Способ идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/70 C12R1/63 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике и может быть использовано для разработки новых диагностических препаратов позволяющих идентифицировать холерные штаммы O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor.

В настоящее время актуальной остается проблема обнаружения, при ежегодных мониторинговых исследованиях холеры, на фоне эпизодических выделений единичных токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1 биовара El Tor из объектов окружающей среды и от человека (заносы), в связи с этим большое значение придают лабораторной диагностике возбудителя холеры, и в частности фагодиагностике.

Известны холерные бактериофаги (1), которые используются для идентификации и фаготипирования холерных вибрионов. Однако поиск новых методов в бактериологической диагностике холеры остается значимым, и в первую очередь связан с необходимостью выделять специфические свойства микроорганизма простым и достоверным способом.

Известен способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus (2), включающий использование индикаторного штамма Vibrio parahaemolyticus КМ-97, из которого готовят диагностический фаг путем смешивания 1,0 мл фага ФК-44 и 1,0 мл фага ФК-46 в соотношении 1:1, в титре n⋅10⁸ БОЕ/мл, после этого проводят посев исследуемого штамма на газон культуры и наносят каплю полученного диагностического препарата фага в центр чашки, посевы выдерживают при температуре 37°С в течение 20-24 часов и по наличию лизиса фагом исследуемого штамма подтверждают принадлежность микроорганизма к виду Vibrio parahaemolyticus.

Однако этот метод не может быть применен для обнаружения бактерий вида Vibrio cholerae, так как препарат эффективен только в отношении штамма Vibrio parahaemolyticus. Важной особенностью бактериофага является то, что он строго специфичен. Из этого следует, что парагемолитический бактериофаг не может лизировать возбудителя холеры.

Известен способ идентификации Yersinia enterocolitica (3), заключающийся в том, что применяют кишечноиерсинеозный фаг ФК-100, который наносят в виде дорожки на двухслойный газон, нижний слой которого представляет собой агаровую среду (рН 7,1) с добавлением ампицелина в концентрации 50 мкг/мл, а верхний получают из исследуемого штамма, который выращивают на 1,5% агаре Хоттингера при 28°С в течение суток засевают в 4,5 мл бульона Хоттингера, сутки инкубируют при 28°С до конечной концентрации n⋅10⁸ м.к./мл, затем из полученной культуры берут 0,3 мл и смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Хоттингера с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара (рН 7,1), после этого посев инкубируют и проводят идентификацию по наличию зоны фаголизиса.

Недостатком способа является невозможность его применения для диагностики холеры, так как фаг ФК-100 лизирует возбудителя иерсинеоза - Y. enterocolitica, холерные вибрионы могут лизировать только холерные фаги.

Таким образом, фагодиагностика, используемая в известном способе, заключается в применении определенного ФК-100 фага, чувствительного к Y. enterocolitica.

Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в изыскании штамма холерного бактериофага, позволяющего с высокой степенью достоверности проводить идентификацию холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor.

Поставленная задача достигается тем, что в способе идентификации холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor включающем использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде, применяют штамм бактериофага Rostov-6, который наносят в виде дорожки на поверхность чашки Петри, заполненной предварительно подготовленным раствором, состоящим из исследуемой культуры, которую вносят в бульон Мартена объемом 4,5 мл рН 7,7, оставляют в термостате на 4 часа при температуре 37°С, затем из этой смеси берут 0,1 мл и вносят в 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена, смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% раствором агара, равномерно распределяют его по поверхности, после подсыхания на последнюю наносят каплей препарат бактериофага Rostov-6, посев инкубируют в термостате при температуре 37°С, в течение 24 часов, проводят идентификацию на выросшей культуре, по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor или их отсутствие.

Для осуществления способа используют бактериофаг Rostov-6, штамм которого хранится в коллекции-депозитарии фагов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Бактериофаг Rostov-6 г был выделен из окружающей среды в качестве компонента водных экосистем. Чистая линия фага Rostov-6 была получена путем многократного пассирования негативных колоний на штамме Vibrio cholerae 19546.

Бактериофаг относится к III морфологической группе по А.С. Тихоненко (1968 г.) и типу С семейства Podoviridae. Данный фаг имеет многогранную головку размером 45,3×51,0 нм и короткий несократимый отросток размером 11,0 нм (см. чертеж).

Геном Vibrio phage Rostov-6 доступен в международной базе GenBank (NCBI) под номером МН105773.

Способ осуществляют на штаммах Vibrio cholerae O1 биовара El Tor и Classical.

Пример 1.

Лизис бактериофагом Rostov-6 штаммов №437, №1123, №11093, и индикаторный (контрольный штамм) №19546. Опытные штаммы относятся к штаммам O1 серогруппы биовара Classical. Культуры были взяты из коллекции музея ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Исследуемую культуру бактериологической петлей вносят в пробирку с бульоном Мартена (рН 7,7) объемом 4,5 мл и ставят в термостат на 4 часа при 37°С. Затем 0,5 мл полученной смеси, переносят в пробирку с 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена.

После этого смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% агаром Мартена и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку.

После подсыхания агара наносят препарат бактериофага Rostov-6. Посев инкубируют в термостате при 37°С 24 часа.

Учитывают результат идентификации по наличию и степени лизиса (см. таблицу 1).

Из таблицы видно, что все три штамма имеют высокую степень лизиса, а именно штаммы: №437, №11093 имели зону лизиса на четыре креста, а штамм №1123 - три креста, т.е. бактериофаг Rostov-6 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов O1 серогруппы биовара Classical.

Пример 2

Исследование штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor №18335, №18372, №18748/2 на чувствительность к бактериофагу Rostov-6. Все штаммы взяты из музея коллекции штаммов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Посев штаммов и все последующие действия производятся так же, как и в примере 1.

Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-6 для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor (см. таблицу 2).

Из таблицы видно, что все штаммы имеют высокую степень лизиса (4+) бактериофагом Rostov-6, подтверждая присутствие холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor.

Пример 3

Исследование проб, взятых из воды на чувствительность к бактериофагу Rostov-6.

Штаммы холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor №23, №53, №127 получены в результате мониторинга в 2016 году. Посев штаммов и все последующие действия производятся так же, как и в примере 1.

Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-6 для идентификации холерных вибрионов O1 серогруппы биовара El Tor выделенных из воды (см. таблицу 3).

Из таблицы видно, что все три штамма имеют высокую степень лизиса, а именно штаммы: №437, №11093 имели зону лизиса на четыре креста, а штамм №1123 - три креста, т.е. бактериофаг Rostov-6 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов 01 серогруппы биовара El Tor.

Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно осуществлять идентификацию холерных вибрионов O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor с помощью бактериофага Rostov-6. Данный препарат может широко применяться в лабораторных исследованиях для идентификации микроорганизмов, а так же при мониторинге холеры в противочумных учреждениях.

Источники информации:

1. Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И. Типирование холерных вибрионов новым набором фагов // Журн. гигиены, эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. - Прага, 1979. - Т. 23, №3. - С. 306-312.

2. «Способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio parahaemolyticus». - Пат. №2531236, кл. С12 №7/00, G01 №33/50. - Опубл. 20.10.2014, Бюл. №29.

3. Способ идентификации Yersinia enterocolitica». - Пат. №2460802, кл. C12Q 1/08. - Опубл. 10.09.2012, Бюл. №25.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для разработки новых диагностических препаратов позволяющих идентифицировать холерные штаммы O1 серогруппы биоваров Classical и El Tor. Способ предусматривает использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде. Применяют штамм бактериофага Rostov-6, который наносят в виде дорожки на поверхность чашки Петри, заполненной предварительно подготовленным раствором, состоящим из исследуемой культуры, которую вносят в бульон Мартена и оставляют в термостате на 4 часа при температуре 37°С. Затем отбирают заданное количество смеси и вносят в 0,7% растопленный и охлажденный до 45°С агара Мартена. Смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% раствором агара. Равномерно распределяют его по поверхности и дают подсохнуть. После подсыхания на последнюю наносят каплей препарат бактериофага Rostov-6, посев инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Затем проводят идентификацию на выросшей культуре по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor или их отсутствие. Изобретение позволяет повысить степень достоверности идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы Classical и El Tor. 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ идентификации холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor, включающий использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде, отличающийся тем, что применяют штамм бактериофага Rostov-6, который наносят в виде дорожки на поверхность чашки Петри, заполненной предварительно подготовленным раствором, состоящим из исследуемой культуры, которую вносят в бульон Мартена объемом 4,5 мл рН 7,7, оставляют в термостате на 4 часа при температуре 37°С, затем из этой смеси берут 0,1 мл и вносят в 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена, смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% раствором агара, равномерно распределяют его по поверхности, после подсыхания на последнюю наносят каплей препарат бактериофага Rostov-6, посев инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов, проводят идентификацию на выросшей культуре по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов O1 серогрупп биоваров Classical и EL Tor или их отсутствие.