты Maxisorp (Thermo Scientific) покрывают стрептавидином (Вако) при 4°С в течение ночи. На третий день биотинилированные антигены иммобилизовали на покрытых стрептавидином планшетах, которые затем блокируют 3% обезжиренным молоком в PBST. Клетки TGI снова центрифугируют. Фаг, содержащий супернатанты, блокируют в 3% обезжиренном молоке и затем загружают в планшеты для ELISA и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. После трех циклов промывки PBST в планшеты добавляют мышиное HRP-антитело против M13 (HR Health), разбавленное 1:2000 3% обезжиренным молоком в PBST, и инкубируют в течение еще одного часа при комнатной температуре.

Планшеты трижды промывают PBST, затем проявляют TMB (Biopanda). НСl добавляют к планшетам, чтобы остановить реакцию. Поглощение при 450 нм считывают на прецизионном устройстве для считывания микропланшетов Emax (Molecular Devices). Клоны, связанные с iCAPS, специально отбирают для дальнейшей характеризации и секвенирования.

[0268] Извлекают колонии E. coli, укрывающие плазмиды, которые продуцируют Fab, отображенные на фаге. Плазмидную ДНК экстрагируют и секвенируют для получения информации Fab ДНК. Специфические праймеры конструируют для амплификации V-участка тяжелой цепи, продукт ПЦР клонируют в pTT5-HCV3, модифицированную версию экспрессирующего вектора pTT5, ранее обработанную рестрикционными ферментами Apal и Sacl, впереди тяжелой константного участка человека путем бесшовного клонирования. Конкретные праймеры также были предназначены для амплификации всей участки легкой цепи фрагмента Fab. Полученный фрагмент ПЦР клонируют в pTT5-IL2-LCC, модифицированный вектор pTT5, обработанный EcoRI и Notl путем бесшовного клонирования. Полученные 2 плазмиды подтверждают секвенированием.

Пример 4. Гибридома

[0269] Гибридомные клетки (lxlO 7) собирают и общую РНК экстрагируют с использованием Tri Reagent, как описано выше для ткани селезенки. кДНК получают с использованием набора Superscript III в соответствии с инструкцией производителя, описанной выше. Полученный кДНК-продукт используют в качестве матрицы для ПЦР с праймерами VhRevU и VhForU, полученный продукт PCR 300 п.о. очищают с использованием набора для очистки ПЦР и секвенируют с тем же праймером. ПЦР-реакцию также проводят с использованием специфического праймера V-участка легкой цепи VkRev7 и VkFor (только для вариабельного участка) или праймеров KappaFor (для полноразмерной легкой цепи каппа). Реакции секвенирования проводят на очищенном ПЦР-продукте для получения последовательности ДНК.

Пример 5. Экспрессия и анализ IgG

[0270] Экспрессия IgG. Две плазмиды на основе pTT5, одна, содержащая тяжелую цепь, и другая, содержащая ДНК легкой цепи, совместно трансфицируют в клетки HEK293F для экспрессии IgG. За 24 часа до трансфекции клетки 293F разбавляют до плотности 8×105 клеток/мл. В день трансфекции клетки поддерживают на уровне 1,1-1,3 × 106 клеток/мл. Один мкг плазмидной ДНК используют для трансфекции 1 мл клеточной суспензионной культуры. 80 мкг ДНК рабавляют в 4 мл свежей произвольной среды 293F. 240 мкг трансфекционного реагента Полиэтиленимина (ПЭИ) разбавляют до конечного объема 4 мл произвольной среды 293F. Через 3 минуты инкубации 4 мл ДНК тщательно перемешивают с 4 мл PEI. 8 мл смеси ДНК и ПЭИ инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре и медленно добавляют в 80 мл суспензионной культуры клеток 293F. Клетки инкубируют на орбитальной платформе со скоростью 130 об/мин при 37°С при 5% СО2 и собирают через 4 дня.

[0271] Очистка IgG: 0,4 мл объема слоя белка A помещают в колонку объемом 1 мл и промывают 10 мл dH20 и 10 мл PBS, pH 8,0. Трансфицированные суспензии клеток 293F центрифугируют при 4000 об/мин в течение 45 минут при 4°С. Осадки отбрасывают, супернатант доводят до рН 8,0 на льду и загружают в подготовленную колонку с белком А. Когда загрузку супернатанта заканчивают, колонку промывают 5 мл рН 8,0 PBS и элюируют 4 мл 0,1 М раствора цитрата натрия-HCl pH 3,5. Элюат, содержащий IgG, нейтрализуют с помощью 200 мкл pH 8,8 1,5 М Трис-HCl-буфера и концентрируют с помощью концентратора объемом 30 кДа с объемом 4 мл. 4, 5мл PBS заполняют концентратор и центрифугируют. Окончательно, IgG заменяют и хранят в PBS. IgG детектируют посредством OD280, а чистоту определяют посредством геля SDS-PAGE и SEC.

[0272] Концентрации, объемы и выходы PA13R3-P1C4, полученные в четырех разных экспериментах, показаны в таблице 4. Концентрации, объемы и количества разных клонов приведены ниже в таблице 5.

Таблица 4. Экспрессия PA13R3-P1C4

Название Концентрация (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) Выход (мг/л) PA13R3-P1C4 0,3 200 60 0,75 PA13R3-P1C4 1,01 500 505 3,2 PA13R3-P1C4 0,49 500 245 1,5 PA13R3-P1C4 1,25 1250 1562,5 3,9

Таблица 5. Экспрессия клонов

Клон Концентрация (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) PA13R3-P1C4 (функциональный) 0,3 200 60 PA2LR3-P2D3 0,31 250 77,5 0,18 200 36 PA2LR3-P1G6 1,99 350 696,5 PA2LR3-P3B10 0,23 600 138 0,64 200 128 PA2R3-P1A7 1,93 400 772 3,1 300 930 0,06 250 15 1,07 1200 1284 PA2LR3-P1H4 1,94 300 582 PA2LR3-P4B1 1,62 250 405 0,98 200 196 PA2LR3-P4B5 0,8 200 160 0,85 450 382,5 0,61 200 122 1,68 600 1008 PA2LR3-P4G10 1,32 250 330 PA2LR3-P4C6 1,63 250 407,5 0,56 250 140 PA2LR3-P3B8 4,13 250 1032,5 PA2LR3-P2B8 1,01 550 555,5 1,78 500 890 1,1 500 550 3,3 900 2970 PA2LR3-P2E5 0,47 550 258,5 PA2R3-P1F1 0,8 500 400 PA2LR3-P3A8 1,65 200 330 PA2LR3-P3F8 1,97 150 295,5 PA2LR3-P5E7 0,74 250 185 PA2LR3-P6B12 2,45 200 490 PA2LR3-P6G7 0,92 200 184

Пример 6. Анализ связывания IgG с iCAPS CB1 методом ELISA

[0273] Очищенный IgG тестируют на связывание с очищенным рецептором CB1 (Системой Представления Конформации Антигена (iCAPS) CB1) с помощью ELISA. Небиотинилированные антигены (например, пустые iCAPS) покрывают непосредственно на планшетах Maxisorp. Первичными антителами являются очищенные IgG с серийными разведениями 1:3, инкубированные на планшете в течение 1 часа. После 3-х циклов промывки PBST добавляют вторичные HRP-козьи антитела против мышиного IgG (Abmart) или HRP-козьи антитела против человеческого IgG (Sigma) в зависимости от вида IgG и инкубируют в течение еще одного часа. Планшеты трижды промывают PBST, затем обрабатывают TMB (Biopanda). HCl добавляют в планшеты для прекращения реакции. Поглощение при 450 нм считывают на прецизионном считывающем устройстве для микропланшетов считывателе Emax (Molecular Devices). Данные по связыванию обобщены в Таблице 6.

Таблица 6. Связывание с CB1 iCAPS

Клон A139 EC50 (нМ) A138 EC50 (нМ) PA2LR3-P1G6 35 81 PA2LR3-P1H4 33,52 21,04 PA2LR3-P2B8 1,8 6,7 PA2LR3-P2D3 2,6 4,9 PA2LR3-P2E5 3,2 10 PA2LR3-P3B10 0,78 1,4 PA2LR3-P3B8 71 PA2LR3-P4B1 1,406 1,277 PA2LR3-P4B5 0,24 0,24 PA2LR3-P4C6 0,4 0,4 PA2LR3-P4G10 1,354 1,189 PA2R3-P1A7 3,5 7,5 PA2R3-P1F1 1,1 1,3 PA13R3-P1C4 0,175 0,1719

Пример 7. Анализ связывания IgG методом FACS

[0274] Исходные клетки TRex CHO, TRex CHO A56, сверхэкспрессирующие CB1 (CB1 T21OA/ партнер слияния), и TRex CHO A156 для интактного человеческого CB1 собирают из колб. 100 мкл клеток 1×10⁶/мл клеток инкубируют с первичными антителами IgG. РЕ-конъюгированное вторичное антитело против человеческого антитела и против мышиного антитела разбавляют в 1:200 раз. Антитело против человеческого Fab FITC разбавляют в 1:32 раза. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и переносят в пробирку Falcon BD 5 мл и анализируют с помощью проточной цитометрии. Связывание очищенного IgG первоначально тестируют при концентрациях 30 нМ и 300 нМ. Идентифицируют несколько связующих, как показано на Фиг. 1A-1F.

[0275] Для дополнительной оценки TRex CHO, TRex CHO A56, сверхэкспрессирующих CB1, интактные человеческие TRex CHO A156 CB1, 5HT2B, мышиный CB1 и человеческий CB2 используют для изучения специфичности связывания IgG, 100 мкл из 1 × 10⁶/мл клеток инкубируют с первичными антителами IgG при 3-кратных серийных разведениях от 1 мкМ до 0,5 нМ в течение 30 минут на льду. После двухкратного промывания 200 мкл буфера FACS клетки инкубируют со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. Клетки промывают 200 мкл буфера FACS дважды и переносят в пробирку BD Falcon объемом 5 мл и анализируют посредством FACS.

[0276] Кроличье поликлональное антитело против CB1, Santa Cruz, и вторичное FITC-конъюгированное антитело против кроличьего антитела используют для определения экспрессии мышиного CB1. Для подтверждения экспрессии CB2 и 5HT2B используют мышиное моноклональное антитело против CB2, R & D, и человеческий IgG P2C2. Оба вторичных антитела, против мышиного антитела и человеческого антитела, были конъюгированы с ПЭ.

[0277] Для выбранных связующих получают полные кривые связывания на рецепторе CB1 путем тестирования диапазона концентраций. Готовят трехкратные серийные разведения от 1 мкМ до 0,1 мкМ. Селективность определяют путем измерения связывания с клетками, экспрессирующими 5HT2B или CB2, по отношению к связыванию с A156 (экспрессия интактного человеческого рецептора CB1) или A56 (сверхэкспрессия рецептора CB1 с модификацией T210A и заменой ICL3 партнером по слиянию) с помощью проточной цитометрии. Как показано на Фиг. 2С и фиг. 2D, экспрессию CB2 и 5HT2B подтверждают с использованием мышиного моноклонального антитела против CB2 и P2C2 человека для подтверждения экспрессии CB2 и 5HT2B, соответственно. Для обнаружения CB2 и 5HT2B используют ПЭ-конъюгированные антитела против мышиных антител (для обнаружения против-CB2) и ПЭ-конъюгированные антитела против человеческих антител. Антитела PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 связываются селективно с CB1, как показано на Фиг. 2A и фиг. 2B. Кроме того, в Таблице 7 показаны концентрации и константы диссоциации (Kd) для каждой из нескольких партий PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2.

[0278] Результаты исследования демонстрируют, что IgG и Fab PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 связываются как с A56, так и с A156, но не с исходными TRex CHO, и не обладают перекрестной активностью в отношении 5ht2b, человеческого CB2 или мышиного CB1.

Таблица 7. Результаты проточной цитометрии для разных партий антител

IgG Концентрация Клеточная линия Kd PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A156 40,54 нМ PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A156 171 нМ PA13R3-P1C4 0,49 мг/мл A156 187 нМ PA13R3-P1C4 1,25 мг/мл A156 72,6 нМ 36E12B2E5 4 мг/мл A156 37,4 нМ 36E12B2H8 7,05 мг/мл A156 25,89 нМ 36E12B6C2 4,85 мг/мл A156 63,95 нМ 36E12B6F2 5,57 мг/мл A156 61,87 нМ 36E12B6C2 5,78 мг/мл A156 151,1 нМ 36E12B6C2 5,9 мг/мл A156 25,97 нМ 36E12B6C2 5,28 мг/мл A156 27,66 нМ PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A56 27,3 нМ PA13R3-P1C4 1,25 мг/мл A56 50,59 нМ 36E12B2E5 4 мг/мл A56 30,95 нМ 36E12B2H8 7,05 мг/мл A56 20,34 нМ 36E12B6C2 4,85 мг/мл A56 29,32 нМ 36E12B6F2 5,57 мг/мл A56 23,91 нМ 36E12B6C2 5,78 мг/мл A56 69,42 нМ 36E12B6C2 5,9 мг/мл A56 60,24 нМ 36E12B6C2 5,28 мг/мл A56 51,94 нМ

Пример 8. Конкурентный анализ

[0279] Интактные человеческие клетки CB1TREX CHO A156 используют для проверки того, связываются ли 36E12B6C2 и P1C4 с аналогичными эпитопами. Концентрации при EC80 и EC50 для P1C4 и 36E12B6C2 используют для окрашивания. Для конкуренции используют избыток IgG, Fab и 36E12B6C2 PA13R3-P1C4. 100 мкл 1×10⁶ клеток/мл клеток A156 инкубируют с IgG конкурента в течение 30 минут на льду, а затем окрашивающие IgG добавляют к смеси с 30-минутной инкубацией на льду. После двухкратного промывания 200 мкл буфера FACS, клетки инкубируют со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. Конъюгированное с ПЭ антитело против человеческого антитела и против мышиного антитела разбавляют в 1:200 раз. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и переносят в пробирку BD Falcon 5 мл и анализируют посредством FACS.

[0280] Результаты исследования показывают, что PA13R3-P1C4 Fab и IgG конкурируют с 36E12B6C2 за связывание CB1, предполагая, что PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 связываются с перекрывающимися эпитопами (Фиг. 3A и B). Конкурент 36E12B6C2, вносимый в концентрации от 100 нМ до 500 нМ, также может конкурировать с PA13R3-P1C4 за связывание с CB1.

Пример 9. Функциональный анализ цАМФ

[0281] Функциональный анализ цАМФ проводят для измерения антагонизма антител. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят в белом 384-луночном планшете с низким объемом (Greiner). 8000 клеток TRex CHO/лунку, стабильно экспрессирующих CB1, высевают в планшет с последующим инкубацией антагониста при разных концентрациях (от 10 мкМ до 0 мкМ) при комнатной температуре в течение 10 мин. 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и 9 мкМ каннабиноида CP55940 (Sigma Aldrich) добавляют к смеси для стимуляции клеток и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре для активации CB1. После 30-минутной инкубации, 5 мкг цАМФ-d2 (разведение 1:39 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) и 5 мкл против-цАМФ-криптата (разведение 1:9 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio), добавляют для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью многоканального считывающего устройства Envision (Perkin Elmer) при возбуждении против-цАМФ-криптата при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием GraphPad Prism.

[0282] Как показано на фиг. 4, два антитела, 36E12B2H8 (гибридома) и PA13R3-P1C4 (полученный фагом) проявляют антагонистическую активность, эквипотентную (36E12B2H8) или более высокую (PA13R3-PIC4), чем положительные контрольные группы с небольшой молекулой (обратные агонисты рецептора CB1 SR141716A (римонабант) и AM251 и нейтральный антагонист AM6545) с значениями IC50 350±28 нМ и 90+13 нМ, соответственно.

Пример 10: Анализ активации ERK.

Для дальнейшего подтверждения антагонистической активности mAb оценивали активацию ERK как часть сигнального пути рецептора CB1. За два дня до эксперимента рецепторные клетки Trex-CHO CB1 высевают при 500000 клеток/лунку в 6-луночные планшеты. 1 мкг/мл тетрациклина используют для индукции экспрессии рецептора CB1 через 24 часа. Клетки находятся в бессывороточной среде в течение по меньшей мере двух часов до эксперимента. Очищенные IgG при 300 нМ добавляют в культуральную среду, через 30 минут клетки стимулируют агонистом рецептора CB1а, WIN55212 (100 нМ) в течение 10 и 15 минут. Лизаты клеток собирают, и уровень активации ERK определяют вестерн-блоттингом. Антитела против ERK и фосфоспецифические антитела против ERK получают от Cell Signaling Inc.

[0284] Обработка агонистом рецептора CB1а WIN55212 индуцирует активацию ERK, что подтверждается увеличением сигнала фосфорилированной ERK. Общую ERK используют в качестве контроля загрузки вестерн-блоттинга, чтобы показать равную загрузку образцов. Как показано на Фиг. 5А, фаговое антитело PA13R3-P1C4 (300 нМ), но не контрольный IgG (нерелевантное связующее вещество) или PA13R3-P1E4, блокирует индуцированное WIN55212 (100 нМ) фосфорилирование ERK. Как показано на Фиг. 5В, гибридомные антитела 36E12B2E5, 36E12B6C2 и 36E12B6F2, но не контрольный IgG, блокируют индуцированное WIN55212 фосфорилирование ERK. AM6545 (нейтральный антагонист) используют в качестве положительного контроля, как показано на Фиг. 5A и 5B.

Пример 11. Функциональные анализы цАМФ

[0285] Функциональный анализ агониста цАМФ (Cisbio) проводят в белом 384-луночном планшете с низким объемом (Greiner). 8000 клеток/лунку стабильно экспрессирующих CB1 клеток TRex CHO высевают в планшет с последующим инкубацией агониста при разных концентрациях (от 1,5 мкМ до 0 мкМ) при комнатной температуре в течение 10 мин. Для проверки активности агонистов (фиг. 6А и 6В) к смеси для стимуляции клеток добавляют 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Для оценки активности положительного аллостерического модулятора (Фиг. 6C и 6D) в смесь стимуляции клеток добавляют 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и 1 мкМ CP55940 и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.

[0286] После 30-минутной инкубации 5 мкг цАМФ-d2 (разведение 1:39 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio), добавляют для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства Envision (Perkin Elmer) при возбуждении против-цАМФ криптата при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

[0287] Результаты скрининга агониста цАМФ идентифицируют четыре потенциальных IgG-агонистов, включая PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6G7 и PA2LR3-P6B12. В частности, PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1 и PA2LR3-P6G7 показывают EC50 > 300 нМ, как показано на Фиг. 6A и 6B. Кроме того, PA2LR3-P6B12 представляет собой потенциальный аллостерический модулятор с EC50 примерно 1000 нМ в присутствии CP55940, как показано на Фиг. 6C. Положительные и отрицательные контроли показаны на Фиг. 6B и 6D.

[0288] Также проводят анализ цАМФ, чтобы дополнительно характеризовать PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят в белых 384-луночных планшетах с низким объемом (Greiner). При 8000 клеток/лунку, клетки TRex-CHO, стабильно экспрессирующие CB1, высевают в планшет с последующим инкубацией с антагонистами, включающими AM6545, SR141716A, PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2, при концентрациях от 3 мкМ до 0 мкМ в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут инкубации к смеси для стимуляции клеток добавляют 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Для количественного определения получения цАМФ к смеси для стимуляции клеток добавляют 5 мкл цАМФ-d2 и 5 мкл против-цАМФ-криптата и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства EnVision (Perkin Elmer) при возбуждении против-цАМФ криптата при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Результаты исследования показаны на Фиг. 7. Ранее AM6545 и SR141716A были охарактеризованы как нейтральный антагонист и обратный агонист, соответственно.

Результаты функциональных анализов цАМФ показывают, что PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2 имеют аналогичные схемы ингибирования с SR141716A, что указывает на то, что PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2 являются обратными агонистами.

Пример 12. Анализ связывания iCAPS методом ELISA

[0289] Анализ связывания ELISA проводят для оценки связывания антител IgG или Fab антител CB1 с iCAPS, экспрессирующими CB1 (A138, содержащего замену нативной последовательности ICL3, с помощью последовательности белка 1 и A139, содержащей замену нативной последовательности ICL3 с BRIL), iCAPS, экспрессирующими 5HT2B (hl3h), пустой iCAPS или rBril-0918. Модифицированными IgG и Fab являются 36E12B6C2 IgG, 36E12B6C2 Fab, PA13R3-P1C4 IgG и PA13R3-P1C4 Fab, по сравнению с отрицательным контрольным связыванием BRIL P1F7 IgG и P1F7 Fab. Для IgG-антител вторичным антителом, используемым для обнаружения связывания, является против-мышиный IgG-HRP; для Fab вторичное антитело, используемое для обнаружения связывания, является антителом против человеческого IgG-HRP. Результаты исследования показаны на Фиг. 8А и 8В и ниже в Таблице 8. Для обоих соединений A138 iCAPS и A139 iCAPS 36E12B6C2 Fab дает более высокие значения EC50 относительно 36E12B6C2 IgG. Напротив, PA13R3-P1C4 IgG и Fab дают приблизительно эквивалентные значения EC50 для связывания как с A139, так и с A138. Ни одно из антител CB1 или Fabs не связывается с rBril-0918, пустыми iCAP или iCAPS, экспрессирующими 5HT2B. Контрольное mAb P1F7 распознает BRIL и, следовательно, показывает связывание с A139, содержащим слияние BRIL в ICL3, но не с A138, не имеющим BRIL.

Таблица 8. Значения EC50 для IgG и Fab 36E12B6C2 и PA13R3-P1C4, определенные методом ELISA

EC50 A139 A138 36E12B6C2 Fab 0,8054 1,017 36E12B6C2 IgG 0,19 0,2011 PA13R3-P1C4 Fab 0,27 0,23 PA13R3-P1C4 IgG 0,17 0,17

Пример 13. Исследование интернализации рецептора CB1

[0290] Влияние антитела против СВ1 на индуцируемую WIN55212 (CB1-специфическим агонистом) интернализацию CB1 исследуют посредством проточной цитометрии. 5 × 10⁵ клеток/лунку клеток TRex-CHO, стабильно экспрессирующих CB1, высевают в 6-луночный планшет. Тетрациклин (1 мкг/мл) добавляют в культуральную среду в течение 24 часов для индуцирования экспрессии CB1. В день эксперимента клетки находятся без сыворотки в течение 2 часов. Затем клетки предварительно инкубируют с антителом против CB1 (300 нМ), AM6545 (нейтральным антагонистом CB1) и отрицательным контролем (связующим BRIL) в течение получаса. Агонист CB1 (1 мкМ WIN55, 212) затем добавляют в культуральную среду в течение 1 часа, чтобы индуцировать интернализацию рецептора. Поверхностную экспрессию CB1 окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-конца CB1 из R & D, и определяют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) с использованием проточной цитометрии. Результаты исследования показаны на Фиг. 9 A. Обработка агонистом CB1 WIN55212 показывает уменьшение MFI по сравнению с контролем, что предполагает интернализацию CB1 (Фиг. 9A, верхний ряд гистограмм).

Предварительная обработка специфическим нейтральным антагонистом CB1 AM6545 блокирует индуцированную WIN55212 интернализацию рецептора CB1 (Фиг. 9 A, верхний ряд гистограмм). Предварительная обработка антителами против CB1 (300 нМ) не влияет на индуцированную WIN55212 интернализацию рецептора CB1 (Фиг. 9 A, средний и нижний ряды гистограмм).

[0291] Исследуют также влияние антитела против СВ1 на интернализацию рецептора. Через 2 часа нахождения в бессывороточной среде в культуральную среду в течение 1 часа добавляют 300 нМ антитела против СВ1, отрицательный контроль P2A12 (связующее BRIL) и агонист CB1, WIN55212. Клетки собирают и окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-конца мыши CB1 (R & D). Результаты исследования показаны на Фиг. 9B. Опять же, WIN55212 индуцирует интернализацию рецептора CB1 и блокируется предварительной обработкой нейтральным антагонистом CB1, AM6545 (Фиг. 9B, верхний ряд гистограмм). На поверхностную экспрессию CB1 не влияют антитела против СВ1, позволяя предположить, что антитела против СВ1 не индуцируют интернализацию рецепторов (Фиг. 9B, средний и нижний ряды гистограмм).

Пример 14. Активность гуманизированных антител против СВ1

[0292] Гуманизированные антитела P1C4 получают и тестируют на активность, специфичность и сродство. Для получения гуманизированных антител были выбраны человеческие каркасы P1C4 на основе гомологии между P1C4 и генами VH и VK человеческой зародышевой линии. Выбранные структуры имеют самую высокую гомологию с VH и VK участками PIC4, и их выбирают на основе компьютерного моделирования, как способные поддерживать структуру CDR, которая, как ожидается, будет представлена PIC4.

Получают следующие гуманизированные антитела: (1) P1C4-H0 - IgG; (2) P1C4-H2 (YE) - IgG (содержащий мутации G27Y и T28E в вариабельном участке тяжелой цепи); и (3) P1C4-H4 (YENG) - IgG (содержащий G27Y, T28E, A60N, мутации Q61G в вариабельном участке тяжелой цепи)

[0293] Анализ цАМФ проводят для определения активности химерных PA13R3-P1C4 и гуманизированных антител PA13R3-P1C4. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят в белых 384-луночных планшетах с низким объемом (Greiner). 8000 клеток/лунку человеческих клеток TRex-CHO, стабильно экспрессирующих нативный CB1, высевают в планшет с последующим инкубацией с Римонабантом (SR141716A), химерным PA12R3-P1C4, PA12R3-P1C4 HO (без обратной мутации), PA12R3-P1C4 H2 (YE), PA12R3-P1C4 H4 (YENG) и P2A12 (отрицательный контроль) при концентрациях от 1 мкМ до 0 мкМ в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут к смеси для стимуляции добавляют 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Для количественного определения продукции цАМФ добавляют 5 мкл цАМФ-d2 и 5 мкг против-цАМФ-криптата и инкубируют в течение одного часа. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства EnVision (Perkin Elmer) с возбуждением криптатом цАМФ при 620 нм и эмиссией при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

[0294] Результаты исследования представлены на Фиг. 10 и ниже в Таблице 9. Функциональный анализ цАМФ показывает, что гуманизированные P1C4-H2 и P1C4-H4 имеют IC50 21 нМ и 17 нМ соответственно. Таким образом, из тестируемых антител гуманизированные антитела H1C4-H2 и PIC4-H4 проявляют активность, даже большую, чем соответствующее химерное антитело, как измерено по ингибированию цАМФ.

Таблица 9. IC50 для химерных и гуманизированных антител против CB1

PA13R3-P1C4
Химерное P1C4-H0
Без мутации P1C4-H2
(YE) P1C4-H4
(YENG) Римонабант IC50 (нМ) 93 146 21 17 415

[0295] Сродство связывания, перекрестную реактивность и специфичность гуманизированных антител P1C4 определяют с помощью проточной цитометрии с родительскими клетками TRex CHO, TRex CHO А56, сверхэкспрессирующими CB1 (T21 OA/партнер гибридизации), нативными человеческими клетками CB1 TRex CHO A156, родительскими Trex (без CB1), мышиными CB1-клетками и человеческими CB2-стабильными клетками. 100 мкл клеток 1×10⁶ клеток/мл клеток инкубируют с химерными PA13R3-P1C4, гуманизированными P1C4-H0 (без мутации) P1C4-H2 (YE), P1C4-H2 (YE), P1C4-H4 (YENG) или P2A12 (контрольными) IgG при 3-кратных серийных разведениях от 300 нМ до 0,5 нМ в течение 30 минут на льду. После двухкратного промывания 200 мкл буфера FACS клетки инкубируют с конъюгированным с PE антителом вторичным антителом против человеческого антитела (Southern Biotech) в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и переносят в пробирку BD Falcon 5 мл и анализируют с помощью проточной цитометрии (BD FACScalibur).

Таблица 10. Сродство связывания и перекрестная реакционноспособность гуманизированных антител P1C4

Kd (нМ) TRexCHO A56
CB1 T210A/партнер по гибридизации TRexCHO A156
Нативный человеческий СВ1 TRexCHO
исходн. TRexCHO
мыш. CB1 TRexCHO
челов. CB2 PA13R3-P1C4
химерное 10,5 25 Нет связ. Нет связ. Нет связ. P1C4-H0
Без мутации 4,5 25 Нет связ. Нет связ. Нет связ. P1C4-H2
(YE) 4,2 9,4 Нет связ. Нет связ. Нет связ. P1C4-H4
(YENG) 4,0 9,6 Нет связ. Нет связ. Нет связ. P2A12
(контроль) Нет связ. Нет связ. Нет связ. Нет связ. Нет связ.

[0296] Результаты исследования показаны на Фиг. 11 и выше в Таблице 10. Гуманизированные антитела против СВ1 связываются с клетками A56 и клетками A156. Оба гуманизированных антитела P1C4-H2 и PIC4-H4 связываются с клетками TRex CHO A56 сверхэкспрессирующими CB1, а также с нативными человеческими клетками CB1 A156 с более высоким сродством по сравнению с химерным антителом P1C4 (фиг. 11A). Кроме того, ни одно из тестируемых антител не проявляет перекрестной реактивности с мышиным CB1 или с CB2 человека (Фиг. 11В).

Пример 15. Пониженная эффекторная функция антитела против CB1

[0297] Конструируют и тестируют антитела против CB1-антагонистов, предназначенные для проявления сниженной эффекторной функции. Получают антитела против антагониста CB1, имеющие одну или несколько следующих модификаций Fc: (1) константный участок IgG4 с мутацией серин-пролин в положении 228 (S228P); (2) константный участок IgG2 с мутацией аланин-серин в положении 330 (A330S) и мутацией пролин-серин в положении 331 (P331S); и (3) гибридная константный участок IgG2/IgG4. Полученные гуманизированные антитела против СВ1, имеющие 0, 2 или 4 обратных мутаций в каркасных участках, представлены как SEQ ID NO: 343-351. Антитела тестируют на степень связывания с рецепторами Fcγ и комплементом C1q с помощью ELISA. Полученные антитела против СВ1 также тестируют на их способность активировать первичные иммунные клетки человека in vitro. В частности, антитела CB1, имеющие одну или более модификацию Fc, тестируют на активацию иммунных клеток, например, путем оценки их сшивающей способности или способности антител индуцировать экспрессию маркеров активации.

[298] Результаты исследования показывают, что антитела к антагонисту CB1 имеют пониженное связывание с FcγR и/или пониженное связывание с Clq и/или сниженную активацию иммунных клеток по отношению к соответствующему антителу против антагониста CB1, которое не содержит модификации константного участка.

Пример 16. Исследование биораспределения

[0299] Исследование проводят для определения биораспределения антитела P4B5 против СВ1 in vivo у мышей. Антитело P4B5 маркировали Vivotag 680 XL (Perkin Elmer), и бесшерстным мышам (n=4 на группу) вводили ВВ инъекцией с использованием 5 мг/кг или 25 мг/кг меченого антитела. Визуализацию всего тела проводят с использованием томографии, опосредованной флуоресценцией (FMT) в следующие моменты времени: 0 часов (0 ч), 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч для измерения флуоресценции в разных тканях. Меченое P4B5 проявляет аналогичное сродство связывания с CB1-клетками относительно немеченого P4B5, как показано на Фиг. 12. EC50 для немеченого P4B5 составляет 60,5 нМ, а EC50 для антитела P4B5, меченого Vivotag 680 XL, составляет 57,8 нМ.

[0300] Результаты исследования показаны на Фиг. 13А и 13В. Меченое антитело обнаруживают на протяжении всего периода времени, как показано на Фиг. 13A.1 и A.2, на которых представлены данные для представительной мыши, которая получает более высокую дозу антитела (25 мг/кг). Однако при вычитании фонового сигнала от крови антитело против CB1 не обнаруживают в головном мозге (Фиг. 13B), что указывает на то, что антитело не проникает через гематоэнцефалический барьер после ВВ инъекции.

Пример 17. Экспрессия и анализ IgG для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4.

[0301] Среди разных подклассов человеческого IgG Fc-участки подклассов IgG2 и IgG4 слабо связываются с эффекторными молекулами, такими как активирующими FcγR или комплемент 1q (C1q), что приводит к снижению эффекторной функции. Чтобы минимизировать активацию иммунной эффекторной функции, гуманизированные антитела из ряда лидеров, P1C4-H2 и P1C4-H4, клонируют в 3 варианта каркасной человеческой Fc, IgG2, IgG4 и гибрид между IgG2 и IgG4 для дальнейшей характеризации.

[0302] Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H2 (SEQ ID NO: 340), вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H4 (SEQ ID NO: 341) и легкая цепь гуманизированного P1C4 (SEQ ID NO: 338) приведены ниже в Таблице 11. Остатки, выделенные жирным шрифтом, представляют собой мутации, а подчеркнутые остатки обозначают участки CDR. Чтобы получить варианты Fc в разных семействах IgG, используют три последовательности константного участка тяжелой цепи. Последовательность константного участка тяжелой цепи IgG2 (SEQ ID NO: 433), константного участка тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 434), константного участка тяжелой цепи гибридного IgG2/4 (SEQ ID NO: 435) показаны ниже в Таблице 11.

Таблица 11. Дизайн вариантов Fc

Антитело/Фрагмент Название или описание последовательности Последовательность SEQ ID NO: Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS 340 Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS 341 Полноразмерная легкая цепь гуманизированного P1C4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 338 Константный участок тяжелой цепи IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 433 Константный участок тяжелой цепи IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 434 Константный участок тяжелой цепи гибридного IgG2/4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 435 P1C4-H2-IgG2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 436 P1C4-H2-IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 437 P1C4-H2-IgG2/4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 438 P1C4-H4-IgG2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 439 P1C4-H4-IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 440 P1C4-H4-IgG2/4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 441 Гуманизированное P1C4-Lc EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 442

[303] Варианты антител экспрессируют и очищают в клетках 293FreeStyle, CHO-S и CHO-K1 в разных партиях в разные сроки.

[0304] Для экспрессии в FreeStyle 293, отдельные плазмиды pTT5, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей, котрансфицируют в клетки FreeStyle HEK293F для экспрессии полноразмерных IgG-антител. Клетки культивируют при 37°С с 5% CО2 в среде для экспрессии FreeStyle 293. За двадцать четыре часа до трансфекции клетки разбавляют до плотности 8 × 10⁵ клеток/мл. Для приготовления раствора для трансфекции 80 мкг ДНК (40 мкг легкой цепи+40 мкг тяжелой цепи) и 240 мкг полиэтиленимина (ПЭИ) разбавляют в 8 мл среды для Freestyle 293F, тщательно перемешивают и фильтруют через 0,2 мкм фильтр в верхней части шприца в коническую пробирку объемом 50 мл, затем инкубируют в течение 15 минут при 22°С. Восемь мл трансфекционного раствора медленно добавляют к 80 мл культуры клеток 293F (разбавленной средой для экспрессии FreeStyle 293 до плотности 1,1-1,3 × 10⁶ клеток/мл), которые затем инкубируют при 37°С с 5% СО2 с вращением при 130 об/мин в течение 4 дней. Супернатанты из трансфицированных клеточных культур собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 45 минут при 4°С, доводят до рН 8,0 с помощью 0,1 М NaOH и выдерживают на льду до очистки белка.

[0305] Для экспрессии CHO-S, отдельные плазмиды pTT5, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей, котрансфицируют в клетки CHO-S для экспрессии полноразмерных IgG-антител. Клетки культивируют в среде CD-CHO при 37°С с 5% СО2. За двадцать четыре часа до трансфекции клетки разбавляют до плотности 0,6-0,7 × 10⁶ клеток/мл в среде CD-CHO. В день трансфекции клетки разбавляют до плотности 1,1-1,3 × 10⁶ клеток/мл в среде CD-CHO в 250 мл встряхиваемых колбах. В каждую колбу для встряхивания объемом 250 мл добавляют 80 мл клеток. Восемьдесят мкг плазмидной ДНК (40 мкг легкой цепи+40 мкг тяжелой цепи) разбавляют до конечного объема 4 мл среды CD-CHO и фильтруют через 0,2 мкм фильтр в верхней части шприца в коническую пробирку объемом 50 мл. В отдельной конической пробирке объемом 50 мл 80 мкл реагента FreeStyle Max разбавляют до конечного объема 4 мл среды CD-CHO. Эти 2 смеси инкубируют при 22°С в течение 3 минут, прежде чем их объединяют, смешивают и инкубируют в течение дополнительных 15 минут при 22°С. 8 мл смеси реагента для ДНК/трансфекции медленно добавляют к 80 мл клеточной культуры в колбе объемом 250 мл. Это приводит к окончательной плотности клеток, равной ~ 1,0 × 10⁶ клеток/мл. Культуральную колбу затем инкубируют на орбитальной платформе для взбалтывания при 37°С с 5% CО2 при скорости 133 об/мин в течение 6 дней. Затем супернатанты культуры собирают центрифугированием (Allegra X-15R, Beckman) при 4000 × g в течение 40 минут при 4°С, доводят до рН 8,0 0,1 М NaOH и выдерживают на льду до очистки белка.

[0306] Очистку IgG из 293 FreeStyle и CHO-S проводят следующим образом: супернатанты загружают в колонки с белком А (объемом 0,4 мл), предварительно уравновешенные PBS pH 7,4, и обеспечивают проток под действие силы тяжести. Колонки промывают 5 мл PBS, pH 7,4, и белок элюируют 4 мл 0,1 М раствора цитрата натрия-HCl, pH 3,5. Элюент нейтрализуют 200 мкл трис-HCl-буфера с рН 8,8, концентрируют и производят замену буфера на PBS, pH 7,4, используя концентратор Amicon 30 кДа 4 мл (Millipore), согласно инструкциям производителя, до конечного объема приблизительно 0,5-1 мл. Концентрации белка определяют с помощью поглощения при 280 нм, и степень чистоты определяют с помощью SDS-PAGE и SEC.

[0307] Экспрессию белка и его очистку в CHO-K1 проводят с использованием запатентованных методов в контрактной исследовательской организации (CRO). Вкратце, для трансфекции используют клетки CHO-K1. IgG очищают шариками MAbelect™ SuRe™, а на стадиях промывки используют Дульбекко PBS (Lonza BE17-512Q). IgG элюируют 0,1 М глицином, рН 3,5

[0308] Для контроля качества (КК) белка для каждого теста используют 3 мкг антитела для анализа методами SDS-PAGE и SEC. Критериями прохождения КК являются чистота >90% в методе SDS PAGE и мономерный пик >90% в методе SEC. Для очищенного белка IgG, который проходит тесты КК, аликвоты белка помещают в пробирки с закручивающейся крышкой в объеме 100 мкл/пробирку с концентрацией ~5 мг/мл. Аликвоты быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -80°C.

Значения выхода белка в 293FreeStyle варьируют от низких значений мг/л до 53 мг/л. Выходы в клетках CHO-S являются низкими при примерно 1 мг/л. Выходы в клетках CHO-K1 варьируются от 198 мг/л до 350 мг/л. SDS-PAGE демонстрирует интактный белок, проходящий при примерно 150 кДа в невосстанавливающих условиях, и 2 полосы, представляющие тяжелую цепь и легкую цепь без видимых разушения или агрегации. Профили SEC и анализ SDS-PAGE для одной из партий 293 FreeStyle показаны на Фиг. 14A и одной из партий CHO-K1 на Фиг. 14B в качестве примеров. Данные по очистке белков для партий 293FreeStyle и CHO-S приведены в Таблице 12.

Таблица 12. Обобщенные данные по очистке белка mAb PA13R3-P1C4

Образец Конц. белка (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) Объем культ. (мл) Выход (мг/л) Мономер методом SEC (%) P1C4-H2-IgG2 2,10 11500 24150,00 600,00 40,25 >90 P1C4-H2-IgG2 2,94 500 1470,00 160,00 9,19 >90 P1C4-H2-IgG4 2,24 14400 32256,00 600,00 53,76 >90 P1C4-H2-IgG4 2,22 500 1110,00 160,00 6,94 >90 P1C4-H2-IgG4 (CHO-S) 0,28 250 69,00 80,00 0,86 >90 P1C4-H2-IgG2/4 2,18 12500 27250,00 600,00 45,42 >90 P1C4-H2-IgG2/4 1,01 600 606,00 160,00 3,79 >90 P1C4-H4-IgG2 2,23 7200 16056,00 600,00 26,76 >90 P1C4-H4-IgG2 3,43 750 2572,50 160,00 16,08 >90 P1C4-H4-IgG4 2,39 10700 25573,00 600,00 42,62 >90 P1C4-H4-IgG4 5,45 500 2725,00 160,00 17,03 >90 P1C4-H4-IgG4 (CHO-S) 0,28 250 68,75 80,00 0,86 >90 P1C4-H4-IgG2/4 2,02 9700 19594,00 600,00 32,66 >90 P1C4-H4-IgG2/4 3,14 750 2355,00 160,00 14,72 >90

Пример 18. Функциональные анализы цАМФ для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

[0309] Доступный для приобретения набор (Cisbio), основанный на формате конкурентного иммуноанализа с использованием меченого криптатом антитела против цАМФ и dAM-меченого цАМФ, используют для характеристики гуманизированных вариантов антител PA13R3-P1C4 путем измерения изменений внутриклеточных уровней цАМФ в клетках TRex-CHO, стабильно экспрессирующих CB1. Количество клеток, концентрацию форсколина и концентрацию СР55,940 оптимизируют в соответствии с инструкциями производителя. Функциональный анализ антагониста цАМФ проводят в белых 384-луночных планшетах с низким объемом (Greiner). Клетки TRex-CHO, экспрессирующие человеческий CB1, высевают при плотности восьми тысяч клеток/лунку в бессывороточную среду Хэма F12, а затем инкубируют с mAb или контрольным соединением при разных концентрациях при 22°C в течение 10 минут. Затем к клеткам добавляют пять мкМ форсколина (при EC20, Sigma Aldrich) и 9 нМ СР55,940 (в EC80, Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 минут при 22°C для усиления активности аденилатциклазы и активации сигнального пути CB1, соответственно. Затем к клеткам добавляют пять мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленными Cisbio) и 5 мкл против-цАМФ-криптата (разведение 1:9 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленными Cisbio), и инкубируют в течение 1 часа при 22°C. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства Envision (Perkin Elmer) при возбуждении криптата цАМФ при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием GraphPad Prism.

[0310] Активность гуманизированных антител PA13R3-P1C4 при этом анализе сравнивают с родительским химерным PA13R3-P1C4, римонабантом, низкомолекулярным обратным агонистом CBl и mAb P2A12, не-GPCR нацеливающим антителом отрицательного контроля mAb изотипа IgGl. PA13R3-P1C4 и его гуманизированные варианты, дозозависимым образом ингибируют индуцированное CP55,940 снижение внутриклеточных уровней цАМФ, в то время как отрицательный контроль P2A12 mAb не оказывает никакого эффекта (Фиг. 15). Средние значения IC50-SD для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 приведены в Таблице 13.

Таблица 13. Обобщенные данные по IC50 для гуманизированных вариантов P1C4, определенные анализом с антагонистом цАМФ

цАМФ IC50 (нМ) цАМФ IC50 (нМ) цАМФ IC50 (нМ) цАМФ IC50 (нМ) Среднее±SD [n] Среднее для Партии 1 [n] Среднее для Партии 2 [n] CHO-S [n] Химерное P1C4-IgG 138±21 [6]# 120±11 [3] 155±8 [3] Н/П P1C4-h0-IgG1 195±96 [5]# 158±57 [4] 343 [1] Н/П P1C4-h2-IgG1 41±4 [3]**, ## 41±4 [3] Н/П Н/П P1C4-h2-IgG2 84±13 [6]**, ## 77±13 [3] 91±11 [3] Н/П P1C4-h2-IgG4 61±13 [7]**, ## 54±8 [3] 63±17 [3] 72 [1] P1C4-h2-IgG2/4 79±13 [6]**, ## 74±14 [3] 85±13 [3] Н/П P1C4-h4-IgG1 42±7 [6]**, ## 40±6 [3] 44±7 [3] Н/П P1C4-h4-IgG2 81±19 [6]**, ## 82±28 [3] 80±13 [3] Н/П P1C4-h4-IgG4 54±9 [7]**, ## 54±12 [3] 54±11 [3] 51 [1] P1C4-h4-IgG2/4 80±17 [6]**, ## 69±9 [3] 90±17 [3] Н/П Римонабант 417±82 [3]* Н/П Н/П Н/П

*p <0,05, **p <0,005; и в сравнении с Римонабантом, # p <0,05, ## p <0,02.

[0311] Гуманизированные варианты P1C4-h2 и h4 являются более активными (в 1,6-3,3 раза), чем химерное PA13R3-P1C4 mAb при анализе антагониста цАМФ (p <0,005). Гуманизированные варианты P1C4-h2 и P1C4-h4 имеют сравнимую эффективность, в то время как среди разных изотипов гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 наблюдается тенденция более высокой эффективности вариантов IgG1 и IgG4 по сравнению с вариантами IgG2 и IgG2/4.

[0312] Авторы изобретения также характеризуют механизм антагонизма гуманизированного варианта антитела PA13R3-P1C4, в частности, являются ли такие антитела как обратные агонисты CB1 или нейтральные антагонисты. В качестве эталонных соединений используют Римонабант (SR141716A), известный обратный агонист CB1 и AM6545, известный нейтральный антагонист CB1.

[0313] Чтобы охарактеризовать действуют ли гуманизированные варианты антител PA13R3-P1C4 как обратный агонист или нейтральный антагонист, анализ цАМФ проводят в отсутствие экзогенного агониста. Форсколин, неспецифический аденилатциклазный активатор, добавляют в среду для оценки уровня базальных уровней цАМФ в пределах обнаружения. Функциональный анализ агониста цАМФ (Cisbio) проводят в белых 384-луночных планшетах с низким объемом (Greiner). Восемь тысяч клеток/лунку человеческих клеток TRex-CHO экспрессирующих CB1, в бессывороточной F12 среде ХМК высевают в планшет с последующим инкубацией mAb или контрольных соединений при разных концентрациях при 22°C в течение 10 минут. К клеткам добавляют пять мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 минут при 22°C. После 30-минутной инкубации при 22°С 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) и 5 мкл против-цАМФ криптата (разведение 1:9 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) добавляют к клеткам и инкубируют в течение 1 часа.

Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального планшета Envision (Perkin Elmer) при возбуждении криптата цАМФ при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием GraphPad Prism.

[0314] Авторы изобретения сравнивают активность гуманизированных вариантов P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 с римонабантом, AM6545 и антителом отрицательного контроля P2A12-IgGl в стимулированных 1,5 мкМ форсколина клетках TRex-CHO CB1 (Фиг. 16A), а также стимулированных 5 мкМ форсколина клетках TRex-CHO CB1 (Фиг. 16B). Результаты показывают, что P1C4-h2-IgG1, P1C4-h2-IgG2, P1C4-h2-IgG4 и римонабант дозозависимым образом увеличивают уровни цАМФ, что свидетельствует об обратном агонистическом механизме. Напротив, нейтральный антагонист CB1, AM6545, и антитело отрицательного контроля, P2A12-IgG1, не влияют на уровни цАМФ.

[0315] Анализ графика методом Шильда проводят для определения равновесной константы диссоциации (KB), которая является мерой сродства связывания антагониста к его рецептору, независимо от природы и концентрации используемого агониста. Кривые ответа на дозу агонистов CB1 CP55,940 и WIN55212 в аналитических тестах на антагонисты цАМФ с HTRF определяют в присутствии разных концентраций P1C4-h2-IgG4.

[0316] На Фиг. 17A-D показан эффект увеличения концентраций P1C4-h2-IgG4 на индуцированную CP55,940 и WIN55212 активность CB1 посредством анализа цАМФ (соответственно). Дозовое отношение (R) рассчитывают на основе EC50 для CP55,940 или WIN55212, посредством которых необходимо увеличить концентрацию агонистов CB1 (CP55,940 или WIN55212), чтобы получить тот же ответ в присутствии P1C4-h2-IgG4, как получают в его отсутствие. В Таблицах 14 и 15 ниже показан наклон Шильда и равновесная константа диссоциации (KB), измеренная в 4 разных экспериментах.

Таблица 14. Угол наклона Шильда и равновесная константа диссоциации для CP55,940

CP55,940 Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Эксперимент 4 Угол наклона Шильда 1,75 1,755 1,32 1,44 KB (нМ) 48 15 26 28

Таблица 15. Угол наклона Шильда и равновесная константа диссоциации для WIN55212

WIN55212 Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Эксперимент 4 Угол наклона Шильда 1,4 2,1 1,5 1,6 KB (нМ) 21 17 22,4 28

Пример 19. Анализ активации ERK для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

[0317] В Примере 10 и на Фиг. 5А показано, что родительское антитело PA13R3-P1C4 блокирует индуцированную WIN55212 активацию ERK. Чтобы подтвердить, что гуманизированные варианты PA13R3-P1C4 также блокируют индуцированную WIN55212 активацию ERK, авторы изобретения тестируют способность этих антител ингибировать индуцированное WIN55212 фосфорилирование ERK.

[0318] За два дня до эксперимента клетки, экспрессирующие рецептор TRex-CHO CB1, высевают при 500000 клеток/лунку в 6-луночные планшеты. 1 мкг/мл тетрациклина используют для индуцирования экспрессии рецептора CB1 через 24 часа. Клетки находятся в бессывороточной среде в течение по меньшей мере двух часов до эксперимента. Очищенные IgG при 300 нМ добавляют в культуральную среду, через 30 минут клетки стимулируют агонистом рецептора CB1, WIN55, 212 (100 нМ) в течение 10 и 15 минут. Лизаты клеток собирают, и уровень активации ERK определяют вестерн-блоттингом. Антитела против ERK и антитела против фосфоспецифической ERK получают от Cell Signaling Inc.

[0319] Как показано на Фиг. 18А, обработка агонистом CB1, WIN55212 повышает уровень фосфорилированной ERK, предполагая, что рецептор CB1 передает сигналы через путь ERK. Предварительная обработка специфическим антагонистом CB1, римонабантом, ингибирует индуцированную WIN55212 активацию ERK. Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против СВ1, P1C4-h2-IgGl и P1C4-h4-IgGl, ингибирует индуцированную WIN55212 активацию ERK (Фиг. 18A). P1C4-h0-IgGl не ингибирует индуцированную WIN55212 активацию ERK. Это согласуется с анализом антагониста цАМФ, который показал, что P1C4-h0-IgGl менее эффективен, чем другие гуманизированные варианты P1C4, и было высказано предположение об отсутствии эффекта на блокировки активации ERK, индуцированной WIN55212.

[0320] Исследуют также влияние P1C4-h2 в каркасах IgG2 и IgG4 на активированный ESC55,212 путь ERK. Подобно химерному PA13R3-P1C4 и гуманизированному P1C4-h2-IgG1, предварительная обработка антителом против СВ1, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 блокирует индуцированное WIN55212 фосфорилирование ERK (Фиг. 18B). Не-GPCR, нацеленный на mAb P2A12, не блокирует индуцированную WIN55212 активацию ERK. Эти результаты показывают, что эти каркасы Fc не влияют на характеристики антагониста PA13R3-P1C4.

Пример 20. Исследование интернализации рецептора CB1 для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4.

[0321] Для характеристики активности PA13R3-P1C4 и гуманизированных вариантов антител используют проточную цитометрию при анализе интернализации рецептора CB1 в присутствии или отсутствии агонистических или антагонистических соединений.

[0322] В день эксперимента клетки находятся без сыворотки в течение 2 часов. Затем клетки предварительно инкубируют с антителом против СВ1 (300 нМ), AM6545 (нейтральным антагонистом CB1) и отрицательным контролем (связующим BRIL) в течение получаса. Затем к культуральной среде в течение 1 часа добавляют агонист CB1 (1 мкМ WIN55, 212), чтобы индуцировать интернализацию рецептора. Поверхностную экспрессию CB1 окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-конца CB1 из R & D, и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяют с использованием проточной цитометрии (Guava).

[0323] Экспрессия CB1 в клетках TRex-293 индуцируется тетрациклином, что очевидно вследствие увеличения поверхностного окрашивания с использованием мышиного моноклонального антитела, нацеленного на N-конец CB1 (Фиг. 19 A, панель A, пунктирная линия). Обработка тетрациклином и агонистом CB1 WIN55212 уменьшает поверхностное окрашивание, что указывает на потерю CB1 на поверхности клетки в результате интернализации (Фиг. 19A, панель A, пунктирная линия). Предварительная обработка CB1-специфичным антагонистом, римонабантом (Фиг. 19 A, панель B, сплошная черная линия) ингибирует индуцированное агонистом снижение окрашивания CB1 на поверхности клеток. Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против СВ1 (PA13R3-P1C4 (Фиг. 19 A, панель D, сплошная черная линия), P1C4-h2-IgGl (Фиг. 19 A, панель F, сплошная черная линия) и P1C4-h4-IgGl (Фиг. 19 A, панель G, сплошная черная линия)) ингибирует индуцированную WIN55212 интернализацию рецептора CB1. P1C4-h0-IgGl (Фиг. 19A, панель E, сплошная черная линия) и антитело отрицательного контроля P2A12-IgGl (Фиг. 19A, панель C, сплошная черная линия) не ингибируют индуцированную WIN55122 интернализацию CB1. В соответствии с результатами анализов антагониста цАМФ и активацией ERК, P1C4-h0-IgGl является менее эффективным, чем другие гуманизированные варианты P1C4, а отсутствие эффекта блокирования индуцированной рецептором WIN55212 интернализации рецептора может быть связано с высокой скоростью диссоциации P1C4-h0-IgGl.

[0324] Среди разных подклассов человеческих IgG, участки Fc подклассов IgG2 и IgG4 плохо связываются с эффекторными молекулами, такими как активирующие FcγR и комплемент 1q (C1q), что приводит к снижению активности эффекторных функций. В связи с этим, P1C4-h2 клонируют в человеческие Fc-каркасы IgG2 и IgG4, так как для обозначенных в изобретении терапевтических применений активация иммунных эффекторных функций является нежелательной (обсуждается в примере 17). Затем анализируют гуманизированные варианты P1C4-h2-IgGl, P1C4-h4-IgG1, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 на предмет блокады интернализации рецептора CB1. Как указано выше, экспрессия CB1 в клетках TRex-293 индуцируется тетрациклином, что является очевидным по увеличению окрашивания поверхности с использованием мышиного моноклонального антитела, нацеленного на N-конец CB1 (Фиг. 19B, панель A, пунктирная линия). Обработка тетрациклином и агонистом CB1, WIN55212 уменьшает поверхностное окрашивание, указывая на потерю CB1 на поверхности клетки вследствие интернализации (Фиг. 19B, панель A, пунктирная линия). Предварительная обработка специфическим антагонистом CB1 (Фиг. 19B, панель B, сплошная черная линия) ингибирует индуцированное агонистом снижение окрашивания CB1 на поверхности клеток.

Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против СВ1 (PA13R3-P1C4 (Фиг. 19B, панель D, сплошная черная линия), P1C4-h2-IgGl (Фиг. 19B панель F, сплошная черная линия) и P1C4-h4-IgGl (Фиг. 19B, панель G, сплошная черная линия)) ингибирует индуцированную WIN55212 интернализацию рецептора CB1. P1C4-h0-IgGl (Фиг. 19B, панель E, сплошная черная линия) и антитело отрицательного контроля P2A12-IgGl (Фиг. 19B, панель C, сплошная черная линия) не ингибируют индуцированную WIN55122 интернализацию CB1.

Пример 21. Анализ связывания гуманизированных вариантов антител PA13R3-P1C4 методом проточной цитометрии

[0325] Сродство связывания гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 определяют методом проточной цитометрии с использованием клеток TRex CHO, стабильно трансфицирующих CB1. Собирают исходные клетки TRex CHO и клетки TRex-CHO, стабильно трансфицированные экспрессирующими конструкциями индуцируемого тетрациклином CB1 человека, человеческого CB2 или мышиного CB1. Для определения связывания тестируемых антител сто микролитров клеток при 1 × 10⁶ клеток/мл инкубируют с тестируемыми антителами с диапазоном концентраций между 1 мкМ и 1,3 нМ в течение 30 минут на льду. Затем клетки центрифугируют при 4°С со скоростью 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант аспирируют, и клетки промывают 200 мкл FACS-буфера. Процедуру промывки повторяют дважды. После окончательной промывки клетки повторно суспендируют в FACS-буфере, содержащем PE-конъюгированное вторичное антитело против Fc человека (разведение 1:200) и инкубируют при 4°С в течение 30 минут. Клетки промывают 200 мкл FACS-буфера дважды и анализируют с помощью проточной цитометрии (Guava). Анализ данных и измерение сродства связывания (KD) проводят с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Среднюю константу диссоциации (KD) гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 определяют путем усреднения по меньшей мере результатов 4 разных экспериментов с использованием по меньшей мере двух разных партий белка (Фиг. 20 A-D и Таблица 16).

Таблица 16. Средняя константа диссоциации (KD) гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

Сродство связывания KD (нМ) Сродство связывания KD (нМ) Среднее±SD [n] Среднее для партии 1 [n] Среднее для партии 2 [n] Среднее для партии 3 [n] PA13R3-P1C4 103±18 [7] 92 [3] 116 [3] 96 [1] P1C4-h0-IgG1 24±6 [7]*** 23 [4] 24 [3] 24 [3] P1C4-h2-IgG1 41±18 [4]** 41 [4] Н/П Н/П P1C4-h2-IgG2 78±24 [6] 74 [3] 77 [3] Н/П P1C4-h2-IgG4 57±11 [7]*** 59 [3] 59 [3] 43 [1] P1C4-h2-IgG2/4 82±24 [6] 82 [3] 82 [3] Н/П P1C4-h4-IgG1 37±12 [7]*** 37 [4] 37 [3] Н/П P1C4-h4-IgG2 65±26 [6]* 65 [3] 65 [3] Н/П P1C4-h4-IgG4 49±15 [7]*** 51 [3] 49 [3] 49 [1] P1C4-h4-IgG2/4 75±41 [6] 69 [3] 74 [3] Н/П

* p <0,05, **p <0,01, *** p <0,001.

[0326] Гуманизированные варианты, за исключением h2-IgG2, h2-IgG2/4 и h4-IgG2/4, показывают статистически значимое увеличение сродства связывания с CB1 человека по сравнению с родительским химерным антителом PA13R3-P1C4. Среднюю константу диссоциации для каждого вида определяют с использованием, по меньшей мере, двух разных белковых препаратов (кроме P1C4-h2-IgG1, который имеет только один белковый препарат). Константы диссоциации для каждого вида являются сопоставимыми между разными белковыми препаратами (Таблица 16). Значения сродства связывания вариантов P1C4-h2 и P1C4-h4 были сходными. Однако наблюдают небольшую тенденцию, хотя и не статистически значимую, более высокого сродства связывания вариантов IgG1 по сравнению с вариантами IgG2, IgG4 и IgG2/4.

[0327] P1C4-h0-IgGl имеет самую низкую измеренную константу диссоциации (KD 24 нМ). Однако максимальный сигнал FACS (средняя интенсивность флуоресценции) P1C4-hO-IgGl не достигает столь же высоких значений, как для других вариантов P1C4. Это может указывать на более высокую скорость диссоциации P1C4-h0-IgGl.

[0328] Селективность связывания и перекрестная реактивность PA13R3-P1C4 и его гуманизированных вариантов также характеризуются проточной цитометрией с использованием клеток TRex CHO, стабильно трансфицированных интересующими GPCR. В частности, определяют селективность связывания для CB1 в сравнении с CB2. Также определяют перекрестную реактивность с мышиным CB1. Для обнаружения экспрессии мышиного CB1 100 мкг клеток при 1 × 10⁶ клеток/мл инкубируют с поликлональным антителом против CB1 (Santa Cruz) с 1 мкг/100 на льду в течение 30 мин. Моноклональное антитело против CB2 мыши от R & D Systems используют для подтверждения экспрессии CB2. 100 клеток при 1 × ^106/мл клеток инкубируют с антителом против CB2 при 0,5 мкг/100 мкл на льду в течение 30 минут. После инкубации клетки затем центрифугируют при 4°С при 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант аспирируют и клетки промывают 200 мкл, FACS-буфера. Процедуру повторяют дважды. После окончательной промывки клетки повторно суспендируют в FACS-буфере, содержащем FITC-конъюгированное антитело против кроличьего антитела (разведение 1: 200) для обнаружения CB1 мыши, и PE-конъюгированное антитело против мышиного IgG (разведение 1:200) в случае CB2 экспрессируют и инкубируют при 4°С в течение 30 минут. После 30-минутной инкубации со вторичным антителом клетки затем центрифугируют при 4°С со скоростью 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант аспирируют для удаления избыточных вторичных антител. Клетки промывают 200 мкл FACS-буфера дважды и анализируют с помощью проточной цитометрии (Guava). Определяют связывание очищенного IgG по кривым полного концентрационного ряда от 1 мкМ до 1,3 нМ. Анализ данных и измерение сродства связывания (KD) проводят с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

[0329] Селективность связывания и перекрестную реактивность гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 для CB1 человека по сравнению с CB2 человека и мышиными CB1 показаны на Фиг. 20E-M. Подобно PA13R3-P1C4, гуманизированные варианты избирательно связываются с CB1 человека и CB2 человека. Никакого существенного связывания с мышиным CB1 не наблюдают при концентрациях до 1 мкМ, что указывает на отсутствие перекрестной реактивности с этим видом, несмотря на высокую аминокислотную идентичность между человеческим и мышиным CB1 во внеклеточных доменах (97% идентичности).

Пример 22. Измерение влияния замены ELC2 на связывание методом FACS

[0330] Чтобы проверить влияние мутаций ECL2 на способность P1C4 связываться с CB1, экспрессируемым на поверхности клетки, авторы получают конструкцию для клеточной экспрессии CB1 путем сайт-направленного мутагенеза. Вкратце, в качестве праймеров в реакции ПЦР используют 2 олигонуклеотида, Apollo_ECL2_h2m_F (CTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACTCAT TGATGAAACCTACCT) (SEQ ID NO: 826) и Apollo_ECL2_h2m_R (GGAAAATGTCT GAGCAAACAGATTGCAGTTTCTTGCAGTTCCAGCCTAGAG) (SEQ ID NO: 827) с использованием в качестве матрицы pcDNA4TO человеческого CB1. С помощью такой реакции вводят мутации E→K и H→L в ECL2, что делает последовательность ECL2 человеческого CB1 идентичной ECL2 мышиного CB1. 50 мкл реакционной смеси ПЦР содержит 10 мкл 5× буфера ПЦР, 2 мкг dNTP (10 мМ каждого), 0,25 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (100 мкМ исходного раствора), 50 нг матрицы ДНК, 1 мкл ДМСО и 1 мкл полимеразы Phusion (NEB). Циклы ПЦР проводят при 95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 1 минуты, 72°C в течение 7 минут и повторяют 16 раз. По окончании реакции ПЦР к ПЦР-продукту добавляют 1 мкл DpnI (20 Ед/мкл). Продукт ПЦР инкубируют при 37°C в течение 1 часа до трансформации 1 мкл в Dh5α E.coli. Полученные трансформанты помещают в планшет, и отдельные колонии секвенируют для подтверждения мутации. Полученную конструкцию называют pcDNA4TO-человеческий/мышиный ECL2 с заменой CB1-IRES-GFP.

[0331] Для подтверждения того, что сайты E→K и H→ L в ECL2 являются решающими для связывания CB1 с PA13R3-P1C4, временно трансфицированные клетки TRex-CHO с человеческим CB 1, мышиным CB1 или человеческими/мышиными ECL2-замененными экспрессирующими конструкциями используют для исследования связывания P1C4-h4-IgGl с помощью проточной цитометрии.

[0332] Клетки TRex-CHO выращивают в культуральной среде Хэма F12 с добавлением 10% зародышевой бычьей сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина и 10 мкг/мл бластидина. За день до трансфекции клетки пассируют и высевают при 0,5 × 10⁶ клеток в 2 мл культуральной среды на лунку в 6-луночном планшете. В день трансфекции клетки трансфицируют pcDNA4TO-человеческим CB1, pcDNA4TO-мышиным CB1-IRES-GFP, pcDNA4TO-человеческим/мышиным ECL2-замененным CBl-IRES-GFP или отрицательным контролем pcDNA4TO-GFP с использованием Lipofectamine 2000 следуя инструкциям Life Technologies. Через день после трансфекции клетки обрабатывают 1 мкг/мл тетрациклина в течение 24 часов для индукции экспрессии CB1. В день эксперимента среды аспирируют; клетки промывают DPBS один раз и инкубируют с буфером для диссоциации клеток в течение 5 минут. Клетки собирают и центрифугируют при 1600 об/мин в течение 3 минут. Супернатанты аспирируют и клетки промывают DPBS. Количество клеток определяют с использованием счетчика клеток Bio-Rad T10. Клетки центрифугируют при 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант аспирируют для удаления DPBS и ресуспендируют при 1 × 10⁶ клеток/мл FACS-буфера (3% FBS в DPBS, 0,09% азида натрия). Чтобы определить связывание mAb PA13R3-P1C4 с человеческим CB1, мышиным CB1, человеческим/мышиным ECL2-замененным CB1 и контрольными клетками, 100 мкл клеток при 1 × 10⁶ клеток/мл инкубируют с P1C4-h4-IgGl, CB1 mAb от R & D или P2A12 в течение 30 минут на льду. Вторичное PE-конъюгированное антитело против человеческого mAb или PE-конъюгированное антитело против мышиного mAb разбавляют при 1:200 в FACS-буфере. В качестве отрицательного контроля используют клетки, окрашенные только вторичным антителом. После инкубации со вторичным антителом клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии (Guava).

[0333] Как показано на Фиг. 21, P1C4-h4-IgG1 связывается с человеческим CB1, но не с мышиным CB1 или человеческим/мышиным ECL2-замененным CB1. Единственное различие между человеческим CB1 и человеческим/мышиным ECL2-замененным CB1, находится по остаткам ECL2 E→K и H→L. Результаты связывания, полученные методом проточной цитометрии, показывают, что ECL2 являются решающими для связывания P1C4. Моноклональное антитело против CB1 от R & D используют в качестве положительного контроля, показывающего экспрессию CB1. P2A12 и pcDNA4TO-GFP используют в качестве контроля окрашивания и пустого векторного контроля соответственно.

Пример 23. Анализ эффекторных функций ADCC и CDC

[0334] Чтобы подтвердить предполагаемое отсутствие эффекторной функции у гуманизированных вариантов P1C4, проводят анализы антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) для CCD-h2-IgG4 и P1C4-h2-IgG4 с использованием клеток Дауди.

[0335] Для анализа ADCC концентрацию целевых клеток Дауди доводят до 12,5 × 10⁴ клеток/мл средой ADCC. 80 мкл клеточной суспензии (1 × 10⁴ жизнеспособных клеток) добавляют в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном. Двадцать мкл антитела, разведенного последовательно в среде ADCC, распределяют в каждую лунку в трех повторностях. Конечные концентрации Ритуксимаб и против-hel-hIgG1 составляют: 0,128 нг/мл, 0,64 нг/мл, 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл; конечная концентрация против-hel-hIgG2, против-hel-hIgG4, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 составляет: 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл. Планшет инкубируют при 22-25°С в течение 30 минут. Концентрацию PBMC регулируют с помощью среды ADCC, так чтобы при добавлении 10 мкл клеток PBMC к клеткам-мишеням соотношение Эффектор:Мишень составляло соответственно 25: 1 и 50: 1. Планшет центрифугируют при 250 × g в течение 4 минут и затем инкубируют при 37°С. За 45 минут до сбора супернатанта 20 мкл раствора для лизиса из набора CytoTox 96 (Promega) добавляют к контрольным лункам для максимального лизиса. После 5-часовой инкубации планшет центрифугируют при 250 × g в течение 4 минут. 50 мкл супернатанта из каждой лунки переносят в чистый планшет для 96-луночного планшета. 50 мкл субстрата из набора CytoTox 96 (Promega) добавляют в каждую лунку и перемешивают в течение 30 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут до того, как в каждую лунку добавляют 50 мкл стоп-раствора и перемешивают в течение 30 секунд. Поглощение считывали при 490 нм. Для анализа данных: % лизиса рассчитывают с использованием GraphPad Prism 5,0 с получением IC50 следующим образом:

[0336] Ритуксимаб индуцирует эффект ADCC у клеток Дауди при IC50 1,19 нг/мл при соотношении E/T 50:1, 0,92 нг/мл при соотношении E/T 25:1. Как показано на Фиг. 22А-С, варианты антител P1C4 Fc не обладают эффектом ADCC при отношении E/T 50:1 и 25:1 у клеток Дауди.

[0337] Для анализа CDC клетки-мишени Дауди собирают и концентрацию клеток доводят до 80 × 10⁴ клеток/мл средой для культивирования клеток. В 96-луночный белый планшет с плоским дном добавляют 25 мкл/лунку клеток. Затем в каждую лунку в двух повторностях добавляют 12,5 мкл P1C4, Ритуксимаб, против-HEL-hlgGl и против-HEL-hIgG2, серийно разбавленные в среде ADCC. Конечные концентрации Ритуксимаб и против-hel-hlgGl составляют: 0,128 нг/мл, 0,64 нг/мл, 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл; конечная концентрация против-hel-hIgG2, против-helIgG4, P1C4-H2-IgG2 и P1C4-H2-IgG4: 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл. Планшеты инкубируют в вытяжном шкафу в течение 15 минут. Человеческий комплемент, разбавленный средой ADCC, добавляют к планшетам, содержащим клетки, при 12,5 мкл/лунку для достижения конечной концентрации 10%. Для лунок с максимальным лизисом добавляют 5 мкл раствора для лизиса. Конечный объем всех лунок доводят до 50 мкл средой ADCC. Планшеты инкубируют при 37°С в течение 2 часов до добавления 50 мкл раствора CTG к клеткам.

Планшеты встряхивают на шейкере для микропланшетов в течение 2 минут со скоростью 200 и затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Сигнал люминесценции был красным с использованием Envision. Для анализа данных: % цитотоксичности и IC50 вычисляют с использованием GraphPad Prism 5,0 следующим образом:

[0338] Эффект CDC у антител тестируют на клетках Дауди, лизис клеток Дауди под действием PBMC осуществляют методом анализа клеточного титра Glo, конечная концентрация комплемента составляет 10%. Ритуксимаб индуцирует эффект CDC у клеток Дауди с IC50 399 нг/мл. Как показано на Фиг. 22D, антитела к P1C4 Fc не обладают никаким эффектом CDC в клетках Дауди.

Пример 24. Распознавание денатурированного белка CB1 антителами P1C4

[0339] Исследование проводят, чтобы проверить, распознают ли PA13R3-P1C4 и его гуманизированные варианты антитела эпитоп (ы) на денатурированном белке CB1 (His-меченом CB1 с усеченными N/C-концами) с помощью вестерн-блоттинга. Очищенный белок CB1 человека (750 нг на полосу) смешивают с SDS-восстанавливающим буфером, содержащим бета-меркаптоэтанол (Double Helix). Денатурированный рекомбинантный белок CB1 загружают на 12% восстанавливающие гели SDS-PAGE, и белок отделяют при 120 В в течение одного часа, затем электропереносят на PVDF-мембраны (предварительно пропитанные метанолом) при 300 мА в течение 70 минут. Мембраны блокируют 5% NFDM/PBS-T в течение одного часа при 22°C с последующим иммуноблоттингом с тестируемыми антителами (2 мкг/мл) в 5% NFDM/PBS-T в течение ночи при 4°С. В качестве положительного контроля используют доступное для приобретения мышиное антитело против His мыши и мышиное антитело против CB1 (R & D Systems), а кроличье антитело против CB1 (Cayman), которое распознает C-концевую область, которая была удалена из рекомбинантного белка CB1, используемого в этом исследовании, служило отрицательным контролем.

[0340] После инкубации в течение ночи мембраны промывают 0,5% Tween-20 PBS (PBS-T) три раза при 22°C. Вторичные AP-конъюгированные антитела против IgG человека (1:5000) или против мышиного IgG или IgG кроликов в 5% NFDM/PBS-T добавляют к соответствующим мембранам, и инкубируют в течение 1 часа при 22°С. Каждую мембрану промывают три раза PBS-T в течение 5 минут. После окончательной промывки сигнал проявляют путем инкубации с раствором субстрата NBT/BCIP при 22°С, и реакцию останавливают промыванием мембраны под проточной водой.

[0341] Результаты Вестерн-блоттинга показывают, что антитела положительного контроля способны обнаруживать денатурированный белок CB1 с правильной кажущейся молекулярной массой 63 кДа (Фиг. 23B, полоса 9 и 10). Никакую полосу не обнаруживают отрицательным контрольным специфическим к С-концу антителом (Фиг. 23B, полоса 11), PA13R3-P1C4 (Фиг. 23 A, полоса 2) или гуманизированными вариантными антителами (Фиг. 23 A, полосы 3-6). Вторичное антитело против человеческого Fc, используемое в эксперименте, смогло обнаружить очищенный человеческий IgG (Фиг. 23A, полоса 1). Результаты показывают, что PA13R3-P1C4 и гуманизированные варианты антител не могут распознать денатурированный и линеаризованный CB1-белок. Вместе с экспериментами по проточной цитометрии эти результаты подтверждают, что PA13R3-P1C4 и гуманизированные варианты антител распознают конформационные, но не линейные эпитопы.

Пример 25. Связывание FACS и цАМФ химерным и гуманизированным P1C4 Fab

[0342] Для определения сродства связывания PA13R3-P1C4 Fab получают полные кривые связывания с рецептором CB1 путем тестирования методом проточной цитометрии в диапазоне концентраций с использованием клеток TRex-CHO, стабильно трансфицированных конструкцией экспрессии CB1, индуцируемой тетрациклином. Получают трехкратные серийные разведения от 3 мкМ до 0,1 мкМ. FITC-конъюгированное антитело против человеческого антитела используют для обнаружения PA13R3-P1C4 Fab, PA13R3-P1C4 Fab, связанные дозозависимым образом с клетками TRex-CHO CBl (Фиг. 24A и Таблица 17).

[0343] Функциональный анализ цАМФ проводят для измерения антагонизма P1C4 Fab. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят в белом 384-луночной планшете с низким объемом (Greiner). 8000 клеток/лунку стабильно экспрессирующих CB1 клеток TRex CHO высевают в планшет с последующим инкубацией P1C4 Fab при разных концентрациях при комнатной температуре в течение 10 минут. 5 мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и 9 нМ каннабиноида CP55940 (Sigma Aldrich) добавляют к смеси для стимуляции клеток и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре для активации CB1. После 30-минутной инкубации 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) и 5 мкл против-цАМФ криптата (разведение 1: 9 конъюгатом и лизисным буфером, предоставленным Cisbio) добавляют для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства Envision (Perkin Elmer) при возбуждении против-цАМФ криптата при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием GraphPad Prism.

Результаты показаны на Фиг. 24B и в Таблице 17. Среднее значение±SD IC50S и константы диссоциации (Kd) измеряют по меньшей мере в двух разных экспериментах.

Таблица 17. IC50 и константы диссоциации PA13R3-P1C4 Fab

Fab Линия клеток Kd методом
проточной цитометрии IC50 цАМФ анализ Химерное P1C4 Челов. CB1 130±9 нМ 427±121 нМ P1C4-h2 Челов. CB1 14±0,4 нМ 52±22 нМ P1C4-h4 Челов. CB1 16,2±2,3 нМ 43±5 нМ

Пример 26. Биофизическая характеризация гуманизированных вариантов P1C4

[0344] Авторы изобретения характеризуют стабильность и растворимость гуманизированных Fc-вариантов PA13R3-P1C4 путем проведения тестов для измерения стабильности при низком и высоком рН и для тестирования максимальной растворимости. Авторы изобретения также характеризуют стабильность этих молекул в ускоренных условиях, в человеческой сыворотке и сыворотке приматов, не являющихся человеком, после нескольких циклов замораживания/оттаивания и в условиях сдвига рН.

[0345] Для того чтобы охарактеризовать рН-стабильность гуманизированных вариантов P1C4 200 мкл каждого антитела (~ 5 мг/мл) и контроль PBS получают и вводят в кассету для диализа Pur-A-Lyzer Maxi 12000 (Sigma, Cat # PURX12015-1KT). Белки диализуют против 2 л буфера с pH 3 (0,1 М уксусной кислоты, доведенного до рН 3 NaOH) или буфера с pH 9 (0,2 М глицина, доведенного до рН 9 NaOH), соответственно при 4°С в течение ночи. Образцы белка извлекают из диализных кассет, переносят в предварительно взвешенные пустые пробирки Эппендорфа и проверяют на видимые осадки. Объем образца измеряют по массе. Чтобы подтвердить успех диализа, берут 3 диализованных образца и проверяют pH на индикаторной бумаге. Для анализа методом SEC отбирают пятьдесят мкл образцов. Остальные образцы выдерживают в инкубаторе при 40°C в течение 48 часов. После этого образцы снова проверяют на видимые осадки. Шесть мкл образца с 48-часовой инкубацией вводят в колонку TSK G3000SWXL SEC, и концентрацию белка вычисляют по площади SEC (после инкубации при 40°C). Для определения степени извлечения белка используют следующую формулу: До диализа (Об. ×, Конц. )/После диализа (Об. × Конц.) Х 100%.

[0346] Никакого осаждения 4-х IgG не наблюдают после диализа против буфера с рН 3 и против буфера с pH 9 с последующей 48-часовой инкубацией при 40°C. Для всех четырех IgG степень извлечения составляет примерно 71-83%. Низкая степень извлечения, вероятно, объясняется тем, что образец остается в диализной кассете. Мономерные IgG, рассчитанные по профилю SEC, составляют более 99% для всех 4 диализованных IgG. IgG в буфере с рН 3 после 48-часовой инкубации при 40°C демонстрируют более высокие пики SEC, что указывает на более высокую гетерогенность IgG после длительной инкубации в буфере с pH 3. Активность цАМФ и CB1-экспрессирующей активности связывания клеток измеряют в соответствии с Примерами 11 и 7, и результаты обобщают в Таблицах 18 и 19 соответственно. Результаты показывают, что при рН 3, активность цАМФ у P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 и P1C4-h4-IgG4 снижается, как и для P1C4-h4-IgG2 с рН 9.

Таблица 18. рН-стабильность гуманизированных вариантов P1C4: растворимость

Образец рН Исх. Конц.
(мг/мл) Исх. Об.
(мкл) Конц.
(мг/мл) Извлеч.
Об. (мкл) Степ.
Извлеч% Мономер
SEC(%) P1C4-H2-IgG2 3 4,6 200 3,79 189 77,86 >99 P1C4-H2-IgG4 3 5,2 200 4,06 184 71,83 >99 P1C4-H4-IgG2 3 4,6 200 3,85 177 74,07 >99 P1C4-H4-IgG4 3 5,5 200 2,99 282 76,65 >99 P1C4-H2-IgG2 9 4,6 200 4,23 176 80,92 >99 P1C4-H2-IgG4 9 5,2 200 4,6 182 80,50 >99 P1C4-H4-IgG2 9 4,6 200 4,26 179 82,88 >99 P1C4-H4-IgG4 9 5,5 200 4,77 188 81,52 >99

Образец рН Исх. Конц.
(мг/мл) Исх. Об.
(мкл) Конц.
(мг/мл) Извлеч.
Об. (мкл) Степ.
Извлеч% Мономер
SEC(%) P1C4-H2-IgG2 3 4,6 200 3,79 189 77,86 >99 P1C4-H2-IgG4 3 5,2 200 4,06 184 71,83 >99 P1C4-H4-IgG2 3 4,6 200 3,85 177 74,07 >99 P1C4-H4-IgG4 3 5,5 200 2,99 282 76,65 >99 P1C4-H2-IgG2 9 4,6 200 4,23 176 80,92 >99 P1C4-H2-IgG4 9 5,2 200 4,6 182 80,50 >99 P1C4-H4-IgG2 9 4,6 200 4,26 179 82,88 >99 P1C4-H4-IgG4 9 5,5 200 4,77 188 81,52 >99

Таблица 19. pH-стабильность гуманизированных вариантов P1C4: активность цАМФ

IC50 (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 pH3 83 104 115 139 pH9 87 85 97 64

[0347] Растворимость гуманизированных вариантов P1C4 характеризуют концентрированием 400 мкл IgG (~ 5 мг/мл) посредством центрифужной фильтрации (Amicon Ultra-0,5mL 30K) при 14000 × g при 4°C до ~100 мкл. Дополнительные 200 мкл IgG добавляют в центрифужные фильтры и концентрируют при 14000 g при 4°C до ~100 мкл. После этого в центрифужные фильтры добавляют еще 200 мкл IgG и концентрируют при 14000 × g при 4°C до ~100 мкл (всего от 800 мкл до 100 мкл). Концентрированный белок проверяют на видимые осадки путем пипетирования вверх и вниз. Затем концентрирование продолжают при при 14000 × g при 4°C, пока объем не становится меньше 50 мкл. Центрифужные фильтры переворачивают и устанавливают в предварительно взвешенную пустую пробирку. Центрифужные фильтры центрифугируют при 1000 × g в течение 5 минут при 4°C для сбора концентрированного образца. Пробирки взвешивают для получения образцов. Если видно количество осадков, пробирки центрифугируют при 14000 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатанты переносят в новые 1,5 мл пробирки Эппендорфа и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем центрифугируют при 14000 × g в течение 10 минут при 4°C, и супернатанты переносят в новые 1,5 мл пробирки Эппендорфа. Для характеристики SEC, 6 мкл супернатанта из концентрированного образца вводят в колонку TSK G3000SWXL SEC, и концентрацию белка, рассчитывают по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают как: конц. (об.×конц.) до/конц. (об.×конц.) после ×100%.

[0348] Четыре варианта Fc концентрируют до концентрации белка свыше 85 мг/мл. Степени извлечения белка составляют более 99%. Наблюдают незначительное видимое осаждение P1C4-h2-IgG4 при 93,9 мг/мл до и после 24-часовой инкубации при комнатной температуре. Никакого видимого осаждения для других 3 IgG при концентрации выше 85 мг/мл после 24-часовой инкубации при комнатной температуре не наблюдают. Мономерные IgG, рассчитанные по профилю SEC, составляют более 96% для всех 4 концентрированных IgG по сравнению с начальным уровнем при ~99%. Данные приведены в таблице 20.

Таблица 20. Растворимость гуманизированных вариантов P1C4

Образец Исх. Конц.
(мг/мл) Исх. Об.
(мкл) Конц. (мг/мл) Конц. Об. (мкл) Степ.
Извлеч% Мономер
SEC(%) P1C4-H2-IgG2 4,6 800 85,6 43,6 >99 96,84 P1C4-H2-IgG4 5,2 800 93,9 44,5 >99 97,39 P1C4-H4-IgG2 4,6 800 87,84 42,2 >99 97,05 P1C4-H2-IgG4 5,5 800 116,51 38,7 >99 96,38

[0349] Также исследуют стабильность методом "ускоренного старения" гуманизированных вариантов P1C4. В 1,5 мл пробирку Эппендорфа помещают 100 образцов белка (~ 5 мг/мл). Пробирку герметизируют парафилмом. Две пробирки устанавливают, одну выдерживают при 4°С, а другую выдерживают при 40°С в течение 33 дней. Аликвоту 20 мкл отбирают для проверки видимых осадков и анализа методом SEC. Для анализа SEC, 6 образцов вводят в колонку для SEC, TSK G3000SWXL, и концентрацию белка измеряют по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают следующим образом: конц. (об.×конц.) до/конц. (об.×конц.) после ×100%.

[0350] После 33-дневной инкубации при 4°С и 40°С осадков не наблюдают. Мономерные IgG, рассчитанные по профилю SEC, составляют более 98% для всех 4 IgG при 4°С и 40°С. Степень извлечения, рассчитанная по профилю SEC, составляет более 96% для всех 4 IgG при при 4°С и 40°С (Таблица 21). Никакого изменения активности варианта P1C4 Fc не наблюдают через 33 дня при 4°С и 40°С, за исключением P1C4-h4-IgG2, который показывает IC50 вне указанного диапазона, что указывает на небольшое снижение его активности. (таблица 22).

Таблица 21. Исследование стабильности методом "ускоренного старения": растворимость

Образец Темп (С) Дни
Инкуб. Исх. Конц.
(мг/мл) Конц. Об. (мкл) Степ.
Извлеч% Мономер
SEC(%) P1C4-H2-IgG2 4 33 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 4 33 5,2 5,23 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 4 33 4,6 4,71 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 4 33 5,5 5,47 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 40 33 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 40 33 5,2 5,28 >99 98 P1C4-H4-IgG2 40 33 4,6 4,46 96,96 >99 P1C4-H4-IgG4 40 33 5,5 5,28 96,00 >99

Таблица 22. Исследование стабильности методом "ускоренного старения": активность

IC50 (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 При 4°C в течение 33 дней 75 55 69 62 При 40°C в течение 33 дней 65 68 88 71

[0351] Также характеризуют стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в сыворотке. Сыворотку человека получают от Sigma. Сыворотку приматов, отличных от человека, собирают в Crown Bioscience. В пробирке Эппендорфа 950 мкл сыворотки смешивают с 50 мкл IgG при конечной конц. 250 мкг/мл (~1,67 мкМ) и инкубируют при 37°С. Образцы по 200 мкл отбирают в моменты времени 0, 24, 48 и 72 часа для анализа связывания методом проточной цитометрии с использованием клеток, экспрессирующих CB1. Начальная концентрация для IgG-теста составляет 500 нМ, и образцы последовательно разбавляют 3 раза для анализа методом проточной цитометрии для определения KD связывания. Результаты, приведенные в Таблицах 23 и 24, не показывают изменений сродства после 24 часов инкубации с сывороткой человека или НЧП при 37°C. Никаких существенных изменений KD не наблюдают для образцов, кроме P1C4-h2-IgG2, которое показывают снижение сродства связывания с клетками, экспрессирующими СВ1, через 48 часов инкубации с сывороткой человека и НЧП. Кроме того, P1C4-h4-IgG2 также показывает снижение сродства связывания с клетками, экспрессирующими СВ1 через 48 часов.

Таблица 23. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в сыворотке человека, 24 часа

Kd (нМ) в челов. Сыворотке h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал (50-150%) 14,5-43,5 17-51 15,5-46,5 15-45 0 часов 21 16 23 16 24 часов 21 11 17 12 48 часов 56 19 31 12 72 часов 38 20 11 15

Таблица 24. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в сыворотке NHP

Kd (нМ) в сыворотке NHP h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал (50-150%) 14,5-43,5 17-51 15,5-46,5 15-45 0 часов 21 19 20 20 24 часов 15 12 16 13 48 часов 57 37 48 28 72 часов 41 29 33 26

[0352] Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 при замораживании/оттаивании характеризуют следующим образом. Аликвоту 100 мкл из замороженных исходных растворов каждого гуманизированного варианта Fc P1C4 оттаивают на водяной бане при 22°C, затем быстро замораживают жидким азотом. Замороженный образец выдерживают при ~80°C в течение по меньшей мере 20 минут, прежде чем его снова оттаивают на водяной бане при температуре 22°C. Образцы проходят через 10 таких циклов замораживания/оттаивания. Визуальный осмотр используют для проверки осадков. Аликвоту 20 мкл отбирают из образца для анализа SEC в циклах 1, 5 и 10 замораживания/оттаивания. Для характеристики методом SEC, 6 мкл инкубированных образцов вводят инжекцией в колонку TSK G3000SWXL для SEC. Концентрацию белка измеряют по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают по формуле: F/T (конц.) до/F/T (конц.) после × 100%.

[0353] Результаты показывают, что после 10 циклов замораживания/оттаивания мономерные IgG составляют более 97% для всех 4 тестируемых вариантов IgG. Степень извлечения белка составляет более 96% для всех IgG. P1C4-H2-IG4 проявляет небольшую мутность после 1-го цикла замораживания/оттаивания, но значительного осаждения или снижения концентрации белка не наблюдают. Результаты обобщены в Таблицах 25-28. Образцы белка, полученные после 5 циклов замораживания/оттаивания, также тестируют на функцию, используя анализ антагониста цАМФ, и рассчитанные результаты IC50 не показывают значительных изменений активности со значениями, попадающими в нормальный диапазон (Таблица 29).

Таблица 25. Стабильность при замораживании/оттаивании P1C4-H2-IgG2

Образец Циклы З/О Исходная
конц.(мг/мл) Конц.
(мг/мл) Степень
извлечения Мономер
SEC P1C4-H2-IgG2 0 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 1 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 5 4,6 4,57 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 10 4,6 4,58 >99 >99

Таблица 26. Стабильность при замораживании/оттаивании P1C4-H2-IgG4

Образец Циклы З/О Исходная
конц.(мг/мл) Конц.
(мг/мл) Степеньизвлечения Мономер
SEC P1C4-H2-IgG4 0 5,2 5,20 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 1 5,2 5,21 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 5 5,2 5,18 >99 98,49 P1C4-H2-IgG4 10 5,2 5,01 96,41 97,88

Таблица 27. Стабильность при замораживании/оттаивании P1C4-H4-IgG2

Образец Циклы З/О Исходная
конц.(мг/мл) Конц.
(мг/мл) СтепеньИзвлечения Мономер
SEC P1C4-H4-IgG2 0 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 1 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 5 4,6 4,58 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 10 4,6 4,52 98,35 >99

Таблица 28. Стабильность при замораживании/оттаивании P1C4-H4-IgG4

Образец Циклы З/О Исходная
конц.(мг/мл) Конц.
(мг/мл) СтепеньИзвлечения Мономер
SEC P1C4-H4-IgG4 0 5,5 5,50 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 1 5,5 5,46 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 5 5,5 5,53 >99 98,60 P1C4-H4-IgG4 10 5,5 5,37 97,64 98,05

Таблица 29. Стабильность при замораживании/оттаивании гуманизированных вариантов: активность цАМФ после 5 циклов

IC50 (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 5 циклов F/T 38 28 43 32

[0354] Для исследования стабильности 4-х вариантов P1C4 Fc при сдвиге pH, 0,2 мл смолы MAbSelect пакуют в колонку с объемом 10 мл и уравновешивают 10 мл DPBS с pH 7,4. 150 мкл образца IgG (~ 5 мг/мл) загружают в колонку. Колонку промывают 1,6 мл DPBS. Затем IgG элюируют 1,6 мл цитрата натрия (рН ~ 3,5). Измеряют концентрацию белка. Затем белок концентрируют до ~ 3 мг/мл для функционального анализа. Никаких видимых осадков не наблюдают. Эти образцы центрифугируют при 14000 × g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант переносят в новую пробирку Эппендорфа и измеряют концентрацию белка. Этот образец также проверяют на агрегацию с помощью SEC и функционально тестируют с помощью антагониста цАМФ. Профили SEC показывают, что процентное содержание мономера IgG составляет более 95% после сдвига рН до рН 3,5. Результаты антагониста цАМФ приведены в Таблице 30 и показывают, что P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 и P1C4-h4-IgG4 стабильны при рН 3,5, при этом измеренные IC50S попадают в пределы приемлемого диапазона.

P1C4-h2-IgG2 ведет себя по разному при рН 3,5 при более низком значении IC50 по сравнению с приемлемым диапазоном. Этот результат аналогичен результату теста на рН-стабильность.

Таблица 30. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 при сдвиге pH

IC50 (нМ) P1C4-h2-IgG2 P1C4-h2-IgG4 P1C4-h4-IgG2 P1C4-h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Приемлемый интервал 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 pH 3,5 34 59 55 43,4

Пример 27. CDR-мутагенез PA13R3-P1C4

[0355] Чтобы исследовать роль каждого аминокислотного положения в каждой CDR, сайт-направленный мутагенез насыщения проводят по каждому положению CDR химерного P1C4 Fab. Синтезируют мутагенные праймеры, содержащие NNS или специфический кодон, растворяют в буфере Tris-EDTA и разбавляют до 10 мкМ рабочего исходного раствора. По двадцать пять мкл для реакций ПЦР были установлены в 96-луночных планшетах с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Полученные продукты ПЦР обрабатывают 0,8 DpnI (20 Ед/мкл) в каждой лунке при 37°С в течение 5 часов. Обработанный DpnI продукт ПЦР (2 мкл) трансформируют в 30 мкл компетентных клеток E. coli Dh5a. ДНК минипрепаративно выделяют из трансформантов с помощью и секвенируют для идентификации желаемых мутаций. Плазмидную ДНК из желаемых клонов используют для трансформации компетентных клеток E. coli BL21 (CodonPlus). Для экспрессии Fab-белка используют одиночные колонии.

[0356] Для экспрессии Fab колонии пикируют в 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл SB-среды и культивируют в течение ночи. На следующий день 10 мкл из каждой лунки используют для инокуляции 500 мкл ZYM-среды с 50 мкг/мл канамицина в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Планшет закрывают воздухопроницаемым герметиком для планшетов и встряхивают 36 часов при 25°C на шейкере при 450 об/мин.

[0358] Для получения образцов для ELISA, 96-луночный планшет с глубокими лунками центрифугируют при 3000 об/мин в настольной центрифуге Beckman в течение 20 минут (~2050 об/мин) при 4°C. 100 мкл супернатанта переносят из планшета для экспрессии в планшет для разбавления, содержащий 200 мкл PBS, pH 7,4, и хорошо перемешивают.

Экспрессию Fab измеряют с помощью ELISA. 96-луночные планшеты ELISA с половинными лунками (Corning, 3690) непосредственно покрывают 2 мкг/мл против-His антителом (Sigma HI 029 2 мг/мл) при 50 мкг/лунку в течение ночи при 4°С. Затем планшет промывают 6 раз 150 мкл PBST с промежуточным вращением. Затем каждую лунку блокируют 175 мкл/лунку 3% молоко/PBS, pH 7,4 в течение 1 часа при 22°С. Планшет затем промывают 6 раз PBST перед разбавлением культуральной среды, содержащей 25 мкл Fab, посредством разбавлением в 3 раза посредством добавления в каждую лунку PBS, рН 7,4, и инкубируют в течение 1 часа при 22°С. Планшет снова промывают 6 раз PBST перед добавлением 50 мкл/лунку антитела против человеческого Fab, меченного HRP (0293 Sigma) добавляют при разбавлении 1:10000 в 3% молоке и инкубируют при 22°С в течение 1 часа. Для проявления ELISA планшет промывают 6 раз PBST и добавляют 50 мкл/лунку субстрата TMB. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл/лунку 1 Н HCl и OD450 считывают на считывающем устройстве BioTek.

[0359] Для измерения связывания iCAPS посредством ELISA, 96-луночные планшеты для ELISA с половинными лунками покрывают 2 мкг/мл, 25 мкг/лунку стрептавидина в PBS, рН 7,4, в течение ночи при 4°С. Затем планшет промывают 6 раз 150 мкл PBST с промежуточным вращением. Затем в планшет добавляют 25 мкл/лунку, 5 мкг/мл CB1 iCAPS для 1-часовой инкубации. После промывки 6 раз PBST, каждую лунку блокируют 175 мкл/лунку 3% молоко/PBS, pH 7,4, в течение 1 часа при 22°С. Планшет затем промывают 6 раз PBST перед добавлением каждую лунку 25 мкл/лунку культуральной среды, содержащей Fab, разбавленной 3 раза PBS, pH 7,4, и инкубируют в течение 1 часа при 22°С. Планшет снова промывают 6 раз PBST перед добавлением 50 мкл/лунку антитела против человеческого Fab (0293 Sigma) при разведении 1:10000 3% молоком и инкубируют при 22°С в течение 1 часа. Для проявления планшета планшет промывают 6 раз PBST и добавляют 50 мкл/лунку субстрата TMB. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл/лунку 1 N HCl, и OD450 читали на считывающем устройстве BioTek.

[0360] Каждый клон анализируют в трех повторностях. Чтобы рассчитать относительное связывание с iCAPS, нормализованное экспрессией Fab, сигнал ELISA для связывания iCAPS делят на данные ELISA по экспрессии Fab и сравнивают с данными для родительского клона. Допустимые изменения определяют как клоны, которые сохраняют по меньшей мере 50% специфической активности связывания iCAPS по сравнению с родительскими клонами. Эти допустимые изменения обобщены в Таблице 31 и Таблице 32. Последовательности CDR указанных мутаций можно найти в Таблице 34.

Таблица 31. Допустимые мутации тяжелой цепи CDR PA13R3-P1C4

CDR Положение Допустимое изменение (с) HCDR1 Y1 H, W Y2 F, I, K, N W3 A, F M4 A, E, F, L, N, Q, T, V N5 I, K, L, S, W HCDR2 Q1 D, E I2 A,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W,Y Y3 F P4 A,F,H,K G5 A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y D6 I,L,M,N,P,Q,V,W,Y G7 A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y E8 A,D,M,Q,V,Y T9 A,D,E,F,G,H,I,K,Q,R,S,T,W,Y K10 D,E,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y Y11 C,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,T,W HCDR3 S1 N,T,Y Y5 A,C,F,H,N,S L6 D,E,F,G,H,I,K,M,N,Q,S,W,Y P7 A,E,F,G,H,KL,Q,R,S,V,W,Y Y8 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V

Таблица 32. Допустимые мутации легкой цепи CDR PA13R3-P1C4

CDR Положение Допустимое изменение (с) LCDR1 S1 A,D,F,L,M,R,T,V,W,Y S2 A,D,E,F,G,H,K,M,N,P,Q,V,W Y3 F L4 F,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,W,Y LCDR2 S1 A,H,N,R T2 A,D,F,G,H,L,M,S,V,W,Y S3 D,F,H,I,K,LN,Q,Y N4 D,E,F,G,H,I,K,Q,R,S,V L5 D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,V,W,Y A6 D,F,G,I,K,Q,R,S,V,W S7 A,D,F,G,H,K,L,R,T,V,W G8 A,F,I,N,P,R,S,T,V,Y LCDR3 H1 A,C,D,E,F,I,K,L,N,R,S,T,V,W,Y Q2 A,C,E,G,N,S,T,V Y3 A,F,G,H,Q,W H4 A,E,G,K,L,N,Q,S,T,V,W R5 A,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,V,W,Y S6 A,C,E,F,G,I,M,P,R,T,V,W,Y P7 K,W,Y P8 D,H T9 D,F,G,I,L,M,N,Q,R,S,V,Y

Пример 28. Иммуноокрашивание CB1 в образцах ткани печени с помощью антитела P1C4-h2-IgG4, конъюгированного с HRP.

[0361] Антитело P1C4-h2-IgG4 метят с использованием набора для конъюгации HRP, Lightning-Link от (Innova Bioscience, 701-0010) в соответствии с инструкциями производителя. Срезы образцов печени, обработанных Parafilm, обрабатывают Clearene Solvent (Leica Biosystems) в течение 5 минут, а затем с уменьшением концентрации этанола до конечной концентрации 50%. Затем срезы помещают в метанол/пероксид водорода в течение 15 минут, после чего их кратковременно промывают в PBS. Затем срезы обрабатывают физраствором с цитратом (Vector, H-3300) с нагревом для извлечения антигена перед помещением в предварительно нагретую водяную ванну с PBS (350 мл) и трипсином (2,45 мл) при 37°C в течение 20 минут. После промывки PBS срезы блокируют казеином (Vector, SP-5020) в течение 1 часа при комнатной температуре. После блокирования добавляют разбавленное 1:100 HRP-конъюгированное P1C4-h2-IgG4 или контрольное изотипичное антитело и инкубируют в течение ночи при 4°C. Затем срезы промывают PBS и обрабатывают 3 капель вектором ABC Tertiaty (Vector, PK-7100) при 22°C в течение 45 минут.

PBS используют для промывки срезов 3 раза, и DAB-смесь (Vector, SK-4100) добавляют к срезам в течение 5-10 минут перед повторной промывкой PBS. После этого срезы контрастируют с использованием Гематоксилина Meyers (TCS Biosciences, HS315) в течение 1 минуты с последующей обработкой в воде с увеличением концентрации этанола (от 50% до 100%)), 2 цикла растворителя Clearene перед установкой в Pertex (Leica Biosystems).

[0362] Результаты показывают положительное CB1-специфическое окрашивание в макрофагах, гепатоцитах и печеночных миофибробластах на ранней стадии NASH (Фиг. 25, левая панель), фиброзе NASH (Фиг. 25, средняя панель) и позднем фиброзе (Фиг. 25, правая панель). Никакое окрашивание не наблюдают с контролируемыми изотипом нерелевантными антителами (Фиг. 26) или нормальными образцами ткани (Фиг. 27).

Пример 29. Измерение влияния антитела против СВ1 на генетические маркеры фиброза в первичных человеческих звездчатых клетках печени

[0363] Первичные звездчатые клетки печени (HSC) выделяют из ткани печени, полученной от 3 здоровых доноров. После 2-3 пассажей в DMEM+10% FBS клетки активировали на пластике и помещают в среду с 0,5% сывороткой в течение ночи. Затем клетки обрабатывают в течение 6 или 24 часов римонабантом (антагонистом CB1), P1C4-h2-IgG4 и нефункциональными контрольными антителами при разных концентрациях. Ингибирование сигнатур профибротических генов, включающих α-SMA, Pro-collagen A1 (I), TIMP1 и TGFβ, измеряют с помощью РВ-ПЦР, и данные наносят на график.

[0364] Результаты показывают, что имеется значительное снижение экспрессии Pro-collagen A1 (I), когда HSC обрабатывают антителами P1C4-h2, но не нефункциональным контролем и PBS (Фиг. 28). Также наблюдают значительное снижение экспрессии TGFP (Фиг. 29) и TIMP1 (Фиг. 30) по сравнению с PBS и нефункциональными контрольными антителами. Кроме того, уменьшение экспрессии α-SMA является также значительным в клетках, обработанных P1C4-IgG1 или IgG4 по сравнению с таковым в PBS или клетках, обработанных нефункциональным связующим (Фиг. 31).

Пример 30: Количественное определение антитела против СВ1 в спинномозговой жидкости обезьян-макак (CSF).

Обезьян-макак (2 самца и 2 самки/группу) обрабатывают P1C4-h2-IgG4 согласно схеме обработки в Таблице 33, и СМЖ собирают в указанные моменты времени. P1C4-h2-IgG4 количественно определяют в 96-луночных планшетах для ELISA, покрытых с антителом против ID в количестве 1 мкг/мл с последующим добавлением СМЖ и детектированием с помощью HRP-конъюгированного антитела против IgG (Abeam) и окрашивающим реагентом.

[0366] Как показано в Таблице 33, антитело обнаруживают только на очень низких уровнях, если вообще обнаруживают. В группе с наивысшей дозой в СМЖ обнаруживают менее 0,1% вводимой дозы, что указывает на то, что экспозиция антител в ЦНС является очень низкой.

Таблица 33. Количественное определение антитела против СВ1 в СМЖ обезьян-макак

Группа Временная отметка Концентрация (нг/мл) 0,3 мг/кг ВВ Перед введением дозы BLQ BLQ BLQ BLQ 2 ч после введения 1ой дозы (д 1) BLQ BLQ BLQ BLQ 2 ч после введения 2ой дозы (д 8) BLQ BLQ 35 BLQ 2 ч после введения 3ей дозы (д 15) BLQ BLQ BLQ BLQ 3 мг/кг ПК Перед введением дозы BLQ BLQ BLQ BLQ 2 ч после введения 1ой (д 1), 2ой (д 8) и 3ей дозы (д 15) BLQ BLQ BLQ BLQ 3 мг/кг ВВ Перед введением дозы BLQ BLQ BLQ BLQ 2 ч после введения 1ой дозы (д 1) BLQ BLQ 37 BLQ 2 ч после введения 2ой дозы (д 8) 15 BLQ BLQ BLQ 2 ч после введения 3ей дозы (д 15) 21 BLQ BLQ BLQ 40 мг/кг ВВ Перед введением дозы BLQ BLQ NA NA 9 ч после введения дозы 86 136* NA NA

BLQ=ниже предела количественной оценки

Пример 31. Измерение влияния антитела против СВ1 на метаболические и сердечно-сосудистые факторы у обезьян-макак

[0367] Программа RIO продемонстрировала кардиометаболические эффекты лечения римонабантом с использованием нескольких факторов. См., например, Pi-Sunyeret al, 2006, J Am Coll Cardio, 147: 362A. В связи с этим, эффект антитела против СВ1, описанный здесь, также оценивают на предмет воздействия на аналогичные кардиометаболические факторы.

[0368] Тучных яванских макак и макак-резусов обрабатывают антителом против СВ1, P1C4-h2-IgG4 при 3 мг/кг или 0,3 мг/кг при еженедельном п.к введением дозы. Для получения отрицательных контролей, набору приматов инъекционно вводят (1) только фармацевтический носитель; или (2) контрольное антитело, которое, как известно, не связывается с CB1. У приматов наблюдают эффекты на прием пищи, массу тела, чувствительность к инсулину, уровни триглицеридов и другие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Показано, что приматы, обработанные антителом против СВ1, P1C4-h2-IgG4, при 3 мг/кг или 0,3 мг/кг, демонстрируют снижение уровня триглицеридов и других факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний. Также показано, что приматы, обработанные антителом против СВ1, P1C4-h2-IgG4, при 3 мг/кг или 0,3 мг/кг проявляют повышенную чувствительность к инсулину. У приматов, которым инъекционно вводили либо только контрольное антитело или только носитель, не наблюдают какого-либо улучшения этих факторов.

[0369] Специалистам в данной области техники будет понятно, что можно ожидать множество модификаций и вариаций изобретения, изложенных в приведенных выше иллюстративных примерах. Следовательно, в изобретение должны быть включены только такие ограничения, которые приведены в прилагаемой формуле изобретения. Все ссылки, приведенные в данном документе, включены в него посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

Таблица 34. Допустимые мутации в последовательностях CDR PA13R3-P1C4

Описание источника последовательности Последовательность Мутация SEQ ID NO Последовательность тяжелой цепи CDR1 YYWMN 352 HYWMN Y1→H 443 IYWMN Y1→I 444 WYWMN Y1→W 445 YFWMN Y2→F 446 YKWMN Y2→K 447 YNWMN Y2→N 448 YYAMN W3→A 449 YYFMN W3→F 450 YYWAN M4→A 451 YYWEN M4→E 452 YYWFN M4→F 453 YYWLN M4→L 454 YYWNN M4→N 455 YYWQN M4→Q 456 YYWTN M4→T 457 YYWVN M4→V 458 YYWMI N5→I 459 YYWMK N5→K 460 YYWML N5→L 461 YYWMS N5→S 462 YYWMW N5→W 463 Последовательность тяжелой цепи CDR2 QIYPGDGETKY 353 DIYPGDGETKY Q1→D 464 EIYPGDGETKY Q1→E 465 QAYPGDGETKY I2→A 466 QDYPGDGETKY I2→D 467 QEYPGDGETKY I2→E 468 QFYPGDGETKY I2→F 469 QGYPGDGETKY I2→G 470 QHYPGDGETKY I2→H 471 QKYPGDGETKY I2→K 472 QLYPGDGETKY I2→L 473 QNYPGDGETKY I2→N 474 QQYPGDGETKY I2→Q 475 QRYPGDGETKY I2→R 476 QSYPGDGETKY I2→S 477 QTYPGDGETKY I2→T 478 QWYPGDGETKY I2→W 479 QYYPGDGETKY I2→Y 480 QIFPGDGETKY Y3→F 481 QIYAGDGETKY P4→A 482 QIYFGDGETKY P4→F 483 QIYHGDGETKY P4→H 484 QIYKGDGETKY P4→K 485 QIYPADGETKY G5→A 486 QIYPCDGETKY G5→C 487 QIYPDDGETKY G5→D 488 QIYPEDGETKY G5→E 489 QIYPFDGETKY G5→F 490 QIYPHDGETKY G5→H 491 QIYPIDGETKY G5→I 492 QIYPKDGETKY G5→K 493 QIYPLDGETKY G5→L 494 QIYPMDGETKY G5→M 495 QIYPQDGETKY G5→Q 496 QIYPRDGETKY G5→R 497 QIYPSDGETKY G5→S 498 QIYPTDGETKY G5→T 499 QIYPVDGETKY G5→V 500 QIYPWDGETKY G5→W 501 QIYPYDGETKY G5→Y 502 QIYPGIGETKY D6→I 503 QIYPGLGETKY D6→L 504 QIYPGMGETKY D6→M 505 QIYPGNGETKY D6→N 506 QIYPGPGETKY D6→P 507 QIYPGQGETKY D6→Q 508 QIYPGVGETKY D6→V 509 QIYPGWGETKY D6→W 510 QIYPGYGETKY D6→Y 511 QIYPGDAETKY G7→A 512 QIYPGDDETKY G7→D 513 QIYPGDEETKY G7→E 514 QIYPGDFETKY G7→F 515 QIYPGDHETKY G7→H 516 QIYPGDIETKY G7→I 517 QIYPGDKETKY G7→K 518 QIYPGDLETKY G7→L 519 QIYPGDMETKY G7→M 520 QIYPGDNETKY G7→N 521 QIYPGDPETKY G7→P 522 QIYPGDQETKY G7→Q 523 QIYPGDRETKY G7→R 524 QIYPGDSETKY G7→S 525 QIYPGDTETKY G7→T 526 QIYPGDVETKY G7→V 527 QIYPGDYETKY G7→Y 528 QIYPGDGATKY E8→A 529 QIYPGDGDTKY E8→D 530 QIYPGDGMTKY E8→M 531 QIYPGDGQTKY E8→Q 532 QIYPGDGVTKY E8→V 533 QIYPGDGYTKY E8→Y 534 QIYPGDGEAKY T9→A 535 QIYPGDGEDKY T9→D 536 QIYPGDGEEKY T9→E 537 QIYPGDGEFKY T9→F 538 QIYPGDGEGKY T9→G 539 QIYPGDGEHKY T9→H 540 QIYPGDGEIKY T9→I 541 QIYPGDGEKKY T9→K 542 QIYPGDGEQKY T9→Q 543 QIYPGDGERKY T9→R 544 QIYPGDGESKY T9→S 545 QIYPGDGETKY T9→T 546 QIYPGDGEVKY T9→W 547 QIYPGDGEYKY T9→Y 548 QIYPGDGETDY K10→D 549 QIYPGDGETEY K10→E 550 QIYPGDGETHY K10→H 551 QIYPGDGETIY K10→I 552 QIYPGDGETLY K10→L 553 QIYPGDGETMY K10→M 554 QIYPGDGETNY K10→N 555 QIYPGDGETPY K10→P 556 QIYPGDGETQY K10→Q 557 QIYPGDGETRY K10→R 558 QIYPGDGETSY K10→S 559 QIYPGDGETTY K10→T 560 QIYPGDGETVY K10→V 561 QIYPGDGETWY K10→W 562 QIYPGDGETYY K10→Y 563 QIYPGDGETKC Y11→C 564 QIYPGDGETKD Y11→D 565 QIYPGDGETKE Y11→E 566 QIYPGDGETKF Y11→F 567 QIYPGDGETKG Y11→G 568 QIYPGDGETKH Y11→H 569 QIYPGDGETKI Y11→I 570 QIYPGDGETKL Y11→L 571 QIYPGDGETKN Y11→N 572 QIYPGDGETKP Y11→P 573 QIYPGDGETKQ Y11→Q 574 QIYPGDGETKR Y11→R 575 QIYPGDGETKT Y11→T 576 QIYPGDGETKW Y11→W 577 Последовательность тяжелой цепи CDR3 SHGNYLPY 354 NHGNYLPY S1→N 578 THGNYLPY S1→T 579 YHGNYLPY S1→Y 580 SHGNALPY Y5→A 581 SHGNCLPY Y5→C 582 SHGNFLPY Y5→F 583 SHGNHLPY Y5→H 584 SHGNNLPY Y5→N 585 SHGNSLPY Y5→S 586 SHGNYDPY L6→D 587 SHGNYEPY L6→E 588 SHGNYFPY L6→F 589 SHGNYGPY L6→G 590 SHGNYHPY L6→H 591 SHGNYIPY L6→I 592 SHGNYKPY L6→K 593 SHGNYMPY L6→M 594 SHGNYNPY L6→N 595 SHGNYQPY L6→Q 596 SHGNYSPY L6→S 597 SHGNYWPY L6→W 598 SHGNYYPY L6→Y 599 SHGNYLAY P7→A 600 SHGNYLEY P7→E 601 SHGNYLFY P7→F 602 SHGNYLGY P7→G 603 SHGNYLHY P7→H 604 SHGNYLKY P7→K 605 SHGNYLLY P7→L 606 SHGNYLQY P7→Q 607 SHGNYLRY P7→R 608 SHGNYLSY P7→S 609 SHGNYLVY P7→V 610 SHGNYLWY P7→W 611 SHGNYLYY P7→Y 612 SHGNYLPA Y8→A 613 SHGNYLPD Y8→D 614 SHGNYLPE Y8→E 615 SHGNYLPF Y8→F 616 SHGNYLPG Y8→G 617 SHGNYLPH Y8→H 618 SHGNYLPI Y8→I 619 SHGNYLPK Y8→K 620 SHGNYLPL Y8→L 621 SHGNYLPM Y8→M 622 SHGNYLPR Y8→R 623 SHGNYLPS Y8→S 624 SHGNYLPV Y8→V 625 Последовательность легкой цепи CDR1 SSYLH 355 ASYLH S1→A 626 DSYLH S1→D 627 FSYLH S1→F 628 LSYLH S1→L 629 MSYLH S1→M 630 RSYLH S1→R 631 TSYLH S1→T 632 VSYLH S1→V 633 WSYLH S1→W 634 YSYLH S1→Y 635 SAYLH S2→A 636 SDYLH S2→D 637 SEYLH S2→E 638 SFYLH S2→F 639 SGYLH S2→G 640 SHYLH S2→H 641 SKYLH S2→K 642 SMYLH S2→M 643 SNYLH S2→N 644 SPYLH S2→P 645 SQYLH S2→Q 646 SRYLH S2→R 833 SWYLH S2→W 648 SSFLH Y3→F 649 SSYFH L4→F 650 SSYHH L4→H 651 SSYIH L4→I 652 SSYKH L4→K 653 SSYNH L4→N 654 SSYPH L4→P 655 SSYQH L4→Q 656 SSYRH L4→R 657 SSYSH L4→S 658 SSYTH L4→T 659 SSYWH L4→W 660 SSYYH L4→Y 661 Последовательность легкой цепи CDR2 STSNLAS 356 ATSNLAS S1→A 662 GTSNLAS S1→G 834 NTSNLAS S1→N 664 RTSNLAS S1→R 665 SASNLAS T2→A 666 SDSNLAS T2→D 667 SFSNLAS T2→F 668 SGSNLAS T2→G 669 SHSNLAS T2→H 670 SLSNLAS T2→L 671 SMSNLAS T2→M 672 SSSNLAS T2→S 673 SVSNLAS T2→V 674 SWSNLAS T2→W 675 SYSNLAS T2→Y 676 STDNLAS S3→D 677 STFNLAS S3→F 678 STHNLAS S3→H 679 STINLAS S3→I 680 STKNLAS S3→K 681 STLNLAS S3→L 682 STNNLAS S3→N 683 STQNLAS S3→Q 684 STYNLAS S3→Y 685 STSDLAS N4→D 686 STSELAS N4→E 687 STSFLAS N4→F 688 STSGLAS N4→G 689 STSHLAS N4→H 690 STSILAS N4→I 691 STSKLAS N4→K 692 STSQLAS N4→Q 693 STSRLAS N4→R 694 STSSLAS N4→S 695 STSVLAS N4→V 696 STSNDAS L5→D 697 STSNEAS L5→E 698 STSNFAS L5→F 699 STSNGAS L5→G 700 STSNHAS L5→H 701 STSNIAS L5→I 702 STSNKAS L5→K 703 STSNMAS L5→M 704 STSNNAS L5→N 705 STSNPAS L5→P 706 STSNQAS L5→Q 707 STSNRAS L5→R 835 STSNVAS L5→V 708 STSNWAS L5→W 709 STSNYAS L5→Y 710 STSNLDS A6→D 711 STSNLFS A6→F 712 STSNLGS A6→G 713 STSNLIS A6→I 714 STSNLKS A6→K 715 STSNLQS A6→Q 716 STSNLRS A6→R 717 STSNLSS A6→S 718 STSNLVS A6→V 719 STSNLWS A6→W 720 STSNLAA S7→A 721 STSNLAD S7→D 722 STSNLAF S7→F 723 STSNLAG S7→G 724 STSNLAH S7→H 725 STSNLAK S7→K 726 STSNLAL S7→L 727 STSNLAR S7→R 728 STSNLAT S7→T 729 STSNLAV S7→V 730 STSNLAW S7→W 731 STSNLASG 732 STSNLASA G8→A 733 STSNLASF G8→F 734 STSNLASI G8→I 735 STSNLASN G8→N 736 STSNLASP G8→P 737 STSNLASR G8→R 738 STSNLASS G8→S 739 STSNLAST G8→T 740 STSNLASV G8→V 741 STSNLASY G8→Y 742 Последовательность легкой цепи CDR3 HQYHRSPPTF 357 AQYHRSPPTF H1→A 743 CQYHRSPPTF H1→C 744 DQYHRSPPTF H1→D 745 EQYHRSPPTF H1→E 746 FQYHRSPPTF H1→F 747 IQYHRSPPTF H1→I 748 KQYHRSPPTF H1→K 749 LQYHRSPPTF H1→L 750 NQYHRSPPTF H1→N 751 QQYHRSPPTF H1→Q 836 RQYHRSPPTF H1→R 752 SQYHRSPPTF H1→S 753 TQYHRSPPTF H1→T 754 VQYHRSPPTF H1→V 755 WQYHRSPPTF H1→W 756 YQYHRSPPTF H1→Y 757 HAYHRSPPTF Q2→A 758 HCYHRSPPTF Q2→C 759 HEYHRSPPTF Q2→E 760 HGYHRSPPTF Q2→G 761 HNYHRSPPTF Q2→N 762 HSYHRSPPTF Q2→S 763 HTYHRSPPTF Q2→T 764 HVYHRSPPTF Q2→V 765 HQAHRSPPTF Y3→A 766 HQFHRSPPTF Y3→F 767 HQGHRSPPTF Y3→G 768 HQHHRSPPTF Y3→H 769 HQQHRSPPTF Y3→Q 770 HQWHRSPPTF Y3→W 771 HQYARSPPTF H4→A 772 HQYERSPPTF H4→E 773 HQYGRSPPTF H4→G 774 HQYKRSPPTF H4→K 775 HQYLRSPPTF H4→L 776 HQYNRSPPTF H4→N 777 HQYQRSPPTF H4→Q 778 HQYSRSPPTF H4→S 779 HQYTRSPPTF H4→T 780 HQYVRSPPTF H4→V 781 HQYWRSPPTF H4→W 782 HQYHASPPTF R5→A 783 HQYHCSPPTF R5→C 784 HQYHDSPPTF R5→D 785 HQYHESPPTF R5→E 786 HQYHFSPPTF R5→F 787 HQYHISPPTF R5→I 788 HQYHLSPPTF R5→L 789 HQYHMSPPTF R5→M 790 HQYHNSPPTF R5→N 791 HQYHQSPPTF R5→Q 792 HQYHVSPPTF R5→V 793 HQYHWSPPTF R5→W 794 HQYHYSPPTF R5→Y 795 HQYHRAPPTF S6→A 796 HQYHRCPPTF S6→C 797 HQYHREPPTF S6→E 798 HQYHRFPPTF S6→F 799 HQYHRGPPTF S6→G 800 HQYHRIPPTF S6→I 801 HQYHRMPPTF S6→M 802 HQYHRPPPTF S6→P 803 HQYHRRPPTF S6→R 804 HQYHRTPPTF S6→T 805 HQYHRVPPTF S6→V 806 HQYHRWPPTF S6→W 807 HQYHRYPPTF S6→Y 808 HQYHRSKPTF P7→K 809 HQYHRSWPTF P7→W 810 HQYHRSYPTF P7→Y 811 HQYHRSPDTF P8→D 812 HQYHRSPHTF P8→H 813 HQYHRSPPDF T9→D 814 HQYHRSPPFF T9→F 815 HQYHRSPPGF T9→G 816 HQYHRSPPIF T9→I 817 HQYHRSPPLF T9→L 818 HQYHRSPPMF T9→M 819 HQYHRSPPNF T9→N 820 HQYHRSPPQF T9→Q 821 HQYHRSPPRF T9→R 822 HQYHRSPPSF T9→S 823 HQYHRSPPVF T9→V 824 HQYHRSPPYF T9→Y 825

Пример 32. Созревание аффинности P1C4-h2-IgG4, антитела против CB1

[0370] Для получения более активных вариантов P1C4-h2-IgG4 проводят комплекс мероприятий по созреванию аффинности путем построения трех больших библиотек отображения дрожжей, содержащих рандомизированные остатки CDR, и с использованием активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS) и FACS для отбора улучшенных связующих. Дополнительные сведения см., Например, Wang et al, 2011, J Biol Chem. 286(51): 44218-44233. Дизайн библиотек был основан на анализе изменчивости остатков CDR в большой базе данных природных человеческих антител тех же семейств зародышевой линии, что и P1C4-h2-IgG4 (член 1-69 семейства VH1 и член 3-20 семейства Vk3). Остатки CDR, выбранные для рандомизации, подчеркнуты ниже в Таблице 35.

Таблица 35. Остатки, рандомизированные в библиотеках созревания аффинности P1C4

Название антитела/Описание последовательности Последовательность SEQ ID NO: P1C4-H2-IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 437 P1C4-LC-гуманизированного EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 828

[0371] Три библиотеки отображения дрожжей были разработаны для переноса мутаций в (1) только легкую цепь, (2) только тяжелую цепь или (3) как в легкую, так и тяжелую цепь. Теоретическое разнообразие каждой библиотеки составляло 6,5 × 10³, 1,4 × 10⁵ и 9,0 × 108, а фактический размер каждой библиотеки составлял 1,5 × 105, 5,0 × 10⁷ и 2,3 × 10⁹, соответственно.

[0372] После нескольких циклов отбора с использованием MACS и FACS при постепенном снижении концентрации CB1 iCAPS идентифицируют четыре клона, которые показывают потенциально более высокое сродство к CB1. Все четыре клона имеют изменения только в CDR легкой цепи и несут неизмененные родительские тяжелые цепи. Последовательности новых легких цепей показаны ниже в Таблице 36 с подчеркиванием измененных остатков.

Таблица 36. Последовательности аффинно зрелых клонов P1C4

Название антитела/Описание последовательности Последовательность SEQ ID NO: RY-LC-B12
FACS3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSRLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 829 RY-LC-A10
FACS5 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNRASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 830 RY-HL-LC-C12
FACS4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSRLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 831 RY-HL-LC-A12
FACS4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSRYLHWYQQKPGQAPRLLIYGTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 832

[0373] Отдельные остатки легких цепей, которые, как установлено, изменяются в процессе аффинного созревания вариантов P1C4, приведены ниже в таблице 37.

Таблица 37. Обобщенные результаты изменений аминокислот в клонах со зрелой аффинностью

Описание источника последовательности Последовательность Мутация SEQ ID NO Последовательность легкой цепи CDR1 SSYLH 355 SRYLH S2->R 833 Последовательность легкой цепи CDR2 STSNLAS 356 GTSNLAS S1->G 834 STSRLAS N4->R 694 STSNRAS L5->R 835 Последовательность легкой цепи CDR3 HQYHRSPPTF 357 QQYHRSPPTF H1->Q 836 HQYSRSPPTF H4->S 779

[0374] Четыре варианта P1C4 со зрелой аффинностью, которые идентифицируют посредством отбора отображения дрожжей, затем переформатируют из вектора отображения дрожжей в полноразмерный IgG4 (с мутацией шарнира по S228P) и тестируют на предмет улучшения сродства связывания и функции антагониста. Каждое антитело экспрессируют в клетках 293 и очищают аффинной хроматографией на белке А. Родительский P1C4-h2-IgG4 также экспрессируют и очищают идентичным образом, чтобы обеспечить сопоставимый контроль.

[0375] Улучшение сродства связывания у четырех вариантов P1C4 со зрелой аффинностью оценивают с помощью проточной цитометрии клетках TRex-CHO, экспрессирующих полноразмерный человеческий CB1, причем родительские клетки TRex-CHO служили в качестве отрицательного контроля. Вкратце, 100 мкл клеток при 1 × 10⁶ клеток/мл инкубируют с вариантами P1C4 со зрелой аффинностью и родительскими P1C4 IgG при 3-кратных серийных разведениях от 1 мкМ до 1,3 нм в течение 30 минут на льду. После двойной промывки 200 буфера для FACS клетки инкубируют со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и переносят в 5 мл пробирку BD Falcon и анализируют методом FACS. Анализ данных и измерение сродства связывания (KD) проводят с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Результаты обобщены в Таблице 38. Сродство связывания увеличивается примерно в 2-3 раза для всех четырех клонов по сравнению с родительским P1C4-h2-IgG4.

Таблица 38. Значения констант диссоциации аффинно зрелых клонов P1C4

Клон Эксп. 1 KD
(нМ) Эксп. 2 KD
(нМ) Средняя KD
(нМ) RY-LC-B12__FACS3 8,75 8,89 8,82 RY-LC-A10__FACS5 N/A 12,41 12,41 RY-HL-LC-C12__FACS4 14,36 13,90 14,13 RY-HL-LC-A12__FACS4 11,51 9,19 10,35 Исходный P1C4-h2-IgG4 N/A 24,14 24,14

[0376] Функциональную активность сродства созревших вариантов P1C4 количественно определяют с помощью анализа антагониста цАМФ с использованием доступного для приобретения набора цАМФ на основе конкурентного иммуноанализа с использованием антитела против цАМФ, меченного криптатом, и d2-меченого цАМФ (Cisbio). Восемь тысяч клеток/лунку клеток TRex-CHO, экспрессирующих человеческий CB1, высевают в белый 384-луночный планшет, с последующей инкубацией с mAb или контрольным соединением при разных концентрациях при 22°C в течение 10 минут. К клеткам добавляют пять мкМ форсколина (Sigma Aldrich) и 9 нМ СР55,940 (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 минут при 22°C для активации сигнального пути CB1. Через 30 минут инкубации при 22°C С к клеткам добавляют 5 цАМФ-d2 и 5 против-цАМФ-криптат и инкубируют в течение 1 часа. Сигнал FRET обнаруживают с помощью многоканального считывающего устройства Envision (Perkin Elmer) при возбуждении против-цАМФ криптата при 620 нм и эмиссии при 665 нм. Анализ данных выполняют с использованием GraphPad Prism. Результаты приведены в Таблице 39. Подобно усилению, наблюдаемому для сродства связывания, функциональная активность возрастает в 2-3 раза у некоторых клонов со зрелой аффинностью (RY-HL-LC-A 12_F AC S4 и RY-LC-B 12_F AC S3) по сравнению с родительским P1C4 -h2-IgG4.

Таблица 39. Значения IC50 аффинно зрелых клонов P1C4

Клон Эксп. 1 IC50(нМ) Эксп. 2 IC50 (нМ) Эксп. 3 IC50 (нМ) Средняя IC50±SD (нМ) RY-LC-B12__FACS3 40,9 32,9 39,7 38±4,3 RY-LC-A10__FACS5 120,2 62,6 48,1 77±38 RY-HL-LC-C12__FACS4 76,76 52,5 43,1 57±17,3 RY-HL-LC-A12__FACS4 48 33,9 42,4 41±7,1 Исходное P1C4-h2-IgG4 115,7 74,1 77,8 89±23

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к новым антителам и их фрагментам, способным связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1). Описанные здесь антитела и их фрагменты включают гуманизированные антитела, способные связываться с рецептором CB1. Настоящее изобретение также относится к применению указанных антител для лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическое или агонистическое воздействие на рецептор CB1. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 31 ил., 39 табл., 32 пр.

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 15 нМ или менее, и где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи с SEQ ID NO: 352, 353 и 354 соответственно и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи со следующими последовательностями:

(a) SEQ ID NO: 833, 694 и 836 соответственно,

(b) SEQ ID NO: 833, 835 и 836 соответственно,

(c) SEQ ID NO: 833, 694 и 357 соответственно и

(d) SEQ ID NO: 833, 834 и 779 соответственно.

2. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 829 или SEQ ID NO: 830.

3. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 831 или SEQ ID NO: 832.

4. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 437.

5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое способно связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 355 или 833;

CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 356, 694, 834 или 835; и

CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 357, 779 или 836,

где CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи одновременно не содержат SEQ ID NО: 355, 356 и 357, и

CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 352, 353 и 354 соответственно.

6. Выделенное антитело или фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

7. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит модифицированный участок Fc.

8. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где антитело конъюгируют со средством, например с другим терапевтическим средством, цитотоксическим средством, молекулой иммуноадгезии или визуализирующим средством.

9. Клетка-хозяин, экспрессирующая выделенное антитело или фрагмент по любому из пп.1-7, содержащее нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антитело.

10. Применение выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-8 для лечения заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, безалкогольного стеатогепатита (NASH), заболевания печени, первичного билиарного цирроза, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака, воспалительного заболевания, боли, рассеянного склероза и глаукомы.

11. Способ диагностики заболевания или расстройства, ассоциированного с CB1, где способ включает приведение клетки в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-5 и определение связавшегося антитела.

12. Способ детекции CB1, включающий приведение клетки в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп.1-5 и определение связавшегося антитела.