СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТРИФОСФАТОВ ДЕЗОКСИУРИДИНА И ДНК-ПОЛИМЕРАЗ СОЧЕТАНИЕМ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР И ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Описание патента на изобретение RU2736969C1

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, органической химии, биотехнологии, микробиологии и медицины и обеспечивает способ определения субстратной совместимости производных нуклеозидтрифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз, заключающийся в сочетании методов: количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB длиной 215 п. н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п. н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог, а также электрофоретического контроля продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта. Предлагаемое изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК и модифицированных ДНК-аптамеров методом SELEX, функциональных аналогов моноклональных антител.

Уровень техники, к которой относится изобретение

Модифицированные нуклеиновые кислоты находят разнообразное применение в методах молекулярной диагностики и терапии. Введение метки в ДНК-зонд позволяет детектировать взаимодействие этого зонда с субстратом, что открывает широкие возможности для создания диагностических систем, основанных на применении ДНК-биосенсоров или ДНК-биочипов, которые позволяют проводить массовый скрининг биологических образцов с одновременным анализом сотен и даже тысяч исследуемых параметров (мутации, точечные нуклеотидные замены (SNPs), выявление болезнетворных агентов и т.п.). Такой меткой может служить радиоактивный изотоп (Detection of specific sequences in nucleic acids, US patent, 4883750, - 1989, Applied biosystems, США), биотин {hanger P.R. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes / P.R. Langer, A.A. Waldrop, D.C. Ward // Proc Nati Acad Sci USA. - 1981. - V. 78. - №11. - P. 6633-6637), флуоресцентный краситель (Биочип для определения мутаций в гене галактоза-1-фосфат-уридил трансферазы, вызывающих поражение печени у новорожденных детей, RU патент, - 2009139324, - 2009, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта РАН, Федеральное агентство по науке и инновациям, Россия) и др.

Нуклеиновые кислоты могут взаимодействовать с молекулярными мишенями белковой природы (Patel D.J. Structure, recognition and discrimination in RNA aptamer complexes with cofactors, amino acids, drugs and aminoglycoside antibiotics. / D.J. Patel, A.K. Suri // J. Biotechnol. - 2000. - V. 74. №1. - P. 39-60). Одноцепочечные фрагменты нуклеиновых кислот, имеющие аффинное сродство к молекулярной мишени, получили название аптамеры. Аптамеры на основе нуклеиновых кислот, по сути, являются функциональными синтетическиими аналогами белковых антител. Аптамеры получают путем отбора фрагментов нуклеиновых кислот по признаку их аффинного сродства к мишени. Методология заключается в повторяющихся циклах взаимодействия вырожденной комбинаторной библиотеки олигонуклеотидов (библиотека олигонуклеотидов со случайными нуклеотидными последовательностями) с молекулярной мишенью и стадиях ферментативной амплификации методом ПЦР той части ДНК-библиотеки, которая связалась с мишенью. Циклы селекции многократно повторяют.

В ходе процесса, который получил название SELEX, происходит обогащение библиотеки высокоаффинными последовательностями и экспоненциальное увеличение их количества. Связывание происходит путем образования водородных связей, электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий нуклеиновых оснований и определенных пространственных форм белковой глобулы.

Недостатком аптамеров на основе природных нуклеотидов является ограниченное разнообразие функциональных групп, входящих в состав ДНК. В белках имееется 21 функциональная группа, в ДНК 4 функциональные группы. Аптамеры на основе природных нуклеотидов часто имеют высокие константы диссоциации со своими мишенями, что является недостатком. Для увеличения липофильного (гидрофобного) взаимодействия аптамеров с мишенью в их структуру вводят липофильные заместители, чаще всего в 5-положение пиримидинового основания нуклеотидов.

Авторами публикации (Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery / L. Gold, D. Ayers, J. Bertino et al. // PLoS One. - 2010. - V. 5. - №12:e15004; Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection / Vaught J.D., Bock C., Carter J. et al. // J Am. Chem. Soc. - 2010. - V. 132. - P. 4141-4151) для получения модифицированных аптамеров предложены карбоксамидные производные дезоксиуридинтрифосфата. Для получения аптамеров на основе карбоксамидных производных дезоксиуридина разработана специальная модифицированная процедура SELEX. С природной ДНК-библиотеки методом реакции удлинения праймера (primer extension, РЕХ) получали комплементарные копии одноцепочечных модифицированных ДНК, которые затем использовали для взаимодействия с мишенью. Реакция удлинения праймера (primer extension, РЕХ) менее чувствительна к изменениям в структуре нуклеотидов чем ПЦР. С той части одноцепочечных модифицированных ДНК, которые связались с мишенью, получают комплементарные копии природных ДНК. Копии природных ДНК затем амплифицируют в ПЦР и получают частично обогащенную природную ДНК-библиотеку, которую используют на последующем цикле селекции. Циклы селекции многократно повторяют. Такая процедура связана с тем, что карбоксамидные производные дезоксиуридинтрифосфатов в ходе ПЦР не встраиваются ДНК-полимеразами в продукт амплификации.

При амплификации ДНК методом РЕХ происходит увеличение количества синтезируемых молекул ДНК в геометрической прогрессии (n*2), что недостаточно для эффективного выполнения SELEX. В случае амплификации ДНК методом ПЦР происходит увеличение количества синтезируемых молекул ДНК в экспоненциальной прогрессии, что позволяет эффективно выполнять SELEX, отбирать аптамеры из библиотеки случайных последовательностей ДНК. Дополнительные процедуры, связанные с несовместимостью карбоксамидных производных нуклеотидов с ДНК-полимеразами в ПЦР, сильно усложняют процесс получения модифицированных ДНК-аптамеров.

В ведущих научных лабораториях промышленно-развитых стран ведутся интенсивные исследования по поиску структур модифицированных нуклеотидов, которые бы воспринимались ДНК-полимеразами и поиск ДНК-полимераз, которые совместимы с модифицированными нуклеотидами. Поиску способов определения субстратной совместимости модифицированных нуклеотидов и ДНК-полимераз уделяется значительное внимание.

Авторами патентной заявки (Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto, WO патентная заявка, - 077292, - 2015, Somalogic Inc, США) для получения аптамеров предложен ряд модифицированных дезоксицитидинтрифосфатов с не встречающимися в природных биомолекулах функциональными группами, присоединенными через карбоксамидный линкер. Совместимость предложенных производных дезоксицитидина с ДНК-полимеразами в ПЦР авторами не указывается.

В патентной завявке (Compositions and methods for detecting microorganisms, WO патентная заявка, - 126769, - 2015, Somalogic Inc, США) ряд модифицированных нуклеотидов, предназначенных для получения аптамеров, существенно расширен. Наряду с производными дезоксицитидина предложено использовать производные дезоксиуридина. Кроме того, помимо карбоксамидного линкера, предложено использовать линкеры, включающие комбинацию нескольких гетероатомов. Совместимость предложенных производных дезоксиуридина и дезоксицитидина с ДНК-полимеразами в ПЦР авторами не указывается.

Автором публикации (The joys of in vitro selection: chemically dressing oligonucleotides to satiate protein targets /B.E. Eaton // Curr. Opin. Chem. Biol. - 1997. - V. 1. - P. 10-16; New uridine derivatives for systematic evolution of RNA ligands by exponential enrichment / T. Dewey, A. Mundt, G. Crouch et al. // J. Am. Chem. Soc. - 1995. - V. 117. - P. 8474-8475) предложен ряд модифицированных дезоксиуридинтрифосфатов, содержащих в положении 5 нуклеозида различные функциональные группы. Совместимость предложенных производных дезоксиуридинтрифосфатов с ДНК-полимеразами в ПЦР автором не указывается.

В патенте (Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same, US patent, - 1998, - 6175001, The Scripps Research Institute, США) для получения аптамеров предложен ряд модифицированных пиримидиновых нуклеотидов, содержащих в положении 5 функциональные группы, характерные для природных аминокислот.

Авторами публикации (Systematic characterization of 2'-deoxynucleoside-5'-triphosphate analogs as substrates for DNA polymerases by polymerase chain reaction and kinetic studies on enzymatic production of modified DNA / Kuwahara M., J. Nagashima, M. Hasegawa et al // Nucleic Acids Res. - 2006. - V. 34. - P. 5383-5394) исследована субстратная совместимость модифицированных по 5-положению трифосфатов 2'-дезоксиуридина и 2'-дезоксицитидина с ДНК-полимеразами Taq, Tth, Vent(exo-), KOD Dash and KOD(exo-) в ПЦР при полной замене природного dTTP на модифицированный аналог. В качестве матрицы использовали коммерческую плазмиду pUC18 и по паре комплементарных праймеров к регионам длиной 110 и 108 пар нуклеотидов. Полноразмерные продукты регистрировали методом электрофореза. Эффективность получения полноразмерных продуктов в ПЦР с модифицированными нуклеотидами сильно различается для ДНК-полимераз. Различия наблюдали и для исследованных регионов, что связано с различиями в последовательности нуклеотидов.

Авторами публикации (Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. /Kuwahara M., Hanawa K., Ohsawa K. et al // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2006. - V. 14. - P. 2518-2526) ряд модифицированных по С5-положению трифосфатов 2'-дезоксиуридина расширен. В структуру заместителей дополнительно ввели остатки природных аминокислот. Модифицированные нуклеотиды исследовали в качестве субстратов с ДНК-полимеразами Taq, Tth, Vent(exo-), KOD Dash and KOD(exo-) в ПЦР при полной замене природного dTTP на модифицированный аналог.

В публикации (The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing 5-(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. / Latham J.A., Johnson R., Toole J.J. // Nucleic Acids Research. - 1994. - V. 22. - P. 2817-2822) предложен модифицированный 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, несущий в 5-положении функциональную пентинильную группу. Соединение оказалось совместимо с доступной Vent (ехо-) ДНК-полимеразой в ПЦР. На основе этого модифицированного нуклеотида получен модифицированный ДНК-аптамер к белку тромбину.

Заявляемое изобретение отличается от вышеописанных аналогов тем, что для определения субстратной совместимости модифицированных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов с модифицирующими группами по 5-положению пиримидинового основания и ДНК-полимераз использовали сочетание методов: количественной ПЦР на специальной ДНК матрице из природных нуклеотидов, включающей вырожденную (комбинаторную) область, длиной 40 нуклеотидов с фланкирующими (праймерными) участками постоянной последовательности при полной замене одного из природных нуклеотидов на модифицированный аналог, метода количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB длиной 215 п. н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п. н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог, а также метода электрофоретического разделения продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта.

Заявляемое изобретение позволяет определить степень совместимости ДНК-полимераз и модифицированных трифосфатов дезоксиуридина в зависимости от химической природы модифицирующего заместителя и длины линкера, соединяющего его с пиримидиновым основанием. Заявляемое изобретение позволяет определить ингибирующее влияние модифицированых трифосфатов дезоксиуридина в различных концентрациях на получение продуктов ПЦР.

Наиболее перспективными областями применения изобретения является использование совместимых производных трифосфатов дезоксиуридина и ДНК-полимераз при получении модифицированых аптамеров, которые по назначению могут применяться для анализа белковых, пептидных и низкомолекулярных биологически-активных молекулярных мишеней, в том числе в датчиках и сенсорных устройствах, а также в качестве терапевтических средств. Модифицированные аптамеры, в отличие от антител, устойчивы к протеазам, что открывает новые возможности их применения, недостижимые для антител.

Раскрытие изобретения

В заявляемом изобретении для определения субстратной совместимости модифицированных трифосфатов дезоксиуридина и ДНК-полимераз использовали сочетание методов:

- количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью длиной 40 нуклеотидов с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог;

- количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB М. tuberculosis длиной 215 п. н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п. н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог;

- электрофоретического контроля продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта.

В заявляемом изобретении использовали синтетические олигонуклеотиды с вырожденной центральной частью Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 и прайцмеры Forw_1-06 и Rev_1-06.

В заявляемом изобретении в качестве бактериальной ДНК-матрицы использовали фрагмент бактериальной ДНК гена rpoB (М. tuberculosis) Matrix_215 длиной 215 п. н., праймеры Forw_215, Rev_215 для амплификации фрагмента длиной 215 п. н. и праймеры Forw_126, Rev_126 для амплификации «вложенного» короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п. н.

В заявляемом изобретении использовали модифицированные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов (mod-dUTP), несущие по С5-положению функциональные группы, присоединенные через карбониламиноаллильный линкер, аллильная часть линкера связана с 5-положением пиримидинового основания транс-алкеновой связью (Фиг. 1). Функциональные группы представлены линейными алифатическими: пропильной (dU121), бутильной (dU126); разветвленными алифатическими: изо-пропильной (dU104), 2-метилпропильной (dU105), 3-метилбутильной (dU106), 4-метилпентильной (dU120); фенилалкильными: фенилметильной (dU99), 2-фенилэтильной (dU111), 3-фенилпропильной (dU118), (4-оксифенил)метильной (dU122); алкилиндольными: (3-индолил)метильной (dU100), (3-индолил)этильной (dU107), (3-индолил)пропильной (dU110). Модифицированные производные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов получены реакцией 5-аминоаллил-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов с N-оксисукцинимидными производными соответствующих кислот.

В заявляемом изобретении использовали ДНК-полимеразы с отсутствующей корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, относящиеся к разным семействам - Taq (семейство А) и Vent(exo-) (семейство В).

В заявляемом изобретении использовали ПЦР с регистрацией в реальном времени, (Real time PCR) по накоплению флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) с возбуждением флуоресценции на длине волны около 500 нм и регистрацией около 530 нм.

Полученные кривые использовали для расчета эффективности амплификации по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическом масштабе (Фиг. 2). В случае вырожденной ДНК-библиотеки, при амплификации которой характер накопления сигнала носил волнообразный характер, вычисления осуществляли по первичному увеличению интенсивности сигнала (Фиг. 2а, Фиг. 2б). Значения эффективности амплификации ДНК для mod-dUTP, вычисленные на основании количественной ПЦР с регистрацией в реальном времени, приведены в табл. 1.

В заявляемом изобретении выход полноразмерных продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 4% агарозном геле. Визуализацию продуктов реакции осуществляли окрашиванием агарозного геля, в котором разделяли продукты ПРЦ, бромистым этидием. Количественную оценку полноразмерного продукта проводили по оптической плотности соответствующих полос в дорожках геля (Фиг. 3).

Выходы целевых продуктов ПЦР для mod-dUTP, определенные на основании результатов электрофореза, приведены в табл. 1. Из таблицы 1 видно, что эффективность амплификации постепенно уменьшается и для Taq-, и для Vent (ехо-)-полимеразы в ряду трифосфатов дезоксиуридина, модифицированных по С5положению азотистого основания фрагментами насыщенных алифатических углеводородов с увеличением длины (и гидрофобности) последних. В ряду ароматических и гетероциклических углеводородов эффективность амплификации уменьшается еще более, причем тенденция зависимости от длины гидрофобного линкера сохраняется.

По эффективности амплификации и по выходу целевого проукта Vent (ехо-)-полимераза демонстрирует преимущество перед Taq-полимеразой. Для Vent (ехо-)-полимеразы пригодны все mod-dUTP (Фиг. 1) с разной степенью эффективности. Для Taq-полимеры относительно хорошими субстратами являются лишь производные с короткими фрагментами насыщенных алифатических углеводородов.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Химическое строение производных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов, несущих по С5-положению функциональные группы, присоединенные через карбониламиноаллильный линкер.

Фиг. 2. Кривые накопления продукта для производных 5'-трифосфатов-2'-дезоксиуридина с полимеразами Taq и Vent (ехо-) и с двумя типами ДНК-матриц -бактериальной ДНК с фиксированной последовательностью и вырожденной синтетической ДНК. ПЦР в режиме реального времени. Визуализация с помощью красителя EvaGreen (Biotium, США).

Фиг. 3. Электрофореграммы продуктов ПЦР с производными 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов при полном замещении природного dTTP. 4% агарозный гель, окрашивание бромистым этидием. NC - отрицательный контроль.

Таблица 1. Эффективность амплификации ДНК и выход целевого продукта при использовании в качестве субстрата mod-dUTP при полной замене природного dTTP. Е - эффективность амплификации (Е=10tgα, где Е - эффективность амплификации, tgα - тангенс угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления флуоресцентного сигнала, представленной в логарифмическом масштабе), η - выход продукта, нормированный на выход немодифицированной ДНК (ПЦР с использованием природного dTTP).

Осуществление изобретения

Для осуществления изобретения кинетику амплификации изучали методом ПЦР в реальном времени по накоплению флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) для каждого модифицированного трифосфата дезоксиуридина на приборе BioRad IQ5. Использовали Taq- и Vent (ехо-)-ДНК-полимеразы, количество которых в реакционную смесь брали согласно рекомендациям производителя (1.5 ед. акт. для Taq-, и 0.5 ед. акт. для Vent (ехо-) полимераз). Реакционная смесь содержала 200 мкМ каждого из немодифицированных дезоксинуклеозидтрифосфатов dATP, dCTP, dGTP, dTTP или один из mod-dUTPs при полной замене природного dTTP на mod-dUTP. В качестве матрицы использовали синтетические олигонуклеотиды "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов длиной 86 нуклеотидов каждая с вырожденной центральной частью длиной 40 нуклеотидов с взаимно комплементарными фланкирующими частями и бактериальную ДНК-матрицу представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB М. tuberculosis длиной 215 п. н. по 106 копий. Температурно-временной профиль ПЦР состоял из предварительной денатурации при 95°С в течение 3 мин, за которой следовали 40 циклов: 95°С (денатурация ДНК) в течение 30 с, 64°С (отжиг праймеров) в течение 30 с, 72°С (достройка праймеров) в течение 40 с и далее завершающая инкубация при 72°С в течение 5 мин.

Эффективность реакции определяли по углу наклона прямого участка S-образной кривой накопления ДНК, представленной в логарифмическом масштабе. Использовали следующую формулу для расчета эффективности: E=10tgα, где Е - эффективность амплификации (динамический показатель накопления флуоресцентного сигнала), tgα - тангенс угла наклона линейного участка кривой накопления флуоресцентного сигнала.

При определении выхода продуктов амплификации в ходе ПЦР в реакционную смесь не добавляли интеркалирующий краситель Eva Green. Температурно-временной режим был аналогичен, примененному для ПЦР в реальном времени, за исключением количества циклов амплификации, которое составляло 32 цикла. Продукты ПЦР разделяли в 4% агарозном геле и затем окрашивали бромистым этидием. Выход целевых продуктов ПЦР оценивали по оптической плотности полос в дорожках геля, соответствующих полноразмерному продукту, с использованием программы ImageJ (NIH, США).

Примеры и их применение

Для осуществления изобретения использовали модифицированные трифосфаты дезоксиуридина которые синтезировали по описанному методу [Чудинов А.В., Киселева Я.Ю., Кузнецова В.Е., Шершов В.Е., Спицын М.А., Гусейнов Т.О., Лапа С.А., Тимофеев Э.Н., Арчаков А.И., Лисица А.В., Радько С.П., Заседателев А.С. 2017. Ферментативный синтез ДНК с высокой степенью модификации. Молекуляр. биология. 51, 534-544].

Использовали синтетические олигонуклеотиды с вырожденной центральной частью Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 и прайцмеры Forw_1-06 и Rev_1-06.

Использовали в качестве бактериальной ДНК-матрицы фрагмент бактериальной ДНК гена rpoB (М. tuberculosis) Matrix_215 длиной 215 п. н., праймеры Forw_215, Rev_215 для амплификации фрагмента длиной 215 п. н. и праймеры Forw_126, Rev_126 для амплификации «вложенного» короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п. н.

Использовали немодифицированные dNTPs (Thermo Scientific, США), полимеразы Taq (Thermo Scientific) и Vent (exo-) (New England Biolabs, США). ПЦР в режиме реального времени проводили в амплификаторе iCycleriQ5 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве флуоресцентного красителя для ПЦР в режиме реального времени использовали Eva Green (Biotium, США). Для разделения фрагментов ДНК использовали электрофорез в 4% агарозном геле. Для окрашивания электрофорезных гелей использовали бромид этидия ("Хеликон", Россия). В качестве маркера длин ДНК использовали 50 bpDNA Ladder (Thermo Scientific, США).

Использовали полуавтоматические пипетки (Gilson, Франция), амплификатор РТС-220 (Bio-Rad, США), амплификатор для ПЦР в режиме реального времени IQ5 (BioRad, США), центрифуга-вортекс "Микроспин" FV-2400 (Biosan, Латвия), высокоскоростную центрифугу для микропробирок Frontier5515 (Ohaus, США), система для горизонтального электрофореза (ООО "Хеликон", Россия), транс-иллюминатор ТСР-20.МС 254/312 нм (Vilber Lourmat, Франция), цифровой фотоаппарат EOS 500D (Canon, Япония) с оптическим фильтром SYBR photographic filter S7569 (Molecular Probes, США). Олигонуклеотиды синтезировали с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA (Applied Biosystems, США). Измерение концентрации олигонуклеотидов и ДНК проводили с помощью спектрофотометра для микрообъемов Nano Drop 1000 (Thermo Scientific, США).

Пример 1.

Количественную ПЦР-РВ проводили в 25 мкл реакционной смеси содержащей смесь матриц Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 каждой по 106 копий, праймеров Forw_1-06 и Rev_1-06 каждого по 5 мкМ, dU119, dATP, dCTP, dGTP каждого по 200 мкМ, Taq ДНК-полимеразу 1.5 ед.акт., краситель Eva Green (Biotium, США), реакционный буфер, оставляемый производителем полимеразы. ПЦР-РВ проводили в амплификаторе iCycler iQ5 ("Bio-Rad Laboratories", США) с возбуждением флуоресценции на длине волны около 500 нм и регистрацией около 530 нм. при следующих условиях: 95°С в течение 3 мин (начальная денатурация); 40 циклов: 95°С (денатурация ДНК) в течение 30 с, 64°С (отжиг праймеров) в течение 30 с, 72°С (достройка праймеров) в течение 40 с и далее завершающая инкубация при 72°С в течение 5 мин. Результаты представлены на Фиг. 2а.

Полученные кривые использовали для расчета эффективности амплификации по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическо масштабе. Вычисления осуществляли по первичному увеличению интенсивности сигнала (Фиг. 2а). Значения эффективности амплификации ДНК, вычисленные на основании количественной ПЦР с регистрацией в реальном времени, приведены в табл.1. (Где Е - эффективность амплификации (Е=10tgα, где Е - эффективность амплификации, tgα - тангенс угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления флуоресцентного сигнала, представленной в логарифмическом масштабе).

Пример 2. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 3. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 4. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 5. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 6. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 7. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 8. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 9. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 10. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 11. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, в табл. 1.

Пример 12. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг, 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 13. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 2а. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 14. Аналогично примеру 1 с заменой Taq ДНК-полимеразы на Vent (ехо-) полимеразу (0.5 ед. акт.). Результаты представлены на Фиг. 10 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 15. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 16. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 17. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 18. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 19. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 10 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 20. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 21. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 22. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 23. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 24. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 25. Аналогично примеру 14 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 26. Аналогично примеру 1 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 2б. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 27. Аналогично примеру 1 с заменой матриц Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 и праймеров Forw_1-06 и Rev_1-06, на матрицу Matrix_215 106 копий, праймеры Forw_126, Rev_126 каждого по 5 мкМ. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 28. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 29. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 30. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 31. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 32. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 33. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 34. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 35. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 36. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 37. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 38. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 39. Аналогично примеру 27 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 2в. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 40. Аналогично примеру 27 с заменой Taq ДНК-полимеразы на Vent (ехо-) полимеразу (0.5 ед. акт.). Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 41. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 42. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 43. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 44. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 45. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 46. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 47. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 48. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 49. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 50. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 51. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 52. Аналогично примеру 40 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 2 г. Значения эффективности амплификации ДНК, представлены в табл. 1.

Пример 53. Аналогично примеру 1, с заменой 40 циклов на 32 цикла и без добавления красителя Eva Green в реакционную смесь. Полученные ПЦР-продукты разделяли в 4% агарозном геле и затем окрашивали бромистым этидием. Выход целевых продуктов ПЦР оценивали по оптической плотности полос в дорожках геля, соответствующих полноразмерному продукту, с использованием программы ImageJ (NIH, США). Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 54. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 55. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 56. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 57. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 58. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 59. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 60. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 61. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 62. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 63. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 64. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 65. Аналогично примеру 53 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 3а. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 66. Аналогично примеру 53, с заменой Taq ДНК-полимеразы на Vent (ехо-) полимеразу (0.5 ед.акт.). Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 67. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 68. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 69. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 70. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 71. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 72. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 73. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 74. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 75. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 76. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 77. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 78. Аналогично примеру 66 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 3б. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 79. Аналогично примеру 53, с заменой с заменой матриц Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 и праймеров Forw_1-06 и Rev_1-06, на матрицу Matrix_215 106 копий, праймеры Forw_126, Rev_126 каждого по 5 мкМ. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 80. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 81. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 82. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 83. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 84. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 85. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 86. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU99. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 87. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 88. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 89. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 90. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 91. Аналогично примеру 79 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 3в. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 92. Аналогично примеру 79 с заменой Taq ДНК-полимеразы на Vent (ехо-) полимеразу (0.5 ед. акт.). Результаты представлены на Фиг. 3 г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 93. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU126. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 94. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU104. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 95. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU105. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 96. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU106. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 97. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU120. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 98. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 99. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU122. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 100. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU111. Результаты представлены на Фиг. 3 г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 101. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU118. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 102. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU100. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 103. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU107. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Пример 104. Аналогично примеру 92 с заменой dU119 на dU110. Результаты представлены на Фиг. 3г. Выход целевых продуктов ПЦР, представлен в табл. 1.

Похожие патенты RU2736969C1

название год авторы номер документа
Способ определения субстратной эффективности производных трифосфатов дезоксиуридина для ДНК-полимераз методом реакции достраивания праймера 2019
  • Чудинов Александр Васильевич
  • Василисков Вадим Александрович
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Тимофеев Эдуард Николаевич
  • Лисица Андрей Валерьевич
  • Радько Сергей Павлович
  • Мифтахов Ринат Азатович
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Заседателев Александр Сергеевич
RU2731739C1
Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений 2017
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Ромашова Ксения Сергеевна
  • Спицын Максим Анатольевич
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Гусейнов Теймур Октаевич
  • Заседателева Ольга Александровна
  • Радько Сергей Павлович
  • Лисица Андрей Валерьевич
  • Чудинов Александр Васильевич
RU2699522C2
Способ термической диссоциации для проведения селекции ДНК-аптамеров 2019
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Тимофеев Эдуард Николаевич
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Радько Сергей Павлович
  • Лисица Андрей Валерьевич
  • Чудинов Александр Васильевич
RU2723373C1
Способ оценки влияния модифицированных трифосфатов дезоксинуклеозидов на олигонуклеотидный состав комбинаторных ДНК-библиотек для проведения селекции модифицированных аптамеров 2021
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Антипова Ольга Сергеевна
  • Чудинов Александр Васильевич
RU2779058C1
Способ получения модифицированных комбинаторных ДНК библиотек методом твердофазной реакции удлинения праймера на ПЭТ-микрочастицах 2018
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Мифтахов Ринат Азатович
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Спицын Максим Анатольевич
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Гусейнов Теймур Октаевич
  • Тимофеев Эдуард Николаевич
  • Радько Сергей Павлович
  • Лисица Андрей Валерьевич
  • Чудинов Александр Васильевич
RU2734941C2
Флуоресцентно-меченые дезоксиуридинтрифосфаты 2016
  • Чудинов Александр Васильевич
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Спицын Максим Анатольевич
  • Гусейнов Теймур Октаевич
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Заседателев Александр Сергеевич
RU2637310C1
Дезоксиуридинтрифосфаты, связанные с цианиновыми красителями сульфамидоалкильными линкерами, для использования в ПЦР 2017
  • Чудинов Александр Васильевич
  • Кузнецова Виктория Евгеньевна
  • Спицын Максим Анатольевич
  • Шершов Валерий Евгеньевич
  • Гусейнов Теймур Октаевич
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Заседателев Александр Сергеевич
RU2667070C1
СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОРИЛГУАНИДИНОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ 2017
  • Купрюшкин Максим Сергеевич
  • Пышная Инна Алексеевна
  • Дмитриенко Елена Владимировна
  • Стеценко Дмитрий Александрович
  • Филипенко Максим Леонидович
  • Оскорбин Игорь Петрович
  • Степанов Григорий Александрович
  • Рихтер Владимир Александрович
  • Иванов Михаил Константинович
  • Пышный Дмитрий Владимирович
RU2698134C2
Способ защиты от контаминации реакционных смесей для ПЦР 2022
  • Оскорбин Игорь Петрович
  • Ендуткин Антон Валентинович
  • Жарков Дмитрий Олегович
  • Филипенко Максим Леонидович
RU2796504C1
КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ С ГОРЯЧИМ СТАРТОМ ИЛИ ДЛЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ С ГОРЯЧИМ СТАРТОМ 2013
  • Пак Хан О.
  • Ли Чон Хи
  • Чхве Сона
  • Ким Хён Со
RU2630999C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 736 969 C1

Реферат патента 2020 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБСТРАТНОЙ СОВМЕСТИМОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТРИФОСФАТОВ ДЕЗОКСИУРИДИНА И ДНК-ПОЛИМЕРАЗ СОЧЕТАНИЕМ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР И ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Изобретение относится к области молекулярной биологии, органической химии, биотехнологии, микробиологии и медицины. Заявлен способ определения субстратной совместимости модифицированных трифосфатов дезоксиуридина и ДНК-полимераз сочетанием методом количественной ПЦР и электрофореза. Сущность изобретения заключается в том, что совместимость модифицированных нуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимераз определяется сочетанием методов: количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице, представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB длиной 215 п.н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; электрофоретического контроля продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта. Модифицированные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфаты содержат в своей структуре функциональные группы, которые присоединены к 5-положению пиримидинового основания карбониламиноаллильным линкером, аллильная часть линкера связана с 5-положением пиримидинового основания транс-алкеновой связью. Функциональные группы представлены линейными алифатическими, разветвленными алифатическими, фенилалкильными, алкилиндольными группами. Использовали ДНК-полимеразы с отсутствующей корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, относящиеся к разным семействам - Taq (семейство А) и Vent(exo-) (семейство Б). Использовали ПЦР с регистрацией в реальном времени, (Real time PCR) по накоплению флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) с возбуждением флуоресценции на длине волны около 500 нм и регистрацией около 530 нм. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 4% агарозном геле. Визуализацию продуктов реакции осуществляли окрашиванием агарозного геля, в котором разделяли продукты ПРЦ, бромистым этидием. Количественную оценку полноразмерного продукта проводили по оптической плотности соответствующих полос в дорожках геля. Предлагаемое изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК и модифицированных аптамеров, функциональных аналогов моноклональных антител. Изобретение обеспечивает определение субстратной совместимости производных нуклеозидтрифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз, предназначенных для получения высокоэффективных модифицированных ДНК-аптамеров методом SELEX. 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 104 пр., 3 ил.

Формула изобретения RU 2 736 969 C1

1. Способ определения субстратной совместимости модифицированных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов и ДНК-полимераз, отличающийся тем, что используют сочетание методов:

- количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов длиной 86 нуклеотидов каждая с вырожденной центральной частью длиной 40 нуклеотидов с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; с последующим определением эффективности амплификации по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическом масштабе и математическим определением субстратной совместимости модифицированных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов и ДНК-полимераз: значение показателя Е меньше 1.2 трактуется как несовместимость, значение Е больше или равно 1.2 трактуется как совместимость; степень совместимости определяется в диапазоне от 1.2 до 2.0 и соответствует градации от «плохо совместим» до «абсолютно совместим»;

- количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице, представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB М. tuberculosis длиной 215 п.н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; с последующим определением эффективности амплификации по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическом масштабе, и математическим определением субстратной совместимости модифицированных 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов и ДНК-полимераз: значение показателя Е меньше 1.2 трактуется как несовместимость, значение Е больше или равно 1.2 трактуется как совместимость; степень совместимости определяется в диапазоне от 1.2 до 2.0 и соответствует градации от «плохо совместим» до «абсолютно совместим»;

- количественным определением целевых продуктов ПЦР: разделение продуктов ПЦР методом электрофореза в 4% агарозном геле, окрашивание бромистым этидием, количественная оценка целевых продуктов ПЦР по оптической плотности полос в дорожках геля с применением специализированного программного обеспечения путем сравнения (вычисления математического отношения) оптической плотности полосы, соответствующей исследуемому модифицированному трифосфату дезоксинуклеозида с оптической плотностью полосы, соответствующей природному трифосфату дезоксинуклеозида; значение отношения меньше 0.2 трактуется как несовместимость, значение отношения больше или равно 0.2 трактуется как совместимость; степень совместимости определяется в диапазоне от 0.2 до 2.0 и соответствует градации от «плохо совместим» до «абсолютно совместим».

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатов содержат в своей структуре функциональные группы, которые присоединены к 5-положению пиримидинового основания карбониламиноаллильным линкером, аллильная часть линкера связана с 5-положением пиримидинового основания транс-алкеновой связью, функциональные группы представлены линейными алифатическими (пропильной, бутильной), разветвленными алифатическими (изо-пропильной, 2-метилпропильной, 3-метилбутильной, 4-метилпентильной), фенилалкильными (метилфенильной, 2-фенилэтильной, 3-фенилпропильной, (4-оксифенил)метильной), алкилиндольными группами (3-индолил)метильной, (3-индолил)этильной, (3-индолил)пропильной).

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что использованы ДНК-полимеразы с отсутствующей корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, относящиеся к разным семействам - Taq (семейство А) и Vent(exo-) (семейство Б).

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что количественную ПЦР в режиме реального времени проводят на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью длиной 40 нуклеотидов с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог, эффективность амплификации определяют по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическом масштабе.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что количественную ПЦР в режиме реального времени проводят на бактериальной матрице, фрагменте бактериальной ДНК гена rpoB (М. tuberculosis) длиной 215 п.н., и амплификации «вложенного» короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н., эффективность амплификации определяют по тангенсу угла наклона прямого участка S-образной кривой накопления сигнала, представленной в логарифмическом масштабе.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что используют синтетические олигонуклеотиды с вырожденной центральной частью Matrix_1f-06 и Matrix_1r-06 и прайцмеры Forw_1-06 и Rev_1-06:

7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в качестве бактериальной ДНК-матрицы используют фрагмент бактериальной ДНК гена rpoB (М. tuberculosis) Matrix_215 длиной 215 п.н., праймеры Forw_215, Rev_215 для амплификации фрагмента длиной 215 п.н. и праймеры Forw_126, Rev_126 для амплификации «вложенного» короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что продукты ПЦР разделяют методом электрофореза в 4% агарозном геле и затем окрашивают бромистым этидием, выход целевых продуктов ПЦР определяют по оптической плотности полос в дорожках геля.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2736969C1

Shou Goji и др., Direct Detection of Thrombin Binding to 8-Bromodeoxyguanosine-Modified Aptamer: Effects of Modification on Affinity and Kinetics, J
of nucleic acids, 15.09.2011, Volume 2011, Article ID 316079, 5 pages
ПРОСТОЙ, ЭФФЕКТИВНЫЙ И БЫСТРЫЙ СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ МОДИФИКАЦИИ И СИНТЕЗА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОВОЛНОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ 2002
  • Дас Ракха Хари
  • Нахар Прадип
RU2295568C2

RU 2 736 969 C1

Авторы

Чудинов Александр Васильевич

Лапа Сергей Анатольевич

Кузнецова Виктория Евгеньевна

Тимофеев Эдуард Николаевич

Василисков Вадим Александрович

Лисица Андрей Валерьевич

Радько Сергей Павлович

Мифтахов Ринат Азатович

Шершов Валерий Евгеньевич

Заседателев Александр Сергеевич

Даты

2020-11-23Публикация

2019-11-18Подача