АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ КАННАБИНОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ 1 (СВ1) Российский патент 2020 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P3/00 A61P9/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании Международной заявки PCT/CN2014/081797, поданной 8 июля 2014 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, способным связываться с каннабиноидным рецептором 1 (CB1), и к способам применения таких антител и антигенсвязывающих фрагментов.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0003] Содержимое текстового файла, представленного в электронном виде вместе с данным документом, включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте: копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: 15-343-W03-Seq_List_ST25.txt, дата регистрации: 27 марта 2015 года, размер файла: 793 кБ).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Каннабиноидный рецептор 1 (CB1) является членом суперсемейства G-белок-сопряженных рецепторов (GPCR). Рецептор CB1 экспрессируется в центральной нервной системе (ЦНС), легких, печени, жировой ткани и почках, и участвует в развитии многих заболеваний человека, включающих в себя, в числе прочих, ожирение, диабет, фиброз, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания, рак, боль, спастичность при MS и глаукому. Более конкретно, показано, что рецептор CB1 проявляет вредную активность, например, при ожирении, сахарном диабете, фиброзе, заболеваниях печени, сердечно-сосудистых заболеваниях и раке; и полезную активность при боли, MS-спастичности, глаукоме и др.

[0005] В данной области существует потребность в новых антагонистах и агонистах рецепторов CB1 для применения в терапевтических целях, а также в селективных связывающих средствах для применения в целях диагностики/визуализации. В частности, желательным может быть соединение, специфичное к рецептору CB1, но не способное к проникновению в ЦНС, что может уменьшить потенциальные ЦНС-опосредованные побочные эффекты модуляции рецептора CB1, такие как психиатрические нежелательные явления, связанные с обратным агонистом CB1, римонабантом.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, способные связываться с каннабиноидным рецептором 1 (также называемым здесь "рецептор CB1" или "CB1"). В некоторых вариантах осуществления рецептор CB1 представляет собой человеческий рецептор CB1. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент распознает один или несколько внеклеточных эпитопов рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты, способные связываться с рецептором CB1, представляют собой функциональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, ингибируют или повышают сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, представляют собой антагонистические антитела, которые ингибируют сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, представляют собой агонистические антитела, которые повышают сигнальную активность рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, являются модуляторами сигнальной активности рецептора CB1, или аллостерическими модуляторами сигнальной активности рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, представляют собой селективные связывающие средства, которые не обладают агонистической или антагонистической активностью. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела или их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, представляют собой селективные связывающие средства, не обладающие агонистической или антагонистической активностью, которые можно использовать в целях диагностики и/или визуализации.

[0007] В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются, по меньшей мере, столь же эффективными, как и низкомолекулярные модуляторы рецептора CB1, такие как, например, AM6545, AM251 или римонабант. В некоторых вариантах осуществления антитела или их фрагменты обладают ингибирующей или активирующей активностью в отношении рецептора СВ1, которая, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 4 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, или, по меньшей мере, в 20 раз превышает активность низкомолекулярных AM6545, AM251 или римонабанта. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты ингибируют передачу сигнала, опосредованную агонистом рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирование передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, измеряют путем определения уровня внутриклеточного цАМФ и/или нижестоящего фосфорилирования ERK.

[0008] В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты имеют преимущество, заключающееся в снижении или отсутствии способности проникать в мозг. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают более низкой способностью проникать в мозг, чем низкомолекулярные агонисты или антагонисты рецептора СВ1 (такие как AM6545, AM251 или римонабант). В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты, связывающиеся с рецептором CB1, оказывают терапевтическое действие, сопровождающееся пониженными побочными эффектами, связанными с центральной нервной системой, по сравнению с низкомолекулярными агонистами или антагонистами рецептора СВ1. Связанные с ЦНС побочные эффекты низкомолекулярного антагониста рецептора CB1 римонабанта включают в себя беспокойство, депрессию, возбуждение, расстройство пищевого поведения, раздражительность, агрессивность и бессонницу (Moreira, 2009, Rev Bras Psiquiatr., 31(2):145-53).

[0009] В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты получают из гибридомных клеточных линий. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты получают из фаговых библиотек.

[0010] В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают сродством к нативному человеческому рецептору СВ1, которое находится, по меньшей мере, в нМ диапазоне. Например, в некоторых вариантах осуществления сродство к рецептору СВ1 составляет примерно 1 мкМ или менее, или примерно 750 нМ или менее, или примерно 500 нМ или менее, или примерно 250 нМ или менее, или примерно 100 нМ или менее, или примерно 75 нМ или менее, или примерно 50 нМ или менее, или примерно 25 нМ или менее, или примерно 10 нМ или менее, или примерно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают сродством к человеческому рецептору СВ1, которое составляет примерно от 0,01 нМ до 500 нМ, примерно от 0,02 нМ до 250 нМ, примерно от 0,02 до 200 нМ, примерно от 0,05 до 100 нМ, примерно от 0,05 до 50 нМ.

[0011] Выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения можно получить из любых видов, включающих в себя, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, хомяков, морских свинок, приматов, лам или людей. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой мышиные антитела. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой химерные антитела. В следующих вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой полностью человеческие антитела.

[0012] В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой гуманизированные или химерные антитела P1C4, описанные в настоящем документе. В одном варианте осуществления гуманизированные антитела P1C4 выбраны из группы, состоящей из P1C4-H0, P1C4-H2 и P1C4-H4, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты содержат модификации Fc, которые приводят к снижению, нарушению или устранению эффекторной функции антитела. В другом варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты выбраны из группы, включающей в себя гибрид P1C4-Н0-IgG2-4, P1C4-Н0-IgG2A330S/P331S, P1C4-Н0-IgG4S228P, гибрид P1C4-Н2-IgG2-4, P1C4-H2-IgG2A330S/P331S, P1C4-H2-IgG4S228P, гибрид P1C4-H4-IgG2-4, P1C4-H4-IgG2A330S/P331S, P1C4-H4-IgG4S228P.

[0013] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49 и 57. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50 и 58. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51 и 59. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52 и 60. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53 и 61. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54 и 62. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55 и 63. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 и 64.

[0014] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7.

[0015] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0016] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 11; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 13; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 15.

[0017] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

[0018] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 17; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 19; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 21; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 23.

[0019] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[0020] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 25; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 27; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 29; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 31.

[0021] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.

[0022] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 33; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 35; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 37; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 39.

[0023] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность ID NO: 40.

[0024] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 41; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 43; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 45; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 47.

[0025] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

[0026] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 49; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 51; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 53; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 55.

[0027] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56.

[0028] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 57; константный участок тяжелой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 59; вариабельный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 61; и константный участок легкой цепи, кодируемый нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 63.

[0029] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

[0030] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело или его фрагмент, нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-351.

[0031] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат гипервариабельные участки (CDR) тяжелой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках тяжелой цепи SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR легкой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках легкой цепи SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0032] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, содержащее гипервариабельные участки (CDR) тяжелой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках тяжелой цепи SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело, содержащее гипервариабельные участки (CDR) легкой цепи, независимо выбранные из CDR, присутствующих в вариабельных участках легкой цепи SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0033] В одном варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 339-341. В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-341. В следующем варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 339-341.

[0034] В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351. В следующем варианте осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 343-351.

[0035] В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 337. В следующем варианте осуществления вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 337. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, которая, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 338. В следующем варианте осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, по существу состоит из, или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 338.

[0036] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает гуманизированное выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с СВ1. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 337, и вариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 339. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 337 и вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 340. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 337 и вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 341. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит полноразмерную легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 338 и полноразмерную тяжелую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351.

[0037] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR1 тяжелой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 352 (YYWMN). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR2 тяжелой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 353 (QIYPGDGETKY). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 354 (SHGNYLPY). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR1 легкой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 355 (SSYLH). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR2 легкой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 356 (STSNLAS). В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент содержит последовательность CDR3 легкой цепи, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 357 (HQYHRSPPTF).

[0038] В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 352, 353 и 354, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 355, 356 и 357, соответственно. В следующем варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи, CDR3 тяжелой цепи, CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 и 357, соответственно. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его фрагмент является химерным или гуманизированным.

[0039] Специалисту в данной области должно быть известно, что CDR тяжелых и легких цепей описанных здесь антител, можно выбирать независимо друг от друга, или комбинировать с получением антитела или его связывающего фрагмента, содержащего любые CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи; и любые CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи описанных здесь антител. Специалисту в данной области также следует понимать, что вариабельные участки тяжелых и легких цепей описанных здесь антител можно выбирать независимо друг от друга, или комбинировать с получением антитела или его связывающего фрагмента, содержащего любые тяжелые и легкие цепи описанных здесь антител.

[0040] В одном варианте осуществления описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой химерное антитело, или его фрагмент, содержащие CDR тяжелых и легких цепей, выбранные из описанных здесь CDR, или консервативные варианты описанных здесь CDR. В другом варианте осуществления описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, представляет собой гуманизированное антитело, или его фрагмент, содержащие CDR тяжелых и легких цепей, выбранные из описанных здесь CDR, или консервативные варианты описанных здесь CDR. В одном варианте осуществления изобретения описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит легкую цепь и/или тяжелую цепь, имеющую описанную здесь последовательность, или их консервативный вариант. В одном варианте осуществления консервативные варианты, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98% или, по меньшей мере, на 99% гомологичны описанной здесь стандартной последовательности. В одном варианте осуществления консервативные варианты содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислотных замен, инсерций или делеций.

[0041] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с СВ1 при пониженной эффекторной функции. В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CB1 и содержит одну или несколько модификаций Fc-участка. В следующем варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с CB1 и имеет аминокислотную последовательность, содержащую одну или несколько мутаций в Fc-участке. В следующем варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию в положении 228, и/или 330, и/или 331. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию в положении 228 Fc-участка, где Fc-участок относится к изотипу IgG4. В следующем варианте осуществления мутация представляет собой S228P. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию в положении 330, и/или в положении 331. В следующем варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию в положении 330 и/или 331, где Fc-участок относится к изотипу IgG2. В следующем варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит следующие мутации в Fc-участке: A330S и P331S. В другом варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участок Fc, который представляет собой гибридный Fc-участок. Например, в одном варианте осуществления Fc-участок представляет собой гибридный Fc-участок IgG2/IgG4, где CH1 и шарнирные участки получены из IgG2, а участки СН2 и СН3 получены из IgG4.

[0042] Таким образом, в одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой химерное или гуманизированное антитело, или фрагмент, содержащий CDR тяжелых и легких цепей, выбранные из описанных здесь CDR или консервативных вариантов описанных здесь CDR, где выделенное антитело или его фрагмент содержит Fc-участок, несущий модификации, которые изменяют эффекторные функции антитела. Например, в одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR легкой и тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 352-357, или их консервативные варианты, а также содержит гибридный Fc-участок IgG2-IgG4, Fc-участок IgG2, содержащий аминокислотные мутации в положениях 330 и 331 (например, A330S и P331S), или Fc-участок IgG4, содержащий аминокислотную мутацию в положении 228 (например, S228P).

[0043] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где значение Kd, характеризующее сродство антитела или фрагмента к рецептору СВ1, составляет примерно 70 нМ или менее, примерно 60 нМ или менее, примерно 50 нМ или менее, примерно 40 нМ или менее, примерно 30 нМ или менее, примерно 25 нМ или менее, примерно 20 нМ или менее, примерно 15 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 8 нМ или менее, примерно 6 нМ или менее, примерно 5 нМ или менее, примерно 4 нМ или менее, примерно 3 нм или менее, примерно 2 нМ или менее, или примерно 1 нМ или менее. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где значение Kd, характеризующее сродство антитела или фрагмента к рецептору СВ1, находится в диапазоне примерно от 1 нМ до 100 нМ, примерно от 2 нМ до 75 нМ, примерно от 3 нМ до 50 нМ, примерно от 4 нм до 10 нМ, или значение Kd, характеризующее сродство к рецептору СВ2, составляет примерно 50 нМ, или примерно 40 нМ, или примерно 30 нМ, или примерно 20 нМ, или примерно 10 нМ, или примерно 5 нМ, или примерно 4 нМ, или примерно 3 нМ, или примерно 2 нМ, или примерно 1 нМ.

[0044] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые являются, по меньшей мере, в 2 раза, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 4 раза, по меньшей мере, в 5 раз, по меньшей мере, в 6 раз, по меньшей мере, в 7 раз, по меньшей мере, в 8 раз, по меньшей мере, в 9 раз, по меньшей мере, в 10 раз, по меньшей мере, в 11 раз, по меньшей мере, в 12 раз, по меньшей мере, в 13 раз, по меньшей мере, в 14 раз, или, по меньшей мере, в 15 раз более активными, чем низкомолекулярный римонабант, где активность антитела, или фрагмента, или римонабанта измеряют путем ингибирования передачи сигнала, опосредованной антагонистом рецептора СВ1, в анализе цАМФ. В следующем варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным.

[0045] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где антитело или его фрагмент обладает более высоким сродством связывания и/или более высокой активностью, чем соответствующее негуманизированное или химерное антитело, причем гуманизированное антитело, или его фрагмент, и соответствующее негуманизированное или химерное антитело содержат одинаковые CDR тяжелой и легкой цепи. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает гуманизированное антитело, или его фрагмент, которые содержат CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 352, 353, 354, 355, 356 и 357, соответственно, где гуманизированное антитело обладает более высоким сродством к рецептору CB1 и/или более высокой активностью в отношении ингибирования агониста рецептора CB1. В одном из вариантов осуществления активность описанных здесь гуманизированных антител и фрагментов, по меньшей мере на 50% выше, по меньшей мере, на 100% выше, по меньшей мере, в 2 раза выше, по меньшей мере, в 3 раза выше, по меньшей мере, в 4 раза выше, по меньшей мере, в 5 раз выше, или, по меньшей мере, в 10 раз выше, чем активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела. В другом варианте осуществления активность измеряют по ингибированию CB1 - продукции цАМФ.

[0046] Активность описанных здесь антител против рецептора CB1 можно измерить с помощью любого способа, известного в данной области техники. Например, в одном варианте осуществления активность описанных здесь антител и фрагментов измеряют по уровню внутриклеточного цАМФ или фосфорилирования ERK. Например, активность можно измерить путем определения уровня ингибирования продукции цАМФ с помощью функционального анализа цАМФ (Cisbio), или уровня ингибирования WIN55,212-индуцированного фосфорилирования ERK методом вестерн-блоттинга.

[0047] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способные конкурировать с описанным здесь антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, за связывание с рецептором CB1. В некоторых других вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться, по существу, с тем же эпитопом на рецепторе CB1, что и описанные здесь антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Такие антитела можно идентифицировать с помощью рутинных анализов конкурентного связывания. В некоторых вариантах осуществления конкурентную способность измеряют методами ELISA, проточной цитометрии или поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

[0048] В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты конъюгируют с одним или несколькими средствами, выбранными из группы, включающей в себя другое терапевтическое средство, цитотоксическое средства, молекулу иммуноадгезии и визуализирующее средство. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0049] В одном аспекте изобретение предлагает способы модуляции сигнальной активности рецептора СВ1, включающие в себя приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с описанным здесь антителом или его фрагментом. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые способы приводят к ингибированию сигнальной активности рецептора СВ1. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые способы приводят к увеличению сигнальной активности рецептора СВ1. В некоторых вариантах осуществления модуляция сигнальной активности рецептора СВ1 является косвенной, например, как под действием аллостерического модулятора. В некоторых вариантах осуществления модуляция сигнальной активности рецептора СВ1 приводит к смещению в сторону передачи сигналов, опосредованной Galpha i/o, от передачи сигналов, опосредованной бета-аррестином.

[0050] В одном аспекте изобретение предлагает способы лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическую или агонистическую активность в отношении рецептора СВ1, у индивидуума, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления способы включают в себя введение индивидууму описанного здесь антитела против рецептора CB1, или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном из вариантов осуществления индивидуум представляет собой млекопитающее. В следующем варианте осуществления индивидуум представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой ожирение, диабет, дислипидемию, метаболические заболевания, фиброз, неалкогольный стеатогепатит (NASH), заболевание печени, первичный билиарный цирроз, заболевание почек, фиброз почек, хроническое заболевание почек, остеопороз, атеросклероз, сердечно-сосудистое заболевание, рак, воспалительное заболевание, боль, спастичность мышечной системы и глазные болезни, включающие в себя глаукому. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой, например, ожирение, диабет, фиброз, заболевание печени, сердечно-сосудистое заболевание или рак, а предлагаемый способ приводит к ингибированию активности рецептора СВ1. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой, например, боль или глаукому, а предлагаемый способ приводит к активации рецептора СВ1, или увеличению активности рецептора СВ1.

[0051] В одном аспекте изобретение предлагает способ детекции рецептора СВ1 в клетке, ткани или организме индивидуума, включающий в себя приведение клетки в контакт с описанным здесь антителом, способным связываться с рецептором СВ1, или его антигенсвязывающим фрагментом. В одном из вариантов осуществления клетка присутствует в организме индивидуума. В другом варианте осуществления клетка присутствует в организме человека. В другом варианте осуществления уровень экспрессии рецептора СВ1 на клетках коррелирует со стадией заболевания. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы применения антител и их фрагментов, способных специфически связываться с рецептором СВ1, в качестве средств диагностики и/или прогнозирования заболеваний человека. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способы визуализации рецептора СВ1, включающие в себя применение описанных здесь антител против рецептора СВ1 и их фрагментов. В одном варианте осуществления способ детекции рецептора CB1 проводят с использованием описанного здесь антитела против рецептора СВ1, или его фрагмента, способных селективно связываться с рецептором CB1. В следующем варианте осуществления антитело, способное селективно связываться с рецептором CB1, или его фрагмент, не обладает агонистической или антагонистической активностью. В другом варианте осуществления антитело, селективно связывающееся с рецептором CB1, или его фрагмент, не способны к интернализации. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способы диагностики и визуализации, включающие в себя применение антитела против рецептора CB1, или его фрагмента, конъюгированного с визуализирующим средством, таким как, например, радиоактивная метка, фермент, флуоресцентная метка, люминесцентная метка, биолюминесцентная метка, магнитная метка или биотин.

[0052] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает клетку-хозяина, экспрессирующую выделенное антитело, или его фрагмент, способные специфически связываться с рецептором CB1. В другом варианте осуществления изобретение предлагает способ получения антитела или его фрагмента, способных специфически связываться с рецептором CB1, где указанный способ включает в себя иммунизацию млекопитающих очищенным рецептором CB1 или его антигенным фрагментом, CB1/липидными комплексами, рецептор CB1-экспрессирующими iCAPS, и/или ДНК, кодирующей рецептор CB1. В другом варианте осуществления в качестве млекопитающих для иммунизации используют мышей. В другом варианте осуществления, перед сбором клеток иммунизированных млекопитающих, животных иммунизируют один, два, три, четыре, пять или более раз очищенным CB1, или его антигенным фрагментом, CB1/липидным комплексом, рецептор CB1-экспрессирующими iCAPS, и/или ДНК, кодирующей рецептор CB1. В следующем варианте осуществления антитело или его фрагмент, способные специфически связываться с рецептором CB1, получают из гибридомной клеточной линии, содержащей клетки, полученные из иммунизированных млекопитающих. В другом варианте осуществления антитело или его фрагмент, способные специфически связываться с рецептором CB1, получают из библиотеки фагового дисплея. В следующем варианте осуществления библиотеку фагового дисплея получают из клеток, выделенных из иммунизированных млекопитающих. В следующем варианте осуществления библиотеку фагового дисплея получают из последовательностей наивных человеческих иммуноглобулинов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0053] На фигуре 1А приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание P2A12 Bril mAb (левый столбец), PA2LR3-P2D3 (средний столбец) или PA2R3-P1A7 (правый столбец) при 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с клеточной линией Trex-CHO нативный человеческий CB1 (экспрессирующей нативный рецептор CB1, темно-серые линии), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средне-серые линии), или исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1B приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2R3-P1F1 (левый столбец), PA2LR3-P2E5 (средний столбец) или PA2LR3-P3B10 (правый столбец) при 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с клеточной линией Trex-CHO нативный CB1 (экспрессирующей нативный человеческий рецептор CB1, темно-серые линии), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средне-серые линии), или исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1C приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P3B8 (левый столбец) или PA2LR3-P1H4 (правый столбец) при 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с клеточной линией Trex-CHO нативный человеческий CB1 (экспрессирующей нативный рецептор CB1, темно-серые линии), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средне-серые линии), или исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1D приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P4B1 (левый столбец), PA2LR3-P4B5 (средний столбец) или PA2LR3-P4C6 (правый столбец) при 300 нм (верхний ряд) или 30нм (нижний ряд) с клеточной линией Trex-CHO нативный человеческий CB1 (экспрессирующей нативный рецептор CB1, темно-серые линии), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средне-серые линии), или исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1E приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P4G10 (левый столбец) или PA2LR3-P6D7 (правый столбец) при 300 нМ (верхний ряд) или 30 нМ (нижний ряд) с клеточной линией Trex-CHO нативный человеческий CB1 (экспрессирующей нативный рецептор CB1, темно-серые линии), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средне-серые линии), или исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; светло-серые линии). На фигуре 1F приведен ряд гистограмм, демонстрирующих связывание PA2LR3-P1G6 (левый столбец), PA2LR3-P1H4 (средний столбец) или PA2LR3-P2B8 (правый столбец) с исходной клеточной линией Trex-CHO (не экспрессирующей рецептор CB1; верхний ряд), клеточной линией Trex-CHO CB1 T210A/партнер по гибридизации (экспрессирующей CB1 на повышенном уровне; средний ряд), или клеточной линией Trex-CHO A156 (экспрессирующей нативный человеческий рецептор CB1; нижний ряд).

[0054] На фигуре 2 показана способность двух антител против рецептора CB1, PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2, селективно связываться с клетками, экспрессирующими CB1. На фигуре 2А (демонстрирующей связывание PA13R3-P1C4) и на фигуре 2В (демонстрирующей связывание 36E12B6C2) показано, что оба антитела связываются с A156 (экспрессирующими нативный человеческий рецептор CB1) и, в еще большей степени, с А56 (экспрессирующими рецептор CB1 на повышенном уровне и модифицированными путем мутации T210A и замены ICL3 на партнер по гибридизации), но не связываются с клетками СНО, не экспрессирующими рецептор CB1, клеточной линией, экспрессирующей СВ2, или клеточной линией, экспрессирующей 5HT2b. Экспрессию CB2 (фигура 2C) и 5HT2b (фигура 2D) подтверждают в клеточных линиях, экспрессирующих CB2 и 5HT2b, соответственно.

[0055] На фигуре 3 приведены результаты конкурентного анализа, позволяющие определить, действительно ли 36E12B6C2 и P1C4 связываются с подобными эпитопами. Клетки Trex CHO A156, экспрессирующие нативный человеческий CB1, инкубируют с конкурирующими IgG (IgG или Fab PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2) и затем с разными концентрациями окрашивающих IgG (300 нМ или 75 нМ P1C4, фигура 3А; 80 нМ или 25 нМ 36E12B6C2, фигура 3B).

[0056] На фигуре 4 показаны результаты функционального антагонистического анализа цАМФ. Антитела 36E12B2H8 (фигура 4A) и PA13R3-P1C4 (фигура 4В) проявляют антагонистическую активность, равную (36E12B2H8) или превышающую (PA13R3-P1C4) активность используемых в качестве положительного контроля низкомолекулярных ингибиторов CB1 AM251 (фигура 4C), SR141716A (римонабант) (фигура 4D) и AM6545 (фигура 4Е). P2A12 и изотип гибридомных IgG используют в качестве отрицательного контроля (фигуры 4F и 4G).

[0057] На фигуре 5A приведены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие уровень фосфорилированной ERK (pERK) и общей ERK в клетках Trex-СНО, экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, после экспрессии рецептора CB1 и обработки контрольным IgG, используемым в качестве положительного контроля низкомолекулярным AM6545, или полученным из фага mAb PA13R3-P1C4 или PA13R3-P1E4, с последующей обработкой 100 нм агониста рецептора CB1, WIN55,212. Вестерн-блоттинг проводят через 10 минут после активации WIN55,212 (левые панели), или через 15 минут после активации WIN55,212 (правые панели). На фигуре 5В приведены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие уровень pERK и общей ERK в клетках Trex-СНО, экспрессирующих нативный человеческий рецептор CB1, после экспрессии рецептора CB1 и обработки контрольным IgG1, контрольным IgG2, WIN55,212, AM6545 или полученным из гибридом mAb 36E12B2E5, 36E12B6C2 или 36E12B2F2, с последующей активацией под действием WIN55,212.

[0058] На фигуре 6А показаны результаты функционального анализа цАМФ, проводимого в отсутствии CP55940 для оценки потенциальной агонистической активности PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 и PA2LR3-P6G6, по сравнению с контрольными соединениями, изображенными на фигуре 6В: CP55940 (положительный контроль), P2A12 (отрицательный контроль) или PA2R3-P1A7 (отрицательный контроль). На фигуре 6С показаны результаты функционального анализа цАМФ, проводимого в присутствии CP55940 для оценки потенциальной аллостерической модуляторной активности PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6B12 и PA2LR3-P6G6, по сравнению с контрольными соединениями, изображенными на фигуре 6D: CP55940 один (положительный контроль), P2A12 (отрицательный контроль) или PA2R3-P1A7 (отрицательный контроль).

[0059] На фигуре 7 показаны результаты анализа цАМФ, проводимого для оценки обратной агонистической или нейтральный антагонистической активности PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2. AM6545 и SR141716A используют в качестве положительного контроля для нейтрального антагониста и обратного агониста, соответственно.

[0060] На фигуре 8А показаны результаты анализа iCAPS методом ELISA с целью определения связывания 36E12B6C2 Fab (верхняя левая панель), или IgG (верхняя правая панель), или P1F7 Fab (нижняя левая панель), или Fab (нижняя правая панель), с rBril-0918, пустыми iCAPS, iCAPS, не экспрессирующими рецептор CB1 (h13h iCAPS), или iCAPS, экспрессирующими человеческий рецептор CB1 (A138 iCAPS и A139 iCAPS). На фигуре 8В показаны результаты анализа iCAPS методом ELISA с целью определения связывания PA13R3-P1C4 Fab (верхняя левая панель), или IgG (верхняя правая панель), или P1F7 Fab (нижняя левая панель), или Fab (нижняя правая панель) с rBril-0918, пустыми iCAPS, iCAPS, не экспрессирующими рецептор CB1 (h13h iCAPS), или iCAPS, экспрессирующими человеческий рецептор CB1 (A138 iCAPS и A139 iCAPS).

[0061] На фигурах 9A и 9B показана интернализация рецептора CB1 после обработки разными средствами. На фигуре 9A показано, что антитела против CB1 не блокируют WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора. На гистограммах, приведенных на фигуре 9А в верхнем ряду, показана поверхностная экспрессия CB1 после обработки WIN55,212, или контролем, или после предварительной обработки CB1-специфическим нейтральным антагонистом AM6545 с последующей обработкой WIN55,212. На гистограммах, приведенных на фигуре 9А в среднем и нижнем рядах, показана поверхностная экспрессия CB1 после предварительной обработки антителами против CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6B12, PA2LR3-P6G7, PA3R3-P4D5, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 и PA2LR3-P4G10, или отрицательным контролем P2A12 с последующей обработкой WIN55,212. На фигуре 9B показано, что антитела против CB1 сами по себе не индуцируют интернализацию рецептора CB1. На гистограммах, приведенных на фигуре 9B в верхнем ряду, показана поверхностная экспрессия CB1 после обработки WIN55,212, или контролем, или после предварительной обработки CB1-специфическим нейтральным антагонистом AM6545 с последующей обработкой WIN55,212. На гистограммах, приведенных на фигуре 9B в среднем и нижнем рядах, показана поверхностная экспрессия CB1 после обработки антителами против CB1 PA2LR3-P3A8, PA2LR3-P3F8, PA2LR3-P5B11, PA2LR3-P5E7, PA2LR3-P6B12, PA2LR3-P6G7, PA3R3- P4D5, PA2LR3- P4B1, PA2LR3-P4B5, PA2LR3-P4C6 и PA2LR3-P4G10, или отрицательным контролем P2A12.

[0062] На фигуре 10 показаны результаты измерения цАМФ в функциональном сравнительном анализе антагонистической активности гуманизированных и химерных антител P1C4. Гуманизированное антитело P1C4-H0 обладает антагонистической активностью, подобной активности химерного антитела P1C4. Гуманизированные антитела P1C4-H4 и PIC4-Н2 обладают более высокой антагонистической активностью, чем химерное антитело P1C4, или используемый в качестве положительного контроля низкомолекулярный ингибитор рецептора CB1 римонабант.

[0063] На фигуре 11 показаны результаты измерения сродства связывания, перекрестной реакционноспособности и специфичности гуманизированных антител P1C4 методом проточной цитометрии. Сродство гуманизированных антител P1C4, P1C4-H2 и P1C4-H4, как к клеткам, осуществляющим нативную экспрессию человеческого CB1 (фигура 11А, верхняя панель), так и к клеткам, осуществляющим экспрессию CB1 на повышенном уровне (фигура 11А, нижняя панель), превосходит сродство химерного антитела P1C4. Ни одно из химерных или гуманизированных антител не связывается с мышиными клетками, экспрессирующими мышиный CB1, исходными клетками TRex-CHO или клетками TRex-CHO, экспрессирующими человеческий CB2 (фигура 11B).

[0064] На фигуре 12 показано сродство немеченого антитела P4B5 по сравнению со сродством Vivotag 680 XL-меченного антитела P4B5 к CB1, экспрессированному на клеточной поверхности.

[0065] На фигуре 13A показаны результаты детекции меченого антитела P4B5 в сердце, легких, печени, почках, желудке, кишечнике и мочевом пузыре в моменты времени 0 ч, 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч (13A.1); и детекции меченого антитела P4B5 в головном мозге в моменты времени 0 ч, 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч (13A.2). На фигуре 13В показаны результаты детекции меченого антитела в головном мозге, включающей в себя детекцию в ткани и в крови (левая панель), по сравнению с результатами детекции меченого антитела в мозге с вычитанием сигнала, поступающего от крови (т.е. только ткань мозга, правая панель).

[0066] На фигуре 14 показаны профили SEC и результаты анализа SDS-PAGE, полученные для гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4, экспрессированных в клетках 293 и CHO-K1. На фигуре 14A показаны профиль SEC (вверху) и результаты анализа методом SDS-PAGE (внизу) для одной из партий 293 FreeStyle. На фигуре 14B показаны профиль SEC (вверху) и результаты анализа методом SDS-PAGE (внизу) для одной из партий CHO-K1.

[0067] На фигуре 15 показаны результаты функциональных анализов гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 по сравнению с исходным химерным PA13R3-P1C4 и mAb P2A12, используемым в качестве отрицательного контроля, не специфичным к GPCR антителом изотипа IgG1, где указанные анализы проводят путем измерения уровня цАМФ.

[0068] На фигуре 16 показано сравнение активности гуманизированных вариантов P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 с активностью римонабанта, AM6545 и используемого в качестве отрицательного контроля антитела P2A12-IgG1 в отношении клеток TRex-CHO CB1, стимулированных 1,5 мкМ форсколином (фигура 16A), а также клеток TRex-CHO CB1, стимулированных 5 мкМ форсколином (фигура 16B).

[0069] На фигуре 17 показано влияние возрастающих концентраций P1C4-h2-IgG4 на CP55,940 (фигура 17A) и WIN55,212 (фигура 17C). Также показаны кривые Шильда для каждого вида обработки (фигуры 17B и 17D).

[0070] На фигурах 18А и 18В показаны результаты анализов активации ERK методом вестерн-блоттинга, в которых измеряют способность гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 блокировать WIN55,212-опосредованную активацию ERK.

[0071] На фигуре 19А показаны результаты исследования интернализации рецептора CB1 методом проточной цитометрии в разных индуцирующих условиях в отсутствии ингибитора (панель А), или в присутствии римонабанта (панель B) или гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 (панели С-G). На фигуре 19B показаны результаты такого же анализа интернализации рецептора CB1, в котором исследуют влияние P1C4-h2, клонированного в разных человеческих каркасных участках Fc IgG2 и IgG4.

[0072] На фигурах 20 A-D показаны результаты анализа методом проточной цитометрии, в котором измеряют связывание гуманизированных вариантов антител PA13R3-P1C4 с клетками TRex-СНО, стабильно трансфицированными тетрациклин-индуцируемым человеческим CB1. На фигурах 20 Е-М показаны результаты анализа селективности связывания и перекрестной реакционноспособности гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 в отношении человеческого CB1 по сравнению с человеческим CB2 и мышиным CB1.

[0073] На фигуре 21 показаны результаты анализа методом проточной цитометрии, в котором измеряют связывание антител (показаны в верхней части) с клетками, экспрессирующими разные конструкции CB1 (показаны слева).

[0074] На фигуре 22 показаны результаты анализа антитело-опосредованной цитотоксичности и комплемент-зависимой цитотоксичности гуманизированных вариантов P1C4, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-H2-IgG4, в отношении клеток Дауди. На фигурах 22А-С показаны результаты анализа антитело-опосредованной цитотоксичности вариантов P14C. На фигуре 22D показаны результаты анализа комплемент-зависимой цитотоксичности вариантов P14C.

[0075] На фигуре 23 показаны результаты анализа методом вестерн-блоттинга, в котором определяют распознавание денатурированного белка CB1 указанными антителами P1C4, используемыми в качестве первичных антител, или контрольными антителами, с использованием вторичных антител против человеческих (фигура 23A) или мышиных (фигура 23B) иммуноглобулинов. В качестве отрицательного контроля используют очищенный человеческий IgG со вторичным антителом против человеческих иммуноглобулинов (фигура 23А, линия 1) и первичное мышиное антитело со вторичным антителом против кроличьих иммуноглобулинов (фигура 23B, линия 11).

[0076] На фигуре 24 показаны результаты анализа Fab-фрагментов химерных и гуманизированных антител P1C4, инкубированных с клетками, экспрессирующими рецептор CB1, на способность к связыванию методом проточной цитометрии (фигура 24A) и ингибированию продукции цАМФ (фигура 24B).

[0077] На фигуре 25 показано положительное CB1-специфическое окрашивание макрофагов, гепатоцитов и печеночных миофибробластов в образцах, соответствующих ранней стадии NASH (левая панель), фиброзу, обусловленному NASH (средняя панель), и поздней стадии фиброза (правая панель).

[0078] На фигуре 26 демонстрируется отсутствие окрашивания клеток, полученных из нормального образца (средняя панель), или из образца, соответствующего фиброзу, обусловленному NASH (правая панель), изотипическими нерелевантными антителами.

[0079] На фигуре 27 показано отсутствие CB1-специфического окрашивания в нормальных тканях.

[0080] На фигуре 28 показаны результаты измерения методом ОТ-ПЦТ экспрессии коллагена А1(I) в первичных звездчатых клетках печени, обработанных PBS, нефункциональным контрольным антителом и антителами P1C4-h2.

[0081] На фигуре 29 показаны результаты измерения методом ОТ-ПЦТ уровней экспрессии TGFβ в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в разных концентрациях и контрольными соединениями.

[0082] На фигуре 30 показаны результаты измерения методом ОТ-ПЦТ уровней экспрессии TIMP1 в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в разных концентрациях и контрольными соединениями.

[0083] На фигуре 31 показаны результаты измерения методом ОТ-ПЦТ уровней экспрессии α-SMA в первичных звездчатых клетках печени, обработанных указанными антителами в разных концентрациях и контрольными соединениями.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0084] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает антигенсвязывающие белки, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, способные селективно связываться с человеческим каннабиноидным рецептором 1 (СВ1). Антитела и их фрагменты представляют собой функциональные антитела, обладающие агонистической или антагонистической активностью в отношении рецептора СВ1, или способные селективно распознавать CB1, но не обладающие агонистической или антагонистической активностью.

[0085] В данном описании термин "антитело" относится к связывающим белкам, содержащим, по меньшей мере, один антигенсвязывающий домен, и включает в себя моноклональные антитела, их фрагменты и/или варианты, в том числе рекомбинантные полипептиды, гибридные белки и иммуноконъюгаты. Таким образом, термины "антитело", "фрагмент антитела" и "вариант антитела" используются здесь как взаимозаменяемые. Примеры фрагментов антител настоящего изобретения включают в себя, без ограничения, фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; фрагмент Fc, состоящий из доменов VH и CHI; фрагмент Fv, состоящий из VL и VH; фрагмент dAb, состоящий из домена VH; выделенные CDR; двухвалентный фрагмент F(аb')₂, содержащий два связанных фрагмента Fab; и одноцепочечные молекулы Fv (scFv). Описанные здесь антитела, способные связываться с рецептором CB1, можно получить из любых видов, включающих в себя, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, приматов, лам и людей. Антитела, связывающие рецептор СВ1, могут представлять собой химерные, гуманизированные или полностью человеческие антитела.

[0086] В данном описании термин "полученный", используемый для обозначения молекулы или полипептида, родственных исходному антителу или другому связывающему белку, относится к молекуле, или полипептиду, которые способны специфически связываться с тем же эпитопом, что и исходное антитело, или другой связывающий белок.

[0087] Если конкретно не указано иначе, применение термина в единственном числе также подразумевает его использование во множественном числе. Если специально не указано иначе, единственное число означает "по меньшей мере один". Если конкретно не указано иначе, слово "или" используется в значении "и/или". Значение фразы "по меньшей мере один" эквивалентно значению фразы "один или несколько". Далее, термин "включающий в себя", а также другие формы, такие как "включает в себя" и "включенный", используется как неограничивающий. Кроме того, если конкретно не указано иначе, такие термины, как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы или компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы или компоненты, содержащие несколько единиц.

[0088] Описанные здесь антитела и их антигенсвязывающие фрагменты являются специфичными к каннабиноидному рецептору 1 (CB1). Под термином "специфичный к" подразумевают, что антитела и их фрагменты связывают рецептор CB1 с большим сродством (т.е. с более низким значением Kd), чем любую другую мишень. Таким образом, антитела и их фрагменты, которые являются селективными в отношении рецептора CB1, связывают рецептор CB1 с большим сродством (т.е. с более низким значением Kd), чем любой другой каннабиноидный рецептор, или любой другой GPCR, или любую другую мишень. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов или вариантов к рецептору CB1, может находиться в диапазоне примерно от 0,01 нМ до 500 нМ, примерно от 0,02 нМ до 250 нМ, примерно от 0,02 до 200 нМ, примерно от 0,05 до 100 нМ, примерно от 0,05 до 50 нМ. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов или вариантов к рецептору CB1, может составлять примерно 500 нМ, примерно 250 нм, примерно 200 нм, примерно 150 нм, примерно 100 нм, примерно 75 нМ, примерно 50 нМ, примерно 25 нМ, примерно 10 нМ, примерно 5 нМ, примерно 1 нМ, примерно 500 пМ, примерно 250 пМ, примерно 100 пМ, примерно 50 пМ или примерно 10 пМ. Значение Kd, характеризующее сродство антител и их фрагментов или вариантов к рецептору CB1, может составлять примерно 100 нМ или менее, примерно 75 нМ или менее, примерно 50 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 1 нМ или менее, примерно 500 пМ или менее, или примерно 100 пМ или менее.

[0089] В данном описании термин "агонист" относится к соединению, которое усиливает сигнальную активность другого соединения или рецепторного участка.

[0090] В данном описании термин "антагонист" относится к соединению, которое ингибирует, уменьшает или предотвращает сигнальную активность другого соединения в участке рецептора и, в более общем смысле, данный термин относится к соединению, которое уменьшает или предотвращает активацию и/или сигнальную активность рецептора.

[0091] "Аллостерический модулятор" представляет собой соединение, которое косвенно модулирует агонистические эффекты другого соединения. Например, аллостерический модулятор может косвенно модулировать агонистический эффект агониста рецептора путем индукции конформационного изменения в структуре белка. Аллостерические модуляторы могут представлять собой положительные (усиливают агонистический эффект соединения-агониста) или отрицательные (уменьшают эффект соединения-агониста) модуляторы.

[0092] В данном описании термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Индивидуум, нуждающийся в лечении, представляет собой индивидуума, который уже имеет заболевание или расстройство, или индивидуума, у которого может развиться заболевание или расстройство, и который нуждается в предотвращении, задержке или ослаблении заболевания или расстройства. Описанные здесь способы "лечения" включают в себя введение индивидууму описанного здесь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, например, индивидууму, страдающему от CB1-ассоциированного заболевания или расстройства (такого как фиброзное заболевание), или предрасположенного к такому заболеванию или расстройству, с целью предотвращения, вылечивания, задержки, уменьшения тяжести, или ослабления одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства, или рецидивирующего заболевания или расстройства, или с целью увеличения срока жизни индивидуума по сравнению со сроком жизни, ожидаемым в отсутствии такого лечения. В данном описании термин "индивидуум" относится к млекопитающему, включающему в себя грызунов, кошачьих, собачьих и приматов. В соответствии с настоящим изобретением индивидуум предпочтительно представляет собой человека.

[0093] Термин "терапевтически эффективное количество" в данном описании относится к количеству соединения или композиции, которое требуется для достижения терапевтического и/или профилактического эффекта у индивидуума. Терапевтически эффективное количество варьирует в зависимости от индивидуума и болезненного состояния, подлежащего лечению, массы и возраста индивидуума, тяжести болезненного состояния, способа введения и т.п., и может быть легко определено рядовым специалистом в данной области. Вводимая доза описанного здесь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может варьировать, например, примерно от 1 нг до 10000 мг, примерно от 1 мкг до 5000 мг, примерно от 1 мг до 1000 мг, примерно от 10 мг до 100 мг. Режим дозирования можно регулировать, чтобы достичь оптимальный терапевтический ответ. Эффективное количество также представляет собой количество, которое обеспечивает сведение к минимуму любых токсических или вредных эффектов (то есть побочных эффектов) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или преобладание положительных эффектов над токсическими или вредными эффектами.

I. Модифицированные антитела против CB1

[0094] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против рецептора CB1 могут содержать одну или несколько модификаций. Описанные здесь модифицированные формы антител против рецептора CB1 можно получить с помощью любых методов, известных в данной области.

[0095] В некоторых вариантах осуществления антитела против рецептора CB1 и их фрагменты представляют собой конъюгаты, дополнительно содержащие средство, выбранное из группы, включающей в себя другое терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекулы иммуноадгезии и визуализирующее средство. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина. В некоторых вариантах осуществления визуализирующее средство представляет собой радиоактивную метку, выбранную из группы, состоящей из: ³H_, ¹⁴C_, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho и ¹⁵³Sm. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство или цитотоксическое средство выбрано из группы, включающей в себя иммунодепрессант, иммуностимулирующее средство, антиметаболит, алкилирующее средство, антибиотик, фактор роста, цитокин, антиангиогенное средство, антимитотическое средство, антрациклин, токсин и апоптотическое средство.

[0096] В одном варианте осуществления описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1 или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгируют с антагонистом CB1. Неограничивающие примеры известных антагонистов CB1 включают в себя римонабант, таранабант, VD60, Isis-414930 Antisense CB1, JD5037, AM6545 и ™38837. В одном варианте осуществления описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгируют с римонабантом. В одном варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с цитотоксическим средством, представляют собой агонисты рецептора CB1. В другом варианте осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с цитотоксическим средством, представляют собой нейтральные средства, связывающие рецептор CB1, которые обеспечивают интернализацию рецептора.

[0097] В другом аспекте изобретения описанное здесь выделенное антитело против рецептора CB1 или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгируют с химиотерапевтическим средством. "Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, используемое для лечения рака. Примеры химиотерапевтических средств включают в себя алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN®; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, такие как алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (главным образом, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (в том числе его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (в том числе его синтетические аналоги KW-2189 и CB1-™1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид мехлорэтаминоксида, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, каличемицин, в особенности каличемицин гамма 11 и каличемицин омега 11 (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, отрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицйины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубицин (в том числе морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идаруцибин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицины, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; алдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (в особенности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), не содержащий кремофор ABRAXANE™, композиция паклитаксела на основе наночастиц рекомбинантного альбумина (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений. Данное определение также включает в себя ингибиторы протеасом, такие как бортезомиб (велкейд), ингибиторы BCL-2, антагонисты IAP (например, имитаторы Smac/xIAP и ингибиторы cIAP, такие как некоторые пептиды, пиридиновые соединения, такие как (S)-N-{6-бензо[1,3]диоксол-5-ил-1-[5-(4-фтор-бензоил)-пиридин-3-ил-метил]-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил}-2-метиламинопропионамид, антисмысловая последовательность xIAP), ингибиторы HDAC (HDACI) и ингибиторы киназ (сорафениб). В одном варианте осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированные с цитотоксическим средством, являются агонистами рецептора СВ1.

[0098] В некоторых вариантах осуществления связывающий белок конъюгируют непосредственно со средством. В других вариантах осуществления связывающий белок конъюгируют со средством через линкер. Подходящие линкеры включают в себя, без ограничения, описанные здесь аминокислоты и полипептидные линкеры. Линкеры могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.

[0100] В некоторых вариантах осуществления антитела и их фрагменты представляют собой биспецифические или бифункциональные антитела. Термин "биспецифические антитела" относится к соединениям, которые содержат антигенсвязывающие участки двух антител в одной молекуле. Таким образом, биспецифическое антитело способно связываться одновременно с двумя разными антигенами. Биспецифическое антитело, как правило, представляет собой искусственное гибридное антитело, содержащее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных связывающих участка или эпитопа. Биспецифические антитела могут представлять собой моноклональные, предпочтительно человеческие или гуманизированные, антитела, которые обладают специфичностью, по меньшей мере, к двум разным антигенам.

[0100] В одном варианте осуществления биспецифическое антитело и/или его фрагмент является специфичным в отношении CB1 и второго антигена-мишени. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело и/или его фрагмент является специфичным в отношении CB1 и TGF-β, 2-AG, PDGF-β, IL-6, анандамида (АЕА) или LOXL-2.

[0101] Описанные здесь антитела и их фрагменты могут связываться с одним или несколькими антигенами-мишенями, выбранными из группы, включающей в себя карбоангидразу IX, альфа-фетопротеин, α-актинин-4, A3, антиген, специфичный для антитела А33, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, BrE3-антиген, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD132, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, специфический антиген-р рака толстой кишки (CSAp), CEA (CEACAM5), CEACAM1, CEACAM6, с-Met, DAM, EGFR, EGFRvIII, EGP-1, EGP-2, ELF2-М, Ер-САМ, Flt-1, Flt-3, рецептор фолиевой кислоты, антиген G250, GAGE, gp100, GROB, HLA-DR, HM1.24, хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) и его субъединицы, HER2/neu, HMGB-1, индуцируемый гипоксией фактор (HIF-1), HSP70-2M, HST-2, Ia, IGF-1R, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), KC4-антиген, KS-1-антиген, KS1-4, Le-Y, LDR/FUT, фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ESO-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, антиген, специфичный для антитела РАМ-4, плацентарный фактор роста, p53, PLAGL2, простатическая кислая фосфатаза, PSA, PRAME, PSMA, PIGF, IGF, IGF-1R, IL-6, RS5, RANTES, T101, SAGE, S100, сурвивин, сурвивин-2B, ТАС, TAG-72, тенасцин, рецепторы TRAIL, TNF-α, антиген Tn, антигены Томсена-Фриденрейха, некротические опухолевые антигены, VEGFR, фибронектин ED-B, WT-1, 17-1A-антиген, факторы комплемента С3, C3a, C3b, C5a, С5, маркер ангиогенеза, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, онкогенный маркер и продукт онкогена (см., например, Sensi et al., Clin Cancer Res 2006, 12:5023-32; Parmiani et al., J Immunol 2007, 178:1975-79; Novellino et al. Cancer Immunol Immunother 2005, 54:187-207).

[0102] Способы получения биспецифических антител хорошо известны. Получение биспецифических антител рекомбинантными методами обычно проводят путем совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулинов, где две тяжелые цепи обладают разной специфичностью (Milstein et al., Nature 305:537 (1983)). Вследствие случайного выбора тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь десяти разных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Выделение правильной молекулы обычно проводят методом аффинной хроматографии. Аналогичные способы описаны в WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991). Другие способы получения биспецифических антител описаны, например, в Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004.

[0103] Вариабельные домены антитела, обладающие желательной специфичностью связывания, можно гибридизовать с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Предпочтительно проводят гибридизацию с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим, по меньшей мере, часть шарнирного участка и участки C_H2 и C_H3. Он может содержать первый константный участок тяжелой цепи (C_H1), содержащий участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующей, по меньшей мере, в одном из гибридов. ДНК, кодирующие гибриды тяжелой цепи иммуноглобулина и, при необходимости, легкую цепь иммуноглобулина, вставляют в разные векторы экспрессии, которые используют для совместной трансформации подходящего организма-хозяина. Более подробное описание способов получения биспецифических антител можно найти, например, в Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986). Разработан ряд рекомбинантных методов, позволяющих осуществлять эффективную продукцию биспецифических антител, как в виде фрагментов антител (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66), так и в виде полноразмерных IgG (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).

[0105] Если не указано иначе, для осуществления настоящего изобретения используют традиционные методы молекулярной биологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, хорошо известные в данной области и описанные, например, в Methods in Molecular Biology, Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Антитела (P. Finch, 1997); Антитела: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Моноклональные антитела: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Phage display: a laboratory manual (C. Barbas III et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); и Using антитела: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).

[0105] В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы получения описанных здесь антител, а также их фрагментов или вариантов, включающие в себя иммунизацию мышей иммуногеном, обеспечивающим иммунный ответ на рецептор CB1, таким как, например, ДНК рецептора CB1, белок рецептора CB1, или липидный комплекс CB1. В некоторых вариантах осуществления мышей иммунизируют 1, 2, 3, 4, 5 или более раз. В некоторых вариантах осуществления мышей иммунизируют ДНК рецептора CB1 и ответ на рецептор CB1 усиливают путем дополнительной иммунизации ДНК, кодирующей рецептор CB1, и/или очищенным белком рецептора CB1, мембранами, содержащими белок рецептора CB1, или iCAPS рецептора CB1. В некоторых вариантах осуществления клетки иммунизированных мышей используют для получения гибридом и фаговых библиотек.

[0106] В некоторых вариантах осуществления продукцию антител против рецептора CB1 осуществляют путем извлечения В-клеток из иммунизированных мышей и использования их для получения гибридомных клеток, продуцирующих антитела против рецептора CB1. Способы получения гибридом хорошо известны в данной области и включают в себя гибридизацию антитело-продуцирующих клеток с клетками миеломы или другими иммортализованными клетками с получением иммортализованной антитело-продуцирующей гибридомной клеточной линии (см., например, Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495). Моноклональные антитела, продуцируемые клетками гибридомы, можно выделить из супернатанта с помощью обычных методов очистки иммуноглобулинов, таких как преципитация, хроматография, ультрафильтрация, центрифугирование, гель-электрофорез и/или любой другой способ, известный в данной области. Супернатанты или отдельные моноклональные антитела можно протестировать на связывание с рецептором CB1 путем оценки связывания с мембранами, содержащими рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами. Например, супернатанты или выделенные моноклональные антитела можно протестировать на связывание с рецептором CB1 с помощью метода ELISA.

[0107] В другом аспекте изобретение предлагает способы получения описанных здесь антител, а также их фрагментов или вариантов, включающие в себя применение фаговой библиотеки. Рекомбинантные способы получения антител с использованием технологии фагового дисплея известны в данной области (см., например, Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994), McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990), and Clackson et al. Nature 352:624 (1991)). В некоторых вариантах осуществления из селезенки иммунизированных мышей выделяют множество антител против рецептора CB1 и получают случайную комбинаторную библиотеку вариабельных генов, соответствующих данным антителам. В некоторых вариантах осуществления используют не библиотеку фагового дисплея, полученную из клеток иммунизированных мышей, а библиотеку генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, полученных из первичных лимфоцитов крови человека.

[0108] В некоторых вариантах осуществления библиотеку фагов подвергают, по меньшей мере, 3 циклам пэннинга с выявлением фагов, связывающихся с рецептором СВ1, после чего связующие компоненты фагов подвергают скринингу на специфическое связывание с рецептором CB1 методом ELISA. Затем выбирают конкретные связующие компоненты и превращают их в полноразмерные антитела.

[0109] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела и их фрагменты представляют собой химерные или гуманизированные антитела. Способы получения химерных и гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Lo, Benny, K. C., editor, in Антитело Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004.

[0110] "Химерное антитело" представляет собой антитело, содержащее, по меньшей мере, часть вариабельного участка тяжелой цепи и, по меньшей мере, часть вариабельного участка легкой цепи, полученные от одного вида; и, по меньшей мере, часть константного участка, полученную от другого вида. Например, в одном из вариантов осуществления химерное антитело может содержать мышиные вариабельные участки и человеческий константный участок. "Гуманизированное антитело" представляет собой антитело, которое содержит гипервариабельные участки (CDR) нечеловеческого антитела; и каркасные участки, а также константные участки человеческого антитела.

[0111] В данном описании термин "CDR" или "гипервариабельный участок" относится к несмежным антигенсвязывающим участкам, присутствующим в вариабельных участках полипептидов как тяжелой, так и легкой цепей. Эти конкретные участки описаны Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977), Kabat et al., Последовательности of protein of immunological interest. (1991), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), и MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), где определения включают в себя аминокислотные остатки, которые при сравнении друг с другом образуют перекрывающиеся участки, или подгруппы. Определение Kabat основано на вариабельности последовательности. Уникальная нумерация IMGT V-участков всех IG и TR всех видов опирается на высокую консервативность структуры вариабельного участка (Lefranc, Mp et al., Dev comp. Immunol. 27:55-77, 2003). Нумерация IMGT, установленная после выравнивания более 5000 последовательностей, учитывает и объединяет определения каркасных участков и CDR. Определение Clothia основано на расположении структурных петлеобразных участков. Контактное определение (MacCallum et al.) основано на анализе кристаллических структур комплексов и взаимодействий антитело-антиген. Аминокислотные остатки, которые составляют CDR в соответствии с каждым из вышеуказанных определений, приведены для сравнения. В одном варианте осуществления настоящего изобретения термин "CDR" относится к CDR, определенному по системе Kabat. В другом варианте осуществления настоящего изобретения CDR представляет собой CDR, определенный по системе IMGT.

[0112] CDR, как правило, играют важную роль в распознавании эпитопа и связывании антитела. Тем не менее можно осуществить изменения остатков, составляющих CDR, которые не препятствуют способности антитела распознавать и связывать свой эпитоп. Например, можно осуществить изменения, которые не влияют на распознавание эпитопа, но увеличивают сродство антитела к эпитопу. Было проведено несколько исследований с целью анализа влияния введения одной или нескольких аминокислотных замен в разных положениях последовательности антитела с использованием информации о первичной последовательности антитела, его свойствах, таких как способность к связыванию, и уровне экспрессии (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; и Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).

[0113] Таким образом, эквиваленты представляющего интерес антитела можно получить путем изменения последовательностей генов тяжелых и легких цепей по участкам CDR1, CDR2 или CDR3, или по каркасным участкам, с использованием таких методов, как олигонуклеотид-опосредованный сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, ПЦР с внесением ошибок, перетасовка ДНК или применение штаммов E. Coli, содержащих гены-мутаторы (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; and Adey et al., 1996, Chap. 16, pp. 277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Путем изменения нуклеотидной последовательности первичного антитела можно получать антитела с повышенным сродством (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; and Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).

[0114] Например, описанные здесь антитела против CB1 могут содержать CDR, полученные из одного или нескольких мышиных антител, и человеческие каркасные и константные участки. Таким образом, в одном варианте осуществления описанное здесь гуманизированное антитело связывается с тем же эпитопом на CB1, что и мышиное антителао, из которого получены CDR. В данном описании приведены примеры гуманизированных антител. Другие гуманизированные антитела против CB1, содержащие описанные здесь CDR тяжелых и легких цепей, или их варианты, которые можно получить с использованием любой человеческой каркасной последовательности, также также входят в объем настоящего изобретения. В одном варианте осуществления каркасные последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя каркасные последовательности, структурно подобные описанным здесь каркасным последовательностям. В некоторых вариантах осуществления человеческие каркасные участки выбирают на основе гомологии генов исходного антитела и зародышевых человеческих VH и VK. В некоторых вариантах осуществления выбранные каркасные участки обладают наивысшей степенью гомологии по отношению к генам VH и VK исходного антитела, а также их структуру можно рассчитать с помощью компьютерного моделирования или других способов, так, чтобы сохранить структуру CDR, которые, согласно расчетам, присутствуют в исходном антителе.

[0115] Для улучшения свойств описанных здесь антител можно осуществить дополнительные модификации каркасных участков. Такие дополнительные модификации каркасных участков могут включать в себя химические модификации; точечные мутации, вводимые для уменьшения иммуногенности или удаления эпитопов Т-клеток; или обратные мутации с введением остатка, присутствующего в исходной зародышевой последовательности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческие каркасные участки и привитые на них описанные здесь CDR, без дополнительных модификаций вариабельного участка. Гуманизированные антитела, которые не содержат обратных мутаций в человеческом каркасном участке, в данном описании обозначают H0 (например, P1C4-Н0). В другом варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческие каркасные участки и привитые на них описанные здесь CDR, где аминокислоту в положении 27 и/или 28 каркасного участка тяжелой цепи 1 подвергают обратной мутации. В следующем варианте осуществления аминокислоту в положении 27 подвергают обратной мутации из глицина (G) на Tyr (Y); а аминокислоту в положении 28 подвергают обратной мутации из Thr (T) на глутаминовую кислоту (Е). Гуманизированные антитела, содержащие такие мутации в положениях 27 и 28, в настоящем документе обозначают "Н2" или "H2 (YE)" (например, P1C4-H2 или P1C4-H2 (YE)). В другом варианте осуществления настоящего изобретения гуманизированные антитела и их фрагменты содержат человеческие каркасные участки и привитые на них описанные здесь CDR, где аминокислоту в положении 27 и/или 28 каркасного участка 1 тяжелой цепи и аминокислоту в положении 60 и/или 61 каркасного участка 3 тяжелой цепи подвергают обратной мутации. В следующем варианте осуществления аминокислоту в положении 27 подвергают обратной мутации из глицина (G) на Tyr (Y); аминокислотув положении 28 подвергают обратной мутации из Thr (T) на глутаминовую кислоту (Е); аминокислоту в положении 60 подвергают обратной мутации из Ala (A) на Asn (N); и аминокислоту в положении 61 подвергают обратной мутации из Gln (Q) на глицин (G). Гуманизированные антитела, содержащие такие мутации в положениях 27, 28, 60 и 61, в настоящем документе обозначают "H4" или "H4 (YENG)" (например, P1C4-H4 или P1C4-H4 (YENG)). В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела и антигенсвязывающие фрагменты содержат модификации в каркасном участке, такие как обратные мутации в легкой цепи. Например, в одном варианте осуществления антитела содержат мутацию в положении 45 и/или 47 каркасного участка 2 легкой цепи. В следующем варианте осуществления аминокислоту в положении 45 подвергают мутации из Arg (R) на Lys (K), а аминокислоту в положении 47 подвергают мутации из лейцина (L) на Trp (W). Настоящее изобретение также охватывает гуманизированные антитела, которые способны связываться с CB1 и содержат модификации в каркасном участке, соответствующие описанным здесь примерам модификаций в применении к любой подходящей каркасной последовательности, а также другие каркасные модификации, способные улучшать свойства антител. Описанные здесь антитела против CB1 и их фрагменты могут относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или любому их сочетанию. Термин "изотип" относится к классу антител, кодируемых генами константного участка тяжелой цепи. Кроме того, константный участок тяжелой цепи может быть получен из любого вида, включающего в себя, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, хомяков, морских свинок, приматов, лам или людей. Например, в одном варианте осуществления антитела против CB1 и их фрагменты настоящего изобретения включают в себя константный участок Fc человеческого IgG1. В другом варианте осуществления антитела против CB1 и их фрагменты содержат константный участок Fc человеческого IgG2, человеческого IgG4, или гибрида IgG2-IgG4.

II. Эффекторные функции и модификации Fc

[0116] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает антитела CB1, содержащие вариантные участки Fc. Fc-участок антитела представляет собой часть антитела, которая связывается с рецепторами Fcγ (FcγR) и молекулами комплемента C1q. Fc-участок играет важную роль в осуществлении эффекторных функций антитела. Термин "эффекторные функции", используемый в данном описании в применении к Fc антитела, относится к таким функциям антитела, как, например, связывание C1q; комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; опсонизация; трансцитоз; и понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора). Такие эффекторные функции, для осуществления которых обычно требуется сочетание Fc-участка со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела), можно оценить с помощью разных методов, традиционно используемых в данной области для анализа указанных эффекторных функций антитела. Вариантные Fc-участки представляют собой Fc-участки, которые содержат изменения, оказывающие влияние на эффекторные функции. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против CB1 содержат модификации Fc-участка, которые уменьшают, ухудшают или устраняют одну или несколько эффекторных функций. Например, в одном варианте осуществления описанные здесь антитела и их фрагменты обладают способностью связывать CB1 при пониженной, ухудшенной или отсутствующей способности к связыванию C1q и/или CDC и/или ADCC. Модификации Fc могут включать в себя вставки, делеции или замены аминокислот, а также химические модификации. Например, модификации Fc-участка можно осуществлять с целью увеличения или уменьшения связывания комплемента; с целью увеличения или уменьшения антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности; или с целью изменения характера гликозилирования. В данной области известны разные модификации Fc, которые описаны, например, в Labrijin et al., Nature Biotech 27(8):767-71 (2009); Idusogie, et al. J Immunol 2000; Greenwood et al Eur J Immunol 23:1098-104 (1993); Mueller et al. Mol Immunol 1997; 34:441-52; и Rother et al Nature Biotechnol 2007; 25:1256-64. Чтобы изменить эффекторные функции описанных здесь примеров антител против СВ1, можно использовать любые из известных в данной области модификаций Fc. Кроме того, разработаны разные терапевтические антитела, содержащие модификации Fc-участка, влияющие на эффекторные функции. Такие терапевтические антитела известны в данной области и включают в себя, например, алемтузумаб, бенрализумаб, бевацизумаб, бимекизумаб, кантузумаб, кодритузумаб, далотузумаб, эфализумаб, элотузумаб, энаватузумаб, энокизумаб, этролизумаб, фарлетузумаб, фиклатузумаб, имгатузумаб, итолизумаб, лифастузумаб, лигелизумаб, лоделцизумаб, лорвотузумаб, могамулизумаб, мотавизумаб, обинутузумаб, окаратузумаб, омализумаб, парсатузумаб, патексизумаб, перакизумаб, пертузумаб, пидилизумаб, квилизумаб, ронтализумаб, софитузумаб, соланезумаб, сувизумаб, теплизумаб, тилдракизумаб, тоцилизумаб, трастузумаб, трастузумаба эмтансин, трегализумаб, ведолизумаб, ворсетузумаб, ворсетузумаба мафодотин, иттрий (90Y)-кливатузумаба тетраксетан, анрукинзумаб, дацетузумаб, даклизумаб, этарацизумаб, милатузумаб, озанезумаб, пинатузумаба ведотин, полатузумаба ведотин, тигатузумаб, велтузумаб, абитузумаб, бокоцизумаб, демцизумаб, гевокизумаб, понезумаб, ралпанцизумаб, ромосозумаб, танезумаб, блозозумаб, концизумаб, кренезумаб, ибализумаб, иксекизумаб, лебрикизумаб, олокизумаб, пембролизумаб, симтузумаб, улокаплумаб, вателизумаб и самализумаб (см., например, SEQ ID NO: 358-432). Чтобы изменить эффекторные функции, период полужизни или другие свойства описанных здесь антител против рецептора СВ1, можно использовать любые известные в данной области модификации Fc.

[0117] В одном варианте осуществления антитело против CB1 выполняет эффекторную функцию на пониженном уровне. В следующем варианте осуществления антитело против СВ1 содержит Fc-участок IgG4, несущий мутацию в положении 228. В следующем варианте осуществления в положении 228 аминокислоту серин (S) заменяют на пролин (P) (т.е. S228P). В другом варианте осуществления антитело против CB1 выполняет эффекторную функцию на пониженном уровне и содержит Fc-участок IgG2, несущий мутацию в положении 330 и/или 331. В следующем варианте осуществления в положении 330 аминокислоту аланин (А) заменяют на серин (S), и/или в положении 331 аминокислоту пролин (Р) заменяют на серин (S). В следующем варианте осуществления антитело против CB1 содержит домен Fc IgG2, несущий обе мутации A330S и P331S. В другом варианте осуществления антитело против CB1 содержит гибридный Fc-участок IgG2/IgG4. Например, в одном варианте осуществления антитело CB1 содержит участок CH1 и шарнирный участок, полученные из IgG2, и участки СН2 и СН3, полученные из IgG4.

[0118] Конформационная антигенпрезентирующая система (iCAPS). iCAPS позволяет осуществлять конформационно правильную презентацию очищенных, выделенных, функциональных GPCR. Очищенные GPCR являются стабильными в липидных бислоях, окруженных белковым поясом.

[0119] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую одно из описанных здесь антител, или его антигенсвязывающий фрагмент или вариант. В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает клетку-хозяина, трансформированную указанным вектором. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В других вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. В других вариантах осуществления эукариотическая клетка выбрана из группы, состоящей из клетки протиста, клетки животного, клетки растения и клетки грибка. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, включающую в себя, без ограничения, 293, COS, NSO и CHO; или клету грибка, такого как Saccharomyces cerevisiae; или клетку насекомого, такую как Sf9. В одном варианте осуществления изобретение предлагает способы получения описанных здесь антител, а также их фрагментов или вариантов, включающие в себя культивирование одной из указанных в данном документе клеток-хозяев в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию связывающего белка.

[0120] Примеры рецептор CB1-связывающих антител настоящего изобретения приведены ниже в таблице 1. Другие типичные рецептор CB1-связывающие антитела настоящего изобретения, определяемые по SEQ ID NO, приведены в перечне последовательностей, показанном в таблице 2. Последовательности типичных рецептор CB1-связывающих антител настоящего изобретения приведены в таблице 3.

Таблица 1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой цепи и вариабельных участков легкой цепи типичных рецептор CB1-связывающих антител

Название Описание последова
тельности SEQ ID NO Последовательность PA13R3-P1C4 (химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 1 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGTCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGAAACTAAGTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTATATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCCCATGGTAACTACCTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 2 EVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGETKYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 3 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 4 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 5 GATATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 6 DIVLTQSPAIMSASLGERV™TCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPPTFGAGTKLELK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 7 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 8 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC 36E12B6C2 (химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 9 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCACCAGCCTAACGTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGGGGTAACCCCTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 10 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLQWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYFCARSGGNPFAFWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 11 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 12 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 13 GATATCCAGATGACACAGACTTCATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCTTCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCACATCAAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGACGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACGCTTCCGTGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 14 DIQMTQTSSSLSASLGDRVTFSCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVTSRFRGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGHTLPWSFGGGTKLEIK Нуклеотидная последовательность константного участка LC 15 CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 16 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 36E12B6C2 (мыши
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 17 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGAATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTCAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCACCTCACCAGCCTAACGTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGGGGTAACCCCTTTGCTTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 18 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYEFSYYWMNWVKQRPGQGLQWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMHLTSLTSEDSAVYFCARSGGNPFAFWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 19 GCTAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 20 AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 21 GATATCCAGATGACACAGACTTCATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCTTCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCACATCAAGGTTCCGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGACGTTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTCATACGCTTCCGTGGTCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 22 DIQMTQTSSSLSASLGDRVTFSCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVTSRFRGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGHTLPWSFGGGTKLEIK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 23 CGGGCAGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 24 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC PA2LR3- P4B5 (химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 25 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTATTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAGTGGAAGGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATTCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 26 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYSGRFKGKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 27 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 28 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 29 GACATTGTTCTCAACCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAAATAAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 30 DIVLNQSPAIMSASLGERV™TCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLEIK Нуклеотид
ная последова
тельность константного участка LC 31 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 32 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P2D3 (химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 33 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAGCTATTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 34 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGSYFAYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 35 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 36 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 37 GATATTGAGCTGGCCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTAGGGCAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCTCCTACGTTCGGTGCTGGGACCAAACTGGAAATAAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 38 DIELAQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRADFTLTIDPVEADDAATYYCLQYASSPPTFGAGTKLEIK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 39 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 40 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P4B1
(химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 41 GAGGTCCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTTGCATTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTTCAATGGAAAGTTCAAGGGTAGAGCCATACTGACTGCAGACATATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 42 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSNYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGRAILTADISSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 43 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 44 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 45 CAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 46 QIVLTQSPAIMSASLGERV™TCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLTFGAGTKLELK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 47 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 48 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P6B12
(химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 49 GAGGTCCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTTACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 50 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSYYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFAYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 51 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 52 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 53 CAAATTGTACTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCCCTCGCGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 54 QIVLTQSPAIMSASLGERV™TCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPLAFGAGTKLELK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 55 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 56 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC PA2LR3-P6G7
(химер
ная) Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка тяжелой цепи (HC) 57 GAGGTTCAGCTTCAGCAATCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTTTGCATTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTTCAATGGAAAGTTCAAGGGTAGAGCCATACTGACTGCAGACATATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCGCACGGTAACTATTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка HC 58 EVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGFAFSNYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNFNGKFKGRAILTADISSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSHGNYFPYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последова
тельность константного участка HC 59 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCATGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка HC 60 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Нуклеотидная последова
тельность вариабель
ного участка легкой цепи (LC) 61 GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCAATCATGTCCGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTACACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACCTCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGCATCATCGTTCCCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA Аминокислот
ная последова
тельность вариабель
ного участка LC 62 DIVLTQSPAIMSASLGERV™TCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQHHRSPPTFGAGTKLELK Нуклеотидная последова
тельность константного участка LC 63 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTTGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA Аминокислот
ная последова
тельность константного участка LC 64 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSLPVTKSFNRGEC

Таблица 2. SEQ ID NO других рецептор CB1-связывающих антител

Название Описание последовательности SEQ ID NO PA2LR3-P1G6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 65 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 66 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 67 Аминокислотная последовательность константного участка HC 68 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 69 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 70 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 71 Аминокислотная последовательность константного участка LC 72 PA2LR3-P1H4 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 73 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 74 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 75 Аминокислотная последовательность константного участка HC 76 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 77 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 78 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 79 Аминокислотная последовательность константного участка LC 80 PA2LR3-P2B8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 81 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 82 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 83 Аминокислотная последовательность константного участка HC 84 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 85 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 86 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 87 Аминокислотная последовательность константного участка LC 88 PA2LR3-P2E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 89 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 90 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 91 Аминокислотная последовательность константного участка HC 92 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 93 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 94 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 95 Аминокислотная последовательность константного участка LC 96 PA2LR3-P3A8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 97 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 98 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 99 Аминокислотная последовательность константного участка HC 100 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 101 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 102 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 103 Аминокислотная последовательность константного участка LC 104 PA2LR3-P3B10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 105 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 106 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 107 Аминокислотная последовательность константного участка HC 108 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 109 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 110 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 111 Аминокислотная последовательность константного участка LC 112 PA2LR3-P3B8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 113 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 114 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 115 Аминокислотная последовательность константного участка HC 116 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 117 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 118 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 119 Аминокислотная последовательность константного участка LC 120 PA2LR3-P3F8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 121 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 122 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 123 Аминокислотная последовательность константного участка HC 124 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 125 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 126 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 127 Аминокислотная последовательность константного участка LC 128 PA2LR3-P4C6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 129 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 130 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 131 Аминокислотная последовательность константного участка HC 132 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 133 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 134 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 135 Аминокислотная последовательность константного участка LC 136 PA2LR3-P4G10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 137 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 138 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 139 Аминокислотная последовательность константного участка HC 140 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 141 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 142 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 143 Аминокислотная последовательность константного участка LC 144 PA2LR3-P5E7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 145 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 146 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 147 Аминокислотная последовательность константного участка HC 148 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 149 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 150 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 151 Аминокислотная последовательность константного участка LC 152 PA2LR3-P6D7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 153 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 154 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 155 Аминокислотная последовательность константного участка HC 156 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 157 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 158 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 159 Аминокислотная последовательность константного участка LC 160 PA2R3-P1A7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 161 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 162 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 163 Аминокислотная последовательность константного участка HC 164 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 165 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 166 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 167 Аминокислотная последовательность константного участка LC 168 PA2R3-P1F1 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 169 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 170 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 171 Аминокислотная последовательность константного участка HC 172 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 173 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 174 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 175 Аминокислотная последовательность константного участка LC 176 PA13R3-P3A7 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 177 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 178 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 179 Аминокислотная последовательность константного участка HC 180 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 181 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 182 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 183 Аминокислотная последовательность константного участка LC 184 PA13R3-P3C3 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 185 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 186 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 187 Аминокислотная последовательность константного участка HC 188 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 189 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 190 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 191 Аминокислотная последовательность константного участка LC 192 PA13R3-P3D10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 193 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 194 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 195 Аминокислотная последовательность константного участка HC 196 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 197 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 198 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 199 Аминокислотная последовательность константного участка LC 200 PA13R3-P3D11 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 201 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 202 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 203 Аминокислотная последовательность константного участка HC 204 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 205 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 206 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 207 Аминокислотная последовательность константного участка LC 208 PA13R3-P3F6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 209 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 210 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 211 Аминокислотная последовательность константного участка HC 212 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 213 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 214 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 215 Аминокислотная последовательность константного участка LC 216 PA13R3-P4C4 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 217 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 218 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 219 Аминокислотная последовательность константного участка HC 220 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 221 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 222 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 223 Аминокислотная последовательность константного участка LC 224 PA13R3-P4F8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 225 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 226 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 227 Аминокислотная последовательность константного участка HC 228 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 229 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 230 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 231 Аминокислотная последовательность константного участка LC 232 PA13R3-P4G11 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 233 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 234 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 235 Аминокислотная последовательность константного участка HC 236 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 237 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 238 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 239 Аминокислотная последовательность константного участка LC 240 PA13R3-P4H10 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 241 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 242 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 243 Аминокислотная последовательность константного участка HC 244 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 245 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 246 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 247 Аминокислотная последовательность константного участка LC 248 PA15R3-P3A6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 249 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 250 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 251 Аминокислотная последовательность константного участка HC 252 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 253 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 254 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 255 Аминокислотная последовательность константного участка LC 256 PA15R3-P3A7(химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 257 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 258 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 259 Аминокислотная последовательность константного участка HC 260 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 261 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 262 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 263 Аминокислотная последовательность константного участка LC 264 PA15R3-P3C9 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 265 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 266 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 267 Аминокислотная последовательность константного участка HC 268 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 269 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 270 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 271 Аминокислотная последовательность константного участка LC 272 PA16R3-P2G6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 273 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 274 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 275 Аминокислотная последовательность константного участка HC 276 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 277 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 278 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 279 Аминокислотная последовательность константного участка LC 280 PA16R3-P1A6 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 281 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 282 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 283 Аминокислотная последовательность константного участка HC 284 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 285 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 286 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 287 Аминокислотная последовательность константного участка LC 288 PA16R3-P1B5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 289 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 290 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 291 Аминокислотная последовательность константного участка HC 292 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 293 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 294 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 295 Аминокислотная последовательность константного участка LC 296 PA16R3-P1E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 297 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 298 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 299 Аминокислотная последовательность константного участка HC 300 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 301 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 302 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 303 Аминокислотная последовательность константного участка LC 304 PA16R3-P1H5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 305 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 306 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 307 Аминокислотная последовательность константного участка HC 308 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 309 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 310 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 311 Аминокислотная последовательность константного участка LC 312 PA18R3-P1D8 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 313 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 314 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 315 Аминокислотная последовательность константного участка HC 316 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 317 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 318 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 319 Аминокислотная последовательность константного участка LC 320 PA18R3-P1E5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 321 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 322 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 323 Аминокислотная последовательность константного участка HC 324 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 325 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 326 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 327 Аминокислотная последовательность константного участка LC 328 PA18R3-P1H5 (химерная) Нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи (HC) 329 Аминокислотная последовательность вариабельного участка HC 330 Нуклеотидная последовательность константного участка HC 331 Аминокислотная последовательность константного участка HC 332 Нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи (LC) 333 Аминокислотная последовательность вариабельного участка LC 334 Нуклеотидная последовательность константного участка LC 335 Аминокислотная последовательность константного участка LC 336

Таблица 3. Последовательности типичных гуманизированных антител

Название/описание последовательности SEQ ID NO Последовательность Вариабельный участок легкой цепи гуманизированного P1C4 337 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIK Полноразмерная легкая цепь гуманизированного P1C4 338 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H0 339 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H2 340 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H4 341 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS Константный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4 342 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H0 гибрид IgG2-4 343 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H0 IgG2A330S/P331S 344 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H0 IgG4S228P 345 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H2 гибрид IgG2-4 346 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H2 IgG2A330S/P331S 347 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H2 IgG4S228P 348 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H4 гибрид IgG2-4 349 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK Гуманизированное P1C4 H4 IgG2A330S/P331S 350 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Гуманизированное P1C4 H4 IgG4S228P 351 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[0121] В некоторых вариантах осуществления предлагаемые в данном описании антитела против рецептора CB1 содержат описанные здесь последовательности или их консервативные варианты. В данном описании термин "консервативные варианты" включает в себя консервативные замены, вставки или делеции аминокислот. Специалистам в данной области известно, что консервативная аминокислотная замена представляет собой замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую подобными структурными или химическими свойствами, например, на аминокислоту, содержащую подобную боковую цепь; и что консервативные замены, вставки или делеции аминокислот приводят к получению последовательности, которая сохраняет билогическую активность исходной последовательности. Примеры консервативных замен описаны в данной области, например, в Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Bengamin/Cummings Publication Company, 4^th Ed. (1987).

III. Способы лечения CB1-ассоциированных расстройств

[0122] Описанные здесь антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить человеку в терапевтических целях. В некоторых вариантах осуществления способы лечения включают в себя введение индивидууму описанных здесь антител и их связывающих фрагментов или вариантов.

[0123] В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способы лечения заболеваний, направленные предпочтительно на периферические рецепторы CB1. "Периферические рецепторы CB1" в соответствии с данным описанием представляют собой рецепторы CB1, локализованные не в мозге, или не в центральной нервной системе (например, рецепторы CB1, находящиеся в пеферической системе). Тогда как термин "общие рецепторы CB1" относится к рецепторам CB1, находящимся в любом участке организма, в том числе, в мозге или в ЦНС.

[0124] В одном варианте осуществления выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для лечения разных заболеваний или расстройств, таких как, например, ожирение, диабет, дислипидемия, фиброз, неалкогольный стеатогепатит (NASH), заболевания печени, первичный билиарный цирроз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, боль, спастичность при рассеянном склерозе (MS), глаукома, воспалительные заболевания, нефропатии, остеопороз, метаболические расстройства, психиатрические расстройства, неврологические расстройства, нейродегенеративные расстройства, репродуктивные расстройства, заболевания почек, фиброз почек, хронические заболевания почек, атеросклероз, рак, заболевания кожи и др.

[0125] Показано, что сигнальный путь рецептора CB1 обуславливает вредную активность, например, при ожирении, диабете, фиброзе, болезнях печени, сердечно-сосудистых заболеваниях и раке (Kunos et al., 2009, Trends Pharmacol Sci 30:1-7). В одном аспекте описанные здесь антитела против CB1, или их фрагменты, используют для противодействия активности CB1. Соответственно, в другом аспекте изобретение предлагает способы лечения CB1-ассоциированных заболеваний или расстройств путем введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько из описанных здесь антител против CB1, или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антагонистические антитела против рецептора CB1 и их фрагменты обеспечивают благоприятный эффект при использовании с целью лечения или профилактики ожирения, диабета, фиброза, болезней печени, сердечно-сосудистых заболеваний, зависимостей, таких как никотиновая зависимость, или рака.

[0126] Неалкогольный стеатогепатит (NASH), также известный как неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD), характеризуется нарастанием жировой дегенерации печени, не связанной с избыточным потреблением алкоголя. NASH представляет собой болезнь печени, характеризующуюся воспалением печени и одновременным накоплением жира. NASH, который часто присутствует у людей, страдающих от диабета и ожирения, связан с метаболическим синдромом. NASH представляет собой прогрессирующую форму относительно доброкачественной неалкогольной жировой болезни печени, которая может медленно ухудшаться, вызывая нарастание фиброза в печени, который, в свою очередь, может привести к развитию цирроза (обзор см. в Smith, et al., 2011, Crit Rev Clin Lab Sci., 48(3):97-113). В настоящее время не существует конкретных способов лечения NASH.

[0127] В одном аспекте описанные здесь антитела против CB1 или их фрагменты используют для лечения, профилактики, диагностики или исследования фиброза. Некоторые исследования на мышиных моделях подтверждают участие рецептора CB1 в развитии фиброза, включающего в себя фиброз печени. (См., например, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192; Tam et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(8):2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19(6):900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68:89-97). Периферические CB1 участвуют в некоторых механизмах, вносящих вклад в развитие NASH и фиброза печени, в том числе стеатоза (жировое перерождение печени), воспаления и повреждения печени (обзор: Mallat et al., 2013, J Hepatology, 59(4):891-896). Показано, что CB1 подвергается повышащей регуляции в активированных звездчатых клетках печени человека (HSC), которые опосредуют фиброз путем трансформации в миофибробласты. (Teixeira-Clerc et al., 2006, Nature Med., 12(6):671-76). CB1 также участвует в диабетической нефропатии. Lin et al., 2014 J. Mol. Med. 92(7):779-92).

[0128] Исследования на мышах с гепатоцит-специфическим и общим нокаутом CB1 подразумевают важную роль CB1 в периферических клетках (гепатоцитах), связанных с некоторыми метаболическими заболеваниями и расстройствами. У мышиной модели индуцированного диетой ожирения как общий нокаут CB1 (CB1-/-), так и гепатоцит-специфический нокаут CB1 (LCB1-/-) приводят к уменьшению стеатоза (жирового перерождения печени) и усилению функции печени, демонстрируя участие CB1, присутствующего в периферических клетках (гепатоцитах), в развитии болезненных патологий, связанных с нелкогольным стеатогепатитом (NASH), диабетом и метаболическим синдромом. (Osei-Hyiaman et al., 2008, J. Clin. Invest., 118(9):3160-3169; Liu et al., 2012, Gastroenterology, 142:1218-1228). Селективный нокдаун CB1 с использованием миРНК (CB1R-GeRPs), обеспечивающей макрофаг-специфический нокдаун CB1, предотвращает прогрессирующую гипергликемию и снижение уровней инсулина и C-пептида в плазме диабетических тучных крыс Цукера (ZDF), которые представляют собой распространенную модель устойчивости к инсулину T2D, гипергликемии и недостаточности бета-клеток (Jourdan et al., 2013, Nature Med. 19(9):1132-1140). У мышиной модели индуцированного алкоголем стеатоза печени как общий нокаут CB1 (CB1-/-), так и гепатоцит-специфический нокаут CB1 (LCB1-/-) приводят к уменьшению стеатоза и усилению функции печени, демонстрируя участие CB1, присутствующего в периферических клетках (гепатоцитах), в развитии болезненной патологии, связанной со стеатозом. (Jeong, et al., 2008, Cell Metabolism, 7:227-235). Показано, что в линиях эпидидимальных белых жировых клеток, полученных от CB1-нокаутных мышей, накопление липидов ниже, чем в контрольных клетках дикого типа (Wagner et al., 2011, Nutrition and Diabetes, 1:e16).

[0129] Исследования, проводимые на разных мышиных моделях заболевания, демонстрируют, что низкомолекулярные антагонисты, действие которых ограничено периферическими рецепторами CB1, могут эффективно подавлять развитие фиброза печени. (См., например, Wei et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192; Tam et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(8):2953-66; Wan et al., 2014, Cell Metabolism, 19(6):900-1; Takano et al., 2014, Synapse, 68:89-97). Неограничивающие примеры известных антагонистов CB1 включают в себя римонабант, таранабант, VD60, антисмыловую последовательность CB1 Isis-414930, JD5037, AM6545 и ™38837. Показано, что такие антагонисты CB1, как римонабант, ингибируют пролиферацию клеток и уменьшают экспрессию профибротического гена в первичных звездчатых клетках печени человека (HSC), которые опосредуют фиброз путем трансформации в миофибробласты (Patsenker et al., 2011, Mol Med.,17(11-12):1285-1294). На мышиной модели CCl₄-индуцированного фиброза печени показано, что антагонист CB1 VD60 (3,4,22-3-деметоксикарбонил-3-гидроксилметил-4-дезацетилвиндолина 3,4-тионокарбонат) ингибирует экспрессию профибротического гена (альфа-коллагена) в активированных звездчатых клетках печени (линия HSC LX-2) и пролиферацию данных клеток, тогда как селективный агонист CB1 ACEA (N-(2-хлорэтил)-5Z,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраенамид) предотвращает данный эффект (Wei Y. et al., 2014, Exp. Biol. Med. 239(2):183-192). Показано, что антагонист CB1 JD5037 отменяет эндоканнабиноид-индуцированное ингибирование сигнального пути инсулина. (Cinar et al., 2014, Hepatology, 59(1)143-153). Блокада CB1 под действием римонабанта приводит к обратному развитию индуцированного воспалением нарушения поглощения глюкозы адипоцитами, выделенными из крыс, получавших рацион с высоким содержанием жиров (Miranville et al, 2010, Obesity 18: 2247-2254).

[0130] Исследования на людях также демонстрируют связь периферических рецепторов CB1 с появлением и развитием заболевания. Например, повышающая регуляция CB1 в печени пациентов с NASH и HCV коррелирует с тяжестью стеатоза и фиброза печени. (Auguet et al., 2014, BioMed Res. Intl. Vol. 2014, Article ID 502542). Кроме того, хронический агонизм CB1 (в результате употребления каннабиса) коррелирует с повышенной тяжестью стеатоза и фиброза печени у пациентов с HCV. (Van der Poorten et al., 2010, PlosOne 5, e12841). Кроме того, показано, что блокада CB1 у пациентов, страдающих от ожирения, уменьшает стеатоз печени. (Despres et al., 2009, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29:416-423).

[0131] Известно, что антагонисты CB1 оказывают разное влияние в зависимости от местонахождения рецептора. Например, можно сделать вывод, что эффекты антагонистов CB1 являются тканеспецифичными, поскольку наблюдающиеся у пациентов благоприятные кардиометаболические эффекты римонабанта не зависят от потери массы. (Pi-Sunyeret al, 2006, J Am Coll Cardio. 147: 362A). Кроме того, известно, что римонабант улучшает гликемический контроль у пациентов с диабетом типа 2 (см., например, Hollander et al., 2010, Diabetes Care. 33(3):605-7), однако данный эффект сопровождается значительными психиатрическими побочными эффектами, обусловленными рецепторами CB1, расположенными в ЦНС. (Kunos et al, 2009, Trends Pharmacol Sci 30:1-7; Moreira et al., 2009, Rev Bras Psiquiatr. 31(2):145-53; Pacher et al, 2013, FEBS J. 280(9): 1918-1943). Результаты исследования Rimonabant in Obesity-Lipids (RIO-Lipids) свидетельствуют о том, что антагонист рецептора CB1 римонабант улучшает профиль некоторых метаболических факторов риска (включающих в себя уровень адипонектина) у пациентов с избыточной массой. (См., например, Després et al., 2005, N Engl J Med, 353:2121-2134).

[0132] Показано, что сигнальный путь рецептора CB1 обуславливает благоприятную активность при боли, спастичности MS, глаукоме и других состояниях. (Pacher et al., 2013, FEBS J. 280(9):1918-1943). В некоторых вариантах осуществления описанные здесь агонистические антитела против рецептора CB1 и их фрагменты оказывают благоприятный эффект при применении для лечения или профилактики боли, спастичности MS и глаукомы. Показано, что агонисты CB1 активируют синтез жирных кислот в печени, глюконеогенез и другие метаболические пути. (См., например, Osei-Hyiaman et al, 2005, J. Clin. Invest., 115(5):1298-1305; Chanda et al., 2012, JBC, 287(45):38041-38049).

[0133] Спастичность при рассеянном склерозе (MS) включает в себя ощущение скованности и широкий диапазон непроизвольных мышечных спазмов (длительные мышечные сокращения или внезапные движения). Спастичность представляет собой один из распространенных симптомов MS, тяжесть которого может варьировать от небольшой скованности до болезненных, неконтролируемых судорог конечностей. В отсутствии лечения спастичность может приводить к серьезным осложнениям, включающим в себя контрактуры (сросшиеся или фиксированные суставы) и пролежни. Существующие в настоящее время средства для лечения спастичности MS включают в себя, в числе прочих, баклофен, тизанидин, диазепам, дантролен, фенол. Показано, что рецепторы CB1 участвуют в регуляции спастичности у мышиной модели MS. (Pryce et al., 2007, Br J Pharmacol. 150(4): 519-525).

[0134] Активация рецепторов CB1 вызывает обезболивающие эффекты при некоторых экспериментальных моделях боли, включающих в себя висцеральную боль, возникающую в желудочнокишечном тракте. Показано, что агонисты CB1, такие как WIN55,212-2 и SAB-378, ингибируют связанные с болью ответы на повторяющееся воздействие болевых раздражителей (Brusberg et al., 2009, J. Neuroscience, 29(5):1554-1564; Talwar et al., 2011, CNS Neurol Disord Drug Targets. 10(5):536-44).

[0135] Специалист в данной области может путем рутинного экспериментирования определить эффективное нетоксичное количество антитела (или другого терапевтического средства), необходимое для лечения CB1-ассоциированного заболевания или растройства. Например, терапевтически активное количество полипептида может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания (например, стадия I или стадия IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, иммуносупрессивные состояния или заболевания) и масса индивидуума, а также способность антитела вызывать желательный ответ у индивидуума. Дозировочный режим можно корректировать, чтобы достичь оптимального терапевтического ответа. Например, ежедневно вводимую дозу можно разделить на несколько приемов, или пропорционально уменьшить, в зависимости от терапевтической ситуации. Однако в большинстве случаев эффективная доза находится в диапазоне примерно от 0,05 до 100 миллиграмм на килограмм массы тела в день, в одном варианте осуществления примерно от 0,5 до 10 миллиграмм на килограмм массы тела в день.

[0136] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь антитела против CB1 и их фрагменты используют в способах сочетанной терапии, где человеческие антитела вводят индивидууму в сочетании с другим терапевтическим средством, например, с одним или несколькими другими антителами, которые связываются с другими мишенями (такими как антитела, которые связываются с другими цитокинами или с молекулами клеточной поверхности). Поскольку наличие альтернативных сигнальных путей может приводить к отсутствию ответа на одно антитело, изобретение предлагает разные стратегии сочетанной терапии, включающие в себя применение антител, связывающихся с разными эпитопами или с разными антигенами на одной клетке-мишени. Проведены доклинические испытания таких сочетаний, как антитело против CD20 и антитело против CD22 (Stein et al., Clin Cancer Res 2004, 10:2868-2878), антитело против CD20 и антитело против HLA-DR (Tobin et al., Leuk Lymphoma 2007, 48:944-956), антитело против CD20 и антитело против TRAIL-R1 (Maddipatla et al., Clin Cancer Res 2007, 13:4556-4564), антитело против IGF-1R и антитело против EGFR (Goetsche et al., Int J Cancer 2005, 113:316-328), антитело против IGF-1R и антитело против VEGF (Shang et al., Mol Cancer Ther 2008, 7:2599-2608), или трастузумаб и пертузумаб, направленные на разные участки человеческого EGFR2 (Nahta et al., Cancer Res 2004, 64:2343-2346), демонстрирующие повышенную или синергическую противоопухолевую активность in vitro и in vivo. Преимуществом таких сочетанных способов лечения является возможность введения более низких доз терапевтических средств, позволяющая избежать токсические эффекты или осложнения, которые могут возникать при использовании разных монотерапий.

[0137] Описанные здесь антитела и фрагменты можно вводить в сочетании с любым желательным терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления в сочетании с описанными здесь антителами и фрагментами можно вводить, например, антитело против LOXL2, антитело против TGFβ, нинтеданиб, ингибитор тирозинкиназы, агонист PPAR, агонист фарнезоидного X-рецептора (FXR), агонист рецептора глюкагоноподобного пептида 1, или ингибитор каспазы.

IV. Фармацевтические композиции

[0138] В другом аспекте изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие антитело против CB1, или его фрагмент.

[0139] Способы получения и введения индивидууму описанных здесь антител, или их фрагментов, хорошо известны специалистам в данной области, или могут быть легко определены специалистами в данной области. Способ введения описанных здесь антител, или их фрагментов, может представлять собой пероральное введение, парентеральное введение, введение путем ингаляции или местное введение. Термин парентеральное введение в соответствии с данным описанием включает в себя внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. В некоторых вариантах осуществления используют внутривенный, внутриартериальный, подкожный и внутримышечный способы парентерального введения. В то время, как однозначно подразумевается, что все указанные способы введения входят в объем настоящего изобретения, форма для введения может представлять собой раствор для инъекции, например, раствор для внутривенной или внутриартериальной инъекции, или раствор для капельного вливания. Как правило, подходящая для инъекции фармацевтическая композиция содержит буфер (такой как ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (такое как полисорбат), необязательно стабилизирующее средство (такое как человеческий альбумин), и др. Однако в других способах, подходящих для применения в настоящем изобретении, полипептиды можно доставлять непосредственно к участку аберрантной клеточной популяции, повышая уровень воздействия терапевтического средства на целевую ткань.

[0140] Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для введения органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и забеференные среды. Фармацевтически приемлемые носители, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя, без ограничения, 0,01-0,1M (например, 0,05M) фосфатный буфер, или 0,8% раствор хлорида натрия. Другие среды, обычно используемые для парентерального введения, включают в себя растворы фосфата натрия, растворы декстрозы в растворе Рингера, растворы декстрозы и хлорида натрия, Рингер-лактат или нелетучие масла. Среды для внутривенного введения включают в себя жидкие и питательные компенсаторные добавки, компенсаторы электролитов, например, на основе раствора Рингера-декстрозы, и т.п. В состав композиций также могут входить консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства, инертные газы и т.п. Более конкретно, фармацевтические композиции, подходящие для инъекций, включают в себя стерильные водные растворы (в случае водорастворимых средств) или дисперсии, а также стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций непосредственно перед введением. В таких случаях композиция должна быть стерильной и обладать достаточной текучестью, чтобы легко проходить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и, в одном варианте осуществления, она должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может представлять собой растворитель или среду для дисперсии, и может содержать, например, воду, этанол, полиол (такой как глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, частиц нужного размера в случае дисперсии и поверхностно-активных веществ. Действие микроорганизмов можно предотвратить путем применения разных противобактериальных и противогрибковых средств, таких как парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и т.п. В некоторых вариантах осуществления в состав композиции вводят изотонические средства, такие как сахара, полиспирты, например, маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированную абсорбцию инъекционных композиций можно достичь путем включения в состав композиции средства, замедляющего абсорбцию, такого как моностеарат алюмия и желатин.

[0141] В любом случае стерильные растворы для инъекций можно получить путем введения активного соединения (например, антитела, отдельно или в сочетании с другими активными средствами) в нужном количестве в подходящий растворитель, при необходимости вместе с одним или несколькими из перечисленных здесь ингредиентов, с последующей стерилизацией фильтрованием. Дисперсии обычно получают путем введения активного соединения в стерильную среду, которая содержит диспергирующую основу и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. Стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов можно получить путем вакуумной сушки и лиофилизации, причем полученный порошок может содержать активный ингредиент и дополнительный желательный ингредиент, присутствующий в полученном ранее стерилизованном фильтрацией растворе. Препараты для инъекций обрабатывают и помещают в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или флаконы, и герметично закрывают в асептических условиях с помощью известных в данной области методов. Кроме того, препараты можно упаковывать и продавать в виде наборов, таких как описанные в одновременно рассматриваемых патентах США № 09/259337 и № 09/259338, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки. Такие изделия промышленного производства в одном варианте осуществления содержат этикетки или вкладыши в упаковку, указывающие, что предлагаемые композиции можно использовать для лечения индивидуума, страдающего от аутоиммунного или неопластического расстройства, или предрасположенного к такому расстройству.

[0142] Дозы описанных здесь стабилизированных антител, или их фрагментов, эффективные для лечения вышеуказанных состояний, варьируют в зависимости от многих разных факторов, включающих в себя способ введения, участок-мишень, физиологическое состояние пациента, независимо от того, является ли пациент человеком или животным, применение других лекарственных средств, а также от того, с какой целью, профилактической или терапевтической, проводится лечение. Как правило, пациент представляет собой человека, однако с помощью указанных способов также можно лечить и отличных от человека млекопитающих, в том числе, трансгенных млекопитающих. Используемые для лечения дозы можно титровать с помощью рутинных методов, известных специалистам в данной области, с целью оптимизации безопасности и эффективности.

[0143] Используемая для пассивной иммунизации доза описанного здесь антитела может варьировать, например, примерно от 0,0001 до 100 мг/кг, более предпочтительно от 0,01 до 5 мг/кг (например, она может составлять 0,02 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг и т.д.) массы тела хозяина. Например, доза может составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела, или она может находиться в диапазоне 1-10 мг/кг, или в конкретных вариантах осуществления она может составлять, по меньшей мере, 1 мг/кг. Дозы, соответствующие промежуточным значениям указанных здесь диапазонов, также входят в объем настоящего описания.

[0144] Такие дозы можно вводить индивидуумам ежедневно, через день, еженедельно или по любой другой схеме, установленной на основании анализа опытных данных. Один из примеров схемы лечения включает в себя введение нескольких доз в течение длительного периода, например, в течение, по меньшей мере, шести месяцев. Другие примеры схемы лечения включают в себя введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. Примеры режимов дозирования включают в себя введение 1-10 мг/кг или 15 мг/кг каждый день, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах одновременно вводят два или более моноклональных антител, обладающих разной специфичностью связывания, причем доза каждого вводимого антитела может находиться в одном из указанных диапазонов.

[0145] Описанные здесь антитела или их фрагменты можно вводить многократно. Интервалы между введением отдельных доз могут составлять, например, один день, неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть неодинаковыми и могут определяться результатами измерения уровня полипептида или молекулы-мишени в крови пациента. В некоторых способах дозу корректируют, чтобы достичь определенной концентрации антитела или токсина в плазме, такой как 1-1000 мкг/мл или 25-300 мкг/мл. Альтернативно антитела или их фрагменты можно вводить в составе композиции, обеспечивающей замедленное высвобождение, при этом введение можно осуществлять с меньшей частотой. Доза и частота введения варьируют в зависимости от периода полужизни антитела в организме пациента. Как правило, наиболее продолжительным периодом полужизни обладают гуманизированные антитела, после них следуют химерные антитела и нечеловеческие антитела. В одном варианте осуществления описанные здесь антитела или их фрагменты можно вводить в неконъюгированном виде. В другом варианте осуществления описанные здесь антитела можно вводить несколько раз в конъюгированном виде. В следующем варианте осуществления описанные здесь антитела, или их фрагменты можно вводить в неконъюгированном виде, затем в конъюгированном виде, или наоборот.

[0146] Доза и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении композиции, содержащие антитела настоящего изобретения или их смеси, вводят пациенту, еще не находящемуся в болезненном состоянии, чтобы повысить устойчивость пациента. Используемое для этого количество определяют как "профилактически эффективная доза". При таком применении точное количество, опять же, зависит от состояния здоровья пациента и его иммунной системы в целом, однако обычно оно варьирует от 0,1 до 25 мг на дозу, предпочтительно от 0,5 до 2,5 мг на дозу. Относительно низкие дозы вводят с относительно маленькими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение в течение всей оставшейся жизни.

[0147] При терапевтическом применении иногда требуется введение относительно высоких доз (например, содержащих примерно от 1 до 400 мг антитела/кг, причем в случае радиоиммуноконъюгатов дозы обычно составляют от 5 до 25 мг, а в случае молекул, конъюгированных с цитотоксином-лекарственным средством, используют более высокие дозы) с относительно короткими интервалами до уменьшения или прекращения развития заболевания, или, в конкретных вариантах осуществления, до частичного или полного улучшения симптомов заболевания у пациента. Затем лекарственное средство можно вводить пациенту в профилактическом режиме.

[0148] В одном варианте осуществления для лечения индивидуума можно использовать молекулу нуклеиновой кислоты (например, в составе вектора), кодирующую описанный здесь полипептид. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, варьируют примерно от 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг, или они находятся в диапазоне 30-300 мкг на пациента. В случае инфекционных вирусных векторов можно использовать дозы, соответствующие содержанию 10-100 или более вирионов в одной дозе.

[0149] Терапевтические средства можно доставлять путем парентерального, местного, внутривенного, перорального, подкожного, внутриартериального, внутричерепного, внутрибрюшинного, интраназального или внутримышечного введения с профилактическими или терапевтическими целями. Для введения описанного здесь антитела можно использовать внутримышечную инъекцию или внутривенную инфузию. В некоторых способах терапевтические антитела или их фрагменты вводят непосредственно в черепную коробку. В некоторых способах антитела или их фрагменты вводят в составе композиций или устройств, обеспечивающих замедленное высвобождение, таких как устройство Medipad™.

[0150] Описанные здесь средства необязательно вводят в сочетании с другими средствами, которые могут обеспечить эффективное лечение расстройства или состояния, требующего такого лечения (например, профилактического или терапевтического). В качестве других средств можно использовать средства, известные в данной области и традиционно используемые для лечения конкретного расстройства.

[0151] Хотя в клинических экспериментах чаще всего используют 131I и 90Y, в данной области известны и другие радиоактивные метки, которые можно использовать в подобных целях. Другие радиоизотопы также используют для визуализации. Например, другие радиоизотопы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают в себя, без ограничения, 123I, 125I, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211A, 213Bi. В настоящем изобретении можно использовать альфа-, гамма- и бета-излучатели. Кроме того, с учетом настоящего описания специалист в данной области может легко определить, без излишнего экспериментирования, какие радионуклиды можно использовать в выбранной схеме лечения. В данной связи другие радионуклиды, уже используемые для клинической диагностики, включают в себя 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, а также 111In. Для потенциального применения в направленной иммунотерапии антитела можно метить разными радионуклидами (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111, 1987). Такие радионуклиды включают в себя 188Re и 186Re, а также, в меньшей степени, 199Au и 67Cu. В патенте США № 5460785, который включен в настоящееописание в качестве ссылки, можно найти дополнительную информацию, касающуюся таких радиоизотопов.

[0152] Как указано выше, описанные здесь антитела, или их фрагменты, можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения заболеваний млекопитающих in vivo. В данной связи следует понимать, что описанные антитела, или их фрагменты вводят в состав композиций, облегчающих введение и обеспечивающих стабильность активного средства. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат фармацевтически приемлемые, нетоксичные, стерильные носители, такие как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. В целях настоящего изобретения фармацевтически эффективное количество описанного здесь антитела, конъюгированного или не конъюгированного с терапевтическим средством, представляет собой количество, достаточное для обеспечения эффективного связывания с мишенью, а также для достижения улучшения, например, уменьшения симптомов заболевания или расстройства, или для детекции вещества или клетки. В случае опухолевых клеток полипептид в некоторых вариантах осуществления может взаимодействовать с выбранными иммунореактивными антигенами, присутствующими на неопластических или иммунореактивных клетках, и обеспечивать повышенную гибель данных клеток. Разумеется, описанные здесь фармацевтические композиции можно вводить в виде одной или нескольких доз, с достижением фармацевтически эффективного количества полипептида.

[0153] В соответствии с объемом настоящего изобретения описанные здесь антитела можно вводить человеку или другому животному с помощью указанных выше способов лечения в количестве, достаточном для достижения терапевтического или профилактического эффекта. Описанные здесь полипептиды можно вводить человеку или другому животному в виде традиционной лекарственной формы, полученной путем объединения описанного здесь антитела с традиционным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем с помощью известных методов. Специалистам в данной области известно, что тип и свойства фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя зависят от количества активного ингредиента, с которым его объединяют, способа введения и других хорошо известных факторов. Специалистам в данной области также следует понимать, что смесь, содержащая один или несколько полипептидов настоящего изобретения, может оказаться особенно эффективной.

[0154] Изобретение также предлагает способ лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией CB1, или повышенной чувствительностью к CB1, включающий в себя пероральное, парентеральное с использованием раствора для инъекции, ингаляционное, или местное введение пациенту или другому индивидууму фармацевтически эффективного количества антитела против CB1.

[0155] Кроме того, изобретение предлагает способ применения фармацевтически эффективного количества антитела против CB1 в производстве лекарственного средства для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией CB1, или повышенной чувствительностью к CB1, включающий в себя пероральное, парентеральное с использованием раствора для инъекции, ингаляционное, или местное введение пациенту или другому индивидууму.

[0156] В некоторых вариантах осуществления описанные здесь выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты обладают преимуществом, заключающимся в минимальном проникновении в мозг. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела и их фрагменты обладают высокой селективностью в отношении рецептора CB1 и не проникают через гематоэнцефалитический барьер, или обладают пониженной способностью проникать через гематоэнцефалитический барьер по сравнению с низкомолекулярными соединениями, специфичными к рецептору CB1, что приводит к минимизации побочных эффектов, связанных с ЦНС. В других вариантах осуществления выделенные антитела и их фрагменты после внутривенной инъекции не проникают через гематоэнцефалитический барьер, или обладают пониженной способностью проникать через гематоэнцефалитический барьер по сравнению с низкомолекулярными соединениями, специфичными к рецептору CB1, такими как римонабант.

[0157] В одном варианте осуществления описанные здесь антитела и их связывающие фрагменты или варианты можно вводить индивидууму с помощью по меньшей мере одного способа, выбранного из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсульного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутритолстокишечного, внутрицервикального, внутрижелудочкового, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатного, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, внутрисиновиального, внутригрудного, интратимпанального, внутриматочного, интравезикального, интравитреального, болюсного, подконъюнктивального, вагинального, ректального, буккального, подъязычного, интраназального и трансдермального введения.

[0158] Настоящее изобртеение предлагает выделенные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела или фрагменты, а также композиции, содержащие указанные выделенные антитела, фрагменты и нуклеиновые кислоты. Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие выделенные антитела, или их фрагменты, или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела или фрагменты, а также один или несколько из фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители включают в себя, например, вспомогательные вещества, разбавители, капсулирующие вещества, наполнители, буферы и другие средства.

описание конкертных аспектов и вариантов осуществления

[0159] Разные описанные здесь аспекты и варианты их осуществления можно объединять друг с другом. Кроме того, любой из описанных выше аспектов и вариантов их осуществления можно объединить с любым из описанных ниже конкретных аспектов и вариантов их осуществления.

[0160] Ниже приведены некоторые конкретные аспекты и варианты осуществления, которые служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения:

[0161] 1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 1 мкМ или менее.

[0162] 2. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 100 нМ или менее.

[0163] 3. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 10 нМ или менее.

[0164] 4. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 1 нМ или менее.

[0165] 5. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент связывается с внеклеточным эпитопом на рецепторе CB1.

[0166] 6. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент связывается с человеческим рецептором CB1.

[0167] 7. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент ингибирует сигнальную активность рецептора CB1.

[0168] 8. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнального пути рецептора CB1, которая по величине, по меньшей мере, эквивалентна активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0169] 9. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнального пути рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 3 раза превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0170] 10. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнального пути рецептора CB1, которая по величине, по меньшей мере, эквивалентна активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию фосфорилирования ERK, опосредованного агонистом рецептора CB1.

[0171] 11. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 7, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении сигнального пути рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 3 раза превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию фосфорилирования ERK, опосредованного агонистом рецептора CB1.

[0172] 12. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент активирует рецептор CB1, или повышает активность рецептора CB1.

[0173] 13. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент представляет собой аллостерический модулятор рецептора CB1.

[0174] 14. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент представляет собой обратный агонист рецептора CB1.

[0175] 15. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент является мышиным.

[0176] 16. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент является химерным.

[0177] 17. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент является гуманизированным.

[0178] 18. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент селективно связывается с CB1.

[0179] 19. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело конъюгировано со средством, таким как другое терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекула иммуноадгезии или визуализирующее средство.

[0180] 20. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 19, где средство представляет собой другое терапевтическое средство, цитотоксическое средство, молекулу иммуноадгезии или визуализирующее средство.

[0181] 21. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 20, где терапевтическое средство представляет собой римонабант.

[0182] 22. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 20, где визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0183] 23. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 18, где антитело не обладает агонистической или антагонистической активностью.

[0184] 24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные конкурировать за связывание с рецептором CB1 с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0185] 25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться по существу с тем же эпитопом на рецепторе CB1, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1.

[0186] 26. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит: вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 10, 18 и 26; и вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 14, 22 и 30.

[0187] 27. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или фрагмент содержит константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 12, 20 и 28, и, константный участок легкой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 16, 24 и 32.

[0188] 28. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; вариабельной участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

[0189] 29. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; вариабельной участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

[0190] 30. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; вариабельной участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

[0191] 31. Выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; константный участок тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; вариабельной участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и константный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.

[0192] 32. Способ противодействия CB1, включающий в себя приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с антителом или связывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0193] 33. Способ усиления активности CB1, включающий в себя приведение клетки, экспрессирующей рецептор CB1, в контакт с антителом или связывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0194] 34. Способ лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическую или агонистическую активность в отношении рецептора CB1, у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает в себя введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по варианту осуществления 1.

[0195] 35. Способ по варианту осуществления 34, где индивидуум представляет собой человека.

[0196] 36. Способ детекции CB1, включающий в себя приведение клетки в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0197] 37. Способ по варианту осуществления 34, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, неалкогольного стеатогепатита (NASH), заболевания печени, первичного билиарного цирроза печени, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака и воспалительного заболевания.

[0198] 38. Способ по варианту осуществления 34, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из боли, спастичности при рассеянном склерозе и глаукомы.

[0199] 39. Способ по варианту осуществления 37, где заболевание или расстройство представляет собой фиброз.

[0200] 40. Способ по варианту осуществления 37, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент противодействует CB1.

[0201] 41. Способ по варианту осуществления 38, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент способствует проявлению активности CB1.

[0202] 42. Способ диагностики заболевания или расстройства, связанного с CB1, включающий в себя приведение клетки в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом по варианту осуществления 1.

[0203] 43. Способ определения прогноза для индивидуума, у которого диагностировано заболевание или расстройство, связанное с CB1, включающий в себя измерение экспрессии CB1 путем приведения клетки в контакт с антителом или его фрагментом по варианту осуществления 1.

[0204] 44. Способ по варианту осуществления 42-43, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, NASH, заболевания печени, первичного билиарного цирроза, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака, воспалительного заболевания, боли, спастичности при MS и глазных заболеваний, включающих в себя глаукому.

[0205] 45. Способ по варианту осуществления 44, где заболевание или расстройство представляет собой фиброз.

[0206] 46. Способ по варианту осуществления 36, где выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, конъюгированы с визуализирующим средством.

[0207] 47. Способ по варианту осуществления 46, где визуализирующее средство выбрано из группы, состоящей из радиоактивной метки, фермента, флуоресцентной метки, люминесцентной метки, биолюминесцентной метки, магнитной метки и биотина.

[0208] 48. Способ по варианту осуществления 42-43, где клетка присутствует в организме индивидуума.

[0209] 49. Способ по варианту осуществления 48, где индивидуум представляет собой человека.

[0210] 50. Клетка-хозяин, экспрессирующая выделенное антитело или фрагмент по варианту осуществления 1.

[0211] 51. Способ получения антитела или его фрагмента, способного специфически связываться с рецептором CB1, где указанный способ включает в себя иммунизацию млекопитающих очищенным рецептором CB1 или его антигенным фрагментом, CB1/липидными комплексами, и/или ДНК, кодирующей рецептор CB1.

[0212] 52. Способ по варианту осуществления 51, где антитело или его фрагмент получают из гибридомной клеточной линии, полученной с использованием клеток иммунизированных млекопитающих.

[0213] 53. Способ по варианту осуществления 51, где антитело или его фрагмент получают из фаговой библиотеки.

[0214] 54. Способ получения антитела или его фрагмента, способного специфически связываться с CB1, где указанный способ включает в себя получение фаговой библиотеки, содержащей вариабельные участки тяжелых и легких цепей из человеческих первичных лимфоцитов крови, и пэннинг фаговой библиотеки по связыванию с рецептором CB1.

[0215] 55. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 352, 353 и 354, соответственно.

[0216] 56. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 355, 356 и 357, соответственно.

[0217] 57. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, имеющие последовательности, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, или, по меньшей мере, на 99% гомологичные аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 352, 353 и 354, соответственно.

[0218] 58. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, имеющие последовательности, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, по меньшей мере, на 96%, по меньшей мере, на 97%, по меньшей мере, на 98%, или, по меньшей мере, на 99% гомологичные аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 355, 356 и 357, соответственно.

[0219] 59. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с тем же эпитопом, что и антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из перечисленных или раскрытых здесь вариантов осуществления.

[0220] 60. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: CDR1 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 443-463; CDR2 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 464-577, и CDR3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 578-625.

[0221] 61. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: CDR1 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 626-661; CDR2 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 662-742, и CDR3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 742-824.

[0222] 62. Выделенное антитело или его фрагмент по варианту осуществления 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело.

[0223] 63. Раскрытое в данном документе выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участок Fc человеческого IgG1.

[0224] 64. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих вариантов осуществления, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит модифицированный участок Fc.

[0225] 65. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 64, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участок Fc, выбранный из группы, состоящей из Fc-участка гибрида IgG2/IgG4, Fc-участка IgG2, содержащего мутации A330S и P331S, и Fc-участка IgG4, содержащего мутацию S228P.

[0226] 66. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с каннабиоидным рецептором 1 (CB1), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 339-341, и, необязательно, вариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 337.

[0227] 67. Выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 64, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 342.

[0228] 68. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 66, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 343-351, и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 338.

[0229] 69. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 341 и константный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 или SEQ ID NO: 435.

[0230] 70. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 340 и константный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434 или SEQ ID NO: 435.

[0231] 71. Выделенное антитело или его фрагмент, нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 85%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95%, или, по меньшей мере, на 99% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-351 и SEQ ID NO 436-824.

[0232] 72. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 100 нМ или менее.

[0233] 73. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 72, где антитело или фрагмент обладает сродством к рецептору CB1, характеризующимся Kd примерно 5 нМ или менее.

[0234] 74. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 10 раз превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0235] 75. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 5 раз превышает активность низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0236] 76. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 74, где антитело или фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая по величине, по меньшей мере, эквивалентна активности низкомолекулярного римонабанта, где величину активности измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0237] 77. Выделенное гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться с CB1, где антитело или его фрагмент обладает более высокой активностью, чем соответствующее негуманизированное или химерное антитело, причем гуманизированное антитело, или его фрагмент, и соответствующее негуманизированное или химерное антитело содержат одинаковые CDR тяжелой и легкой цепи, где активность измеряют по ингибированию передачи сигнала, опосредованной агонистом рецептора CB1, с помощью анализа цАМФ.

[0238] 78. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 77, где гуманизированное антитело или его фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 2 раза превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0239] 79. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 78, где гуманизированное антитело или его фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 3 раза превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0240] 80. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 77, где гуманизированное антитело или его фрагмент обладает ингибирующей активностью в отношении рецептора CB1, которая, по меньшей мере, в 5 раз превышает активность соответствующего негуманизированного или химерного антитела или фрагмента.

[0241] 81. Раскрытое в данном описании выделенное гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где способность антитела или фрагмента проникать в мозг снижена или отсутствует.

[0242] 82. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 81, где способность антитела или фрагмента проникать в мозг снижена по сравнению с низкомолекулярным агонистом или антагонистом рецептора CB1.

[0243] 83. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 81, где антитело или фрагмент обладает пониженными побочными эффектами, связанными с центральной нервной системой (ЦНС), по сравнению с низкомолекулярным агонистом или антагонистом рецептора CB1.

[0244] 84. Выделенное гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по варианту осуществления 83, где низкомолекулярный агонист или антагонист рецептора CB1 представляет собой AM6545, AM251, таранабант или римонабант.

[0245] 85. Способ лечения заболевания или расстройства, отвечающего на антагонистическую или агонистическую активность в отношении рецептора CB1, у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает в себя введение индивидууму антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из вариантов осуществления 55-84.

[0246] 86. Способ по варианту осуществления 85, где индивидуум представляет собой человека.

[0247] 87. Способ по варианту осуществления 85, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из ожирения, диабета, дислипидемии, метаболических заболеваний, фиброза, NASH, заболевания печени, первичного билиарного цирроза, заболевания почек, фиброза почек, хронического заболевания почек, остеопороза, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания, рака, воспалительного заболевания, боли, спастичности при MS и глазных заболеваний, включающих в себя глаукому.

[0248] 88. Способ по варианту осуществления 85, где способность антитела или антигенсвязывающего фрагмента проникать в мозг снижена или отсутствует.

[0249] Хотя выше изобретение описано с приведением некоторых подробностей в качестве иилюстраций и примеров для облегчения понимания, для рядового специалиста в данной области должно быть очевидно в свете разъяснений, приведенных в настоящем изобретении, что можно осуществить некоторые изменения и модификации, не отступая от сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Нижеследующие примеры приведены только для иллюстрации, но не для ограничения. Специалистам в данной области хорошо известны разные некритические параметры, которые можно изменить или модифицировать с получением практически таких же результатов.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Иммунизация мышей с целью получения антител против рецептора CB1

[0250] Последовательность кДНК и праймеры для клонирования человеческого рецептора CB1 получают на основе стандартной последовательности NM_001160258 из электронного архива по биологии и медицине NCBI. Рецептор CB1 получают путем временной экспрессии, осуществляемой в клетках 293 с использованием липофектамина, или путем получения стабильных клеточных линий. Для получения стабильной клеточной линии конструкцию нативного полноразмерного человеческого рецептора CB1 pcDNA4/TO трансфицируют в тетрациклин-индуцируемую систему Trex-CHO и клетки Trex-293. Клетки культивируют в присутствии антибиотиков зеоцина и бластицидина. Клоны, экспрессирующие CB1 после индукции тетрациклином, идентифицируют путем FACS-окрашивания антителом против рецептора CB1, R&D (клон 368302). Получают мембраны, которые используют для иммунизации либо непосредственно, либо после солюбилизации мембранных белков в детергенте с последующей очисткой. Очищенный рецептор CB1 стабилизируют в липидном бислое. CB1/липидный комплекс обозначают как iCAPS рецептора CB1.

[0251] Мышей Balb/c иммунизируют в течение 2 циклов ДНК, кодирующей рецептор CB1, с последующими иммунизациями мембранами, содержащими рецептор CB1, или iCAPS, содержащими рецептор CB1. Образцы крови берут до и после иммунизации, сыворотку тестируют методом ELISA на связывание с мембранами, содержащими рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами. Когда мышиная сыворотка дает положительный сигнал на мембранах, содержащих рецептор CB1, по сравнению с наивными мембранами, мышей умерщвляют, селезенки удаляют и используют для получения гибридом и фаговых библиотек.

Пример 2. Извлечение лимфоцитов, выделение B-клеток, гибридизация и выбор гибридом, связывающихся с рецептором CB1

[0252] Из иммунизированных мышей удаляют селезенки и получают суспензии отдельных клеток. Чтобы получить суспензии отдельных клеток, селезенки переносят на сито, помещенное сверху конической центрифужной пробирки объемом 50 мл, и с помощью поршня от шприца на 3 мл выдавливают клетки из селезенки. Красные кровяные клетки лизируют охлажденным на льду буфером ACK в течение 10 мин, добавляют 5 мл DMEM и проводят центрифугирование. Данную стадию повторяют один раз, после чего клетки ресуспендируют в среде DMEM с получением концентрации 2×10⁷/мл.

[0253] Извлечение и получение клеток миеломы: клетки SP2/0 высевают при плотности примерно 5×10⁴ клеток/мл и пересаживают каждые 2 дня. Перед гибридизацией исходные клетки миеломы собирают путем центрифугирования в конической центрифужной пробирке объемом 50 мл при комнатной температуре (RT) при 500 g в течение 10 минут. Клетки промывают 3 раза путем добавления 30 мл среды, не содержащей сыворотку, и повторяют центрифугирование. Супернатант удаляют пипеткой, клеточный осадок ресуспендируют в 25 мл среды и доводят до концентрации жизнеспособных клеток 2×10⁷/мл.

[0254] Слияние клеток: Клетки миеломы и клетки селезенки смешивают в соотношении 1:5. Смесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, после чего супернатант отбрасывают, получая клеточный осадок. Смесь клеток дважды промывают рабочим буфером для гибридизации и центрифугируют с получением клеточного осадка. Клеточный осадок осторожно ресуспендируют в буфере для гибридизации до конечной концентрации клеток 8×10⁷/мл. Смеси клеток помещают в ячейку с электродами и проводят электрослияние. После слияния клетки оставляют в покое в течение 5 мин, промывают 1× средой DMEM, к гибридизованным клеткам добавляют нагретую среду HAT до конечной концентрации 0,5×10⁶ B-клеток/мл. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета добавляют 100 мкл клеточной суспензии (5×10⁴ B-клеток). Средняя эффективность слияния составляет 1 гибридома/1×10⁴ B-клеток, следовательно, в соответствии с данной методикой, в каждой лунке содержится 5 гибридом.

[0255] Культивирование гибридомных клеток. Гибридомы культивируют в инкубаторе для культивирования клеток при 5% CO₂, 37°C. Рост гибридом проверяют ежедневно. Обычно колонии можно увидеть через 5 дней. Среду заменяют на свежую DMEM на 7 день перед положительным скринингом.

[0256] Положительный скрининг: через 7-9 дней после слияния клеток, когда колонии увеличиваются, 100 мкл супернатанта из каждой гибридома-содержащей лунки переносят в отдельную лунку нового 96-луночного планшета и анализируют методом ELISA с использованием белка CB1.

Пример 3. Получение и скрининг фаговых библиотек

[0257] Экстракция общей РНК: Ткань селезенки собирают в RNAlater. Маленький кусочек замороженной ткани (~30 мг) гомогенизируют в ступке, охлажденной в жидком N₂, и перемалывают до состояния мелкого порошка. Добавляют реагент TRIzol®, энергично встряхивая вручную в течение 30 секунд. 1 мл раствора переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл при комнатной температуре 2-3 мин и оставляют стоять при комнатной температуре в течение нескольких минут. К смеси добавляют 0,2 мл хлороформа на 1 мл раствора и энергично встряхивают вручную в течение 30 секунд. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и затем центрифугируют при 12000 g в течение 20 мин при 4°C. Водную фазу удаляют и переносят в новую пробирку. В пробирку добавляют равный объем изопропилового спирта и перемешивают в течение 30 секунд. После инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин смесь центрифугируют при 12000 g в течение 15 мин при 4°C. Осадок промывают путем добавления 500 мкл 75% этанола и центрифугируют при 12000 g в течение 15 мин при 4°C. Полученный осадок общей РНК сушат на воздухе и растворяют в 50 мкл не содержащей РНКазы воде на 1 мкг предполагаемой РНК. OD измеряют при 260 нм и 280 нм в образце РНК, разведенном в соотношении 1:10.

[0258] Получение кДНК: Синтез первой цепи кДНК проводят с помощью коммерческого набора (Invitrogen, № по каталогу: 18080-051), коротко говоря, 20 мкг общей РНК смешивают с 5 мкМ oligo(dT)20 и 1 мМ dNTP в DEPC-обработанной воде объемом 40 мкл, инкубируют при 65°C в течение 5 мин и затем добавляют 80 мкл буфера при КТ, содержащего 5 мМ MgCl₂, 10 мкМ DTT, 16 единиц RNaseOUT и 80 единиц обратной транскриптазы Superscript III. Полученную смесь инкубируют при 50°C в течение 50 мин, инактивируют нагреванием, после чего добавляют 4 мкл РНКазы H, чтобы удалит остаток РНК. кДНК используют для последующего конструирования библиотеки.

[0259] Библиотеку химерных Fab конструируют следующим образом: Вариабельные участки тяжелой цепи или легкой цепи амплифицируют с использованием праймеров, специфичных для тяжелой цепи или легкой цепи, представляющих несколько зародышевых семейств, описанных в Barbas et al, и полученной выше мышиной кДНК в качестве матрицы. Константные участки человеческой тяжелой цепи и легкой цепи, Ch1 и CL1, соответственно, амплифицируют из существующего клона pCOM3xTT. Вариабельный участок и константный участок тяжелой цепи соединяют, используя ПЦР с перекрывающимися праймерами. Полученные тяжелую цепь и легкую цепь соединяют, снова используя ПЦР с перекрывающимися праймерами, и получают ДНК-фрагмент химерного Fab, который клонируют в модифицированном векторе pCOM3x в виде фрагмента SfiI, вставленного путем лигирования. Библиотеку лигированной ДНК очищают и используют для трансформации высокоэффективных компетентных клеток SS320. Общее число полученных уникальных трансформантов составляет, по меньшей мере, 5×10⁷.

[0260] Проводят пэннинг путем двойного вычитания фаговой библиотеки, полученной из иммунизированных мышей, в иммунопробирках Maxisorp (Thermo Scientific), покрытых пустыми iCAPS, с последующим двойным вычитанием на Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Life Technologies), покрытых биотинилированным белком Bril. Все стадии вычитания длятся 30 минут. В это время iCAPS, содержащие биотинилированный рецептор CB1, наносят на Dynabeads MyOne Strepavidin T1 (Life Technologies). Затем полученный после вычитания фаговый пул и CB1-содержащие iCAPS на гранулах смешивают, наряду с небиотинилированным белком Bril и пустыми iCAPS для конкуренции, и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре при вращении. Гранулы отделяют от связывающей смеси с помощью магнита и промывают несколько раз, чтобы удалить несвязанные фаги (5 раз в цикле 1, 10 в каждом из циклов 2 и 3). Связанные фаги элюируют дважды глициновым буфером, pH 2,2, каждый раз по 10 минут. Элюаты объединяют, нейтрализуют Tris-HCl, pH 8,0, и используют для инфицирования клеток TG1 с получением фага, который подвергают следующему циклу пэннинга. После 3 циклов пэннинга отбирают отдельные колонии и подвергают их скринингу методом ELISA для моноклональных фагов.

[0261] Для скрининга средств, связывающих фаги, отдельные колонии TG1, инфицированных фагами, отобранными в результате пэннинга, помещают в 96-луночные планшеты, содержащие среду 2YT/карбенициллин/глюкоза, и встряхивают в течение ночи при 30°C. На следующий день небольшой объем насыщенной культуры переносят на свежую среду 2YT/карбенициллин/глюкоза и встряхивают при 37°C до достижения значения OD₆₀₀ 0,6-0,7. Затем культуру инфицируют херперным фагом KO7. Инфицированные клетки TG1 центрифугируют, ресуспендируют в среде 2YT/карбенициллин/канамицин и встряхивают при 30°C в течение ночи. В это время 96-луночные планшеты Maxisorp (Thermo Scientific) покрывают стрептавидином (Wako) при 4°C в течение ночи. На третий день биотинилированные антигены улавливают на планшетах, покрытых стрептавидином, которые затем блокируют 3% обезжиренным молоком в PBST. Клетки TG1 снова центрифугируют. Фаг-содержащие супернатанты блокируют 3% обезжиренным молоком, затем загружают на планшеты ELISA и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. После трех циклов промывания PBST в планшеты добавляют HRP-меченое мышиное антитело против M13 (GE Healthcare), разведенное 1:2000 3% обезжиренным молоком в PBST и инкубируют еще час при комнатной температуре. Планшеты промывают три раза PBST и затем проявляют ™B (Biopanda). Реакцию останавливают путем добавления в планшеты HCl. Поглощение при 450 нм прочитывают на ридере для микропланшет Emax precision (Molecular Devices). Клоны, специфически связывающиеся с iCAPS, отбирают и подвергают дальнейшей характеризации и секвенированию.

[0262] Выделяют колонии E. coli, несущие плазмиды, которые продуцируют Fab, презентированные на фаге. Плазмидную ДНК экстрагируют и секвенируют, получая информацию по ДНК, кодирующей Fab. Конструируют специфические праймеры, чтобы амплифицировать V-участок тяжелой цепи, продукт ПЦР клонируют в pTT5-HCV3, модифицированной версии вектора экспрессии pTT5, ранее обработанной ферментами рестрикции ApaI и SacI, перед константным участком человеческой тяжелой цепи, путем непрерывного клонирования. Кроме того, конструируют специфические праймеры, чтобы амплифицировать поноразмерный участок легкой цепи фрагмента Fab. Фрагмент, полученный методом ПЦР, клонируют в pTT5-IL2-LCC, модифицированном векторе pTT5, обработанном EcoRI и NotI, путем непрерывного клонирования. Последовательности 2 полученных плазмид подтверждают секвенированием.

Пример 4. Секвенирование гибридом

[0263] Клетки гибридомы (1×10⁷) собирают и экстрагируют общую РНК с помощью реагента Tri по способу, описанному выше для ткани селезенки. кДНК получают с помощью набора SuperScript III в соответствии с инструкцией производителя, как описано выше. Проводят ПЦР с использованием полученной кДНК в качестве матрицы и праймеров VhRevU и VhForU, получая продукт ПЦР размером 300 п.о., который очищают с помощью набора для очистки продуктов ПЦР и секвенируют, используя такие же праймеры. Также проводят реакцию ПЦР, используя праймеры VkRev7 и VkFor, специфичные для V-участка легкой цепи (только для вариабельного участка), или праймеры KappaFor (специфичные для полноразмерной легкой цепи каппа). Очищенный продукт ПЦР подвергают реакциям секвенирования, получая последовательность ДНК.

Пример 5. Экспрессия и анализ IgG

[0264] Экспрессия IgG: Две плазмиды, полученные на основе pTT5, одна из которых содержит ДНК тяжелой цепи, а другая - ДНК легкой цепи, совместно трансфицируют в клетки HEK293F, чтобы обеспечить экспрессию IgG. За 24 часа до трансфекции клетки 293F разбавляют до плотности 8×10⁵ клеток/мл. В день трансфекции плотность клеток поддерживают на уровне 1,1-1,3×10⁶ клеток/мл. Для трансфекции используют один мкг плазмидной дНК на 1 мл суспензионной культуры клеток. 80 мкг ДНК разводят в 4 мл свежей среды 293F freestyle. 240 мкг реагента для трансфекции полиэтиленимина (PEI) разводят в конечном объеме 4 мл среды 293F freestyle. После инкубации в течение 3 минут 4 мл ДНК тщательно смешивают с 4 мл PEI. 8 мл смеси ДНК и PEI инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре и медленно добавляют к 80 мл суспензионной культуры клеток 293F. Клетки инкубируют на платформе с орбитальным вращением со скоростью 130 об/мин при 37°C и 5% CO₂ в течение 4 дней, после чего собирают.

[0265] Очистка IgG: Слой, содержащий белок A, объемом 0,4 мл помещают в колонку объемом 1 мл и промывают 10 мл dH₂O и 10 мл PBS, pH 8,0. Суспензии трансфицированных клеток 293F центрифугируют при 4000 об/мин в течение 45 минут при 4°C. Осадки отбрасывают, супернатант доводят до pH 8,0 на льду и загружают на приготовленную колонку с белком A. После окончания загрузки супернатанта колонку промывают 5 мл PBS, pH 8,0, и элюируют 4 мл 0,1 M буфера цитрат Na-HCl, pH 3,5. Элюированные образцы, содержащие IgG, нейтрализуют 200 мкл 1,5M буфера Tris-HCl, pH 8,8, и концентрируют с использованием концентратора 4 мл, 30 кДа. 4,5 мл PBS помещают в концентратор и центрифугируют. В конечном счете, после замены среды IgG хранят в PBS. IgG детектируют по OD₂₈₀ и определяют их чистоту методами SDS-PAGE и SEC.

[0266] Значения концентраций, объемов и выходов PA13R3-P1C4, полученные в четырех разных экспериментах, показаны в таблице 4. Значения концентраций, объемов и количеств разных клонов показаны ниже в таблице 5.

Таблица 4. Экспрессия PA13R3-P1C4

Название Концентрация (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) Выход (мг/л) PA13R3-P1C4 0,3 200 60 0,75 PA13R3-P1C4 1,01 500 505 3,2 PA13R3-P1C4 0,49 500 245 1,5 PA13R3-P1C4 1,25 1250 1562,5 3,9

Таблица 5. Экспрессия клонов

Клон Концентрация (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) PA13R3-P1C4 (функциональный) 0,3 200 60 PA2LR3-P2D3 0,31 250 77,5 0,18 200 36 PA2LR3-P1G6 1,99 350 696,5 PA2LR3-P3B10 0,23 600 138 0,64 200 128 PA2R3-P1A7 1,93 400 772 3,1 300 930 0,06 250 15 1,07 1200 1284 PA2LR3-P1H4 1,94 300 582 PA2LR3-P4B1 1,62 250 405 0,98 200 196 PA2LR3-P4B5 0,8 200 160 0,85 450 382,5 0,61 200 122 1,68 600 1008 PA2LR3-P4G10 1,32 250 330 PA2LR3-P4C6 1,63 250 407,5 0,56 250 140 PA2LR3-P3B8 4,13 250 1032,5 PA2LR3-P2B8 1,01 550 555,5 1,78 500 890 1,1 500 550 3,3 900 2970 PA2LR3-P2E5 0,47 550 258,5 PA2R3-P1F1 0,8 500 400 PA2LR3-P3A8 1,65 200 330 PA2LR3-P3F8 1,97 150 295,5 PA2LR3-P5E7 0,74 250 185 PA2LR3-P6B12 2,45 200 490 PA2LR3-P6G7 0,92 200 184

Пример 6. Анализ связывания IgG с CB1-содержащими iCAPS методом ELISA

[0267] Очищенные IgG тестируют на связывание с очищенным рецептором CB1 (CB1-содержащая конформационная антиген-презентирующая система (iCAPS)) методом ELISA. Небиотинилированные антигены (например, пустые iCAPS) наносят непосредственно на планшеты Maxisorp. Первичные антитела, представляющие собой серийные разведения очищенных IgG 1:3, инкубируют на планшете в течение 1 часа. После 3 циклов промывания PBST, в качестве вторичных антител добавляют HRP-меченные козлиные антитела против мышиных IgG (Abmart) или HRP-меченные козлиные антитела против человеческих IgG (Sigma), в зависимости от вида IgG, и инкубируют еще час. Планшеты промывают три раза PBST и затем проявляют ™B (Biopanda). Реакцию останавливают путем добавления HCl. Поглощение при 450 нм прочитывают на ридере для микропланшетов Emax precision (Molecular Devices). Результаты анализа связывания приведены в таблице 6.

Таблица 6. Связывание с CB1-содержащими iCAPS

Клон EC50 A139 (нМ) EC50 A138 (нМ) PA2LR3-P1G6 35 81 PA2LR3-P1H4 33,52 21,04 PA2LR3-P2B8 1,8 6,7 PA2LR3-P2D3 2,6 4,9 PA2LR3-P2E5 3,2 10 PA2LR3-P3B10 0,78 1,4 PA2LR3-P3B8 71 PA2LR3-P4B1 1,406 1,277 PA2LR3-P4B5 0,24 0,24 PA2LR3-P4C6 0,4 0,4 PA2LR3-P4G10 1,354 1,189 PA2R3-P1A7 3,5 7,5 PA2R3-P1F1 1,1 1,3 PA13R3-P1C4 0,175 0,1719

Пример 7. Анализ связывания IgG методом FACS

[0268] Исходные клетки TRex CHO, TRex CHO A56, экспрессирующие CB1 (CB1 T210A/партнер по гибридизации) на повышенном уровне, и TRex CHO A156, экспрессирующие нативный человеческий CB1, собирают из колб. 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1×10⁶ клеток/мл, инкубируют с первичными антителами IgG. В качестве вторичных антител используют PE-конъюгированные антитела против человеческих IgG и против мышиных IgG, разведенные 1:200. FITC-меченные антитела против человеческого Fab разводят 1:32. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS, переносят в пробирки BD Falcon объемом 5 мл и анализируют методом проточной цитометрии. Связывание очищенных IgG изначально тестируют при концентрациях 30 нМ и 300 нМ. Идентифицируют ряд связывающих соединений, показанных на фигурах 1A-1F.

[0269] Проводят дополнительный анализ исходных клеток TRex CHO, клеток TRex CHO A56, экспрессирующих CB1 на повышенном уровне, и клеток TRex CHO A156, экспрессирующих нативный человеческий CB1, в котором используют 5HT2B, мышиный CB1 и человеческий CB2, чтобы определить специфичность связывания IgG. 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1×10⁶ клеток/мл, инкубируют с первичными антителами IgG в 3-кратных серийных разведениях, начиная от 1 мкМ до 0,5 нМ в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS, затем инкубируют со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. После двух промываний 200 мкл буфера FACS клетки переносят в пробирки BD Falcon объемом 5 мл и анализируют методом FACS.

[0270] Кроличье моноклональное антитело против CB1 Santa Cruz и FITC-конъюгированное вторичное антитело против кроличьих IgG используют для детекции экспрессии мышиного CB1. Мышиные моноклональные антитела против CB2 R&D и человеческий IgG P2C2 используют для подтверждения экспрессии CB2 и 5HT2B соответственно. В качестве вторичных антител используют антитела против мышиных IgG и антитела против человеческих IgG, конъюгированные с PE.

[0271] Чтобы выбрать связывающие соединения, строят полные кривые связывания для рецептора CB1 на основе тестирования в диапазоне концентраций. Готовят трехкратные серийные разведения от 1 мкМ до 0,1 мкМ. Селективность определяют путем измерения связывания с клетками, экспрессирующими 5HT2B или CB2, по сравнению с клетками A156 (экспрессирующими нативный человеческий рецептор CB1) или A56 (экспрессирующими рецептор CB1 на повышенном уровне и содержащими модификацию T210A и замену ICL3 на партнера по гибридизации), используя метод проточной цитометрии. Как показано на фигуре 2C и фигуре 2D, экспрессию CB2 и 5HT2B подтвержают с использованием мышиных моноклональных антител против CB2 и P2C2 против человеческих IgG, соответственно. Для детекции CB2 и 5HT2B используют PE-конъюгированные антитела против мышиных IgG (дя детекции антител против CB2) и PE-конъюгированные антитела против человеческих IgG, соответственно. Антитела PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 селективно связываются с CB1, как показано на фигуре 2A и фигуре 2B. Кроме того, в таблице 7 приведены концентрации и константы диссоциации (Kd) для каждой из нескольких партий PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2.

[0272] Результаты исследования демонстрируют, что IgG и Fab PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 связываются как с A56, так и с A156, но не связываются с исходной линией TRex CHO и не обладают перекрестной активностью в отношении 5ht2b, человеческого CB2 или мышиного CB1.

Таблица 7. Результаты анализа разных партий антител методом проточной цитометрии

IgG Концентрация Клеточная линия Kd PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A156 40,54 нМ PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A156 171 нМ PA13R3-P1C4 0,49 мг/мл A156 187 нМ PA13R3-P1C4 1,25 мг/мл A156 72,6 нМ 36E12B2E5 4 мг/мл A156 37,4 нМ 36E12B2H8 7,05 мг/мл A156 25,89 нМ 36E12B6C2 4,85 мг/мл A156 63,95 нМ 36E12B6F2 5,57 мг/мл A156 61,87 нМ 36E12B6C2 5,78 мг/мл A156 151,1 нМ 36E12B6C2 5,9 мг/мл A156 25,97 нМ 36E12B6C2 5,28 мг/мл A156 27,66 нМ PA13R3-P1C4 1,01 мг/мл A56 27,3 нМ PA13R3-P1C4 1,25 мг/мл A56 50,59 нМ 36E12B2E5 4 мг/мл A56 30,95 нМ 36E12B2H8 7,05 мг/мл A56 20,34 нМ 36E12B6C2 4,85 мг/мл A56 29,32 нМ 36E12B6F2 5,57 мг/мл A56 23,91 нМ 36E12B6C2 5,78 мг/мл A56 69,42 нМ 36E12B6C2 5,9 мг/мл A56 60,24 нМ 36E12B6C2 5,28 мг/мл A56 51,94 нМ

Пример 8. Конкурентный анализ

[0273] Чтобы определить, связываются ли 36E12B6C2 и P1C4 с подобными эпитопами, используют клетки TRex CHO A156, экспрессирующие нативный человеческий CB1. Для окрашивания используют концентрации P1C4 и 36E12B6C2, соответствующие EC80 и EC50. Для анализа конкуренции используют избыток IgG, Fab PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2. 100 мкл суспензии клеток A156 с плотностью 1×10⁶ клеток/мл инкубируют с конкурирующими IgG в течение 30 минут на льду, после чего к смеси добавляют окрашивающие IgG и инкубируют еще 30 минут на льду. Дважды промывают 200 мкл буфера FACS и затем клетки инкубируют со вторичным антителом в течение 30 минут на льду. PE-конъюгированные антитела против человеческих IgG и против мышиных IgG разводят 1:200. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS, переносят в пробирки BD Falcon объемом 5 мл и анализируют методом FACS.

[0274] Результаты иследования демонстрируют, что Fab и IgG PA13R3-P1C4 конкурируют с 36E12B6C2 за связывание с CB1, позволяя предположить, что PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2 связываются с перекрывающимися эпитопами (фигуры 3A и B). Соединение 36E12B6C2, используемое в концентрациях от 100 нМ до 500 нМ, также способно конкурировать с PA13R3-P1C4 за связывание с CB1.

Пример 9. Функциональный анализ цАМФ

[0275] Чтобы измерить антагонистическую активность антител, проводят функциональный анализ цАМФ. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят на белом 384-луночном низкообъемном планшете (Greiner). В каждую лунку планшета высевают 8000 клеток TRex CHO, стабильно экспрессирующих CB1, после чего проводят инкубацию с антагонистом в разных концентрациях (варьирующих от 10 мкМ до 0 мкМ) при комнатной температуре в течение 10 мин. Для стимуляции смеси к клеткам добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и 9 мкМ каннабиноид CP55940 (Sigma Aldrich), после чего инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы активировать CB1. После инкубации в течение 30 мин добавляют 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism.

[0276] Как показано на фигуре 4, два антитела, 36E12B2H8 (полученное с использованием гибридом) и PA13R3-P1C4 (полученное с использованием фагов) обладают антагонистической активностью, равной (36E12B2H8) или превышающей (PA13R3-PIC4) активность низкомолекулярных соединений, используемых в качестве положительных контролей (таких как обратные агонисты рецептора CB1 SR141716A (римонабант) и AM251 и нейтральный антагонист AM6545), со значениями IC50 350±28 нМ и 90±13 нМ, соответственно.

Пример 10: Анализ активации ERK

[0277] Чтобы подтвердить антагонистическую активность mAb, определяют активацию ERK как часть сигнального пути рецептора CB1. За два дня до эксперимента клетки Trex-CHO, экспрессирующие рецептор CB1, высевают в 6-луночные планшеты при плотности 500000 клеток/лунку. Через 24 часа добавляют 1 мкг/мл тетрациклина, чтобы индуцировать экспрессию рецептора CB1. В течение, по меньшей мере, двух часов перед началом эксперимента клетки держат на бессывороточной среде. К культуральной среде добавляют IgG в концентрации 300 нМ и через 30 минут клетки стимулируют агонистом рецептора CB1 WIN55,212 (100 нМ) в течение 10 и 15 минут. Собирают клеточные лизаты и определяют уровень активации ERK методом вестерн-блоттинга. Антитела против ERK и против фосфо-ERK получают от Cell Signaling Inc.

[0278] Обработка агонистом рецептора CB1 WIN55,212 индуцирует активацию ERK, что подтверждает увеличение сигнала фосфорилированной ERK. Общую ERK используют в качестве контроля загрузки в методе вестерн-блоттинга, чтобы подтвердить равную загрузку образцов. Как показано на фигуре 5A, полученное с использованием фагов антитело PA13R3-P1C4 (300 нМ), но не контрольный IgG (неспецифическое связывающее соединение) или PA13R3-P1E4, блокирует индуцированное WIN55,212 (100 нМ) фосфорилирование ERK. Как показано на фигуре 5B, полученные с использованием гибридом антитела 36E12B2E5, 36E12B6C2 и 36E12B6F2, но не контрольный IgG, блокируют WIN55,212-индуцированное фосфорилирование ERK. AM6545 (нейтральный антагонист) используют в качестве положительного контроля, как показано на фигурах 5A и 5B.

Пример 11. Функциональные анализы цАМФ

[0279] Функциональный анализ агонистической активности путем измерения цАМФ проводят на белом 384-луночном низкообъемном планшете (Greiner). В каждую лунку планшета высевают 8000 клеток TRex CHO, стабильно экспрессирующих CB1, после чего проводят инкубацию с агонистом в разных концентрациях (варьирующих от 1,5 мкМ до 0 мкМ) при комнатной температуре в течение 10 мин. Для тестирования агонистической активности (фигуры 6A и 6B) к смеси, стимулирующей клетки, добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Чтобы определить активность положительного аллостерического модулятора (фигуры 6C и 6D), к смеси, стимулирующей клетки, добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и 1 мкМ CP55940, после чего смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.

[0280] После инкубации в течение 30 мин добавляют 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism.

[0281] Результаты скрининга на агонистическую активность путем измерения цАМФ позволяют идентифицировать четыре потенциальных агонистических IgG, включающих в себя PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1, PA2LR3-P6G7 и PA2LR3-P6B12. В частности, PA2LR3-P2D3, PA2LR3-P4B1 и PA2LR3-P6G7 характеризуются EC50 >300 нМ, как показано на фигурах 6A и 6B. Кроме того, PA2LR3-P6B12 является потенциальным аллостерическим модулятором с EC50 примерно 1000 нМ в присутствии CP55940, как показано на фигуре 6C. Положительные и отрицательные контроли показаны на фигурах 6B и 6D.

[0282] Анализ цАМФ также проводят для дополнительной характеризации PA13R3-P1C4 и 36E12B6C2. Функциональный анализ с измерением цАМФ (Cisbio) проводят на белом 384-луночном низкообъемном планшете (Greiner). В каждую лунку планшета высевают 8000 клеток TRex CHO, стабильно экспрессирующих CB1, после чего проводят инкубацию с антагонистами, включающими в себя AM6545, SR141716A, PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2, в концентрациях, варьирующих от 3 мкМ до 0 мкМ в течение 10 минут при комнатной температуре. После инкубации в течение 10 минут к смеси, стимулирующей клетки, добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Чтобы количественно определить продукцию цАМФ, добавляют 5 мкл цАМФ-d2 и 5 мкл анти-цАМФ-криптата для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism. Результаты исследования показаны на фигуре 7. AM6545 и SR141716A были ранее охарактеризованы как нейтральный антагонист и обратный агонист, соответственно. Результаты функциональных анализов с измерением цАМФ свидетельствуют о том, что характер ингибирования PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2 подобен характеру ингибирования SR141716A, позволяя предположить, что PA12R3-P1C4 и 36E12B6C2 являются обратными агонистами.

Пример 12. Анализ связывания iCAPS методом ELISA

[0283] Анализ связывания методом ELISA проводят, чтобы оценить связывание IgG или Fab антитела против рецептора CB1 с iCAPS, экспрессирующими CB1 (A138, содержащие замену нативной последовательности ICL3 на белковую последовательность 1, и A139, содержащие замену нативной последовательности ICL3 на BRIL), iCAPS, экспрессирующими 5HT2B (h13h), пустыми iCAPS, или rBril-0918. IgG и Fab включают в себя IgG 36E12B6C2, Fab 36E12B6C2, IgG PA13R3-P1C4 и Fab PA13R3-P1C4, которые тестируют по сравнению с используемым в качестве отрицательного контроля BRIL-связывающим IgG P1F7 и Fab P1F7. В случае IgG антитела, вторичное антитело, используемое для детекции связывающих соединений, представляет собой конъюгат антитело против мышиного IgG-HRP; в случае Fab вторичное антитело, используемое для детекции связывающих соединений, представляет собой конъюгат антитело против человеческого IgG-HRP. Результаты исследования приведены на фигурах 8A и 8B, а также в приведенной ниже таблице 8. В случае соединений, связывающих и iCAPS A138, и iCAPS A139, Fab 36E12B6C2 характеризуется более высокими значениями EC50, чем IgG 36E12B6C2. С другой стороны, IgG и Fab PA13R3-P1C4 имеют примерно одинаковые значения EC50 для связывания с A139 и A138. Ни одно из антител или Fab против CB1 не связывается с rBril-0918, пустыми iCAPs, или iCAPS, экспрессирующими 5HT2B. Контрольное mAb P1F7 распознает BRIL и, следовательно, может связываться с A139, содержащим гибрид BRIL в ICL3, но не с A138, не содержащим BRIL.

Таблица 8. Значения EC50, определенные методом ELISA для IgG и Fab 36E12B6C2 и PA13R3-P1C4

EC50 A139 A138 Fab 36E12B6C2 0,8054 1,017 IgG 36E12B6C2 0,19 0,2011 Fab PA13R3-P1C4 0,27 0,23 IgG PA13R3-P1C4 0,17 0,17

Пример 13. Исследование интернализации рецептора CB1

[0284] Влияние антитела против CB1 на WIN55,212 (CB1-специфичный агонист)-индуцированную интернализацию CB1 анализируют методом проточной цитометрии. Клетки TRex-CHO, стабильно экспрессирующие CB1, высевают в 6-луночный планшет с плотностью 5×10⁵ клеток/лунку. В культуральную среду добавляют тетрациклин (1 мкг/мл) и инкубируют в течение 24 часов, чтобы индуцировать экспрессию CB1. В день эксперимента клетки держат в бессывороточной среде в течение 2 часов. Затем клетки предварительно инкубируют с антителом против CB1 (300 нМ), AM6545 (нейтральный антагонист CB1) и отрицательным контролем (соединение, связывающее BRIL) в течение получаса. Затем в культуральную среду добавляют агонист CB1 (1 мкМ WIN55,212) и инкубируют 1 час, чтобы индуцировать интернализацию рецептора. Экспрессированный на поверхности CB1 окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-концевого участка CB1, полученным от R&D, и методом проточной цитометрии определяют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Результаты исследования приведены на фигуре 9A. После обработки агонистом CB1 WIN55,212 значение MFI уменьшается по сравнению с контролем, что позволяет предположить наличие интернализации CB1 (фигура 9A, верхний ряд гистограмм). Предварительная обработка CB1-специфичным нейтральным антагонистом AM6545 блокирует WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора CB1 (фигура 9A, верхний ряд гистограмм). Предварительная обработка антителами против CB1 (300 нМ) не влияет на WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора (фигура 9A, средний и нижний ряды гистограмм).

[0285] Также исследуют влияние антитела против CB1 на интернализацию рецептора. После культивирования в бессывороточной среде в течение 2 часов к культуральной среде добавляют 300 nM антитела против CB1, отрицательный контроль P2A12 (соединение, связывающее BRIL), агонист CB1 WIN55,212 и инкубируют в течение 1 часа. Клетки собирают и окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-концевого участка CB1 (R&D). Результаты исследования приведены на фигуре 9B. Опять же, WIN55212 индуцирует интернализацию рецептора CB1, которая блокируется предварительной обработкой нейтральным антагонистом CB1 AM6545 (фигура 9B, верхний ряд гистограмм). Антитела против CB1 не влияют на поверхностную экспрессию CB1, позволяя предположить, что антитела против CB1 не индуцируют интернализацию рецептра (фигура 9B, средний и нижний ряды гистограмм).

Пример 14. Специфическая активность гуманизированных антител против CB1

[0286] Получают гуманизированные антитела P1C4 и тестируют их на активность, специфичность и сродство. Для получения гуманизированных антител P1C4 выбирают человеческие каркасные участки на основе гомологии P1C4 и генов человеческих зародышевых VH и VK. Каркасные участки, обладающие наивысшей степенью гомологии в отношении участков VH и VK P1C4, подвергают отбору на основе компьютерного моделирования по способности поддерживать структуру CDR, предположительно присутствующую в P1C4.

Получают следующие гуманизированные антитела: (1) P1C4-H0-IgG; (2) P1C4-H2(YE)- IgG (содержащее мутации G27Y и T28E в вариабельном участке тяжелой цепи); и (3) P1C4-H4(YENG)- IgG (содержащее мутации G27Y, T28E, A60N и Q61G в вариабельном участке тяжелой цепи)

[0287] Активность химерного антитела PA13R3-P1C4 и гуманизированного антитела PA13R3-P1C4 определяют путем анализа цАМФ. Функциональный анализ с измерением цАМФ (Cisbio) проводят на белых 384-луночных низкообъемных планшетах (Greiner). В каждую лунку планшета высевают клетки TRex-CHO, стабильно экспрессирующие нативный человеческий CB1, с плотностью 8000 клеток/лунку и затем проводят инкубацию с римонабантом (SR141716A), химерным PA12R3-P1C4, PA12R3-P1C4 H0 (без обратной мутации), PA12R3-P1C4 H2 (YE), PA12R3-P1C4 H4 (YENG) и P2A12 (отрицательный контроль) в концентрациях, варьирующих от 1 мкМ до 0 мкМ, в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут к стимулирующей смеси добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Чтобы количественно определить продукцию цАМФ, добавляют 5 мкл цАМФ-d2 и 5 мкл анти-цАМФ-криптата и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism.

[0288] Результаты исследования приведены на фигуре 10 и ниже в таблице 9. Функциональный анализ с измерением цАМФ показывает, что гуманизированные P1C4-H2 и P1C4-H4 имеют IC50 21 нМ и 17 нМ, соответственно. Таким образом, среди тестируемых антител гуманизированные антитела H1C4-H2 и P1C4-H4 обладают даже большей активностью, измеряемой по ингибированию цАМФ, чем соответствующее химерное антитело.

Таблица 9. IC50 химерных и гуманизированных антител против CB1

PA13R3-P1C4
химерное P1C4-H0
Число мутаций P1C4-H2
(YE) P1C4-H4
(YENG) Римонабант IC50 (нМ) 93 146 21 17 415

[0289] Сродство связывания, перекрестную реакционноспособность и специфичность гуманизированных антител P1C4 определяют методом проточной цитометрии с использованием исходных клеток TRex CHO, клеток TRex CHO A56, экспрессирующих CB1 на повышенном уровне (T210A/партнер по гибридизации), клеток TRex CHO A156, экспрессирующих нативный человеческий CB1, исходных клеток Trex (не экспрессирующих CB1), мышиных клеток, экспрессирующих CB1, и клеток, стабильно экспрессирующих человеческий CB2. 100 мкл суспензии, содержащей 1×10⁶ клеток/мл, инкубируют с химерным PA13R3-P1C4, гуманизированными P1C4-H0 (не содержит мутации), P1C4-H2 (YE), P1C4-H4 (YENG) или P2A12 (контрольный) IgG в 3-кратных серийных разведениях от 300 нМ до 0,5 нМ в течение 30 минут на льду. Затем клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и инкубируют с PE-конъюгированным вторичным антителом против человеческих IgG (Southern Biotech) в течение 30 минут на льду. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS, переносят в пробирки BD Falcon объемом 5 мл и анализируют методом проточной цитометрии (BD FACScalibur).

Таблица 10. Сродство связывания и перекрестная реакционноспособность гуманизированных антител P1C4

Kd (нМ) TRexCHO A56
CB1 T210A/партнер по гибридизации TRexCHO A156, нативный человеческий CB1 TRexCHO, исходные TRexCHO, мышиный CB1 TRexCHO, человеческий CB2 PA13R3-P1C4, химерное 10,5 25 Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания P1C4-H0, не содержащее мутации 4,5 25 Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания P1C4-H2 (YE) 4,2 9,4 Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания P1C4-H4 (YENG) 4,0 9,6 Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания P2A12
(контроль) Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания Отсутствие связывания

[0290] Результаты исследования показаны на фигуре 11 и в приведенной выше таблице 10. Гуманизированные антитела против CB1 связываются с клетками A56 и с клетками A156. Оба гуманизированные антитела P1C4-H2 и PIC4-H4 связываются с клетками TRex CHO A56, экспрессирующими CB1 на повышенном уровне, а также с клетками A156, экспрессирующими нативный человеческий CB1, с более высоким сродством, чем химерное антитело P1C4 (фигура 11A). Кроме того, ни одно из тестируемых антител не обладает перекрестной реакционноспособностью в отношении мышиного CB1 или человеческого CB2 (фигура 11B).

Пример 15. Пониженные эффекторные функции антител против CB1

[0291] Конструируют и тестируют антагонистические антитела против CB1, обладающие пониженными эффекторными функциями. Получают антагонистические антитела против CB1, содержащие одну или несколько из перечисленных ниже модификаций Fc: (1) константный участок IgG4, содержащий замену серина на пролин в положении 228 (S228P); (2) константный участок IgG2, содержащий замену аланина на серин в положении 330 (A330S) и замену пролина на серин в положении 331 (P331S); и (3) гибридный константный участок IgG2/IgG4.

[0292] Последовательности полученных гуманизированных антител против CB1, содержащих 0, 2 или 4 обратные мутации в каркасных участках, описаны в SEQ ID NO: 343-351. Антитела тестируют на связывание с рецепторами Fcγ и компонентом комплемента C1q методом ELISA. Полученные антитела против CB1 также тестируют на способность активировать первичные человеческие иммунные клетки in vitro. А именно, антитела против CB1, содержащие одну или несколько модификаций Fc, тестируют на способность активировать иммунные клетки, например, путем определения их способности образовывать поперечные связи или индуцировать экспрессию маркеров активации. Результаты исследования демонстрируют, что антагонистические антитела против CB1 обладают более низкой способностью связывать FcγR и/и C1q, и/или индуцировать активацию иммунных клеток, чем соответствующее антагонистическое антитело против CB1, не содержащее модификации константного участка.

Пример 16. Исследование биораспределения

[0293] В данном исследовании определяют биораспределение антитела против CB1 P4B5 у мышей in vivo. Антитело P4B5 метят Vivotag 680 XL (Perkin Elmer) и вводят бесшерстным мышам (n=4 на группу) в.в. в дозе 5 мг/кг или 25 мг/кг. Визуализацию всего организма с измерением флуоресценции в разных тканях проводят методом флуоресцентной томографии (FMT) в следующие моменты времени: 0 часов (0 ч), 1 ч, 5 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 144 ч. Как показано на фигуре 12, меченное P4B5 связывается с CB1 с таким же сродством, что и немеченное P4B5. EC50 немеченного P4B5 составляет 60,5 нМ, а EC50 антитела P4B5, меченного Vivotag 680 XL, составляет 57,8 нМ.

[0294] Результаты исследования приведены на фигурах 13A и 13B. Меченное антитело детектируют на протяжении определенного периода времени, как показано на фигурах 13A.1 и A.2, на которых приведены результаты, полученные от типичной мыши, получающей повышенную дозу антитела (25 мг/кг). Однако после вычитания фонового сигнала крови антитело против CB1 не детектируют в мозге (фигура 13B), делая вывод, что антитело не протикает через гематоэнцефалический барьер после в.в. инъекции.

Пример 17. Экспрессия и анализ IgG гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

[0295] Среди разных подклассов человеческих IgG Fc-участки подклассов IgG2 и IgG4 отличаются низким связыванием с эффекторными молекулами, такими как активирующие FcγR или компонент комплемента 1q (C1q), которое обуславлявает пониженную эффекторную активность. Чтобы минимизировать активацию иммунных эффекторных функций, гуманизированные антитела основных серий P1C4-H2 и P1C4-H4 клонируют в 3 вариантах человеческих каркасных участков, Fc IgG2, IgG4 и гибрида IgG2 и IgG4, с целью дополнительной характеризации.

[0296] Последовательности вариабельного участка тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H2 (SEQ ID NO: 340), вариабельного участка тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H4 (SEQ ID NO: 341) и легкой цепи гуманизированного P1C4 (SEQ ID NO: 338) приведены ниже в таблице 11. Жирным шрифтом выделены остатки, введенные в результате обратных мутаций, а подчеркиванием выделены участки CDR. Для получения вариантов Fc разных семейств IgG используют три последовательности константных участков тяжелой цепи. Последовательности константного участка тяжелой цепи IgG2 (SEQ ID NO: 433), константного участка тяжелой цепи IgG4 (SEQ ID NO: 434), гибридного константного участка тяжелой цепи IgG2/4 (SEQ ID NO: 435) показаны ниже в таблице 11.

Таблица 11. Конструкция вариантов Fc Название или описание последовательности антитела/фрагмента Последовательность SEQ ID NO: Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS 340 Вариабельный участок тяжелой цепи гуманизированного P1C4-H4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSS 341 Полноразмерная легкая цепь гуманизированного P1C4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 338 Константный участок тяжелой цепи IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 433 Константный участок тяжелой цепи IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 434 Гибридный константный участок тяжелой цепи IgG2/4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 435 P1C4-H2-IgG2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 436 P1C4-H2-IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 437 P1C4-H2-IgG2/4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 438 P1C4-H4-IgG2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 439 P1C4-H4-IgG4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 440 P1C4-H4-IgG2/4 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYEFSYYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIYPGDGETKYNGKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSHGNYLPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 441 Гуманизированное P1C4-Lc EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLHWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 442

[0297] Варианты антител экспрессируют в клетках 293FreeStyle, CHO-S и CHO-K1 с последующей очисткой в разных партиях и в разные моменты времени.

[0298] Для проведения экспрессии в 293 FreeStyle отдельные плазмиды pTT5, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей, совместно трансфицируют в клетки FreeStyle HEK293F, чтобы обеспечить экспрессию полноразмерного антитела IgG. Клетки культивируют при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в среде для экспрессии FreeStyle 293. За двадцать четыре часа до трансфекции клетки разбавляют до плотности 8×10⁵ клеток/мл. Чтобы получить раствор для трансфекции, 80 мкг ДНК (40 мкг ДНК, кодирующей легкую цепь,+40 мкг ДНК, кодирующей тяжелую цепь) и 240 мкг полиэтиленимина (PEI) разводят в 8 мл среды Freestyle 293F, тщательно перемешивают, фильтруют через фильтровальные насадки для шприца с размером пор 0,2 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубируют в течение 15 минут при 22°C. Восемь мл раствора для трансфекции медленно добавляют к 80 мл клеточной культуры 293F (разбавленной средой для экспрессии FreeStyle 293 до плотности 1,1-1,3×10⁶ клеток/мл) и инкубируют при 37°C в 5% CO₂ при вращении со скоростью 130 об/мин в течение 4 дней. Супернатанты трансфицированных клеточных культур собирают путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 45 минут при 4°C, доводят до pH 8,0 0,1 M NaOH и держат на льду до очистки белка.

[0299] Для проведения экспрессии в CHO-S отдельные плазмиды pTT5, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей, совместно трансфицируют в клетки CHO-S, чтобы обеспечить экспрессию полноразмерного антитела IgG. Клетки культивируют в среде CD-CHO при 37°C и 5% CO_2. За двадцать четыре часа до трансфекции клетки разбавляют до плотности 0,6-0,7×10⁶ клеток/мл в среде CD-CHO. В день трансфекции клетки разбавляют до плотности 1,1-1,3×10⁶ клеток/мл средой CD-CHO во встряхиваемых колбах объемом 250 мл. К каждой встряхиваемой колбе объемом 250 мл добавляют 80 мл клеток. Восемьдесят мкг плазмидной ДНК (40 мкг ДНК, кодирующей легкую цепь,+40 мкг ДНК, кодирующей тяжелую цепь) разводят в конечном объеме 4 мл среды CD-CHO и фильтруют через фильтровальные насадки для шприца с размером пор 0,2 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. В отдельной конической пробирке объемом 50 мл 80 мкл реагента FreeStyle Max разводят в конечном объеме 4 мл среды CD-CHO. 2 полученные смеси инкубируют при 22°C в течение 3 минут, после чего их объединяют, смешивают и инкубируют еще 15 минут при 22°C. 8 мл смеси ДНК/реагент для трансфекции медленно добавляют к 80 мл клеточной культуры в колбе объемом 250 мл. В результате достигается конечная плотность ~1,0×10⁶ клеток/мл. Затем культуральные колбы инкубируют на платформе с орбитальным вращением со скоростью 133 об/мин при 37°C и 5% CO₂ в течение 6 дней. Культуральные супернатанты собирают путем центрифугирования (Allegra X-15R, Beckman) при 4000 g в течение 40 минут при 4°C, доводят до pH 8,0 0,1 M NaOH и держат на льду до очистки белка.

[0300] Очистку IgG, полученных с использованием 293 FreeStyle и CHO-S, проводят следующим образом: супернатанты загружают на колонки с белком A (объем слоя 0,4 мл), предварительно уравновешенные PBS pH 7,4, и оставляют стекать под действием силы тяжести. Колонки промывают 5 мл PBS pH 7,4, после чего белок элюируют 4 мл буфера 0,1 M Na цитрат-HCl pH 3,5. Элюированное вещество нейтрализуют 200 мкл буфера 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, концентрируют и заменяют буфер на PBS, pH 7.4, с помощью концентратора Amicon, 30 кДа, 4 мл (Millipore), в соответствии с инструкциями производителя, с достижением конечного объема примерно 0,5-1 мл. Концентрацию белка определяют по поглощению при 280 нм, а чистоту определяют методами SDS-PAGE и SEC.

[0301] Экспрессию белка в CHO-K1 и последующую очистку проводят с помощью методов, запатентованных контрактной исследовательской организацией (CRO). Коротко говоря, для трансфекции используют клетки CHO-K1. IgG очищают с помощью гранул MabSelect™ SuRe™, стадии промывания проводят с использованием PBS в модификации Дульбекко (Lonza BE17-512Q). IgG элюируют 0,1 M глицином, pH 3,5.

[0302] Во всех тестах, анализах SDS-PAGE и SEC, проводимых с целью QC (контроля качества) белка, используют 3 мкг антитела. Критерии удовлетворяющие требованиям QC, включают в себя чистоту >90% по результатам SDS PAGE и мономерный пик >90% в методе SEC. Аликвоты очищенного белка IgG, прошедшего тесты QC, помещают в пробирки с завинчивающимися крышками в количестве 100 мкл/пробирку при концентрации ~5 мг/мл. Аликвоты быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -80°C.

Выход белка в клетках 293FreeStyle варьирует от низкого до 53 мг/л. Выход в клетках CHO-S является низким и составляет примерно 1 мг/л. Выход в клетках CHO-K1 варьирует от 198 мг/л до 350 мг/л. Результаты SDS-PAGE свидетельствуют о наличии интактного белка, элюирующегося в невосстанавливающих условииях как белок с массой примерно 150 кДа, и 2 полос, соответствующих тяжелой цепи и легкой цепи, при отсутствии видимой деградации или агрегации. В качестве примеров профили SEC и результаты SDS-PAGE для одной из партий 293 FreeStyle приведены на фигуре 14A, и для одной из партий CHO-K1 - на фигуре 14B. Результаты очистки белков, экспрессированных с использованием партий 293FreeStyle и CHO-S, приведены в таблице 12.

Таблица 12. Результаты очистки белка mAb PA13R3-P1C4

Образец Конц. белка (мг/мл) Объем (мкл) Количество (мкг) Объем культуры (мл) Выход (мг/л) Мономер по SEC (%) P1C4-H2-IgG2 2,10 11500 24150,00 600,00 40,25 >90 P1C4-H2-IgG2 2,94 500 1470,00 160,00 9,19 >90 P1C4-H2-IgG4 2,24 14400 32256,00 600,00 53,76 >90 P1C4-H2-IgG4 2,22 500 1110,00 160,00 6,94 >90 P1C4-H2-IgG4 (CHO-S) 0,28 250 69,00 80,00 0,86 >90 P1C4-H2-IgG2/4 2,18 12500 27250,00 600,00 45.42 >90 P1C4-H2-IgG2/4 1.01 600 606,00 160,00 3,79 >90 P1C4-H4-IgG2 2,23 7200 16056,00 600,00 26,76 >90 P1C4-H4-IgG2 3,43 750 2572,50 160,00 16,08 >90 P1C4-H4-IgG4 2,39 10700 25573,00 600,00 42,62 >90 P1C4-H4-IgG4 5,45 500 2725,00 160,00 17,03 >90 P1C4-H4-IgG4 (CHO-S) 0,28 250 68,75 80,00 0,86 >90 P1C4-H4-IgG2/4 2,02 9700 19594,00 600,00 32,66 >90 P1C4-H4-IgG2/4 3,14 750 2355,00 160,00 14,72 >90

Пример 18. Функциональный анализ гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 путем измерения цАМФs

[0303] Коммерчески доступный набор (Cisbio) для проведения иммуноанализа в конкурентном формате, содержащий криптат-меченое антитело против цАМФ и d2-меченый цАМФ, используют для характеристики гуманизированных вариантов антител PA13R3-P1C4 путем измерения изменений уровней внутриклеточного цАМФ в клетках TRex-CHO, стабильно экспрессирующих CB1. Число клеток, концентрацию форсколина и концентрацию CP55,940 оптимизируют в соответствии с инструкциями производителя. Антагонистический функциональный анализ цАМФ проводят в белых 384-луночных низкообъемных планшетах (Greiner). Клетки TRex-CHO, экспрессирующие человеческий CB1, высевают с плотностью восемь тысяч клеток/лунку в бессывороточной среде Hamʹs F12 и инкубируют с mAb или контрольным соединением в разных концентрациях при 22°C в течение 10 минут. Затем к клеткам добавляют пяти мкМ форсколин (при концентрации EC20, Sigma Aldrich) и 9 нМ CP55,940 (при EC80, Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 минут при 22°C для повышениям активности аденилатциклазы и активации сигнального пути CB1, соответственно. Затем к клеткам добавляют пять мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и инкубируют в течение 1 часа при 22°C. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism.

[0304] В данном анализе активность гуманизированных антител PA13R3-P1C4 сравнивают с активностью исходного химерного PA13R3-P1C4, римонабанта, низкомолекулярного обратного агониста CB1, и mAb P2A12, неспецифичного к GPCR антитела изотипа IgG1, используемого в качестве отрицательного контроля. mAb PA13R3-P1C4 и его гуманизированные варианты дозо-зависимо ингибируют CP55,940-индуцированное уменьшение уровня внутриклеточного цАМФ, тогда как используемое в качестве отрицательного контроля mAb P2A12 не оказывает никаких эффектов (фигура 15). Средние значения IC50±SD гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 приведены в таблице 13.

Таблица 13. Значения IC₅₀ гуманизированных вариантов P1C4, определенные путем антагонистического анализа цАМФ

IC50 цАМФ (нМ) IC50 цАМФ (нМ) IC50 цАМФ (нМ) IC50 цАМФ (нМ) Среднее значение±SD [n] Среднее значение для партии 1 [n] Среднее значение для партии 2 [n] CHO-S [n] Химерный P1C4-IgG 138±21 [6]^# 120±11 [3] 155±8 [3] N/A P1C4-h0-IgG1 195±96 [5]^# 158±57 [4] 343 [1] N/A P1C4-h2-IgG1 41±4 [3]**^{, ##} 41±4 [3] N/A N/A P1C4-h2-IgG2 84±13 [6]**^,## 77±13 [3] 91±11 [3] N/A P1C4-h2-IgG4 61±13 [7]**^,## 54±8 [3] 63±17 [3] 72 [1] P1C4-h2-IgG2/4 79±13 [6]**^{, ##} 74±14 [3] 85±13 [3] N/A P1C4-h4-IgG1 42±7 [6] **^,## 40±6 [3] 44±7 [3] N/A P1C4-h4-IgG2 81±19 [6]**^,## 82±28 [3] 80±13 [3] N/A P1C4-h4-IgG4 54±9 [7]**^,## 54±12 [3] 54±11 [3] 51 [1] P1C4-h4-IgG2/4 80±17 [6]**^,## 69±9 [3] 90±17 [3] N/A Римонабант 417±82 [3]* N/A N/A N/A

*p <0,05, **p <0,005; и в сравнении с римонабантом ^#p <0,05, ^##p <0,02.

[0305] Гуманизированные варианты P1C4-h2 и h4 являются более активными (в 1,6-3,3 раза), чем химерное mAb PA13R3-P1C4 по результатам антагонистического анализа цАМФ (p<0,005). Гуманизированные варианты P1C4-h2 и P1C4-h4 обладают сравнимой активностью, тогда как среди разных изотипов гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 более высокая активность чаще наблюдается у вариантов IgG1 и IgG4, чем у вариантов IgG2 и IgG2/4.

[0306] Авторы изобретения дополнительно характеризуют механизм антагонизма гуманизированного варианта антитела PA13R3-P1C4, в частности, могут ли такие антитела вести себя как обратные агонисты или нейтральный антагонисты CB1. Римонабант (SR141716A), известный обратный агонист CB1, и AM6545, известный нейтральный антагонист CB1, используют в качестве стандартных соединений.

[0307] Чтобы определить, действительно ли гуманизированный вариант антитела PA13R3-P1C4 действует как обратный агонист или нейтральный антагонист, проводят анализ цАМФ в отсутствии экзогенного агониста. Форсколин, неспецифический активатор аденилилциклазы, добавляют в аналитическую среду, чтобы повысить базовый уровень цАМФ до пределов детекции. Агонистический функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят в белых 384-луночных низкообъемных планшетах (Greiner). Клетки TRex-CHO, экспрессирующие человеческий CB1, высевают с плотностью восемь тысяч клеток/лунку в бессывороточной среде Hamʹs F12 и инкубируют с mAb или контрольным соединением в разных концентрациях при 22°C в течение 10 минут. Затем к клеткам добавляют пяти мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и инкубируют в течение 30 минут при 22°C. Затем к клеткам добавляют 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и инкубируют в течение 1 часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism.

[0308] Авторы настоящего изобретения сравнивают активность гуманизированных вариантов P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 с активностью римонабанта, AM6545 и антитела P2A12-IgG1, используемого в качестве отрицательного контроля, в клетках TRex-CHO CB1, стимулированных 1,5 мкМ форсколином (фигура 16A), а также в клетках TRex-CHO CB1, стимулированных 5 мкМ форсколином (фигура 16B). Результаты демонстрируют, что P1C4-h2-IgG1, P1C4-h2-IgG2, P1C4-h2-IgG4 и римонабант дозо-зависимо повышают уровень цАМФ, что указывает на механизм обратного агонизма. И наоборот, AM6545, нейтральный антагонист CB1, и антитело P2A12-IgG1, используемое в качестве отрицательного контроля, не влияют на уровень цАМФ.

[0309] Проводя анализ кривых Шильда, чтобы определить равновесную константу диссоциации (K_B), которая является показателем сродства антагониста к рецептору независимо от природы и концентрации используеого агониста. Кривые доза-ответ для агонистов CB1 CP55,940 и WIN55,212 в анализе с использованием антагониста цАМФ HTRF получают в присутствии разных концентраций P1C4-h2-IgG4.

[0310] На фигурах 17A-D показано влияние увеличивающихся концентраций P1C4-h2-IgG4 на CP55,940- и WIN55,212-индуцированную активность CB1, измеряемое путем анализа цАМФ (соответственно). Отношение доз (R) рассчитывают на основании EC50 CP55,940 или WIN55,212, концентрации, до которой нужно повысить количество агонистов CB1 (CP55,940 или WIN55,212), чтобы получить такой же ответ в присутствии P1C4-h2-IgG4, как и в его отсутствии. В приведенных ниже таблицах 14 и 15 показаны значения наклона кривых Шильда и равновесные константы диссоциации (K_B), измеренные в 4 разных экспериментах.

Таблица 14. Значения наклона кривых Шильда и равновесные константы диссоциации для CP55,940

CP55,940 Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Эксперимент 4 Наклон Шильда 1,75 1,755 1,32 1,44 K_B (нМ) 48 15 26 28

Таблица 15. Значения наклона кривых Шильда и равновесные константы диссоциации для WIN55,212

WIN55,212 Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Эксперимент 4 Наклон Шильда 1,4 2,1 1,5 1,6 K_B (нМ) 21 17 22,4 28

Пример 19. Анализ активации ERK под действием гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

[0311] В примере 10 и на фигуре 5A показано, что исходное антитело PA13R3-P1C4 блокирует WIN55,212-индуцированную активацию ERK. Чтобы подтвердить, что гуманизированные варианты PA13R3-P1C4 также блокируют WIN55,212-индуцированную активацию ERK, авторы изобретения тестируют способность указанных антител ингибировать WIN55,212-индуцированное фосфорилирование ERK.

[0312] За два дня до эксперимента клетки Trex-CHO, экспрессирующие рецептор CB1, высевают в 6-луночные планшеты при плотности 500000 клеток/лунку. Через 24 часа добавляют 1 мкг/мл тетрациклина, чтобы индуцировать экспрессию рецептора CB1. В течение, по меньшей мере, двух часов перед началом эксперимента клетки держат на бессывороточной среде. К культуральной среде добавляют очищенные IgG в концентрации 300 нМ и через 30 минут клетки стимулируют агонистом рецептора CB1 WIN55,212 (100 нМ) в течение 10 и 15 минут. Собирают клеточные лизаты и определяют уровень активации ERK методом вестерн-блоттинга. Антитела против ERK и против фосфо-ERK получают от Cell Signaling Inc.

[0313] Как показано на фигуре 18A, обработка агонистом CB1 WIN55,212 повышает уровень фосфорилированной ERK, позволяя предположить, что сигналы рецептора CB1 опосредуются путем ERK. Предварительная обработка CB1-специфическим антагонистом римонабантом ингибирует WIN55,212-индуцированную активацию ERK. Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против CB1 P1C4-h2-IgG1 и P1C4-h4-IgG1 ингибирует WIN55,212-индуцированную активацию ERK (фигура 18A). P1C4-h0-IgG1 не ингибирует WIN55,212-индуцированную активацию ERK. Это согласуется с результатами антагонистического анализа цАМФ, которые демонстрируют, что P1C4-h0-IgG1 является менее активным, чем другие гуманизированные варианты P1C4, и позволяет предположить, что указанное антитело не обладает способностью блокировать WIN55,212-индуцированную активацию ERK.

[0314] Также определяют влияние P1C4-h2, содержащих каркасные участки IgG2 и IgG4, на WIN55,212-активируемый путь ERK. Подобно химерному PA13R3-P1C4 и гуманизированному P1C4-h2-IgG1, предварительная обработка антителами против CB1 P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 блокирует WIN55,212-индуцированное фосфорилирование ERK (фигура 18B). Не специфичное к GPCR mAb P2A12 не блокирует WIN55,212-индуцированную активацию ERK. Полученные результаты свидетельствуют о том, что указанные Fc каркасные участки не влияют на антагонистические свойства PA13R3-P1C4.

Пример 20. Исследование влияния гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 на интернализацию рецептора CB1

[0315] Влияние PA13R3-P1C4 и гуманизированных вариантов антител на интернализацию рецептора CB1 анализируют методом проточной цитометрии в присутствии или отсутствии агонистических или антагонистических соединений.

[0316] В день эксперимента клетки держат в бессывороточной среде в течение 2 часов. Затем клетки предварительно инкубируют с антителом против CB1 (300 нМ), AM6545 (нейтральный антагонист CB1) и отрицательным контролем (соединение, связывающее BRIL) в течение получаса. Затем в культуральную среду добавляют агонист CB1 (1 мкМ WIN55,212) и инкубируют 1 час, чтобы индуцировать интернализацию рецептора. Экспрессированный на поверхности CB1 окрашивают мышиным моноклональным антителом против N-концевого участка CB1, полученным от R&D, и методом проточной цитометрии (Guava) определяют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI).

[0317] Тетрациклин индуцирует экспрессию CB1 в клетках TRex-293, что подтверждает увеличение поверхностного окрашивания мышиным моноклональным антителом, специфичным к N-концевому участку CB1 (фигура 19A, панель A, линия, обозначенная точками). Обработка тетрациклином в присутствии агониста CB1 WIN55,212 уменьшает поверхностное окрашивание, свидетельствуя о снижении количества CB1 на клеточной поверхности в результате интернализации (фигура 19A, панель A, пунктирная линия). Предварительная обработка CB1-специфичным антагонистом римонабантом (фигура 19A, панель B, сплошная черная линия) ингибирует агонист-индуцированное уменьшение окрашивания CB1 на клеточной поверхности. Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против CB1 (PA13R3-P1C4 (фигура 19A, панель D, сплошная черная линия), P1C4-h2-IgG1 (фигура 19A, панель F, сплошная черная линия) и P1C4-h4-IgG1 (фигура 19A, панель G, сплошная черная линия)) ингибирует WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора CB1. P1C4-h0-IgG1 (фиг. 19A, панель E, сплошная черная линия) и используемое в качестве отрицательного контроля антитело P2A12-IgG1 (фигура 19A, панель C, сплошная черная линия) не ингибируют WIN55,212-индуцированную интернализацию CB1. Согласно результатам антагонистического анализа цАМФ и анализа активаци ERK, P1C4-h0-IgG1 является менее активным, чем другие гуманизированные варианты P1C4, причем его неспособность блокировать WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора может быть обусловлена высокой скоростью диссоциации P1C4-h0-IgG1.

[0318] Среди разных подклассов человеческих IgG Fc-участки подклассов IgG2 и IgG4 отличаются низким связыванием с эффекторными молекулами, такими как активирующие FcγR или компонент комплемента 1q (C1q), которое обуславлявает пониженную эффекторную активность. Соответственно, P1C4-h2 клонируют в человеческих каркасных участках Fc IgG2 и IgG4, поскольку при терапевтическом применении активация иммунных эффекторных функций является нежелательной (как описано в примере 17). Затем гуманизированные варианты P1C4-h2-IgG1, P1C4-h4-IgG1, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 анализируют на способность блокировать интернализацию рецептора CB1. Как указано выше, экспрессию CB1 в клетках TRex-293, индуцированную тетрациклином, подтверждают путем увеличения окрашивания поверхности мышиным моноклональным антителом, специфичным к N-концевому участку CB1 (фигура 19B, панель A, линия, отмеченная точками). Обработка тетрациклином в присутствии агониста CB1 WIN55,212 уменьшает поверхностное окрашивание, свидетельствуя о снижении количества CB1 на клеточной поверхности в результате интернализации (фигура 19B, панель A, пунктирная линия). Предварительная обработка CB1-специфичным антагонистом римонабантом (фигура 19B, панель B, сплошная черная линия) ингибирует агонист-индуцированное уменьшение окрашивания CB1 на клеточной поверхности. Подобно римонабанту, предварительная обработка антителами против CB1 (PA13R3-P1C4 (фигура 19B, панель D, сплошная черная линия), P1C4-h2-IgG1 (фигура 19B, панель F, сплошная черная линия) и P1C4-h4-IgG1 (фигура 19B, панель G, сплошная черная линия)) ингибирует WIN55,212-индуцированную интернализацию рецептора CB1. P1C4-h0-IgG1 (фиг. 19B, панель E, сплошная черная линия) и используемое в качестве отрицательного контроля антитело P2A12-IgG1 (фигура 19B, панель C, сплошная черная линия) не ингибируют WIN55,212-индуцированную интернализацию CB1.

Пример 21. Анализ связывания гуманизированных вариантов антител PA13R3-P1C4 методом проточной цитометрии

[0319] Сродство гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 определяют методом проточной цитометрии с использованием клеток TRex CHO, стабильно трансфицированных CB1. Собирают исходные клетки TRex CHO и клетки TRex-CHO, стабильно трансфицированные конструкциями, обеспечивающими экспрессию тетрациклин-индуцируемого человеческого CB1, человеческого CB2 или мышиного CB1. Чтобы определить связывание тестируемых антител, сто микролитров суспензии клеток с плотностью 1×10⁶ клеток/мл инкубируют с тестируемыми антителами в диапазоне концентраций от 1 мкМ до 1,3 нМ в течение 30 минут на льду. Затем клетки центрифугируют при 4°C и 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант удаляют отсасыванием, после чего клетки промывают 200 мкл буфера FACS. Процедуру промывания повторяют дважды. После последнего промывания клетки ресуспендируют в буфере FACS, содержащем вторичные PE-конъюгированные антитела против Fc человеческих IgG (в разведении 1:200), и инкубируют при 4°C в течение 30 минут. Затем клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и анализируют методом проточной цитометрии (Guava). Анализ результатов и измерение сродства (K_D) проводят с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Средние значения константы диссоциации (K_D) гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 определяют, используя результаты, по меньшей мере, 4 разных экспериментов, проводимых с использованием, по меньшей мере, 2 разных партий белка (фигуры 20A-D и таблица 16).

Таблица 16. Средние значения константы диссоциации (K_D) гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4

Сродство связывания K_D (нМ) Сродство связывания K_D (нМ) Среднее±SD [n] Среднее для партии 1 [n] Среднее для партии 2 [n] Среднее для партии 3 [n] PA13R3-P1C4 103±18 [7] 92 [3] 116 [3] 96 [1] P1C4-h0-IgG1 24±6 [7]*** 23 [4] 24 [3] 24 [3] P1C4-h2-IgG1 41±18 [4]** 41 [4] N/A N/A P1C4-h2-IgG2 78±24 [6] 74 [3] 77 [3] N/A P1C4-h2-IgG4 57±11 [7]*** 59 [3] 59 [3] 43 [1] P1C4-h2-IgG2/4 82±24 [6] 82 [3] 82 [3] N/A P1C4-h4-IgG1 37±12 [7]*** 37 [4] 37 [3] N/A P1C4-h4-IgG2 65±26 [6]* 65 [3] 65 [3] N/A P1C4-h4-IgG4 49±15 [7]*** 51 [3] 49 [3] 49 [1] P1C4-h4-IgG2/4 75±41 [6] 69 [3] 74 [3] N/A

*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001.

[0320] У гуманизированных вариантов, за исключением h2-IgG2, h2-IgG2/4 и h4-IgG2/4, наблюдается статистически значимое увеличение сродства к человеческому CB1 по сравнению с исходным химерным антителом PA13R3-P1C4. Средние значения константы диссоциации для каждого соединения определяют с использованием, по меньшей мере, двух разных препаратов белка (за исключением P1C4-h2-IgG1, который существует в виде только одного препарата). Сравнивают константы диссоциации, полученные для разных партий одного соединения (таблица 16). Варианты P1C4-h2 и P1C4-h4 обладают сходными значениями сродства. Однако существует слабая тенденция, которая не является статистически значимой, заключающаяся в том, что варианты IgG1 обладают более высоким сродством, чем варианты IgG2, IgG4 и IgG2/4.

[0321] P1C4-h0-IgG1 имеет самую низкое измеренное значение константы диссоциации (K_D 24 нМ). Однако максимальный сигнал FACS (средняя интенсивность флуоресценции) у P1C4-h0-IgG1 меньше, чем у других вариантов P1C4. Это может свидетельствовать о более высокой скорости диссоциации P1C4-h0-IgG1.

[0322] Селективность связывания и перекрестную реакционноспособность PA13R3-P1C4 и его гуманизированных вариантов также характеризуют методом проточной цитометрии с использованием клеток TRex CHO, стабильно трансфицированных представляющими интерес GPCR. А именно, определяют селективность связывания с CB1 по сравнению с CB2. Также определяют перекрестную реакционноспособность в отношении мышиного CB1. Чтобы детектировать экспрессию мышиного CB1, 100 мкл суспензии клеток с плотностью 1×10⁶ клеток/мл инкубируют с кроличьим поликлональным антителом против CB1 (Santa Cruz) в концентрации 1 мкг/100 мкл на льду в течение 30 мин. Мышиное моноклональное антитело против CB2, полученное от R&D Systems, используют для подтверждения экспрессии CB2. 100 мкл суспензии клеток с плотностью 1×10⁶ клеток/мл инкубируют с антителом против CB2 в концентрации 0,5 мкг/100 мкл на льду в течение 30 минут. После инкубации клетки центрифугируют при 4°C и 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант удаляют отсасыванием, после чего клетки промывают 200 мкл буфера FACS. Процедуру промывания повторяют дважды. После последнего промывания клетки ресуспендируют в буфере FACS, содержащем FITC-конъюгированные вторичные антитела против кроличьих IgG (в разведении 1:200) для детекции мышиного CB1, и PE-конъюгированные вторичные антитела против мышиных IgG (в разведении 1:200) для детекции CB2, и инкубируют при 4°C в течение 30 минут. После инкубации в течение 30 минут со вторичными антителами клетки центрифугируют при 4°C и 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант отсасывают, чтобы удалить избыток вторичных антител. Клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и анализируют методом проточной цитометрии (Guava). Строят кривые связывания очищенных IgG с учетом всех концентраций от 1 мкМ до 1,3 нМ. Анализ результатов и измерение сродства (K_D) проводят с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.

[0323] Значения селективности связывания и перекрестной реакционноспособности гуманизированных вариантов PA13R3-P1C4 в отношении человеческого CB1 по сравнению с человеческим CB2 и мышиным CB1 показаны на фигурах 20E-M. Подобно PA13R3-P1C4, гуманизированные варианты селективно связываются с человеческим CB1 по сравнению с человеческим CB2. Связывание с мышиным CB1 практически не наблюдается при концентрациях до 1 мкМ, свидетельствуя об отсутствии перекрестной реакционноспособности в отношении данных соединений, несмотря на высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей внеклеточных доменов человеческого и мышиного CB1 (идентичность 97%).

Пример 22. Влияние перестановки ELC2 на связывание FACS

[0324] Чтобы протестировать влияние мутаций ECL2 на способность P1C4 связывать CB1, экспрессированный на клеточной поверхности, авторы изобретения получают конструкцию, обеспечивающую экспрессию CB1 в клетках путем направленного мутагенеза. Коротко говоря, проводят ПЦР, используя 2 олигонуклеотида, Apollo_ECL2_h2m_F (CTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACTCATTGATGAAACCTACCT) (SEQ ID NO: 826) и Apollo_ECL2_h2m_R (GGAAAATGTCTGAGCAAACAGATTGCAGTTTCTTGCAGTTCCAGCCCAGG) (SEQ ID NO: 827), в качестве праймеров и pcDNA4TO-человеческий CB1 в качестве матрицы. Посредством данной реакции в ECL2 вводят мутации E→K и H→L, получая последовательность ECL2 человеческого CB1, идентичную последовательности ECL2 мышиного CB1. 50 мкл реакционной смеси для ПЦР содержат 10 мкл буфера 5×PCR, 2 мкл dNTP (каждый в концентрации 10 мМ), 0,25 мкл каждого из обратного и прямого праймеров (100 мМ исходный раствор), 50 нг ДНК-матрицы, 1 мкл DMSO и 1 мкл полимеразы Phusion (NEB). Циклы ПЦР, которые включают в себя 95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 1 минуты, 72°C в течение 7 минут, повторяют 16 раз. После окончания реакции к продукту ПЦР добавляют 1 мкл DpnI (20 ед/мкл). Продукт ПЦР инкубируют при 37°C в течение 1 часа и затем 1 мкл используют для трансформации Dh5α E. coli. Полученные трансформанты культивируют в чашках и отдельные колонии подвергают секвенированию, чтобы подтвердить наличие мутации. Полученную конструкцию называют pcDNA4TO-CB1 с перестановкой человеческий/мышиный ECL2-IRES-GFP.

[0325] Чтобы подтвердить, что участки E→K и H→L в ECL2 играют важную роль в связывании PA13R3-P1C4 с CB1, методом проточной цитометрии проводят анализ связывания P1C4-h4-IgG1 с клетками TRex-CHO, временно трансфицированными конструкциями, обеспечивающими экспрессию человеческого CB1, мышиного CB1 или CB1 с перестановкой человеческий/мышиный ECL2.

[0326] Клетки TRex-CHO выращивают в культуральной среде Hamʹs F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина и 10 мкг/мл бластицидина. За день до трансфекции клетки пересаживают и высевают в 6-луночный планшет в количестве 0,5×10⁶ клеток на лунку, содержащую 2 мл культуральной среды. В день трансфекции в клетки вводят pcDNA4TO-человеческий CB1, pcDNA4TO-мышиный CB1-IRES-GFP, pcDNA4TO-CB1 с перестановкой человеческий/мышиный ECL2-IRES-GFP или pcDNA4TO-GFP в качестве отрицательного контроля, используя липофектамин 2000 в соответствии с инструкциями Life Technologiesʹ. На следующий день после трансфекции клетки обрабатывают тетрациклином, 1 мкг/мл, в течение 24 часов, чтобы индуцировать экспрессию CB1. В день эксперимента среду отсасывают; клетки промывают один раз DPBS и инкубируют с буфером для диссоциации клеток в течение 5 минут. Клетки собирают и центрифугируют при 1600 об/мин в течение 3 минут. Супернатанты удаляют отсасыванием, после чего клетки промывают DPBS. Число клеток определяют с помощью цитометра Bio-Rad T10. Клетки центрифугируют при 1600 об/мин в течение 3 минут; супернатант отсасывают, чтобы удалить DPBS, после чего клетки ресуспендируют в буфере FACS (3% FBS в DPBS, 0,09% азида натрия) до плотности 1×10⁶ клеток/мл. Чтобы определить связывание mAb PA13R3-P1C4 с клетками, экспрессирующими человеческий CB1, мышиный CB1, CB1 с перестановкой человеческий/мышиный ECL2, а также с контрольными клетками, 100 мкл суспензии, содержащей 1×10⁶ клеток/мл, инкубируют с P1C4-h4-IgG1, mAb против CB1, R&D, или P2A12 в течение 30 минут на льду. Вторичные PE-конъюгированные mAb против человеческих IgG или PE-конъюгированные mAb против мышиных IgG разводят 1:200 буфером FACS. Клетки, окрашенные только вторичным антителом, используют в качестве отрицательного контроля. После инкубации со вторичным антителом клетки дважды промывают 200 мкл буфера FACS и анализируют методом проточной цитометрии (Guava).

[0327] Как показано на фигуре 21, P1C4-h4-IgG1 связывается с человеческим CB1, но не с мышиным CB1 и не с CB1, содержащим перестановку человеческий/мышиный ECL2. Единственным различием между человеческим CB1 и CB1, содержащим перестановку человеческий/мышиный ECL2, является замена остатков E→K и H→L в ECL2. Результаты измерения связывания методом проточной цитометрии свидетельствуют о том, что ECL2 играет ключевую роль в связывании P1C4. Моноклональное антитело против CB1, R&D, используют в качестве положительного контроля, демонстрирующего экспрессию CB1. P2A12 и pcDNA4TO-GFP используют в качестве контроля окрашивания и пустого контрольного вектора, соответственно.

Пример 23. Анализ эффекторных функций ADCC и CDC

[0328] Чтобы подтвердить предполагаемое отсутствие эффекторных функций у вариантов P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 гуманизированного P1C4, проводят анализы антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC) с использованием клеток Дауди.

[0329] Чтобы провести анализ ADCC, концентрацию клеток-мишеней Дауди доводят до 12,5×10⁴ клеток/мл средой ADCC. В каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета добавляют 80 мкл клеточной суспензии (1×10⁴ жизнеспособных клеток). Двадцать мкл серийных разведений антитела в среде ADCC распределяют в лунки с тройными повторами. Конечные концентрации ритуксимаба и Anti-hel-hIgG1 составляют: 0,128 нг/мл, 0,64 нг/мл, 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл; конечные концентрации Anti-hel-hIgG2, Anti-hel-hIgG4, P1C4-h2-IgG2 и P1C4-h2-IgG4 составляют: 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл. Планшшет инкубируют при 22-25°C в течение 30 минут. Концентрацию PBMC доводят средой ADCC так, чтобы после добавления 100 мкл клеток PBMC к клеткам-мишеням, отношение эффекторные клетки:клетки-мишени составляло 25:1 и 50:1, соответственно. Планшет центрифугируют при 250 g в течение 4 минут и затем инкубируют при 37°C. За 45 минут до сбора супернатанта 20 мкл лизирующего раствора из набора CytoTox 96 (Promega) добавляют в контрольные лунки максимального лизиса. После инкубации в течение 5 часов планшет центрифугируют при 250 g в течение 4 минут. 50 мкл супернатанта из каждой лунки переносят в чистый плоскодонный 96-луночный аналитический планшет. В каждую лунку добавляют 50 мкл субстрата из набора CytoTox 96 (Promega) и перемешивают в течение 30 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего в каждую лунку добавляют 50 мкл останавливающего раствора и перемешивают в течение 30 секунд. Поглощение считывают при 490 нм. Анализ полученных данных: % лизиса рассчитывают с помощью GraphPad Prism 5.0 с получением IC₅₀ по следующей формуле:

% лизиса=[(экспериментальное высвобождение)- (мишени+PBMC)]/[(максимальный лизис)-среднее(только мишени)]×100

[0330] Ритуксимаб индуцирует эффект ADCC в клетках Дауди со значением IC50 1,19 нг/мл при соотношении E/T 50:1, 0,92 нг/мл при соотношении E/T 25:1. Как показано на фигурах 22A-C варианты Fc антител P1C4 не обладают активностью ADCC в клетках Дауди при соотношении E/T 50:1 и 25:1.

[0331] Чтобы провести анализ CDC, клетки-мишени Дауди собирают и доводят их концентрацию до 80×10⁴ клеток/мл средой для культивирования клеток. Суспензию клеток вносят в плоскодонный 96-луночный белый планшет в объеме 25 мкл/лунку. Затем во все лунки с двойными повторами добавляют серийные разведения P1C4, ритуксимаба, Anti-HEL-hIgG1 и Anti-HEL-hIgG2 в среде ADCC, в объеме 12,5 мкл/лунку. Конечные концентрации ритуксимаба и Anti-hel-hIgG1 составляют: 0,128 нг/мл, 0,64 нг/мл, 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл; конечные концентрации Anti-hel-hIgG2, Anti-hel-hIgG4, P1C4-H2-IgG2 и P1C4-H2-IgG4 составляют: 3,2 нг/мл, 16 нг/мл, 80 нг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл. Планшеты инкубируют в вытяжном шкафу в течение 15 минут. В планшеты, содержащие клетки, добавляют человеческий комплемент, разбавленный средой ADCC, в объеме 12,5 мкл/лунку с достижением конечной концентрации 10%. В лунки максимального лизиса добавляют 5 мкл лизирующего раствора. Конечный объем во всех лунках доводят до 50 мкл средой ADCC. Планшеты инкубируют при 37°C в течение 2 часов и затем к клеткам добавляют 50 мкл/лунку раствора CTG. Планшеты встряхивают на шейкере для микропланшет в течение 2 минут со скоростью 200 и затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Люминесцентный сигнал считывают с помощью Envision. Анализ полученных данных: % цитотоксичности и IC₅₀ рассчитывают с помощью GraphPad Prism 5.0 по следующей формуле:

% цитотоксичности=[(экспериментальное значение)- среднее(клетки+комплемент)]/[среднее(максимальный лизис)-среднее(только клетки)]×100

[0332] CDC-активность антител тестируют на клетках Дауди, лизис клеток Дауди под действием PBMC оценивают с помощью анализа клеточного титра Glo, конечная концентрация комплемента составляет 10%. Ритуксимаб индуцирует CDC-активность в отношении клеток Дауди с IC50 399 нг/мл. Как показано на фигуре 22D, варианты Fc антитела P1C4 не проявляют CDC-активности в отношении клеток Дауди.

Пример 24. Распознавание денатурированного белка CB1 антителами P1C4

[0333] В данном исследовании методом вестерн-блоттинга определяют, способны ли PA13R3-P1C4 и его гуманизированные варианты распознавать эпитоп (эпитопы) на денатурированном белке CB1 (His-меченый, укороченный по N/C-концам CB1). Очищенный человеческий белок CB1 (750 нг на полосу) смешивают с SDS-содержащим восстанавливающим буфером, содержащим бета-меркаптоэтанол (Double Helix). Денатурированный рекомбинантный белок CB1 загружают на 12% восстанавливающие гели SDS-PAGE, после чего белок разделяют при 120 В в течение одного часа и переносят на мембраны PVDF (предварительно замоченные в метаноле) под действием электрического тока при 300 мА в течение 70 минут. Мембраны блокируют 5% NFDM/PBS-T в течение одного часа при 22°C и затем проводят иммуноблоттинг с использованием тестируемых антител (2 мкг/мл) в 5% NFDM/PBS-T в течение ночи at 4°C. В качестве положительных контролей используют коммерческое мышиное антитело против His и мышиное антитело против CB1 (R&D Systems), а в качестве отрицательного контроля используют кроличье антитело против CB1 (Cayman), котрое распознает C-концевой участок, удаленный из рекомбинантного белка CB1, используемого в данном исследовании.

[0334] После инкубации в течение ночи мембраны при 22°C промывают три раза PBS, содержащим 0,5% твин-20 (PBS-T). К соответствующим мембранам добавляют вторичные AP-конъюгированные антитела против человеческих IgG (1:5000), или против мышиных IgG, или против кроличьих IgG, в 5% NFDM/PBS-T и инкубируют в течение 1 часа при 22°C. Мембраны промывают PBS-T три раза по 5 минут. После последнего промывания развивают окрашивание путем инкубации с раствором субстрата NBT/BCIP при 22°C и затем реакцию останавливают путем промывания мембран проточной водой.

[0335] Результаты вестерн-блоттинга демонстрируют, что используемые в качестве положительного контроля антитела позволяют детектировать денатурированный белок CB1 с правильной кажущейся молекулярной массой 63 кДа (фигура 23B, полосы 9 и 10). Полосы, соответствующие используемому в качестве отрицательного контроля антителу, специфичному к C-концу (фигура 23B, полоса 11), PA13R3-P1C4 (фигура 23A, полоса 2) или гуманизированным вариантам антител (фигура 23A, полосы 3-6), не детектируются. Испльзуемые в данном эксперименте вторичные антитела против человеческого Fc позволяют детектировать очищенный человеческий IgG (фигура 23A, полоса 1). Результаты свидетельствуют о том, что PA13R3-P1C4 и гуманизированные варианты антител не способны распознавать денатурированный и развернутый белок CB1. Наряду с результатами, полученными методом проточной цитометрии, результаты данного эксперимента подтвержают, что PA13R3-P1C4 и гуманизированные варианты антител распознают конформационные, но не линейные эпитопы.

Пример 25. Связывание химерных и гуманизированных Fab P1C4, определяемое путем измерения цАМФ и методом FACS

[0336] Чтобы определить сродство Fab PA13R3-P1C4, получают полные кривые связывания с рецептором CB1 путем тестирования диапазона концентраций с использованием клеток TRex-CHO, стабильно трансфицированных конструкцией, обеспечивающей тетрациклин-индуцируемую экспрессию CB1, методом проточной цитометрии. Получают трехкратные серийные разведения от 3 мкМ до 0,1 мкМ. Для детекции Fab PA13R3-P1C4 используют FITC-конъюгированные антитела против человеческих IgG. Fab PA13R3-P1C4 связываются с клетками TRex-CHO CB1 в дозо-зависимой манере (фигура 24A и таблица 17).

[0337] Функциональный анализ с измерением цАМФ проводят, чтобы определить антагонистическую активность Fab P1C4. Функциональный анализ цАМФ (Cisbio) проводят на белом 384-луночном низкообъемном планшете (Greiner). В каждую лунку планшета высевают 8000 клеток TRex CHO, стабильно экспрессирующих CB1, после чего проводят инкубацию с Fab P1C4 в разных концентрациях при комнатной температуре в течение 10 мин. Для стимуляции смеси к клеткам добавляют 5 мкМ форсколин (Sigma Aldrich) и 9 мкМ каннабиноид CP55940 (Sigma Aldrich), после чего инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы активировать CB1. После инкубации в течение 30 мин добавляют 5 мкл цАМФ-d2 (разведение 1:39, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) и 5 мкл анти-цАМФ-криптата (разведение 1:9, конъюгат и буфер для лизиса получают от Cisbio) для стимуляции клеток и инкубируют в течение часа. Сигнал FRET детектируют с помощью планшет-ридера Envision для нескольких меток (Perkin Elmer) при длине волны возбуждения анти-цАМФ-криптата 620 нм и длине волны испускания 665 нм. Анализ результатов проводят с помощью GraphPad Prism. Результаты приведены на фигуре 24B и в таблице 17. Показанные средние значения IC₅₀ и константы диссоциации (Kd) ± SD получают с использованием результатов, по меньшей мере, 2 разных экспериментов.

Таблица 17. Значения IC₅₀ и константы диссоциации Fab PA13R3-P1C4

Fab Клеточная линия Kd, определенная методом проточной цитометрии IC₅₀, определенная путем анализа цАМФ Химерного P1C4 Экспрессирующая человеческий CB1 130±9 нМ 427±121 нМ P1C4-h2 Экспрессирующая человеческий CB1 14±0,4 нМ 52±22 нМ P1C4-h4 Экспрессирующая человеческий CB1 16,2±2,3 нМ 43±5 нМ

Пример 26. Определение биофизических характеристик гуманизированных вариантов P1C4

[0338] Авторы характеризуют стабильность и растворимость гуманизированных вариантов Fc PA13R3-P1C4 путем проведения тестов с измерением стабильности при низких и высоких pH и с определением максимальной растворимости. Авторы также характеризуют стабильность указанных молекул в ускоренных условиях, в человеческой сыворотке и в сыворотке отличных от человека приматов, после нескольких циклов замораживания/оттаивания, а также в условиях сдвига pH.

[0339] Чтобы охарактеризовать pH-стабильность гуманизированных вариантов P1C4, 200 мкл каждого антитела (~5 мг/мл) и PBS в качестве контроля вводят в диализную кассету Pur-A-Lyzer Maxi 12000 (Sigma, Cat# PURX12015-1KT). Белки диализуют против 2 л буфера с pH 3 (0,1 M уксусная кислота, доведенная до pH 3 NaOH) или буфера с pH 9 (0,2 M глицин, доведенный до pH 9 NaOH), соответственно, при 4°C в течение ночи. Образцы белков извлекают из диализных кассет, помещают в предварительно взвешенные пустые пробирки Эппендорфа и проверяют на наличие видимого осадка. Измеряют массу образца. Чтобы подтвердить успешное протекание диализа, берут 3 мкл диализованного образца и проверяют с помощью индикаторной бумаги для определения pH. Аликвоты образцов объемом пятьдесят мкл используют для анализа SEC. Оставшуюся часть держат в инкубаторе при 40°C в течение 48 часов. Затем образцы снова проверяют на наличие видимого осадка. После инкубации в течение 48 часов шесть мкл образца вводят на колонку TSK G3000SWXL SEC и рассчитывают концентрацию белка по площади пиков SEC (после инкубации при 40°C). Степень извлечения белка определяют по следующей формуле: количество до диализа (об.×конц.)/количество после диализа (об.×конц.) ×100%.

[0340] После диализа против буферов с pH 3 и pH 9 и последующей инкубации в течение 48 часов при 40°C осадок в растворах 4 IgG не наблюдается. Степень извлечения всех четырех IgG составляет примерно 71-83%. Низкая степень извлечения может быть связана с тем, что часть образца остается в диализной кассете. Рассчитанные по профилям SEC количества мономеров IgG составляют более 99% для всех 4 диализованных IgG. После диализа против буфера pH 3 и последующей инкубации в течение 48 часов при 40°C IgG дают более широкие пики SEC, позволяющие предположить более высокую гетерогенность IgG после длительной инкубации в буфере с pH 3. Способность антител влиять на уровень цАМФ и связываться с клетками, экспрессирующими CB1, измеряют с помощью способов, описанных в примерах 11 и 7, результаты приведены в таблицах 18 и 19, соответственно. Результаты демонстрируют, что после инкубации при pH 3 активность P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 и P1C4-h4-IgG4 в отношении цАМФ уменьшается, как и активность P1C4-h4-IgG2 после инкубации при pH 9.

Таблица 18. pH-стабильность гуманизированных вариантов P1C4: растворимость

Образец pH Исх.конц. (мг/мл) Исх. объем (мкл) Конц. (мг/мл) Объем извлеч. образца (мкл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H2-IgG2 3 4,6 200 3,79 189 77,86 >99 P1C4-H2-IgG4 3 5,2 200 4,06 184 71,83 >99 P1C4-H4-IgG2 3 4,6 200 3,85 177 74,07 >99 P1C4-H4-IgG4 3 5,5 200 2,99 282 76,65 >99 P1C4-H2-IgG2 9 4,6 200 4,23 176 80,92 >99 P1C4-H2-IgG4 9 5,2 200 4,6 182 80,50 >99 P1C4-H4-IgG2 9 4,6 200 4,26 179 82,88 >99 P1C4-H4-IgG4 9 5,5 200 4,77 188 81,52 >99

Таблица 19. pH-стабильность гуманизированных вариантов P1C4: активность в отношении цАМФ

IC₅₀ (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 pH3 83 104 115 139 pH9 87 85 97 64

[0341] Растворимость гуманизированных вариантов P1C4 характеризуют путем концентрирования 400 мкл IgG (~5 мг/мл) фильтрованием на центрифуге (Amicon Ultra-0,5 мл 30K) при 14000 g и 4°C до ~100 мкл. В центрифужные фильтры добавляют еще 200 мкл IgG и концентрируют при 14000 g и 4°C до ~100 мкл. Затем в центрифужные фильтры добавляют еще порцию IgG объемом 200 мкл и концентрируют при 14000 g и 4°C до ~100 мкл (всего 800 мкл концентрируют до 100 мкл). Концентрированный белок проверяют на наличие видимого осадка путем перемешивания пипетированием. Затем концнетрирование продолжают при 14000 g и 4°C до достижения объема менее 50 мкл. Центрифужные фильтры переворачивают и помещают в заранее взвешенные пустые пробирки. Центрифужные фильтры центрифугируют при 1000 g в течение 5 минут при 4°C и собирают концентрированный образец. Пробирки взвешивают, чтобы определить объем образцов. Если наблюдается образование осадка, пробирки центрифугируют при 14000 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатанты удаляют, помещают в новые пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем осадок осаждают центрифугированием при 14000 g в течение 10 минут при 4°C и супернатанты переносят в новые пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл. Чтобы провести анализ методом SEC, 6 мкл супернатанта концентрированного образца вводят на колонку TSK G3000SWXL SEC и концентрацию белка рассчитывают по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают по следующей формуле: количество до конц. (об.×конц.)/количество после конц. (об.×конц.) ×100%.

[0342] Четыре варианта Fc концентрируют до достижения концентрации белка более 85 мг/мл. Степень извлечения белка составляет более 99%. Наблюдается небольшой видимый осадок P1C4-h2-IgG4 при 93,9 мг/мл до и после инкубации в течение 24 часов при комнатной температуре. В образцах 3 других IgG при концентрации выше 85 мг/мл после инкубации в течение 24 часов при комнатной температуре видимый осадок отсутствует. Содержание мономеров IgG, рассчитанное по профилю SEC, составляет более 96% для всех 4 концентрированных IgG по сравнению с исходным уровнем ~99%. Результаты приведены в таблице 20.

Таблица 20. Растворимость гуманизированных вариантов P1C4

Образец Исх.конц. (мг/мл) Исх. объем (мкл) Конц. (мг/мл) Объем после концентрирования (мкл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H2-IgG2 4,6 800 85,6 43,6 >99 96,84 P1C4-H2-IgG4 5,2 800 93,9 44,5 >99 97,39 P1C4-H4-IgG2 4,6 800 87,84 42,2 >99 97,05 P1C4-H4-IgG4 5,5 800 116,51 38,7 >99 96,38

[0343] Кроме того, определяют стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в ускоренных условиях. В пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл помещают 100 мкл образца белка (~5 мг/мл). Пробирку закрывают парафильмом. Используют две пробирки, одну держат при 4°C, а другую - при 40°C в течение 33 дней. Берут аликвоту объемом 20 мкл, чтобы проверить образец на наличие видимого осдка и провести анализ SEC. Анализ SEC проводят путем введения 6 мкл образца на колонку TSK G3000SWXL SEC с последующим определением концентрации белка по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают по следующей формуле: количество до инкуб. (об.×конц.)/количество после инкуб. (об.×конц.) ×100%.

[0344] После инкубации в течение 33 дней при 4°C и 40°C осадок не наблюдается. Содержание мономеров IgG, рассчитанное по профилю SEC, составляет более 98% для всех 4 IgG после инкубации как при 4°C, так и при 40°C. Степень извлечения, рассчитанная по профилю SEC, составляет более 96% для всех 4 IgG после инкубации как при 4°C, так и при 40°C (таблица 21). После инкубации в течение 33 дней при 4°C и 40°C изменение активности вариантов Fc P1C4 не наблюдается, за исключением P1C4-h4-IgG2, у которого IC₅₀ находится вне стандартного диапазона, свидетельствуя о небольшом снижении активности (таблица 22).

Таблица 21. Стабильность в ускоренных условиях: растворимость

Образец Темп. °C Период инкубации (дни) Исх.конц. (мг/мл) Конц. (мг/мл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H2-IgG2 4 33 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 4 33 5,2 5,23 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 4 33 4,6 4,71 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 4 33 5,5 5,47 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 40 33 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 40 33 5,2 5,28 >99 98 P1C4-H4-IgG2 40 33 4,6 4,46 96,96 >99 P1C4-H4-IgG4 40 33 5,5 5,28 96,00 >99

Таблица 22. Стабильность в ускоренных условиях: активность

IC₅₀ (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 При 4°C в течение 33 дней 75 55 69 62 При 40°C в течение 33 дней 65 68 88 71

[0345] Определяют стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в сыворотке. Человеческую сыворотку получают от Sigma. Сыворотку отличных от человека приматов собирают в Crown Bioscience. В пробирке Эппендорфа смешивают 950 мкл сыворотки и 50 мкл IgG до конечной концентрации 250 мкг/мл (~1,67 мкМ) и инкубируют при 37°C. Образцы объемом 200 мкл берут через 0, 24, 48 и 72 часа и методом проточной цитометрии анализируют связывание с клетками, экспрессирующими CB1. Готовят 3-кратные серийные разведения образцов тестируемых IgG с исходной концентрацией 500 nM и используют их для определения K_D методом проточной цитометрии_. Результаты, приведенные в таблицах 23 и 24, свидетельствуют об отсутствии изменений сродства после инкубации в течение 24 часов с человеческой сывороткой или сывороткой NHP при 37°C. Значительные изменения K_D отсутствуют в образцах, за исключением P1C4-h2-IgG2, у которого наблюдается уменьшение сродства к клеткам, экспрессирующим CB1, после инкубации в течение 48 часов с человеческой сывороткой или сывороткой NHP. Кроме того, у P1C4-h4-IgG2 также наблюдается уменьшение сродства к клеткам, экспрессирующим CB1, после инкубации в течение 48 часов.

Таблица 23. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в человеческой сыворотке, 24 часа

K_d (нМ) в человеческой сыворотке h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон (50-150%) 14,5-43,5 17-51 15,5-46,5 15-45 0 часов 21 16 23 16 24 часа 21 11 17 12 48 часов 56 19 31 12 72 часа 38 20 11 15

Таблица 24. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 в сыворотке NHP

Kd (нМ) в сыворотке NHP h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон (50-150%) 14,5-43,5 17-51 15,5-46,5 15-45 0 часов 21 19 20 20 24 часа 15 12 16 13 48 часов 57 37 48 28 72 часа 41 29 33 26

[0346] Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 после замораживания/оттаивания характеризуют следующим образом. Аликвоту объемом 100 мкл замороженного исходного раствора каждого из гуманизированных вариантов Fc P1C4 отаивают на водяной бане при 22°C, затем быстро замораживают в жидком азоте. Замороженный образец держат при -80°C в течение, по меньшей мере, 20 минут, после чего его снова отаивают на водяной бане при 22°C. Образцы подвергают 10 указанным циклам замораживания/оттаивания. Наличие осадка проверяют визуально. Аликвоты образца объемом 20 мкл берут для анализа методом SEC после 1, 5 и 10 циклов замораживания/оттаивания. Для анализа методом SEC 6 мкл инкубированного образца вводят на колонку TSK G3000SWXL SEC. Концентрацию белка определяют по площади пика SEC. Степень извлечения белка рассчитывают по следующей формуле: количество до З/О (об.×конц.)/количество после З/О (об.×конц.) ×100%.

[0347] Результаты демонстрируют, что после 10 циклов замораживания/оттаивания содержание мономеров IgG выше 97% в образцах всех 4 тестируемых вариантов IgG. Степень извлечения белка составляет более 96% для всех IgG. В образце, содержащем P1C4-H2-IG4, наблюдается небольшое помутнение после 1-ого цикла замораживания/оттаивания, однако заметный осадок или значительное уменьшение концентрации белка не наблюдается. Результаты приведены в таблицах 25-28. Образцы белков, извлеченных после 5 циклов замораживания/оттаивания, также тестируют на активность с помощью антагонистического анализа цАМФ, получая значения IC₅₀, которые демонстрируют отсутствие существенных изменений в активности и находятся в нормальном диапазоне (таблица 29).

Таблица 25. Стабильность P1C4-H2-IgG2 после замораживания/оттаивания

Образец Циклы З/О Исх.конц. (мг/мл) Конц. (мг/мл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H2-IgG2 0 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 1 4,6 4,66 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 5 4,6 4,57 >99 >99 P1C4-H2-IgG2 10 4,6 4,58 >99 >99

Таблица 26. Стабильность P1C4-H2-IgG4 после замораживания/оттаивания

Образец Циклы З/О Исх.конц. (мг/мл) Конц. (мг/мл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H2-IgG4 0 5,2 5,20 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 1 5,2 5,21 >99 >99 P1C4-H2-IgG4 5 5,2 5,18 >99 98,49 P1C4-H2-IgG4 10 5,2 5,01 96,41 97,88

Таблица 27. Стабильность P1C4-H4-IgG2 после замораживания/оттаивания

Образец Циклы З/О Исх.конц. (мг/мл) Конц. (мг/мл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H4-IgG2 0 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 1 4,6 4,60 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 5 4,6 4,58 >99 >99 P1C4-H4-IgG2 10 4,6 4,52 98,35 >99

Таблица 28. Стабильность P1C4-H4-IgG4 после замораживания/оттаивания

Образец Циклы З/О Исх.конц. (мг/мл) Конц. (мг/мл) Степень извлечения (%) Содержание мономеров по SEC (%) P1C4-H4-IgG4 0 5,5 5,50 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 1 5,5 5,46 >99 >99 P1C4-H4-IgG4 5 5,5 5,53 >99 98,60 P1C4-H4-IgG4 10 5,5 5,37 97,64 98,05

Таблица 29. Стабильность гуманизированных вариантов после замораживания/оттаивания: активность в отношении цАМФ после 5 циклов

IC50 (нМ) h2-IgG2 h2-IgG4 h4-IgG2 h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон (50-150%) 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 После 5 циклов З/О 38 28 43 32

[0348] Чтобы определить стабильность 4 вариантов Fc P1C4 при сдвиге pH, 0,2 мл смолы MabSelect помещают в колонку объемом 10 мл и уравновешивают 10 мл DPBS, pH 7,4. На колонку загружают 150 мкл образца IgG (~5 мг/мл). Колонку промывают 1,6 мл DPBS. Затем IgG элюируют 1,6 мл цитрата натрия (pH ~3,5). Измеряют концнетрацию белка. Затем белок концентрируют до ~3 мг/мл и используют для функционального анализа. Видимый осадок отсутствует. Полученные образцы центрифугируют при 14000 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант переносят в новую пробирку Эппендорфа и измеряют концентрацию белка. Полученный образец проверяют на агрегацию методом SEC и подвергают функциональному тестированию с помощью антагонистического анализа с измерением цАМФ. Профили SEC свидетельствуют о том, что содержание мономеров IgG составляет более 95% после сдвига pH до 3,5. Результаты антагонистического анализа цАМФ, приведенные в таблице 30, демонстрируют, что P1C4-h2-IgG4, P1C4-h4-IgG2 и P1C4-h4-IgG4 являются стабильными при pH 3,5, а измеренные значения IC₅₀ попадают в допустимый диаппазон. P1C4-h2-IgG2 ведет себя при pH 3,5 по-другому и имеет значение IC₅₀ ниже допустимого диапазона. Данный результат согласуется с результатами тестирования pH-стабильности.

Таблица 30. Стабильность гуманизированных вариантов P1C4 при сдвиге pH

IC50 (нМ) P1C4-h2-IgG2 P1C4-h2-IgG4 P1C4-h4-IgG2 P1C4-h4-IgG4 Среднее±SD (Evitra) 69±16 58±5 50±17 61±23 Допустимый диапазон 34,5-103,5 29-87 25-75 30,5-91,5 pH3,5 34 59 55 43,4

Пример 27. CDR-мутагенез PA13R3-P1C4

[0349] Чтобы исследовать роль каждого аминокислотного положения в каждом CDR, проводят сайт-направленный насыщающий мутагенез по всем положениям CDR Fab химерного P1C4. Синтезируют мутагенные праймеры, содержащие NNS или специфический кодон, растворяют их в буфере трис-EDTA и разбавляют до 10 мкМ рабочим раствором. Двадцать пять мкл реакционных смесей ПЦР помещают в 96-луночные планшеты, используя высокоточную ДНК-полимеразу. Полученные продукты ПЦР обрабатывают путем добавления 0,8 мкл DpnI (20 ед/мкл) в каждую лунку при 37°C в течение 5 часов. DpnI-обработанный продукт ПЦР (2 мкл) используют для трансформации 30 мкл Dh5α-компетентных клеток E. coli. ДНК выделяют из трансформантов с использованием miniprep и секвенируют, чтобы идентифицировать желательные мутации. Плазмидную ДНК из желательных клонов используют для трансформации BL21 (CodonPlus)-компетентных клеток E. coli. Отдельные колонии используют для экспрессии белка Fab.

[0350] Чтобы осуществить экспрессию Fab, выбранные колонии помещают в 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл среды SB и культивируют в течение ночи. На следующий день 10 мкл из каждой лунки используют для инокуляции 500 мкл среды ZYM, содержащей 50 мкг/мл канамицина, в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Планшет закрывают воздухопроницаемым покрытием для планшетов и встряхивают в течение 36 часов при 25°C на шейкере при 450 об\мин.

[0351] Чтобы получить образцы для ELISA, 96-луночный планшет с глубокими лунками центрифугируют при 3000 об/мин в настольной центрифуге Beckman в течение 20 минут (~2050 rcf) при 4°C. 100 мкл супернатантов переносят из планшета для экспрессии в планшет для разведения, содержащий 200 мкл PBS, pH 7,4, и тщательно перемешивают.

[0352] Экспрессию Fab измеряют методом ELISA. 96-луночные планшеты ELISA с половинным объемом лунок (Corning, 3690) непосредственно покрывают 2 мкг/мл антитела против his (Sigma H1029 2 мг/мл) в концентрации 50 мкл/лунку в течение ночи при 4°C. Затем планшет промывают 6 раз 150 мкл PBST. Каждую лунку блокируют 175 мкл/лунку 3% молоко/PBS, pH 7,4, в течение 1 часа при 22°C. Затем планшет промывают 6 раз PBST, в каждую лунку добавляют 25 мкл/лунку Fab-содержащей культуральной среды, разведенной в 3 раза PBS, pH 7,4, и инкубируют в течение 1 часа при 22°C. Планшет снова промывают 6 раз PBST и затем добавляют 50 мкл/лунку HRP-меченных антител против Fab человеческих IgG (0293 Sigma), разведенных 1:10000 3% молоком, и инкубируют при 22°C в течение 1 часа. Для развития окраски планшет промывают 6 раз PBST и добавляют 50 мкл/лунку субстрата ™B. Реакцию останавливают путем добавления 50 мкл/лунку 1N HCl и прочитывают OD₄₅₀ на ридере BioTek.

[0353] Для измерения связывания iCAPS методом ELISA 96-луночные планшеты ELISA с половинным объемом лунок покрывают 25 мкл/лунку раствора стрептавидина в PBS, 2 мкг/мл, pH 7,4, в течение ночи при 4°C. Затем планшет промывают 6 раз 150 мкл PBST, переворачивая его в промежутке между промываниями. В планшет добавляют 25 мкл/лунку iCAPS CB1, 5 мкг/мл, и инкубируют в течение 1 часа. Промывают 6 раз PBST, после чего каждую лунку блокируют 175 мкл/лунку 3% молоко/PBS, pH 7,4, в течение 1 часа при 22°C. Затем планшет промывают 6 раз PBST и добавляют в каждую лунку 25 мкл/лунку Fab-содержащей культуральной среды, разбавленной в 3 раза PBS, pH 7,4, и инкубируют в течение 1 часа при 22°C. Планшет снова промывают 6 раз PBST и затем добавляют 50 мкл/лунку антител против человеческих Fab (0293 Sigma), разведенных 1:10000 3% молоком, и инкубируют при 22°C в течение 1 часа. Для развития окраски планшет промывают 6 раз PBST и добавляют 50 мкл/лунку субстрата ™B. Реакцию останавливают путем добавления 50 мкл/лунку 1N HCl и прочитывают OD₄₅₀ на ридере BioTek.

[0354] Каждый клон анализируют с тройными повторами. Чтобы рассчитать относительное связывание с iCAPS, нормализованное по экспрессии Fab, сигнал ELISA, соответствующий связыванию iCAPS, делят на величину экспрессии Fab, определенную методом ELISA, и сравнивают с результатами, полученными от исходного клона. Допустимыми считают изменения, содержащиеся в клонах, которые сохраняют, по меньшей мере, 50% способности исходных клонов специфически связываться с iCAPS. Указанные допустимые изменения приведены в таблице 31 и таблице 32. Последовательности CDR, содержащие указанные мутации, показаны в таблице 34.

Таблица 31. Допустимые мутации в CDR тяжелой цепи PA13R3-P1C4

CDR Положение Допустимые изменения HCDR1 Y1 H, W Y2 F, I, K, N W3 A, F M4 A, E, F, L, N, Q, T, V N5 I, K, L, S, W HCDR2 Q1 D, E I2 A,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W,Y Y3 F P4 A,F,H,K G5 A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y D6 I,L,M,N,P,Q,V,W,Y G7 A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y E8 A,D,M,Q,V,Y T9 A,D,E,F,G,H,I,K,Q,R,S,T,W,Y K10 D,E,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y Y11 C,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,T,W HCDR3 S1 N,T,Y Y5 A,C,F,H,N,S L6 D,E,F,G,H,I,K,M,N,Q,S,W,Y P7 A,E,F,G,H,KL,Q,R,S,V,W,Y Y8 A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,R,S,V

Таблица 32. Допустимые мутации в CDR легкой цепи PA13R3-P1C4

CDR Положение Допустимые изменения LCDR1 S1 A,D,F,L,M,R,T,V,W,Y S2 A,D,E,F,G,H,K,M,N,P,Q,V,W Y3 F L4 F,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,W,Y LCDR2 S1 A,H,N,R T2 A,D,F,G,H,L,M,S,V,W,Y S3 D,F,H,I,K,LN,Q,Y N4 D,E,F,G,H,I,K,Q,R,S,V L5 D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,V,W,Y A6 D,F,G,I,K,Q,R,S,V,W S7 A,D,F,G,H,K,L,R,T,V,W G8 A,F,I,N,P,R,S,T,V,Y LCDR3 H1 A,C,D,E,F,I,K,L,N,R,S,T,V,W,Y Q2 A,C,E,G,N,S,T,V Y3 A,F,G,H,Q,W H4 A,E,G,K,L,N,Q,S,T,V,W R5 A,C,D,E,F,I,L,M,N,Q,V,W,Y S6 A,C,E,F,G,I,M,P,R,T,V,W,Y P7 K,W,Y P8 D,H T9 D,F,G,I,L,M,N,Q,R,S,V,Y

Пример 28. Иммуноокрашивание CB1 в образцах ткани печени антителом P1C4-h2-IgG4, конъюгированным с HRP.

[0355] P1C4-h2-IgG4 антитело метят с помощью набора для конъюгации Lightning-Link HRP (Innova Bioscience, 701-0010) в соответствии с инструкциями производителя. Обработанные парафильмом срезы образцов печени человека обрабатывают растворителем Clearene (Leica Biosystems) в течение 5 минут и затем этанолом в уменьшающихся концентрациях, до конечной концентрации 50%. Затем срезы помещают в метанол/пероксид водорода на 15 минут, после чего их быстро промывают PBS. После этого срезы обрабатывают раствором лимонной кислоты в физрастворе (Vector, H-3300), нагревая для извлечения антигена, и помещают в предварительно нагретый PBS (350 мл) и трипсин (2,45 мл) на водяной бане при 37°C в течение 20 минут. После промывания PBS срезы блокируют казеином (Vector, SP-5020) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляют разведенное 1:100 HRP-конъюгированное антитело P1C4-h2-IgG4 или изотипическое контрольное антитело и инкубируют в течение ночи при 4°C. После инкубации срезы промывают PBS и обрабатывают 3 каплями Vector ABC Tertiary (Vector, PK-7100) при 22°C в течение 45 минут. Срезы 3 раза промывают PBS и добавляют смесь DAB (Vector, SK-4100), инкубируют в течение 5-10 минут и снова быстро промывают PBS. Затем срезы подвергают контрастному окрашиванию гематоксилином Майера (TCS Biosciences, HS315) в течение 1 минуты с последующей обработкой водой, возрастающими концентрациями этанола (от 50% до 100%), 2 циклами растворителя Clearene, после чего их заключают в Pertex (Leica Biosystems).

[0356] Результаты демонстрируют наличие положительного CB1-специфичного окрашивания макрофагов, гепатоцитов и миофибробластов печени в образцах, соответствующих раннему NASH (фигура 25, левая панель), фиброзу NASH (фигура 25, средняя панель) и позднему фиброзу (фигура 25, правая панель). При использовании изотипических контрольных иррелевантных антител (фигура 26) или образцов нормальной ткани (фигура 27) окрашивание не наблюдается.

Пример 29. Измерение влияния антитела против CB1 на генетические маркеры фиброза в первичных звездчатых клетках печени человека

[0357] Первичные звездчатые клетки печени (HSCs) выделяют из ткани печени, полученной от 3 здоровых доноров. После 2-3 пассажей в DMEM+10% FBS клетки активируют путем адгезии на пластике, помещают в среду, содержащую 0,5% сыворотки, и держат в ней в течение ночи. Затем клетки обрабатывают в течение 6 или 24 часов римонабантом (антагонист CB1), P1C4-h2-IgG4 и нефункциональным контрольным антителом в разных концентрациях. Ингибирование профиля экспрессии профибротического гена, включающего в себя экспрессию α-SMA, проколлагена A1(I), TIMP1 и TGFβ, измеряют методом ОТ-ПЦР, результаты приводят в виде графиков.

[0358] Результаты демонстрируют значительное уменьшение экспрессии проколлагена A1(I) после обработки HSC антителом P1C4-h2, но не нефункциональным контрольным антителом и не PBS (фигура 28). Также наблюдается значительное уменьшение экспрессии TGFβ (фигура 29) и TIMP1 (фигура 30) по сравнению с PBS и нефункциональным контрольным антителом. Кроме того, наблюдается значительное уменьшение экспрессии α-SMA в клетках, обработанных P1C4-IgG1 или IgG4 по сравнению с клетками, обработанными PBS или нефункциональным связывающим соединением (фигура 31).

Пример 30: Количественное определение антитела против CB1 в цереброспинальной жидкости (CSF) яванских макак

[0359] Яванским макакам (2 самца и 2 самки/группу) вводят P1C4-h2-IgG4 в соответствии со схемой, приведенной в таблице 33, и в указанные моменты времени собирают CSF. Количество P1C4-h2-IgG4 определяют методом ELISA, используя 96-луночные планшеты, покрытые антителом против ID в концентрации 1 мкг/мл, с последующим добавлением CSF и детекцией с использованием HRP-конъюгированного антитела против IgG (Abcam) и окрашивающего реагента.

[0360] Как показано в таблице 33, антитело детектируют только на очень низком уровне, или совсем не детектируют. В группе, получающей самую высокую дозу, в CSF детектируют менее 0,1% от введенного количества, что свидетельствует об очень низком проникновении антитела в ЦНС.

Таблица 33. Количественное определение антитела против CB1 в CSF яванских макак

Группа Время отбора образцов Концентрация (нг/мл) 0,3 мг/кг в.в. До введения дозы BLQ BLQ BLQ BLQ Через 2 ч после введения 1^ой дозы (день 1) BLQ BLQ BLQ BLQ Через 2 ч после введения 2^ой дозы (день 8) BLQ BLQ 35 BLQ Через 2 ч после введения 3^ей дозы (день 15) BLQ BLQ BLQ BLQ 3 мг/кг п.к. До введения дозы BLQ BLQ BLQ BLQ Через 2 ч после введения 1^ой дозы (день 1), 2^ой дозы (день 8) и 3^ей дозы (день 15) BLQ BLQ BLQ BLQ 3 мг/кг в.в. До введения дозы BLQ BLQ BLQ BLQ Через 2 ч после введения 1^ой дозы (день 1) BLQ BLQ 37 BLQ Через 2 ч после введения 2^ой дозы (день 8) 15 BLQ BLQ BLQ Через 2 ч после введения 3^ей дозы (день 15) 21 BLQ BLQ BLQ 40 мг/кг в.в. До введения дозы BLQ BLQ NA NA Через 9 ч после введения дозы 86 136* NA NA

BLQ=ниже предела количественного определения

Пример 31. Измерение влияния антитела против CB1 на метаболические и сердечнососудистые факторы у яванских макак

[0361] Программа RIO демонстрирует кардиометаболические эффекты лечения римонабантом с использованием нескольких факторов. См., например, Pi-Sunyeret al., 2006, J Am Coll Cardio, l47:362A. Также определяют влияние описанных здесь антител против CB1, как таковых, на аналогичные кардиометаболические факторы.

[0362] Страдающим от ожирения яванским макакам и макакам-резус еженедельно п.к. вводят антитело против CB1 P1C4-h2-IgG4 в дозе 3 мг/кг или 0,3 мг/кг. В качестве отрицательного контроля ряду приматов вводят либо (1) один фармацевтический носитель; либо (2) контрольное антитело, которое заведомо не связывает CB1. Наблюдают влияние на потребление пищи, массу тела, чувствительность к инсулину, уровни триглицеридов и другие факторы сердечнососудистого риска у приматов.

[0363] У приматов, получающих антитело против CB1 P1C4-h2-IgG4 в дозе 3 мг/кг или 0,3 мг/кг, наблюдается снижение уровней триглицеридов и других факторов сердечнососудистого риска. У приматов, получающих антитело против CB1 P1C4-h2-IgG4 в дозе 3 мг/кг или 0,3 мг/кг, также наблюдается улучшение чувствительности к инсулину. У приматов, которым вводят либо контрольное антитело, либо только носитель, отсутствуют улучшения каких-либо из указанных факторов.

Специалисты в данной области могут осуществлять многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения, описанного с использованием приведенных выше иллюстративных примеров. Следовательно, к настоящему изобретению можно применять лишь ограничения, накладываемые прилагающейся формулой изобретения. Все цитирующиеся здесь ссылки включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте и во всех целях.

Таблица 34. Последовательности допустимых мутаций в CDR PA13R3-P1C4

Описание исходной последовательности Последовательность Мутация SEQ ID NO Последовательность CDR1 тяжелой цепи YYWMN 352 HYWMN Y1→H 443 IYWMN Y1→I 444 WYWMN Y1→W 445 YFWMN Y2→F 446 YKWMN Y2→K 447 YNWMN Y2→N 448 YYAMN W3→A 449 YYFMN W3→F 450 YYWAN M4→A 451 YYWEN M4→E 452 YYWFN M4→F 453 YYWLN M4→L 454 YYWNN M4→N 455 YYWQN M4→Q 456 YYWTN M4→T 457 YYWVN M4→V 458 YYWMI N5→I 459 YYWMK N5→K 460 YYWML N5→L 461 YYWMS N5→S 462 YYWMW N5→W 463 Последовательность CDR2 тяжелой цепи QIYPGDGETKY 353 DIYPGDGETKY Q1→D 464 EIYPGDGETKY Q1→E 465 QAYPGDGETKY I2→A 466 QDYPGDGETKY I2→D 467 QEYPGDGETKY I2→E 468 QFYPGDGETKY I2→F 469 QGYPGDGETKY I2→G 470 QHYPGDGETKY I2→H 471 QKYPGDGETKY I2→K 472 QLYPGDGETKY I2→L 473 QNYPGDGETKY I2→N 474 QQYPGDGETKY I2→Q 475 QRYPGDGETKY I2→R 476 QSYPGDGETKY I2→S 477 QTYPGDGETKY I2→T 478 QWYPGDGETKY I2→W 479 QYYPGDGETKY I2→Y 480 QIFPGDGETKY Y3→F 481 QIYAGDGETKY P4→A 482 QIYFGDGETKY P4→F 483 QIYHGDGETKY P4→H 484 QIYKGDGETKY P4→K 485 QIYPADGETKY G5→A 486 QIYPCDGETKY G5→C 487 QIYPDDGETKY G5→D 488 QIYPEDGETKY G5→E 489 QIYPFDGETKY G5→F 490 QIYPHDGETKY G5→H 491 QIYPIDGETKY G5→I 492 QIYPKDGETKY G5→K 493 QIYPLDGETKY G5→L 494 QIYPMDGETKY G5→M 495 QIYPQDGETKY G5→Q 496 QIYPRDGETKY G5→R 497 QIYPSDGETKY G5→S 498 QIYPTDGETKY G5→T 499 QIYPVDGETKY G5→V 500 QIYPWDGETKY G5→W 501 QIYPYDGETKY G5→Y 502 QIYPGIGETKY D6→I 503 QIYPGLGETKY D6→L 504 QIYPGMGETKY D6→M 505 QIYPGNGETKY D6→N 506 QIYPGPGETKY D6→P 507 QIYPGQGETKY D6→Q 508 QIYPGVGETKY D6→V 509 QIYPGWGETKY D6→W 510 QIYPGYGETKY D6→Y 511 QIYPGDAETKY G7→A 512 QIYPGDDETKY G7→D 513 QIYPGDEETKY G7→E 514 QIYPGDFETKY G7→F 515 QIYPGDHETKY G7→H 516 QIYPGDIETKY G7→I 517 QIYPGDKETKY G7→K 518 QIYPGDLETKY G7→L 519 QIYPGDMETKY G7→M 520 QIYPGDNETKY G7→N 521 QIYPGDPETKY G7→P 522 QIYPGDQETKY G7→Q 523 QIYPGDRETKY G7→R 524 QIYPGDSETKY G7→S 525 QIYPGDTETKY G7→T 526 QIYPGDVETKY G7→V 527 QIYPGDYETKY G7→Y 528 QIYPGDGATKY E8→A 529 QIYPGDGDTKY E8→D 530 QIYPGDGMTKY E8→M 531 QIYPGDGQTKY E8→Q 532 QIYPGDGVTKY E8→V 533 QIYPGDGYTKY E8→Y 534 QIYPGDGEAKY T9→A 535 QIYPGDGEDKY T9→D 536 QIYPGDGEEKY T9→E 537 QIYPGDGEFKY T9→F 538 QIYPGDGEGKY T9→G 539 QIYPGDGEHKY T9→H 540 QIYPGDGEIKY T9→I 541 QIYPGDGEKKY T9→K 542 QIYPGDGEQKY T9→Q 543 QIYPGDGERKY T9→R 544 QIYPGDGESKY T9→S 545 QIYPGDGETKY T9→T 546 QIYPGDGEVKY T9→W 547 QIYPGDGEYKY T9→Y 548 QIYPGDGETDY K10→D 549 QIYPGDGETEY K10→E 550 QIYPGDGETHY K10→H 551 QIYPGDGETIY K10→I 552 QIYPGDGETLY K10→L 553 QIYPGDGE™Y K10→M 554 QIYPGDGETNY K10→N 555 QIYPGDGETPY K10→P 556 QIYPGDGETQY K10→Q 557 QIYPGDGETRY K10→R 558 QIYPGDGETSY K10→S 559 QIYPGDGETTY K10→T 560 QIYPGDGETVY K10→V 561 QIYPGDGETWY K10→W 562 QIYPGDGETYY K10→Y 563 QIYPGDGETKC Y11→C 564 QIYPGDGETKD Y11→D 565 QIYPGDGETKE Y11→E 566 QIYPGDGETKF Y11→F 567 QIYPGDGETKG Y11→G 568 QIYPGDGETKH Y11→H 569 QIYPGDGETKI Y11→I 570 QIYPGDGETKL Y11→L 571 QIYPGDGETKN Y11→N 572 QIYPGDGETKP Y11→P 573 QIYPGDGETKQ Y11→Q 574 QIYPGDGETKR Y11→R 575 QIYPGDGETKT Y11→T 576 QIYPGDGETKW Y11→W 577 Последовательность CDR3 тяжелой цепи SHGNYLPY 354 NHGNYLPY S1→N 578 THGNYLPY S1→T 579 YHGNYLPY S1→Y 580 SHGNALPY Y5→A 581 SHGNCLPY Y5→C 582 SHGNFLPY Y5→F 583 SHGNHLPY Y5→H 584 SHGNNLPY Y5→N 585 SHGNSLPY Y5→S 586 SHGNYDPY L6→D 587 SHGNYEPY L6→E 588 SHGNYFPY L6→F 589 SHGNYGPY L6→G 590 SHGNYHPY L6→H 591 SHGNYIPY L6→I 592 SHGNYKPY L6→K 593 SHGNYMPY L6→M 594 SHGNYNPY L6→N 595 SHGNYQPY L6→Q 596 SHGNYSPY L6→S 597 SHGNYWPY L6→W 598 SHGNYYPY L6→Y 599 SHGNYLAY P7→A 600 SHGNYLEY P7→E 601 SHGNYLFY P7→F 602 SHGNYLGY P7→G 603 SHGNYLHY P7→H 604 SHGNYLKY P7→K 605 SHGNYLLY P7→L 606 SHGNYLQY P7→Q 607 SHGNYLRY P7→R 608 SHGNYLSY P7→S 609 SHGNYLVY P7→V 610 SHGNYLWY P7→W 611 SHGNYLYY P7→Y 612 SHGNYLPA Y8→A 613 SHGNYLPD Y8→D 614 SHGNYLPE Y8→E 615 SHGNYLPF Y8→F 616 SHGNYLPG Y8→G 617 SHGNYLPH Y8→H 618 SHGNYLPI Y8→I 619 SHGNYLPK Y8→K 620 SHGNYLPL Y8→L 621 SHGNYLPM Y8→M 622 SHGNYLPR Y8→R 623 SHGNYLPS Y8→S 624 SHGNYLPV Y8→V 625 Последовательность CDR1 легкой цепи SSYLH 355 ASYLH S1→A 626 DSYLH S1→D 627 FSYLH S1→F 628 LSYLH S1→L 629 MSYLH S1→M 630 RSYLH S1→R 631 TSYLH S1→T 632 VSYLH S1→V 633 WSYLH S1→W 634 YSYLH S1→Y 635 SAYLH S2→A 636 SDYLH S2→D 637 SEYLH S2→E 638 SFYLH S2→F 639 SGYLH S2→G 640 SHYLH S2→H 641 SKYLH S2→K 642 SMYLH S2→M 643 SNYLH S2→N 644 SPYLH S2→P 645 SQYLH S2→Q 646 SVYLH S2→V 647 SWYLH S2→W 648 SSFLH Y3→F 649 SSYFH L4→F 650 SSYHH L4→H 651 SSYIH L4→I 652 SSYKH L4→K 653 SSYNH L4→N 654 SSYPH L4→P 655 SSYQH L4→Q 656 SSYRH L4→R 657 SSYSH L4→S 658 SSYTH L4→T 659 SSYWH L4→W 660 SSYYH L4→Y 661 Последовательность CDR2 легкой цепи STSNLAS 356 ATSNLAS S1→A 662 HTSNLAS S1→H 663 NTSNLAS S1→N 664 RTSNLAS S1→R 665 SASNLAS T2→A 666 SDSNLAS T2→D 667 SFSNLAS T2→F 668 SGSNLAS T2→G 669 SHSNLAS T2→H 670 SLSNLAS T2→L 671 SMSNLAS T2→M 672 SSSNLAS T2→S 673 SVSNLAS T2→V 674 SWSNLAS T2→W 675 SYSNLAS T2→Y 676 STDNLAS S3→D 677 STFNLAS S3→F 678 STHNLAS S3→H 679 STINLAS S3→I 680 STKNLAS S3→K 681 STLNLAS S3→L 682 STNNLAS S3→N 683 STQNLAS S3→Q 684 STYNLAS S3→Y 685 STSDLAS N4→D 686 STSELAS N4→E 687 STSFLAS N4→F 688 STSGLAS N4→G 689 STSHLAS N4→H 690 STSILAS N4→I 691 STSKLAS N4→K 692 STSQLAS N4→Q 693 STSRLAS N4→R 694 STSSLAS N4→S 695 STSVLAS N4→V 696 STSNDAS L5→D 697 STSNEAS L5→E 698 STSNFAS L5→F 699 STSNGAS L5→G 700 STSNHAS L5→H 701 STSNIAS L5→I 702 STSNKAS L5→K 703 STSNMAS L5→M 704 STSNNAS L5→N 705 STSNPAS L5→P 706 STSNQAS L5→Q 707 STSNVAS L5→V 708 STSNWAS L5→W 709 STSNYAS L5→Y 710 STSNLDS A6→D 711 STSNLFS A6→F 712 STSNLGS A6→G 713 STSNLIS A6→I 714 STSNLKS A6→K 715 STSNLQS A6→Q 716 STSNLRS A6→R 717 STSNLSS A6→S 718 STSNLVS A6→V 719 STSNLWS A6→W 720 STSNLAA S7→A 721 STSNLAD S7→D 722 STSNLAF S7→F 723 STSNLAG S7→G 724 STSNLAH S7→H 725 STSNLAK S7→K 726 STSNLAL S7→L 727 STSNLAR S7→R 728 STSNLAT S7→T 729 STSNLAV S7→V 730 STSNLAW S7→W 731 STSNLASG 732 STSNLASA G8→A 733 STSNLASF G8→F 734 STSNLASI G8→I 735 STSNLASN G8→N 736 STSNLASP G8→P 737 STSNLASR G8→R 738 STSNLASS G8→S 739 STSNLAST G8→T 740 STSNLASV G8→V 741 STSNLASY G8→Y 742 Последовательность CDR3 легкой цепи HQYHRSPPTF 357 AQYHRSPPTF H1→A 743 CQYHRSPPTF H1→C 744 DQYHRSPPTF H1→D 745 EQYHRSPPTF H1→E 746 FQYHRSPPTF H1→F 747 IQYHRSPPTF H1→I 748 KQYHRSPPTF H1→K 749 LQYHRSPPTF H1→L 750 NQYHRSPPTF H1→N 751 RQYHRSPPTF H1→R 752 SQYHRSPPTF H1→S 753 TQYHRSPPTF H1→T 754 VQYHRSPPTF H1→V 755 WQYHRSPPTF H1→W 756 YQYHRSPPTF H1→Y 757 HAYHRSPPTF Q2→A 758 HCYHRSPPTF Q2→C 759 HEYHRSPPTF Q2→E 760 HGYHRSPPTF Q2→G 761 HNYHRSPPTF Q2→N 762 HSYHRSPPTF Q2→S 763 HTYHRSPPTF Q2→T 764 HVYHRSPPTF Q2→V 765 HQAHRSPPTF Y3→A 766 HQFHRSPPTF Y3→F 767 HQGHRSPPTF Y3→G 768 HQHHRSPPTF Y3→H 769 HQQHRSPPTF Y3→Q 770 HQWHRSPPTF Y3→W 771 HQYARSPPTF H4→A 772 HQYERSPPTF H4→E 773 HQYGRSPPTF H4→G 774 HQYKRSPPTF H4→K 775 HQYLRSPPTF H4→L 776 HQYNRSPPTF H4→N 777 HQYQRSPPTF H4→Q 778 HQYSRSPPTF H4→S 779 HQYTRSPPTF H4→T 780 HQYVRSPPTF H4→V 781 HQYWRSPPTF H4→W 782 HQYHASPPTF R5→A 783 HQYHCSPPTF R5→C 784 HQYHDSPPTF R5→D 785 HQYHESPPTF R5→E 786 HQYHFSPPTF R5→F 787 HQYHISPPTF R5→I 788 HQYHLSPPTF R5→L 789 HQYHMSPPTF R5→M 790 HQYHNSPPTF R5→N 791 HQYHQSPPTF R5→Q 792 HQYHVSPPTF R5→V 793 HQYHWSPPTF R5→W 794 HQYHYSPPTF R5→Y 795 HQYHRAPPTF S6→A 796 HQYHRCPPTF S6→C 797 HQYHREPPTF S6→E 798 HQYHRFPPTF S6→F 799 HQYHRGPPTF S6→G 800 HQYHRIPPTF S6→I 801 HQYHRMPPTF S6→M 802 HQYHRPPPTF S6→P 803 HQYHRRPPTF S6→R 804 HQYHRTPPTF S6→T 805 HQYHRVPPTF S6→V 806 HQYHRWPPTF S6→W 807 HQYHRYPPTF S6→Y 808 HQYHRSKPTF P7→K 809 HQYHRSWPTF P7→W 810 HQYHRSYPTF P7→Y 811 HQYHRSPDTF P8→D 812 HQYHRSPHTF P8→H 813 HQYHRSPPDF T9→D 814 HQYHRSPPFF T9→F 815 HQYHRSPPGF T9→G 816 HQYHRSPPIF T9→I 817 HQYHRSPPLF T9→L 818 HQYHRSPPMF T9→M 819 HQYHRSPPNF T9→N 820 HQYHRSPPQF T9→Q 821 HQYHRSPPRF T9→R 822 HQYHRSPPSF T9→S 823 HQYHRSPPVF T9→V 824 HQYHRSPPYF T9→Y 825

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> RuiYi, Inc.

KRETZ-ROMMEL, Anke

SHI, Lei

FERRINI, Roger

YANG, Teddy

Xu, Fei

CAMPION, Brian

<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ КАННАБИНОИДНЫМ РЕЦЕПТОРОМ 1 (CB1)

<130> 15-343-WO3

<150> PCT/CN2014/074199

<151> 2014-03-27

<150> PCT/CN2014/081797

<151> 2014-07-08

<160> 827

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA13R3-P1C4

<400> 1

gaggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgaattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga aactaagtac 180

aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctat 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcccat 300

ggtaactacc ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 2

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA13R3-P1C4

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA13R3-P1C4

<400> 3

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 4

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA13R3-P1C4

<400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 5

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA13R3-P1C4

<400> 5

gatattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacc cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 6

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA13R3-P1C4

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 7

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA13R3-P1C4

<400> 7

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 8

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA13R3-P1C4

<400> 8

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 9

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи 36E12B6C2

<400> 9

caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgaattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttcagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcacctca ccagcctaac gtctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgggg 300

ggtaacccct ttgctttctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 10

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи 36E12B6C2

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 11

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи 36E12B6C2

<400> 11

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 12

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи 36E12B6C2

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 13

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи 36E12B6C2

<400> 13

gatatccaga tgacacagac ttcatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

ttcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcacatca 180

aggttccgtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagacgttg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttccgtggtc gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 14

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи 36E12B6C2

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Thr Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи 36E12B6C2

<400> 15

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 16

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи 36E12B6C2

<400> 16

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 17

<211> 351

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 17

caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgaattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttcagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcacctca ccagcctaac gtctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgggg 300

ggtaacccct ttgctttctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 18

<211> 117

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Glu Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Asn Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 19

<211> 993

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 19

gctaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 240

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 300

gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 360

ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 420

atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 480

tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 540

agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 600

gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 660

aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 720

atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 780

tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840

ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900

gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960

actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tga 993

<210> 20

<211> 330

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 20

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 21

<211> 321

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 21

gatatccaga tgacacagac ttcatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

ttcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcacatca 180

aggttccgtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagacgttg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttccgtggtc gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 22

<211> 107

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Thr Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 324

<212> ДНК

<213> Mus sp.

<400> 23

cgggcagatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324

<210> 24

<211> 107

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 24

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 25

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 25

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt tattactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

agtggaaggt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

attcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 26

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 26

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 27

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 27

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 28

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 28

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 29

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 29

gacattgttc tcaaccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgct cacgttcggt 300

gctgggacca aactggaaat aaaa 324

<210> 30

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 30

Asp Ile Val Leu Asn Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 31

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 31

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 32

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3- P4B5

<400> 32

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 33

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 33

gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtagctatt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 34

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 34

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 35

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 35

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 36

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 37

<211> 333

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 37

gatattgagc tggcccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag cggcagtggg tctagggcag acttcaccct caccattgat 240

cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtctac aatatgctag ttctcctcct 300

acgttcggtg ctgggaccaa actggaaata aaa 333

<210> 38

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 38

Asp Ile Glu Leu Ala Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr

20 25 30

Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala

85 90 95

Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 39

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 40

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P2D3

<400> 40

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 41

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 41

gaggtccagc ttcagcaatc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggctt tgcattcagt aactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaacttc 180

aatggaaagt tcaagggtag agccatactg actgcagaca tatcctccaa cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 42

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 42

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Phe Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Ile Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 43

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 43

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 44

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 45

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 45

caaattgtgt tgacacagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgct cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 46

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 46

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 47

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 47

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 48

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P4B1

<400> 48

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 49

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 49

gaggtccagc ttcagcaatc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag tacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 50

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 50

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 51

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 51

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 52

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 52

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 53

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 53

caaattgtac tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttcccccct cgcgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 54

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 54

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Leu Ala Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 55

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 55

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 56

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P6B12

<400> 56

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 57

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 57

gaggttcagc ttcagcaatc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggctt tgcattcagt aactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cccggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaacttc 180

aatggaaagt tcaagggtag agccatactg actgcagaca tatcctccaa cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 58

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 58

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Phe Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Ile Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 59

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 59

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 60

<211> 330

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 61

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 61

gatattgtgc taactcagtc tccagcaatc atgtccgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tacactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacctcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagcatcatc gttccccacc cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 62

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 62

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln His His Arg Ser Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 63

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 63

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 64

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P6G7

<400> 64

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 65

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 65

gaggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt tactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatgggaagt tcaagggtaa agccacactg actgtagaca aatcctccag tacagcctac 240

atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 66

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 66

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Gly Asn Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 67

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 67

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtca 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 68

<211> 204

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 68

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

195 200

<210> 69

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 69

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60

atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtggagta gttacccact cacgttcggt 300

gctgggacca agctggagct gaaa 324

<210> 70

<211> 108

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок легкой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 70

Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 71

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 71

cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagcttgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttaa 324

<210> 72

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константный участок легкой цепи PA2LR3-P1G6

<400> 72

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 73

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1H4

<400> 73

gaggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg cttctggcta tgtattcggt aactactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180

aatgggaagt tcaaaggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgcac 300

ggtaactatt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 74

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельный участок тяжелой цепи PA2LR3-P1H4

<400> 74

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15