Способ идентификации Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара El Tor Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/02 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике и может быть использовано для разработки новых диагностических препаратов, позволяющих идентифицировать холерные штаммы 01 серогруппы биовара E1 Tor.

В настоящее время холера остается приоритетной проблемой мирового здравоохранения (1,2). Существует угроза возникновения различных чрезвычайных ситуаций биолого-социального характера, имеющих международное значение и проявляющихся в виде масштабных эпидемий, и вспышек этой инфекции. Кроме того, глобальные изменения климата, сопровождающиеся неожиданными аномалиями в ранее стабильных климатических зонах, могут способствовать распространению холерных вибрионов, что может привести к эпидосложнениям по холере.

Несмотря на активное внедрение в лабораторную практику современных способов диагностики холерного вибриона, на данном этапе распространенность холеры остается на высоком уровне (3). В связи с чем одним из приоритетных исследований науки является изучение бактериофагов.

Большинство выделенных фагов уже используются для идентификации и фаготипирования холерных вибрионов (4). Тем не менее поиск современных методов в бактериологической диагностике холеры, а также поиск бактерифагов обладающих высокой литической активностью является немаловажным в наше время, так как холерные вибрионы могут становится устойчивыми к уже встречающимся фагам и понижать их литическую активность. Процесс взаимодействия фагов с бактериальной клеткой характеризуется последовательной сменой определенных стадий: адсорбции, инъекции или проникновение бактериофага, репродукции вирусных частиц и выхода дочерних популяций бактериофага. Некоторые фаги специфичны к отдельным типам бактерий, тогда как другие обладают широким спектром активности и могут поражать определенный род бактерий.

Таким образом существует необходимость поиска и разработки новых средств для лабораторной диагностики возбудителя холеры. При идентификации холерных вибрионов значительное место принадлежит определению фагочувствительности.

Известен способ обнаружения микроорганизма вида Vibrio mimicus (5), который осуществляют следующим образом: в качестве индикаторного штамма используют Vibrio cholerae E1 Tor KM 199, для этого трех часовую бульонную культуру данного индикаторного штамма в количестве 0,2 мл вносят в смесь инкубированного, отфильтрованного лизогенного микроорганизма, 1 мл последнего соединяют с 5 мл 0,7% агара Мартена, затем взвесь высевают на агаровую пластину 1,5% агара мартена и культивируют при 37°С в течение 20-24 часов, по литической реакции делают вывод о наличии фага Vibrio mimicus Ф-19.

Однако этот метод не может быть применен для обнаружения бактерий вида Vibrio cholerae, так как препарат эффективен только в отношении штамма Vibrio mimicus. Важной особенностью бактериофага является то, что он строго специфичен. Из этого следует, что данный бактериофаг не может лизировать возбудителя холеры.

Известен способ идентификации холерных вибрионов Ol серогруппы биоваров Classical и E1 Tor (6), заключающийся в том, что применяют холерный бактериофаг Rostov-б, который наносят в виде дорожки на двухслойный агар, при этом исследуемый штамм, выращенный на 1,5% агаре Мартена при 37°С в течение суток засевают в 4,5 мл бульона Мартена, сутки посевы инкубируют при 37°С до конечной концентрации n⋅10⁸ м.к./мл, далее из полученной культуры берут 0,3 мл и смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Мартена с 50 мкг/мл ампициллина и выливают вторым слоем на пластинки агара (Рн 7,1) в чаши Петри, после этого посев инкубируют и проводят идентификацию по наличию зоны фаголизиса.

Недостатком данного способа является то, что бактериофаг Ростов-6 является умеренным фагом, поэтому его литическая активность, в отношении холерных вибрионов биоваров E1 Tor, ниже чем бактериофага Ростов-13, который является вирулентным (литическим) благодаря отсутствию генов интегразы.

Кроме того отсутствие очистки методом фильтрации данного диагностического бактериофага приводит к его низкому качеству, так как присутствие примесей в препарате в виде обломков и жгутиков холерного вибриона приводит к не достоверной диагностике.

Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в поиске штамма холерного бактериофага, обладающего высокой литической активностью для проведения более достоверной и качественной идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров E1 Tor.

Поставленная задача достигается тем, что в способе идентификации Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара E1 Tor, включающем использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде, отличие заключается в том что применяют штамм бактериофага ROSTOV-13, который предварительно проходит двух этапную фильтрацию в тангенциальном поле первоначально с помощью кассеты с диаметром 0,45 мкм, затем используют кассету диаметром 0,22 мкм, после очищенный бактериофаг наносят на двухслойную поверхность чаши Петри, при этом в верхний слой входит 4,5 мл 0,7% агара Мартена, предварительно растопленного и охлажденного до 45°С, затем в него вносят 0,5 мл четырех часовой бульонной культуры штамма Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара E1 Tor, содержимое пробирки перемешивают и быстро выливают на поверхность чаши с 1,5% агаром, представляющим нижний слой чаши, затем агар равномерно распределяют по поверхности, а после застывания наносят капли бактериофага, которые при стекании образуют дорожки, посев инкубируют в течение 16-18 часов при температуре 37°С, проводят идентификацию на выросшей культуре по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor или их отсутствие путем оценки литической активности, которую учитывают по пятибальной шкале-крестцовой системы

Способ осуществляется следующим образом.

Для осуществления способа используют бактериофаг Rostov-13, штамм которого хранится в коллекции-депозитария фагов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Холерный бактериофаг Rostov-13 относится к III морфогруппе (Тихоненко головки 48,26×47,15 нм и несокращающийся отросток 13,78 нм (риснок 1).

Геном VibriophageRostov-13 доступен в международной базе GenBank (NCBI) под номером ОК169294-ОK169295

Для обнаружения бактериофага Rostov-13 используют пробы воды, доставленные для изучения на вибриофлору. В исследуемую пробу на наличие холерного вибриона (1-й пептон) добавляют 4-часовую бульонную культуру индикаторного штамма Vibrio cholerae Ol №13169, которую культивировали в термостате в течение суток при 37°С.На следующий день выращенные холерные вибрионы инактивируют 20 минут, добавляя хлороформ (1:10). Затем центрифугируют взвеси в течение 30 мин при 4 тыс.об/мин. (центрифуга РС-6) Отобранная надосадочная жидкость является бактериофагом Rostov-13. После чего бактериофаг проходит двух этапную очистку фильтрацией с помощью прибора LabScale™ (Индия), осуществляя фильтрацию в тангенциальном поле первоначально касетой Pelicon XL с диаметром отверстий 0,45 мкм, затем используют кассету Pelicon XL с диаметром отверстий 0,22 мкм, для очищения бактериофагов от обломков и жгутиков клеток холерного вибриона, других примесей, которые могут загрязнить получившийся фаговый субстрат.

Очищенный бактериофаг наносят на двухслойный агар Мартена. Источником питания холерных вибрионов является нижний слой, состоящий из 15-30 мл 1,5-1,6% питательного агара Мартена, разлитого в чашки Петри. Перед употреблением чашки тщательно подсушивают в термостате при 37°С, так как капли конденсата искажают результаты. В верхний слой входит 4,5 мл 0,7%-го агара Мартена, предварительно растопленный и охлажденный до 45°С. В охлажденный агар вносят 0,5 мл 4-х часовой бульонной культуры штамма V cholerae 01 серогруппы биоваров E1 Tor. Круговыми движениями содержимое пробирки перемешивают, быстро выливают на поверхность чашки с 1,5% агаром. После застывания агара, наносят капли бактериофага, при стекании капель образуются дорожки, затем чашки переворачивают вниз и инкубируют 16-18 часов при 37°С.

Оценку литической активности бактериофага учитывают по пятибалльной шкале (крестцовой системе):

1. (-) отсутствие литической активности;

2. (+) низкая литическая активность;

3. (++) образование зоны лизиса с большим количеством колоний вторичного роста бактерий;

4. (+++) зона лизиса с единичными колониями вторичного роста культуры;

5. (++++) прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста.

Проведение очистки двух этапной фильтрацией бактериофага Rostov-13, подтверждает его стерильность, следовательно, увеличивает длительность эффективного применения в опытах in vitro при диагностике штаммов V. cholerae 01 серогруппы биоваров E1 Tor.

Эффективность способа подтверждается примерами. Пример 1.

Изучение литической активности холерного бактериофага Ио51оу-13 в отношении 31 штамма 01 серогруппыбиовара E1Tor, выделенных в России в 2019-2020 г. Литическая активность бактериофага Rostov-13 составила 96,7%. Данные штаммы были взяты из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Исследуемую культуру бактериологической петлей вносят в пробирку с бульоном Мартена (рн-7,7), объемом 4,5 мл и ставят в термостат на 4 часа при 37°С.Затем 0,5 мл полученной смеси, переносят в пробирку с 4,5 мл 0,7% растопленного и охлажденного до 45°С агара Мартена.

После этого смесь в пробирке перемешивают круговыми движениями и быстро выливают на поверхность чашки Петри с 1,5% агаром Мартена и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку.

После подсыхания агара наносят очищенный препарат бактериофага Rostov-13. Посев инкубируют в термостате при 37°С 24 часа.

Учитывают результат идентификации по наличию и степени лизиса (см. таблицу 1).

Из таблицы1 видно, что 30 штаммов из 31 имеют разную степень лизиса, т.е. бактериофаг Rostov-13 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor. Также отсутствие лизиса показал штамм V. choleraeO1 EITor20591.

Пример 2

Исследование штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor выделенных от больных людей ОКИ, на чувствительность к бактериофагу Rostov-13. Все штаммы взяты из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Посев штаммов и все последующие действия производят так же, как и в примере 1.

Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-13 для идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы биовара EI Tor представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что большинство штаммов имеют высокую степень лизиса (3,4+) бактериофагом Rostov-13, литическая активность в данном опыте составила 94% подтверждая присутствие холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor. Отсутствие лизиса показал штамм V. choleroeOl E1 Torl45.

Пример 3

Исследование штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor, находящихся в музее культур лаборатории бактериофагов, на чувствительность к бактериофагу Rostov-13. Все штаммы взяты из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Посев штаммов и все последующие действия производят так же, как и в примере 1 и 2.

Результаты лабораторных испытаний фагового препарата Rostov-13 для идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor представлены в таблице 3.

Из таблицы №3 следует, что все выбранные штаммы из музея коллекции лаборатории бактериофагов имеют разную, но в основном, высокую степень лизиса, т.е. бактериофаг Rostov-13 достоверно показал присутствие в исследуемых штаммах холерных вибрионов 01 серогруппы биовара EI Tor, процентное соотношение более 97%,также в таблице присутствует штамм №20291, который показал отсутствие лизиса.

Использование предполагаемого изобретения, за счет высокого показателя литического действия бактериофага Rostov-13B позволяет достоверно осуществлять идентификацию холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1Torc.

Данный препарат может широко применяться в лабораторных исследованиях для идентификации микроорганизмов, а также при мониторинге холеры в противочумных учреждениях.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

1. Charnley G. Е.С, Kelman I., Murray К. A. Drought-related cholera outbreaks in Africaand the implications for climate change: a narrative review //Pathogens and GlobalHealth. - 2022. - T. 116. - №. 1. - С 3-12.DOI: 10.1080/20477724.2021.1981716.

2. Москвитина Э.А., Янович Е.Г., Куриленко М.Л., Кругликов В.Д., Титова СВ., Левченко Д.А., Водопьянов А.С, Лопатин А.А., Иванова С.М., Мишанькин Б.М., Кривенко А.С, Анисимова Г.Б., Носков А.К. Холера: мониторинг эпидемиологической обстановки в мире и России (2010-2019 гг.). Прогноз на 2020 г. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2020; 2. - С 38-47. DOI: 10.21055/0370-1069-2020-2-38-47.

3. Носков А. К. и др. Холера: тенденции развития эпидемического процесса в 2021 г., прогноз на 2022 г //Проблемы особо опасных инфекций. - 2022. - №. 1. - С.24-34. DOI: 10.21055/0370-1069-2022-1 -24-34.

4. Дрожевкина М.С, Арутюнов Ю.И. Типирование холерных вибрионов новым набором фагов // Журн. гигиены, эпидемиол.,микробиол. и иммунобиол. - Прага, 1979. - Т. 23, №3. -С 306-312.

5. «Способ выделения и дифференциации фага Vibriomimicus». - Пат.№2375437, кл. С12 1/00, C12Q 1/02. - Опубл. 10.12.2009. Бюл. №34.

6. «Способ идентификации холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и Е1Tor». - пат. №2729575,кл. C12Q 1/02, C12Q 1/70, C12R 1/63. - Опубл. 07.08.2020. Бюл. №22.

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что применяют штамм бактериофага ROSTOV-13, который предварительно проходит двухэтапную фильтрацию в тангенциальном поле, первоначально с помощью кассеты с диаметром отверстий 0,45 мкм, затем используют кассету с диаметром 0,22 мкм, после очищенный бактериофаг наносят на двухслойную поверхность чаши Петри, при этом в верхний слой входит 4,5 мл 0,7% агара Мартена, предварительно растопленного и охлажденного до 45°С, затем в него вносят 0,5 мл четырехчасовой бульонной культуры штамма Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара E1 Тог, содержимое пробирки перемешивают и быстро выливают на поверхность чаши с 1,5% агаром, представляющим нижний слой чаши, затем агар равномерно распределяют по поверхности, а после застывания наносят капли бактериофага, которые при стекании образуют дорожки, посев инкубируют в течение 16-18 часов при температуре 37°С, проводят идентификацию на выросшей культуре по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов 01 серогруппы биовара E1 Tor или их отсутствие путем оценки литической активности, которую учитывают по пятибалльной шкале крестцовой системы. Изобретение позволяет более достоверно и качественно идентифицировать холерные вибрионы 01 серогруппы биовара E1 Tor. 3 табл.

Способ идентификации Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара E1 Tor, включающий использование лизабельности микроба диагностическим фагом на агаровой среде, отличающийся тем, что применяют штамм бактериофага ROSTOV-13, который предварительно проходит двухэтапную фильтрацию в тангенциальном поле, первоначально с помощью кассеты с диаметром отверстий 0,45 мкм, затем используют кассету с диаметром 0,22 мкм, после очищенный бактериофаг наносят на двухслойную поверхность чаши Петри, при этом в верхний слой входит 4,5 мл 0,7% агара Мартена, предварительно растопленного и охлажденного до 45°С, затем в него вносят 0,5 мл четырехчасовой бульонной культуры штамма Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара E1 Tor, содержимое пробирки перемешивают и быстро выливают на поверхность чаши с 1,5% агаром, представляющим нижний слой чаши, затем агар равномерно распределяют по поверхности, а после застывания наносят капли бактериофага, которые при стекании образуют дорожки, посев инкубируют в течение 16-18 часов при температуре 37°С, проводят идентификацию на выросшей культуре по наличию зоны фаголизиса, которая подтверждает присутствие холерных вибрионов 01 серогруппы биовара El Тог или их отсутствие путем оценки литической активности, которую учитывают по пятибалльной шкале крестцовой системы.