СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ КРОВИ, СПЕРМЫ И СЛЮНЫ ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ВЫТЯЖЕК СО СЛЕДОВ НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано при проведении внутрилабораторного контроля качества результатов судебно-медицинских лабораторных исследований в условиях лаборатории судебно-медицинской экспертизы.

Как известно, оценка качества результатов лабораторных исследований является очень важной проблемой судебной медицины, поскольку в последние годы появилась возможность исследования вытяжки из пятен, следов и участков на вещественных доказательствах количественными методами с помощью современных автоматизированных технологий различных производителей диагностических средств с ассортиментом исследуемых биологических маркеров, которые можно обнаружить на вещественных доказательствах.

До настоящего времени отмечалось преобладание качественных, либо полуколичественных методик исследования вещественных доказательств с отсутствием единых методов оценки качества. С внедрением в лабораторную практику судебно-медицинской экспертизы методов количественного анализа возникла необходимость разработки системы оценки качества проведения исследований вытяжки из пятен, следов и участков на вещественных доказательствах, позволяющую минимизировать расхождение полученных в ходе исследований результатов посредством проведения процедур внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК), проводимых ежедневно доступными средствами и в удобные временные сроки.

В соответствии с требованиями международного стандарта ГОСТ Р ИСО 15189:2015 все медицинские лаборатории обязаны проводить процедуры внутрилабораторного контроля качества для подтверждения уровня желаемого качества получаемых результатов с использованием контрольных материалов, близких по своему составу и происхождению к исследуемым биопробам [1] и требованиями по Приказу № 45 [2]. Стандартизованные процедуры ВЛКК существуют в практике клинических лабораторных исследований и проводятся с использованием контрольных материалов, закупаемых лабораторией от надежных производителей в соответствии с ГОСТ Р 53133.2-2008 и являются обязательной составляющей системы аналитического качества, проводимой ежедневно с помощью доступных методов оценки приемлемости результатов [3]. Однако контрольные материалы из вытяжек следов вещественных доказательств, до настоящего времени не производятся, как на территории Российской Федерации, так и на международном уровне, что не позволяет внедрить существующие методы ВЛКК в практику лабораторий судебно-медицинской экспертизы. Кроме того, метод ВЛКК, который существует в медицинских лабораториях не применим для лабораторий судебно-медицинской экспертизы, так как он основан на формировании допустимых аналитических погрешностей измерения, позволяющих оценить приемлемость полученных данных, на основании базы данных по биологической вариации [4], которая была создана Международной Федерацией по Клинической Химии и Лабораторной Медицине (IFCC) для разных биомаркеров на основе экспериментальных исследований популяции здоровых лиц, исходя из их концентрации в цельной крови, сыворотке, плазме крови, моче, слюне и т.д., тогда как в судебно-медицинской практике применяется исследование экстрактов вытяжек из вещественных доказательств данных биологических жидкостей, отличных по биологическим свойствам от нативного биоматериала, также биоматериал вещественных доказательств может быть не только от живых, но и умерших лиц с разными сроками хранения до момента исследования, что не позволяет использовать существующую базу данных по биологической вариации.

В связи с вышеописанными особенностями аналоги методов ВЛКК в практике лабораторий судебно-медицинской экспертизы отсутствуют.

Техническим результатом изобретения является возможность разработки способа количественной оценки результатов внутрилабораторного контроля качества исследования биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек на вещественных доказательствах в судебно-медицинской практике.

Технический результат достигается тем, что способ количественной оценки результатов внутрилабораторного контроля качества исследования биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек вещественных доказательств в судебно-медицинской практике заключается в определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в не менее чем в 22 дубликатах установочной серии с последующим вычислением стандартного отклонения, определяемого по формуле Далберга [5]:

где

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

– разница между измерениями в дубликате,

N – количество пар (дубликатов),

S – стандартное отклонение результатов вышеуказанных количественных измерений в дубликатах,

с последующим вычислением коэффициента аналитической вариации (%СV), определяемого как относительное стандартное отклонение (%RSD) при условии, что величина стандартного отклонения (S) пропорциональна значению концентрации исследуемого вещества, определяемого по формуле Далберга [5]:

, где

- коэффициент аналитической вариации,

- относительное стандартное отклонение,

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

N - количество пар дубликатов,

после чего оценивают показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами как в установочной, так и в ежедневной серии с помощью величины стандартной неопределенности результатов измерения, выраженной через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений, с коэффициентом охвата при 95,0% доверительном интервале, равного 1,96, вычисляемой по формуле:

, где

MD – минимальная разница между двумя результатами, выраженная через неопределенность разницы u(D),

– коэффициент охвата 1,96, при 95,0% доверительном интервале,

U(A) – стандартная неопределенность результатов измерения, выраженная через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений,

после чего проводят ежедневный ВЛКК, основанный на определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в одной серии в день, состоящей из одного дубликата текущей пробы, в течение рабочих дней месяца, с вычислением показателя относительной разницы (RelDiff%) между двумя наблюдениями по формуле:

, где

RelDiff% – относительная разница;

Х1 – величина первого результата наблюдения;

Х2 – величина второго результата наблюдения,

после чего результат относительной разницы (RelDiff%), полученной при определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах в дубликатах каждой ежедневной серии, сопоставляют с величиной минимальной разницы (MD) и при нахождении показателя относительной разницы (RelDiff%) в пределах одной минимальной разницы (±1,0 MD) результат ВЛКК исследования биологических проб спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах оценивают как приемлемый.

Способ осуществляется следующим образом:

Плановые пробы судебно-медицинской экспертизы готовят из водных экстрактов со следов биологического происхождения (спермы, крови, слюны) на вещественных доказательствах, для чего вырезают фрагмент предмета-носителя, либо заведомого образца размерами от 0,5×0,5 см до 10×10 см, в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины вышеуказанных следов, после чего фрагмент заливают необходимым объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды, полностью покрывающим исследованный материал с РН=7,2-7,4 и экстрагируют при температуре 4°С от 18 до 24 часов. Из полученного экстракта определяют содержание следов вещественных доказательств, таких как сперма с помощью измерения активности ПСА, крови и костных фрагментов по наличию IgG человека методом иммуноферментного анализа, а также слюны по оценке активности амилазы с помощью колориметрического метода. Установочную серию в количестве 22 измерений в дубликатах проводят в лаборатории судебно-медицинской экспертизы. Измерение дубликатов проб в установочной серии проводят с учетом особенностей выполнения иммуноферментного и колориметрического методов исследования до накопления необходимого количества дубликатов, на что может потребоваться несколько дней, после чего вычисляют показатели стандартного отклонения (S) и коэффициента аналитической вариации (%CVa) с помощью формулы Далберга [6].

, где

- коэффициент аналитической вариации,

- относительное стандартное отклонение,

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

N - количество пар дубликатов,

после чего оценивают показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами ежедневной серии с помощью величины стандартной неопределенности результатов измерения, выраженной через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений, с коэффициентом охвата при 95,0% доверительном интервале, равным 1,96, вычисляемой по формуле:

, где

MD – минимальная разница между двумя результатами, выраженная через неопределенность разницы u(D),

– коэффициент охвата 1,96, при 95,0% доверительном интервале,

U(A) – стандартная неопределенность результатов измерения, выраженная через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений,

после чего проводят ежедневный ВЛКК, основанный на определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в одной серии в день, состоящей из одного дубликата текущей пробы, в течение рабочих дней месяца, с вычислением показателя относительной разницы (RelDiff%) между двумя наблюдениями по формуле:

, где

RelDiff% – относительная разница;

Х1 – величина первого результата наблюдения;

Х2 – величина второго результата наблюдения,

На основе полученного % CVa вычисляют показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами ежедневной серии, расцениваемый как приемлемости результатов ВЛКК.

После определения критерия приемлемости в виде MD проводят оперативный ежедневный ВЛКК с измерением проб вещественных доказательств в режиме один дубликат плановой пробы за один рабочий день, в котором осуществляют 2 повторных измерения пробы, с первым измерением в 10 часов утра и ее повторным исследованием в 12 часов каждого рабочего дня, что составляет одну серию в день на протяжении рабочих дней календарного месяца. При этом первый раз пробу измеряют для выдачи официального результата судебно-медицинской экспертизы, а повторное измерение проводят в целях контроля качества. Стабильность исследуемых биологических маркеров в сыворотке крови составляет для амилазы до 4 дней, для IgG – до 11 дней, для ПСА общего – до 1 дня при комнатной температуре в соответствии с ГОСТ Р 63079.4-2008 [7].

Каждый результат 1-го и 2-го измерений ежедневной серии заносят в протокол в виде таблицы.

В дубликатах ежедневной серии результат относительной разницы (RelDiff%), полученной при определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах в дубликатах каждой ежедневной серии, сопоставляют с величиной минимальной разницы (MD) и при нахождении показателя относительной разницы (RelDiff%) в пределах одной минимальной разницы (±1,0 MD) результат ВЛКК исследования биологических проб спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах оценивают как приемлемый.

Причинно-следственная связь между существенными признаками заявляемого способа и достигаемым техническим результатом:

• Определяют концентрацию биологических маркеров или активность ферментов в биологических пробах спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах, в не менее, чем в 22 дубликатах установочной серии.

Выбор количества не менее чем 22 повторных измерений проб исследуемого аналита в дубликатах основан на том, что повторные измерения любого параметра сужают доверительный интервал (Conf interv) и уменьшают погрешность полученных результатов. Величину доверительного интервала вычисляют с помощью стандартного отклонения в зависимости от количества пар дубликатов. На Фиг.1 показано, что стандартное отклонение (S), вычисленное с помощью формулы Далберга, отображенное по оси Y имеет самое большое значение при количестве измерений 2 и стремительно уменьшается при увеличении повторов до 5. При количестве измерений от 5 до 20 стандартное отклонение снижается менее интенсивно, а после 20 дубликатов включительно погрешность снижается не столь существенно, что служит критерием выбора для оценки погрешности повторных измерении в количестве не менее 22 (ось X).

На Фиг. 1 представлен график изменения величин стандартного отклонения и доверительного интервала, полученных при измерении дубликатов исследуемых проб по формуле Далберга, в зависимости от количества измерений. По оси X – количество измерения (Number); по оси Y – c левой стороны стандартное отклонение (S), вычисленное из дубликатов по формуле Далберга (Dahlberg), справа – доверительный интервал (Conf Interv); пологая пунктирная линия величина S; горизонтальная черная линия – значение доверительного интервала; вертикальные черные линии – диапазон доверительного интервала в зависимости от количества проб.

Как видно из представленного графика на фиг. 1, доверительный интервал для данной серии измерений находится в пределах от 0,2 до 0,8, что демонстрирует приемлемую погрешность измерений для данной серии опыта.

Применение дубликатов позволяет повторно определять концентрацию биосубстратов или активность ферментов в идентичных пробах со следов на вещественных доказательствах без изменения их свойств в целях сравнения результатов измерения при исследовании проб с разным содержанием определяемых биологических маркеров [8], что позволяет проводить количественную оценку погрешности измерений, выполненных по одной серии в день.

• Затем вычисляют стандартное отклонение, определяемое по формуле Далберга:

, где

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

– разница между измерениями в дубликате,

N – количество пар (дубликатов),

S – стандартное отклонение результатов вышеуказанных количественных измерений в дубликатах,

с последующим вычислением коэффициента аналитической вариации (%СV), определяемого как относительное стандартное отклонение (%RSD) при условии, что величина стандартного отклонения (S) пропорциональна значению концентрации исследуемого вещества, определяемого по формуле Далберга:

, где

- коэффициент аналитической вариации,

- относительное стандартное отклонение,

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

N - количество пар дубликатов,

Проведение измерение проб в дубликатах позволяет получить количественную характеристику погрешности серии измерений в виде стандартного отклонения (S) и коэффициента вариации (%CV).

Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества в соответствии с ГОСТ Р 53133.2-2008 [3] и Приказом №45 МЗ РФ [2] предусматривает выявление недопустимых случайных погрешностей с математическим выражением величины случайной погрешности в виде стандартного отклонения (S) и коэффициента вариации (CV) результатов измерений аналитов в контрольном материале, поэтому S и CV служат характеристикой случайных погрешностей и используются для оценки повторяемости и прецизионности измерений при проведении процедуры ВЛКК.

Количественное определение случайной ошибки измерения с помощью формулы Далберга является одним из известных методов, предложенных с 1940 года для оценки погрешностей, выраженных количественно с помощью стандартного отклонения, при выполнении медицинских исследований с помощью проведения двух повторных измерений одного исследуемого показателя [5]. В идеале измерение одной и той же пробы дважды не должно иметь различий в величине измеряемых показателей, поэтому величина S является характеристикой, позволяющей получить представление о возможном разбросе результатов, а CVa – процентную характеристику погрешности измерения.

• После чего оценивают показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами ежедневной серии с помощью величины стандартной неопределенности результатов измерения, выраженной через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений, с коэффициентом охвата при 95,0% доверительном интервале, равным 1,96, вычисляемой по формуле:

, где

MD – минимальная разница между двумя результатами, выраженная через неопределенность разницы u(D),

k – коэффициент охвата 1,96, при 95,0% доверительном интервале,

u(A) – стандартная неопределенность результатов измерения, выраженная через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений.

Показатель разницы между результатами одной и той же пробы пациента, оцененный в динамике, эффективно используется в медицинской практике для оценки клинической значимости различий при интерпретации данных лабораторного исследования и называется «критической разницей», или «референтным переменным значением» (RCV) [9]. Показатель RCV вычисляют с использованием данных по биологической вариации, что не применимо для судебно-медицинских исследований, при которых целесообразно оценивать разницу в дубликатах только с использованием аналитических критериев качества в виду отсутствия базы данных по биологической вариации. Применение показателя минимальной разницы (MD) между двумя результатами, выраженной через неопределенность разницы u(D) при доверительном интервале 95,0%, с метрологической точки зрения корректно и позволяет оценить границы приемлемости результатов с помощью показателя стандартной неопределенности результатов измерения (U(A)), выраженной через стандартное отклонение (S) или коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученными при проведении установочной серии измерений [6, 10].

• После чего проводят ежедневный ВЛКК, основанный на определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в одной серии в день, состоящей из одного дубликата текущей пробы, в течение рабочих дней месяца, с вычислением показателя относительной разницы (RelDiff%) между двумя наблюдениями по формуле:

, где

RelDiff%– относительная разница;

Х₁ – величина первого результата наблюдения;

Х₂ – величина второго результата наблюдения.

• после чего результат относительной разницы (RelDiff%), полученной при определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах в дубликатах каждой ежедневной серии, сопоставляют с величиной минимальной разницы (MD) и при нахождении показателя относительной разницы (RelDiff%) в пределах одной минимальной разницы (±1,0 MD) результат ВЛКК исследования биологических проб спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах оценивают как приемлемый.

В процессе ВЛКК по дубликатам вначале проводят сравнение полученной разницы между 1-м и 2-м результатом измерения в установочной серии, чтобы получить показатель минимальной разницы (MD), которую применяют в качестве предельно допускаемого значения характеристик погрешностей или контрольных пределов (±1,0 MD), а затем проводят ежедневные серии ВЛКК со сравнением полученной относительной разницы (RelDiff%) между 1-м и 2-м результатами измерения каждого дубликата с показателем минимальной разницы (MD), полученного в установочной серии, которую применяют в качестве предельно допускаемых значений характеристик погрешностей. Отличие в полученной относительной разнице (RelDiff%), не превышающее одно значение MD (±1,0 MD) в ежедневной серии измерений является критерием приемлемости результатов ВЛКК.

Примеры конкретного выполнения заявляемого способа

Пример 1.

Внутрилабораторный контроль качества исследований концентрации общего простатического специфического антигена (ПСА) для доказательного установления наличия спермы

Для выявления следов спермы в пятнах на вещественных доказательствах использовалось исследование концентраций общего простатического специфического антигена (ПСА) из водных экстрактов со следов на вещественных доказательств, в которых предполагалось присутствие семенной жидкости. Пробы для проведения межлабораторного сравнения приготавливались в судебно-биологическом отделении СПб ГБУЗ Бюро Судебно-медицинской экспертизы. Плановые пробы для судебно-медицинского исследования готовились из водных экстрактов со следов на вещественных доказательствах, для чего вырезались фрагменты визуально видимых пятен, либо образцов, заведомо содержащих человеческую сперму, размерами от 0,5×0,5 см до 30×20 см, после чего фрагменты с небольшим избытком заливали необходимым объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды, полностью покрывающим исследуемый материал, с РН=7,2-7,4 и экстрагировали при температуре 4°С от 18 до 24 часов. В полученных экстрактах определялось наличие спермы иммунологическим методом посредством иммуноферментного анализа с использованием отечественной тест-системы «онко ИФА - общий ПСА Алкор БИО» (г. Санкт-Петербург, Россия), которая применяется в клинической практике для диагностики рака предстательной железы и ряда других заболеваний. Измерения проводили в соответствии с инструкциями производителя, результаты исследований регистрировали на медицинском микропланшетном ридере «Sunrise» фирмы «Tecan Austria GmbH» с программным обеспечением «Magellan» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003 г.).

Этап 1. Проведение установочной серии

Для внутрилабораторного контроля качества измерения ПСА из экстрактов проб с вещественных доказательств было проведено 22 измерения в дубликатах установочной серии для оценки показателей сходимости S, %CVa, на основании которых была вычислена минимальная разница MD, после чего проводился ежедневный оперативный контроль качества в течение 26 рабочих дней календарного месяца по 1 серии измерений в дубликате в день с вычислением относительной разницы (RelDiff%) каждого дубликата и сопоставлением полученного значения с величиной MD.

Всего выполнено 44 измерения проб ПСА для установочной серии и 52 измерения для ежедневного оперативного ВЛКК, итого 96 измерений проб ПСА.

Результаты измерения ПСА установочной серии представлены в таблице 1. По результатам установочной серии определяются показатели сходимости с помощью вычисления стандартного отклонения (S) и коэффициента аналитической вариации %CVa, после чего оценивается показатель приемлемости разницы результатов в виде минимальной разницы MD.

Величина стандартного отклонения (S), вычисленного по формуле Dahlberg для 22 дубликатов составила 2,81 нг/мл, коэффициента аналитической вариации (%CVa) - 4,20%.

Таблица 1.

Протокол результатов измерения ПСА установочной серии внутрилабораторного контроля качества исследования проб биологического материала (сперма), полученного из вытяжек с вещественных доказательств в судебно-медицинской практике

№ измерения
установочной серии Рез-т
№1 Рез-т
№2 1 1,44 1,33 2 1,76 1,66 3 2,53 2,32 4 3,01 2,87 5 4,25 3,88 6 5,37 5,23 7 38,76 34,92 8 39,51 35,60 9 44,11 43,72 10 47,70 45,60 11 51,11 46,43 12 51,76 48,17 13 52,47 49,95 14 245,88 237,14 15 237,12 228,31 16 228,3 223,9 17 54,87 52,51 18 55,14 53,40 19 56,78 54,28 20 285,42 283,22 21 259,07 250,29 22 278,22 261,73

На основании полученного показателя сходимости установочной серии, определенного через коэффициент аналитической вариации (%CVa), как параметра стандартной неопределенности, величина минимальной разницы (MD) для результатов ПСА была определена следующим образом:

Таким образом, величина MD как критерий приемлемости разницы результатов измерения проб ПСА в установочной серии составила 12,07%.

Этап 2. Проведение ежедневной серии

После получения величины MD из результатов установочной серии проводится ежедневный контроль качества, основанный на измерении одной серии измерений в день, состоящей из одного дубликата плановой пробы, в течение рабочих дней месяца, которые в данном случае составили 26 дней, с вычислением показателей относительной разницы для каждой серии измерения в дубликатах с занесением результатов измерений и показателей относительной разницы в протокол исследования. Результаты измерений с вычисленными показателями и относительной (RelDiff%) разницы представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Протокол результатов измерения ПСА ежедневных серий внутрилабораторного контроля качества

№ измерения
серий ВЛКК Рез-т
№1 Рез-т
№2 Рез-т
№2
после
корректировки
(если необходимо) RelDiff% RelDiff%
после
корректировки
(если необходимо) 1 64,18 63,83 -0,55 2 65,22 64,93 -0,43 3 66,75 65,91 -1,26 4 244,89 237,12 -3,23 5 235,12 226,33 -3,81 6 220,33 215,94 -2,01 7 63,02 62,31 -1,12 8 62,44 60,73 -2,78 9 57,00 55,02 -3,54 10 56,11 53,40 -4,95 11 50,15 49,02 -2,28 12 48,58 46,22 -4,98 13 45,36 44,88 -1,07 14 44,12 43,92 -0,47 15 43,08 42,81 -0,61 16 6,45 6,40 -0,76 17 5,92 5,06 5,15 -15,66 -12,95 18 4,95 4,01 4,28 -21,02 -12,96 19 3,82 3,73 -2,38 20 2,35 2,29 -2,72 21 1,94 1,90 -2,19 22 0,99 0,94 -4,78 23 0,90 0,71 0,81 -23,16 -5,71 24 0,45 0,42 -6,63 25 0,38 0,37 -4,53 26 0,60 0,54 -10,53

Результаты ВЛКК для ПСА превысили МD для серий 17, 18 и 23 и рассматривались как неприемлемые, значения которых находились в диапазоне низких концентраций ПСА. Как правило, именно при измерении низких концентраций биомаркеров отмечается наибольшая погрешность результатов, что отражено в данном примере

Этап 3. Повторное определение концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах, а также определение значения минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами

Полученное значение минимальной разницы существенно выше, чем в установочной серии. Результаты 17,18 и 23 измерений ПСА были повторно измерены после проведения корректирующих действий и заменены на исправленные в тот же день. После корректировки . Данное значение минимальной разницы незначительно отличается от значения MD в % в установочной серии, что говорит о приемлемости результатов ВЛКК.

Пример 2.

Внутрилабораторный контроль качества исследований концентрации общего иммуноглобулина G (IgG) для доказательного установления видовой принадлежности крови

Для установления видовой принадлежности крови в пятнах на вещественных доказательствах использовалась исследование концентраций общего иммуноглобулина G (IgG) из водных экстрактов со следов на вещественных доказательствах, в которых предполагалось присутствие крови человека. Пробы для проведения межлабораторного сравнения приготавливались в судебно-биологическом отделении СПб ГБУЗ Бюро Судебно-медицинской экспертизы. Плановые пробы для судебно-медицинского исследования готовились из водных экстрактов со следов на вещественных доказательствах, для чего вырезались фрагменты визуально видимых пятен, либо образцов, заведомо содержащих кровь человека, размерами от 0,5×0,5 см до 10×10 см, в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов, после чего фрагменты с небольшим избытком заливали необходимым объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды, полностью покрывающим исследуемый материал, с РН=7,2–7,4 и экстрагировали при температуре 4^о С от 18 до 24 часов. В полученных экстрактах определялась принадлежность крови человеку, а не животным посредством иммуноферментного анализа с использованием отечественной тест-системы «IgG общий - ИФА-БЕСТ» (г. Санкт-Петербург, Россия), которая применяется в клинической практики для диагностики иммунитета. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя, результаты исследований регистрировали на медицинском микропланшетном ридере «Sinrise» фирмы «Tecan Austria GmbH» с программным обеспечением «Magellan» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003 г.).

Этап 1. Проведение установочной серии

Для внутрилабораторного контроля качества измерения IgG из экстрактов проб с вещественных доказательств было проведено 22 измерения в дубликатах установочной серии для оценки показателей сходимости S, %CVa, на основании которых была вычислена минимальная разница MD, после чего проводился ежедневный оперативный контроль качества в течении 26 рабочих дней календарного месяца по 1 серии измерений в дубликате в день. Всего выполнено 44 измерения проб IgG для установочной серии и 52 измерения для ежедневного оперативного ВЛКК, итого 96 измерения проб IgG.

Результаты измерения IgG установочной серии представлены в таблице 3.

По результатам установочной серии определяются показатели сходимости с помощью вычисления стандартного отклонения (S) и коэффициента аналитической вариации %CVa, после чего оценивается показатель приемлемости разницы результатов в виде минимальной разницы MD.

Величина стандартного отклонения (S), вычисленного по формуле Dahlberg для 22 дубликатов составила 0,73 мг/мл, коэффициента аналитической вариации (%CVa) – 6,03%.

Таблица 3.

Протокол результатов измерения IgG установочной серии внутрилабораторного контроля качества исследования проб биологического материала (кровь), полученного из вытяжек с вещественных доказательств в судебно-медицинской практике

№ измерения
установочной серии Рез-т
№1 Рез-т
№2 1 27,57 28,05 2 24,06 24,97 3 23,52 23,88 4 22,59 23,31 5 22,17 22,86 6 17,78 20,19 7 16,08 16,58 8 15,33 16,13 9 13,65 14,62 10 13,12 14,56 11 11,57 12,70 12 10,81 11,86 13 8,53 10,17 14 8,87 10,75 15 8,48 9,75 16 8,41 9,52 17 8,07 8,28 18 8,14 8,32 19 8,04 8,16 20 7,99 8,09 21 7,88 7,94 22 7,84 7,92

На основании показателя сходимости установочной серии величина MD, выраженная через коэффициент аналитической вариации (%CVa) для результатов IGG, была вычислена аналогично, только стандартная неопределенность u(A) определялась через %CVa:

Таким образом, величина MD как критерий приемлемости разницы результатов измерения проб IgG составила 16,9%.

Этап 2. Проведение ежедневной серии

После получения величины MD из результатов установочной серии проводится ежедневный контроль качества, основанный на измерении одной серии измерений в день, состоящей из одного дубликата плановой пробы, в течение 26 рабочих дней месяца с вычислением показателей относительной разницы для каждой серии измерения в дубликатах с занесением результатов измерений и показателей относительной разницы в протокол исследования. Результаты измерений с вычисленными показателями относительной (RelDiff%) разницы представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Протокол результатов измерения IgG ежедневного внутрилабораторного контроля качества

№ измерения
серий ВЛКК Рез-т
№1 Рез-т
№2 Рез-т
№2
после
корректировки
(если необходимо) RelDiff% RelDiff%
после
корректировки
(если необходимо) 1 26,41 25,83 -2,22 2 27,54 26,32 -4,53 3 27,04 26,61 -1,60 4 27,33 26,44 -3,31 5 25,72 26,53 3,10 6 24,31 25,14 3,36 7 21,32 27,41 25,84 24,99 19,17 8 21,03 19,92 -5,42 9 19,04 17,73 -7,13 10 18,91 17,12 -9,94 11 16,54 15,04 -9,50 12 15,42 15,93 3,25 13 13,22 11,11 12,78 -17,34 -13,98 14 14,03 11,64 13,47 -18,62 -14,58 15 12,71 11,02 -14,24 16 9,44 8,91 -5,78 17 9,83 8,52 -14,28 18 8,83 7,94 -10,61 19 8,50 7,92 -7,06 20 8,31 8,03 -3,43 21 7,94 7,31 -8,26 22 10,34 10,22 -1,17 23 10,10 10,94 7,98 24 10,02 9,91 -1,10 25 9,53 9,32 -2,23 26 9,44 9,12 -3,45

Этап 3. Повторное определение концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах, а также определение значения минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами

Результаты ВЛКК для IgG по относительной разнице (%RelDiff) превысили МD для серий 7, 13, 14, значение которых находились в диапазоне средних концентраций IgG. Результаты 7, 13, 14 измерений концентрации IgG были повторно измерены после проведения корректирующих действий и заменены на исправленные в тот же день. После корректировки . Данное значение минимальной разницы незначительно отличается от значения MD в % в установочной серии, что говорит о приемлемости результатов ВЛКК.

Пример 3.

Внутрилабораторный контроль качества исследований активности α-амилазы для ориентировочного установления наличия слюны

Для установления ориентировочного наличия слюны в пятнах на вещественных доказательствах использовалась исследование концентраций α-амилазы из водных экстрактов со следов на вещественных доказательствах, в которых предполагалось присутствие слюны человека. Пробы для проведения межлабораторного сравнения приготавливались в судебно-биологическом отделении СПб ГБУЗ Бюро Судебно-медицинской экспертизы. Плановые пробы для судебно-медицинского исследования готовились из водных экстрактов со следов на вещественных доказательствах, для чего вырезались фрагменты визуально видимых пятен, либо образцов, заведомо содержащих слюну человека, размерами от 0,5×0,5 см до 10×10 см, в зависимости от тактики экспертного исследования, характера и величины следов, после чего фрагменты с небольшим избытком заливали необходимым объемом дистиллированной (лучше деионизированной) воды, полностью покрывающим исследуемый материал, с РН=7,2–7,4 и экстрагировали при температуре 4°С от 18 до 24 часов. В полученных экстрактах определялось наличие слюны по присутствию α-амилазы кинетическим методом посредством колориметрии с использованием отечественной тест-системы «Амилаза-Ново-1 (100) ВЕКТОР БЕСТ» (г. Санкт-Петербург, Россия), которая используется в клинической практике для определения активности альфа-амилазы в сыворотке, плазме крови и моче. Повышенная активность альфа-амилазы в плазме отмечается при следующих заболеваниях: остром панкреатите, паротите, алкоголизме, почечной недостаточности, вирусном гепатите, СПИДе. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя, результаты исследований регистрировали на медицинском микропланшетном ридере «Sinrise» фирмы «Tecan Austria GmbH» с программным обеспечением «Magellan» (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №2003/829 от 22.05.2003 г.).

Этап 1. Проведение установочной серии

Для внутрилабораторного контроля качества измерения α-амилазы из экстрактов проб с вещественных доказательств было проведено 22 измерений в дубликатах установочной серии для оценки показателей сходимости S, %CVa, на основании которых была вычислена минимальная разница MD, после чего проводился ежедневный оперативный контроль качества в течение 26 рабочих дней календарного месяца по 1 серии измерений в дубликате в день. Всего выполнено 44 измерения проб α-амилазы для установочной серии и 52 измерения для ежедневного оперативного ВЛКК, итого 96 измерения проб α-амилазы.

Результаты измерения установочной серии α-амилазы представлены в таблице 5.

По результатам установочной серии определяются показатели сходимости с помощью вычисления стандартного отклонения (S) и коэффициента аналитической вариации %CVa, после чего оценивается показатель приемлемости разницы результатов в виде минимальной разницы MD.

Величина стандартного отклонения (S), вычисленного по формуле Dahlberg для 25 дубликатов составила 163,21 Е/л, коэффициента аналитической вариации (%CVa) – 8,99%.

Таблица 5.

Протокол результатов измерения установочной серии α-амилазы внутрилабораторного контроля качества исследования проб биологического материала (слюна), полученного из вытяжек с вещественных доказательств в судебно-медицинской практике

№ измерения
устано-
вочной серии Рез-т
№1 Рез-т
№2 1 7212,26 7106,09 2 5930,08 5832,49 3 4406,40 4330,96 4 3055,86 2999,28 5 2513,86 1896,92 6 1705,92 1051,65 7 685,00 676,23 8 636,70 599,38 9 462,52 421,54 10 364,46 324,94 11 285,42 259,07 12 245,90 235,12 13 227,33 221,75 14 210,77 204,18 15 195,40 192,21 16 173,45 170,25 17 164,67 155,88 18 152,69 150,49 19 146,30 145,05 20 142,71 138,32 21 137,56 136,27 22 135,93 134,72

На основании полученного показателя сходимости установочной серии, определенного через коэффициент аналитической вариации (%CVa) для результатов ПСА, была вычислена аналогично, только стандартная неопределенность u(A) определялась через %CVa:

Таким образом, величина MD как критерий приемлемости разницы результатов измерения проб α-амилазы составила 25,17%.

Этап 2. Проведение ежедневной серии

После получения величины MD из результатов установочной серии проводится ежедневный контроль качества, основанный на измерении одной серии измерений в день, состоящей из одного дубликата плановой пробы, в течение 26 рабочих дней месяца с вычислением показателей абсолютной и относительной разницы для каждой серии измерения в дубликатах с занесением результатов измерений и показателей абсолютной и относительной разницы в протокол исследования (табл.6).

Таблица 6.

Протокол результатов измерения ежедневного внутрилабораторного контроля качества α-амилазы

№ измерения
серий ВЛКК Рез-т
№1 Рез-т
№2 Рез-т
№2
после
корректировки
(если необходимо) RelDiff% RelDiff%
после
корректировки
(если необходимо) 1 6922,46 6643,63 -4,11 2 5835,68 4994,79 -15,53 3 4296,62 3782,87 -12,72 4 2915,64 2755,37 -5,65 5 2496,30 1820,08 2477,71 -31,33 -30,60 6 1633,46 1029,70 1631,83 -45,34 -45,25 7 678,41 660,85 -2,62 8 623,53 564,25 -9,98 9 430,32 414,95 -3,64 10 331,52 298,59 -10,45 11 283,22 250,29 -12,34 12 237,12 228,33 -3,78 13 223,94 212,97 -5,02 14 208,57 199,79 -4,30 15 193,21 175,64 -9,53 16 172,25 171,25 -0,58 17 160,27 153,69 -4,19 18 151,49 147,30 -2,80 19 145,10 144,10 -0,69 20 139,32 136,12 -2,32 21 138,92 137,31 -1,17 22 137,20 136,44 -0,56 23 136,11 135,89 -0,16 24 134,90 133,55 -1,01 25 133,20 132,83 -0,28 26 131,54 130,11 -1,09

Этап 3. Повторное определение концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах, а также определение значения минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами

Результаты ВЛКК по активности α-амилазы превысили MD для серий 5 и 6, значение которых находились в среднем диапазоне значений активности α-амилазы. Результаты 5 и 6 измерений активности вышеуказанного фермента были повторно измерены после проведения корректирующих действий и заменены на исправленные в тот же день. После корректировки . Данное значение минимальной разницы незначительно отличается от значения MD в % в установочной серии, что говорит о приемлемости результатов ВЛКК.

Таким образом, впервые разработан способ количественной оценки результатов внутрилабораторного контроля качества исследования биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек вещественных доказательств в судебно-медицинской практике.

Литература

1. ГОСТ Р ИСО 15 189:2015 Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетенции. М.: Стандартинформ; 2015.

2. Приказ МЗ РФ № 45 от 7.02.2000 «O системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» // Управление качеством клинических лабораторных исследований /Под ред. В.В. Меньшикова, – М.: Лабпресс, 2000. – С. 41-43.

3. ГОСТ Р 53133.2-2008 Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Часть 2. Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов. - М.: Стандартинформ, 2009.

4. http://www.westgard.com/biodatabase1.htm. (доступ 2016-02-11).

5. Dahlberg G. Statistical methods for medical and biological students. London: George Allen and Unwin; 1940. p.122-132.

6. Kallner A. Laboratory Statistics: Methods in Chemistry and Health Sciences. - Second edition. – Elsever: USA, 2018. – 148 p.

7. ГОСТ Р 53079.4-2008.Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа. - М.: Стандартинформ, 2010

8. CLSI EP9-A2: Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved Guideline. 2nd Ed. Wayne, USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2002; 75 p.

9. Fraser C.G. Biological variation in clinical chemistry: from principles to practice. – Washington: AACC Press, 2001. – 151 p.

10. ГОСТ Р 54500.3-2011 Неопределенность измерения. Часть 3. Руководство по выражению неопределенности измерения. – М.: Стандартинформ, 2012.

Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для количественной оценки результатов внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК) исследования биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах. Определяют концентрацию биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах биологических материалов в не менее чем в 22 дубликатах установочной серии. Далее вычисляют стандартное отклонение, определяемое по формуле Далберга, коэффициент аналитической вариации (%СV), после чего оценивают показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами в установочной серии с помощью коэффициента аналитической вариации (%CVа). Затем проводят ежедневную серию измерений и осуществляют ВЛКК одной серии в день, состоящей из одного дубликата текущей пробы, в течение рабочих дней месяца, с вычислением показателя относительной разницы (RelDiff%) между двумя наблюдениями. После чего результат относительной разницы (RelDiff%), полученной при определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах в дубликатах каждой ежедневной серии, сопоставляют с величиной минимальной разницы (MD). При нахождении показателя относительной разницы (RelDiff%) в пределах одной минимальной разницы (±1,0 MD) результат ВЛКК исследования биологических проб спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах, оценивают как приемлемый. Способ обеспечивает количественную оценку результатов ВЛКК биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах за счет вычисления стандартного отклонения по формуле Далберга для не менее чем 22 дубликатов установочной серии. 6 табл., 3 пр., 1 ил.

Способ количественной оценки результатов внутрилабораторного контроля качества (ВЛКК) исследования биологических проб крови, спермы и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах, заключающийся в определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в не менее чем в 22 дубликатах установочной серии с последующим вычислением стандартного отклонения, определяемого по формуле Далберга:

где – результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

– разница между измерениями в дубликате,

N – количество пар (дубликатов),

S – стандартное отклонение результатов вышеуказанных количественных измерений в дубликатах,

с последующим вычислением коэффициента аналитической вариации (%СV), определяемого как относительное стандартное отклонение (%RSD) при условии, что величина стандартного отклонения (S) пропорциональна значению концентрации исследуемого вещества, определяемого по формуле Далберга:

,

где - коэффициент аналитической вариации,

- относительное стандартное отклонение,

– результат первого измерения,

– результат второго измерения,

i – номер пары дубликата,

N - количество пар дубликатов,

после чего оценивают показатель минимальной разницы (MD) между первым и вторым полученными результатами в установочной серии с помощью величины стандартной неопределенности результатов измерения, выраженной через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений, с коэффициентом охвата при 95,0% доверительном интервале, равным 1,96, вычисляемой по формуле:

,

где MD – минимальная разница между двумя результатами, выраженная через неопределенность разницы u (D),

– коэффициент охвата 1,96, при 95,0% доверительном интервале,

u(A) – стандартная неопределенность результатов измерения, выраженная через коэффициент аналитической вариации (%CVа), полученный при проведении установочной серии измерений;

затем проводят ежедневную серию измерений и осуществляют ВЛКК, основанный на определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах вышеуказанных биологических материалов в одной серии в день, состоящей из одного дубликата текущей пробы, в течение рабочих дней месяца, с вычислением показателя относительной разницы (RelDiff%) между двумя наблюдениями по формуле:

,

где RelDiff% – относительная разница;

Х1 – величина первого результата наблюдения;

Х2 – величина второго результата наблюдения,

после чего результат относительной разницы (RelDiff%), полученной при определении концентрации биологических маркеров или активности ферментов в биологических пробах в дубликатах каждой ежедневной серии, сопоставляют с величиной минимальной разницы (MD) и при нахождении показателя относительной разницы (RelDiff%) в пределах одной минимальной разницы (±1,0 MD) результат ВЛКК исследования биологических проб спермы, крови и слюны человека, полученных из вытяжек со следов на вещественных доказательствах, оценивают как приемлемый.