Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может найти применение при лечении тромбозов.
Тромболитические препараты - естественные патогенетические средства лечения тромбозов, осложняющих течение как сердечно-сосудистых, так и инфекционно-аллергических заболеваний. При опасных сосудистых заболеваниях - инфаркте миокарда, инсульте - применение их обязательно, если препараты есть в клинике и не противопоказаны пациенту. Для менее тяжелых, но также довольно распространенных ситуаций тромбоза, например при тромбофлебите, тромболитическая терапия как метод консервативного лечения используется не всегда, во-первых, из-за хорошо известных ее осложнений (кровотечения, ретромбозы), во-вторых, из-за высокой стоимости лечения. Поэтому актуальным остается как создание недорогих тромболитических средств, так и поиск способов нейтрализации их опасных побочных действий.
Известен штамм Arthrobotrys longa Mecht 1 - продуцент комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена (Авторское свидетельство СССР 745943, С 12 N 1/14, 1980 [1]).
Однако фибринолитическая и тромболитическая активность данного известного комплекса ферментов, выделенного из культуральной жидкости данного известного штамма гриба, недостаточно высокая.
Известно применение лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства, вызывающего растворение экспериментальных тромбов у лабораторных животных при его внутривенном введении (Г.В. Андреенко и др. ж. Гематология и трансфузиология, 1983, вып.12, стр.48-50 [2]).
Однако наружное применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства лечения тромбозов не описано.
Использование фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного тромболитического средства для лечения тромбозов при тромбофлебитах перспективно, так как при наружном применении уменьшается риск развития осложнений, связанных с внутривенным введением любого лекарственного средства (пирогенное, аллергическое действие, заражение гепатитом, вирусом СПИДа). Кроме того, при наружном применении могут быть смягчены специфические побочные эффекты тромболитической терапии - ретромбозы и кровотечения.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение нового штамма - продуцента лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов с повышенной активностью, упрощение лечения тромбозов и снижение нежелательных последствий лечения за счет наружного применения лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена.
Указанный технический результат достигается тем, что получен новый штамм - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена: гриб Arthrobotrys longa Mecht 2. Впервые рекомендовано применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного средства лечения тромбозов.
Данный технический результат достигается также тем, что в способе лечения тромбозов, включающем использование тромболитических ферментных препаратов, препараты используют путем их нанесения на кожные покровы. При этом в качестве тромболитического препарата используют лонголитин. Его рекомендуют использовать в виде раствора в глицерине преимущественно с концентрацией 3-100 мг/мл.
На фиг. 1 представлена динамика биохимических показателей гемостаза и фибринолиза (%-ное отношение к фоновым значениям) при применении препарата лонголитина и после его отмены.
На фиг.2 представлено изменение (%) биохимических показателей гемостаза и фибринолиза через 7 дней после отмены лонголитина.
Ниже приведены примеры реализации изобретения.
Пример 1. Мицелий штамма Arthrobotrys longa Mecht 2 в течение 20 лет инкубировали на агаризованной среде Чапека следующего состава, г/л: Na2NO3 29-31; KH2PO4 0,9-1,1; KCl 0,4-0,5; Mg2SO4 0,4-0,6; сахароза 24-26; вода водопроводная - остальное. По истечении 20 лет селекционных работ на данной среде был получен новый штамм Arthrobotrys longa Mecht 2, депонированный в коллекции лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета.
Полученный штамм является плесневым грибом и относится к классу Fungi Imperfecti, род Arthrobotrys.
На агаризованной среде Чапека указанного выше состава новый штамм образует широкорастущие ворсистые колонии, белые, с возрастом розовеющие. Макроконидиальное спороношение отсутствует. Наблюдается обильное образование микроконидий на вегетативных гифах. Обратная сторона колонии бесцветная или желтоватая. На сусло-агаре (5o БЛГ, агар-агар - 20 г/л) в центре ворсистой белой, розовеющей с возрастом колонии образуются более высокие выросты-столоны, представляющие слабоветвящиеся мицелиальные тяжи. Обратная сторона колонии с радиальными складками, коричневатая.
Культуральные признаки. При росте в погруженной культуре в колбах на качалке, имеющей 240 об/мин, при 25-26oС в течение 144-168 часов на сусле (4o БЛГ) и на синтетической среде, содержащей в г/л: КH2PО4 4,2-4,4; NaNO3 18-20; KNO3 2,2-2,8; сахарозу 20-40; воду водопроводную - остальное, наблюдается образование одноклеточных микроконидий величиной в 3-5 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия. Культуральная жидкость имеет вид разведенного молока, плохо фильтруется, пигментов во внешнюю среду не выделяет.
Описание культивирования. Споры с агаризованной среды Чапека - глубинное культивирование в 2 этапа: выращивание посевного мицелия и проведение собственно биосинтеза комплекса ферментов.
Посевной мицелий выращивали в течение 36-48 ч на среде, содержащей, г/л: КН2PO4 2,0-2,4; NaNO3 9,3-9,8; KNO3 1,15-1,35; сахарозу 18-20; воду водопроводную - остальное. Биосинтез проводили в течение 144-148 ч на среде того же состава с более концентрированным (в 2 раза) содержанием исходных компонентов в качалочных колбах объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке с 240 об/мин при температуре 25-26oС.
Фибринолитические и тромболитические ферменты образуются в глубинных условиях при росте на качалке с 240 об/мин на синтетической среде при температуре 25-26oС в течение 144-168 ч в количестве 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Новый штамм сохраняет специфическую способность к активации плазминогена (для сравнения: исходный штамм Arthrobotrys Mecht 1 при культивировании в этих же условиях накапливает комплекс ферментов в количестве 0,75 г сырца с 1 л культуральной жидкости).
Пример 2. Препарат лонголитина получили путем осаждения из культуральной жидкости Arthrobotrys longa Merch 2 2-кратным объемом охлажденного ацетона. Полученный препарат лонголитина в виде раствора в глицерине наносили крысам на освобожденный участок кожи внутренней поверхности бедра размером около 10 мм • 10 мм и легким массажем втирали в ткань ежедневно в течение 10 дней. Каждое животное получало однократно примерно 0,16 мл раствора. Кровь для исследований брали из яремной вены до опыта, через 7, 10 дней от начала процедуры и спустя неделю после отмены препарата. Использовали две дозы: 5 мг/мл (активность 25 усл. ед.) и 30 мг/мл (активность 60 усл. ед.). Контрольным животным на кожу наносили глицерин. В крови определяли биохимические параметры свертывания крови и фибринолиза: концентрацию фибриногена по Лазару, время рекальцификации, время лизиса эуглобулиновой фракции по Ниверовскому, фибринолитическую активность на стандартных фибриновых пластинках по Аструпу, уровень ингибиторов фибринолиза - α2-антиплазмина по Нордо и антиактиватора по Беннет.
Результаты представлены в таблице и на фиг.1 и фиг.2. Из данных, приведенных в таблице и на фиг.1, видно, что после 7 дней ежедневного втирания препарата в кожный лоскут он проникает через мягкие ткани в общий кровоток. В крови опытных крыс развивается незначительно выраженное состояние гиперкоагуляции и депрессии фибринолиза, регистрируемое укорочением времени рекальцификации, увеличением концентрации фибриногена, снижением фибринолитической активности, измеренной как на фибриновых пластинках, так и по времени лизиса эуглобулиновой фракции, увеличением уровня α2-антиплазмина. Наоборот, состояние контрольных животных к 7 дню эксперимента можно охарактеризовать как стабильное с некоторой тенденцией к гиперкоагуляции.
Таким образом, в основном разнонаправленные сдвиги изучаемых показателей в опытной и контрольной группах экспериментальных животных свидетельствуют об активном воздействии препарата лонголитина на систему гемостаза и фибринолиза при нанесении его на кожный лоскут. Лонголитин проникает сквозь эпидермис в субэпидермальное пространство, распространяется по системе микроциркуляции и, действуя на систему гемостаза и фибринолиза, вызывает их ответную реакцию, регистрируемую в системном кровотоке в виде слабовыраженной гиперкоагуляции и подавления фибринолиза. Такой ответ типичен для фибринолитических и протеолитических ферментов при попадании их в кровоток и представляет регуляторные противодействия организма агрессивной протеолитической активности с возможным развитием как тромбоза, так и кровоточивости.
Пример 3. Наркотизированным крысам в изолированный лигатурой участок вены вводили раствор тромбина, что приводило к образованию тромбов внутри сегмента V. Jugularis. На участок вены с тромбом наносили раствор лонголитина в глицерине. Наблюдали полное растворение тромбов в 85% случаев, частичное - в 9%. В 6% случаев тромбы не растворялись. Время лизиса тромба составляло от 30 мин до 4 ч, что зависело от их размеров, времени стабилизации и активности препарата. Контрольные тромбы не растворялись в течение всего опыта (7-8 ч).
Таким образом, при реализации изобретения, используя новый штамм - продуцент лонголитина - путем его поверхностного применения, можно лечить тромбозы, исключая отрицательные последствия лечения, наблюдающиеся при внутривенном введении тромболитических ферментов. Лонголитин - это первый тромболитический препарат, впервые успешно применный поверхностно при лечении тромбозов.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ШТАММ ГРИБА ARTHROBOTRYS LONGA ВКПМ F-942 - ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА - КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ | 2006 |
|
RU2332450C1 |
Штамм Sarocladium kiliense - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и способ получения лонголитина | 2019 |
|
RU2716984C1 |
Штамм N1-продуцент фибринолитических ферментов | 1978 |
|
SU745943A1 |
ШТАММ SAROCLADIUM STRICTUM - ПРОДУЦЕНТ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С АКТИВАТОРНОЙ К ПЛАЗМИНОГЕНУ АКТИВНОСТЬЮ | 2019 |
|
RU2728456C1 |
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОТРОМБОЗНОГО ГЕЛЯ | 2006 |
|
RU2322232C1 |
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКИМ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ | 2002 |
|
RU2216348C1 |
Штамм базидиального гриба CopRINUS DомеSтIсUS (FR)GRaY ВКМ F 2459 Д - продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов. | 1983 |
|
SU1137762A1 |
ПРОЛОНГИРОВАННОЕ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1995 |
|
RU2121362C1 |
ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА РОДА Coprinus | 2010 |
|
RU2435848C1 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРОМИЦЕТОВ | 2020 |
|
RU2788697C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в медицине. Сущность изобретения: получен новый штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht 2 - продуцент лонголитина - комплекса тромболитических и фибринолитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена. Предложено наружное применение лонголитина при лечении тромбозов путем нанесения его на кожные покровы в виде раствора в глицерине с концентрацией 3-100 мг/мл. Штамм накапливает до 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Применение лонголитина исключает отрицательные последствия лечения. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Г.В | |||
АНДРЕЕНКО и др | |||
Тромболитические свойства лонголитина - комплекса ферментов, выделенного из культуры ARTНROBOTRYS LONGA | |||
Гематология и трансфузиология | |||
Гребенчатая передача | 1916 |
|
SU1983A1 |
Штамм N1-продуцент фибринолитических ферментов | 1978 |
|
SU745943A1 |
Штамм 5 продуцент протеолитического фермента обладающего фибринолитическим и тромболитическим действием | 1964 |
|
SU464617A1 |
Штамм т-54-продуцент фибринолитического фермента | 1975 |
|
SU565936A1 |
Авторы
Даты
2002-05-20—Публикация
2000-07-21—Подача