ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза.

Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes играет важную роль в перинатальной и неонатальной патологии человека, вызывает серьезные поражения у лиц с дефектами иммунной системы и представляет собой серьезную проблему для медицины и ветеринарии. Многочисленные вспышки этого заболевания в ряде стран, включая Россию, связанные с употреблением в пищу инфицированных продуктов, частота носительства возбудителя у людей и их широкое распространение во внешней среде, требуют разработки методов для выделения, идентификации и типирования листерий [2].

В этой связи разработка простых, недорогих, питательных сред для идентификации листерий из материалов различного происхождения представляется весьма актуальным, как для характеристики распространения штаммов Listeria monocytogenes, так и для разработки новых подходов к их типированию, с целью выявления значимых, вирулентных культур листерий.

В настоящее время для этих целей используют селективную среду по прописи Lucas D. et. al, (1990 г), селективную среду для выделения листерий - PAL CAM по прописи Netten P. et. al. (1989 г), питательную среду с теллуритом калия (3,4).

Кроме того, эти среды дорогостоящи и многокомпонентны, сложны в приготовлении и недоступны практическим лабораториям, занимающимся диагностикой листериоза.

Наиболее близким решением задачи по совокупности признаков является среда для обнаружения и идентификации гемолитических штаммов Listeria на плотной селективной среде, содержащей, г/л: питательный агар ДИФКО (с переваром бычьих сердец и мозгов) - 52,0, хлорид лития - 15,0, эскулин - 0,75, акрифлавина гидрохлорид - 5 мг/л, дистиллированная вода - 900 мл, в смесь добавляют 0,7% цитрат железа-аммония - 70 мл, 10 мл 2% натриевой соли цефтазидима пентагидрата (7).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что среда для обнаружения и идентификации гемолитических штаммов Listeria - дорогостоящая, импортного производства, недоступна широкой сети практических лабораторий, занимающихся диагностикой листерий.

Задача предлагаемого изобретения - повышение селективных свойств среды.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда содержит в качестве основного источника азота - питательный агар для культивирования микроорганизмов, акрифлавин гидрохлорид и теллурит калия в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры при следующем соотношении компонентов, (1,5,6) г/л дистиллированной воды:
Питательный агар для культивирования микроорганизмов - 39,0 - 41,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 4,5 - 5,5
Тиамин-бромид - 0,0025 - 0,0035
Д(+)-глюкоза - 0,8 - 1,2
Динатрий фосфат - 2,0 - 3,0
Акрифлавин гидрохлорид - 0,0045 - 0,0055
Налидиксовая кислота - 0,035 - 0,045
Ex tempore теллурит калия - - 0,15-0,25
Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в количестве (минимальное): питательный агар для культивирования микроорганизмов - 39,0 г, витаминный препарат "ЭКД" - 4,5 г, тиамин-бромид - 0,0025 г, Д(+) глюкоза - 0,8 г, динатрий фосфат - 2,0 г, акрифлавин гидрохлорид - 0,0045 г.

Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,035 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды). Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 112^oС в течение 20 мин. После автоклавирования вносят 0,15 г теллурита калия (эквивалентное 9 мл 2% водно-глицеринового раствора теллурита калия). Разливают в стерильные чашки Петри, предварительно охладив среду до 45-50^oС, чашки со средой подсушивают в термостате при 37±1^oС в течение (35±5) мин.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в количестве (оптимальное): питательный агар для культивирования микроорганизмов 40,0 г, витаминный препарат "ЭКД" - 5,0 г, тиамин-бромид - 0,003 г, Д(+)глюкоза - 1,0 г, динатрий фосфат - 2,5 г, акрифлавин гидрохлорид - 0,005 г. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,04 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды). Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 112^oС в течение 20 мин. После автоклавирования вносят 0,2 г теллурита калия (эквивалентное 10 мл 2%-ного водно-глицеринового раствора теллурита калия). Далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1,2 тем, что растворяют следующие ингредиенты среды, взятые в количестве (максимальные): питательный агар для культивирования микроорганизмов - 41,0 г, витаминный препарат ЭКД - 5,5 г, тиамин-бромид - 0,0035 г, Д (+)-глюкоза - 1,2 г, динатрий фосфат - 3,0 г, акрифлавин гидрохлорид - 0,0055 г. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,045 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1%-ного раствора NaОН при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды). Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 112^oС в течение 20 мин. После автоклавирования вносят 0,25 г теллурита калия (эквивалентное 11 мл 2%-ного водно-глицеринового раствора теллурита калия). Далее согласно примеру 1,2.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной среды представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда по показателям чувствительности и скорости роста не уступает известной среде. Предлагаемая среда имеет преимущество, так как она подавляет рост сопутствующей грамположительной микрофлоры Staphilococcus aureus "biotco", Staphilococcus aureus wood - 46, Streptococcus faecalis 1379, Streptococcus 5957 и грамотрицательной микрофлоры Escherichia Coli O₅₅K₅₉ 3912/41, Escherichia Coli 168/59, Proteus vulgaris H•19 222. Обеспечивая при этом характерный рост листерий в виде круглых, черных, мелких колоний, тем самым повышается эффективность бактериологической диагностики листериоза.

Известная среда частично подавляет рост грамотрицательной микрофлоры E. Coli O₅₅K₅₉ 3912/41, E. Coli 168/59 и не подавляет роение протея, который образует по всей поверхности чашки вуалеобразный налет, что затрудняет выделение штаммов Listeria в чистой культуре. Известная среда не подавляет рост грамположительной микрофлоры St.aureus "biotco", St. aureus "wood - 46", Str. faecalis 1379, Streptococcus 5957. При этом на известной среде невозможно идентифицировать Listeria от Streptococcus, так как они растут в виде черных колоний, что затрудняет работу бактериологов по выделению листерий.

Предлагаемая питательная среда разработана на основе гостированных ингредиентов, проста в применении, не содержит дорогостоящих, нестандартных ингредиентов, таких как мясо и сыворотка крупного рогатого скота.

Источники информации
1. Химические реактивы и высокочистые химические вещества. Каталог. М. "Химия", 1983г.

2. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики (инструктивные документы). M., 1987.

3. Бакулов Н.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Ульяновск, 1991 г.

4. Бакулов Н. И. , Васильев Д.А. Методические реакции по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листериоза. Ульяновск, 1992 г.

5. ФС42 -3520-98
6. ФС 42-386 ВС-91.

7. Qverlay technique for direct detection and identification of haemolytic Listeria on selective plating medium. Comparison of five media. Domingues lucas et.al. Z. Lebensm. - untersuch. und Forsh 1990. 191. 1.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики листериоза. Среда в качестве основного источника азота использует питательный агар для культивирования микроорганизмов, витаминный препарат "ЭКД", характеризующийся высоким содержанием аминокислот и комплекса витаминов, тиамин-бромид, глюкозу, обеспечивающую энергетическое питание, динатрий фосфат для придания изотонических свойств среды, в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры - налидиксовую кислоту, акрифлавин гидрохлорид и теллурит калия. Среда полностью ингибирует рост сопутствующей микрофлоры, обладает высокой чувствительностью, повышенной селективностью. 1 табл.

Питательная среда для идентификации листерий, содержащая питательный агар, акрифлавин гидрохлорид, теллурит калия в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве стимулятора роста витаминный препарат "ЭКД" и тиамин - бромид, в качестве энергетического питания - Д (+) глюкозу, для придания изотонических свойств среды - динатрий фосфат, в качестве дополнительного ингибитора сопутствующей микрофлоры - налидиксовую кислоту, а в качестве питательного агара - питательный агар для культивирования микроорганизмов при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:
Питательный агар для культивирования микроорганизмов - 39,0-41,0
Витаминный препарат "ЭКД" - 4,5-5,5
Тиамин-бромид - 0,0025-0,0035
Д (+) - глюкоза - 0,8-1,2
Динатрий фосфат - 2,0-3,0
Акрифлавин гидрохлорид - 0,0045-0,0055
Налидиксовая кислота - 0,035-0,045
Ex tempore теллурит калия - 0,15-0,25в