Искусственная генетическая конструкция для гетерологической экспрессии рецептор-связывающего домена S-белка в слитной полипептидной цепи с нуклеокапсидным белком Российский патент 2023 года по МПК C07K14/01 C12N15/34 C12N15/62 C12N15/63 

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и касается созданных de novo генетических конструкций и штаммов продуцентов, обеспечивающих гетерологическую экспрессию рецептор-связывающего домена S-белка в слитной полипептидной цепи с нуклеокапсидным белком, пригодных для структурно-функциональных исследований.

Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов на основе или с использованием рецептор-связывающего домена S-белка и нуклеокапсидного белка и способов их использования:

RU 2 752 858 C1. Интегративный плазмидный вектор pVEAL2-S-RBD, обеспечивающий экспрессию и секрецию рекомбинантного рецепторсвязывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 в клетках млекопитающих, рекомбинантный штамм клеточной линии CHO-K1-RBD и рекомбинантный белок RBD SARS-CoV-2, продуцируемый указанным штаммом клеточной линии CHO-K1-RBD,

RU 2 772 904 C1. Рекомбинантная плазмида pVBL-RBDdelta, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного рецептор-связывающего домена (RBD) коронавируса SARS-CoV-2 линии B.1.617.2 в клетках млекопитающих,

RU 2 752 862 C1. Штамм hCoV-19/Russia/Omsk-202118-1707/2020 коронавируса SARS-CoV-2, иммуносорбент, содержащий цельновирионный очищенный антиген, полученный на основе указанного штамма и тест-система ИФА для выявления антител классов M, G и A к коронавирусу SARS-CoV-2 с использованием указанного иммуносорбента,

RU 2 733 831 C1. Искусственный ген, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецептор-связующего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2,

RU 2 720 614 C9. Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты),

RU 2 720 614 C1. Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты),

RU 2 733 832 C1. Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2,

RU 2 743 595 C1. Вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19,

RU 2 743 593 C1. Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов,

RU 2 743 594 C1. Пептидные иммуногены, используемые в качестве компонентов вакцинной композиции против коронавирусной инфекции COVID-19,

RU 2 738 081 C1. Пептидные иммуногены и вакцинная композиция против коронавирусной инфекции COVID-19 с использованием пептидных иммуногенов,

US 1 0973908 B1. Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine,

CN112707968A. Recombinant receptor binding protein and recombinant receptor protein for detecting neutralizing antibody of novel coronavirus,

WO 2021 216205 A1. Vaccines formed by virus and antigen conjugation,

WO 2022 096899 A1. Viral spike proteins and fusion thereof,

WO 2021 188818 A1. Vaccine constructs and compositions and methods of use thereof,

WO 2021 219047 A1. Method for improving immunogenicity of protein/peptide antigen,

CN 111620952 A. Novel coronavirus vaccine based on chimeric virus-like particles,

WO 2021 163365 A1. Sars-cov-2 vaccine,

WO 2021 211688 A1. Sars-2 spike protein designs, compositions and methods for their use,

WO 2022 131832 A1. Novel vaccine composition for prevention and treatment of coronavirus,

RU 2 742 336 C1. КРОСС-РЕАКТИВНАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА А ЧЕЛОВЕКА,

SU 1 713 930 A1. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая кор-антиген вируса гепатита В, лишенный ДНК 39С концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pReS/1-55/, способ ее конструирования и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент кор-антигена, вируса гепатита В, лишенного 39 С концевых аминокислот с экспонированным на его поверхности эпитопом pReS /1-55/,

RU 2 216 590 C1. РЕКОМБИНАНТНЫЙ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA TYPHIMURIUM T10/PKHBC - ПРОДУЦЕНТ КОРОВОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В,

Известен природный ген рецептор-связывающего домена S-белка, депонированного в базе данных GenBank под номером QHD43416.1 (фрагмент Arg333-Phe526, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/QHD43416.1). Также известен природный ген нуклеокапсидного белка депонированного в базе данных Uniprot номер P03146 (фрагмент Met1-Val149, https://www.uniprot.org/uniprot/P03146).

Однако из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала идентичная представленной SEQ ID NO: 1, близкая естественная или искусственная генетическая конструкция кодирующая рецептор-связывающий домен S-белка и нуклеокапсидный белок в слитной полипептидной цепи.

Отличительными признаками изобретения являются: ген кодирующий два белка в слитной полипептидной цепи, а именно рецептор-связывающий домен (фрагмент Arg333-Phe526) S-белка и нуклеокапсидный белок (фрагмент Met1-Val149); ген полностью искусственно составленный и обладающий оптимизированным составом кодонов обеспечивающим рекомбинантную гетерологическую экспрессию химерного белка как в прокариотической так и в эукариотической системе экспрессии (например в E. coli и P. pastoris; ген дополнительно оптимизированный с целью предотвращения образования шпилек РНК на 5`-конце; обеспечение простой детекции и/или возможности аффинной очистки целевого продукта благодаря наличию в составе гена кодирующего последовательно несколько аминокислотных остатков гистидина в той же рамке считывания (полигистидиновый таг); наличие гена кодирующего аминокислотную последовательность соответствующую сайту узнавания протеиназы вируса гравировки табака (ВГТ) после двух белков в химерной конструкции и перед полигистидиновым тагом, что позволяет в процессе очистки, при необходимости, произвести отделение полигистидинового тага от основной химерной конструкции с помощью высокоспецифичного протеолитического фермента; наличие гена кодирующего пептид состоящий из аминокислотных остатков глицина и серина (гибкий линкер) между генами двух белков в слитной полипептидной цепи.

Техническим результатом изобретения является возможность гетерологического синтеза химерного белка в рекомбинантных штаммах продуцентах, а также возможность получения его гомогенного препарата подходящего для структурных и биофизических исследований, а также использования для конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Аминокислотные последовательности белков были взяты из баз данных GenBank и Uniprot, добавлены гены кодирующие линкер, сайт узнавания протеиназы, полигистидиновый таг, проведена замена кодонов на оптимальные (как указано выше). Синтез гена белка был заказан в компании GenScript (США) в составе плазмидного вектора pPICZalphaA (Invitrogen, США). Правильность гена и сборки экспрессионного вектора проверялась секвенированием. Для амплификации плазмидной ДНК (вектора) использовался бактериальный рекомбинантный штамм E. coli DH10b.

Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой pPICZalphaA трансформировались клетки дрожжей P. pastoris штамма GS115, в которых методом рекомбиниринга экспрессионная кассета с целевым геном SEQ ID NO: 1 встраивалась в хромосомную ДНК. Далее проводилась селекция клонов (фиг. 1) - отбирались клоны с наибольшим количеством вставок в хромосомную ДНК посредством выращивания колоний на твёрдых агаризованных питательных средах с возрастающей концентрацией антибиотика зеоцина. Клоны содержащие набольшее количество вставок экспрессионных кассет содержащих гент устойчивости к антибиотику вырастали при наибольшей его концентрации. Таким образом получился ряд рекомбинантных штаммов-продуцентов P. pastoris, в геноме которых содержался целевой ген. В результате культивирования штамма-продуцента, в биомассе нарабатывался целевой белок, что проверялось методом дот-блота с помощью антител против полигистидинового тага (фиг. 2). После наработки биомассы проводилось выделение целевого белка при помощи гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась сборка нуклеокапсидного белка методом динамического светорассеяния (DLS) (фиг. 3) и электронной микроскопии (EM) (фиг. 4).

Сущность изобретения поясняется фигурами 1-4 и показывает его техническую реализуемость.

На фиг.1 представлены фотографии твёрдых агаризованных питательных сред YPD в чашках Петри стандартного размера с возрастающей концентрацией антибиотика. Клоны содержащие набольшее количество вставок экспрессионных кассет содержащих гент устойчивости к антибиотику вырастали при наибольшей его концентрации (1500 мкг/мл). Таким образом получился ряд рекомбинантных штаммов-продуцентов P. pastoris, в геноме которых содержался целевой ген в наибольшем количестве копий.

На фиг.2 приведены результаты тестирования экспрессии при культивировании штаммов-продуцентов методом дот-блота с помощью антител против полигистидинового тага для выявления наиболее продуктивных штаммов-продуцентов. Точка справа вне столбца соответствует пробе контрольного белка содержащего полигистидиновый таг нанесённого на мембрану. Остальные точки в рядах и столбцах соответствуют конкретным клонам штамма-продуцента. В верхней половине фотографии мембраны представлены пробы лизированной биомассы клонов штамма-продуцента, в нижней — пробы культуральной жидкости.

На фиг.3 приведены результаты измерений характерного гидродинамического размера продуктов гена SEQ ID NO: 1 с помощью динамического светорассеяния (DLS). В расчёте использовалась сферическая форма рассеивающих частиц. В левой части фигуры приведён график зависимости интенсивности сигнала (%, ось ординат) от размера (нм, ось абсцисс), в правой части фигуры приведено изображение соответствующей корреляционной функции. Обе части фигуры содержат две кривые: одна соответствует неклеокапсидному белку без рецептор-связывающего домена (меньшие значения распределения размеров частиц (левая часть фигуры — левый график, правая часть фигуры — график слева внизу)), вторая соответствует продукту гена SEQ ID NO: 1 (левая часть фигуры — правый график, правая часть фигуры — график справа вверху)). Проведённый анализ методом DLS показывает размер полученной частицы соответствующий ожидаемому.

На фиг.4 приведены микрофотографии продукта гена SEQ ID NO: 1 показывающие правильный (шарообразный) фолдинг входящего в состав химерного белка нуклеокапсидного белка образующего сферическую частицу и размер полученной сферической частицы соответствующий ожидаемому. Фотографии выполнены с помощью метода электронной микроскопии (EM) в негативном контрастировании, шкалы 100 и 50 нм для масштабирования снимка приведены на изображениях.

Перечень последовательностей

Последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1

atgaccaatctgtgtccgtctgtatatgcttggaaccgtaagcgtatttccaactgcgtggccgactacagcgttttctacaacagcgcatccttcagcacctttaagtgctacggcgtcagcccgaccaaatttaatgatttctgttttacgaacgtttatgcagacagcttcgtgatccgtggtgatgaagttcgtcaaattgcgccaggtcagaccggcaaaatcgcggactacaactacaagctgccggatgacttcactggttgcgtcatcgcgtggagttctaacaacctggattccaaagttggcggtaattacaactacctgtaccgtctgtttcgtaagagcaatctgaaaccgtttgagcgtgacatcagcaccgagatttatcaagcgggttctacgccgtgtaatggcgtggaaggtttcaactgctattttccgctgcaaagctatggcttccagcctaccaacggcgtgggttatcagccgtatcgtgttgtggtgctgtctttcgagctgctgcacgctccggctaccgtttgcggcaccggtggtggcggttccggtggtaccatggatatcgacccgtacaaagaatttggcgcaaccgttgagttcctgtctttcctgccgagcgattttttcccgtccgtgcgtgacctgttcgataccgcttctgccttctaccgtgaggcgtttgagagcccggagcactgcagcccgcatcacaccgcgctgcgtcaggcaattctgtgttggggtgaactgatgaccctggcgacttgggttggtgtcaactttgaggacccggcgagcagagacctggttgtctcctacgtgaacaccaacatgggtctgaagttccgtcaactgctgtggtttcatatcagctgcctgacctttggccgtgaaacggttattgaatatttcgtgtctttcggcgtttggattcgtaccccgccagcgtatcgtccgcctaatgctccgatcctgagcaccctgccggagactacggtggtgggatccggtggcggttccggtaagcttgaaaacctgtacttccagggtctcgaggtcgaccaccaccatcaccaccatcaccaccat

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, в частности к созданной de novo генетической конструкции, обеспечивающей гетерологическую экспрессию рецептор-связывающего домена S-белка в слитной полипептидной цепи с нуклеокапсидным белком. Изобретение может быть применимо в гетерологическом синтезе указанного химерного белка в рекомбинантных штаммах продуцентах, а также для получения его гомогенного препарата, подходящего для структурных и биофизических исследований. 4 ил.

Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, кодирующая рецептор-связывающий домен S-белка в слитной полипептидной цепи с нуклеокапсидным белком.