ШТАММ ГРИБА ARTHROBOTRYS LONGA ВКПМ F-942 - ПРОДУЦЕНТ ЛОНГОЛИТИНА - КОМПЛЕКСА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКИХ И ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/14 C12N9/78 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может найти применение при лечении тромбозов.

Известен штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №1 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов (авторское свидетельство СССР №745943, кл. С12N 1/14, опубл. 1980) [1].

Однако активность лонголитина в получаемом из культуральной жидкости ферментном препарате низкая, недостаточная для обеспечения возможности его промышленного использования.

Известен штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №2 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов (патент RU №2182596, кл. С12N 1/14, опубл. 2002) [2].

Этот известный штамм является наиболее близким аналогом предлагаемого штамма гриба.

Однако фибринолитическая и тромболитическая активности комплекса ферментов, содержащегося в культуральной жидкости этого известного штамма гриба, недостаточно высоки для того, чтобы использовать его в качестве продуцента в промышленных условиях.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является обеспечение возможности повышения фибринолитической и тромболитической активностей лонголитина.

Данный технический результат достигается тем, что продуцентом лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов - является новый штамм гриба Arthrobotrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Мицелий известного [2] штамма гриба Arthrobotrys longa Mecht №2 выращивают в пробирках на косяках питательной агаризованной среды Чапека следующего состава, г/л: KH₂PO₄ - 0,9-1,1; NaNO₃ - 2,9-3,1; KCl - 0,4-0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,4-0,5; сахароза - 24-26; вода водопроводная - остальное.

Затем проводят глубинное культивирование гриба в 2 этапа: выращивание посевного мицелия и проведение собственно биосинтеза лонголитина.

Посевной мицелий выращивают 36-40 часов в жидкой питательной среде, содержащей, г/л: K₂HPO₄ - 2,0-2,4; NaNO₃ - 9,3-9,8; KNO₃ - 1,15-1,35; сахароза - 18-20; вода водопроводная - остальное.

Биосинтез комплекса ферментов проводят в течение 120-144 часов на среде того же состава с увеличенной 2 раза концентрацией исходных компонентов в качалочных колбах объемом 750 мл с 200 мл питательной среды при температуре 26-28°С.

Из полученной культуральной жидкости клетки осаждают центрифугированием. Из полученного центрифугата культуральной жидкости высаживают лонголитин двумя объемами охлажденного до - 20°С ацетона при температуре 4°С.

Осадок отделяют на мембранном фильтре и сушат под вакуумом.

Для определения фибринолитической активности (ФА) 15 мг полученного осадка (препарата лонголитина) растворяют в 1 мл физиологического раствора. Приготовленный раствор наносят в объеме 0,03 мл на непрогретые и на прогретые при 86°С фибриновые пластины. Способность к активации плазминогена (АА) определяют по разности зон лизиса на непрогретых и на прогретых пластинах полимерного фибрина.

За единицу ФА принимают зону лизиса в 10 мм² стандартной фибриновой пластины (к 9 мл бычьего 0,3% фибриногена добавляют 0,2 мл тромбина с концентрацией 2 мг/мл), которая образуется за 5-6 час при температуре 37°С после нанесения 1 мл раствора лонголитина, содержащего 15 мг сухого препарата лонголитина.

Установлено, что у исходного известного [2] штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 площадь зон лизиса на непрогретых пластинах равна 400-600 мм² (ФА). АА составляет 25-50% от ФА. Из этого следует, что активность лонголитина у известного [2] штамма Arthrobortrys longa Mecht №2 в единицах активности составляет около 16500 единиц ФА.

Пример 2. Для получения нового штамма в стерильные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл наливают по 1 мл полученной культуральной жидкости известного [2] штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2, содержащей 10⁵ клеток/мл. Пробирки герметично закрывают и передают на обработку гамма-лучами.

Обработку гамма-лучами ведут, поместив приготовленные пробирки с культуральной жидкостью на различном расстоянии от источника. Все пробирки обрабатывают в течение одинакового промежутка времени. Поглощенную дозу рассчитывают по данным счетчика Гейгера в каждой точке расположения пробы.

После облучения клетки высевают на чашки Петри и проверяют их жизнеспособность. В таблице 1 указано усредненное количество выживших клеток в пробирке после обработки содержащейся в ней культуральной жидкости исходного штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 различными дозами гамма-облучения.

Таблица 1Количество выживших клеток после обработки культуральной жидкости исходного штамма Arthrobortrys longa Mecht №2 различными дозами гамма-облучения.№ образцаДоза экспозиционная (кРад)Усредненное количество выживших клеток в 1-й облученной пробирке11010⁵24010⁴38010³412010²5200563000

Как видно из таблицы 1, критической величиной является поглощенная доза 300 кРад, после получения которой клетки погибают.

Отбирают 1000 колоний клеток, выживших после получения поглощенной дозы 200 кРад, и проверяют их на активность лонголитина. Для этого колонии рассевают на отдельные чашки Петри и затем подращивают в 800 мл жидкой среды в колбах объемом 2 л. После выращивания в течение 120-144 часов клетки осаждают центрифугированием, из приготовленного центрифугата культуральной жидкости выделяют лонглитин, определяют его фибринолитическую (ФА) и активаторную активность (АА).

Результаты проверки представлены в таблице 2.

Таблица 2Фибринолитическая (ФА) и активаторная активность (АА) лонголитина, выделенного из культуральной жидкости нового мутантного штамма гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942№ образцаКоличество проверенных клоновАктивность лонголитина в мм² зоны лизисаФибринолитическаяАктиваторная1756200-400120-2002173200-400120-200361300-500180-300418600-800250-400521000-1200450-600

Как видно из таблицы 2, фибринолитическая и активаторная активность лонголитина, содержащегося в культуральной жидкости двух выделенных клонов клеток, выживших при поглощенной дозе 200 кРад, в 3 раза выше, чем эта активность исходного штамма Arthrobotrys longa Mecht №2.

Эти клоны отобрали и использовали для дальнейшего фенотипирования.

Новый мутантный штамм гриба, названный авторами Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), при росте на среде Чапека образует широкорастущие ворсистые колонии с интенсивной оранжево-розовой пигментацией, которая увеличивается с возрастом колонии. Макроконидиальное спороношение отсутствует. Обратная сторона колоний желтоватая. Наблюдается обильное образование микроконидий на вегетативных гифах. При росте на сусло-агаре состава: сусло с базовым левовращающим градусом (БЛГ) 5° (показатель сахаристости сусла по рефрактометру), агар-агар - 20 г/л интенсивность окраски ворсистой розоватой колонии с возрастом увеличивается в центре. В центре колонии с возрастом образуются более высокие выросты - столоны - слабоветвящиеся мицелиальные тяжи. Обратная сторона колоний с радиальными складками, коричневая.

Культуральные признаки. При росте в погруженной культуре в колбах на качалке, имеющей 240 об/мин при температуре 26-28°С в течение 144-168 час на сусле (4° БЛГ) и на синтетической среде, содержащей, г/л: K₂HPO₄ - 4,2-4,4; NaNo₃ - 18-20; KNO₃ - 2,2-2,8; сахароза - 20-40; вода водопроводная - остальное, наблюдается образование одноклеточных микроконидий величиной 4-6 мкм. Микроконидии образуются непосредственно на гифах вегетативного мицелия. Культуральная жидкость имеет вид разбавленного водой молока, плохо фильтруется, пигментов во внешнюю среду не выделяет. Ортимум рН роста в глубинной культуре 6,5. Гриб растет на простой синтетической среде, не требует добавления витаминов и факторов роста.

Лоноголитин, выделяемый новым штаммом, чувствителен к 4-(2-аминоэтил)бензен сульфонилфлуорид гидрохлориду, который в концентрации 16 микромолей полностью ингибирует его активность. Что доказывает принадлежность этого комплекса ферментов, продуцируемого новым штаммом Arthrobortrys longa, к сериновому типу протеаз. Новый мутантный штамм Arthrobortrys longa синтезирует лонголитин с активностью 36300 единиц ФА. Известный [2] исходный штамм при культивировании в тех же условиях синтезирует лонголитин с активностью около 16500 единиц ФА. Лонголитин, синтезируемый новым штаммом, сохраняет способность к активации плазминогена, присущую известному [2] штамму.

Новый мутантный штамм гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1) синтезирует лонголитин в количестве 6-10 г на 1 л культурального фильтрата. Для сравнения: исходный штамм [2] гриба Arthrobortrys longa Mecht №2 при культивировании в этих же условиях накапливает лонголитин в количестве 2-4 г на 1 л культарального фильтрата.

Новый штамм гриба хранится в коллекции микроорганизмов Общества с ограниченной ответственностью «Лонгофарм» под авторским названием Arthrobotrys longa Mecht №3 (Longopharm №1). Он депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИгенетика под названием Arthrobotrys longa ВКПМ F-942.

Таким образом, новый мутантный штамм гриба Arthrobortrys longa Mecht №3 (Longopharm №1), ВКПМ F-942 обеспечивает получение лонголитина с повышенной ферментативной активностью, что позволит использовать его в промышленных условиях.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при лечении тромбозов. Штамм гриба Arthrobotrys longa ВКПМ F-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов и может быть использован в качестве продуцента лонголитина. Изобретение позволяет повысить выход лонголитина. 2 табл.

Штамм гриба Arthrobotrys longa ВКПМ F-942 - продуцент лонголитина - комплекса фибринолитических и тромболитических ферментов.