ШТАММ ARTHROBOTRYS LONGA MECHT - ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА - КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА И НАРУЖНОЕ СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ТРОМБОЗОВ Российский патент 2002 года по МПК C12N1/14 C12N9/78 A61K35/70 

Описание патента на изобретение RU2182596C2

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и может найти применение при лечении тромбозов.

Тромболитические препараты - естественные патогенетические средства лечения тромбозов, осложняющих течение как сердечно-сосудистых, так и инфекционно-аллергических заболеваний. При опасных сосудистых заболеваниях - инфаркте миокарда, инсульте - применение их обязательно, если препараты есть в клинике и не противопоказаны пациенту. Для менее тяжелых, но также довольно распространенных ситуаций тромбоза, например при тромбофлебите, тромболитическая терапия как метод консервативного лечения используется не всегда, во-первых, из-за хорошо известных ее осложнений (кровотечения, ретромбозы), во-вторых, из-за высокой стоимости лечения. Поэтому актуальным остается как создание недорогих тромболитических средств, так и поиск способов нейтрализации их опасных побочных действий.

Известен штамм Arthrobotrys longa Mecht 1 - продуцент комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена (Авторское свидетельство СССР 745943, С 12 N 1/14, 1980 [1]).

Однако фибринолитическая и тромболитическая активность данного известного комплекса ферментов, выделенного из культуральной жидкости данного известного штамма гриба, недостаточно высокая.

Известно применение лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства, вызывающего растворение экспериментальных тромбов у лабораторных животных при его внутривенном введении (Г.В. Андреенко и др. ж. Гематология и трансфузиология, 1983, вып.12, стр.48-50 [2]).

Однако наружное применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве средства лечения тромбозов не описано.

Использование фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного тромболитического средства для лечения тромбозов при тромбофлебитах перспективно, так как при наружном применении уменьшается риск развития осложнений, связанных с внутривенным введением любого лекарственного средства (пирогенное, аллергическое действие, заражение гепатитом, вирусом СПИДа). Кроме того, при наружном применении могут быть смягчены специфические побочные эффекты тромболитической терапии - ретромбозы и кровотечения.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение нового штамма - продуцента лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов с повышенной активностью, упрощение лечения тромбозов и снижение нежелательных последствий лечения за счет наружного применения лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена.

Указанный технический результат достигается тем, что получен новый штамм - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена: гриб Arthrobotrys longa Mecht 2. Впервые рекомендовано применение комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов в качестве наружного средства лечения тромбозов.

Данный технический результат достигается также тем, что в способе лечения тромбозов, включающем использование тромболитических ферментных препаратов, препараты используют путем их нанесения на кожные покровы. При этом в качестве тромболитического препарата используют лонголитин. Его рекомендуют использовать в виде раствора в глицерине преимущественно с концентрацией 3-100 мг/мл.

На фиг. 1 представлена динамика биохимических показателей гемостаза и фибринолиза (%-ное отношение к фоновым значениям) при применении препарата лонголитина и после его отмены.

На фиг.2 представлено изменение (%) биохимических показателей гемостаза и фибринолиза через 7 дней после отмены лонголитина.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Мицелий штамма Arthrobotrys longa Mecht 2 в течение 20 лет инкубировали на агаризованной среде Чапека следующего состава, г/л: Na2NO3 29-31; KH2PO4 0,9-1,1; KCl 0,4-0,5; Mg2SO4 0,4-0,6; сахароза 24-26; вода водопроводная - остальное. По истечении 20 лет селекционных работ на данной среде был получен новый штамм Arthrobotrys longa Mecht 2, депонированный в коллекции лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета.

Полученный штамм является плесневым грибом и относится к классу Fungi Imperfecti, род Arthrobotrys.

На агаризованной среде Чапека указанного выше состава новый штамм образует широкорастущие ворсистые колонии, белые, с возрастом розовеющие. Макроконидиальное спороношение отсутствует. Наблюдается обильное образование микроконидий на вегетативных гифах. Обратная сторона колонии бесцветная или желтоватая. На сусло-агаре (5o БЛГ, агар-агар - 20 г/л) в центре ворсистой белой, розовеющей с возрастом колонии образуются более высокие выросты-столоны, представляющие слабоветвящиеся мицелиальные тяжи. Обратная сторона колонии с радиальными складками, коричневатая.

Культуральные признаки. При росте в погруженной культуре в колбах на качалке, имеющей 240 об/мин, при 25-26oС в течение 144-168 часов на сусле (4o БЛГ) и на синтетической среде, содержащей в г/л: КH24 4,2-4,4; NaNO3 18-20; KNO3 2,2-2,8; сахарозу 20-40; воду водопроводную - остальное, наблюдается образование одноклеточных микроконидий величиной в 3-5 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия. Культуральная жидкость имеет вид разведенного молока, плохо фильтруется, пигментов во внешнюю среду не выделяет.

Описание культивирования. Споры с агаризованной среды Чапека - глубинное культивирование в 2 этапа: выращивание посевного мицелия и проведение собственно биосинтеза комплекса ферментов.

Посевной мицелий выращивали в течение 36-48 ч на среде, содержащей, г/л: КН2PO4 2,0-2,4; NaNO3 9,3-9,8; KNO3 1,15-1,35; сахарозу 18-20; воду водопроводную - остальное. Биосинтез проводили в течение 144-148 ч на среде того же состава с более концентрированным (в 2 раза) содержанием исходных компонентов в качалочных колбах объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке с 240 об/мин при температуре 25-26oС.

Фибринолитические и тромболитические ферменты образуются в глубинных условиях при росте на качалке с 240 об/мин на синтетической среде при температуре 25-26oС в течение 144-168 ч в количестве 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Новый штамм сохраняет специфическую способность к активации плазминогена (для сравнения: исходный штамм Arthrobotrys Mecht 1 при культивировании в этих же условиях накапливает комплекс ферментов в количестве 0,75 г сырца с 1 л культуральной жидкости).

Пример 2. Препарат лонголитина получили путем осаждения из культуральной жидкости Arthrobotrys longa Merch 2 2-кратным объемом охлажденного ацетона. Полученный препарат лонголитина в виде раствора в глицерине наносили крысам на освобожденный участок кожи внутренней поверхности бедра размером около 10 мм • 10 мм и легким массажем втирали в ткань ежедневно в течение 10 дней. Каждое животное получало однократно примерно 0,16 мл раствора. Кровь для исследований брали из яремной вены до опыта, через 7, 10 дней от начала процедуры и спустя неделю после отмены препарата. Использовали две дозы: 5 мг/мл (активность 25 усл. ед.) и 30 мг/мл (активность 60 усл. ед.). Контрольным животным на кожу наносили глицерин. В крови определяли биохимические параметры свертывания крови и фибринолиза: концентрацию фибриногена по Лазару, время рекальцификации, время лизиса эуглобулиновой фракции по Ниверовскому, фибринолитическую активность на стандартных фибриновых пластинках по Аструпу, уровень ингибиторов фибринолиза - α2-антиплазмина по Нордо и антиактиватора по Беннет.

Результаты представлены в таблице и на фиг.1 и фиг.2. Из данных, приведенных в таблице и на фиг.1, видно, что после 7 дней ежедневного втирания препарата в кожный лоскут он проникает через мягкие ткани в общий кровоток. В крови опытных крыс развивается незначительно выраженное состояние гиперкоагуляции и депрессии фибринолиза, регистрируемое укорочением времени рекальцификации, увеличением концентрации фибриногена, снижением фибринолитической активности, измеренной как на фибриновых пластинках, так и по времени лизиса эуглобулиновой фракции, увеличением уровня α2-антиплазмина. Наоборот, состояние контрольных животных к 7 дню эксперимента можно охарактеризовать как стабильное с некоторой тенденцией к гиперкоагуляции.

Таким образом, в основном разнонаправленные сдвиги изучаемых показателей в опытной и контрольной группах экспериментальных животных свидетельствуют об активном воздействии препарата лонголитина на систему гемостаза и фибринолиза при нанесении его на кожный лоскут. Лонголитин проникает сквозь эпидермис в субэпидермальное пространство, распространяется по системе микроциркуляции и, действуя на систему гемостаза и фибринолиза, вызывает их ответную реакцию, регистрируемую в системном кровотоке в виде слабовыраженной гиперкоагуляции и подавления фибринолиза. Такой ответ типичен для фибринолитических и протеолитических ферментов при попадании их в кровоток и представляет регуляторные противодействия организма агрессивной протеолитической активности с возможным развитием как тромбоза, так и кровоточивости.

Пример 3. Наркотизированным крысам в изолированный лигатурой участок вены вводили раствор тромбина, что приводило к образованию тромбов внутри сегмента V. Jugularis. На участок вены с тромбом наносили раствор лонголитина в глицерине. Наблюдали полное растворение тромбов в 85% случаев, частичное - в 9%. В 6% случаев тромбы не растворялись. Время лизиса тромба составляло от 30 мин до 4 ч, что зависело от их размеров, времени стабилизации и активности препарата. Контрольные тромбы не растворялись в течение всего опыта (7-8 ч).

Таким образом, при реализации изобретения, используя новый штамм - продуцент лонголитина - путем его поверхностного применения, можно лечить тромбозы, исключая отрицательные последствия лечения, наблюдающиеся при внутривенном введении тромболитических ферментов. Лонголитин - это первый тромболитический препарат, впервые успешно применный поверхностно при лечении тромбозов.

Похожие патенты RU2182596C2

название год авторы номер документа
ШТАММ ГРИБА ARTHROBOTRYS LONGA ВКПМ F-942 - ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА - КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ 2006
  • Неумывакин Леонид Власович
  • Шаркова Тамара Сергеевна
  • Хромов Игорь Сергеевич
  • Тарантул Вячеслав Залманович
RU2332450C1
Штамм Sarocladium kiliense - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и способ получения лонголитина 2019
  • Хохлов Николай Валерьевич
  • Великанов Евгений Викторович
  • Бровкин Алексей Николаевич
RU2716984C1
Штамм N1-продуцент фибринолитических ферментов 1978
  • Андреенко Галина Васильевна
  • Максимова Роза Алексеевна
  • Серебрякова Тамара Николаевна
  • Силаев Алексей Борисович
  • Шаркова Тамара Сергеевна
  • Гаврилов Олег Константинович
  • Мурашова Нина Сергеевна
  • Теплякова Тамара Владимировна
SU745943A1
ШТАММ SAROCLADIUM STRICTUM - ПРОДУЦЕНТ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С АКТИВАТОРНОЙ К ПЛАЗМИНОГЕНУ АКТИВНОСТЬЮ 2019
  • Корниенко Елена Игоревна
  • Осмоловский Александр Андреевич
  • Шаркова Тамара Сергеевна
  • Налобин Денис Сергеевич
  • Кураков Александр Васильевич
RU2728456C1
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОТРОМБОЗНОГО ГЕЛЯ 2006
  • Неумывакин Леонид Власович
  • Шаркова Тамара Сергеевна
  • Хромов Игорь Сергеевич
  • Тарантул Вячеслав Залманович
  • Серебровская Тамара Николаевна
  • Подорольская Лидия Васильевна
RU2322232C1
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКИМ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ 2002
  • Белогуров А.А.
  • Бибилашвили Р.Ш.
  • Гурский Я.Г.
  • Дельвер Е.П.
  • Товарова И.И.
RU2216348C1
Штамм базидиального гриба CopRINUS DомеSтIсUS (FR)GRaY ВКМ F 2459 Д - продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов. 1983
  • Денисова Н.П.
  • Псурцева Н.В.
  • Фалина Н.Н.
  • Петрищев Н.Н.
  • Киянов В.И.
SU1137762A1
ПРОЛОНГИРОВАННОЕ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1995
  • Айсина Роза Бакировна
  • Варфоломеев Сергей Дмитриевич
RU2121362C1
ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА РОДА Coprinus 2010
  • Шамцян Марк Маркович
  • Петрищев Николай Николаевич
  • Денисова Нина Павловна
  • Чефу Светлана Григорьевна
  • Васина Елена Юрьевна
  • Тозик Евгения Викторовна
  • Колесников Борис Алексеевич
RU2435848C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРОМБОЛИТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИКРОМИЦЕТОВ 2020
  • Фокичев Николай Сергеевич
  • Осмоловский Александр Андреевич
  • Лукьянова Анна Александровна
  • Корниенко Елена Игоревна
  • Налобин Денис Сергеевич
RU2788697C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 182 596 C2

Реферат патента 2002 года ШТАММ ARTHROBOTRYS LONGA MECHT - ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА - КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА И НАРУЖНОЕ СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ТРОМБОЗОВ

Изобретение относится к биотехнологии, может найти применение в медицине. Сущность изобретения: получен новый штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht 2 - продуцент лонголитина - комплекса тромболитических и фибринолитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена. Предложено наружное применение лонголитина при лечении тромбозов путем нанесения его на кожные покровы в виде раствора в глицерине с концентрацией 3-100 мг/мл. Штамм накапливает до 2-4 г сырца с 1 л культуральной жидкости. Применение лонголитина исключает отрицательные последствия лечения. 2 с.п.ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 182 596 C2

1. Штамм Arthrobotrys longa Mecht 2 - коллекция лаборатории биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена. 2. Применение лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов со специфической способностью к активации плазминогена в качестве наружного средства лечения тромбозов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2002 года RU2182596C2

Г.В
АНДРЕЕНКО и др
Тромболитические свойства лонголитина - комплекса ферментов, выделенного из культуры ARTНROBOTRYS LONGA
Гематология и трансфузиология
Гребенчатая передача 1916
  • Михайлов Г.М.
SU1983A1
Штамм N1-продуцент фибринолитических ферментов 1978
  • Андреенко Галина Васильевна
  • Максимова Роза Алексеевна
  • Серебрякова Тамара Николаевна
  • Силаев Алексей Борисович
  • Шаркова Тамара Сергеевна
  • Гаврилов Олег Константинович
  • Мурашова Нина Сергеевна
  • Теплякова Тамара Владимировна
SU745943A1
Штамм 5 продуцент протеолитического фермента обладающего фибринолитическим и тромболитическим действием 1964
  • Имшенецкий Александр Александрович
  • Броцкая Сарра Зиновьевна
  • Коршунов Виктор Васильевич
SU464617A1
Штамм т-54-продуцент фибринолитического фермента 1975
  • Егоров Николай Сергеевич
  • Агре Нина Семеновна
  • Выборных Светлана Николаевна
SU565936A1

RU 2 182 596 C2

Авторы

Серебрякова Т.Н.

Шаркова Т.С.

Подорольская Л.В.

Максимова Р.А.

Андреенко Г.В.

Неумывакин Л.В.

Даты

2002-05-20Публикация

2000-07-21Подача