КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО (ADC), КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С БЕЛКАМИ FLT3 Российский патент 2020 года по МПК A61K39/395 C07K16/28 C12N15/13 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки Соединенных Штатов Америки №62/130476, поданной 09 марта 2015 года, содержание которой полностью включено в качестве ссылки.

ПОДАЧА СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

[0002] Содержание следующей подачи текстового файла ASCII полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки: машиночитаемая форма (CRF) списка последовательностей (название файла: 511582009240SeqList.txt, дата записи: 7 марта 2016 года, размер: 44,847 байт).

ЗАЯВЛЕНИЕ ПРАВ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ, СДЕЛАННЫЕ ЗА СЧЕТ ФИНАНСИРОВАНИЯ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

[0003] Не применимо.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0004] Изобретение, описываемое в настоящем документе, относится к антителам, их антигенсвязывающим фрагментам и конъюгатам таких антител с лекарственным средством (ADC), которые связываются с белками, называемыми FLT3. Кроме того изобретение относится к прогностическим, профилактическим и терапевтическим способам и композициям, которые полезны для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих FLT3.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

[0005] По оценкам в 2013 году у 1660290 мужчин и женщин (854790 мужчин и 805500 женщин) была диагностирована злокачественная опухоль и 580350 мужчин и женщин умерли от злокачественных опухолей различных органов и тканей. В период 2006-2010, средний возраст на момент постановки диагноза злокачественной опухоли различных органов и тканей составлял 66 лет. Частота встречаемости с поправкой на возраст составила 463,0 на 100000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на случаях, диагностированных в 2006-2010 в 18 географических областях SEER (Примечание: SEER=Программа наблюдений, эпидемиологии и конечных исходов, национальный институт рака). В 2006-2010 средний возраст смерти от злокачественных опухолей различных органов и тканей составлял 72 года. Смертность с поправкой на возраст составляла 176,4 на 100000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на пациентах, которые умерли в 2006-2010 в США. Общая пятилетняя относительная выживаемость для 2003-2009 из 18 географических областей SEER составила 65,8%.

[0006] Лейкозы представляют собой злокачественные опухоли, которые начинаются в кроветворной ткани, такой как костный мозг, и вызывают выработку и выход в кровоток аномально большого числа клеток крови. Основные лейкозы включают острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) и волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ).

[0007] Для группы этих лейкозов по оценкам у 48610 мужчин и женщин диагностирован лейкоз (27880 мужчин и 20730 женщин) и 23720 мужчин и женщин умерли от лейкоза в 2013 году. В 2006-2010 году средний возраст на момент постановки диагноза лейкоза составлял 66 лет. Частота встречаемости с поправкой на возраст составила 12,8 на 100000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на случаях, диагностированных в 2006-2010 в 18 географических областях SEER. В 2006-2010 средний возраст смерти от лейкоза составил 75 лет. Смертность с поправкой на возраст составляла 7,1 на 100000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на пациентах, которые умерли в 2006-2010 в США. Общая пятилетняя относительная выживаемость для 2003-2009 из 18 географических областей SEER составила 56,0%.

[0008] ХЛЛ представляет собой второй наиболее распространенный тип лейкоза у взрослых лейкоз, и, как правило, ухудшение наступает медленно. Он часто встречается в среднем возрасте и старше и редко встречается у детей. Пациентов с ранней стадией ХЛЛ не лечат химиотерапией, до тех пор пока у них не появляются симптомы или они не начинают демонстрировать быстрое прогрессирование заболевания. Раннее начало химиотерапии не имеет преимуществ при ХЛЛ и может даже повысить смертность. Когда начинают химиотерапию, аналог нуклеозидов флударабин является наиболее широко используемой терапией первой линии при ХЛЛ. Комбинированные схемы лечения показали улучшенную частоту ответов в нескольких клинических испытаниях и включают следующие: флударабин, циклофосфамид и ритуксимаб (FCR); пентостатин, циклофосфамид и ритуксимаб (PCR); флударабин, циклофосфамид и митоксантрон (FCM); циклофосфамид, винкристин, и преднизон (CVP); циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон (CHOP). По оценкам у 15,680 мужчин и женщин (9,720 мужчин и 5,960 женщин) будет диагностирован хронический лимфоцитарный лейкоз и 4,580 мужчин и женщин умрут от хронического лимфоцитарного лейкоза в 2013. В 2006-2010, средний возраст на момент постановки диагноза хронического лимфоцитарного лейкоза составлял 71 год. Частота встречаемости с поправкой на возраст составила 4,3 на 100,000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на случаях, диагностированных в 2006-2010 в 18 географических областях SEER. В 2006-2010 средний возраст смерти от хронического лимфоцитарного лейкоза составил 79 лет. Смертность с поправкой на возраст составляла 1,4 на 100,000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на пациентах, которые умерли в 2006-2010 в США. Общая пятилетняя относительная выживаемость для 2003-2009 из 18 географических областей SEER составила 79,2%.

[0009] Острый миелолейкоз (ОМЛ) представляет собой наиболее распространенный тип острого лейкоза у взрослых. Текущее лечение ОМЛ должно быть достаточно агрессивным для того чтобы достичь полной ремиссии (ПР), поскольку частичная ремиссия не приносит существенной пользы для выживания. Процент пациентов с ремиссией у взрослых с ОМЛ обратно пропорционален возрасту, с ожидаемым процентом ремиссии не более 65% для пациентов моложе 60 лет. Данные позволяют предположить, что после достижения ремиссии, ее длительность может быть короче у пациентов более старшего возраста. Пациенты, которые экспрессируют антиген клетки-предшественника CD34 и/или P-гликопротеин (продукт гена MDR1), имеют худший исход. Цитогенетический анализ предоставляет наиболее сильную из доступной прогностической информации, предсказывая как результат индукции ремиссии, так и результат терапии после ремиссии. Цитогенетические аномалии, которые указывают на хороший прогноз, включают t(8; 21), inv(16) или t(16;16), и t(15;17). Нормальная цитогенетика предсказывает средний риск ОМЛ. Пациенты с ОМЛ, который характеризуется делециями длинных плеч или моносомией по хромосомам 5 или 7, транслокациями или инверсий хромосомы 3, t(6; 9), t(9; 22) или нарушениями хромосомы 1, 1q23, имеют особенно плохой прогноз относительно химиотерапии. По оценкам у 14,590 мужчин и женщин (7,820 мужчин и 6,770 женщин) будет диагностирован острый миелолейкоз и 10,370 мужчин и женщин умрут от острого миелолейкоза в 2013. В 2006-2010, средний возраст на момент постановки диагноза острого миелолейкоза составил 67 лет. Частота встречаемости с поправкой на возраст составила 3,7 на 100,000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на случаях, диагностированных в 2006-2010 в 18 географических областях SEER. В 2006-2010 средний возраст смерти от острого миелолейкоза составил 72 года. Смертность с поправкой на возраст составляла 2,8 на 100,000 мужчин и женщин в год. Эти частоты основываются на пациентах, которые умерли в 2006-2010 в США. Общая пятилетняя относительная выживаемость для 2003-2009 из 18 географических областей SEER составила 24,2%. Следует заметить, что, всю общую информацию по злокачественным опухолям получали с веб-сайт NCI (www.cancer.gov), и все статистические данные основаны на статистических данных по встречаемости из SEER и статистических данных по смертности из Национального центра медицинской статистики (NCHS), которые были найдены в: Howlader N., et al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/, на основании загрузки данных SEER на ноябрь 2012, опубликованной на веб-сайт SEER, 2013.

[0010] Острый лимфобластный лейкоз ("ОЛЛ") представляет собой группу злокачественных новообразований лимфоидных клеток на стадии предшественников B/T-клеток, возникающих из-за генетических изменений, которые блокируют дифференцировку лимфоидных клеток и приводят к нарушенной клеточной пролиферации и выживаемости. За последние несколько десятилетий были достигнуты примечательные успехи в лечении детского ОЛЛ, и пятилетние коэффициенты выживаемости сейчас достигают 90%. Однако вплоть до 20% детей остаются невосприимчивыми к лечению или у них развивается рецидив после лечения, и коэффициент бессобытийной выживаемости для этих пациентов остается плохим. Лечить взрослых пациентов с ОЛЛ все также сложно из-за высокой частоты рецидивов даже после значительного прогресса в современной химиотерапии. В последние десятилетия были достигнуты быстрые улучшения в результатах лечения ОЛЛ, которые, в основном, основаны на интенсификации и оптимизации химиотерапии, риск-адаптированного использования трансплантации стволовых клеток, а также индивидуализированной и направленной терапии, в том числе моноклональных антител. При помощи секвенирования следующего поколения оценивают дополнительные мутации, нарушающие нормальный лимфопоэз, и значимость взаимодействующих мутаций, а также эпигенетические изменения. Данные, полученные таким образом, помогут в оценке прогноза отдельного пациента но, что важно, также во внедрении направленной терапии, соответствующей мутационным нарушениям.

[0011] Кроме того, реализуется терапевтическая полезность моноклональных антител (МАТ) (G. Kohler и C.Milstein, Nature 256:495-497 (1975)). Моноклональные антитела в настоящее время одобрены в качестве терапии при трансплантации, злокачественной опухоли, инфекционном заболевании, сердечно-сосудистом заболевании и воспалении. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции. Такие различия в функциях отражены в отличающихся трехмерных структурах для различных изотипов иммуноглобулинов (P.M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).

[0012] Поскольку мыши удобны для иммунизации и распознают большинство антигенов человека в качестве чужеродных МАТ с терапевтическим потенциалом против мишеней человека имеют, как правило, мышиное происхождение. Однако мышиные МАТ имеют присущие им недостатки в качестве терапевтических средств для человека. Они требуют более частого дозирования, поскольку МАТ имеют более короткое время полужизни в циркуляции у людей, чем антитела человека. Более принципиально то, что повторное введение антител мыши в иммунную систему человека заставляет иммунную систему человека отвечать, распознавая белок мыши как чужеродный и генерируя ответ в виде человеческого антитела к антителам мыши (HAMA). Такой ответ с HAMA может приводить к аллергической реакции и быстрому удалению антитела мыши из циркуляции, тем самым делая бесполезным лечение мышиным антителом. Чтобы избежать таких воздействий, были предприняты попытки создать иммунную систему человека внутри мышей.

[0013] Изначально надеялись создать трансгенных мышей, способных отвечать на антигены антителами с человеческими последовательностями (См. Bruggemann et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)), но были ограничения по количеству ДНК, которая могла быть стабильно сохраняться в доступных клонирующих носителях. Использование клонирующих векторов на основе искусственной дрожжевой хромосомы (YAC) привело к введению больших фрагментов локуса Ig зародышевой линии человека в трансгенных млекопитающих. По существу большинство областей V, D, и J генов человека, расположенных с одинаковым интервалом и найденных в геноме человека, и константные области человека были введены в мышей с использованием YAC. Одна линия таких трансгенных мышей известна как мыши XenoMouse® и она коммерчески доступна у Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA), бывшей Abgenix, Inc.

[0014] Кроме того, антитела можно получать с использованием трансгенных мышей VelocImmune, у которых геномные последовательности, несущие мышиные эндогенные локусы вариабельных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина (сегменты VH, DH и JH) и/или легкой цепи каппа (VK и JK), были заменены, полностью или частично, геномными последовательностями человека, несущими неарранжированные локусы вариабельных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека (VH, DH, и JH) и/или легкой цепи каппа (VK и JK) (Regeneron, Tarrytown, NY) зародышевой линии. См., например, патенты США №№. 6586251, 6596541, 7105348, 6528313, 6638768 и 6528314.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0015] Изобретение относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам и конъюгатам таких антител с лекарственным средством (ADC), которые связываются с белками FLT3 и полипептидными фрагментами белков FLT3. В определенных вариантах осуществления изобретение включает полноразмерные антитела человека, конъюгированные с терапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления существует исключение, когда не кодируют полную последовательность нуклеиновой кислоты с фигуры 2A и/или 2B и/или не получают полную аминокислотную последовательность с фигуры 3A и/или 3B. В определенных вариантах осуществления кодируют полную последовательность нуклеиновой кислоты с фигуры 2A и/или 2B и/или получают полную аминокислотную последовательность с фигуры 3A и/или 3B, любая из которых находится в соответствующих стандартных лекарственных формах для человека.

[0016] Изобретение дополнительно относится к различным иммуногенным или терапевтическим композициям, таким как конъюгаты антитело-лекарственное средство, и стратегиям для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих FLT3, таких как злокачественные опухоли тканей, перечисленные в таблице I (например, ОМЛ, ОЛЛ, включая B-клеточный лимфобластный лейкоз и лимфобластный лейкоз предшественников B-клеток).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0017] Фигура 1. кДНК и аминокислотная последовательность FLT3 показаны на фигуре 1. Начальный метионин подчеркнут. Открытая рамка считывания охватывает нуклеиновую кислоту в пределах 67-3048, включая стоп-кодон.

[0018] Фигура 2A. кДНК и аминокислотная последовательность тяжелой цепи CHv62.21. Вариабельная область тяжелой цепи отмечена двойным подчеркиванием, и константная область тяжелой цепи IgG1 человека подчеркнута.

[0019] Фигура 2B. кДНК и аминокислотная последовательность легкой цепи CHv62.21 и легкой цепи CHv62.21pAF. Вариабельная область легкой цепи отмечена двойным подчеркиванием, константная область каппа человека подчеркнута.

[0020] Фигура 2C. кДНК и аминокислотная последовательность тяжелой цепи CHv62.21, модифицированной путем вставки неприродной аминокислоты. Знаком X отмечено расположение амбер-кодона для вставки неприродной аминокислоты ("nnAA") пара-ацетилфенилаланина (pAF) в остатке 371 нуклеиновой кислоты. Вариабельная область тяжелой цепи отмечена двойным подчеркиванием, и константная область тяжелой цепи IgG1 человека подчеркнута.

[0021] Фигура 3A. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи CHv62.21. Вариабельная область тяжелой цепи отмечена двойным подчеркиванием, и константная область тяжелой цепи IgG1 человека подчеркнута.

[0022] Фигура 3B. Аминокислотная последовательность легкой цепи CHv62.21 и легкой цепи CHv62.21pAF. Вариабельная область легкой цепи отмечена двойным подчеркиванием, константная область каппа человека подчеркнута.

[0023] Фигура 3C. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи CHv62.21. Аминокислотное положение 124, обозначенное X, представляет собой расположение амбер-кодона для вставки неприродной аминокислоты ("nnAA") пара-ацетилфенилаланина (pAF). Вариабельная область тяжелой цепи отмечена двойным подчеркиванием, и константная область тяжелой цепи IgG1 человека подчеркнута.

[0024] Фигура 4A. Выравнивание тяжелой цепи CHv62.21 с Ig зародышевой линии человека.

[0025] Фигура 4B. Выравнивание легкой цепи CHv62.21 с Ig зародышевой линии человека.

[0026] Фигура 5. Исследование эффективности и подбора дозы CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в модели подкожного ксенотрансплантата из линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантированной мышам CB17/SCID.

[0027] Фигура 6. Исследование эффективности CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) и CHv62.21pAF (AGS62P) (голое антитело) у модели подкожного ксенотрансплантата из линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантированной мышам CB17/SCID.

[0028] Фигура 7. CHv62.21 и CHv62.21pAF не опосредуют антитело зависимую цитотоксичность (ADCC) in vitro EOL-1, SEM, и Raji (слева направо на фигуре). Детали анализа: 1) E:T=100:1; 2) концентрация антитела=2,5 мкг/мл; 3) Время инкубации: 4 часа; 4) Контроль изотипа МАТ и ADC: AGS91.1-L363-pAF, AGS91.88-pAF-AGSL-0182-30; 5) Положительный контроль: ритуксимаб, направленный на клетки Raji.

[0029] Фигура 8. CHv62.21 демонстрирует неблокирующую лиганд активность. МАТ-блокатор лиганда FLT3 (1b37.1), которое сравнивают с CHv62.21 в анализе связывания лигандов, подтверждает, что МАТ CHv62.21 не является блокатором лиганда.

[0030] Фигура 9. CHv62.21 не препятствует опосредованной FL пролиферации клеток.

[0031] Фигура 10. Цитотоксическая активность МАТ 1b37.1, блокирующего лиганд FLT3, снижается в присутствии FL. Фигура 10(A). Оценка цитотоксичности in vitro v62-1b21.1-AGL-0129-08 с лигандом и без лиганда FLT3 человека (hFL) на клетках RS-4-11. Фигура 10(B). Оценка цитотоксичности in vitro v62-1b37.1-AGL-0129-08 с лигандом и без лиганда FLT3 человека (hFL) на клетках RS-4-11.

[0032] Фигура 11. Лиганд FLT3 не мешает цитотоксичности, опосредованной CHv62.21pAF-AGL-0182-30, на клетках MOLM-13. Фигура 11(A). Оценка связывания биотинилированных CHv62.21pAF и v62-1b37.1 в присутствии лиганда FLT3 человека на клетках MOLM-13. Фигура 11(B). Оценка цитотоксичности in vitro CHv62.21pAF-AGL-0182-30 с лигандом и без лиганда FLT3 человека на клетках MOLM-13.

[0033] Фигура 12. Стабильность in vitro CHv62.21pAF-AGL-0182-30. Фигура 12(A). Оценка стабильности CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в сыворотке человека. Фигура 12(B). Оценка стабильности CHv62-AGL-0301-20 в сыворотке человека.

[0034] Фигура 13. Исследование эффективности CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) и CHv62.21pAF (голое антитело) у модели подкожного ксенотрансплантата из линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантированной мышам CB17/SCID, при помощи режима многократных доз.

[0035] Фигура 14. Эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в модели подкожно вводимого ксенотрансплантата SEM-xcl.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Краткое описание разделов

I.) Определения

II.) Антитела к FLT3

III.) Конъюгаты антитело-лекарственное средство в общих чертах

III(A). Майтанзиноиды

III(B). Ауристатины и доластатины

III(C). Калихимицин

III(D). Другие цитотоксические средства

IV.) Конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые связываются с FLT3

V.) Линкерные группы

VI.) Удлиняющая группа

VII.) Аминокислотная группа

VIII.) Спейсерная группа

IX.) Группа лекарственного средства

X.) Содержание лекарственного средства

XI.) Способы определения цитотоксического эффекта ADC

XII.) Лечение злокачественной опухоли/опухолей, экспрессирующих FLT3

XIII.) FLT3 в качестве мишени для терапии на основе антител

XIV.) Смеси ADC к FLT3

XV.) Комбинированное лечение

XVI.) Наборы/Промышленные изделия

I.) Определения:

[0036] Если не определено иное, все термины в области изобретения, обозначения и другие научные термины или терминология, использованные в настоящем документе, имеют значение, в котором их обычно понимают специалисты в области, к которой принадлежит изобретение. В некоторых случаях, термины с общепринятыми значениями определены в настоящем документе для ясности и/или для получения справки, и включение таких определений в настоящий документ не обязательно должно толковаться как наличие существенных отличий от того, как это понимается в данной области. Многие из способов и процедур, описанных или упомянутых в настоящем документе, хорошо понятны и широко используются при помощи общепринятой методологии специалистами в данной области, такие как, например, широко используемые методологии молекулярного клонирования, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. При необходимости, процедуры, связанные с использованием коммерчески доступных наборов и реагентов, обычно выполняют в соответствии с протоколами и/или параметрами, определенными производителем, если не указано иначе.

[0037] При указании торгового наименования в настоящем документе, ссылка на торговое наименование также относится к составу продукта, непатентованному лекарственному средству, и активному фармацевтическому ингредиенту/ингредиентам продукта с торговым наименованием, если иное не указано в контексте.

[0038] Термины "прогрессирующая злокачественная опухоль", "местно-распространенный рак", "прогрессирующее заболевание" и "местнораспространенное заболевание" означают злокачественные опухоли, которые распространились через соответствующую тканевую капсулу, и включают стадию заболевания C по системе Американской урологической ассоциации (AUA), стадию заболевания C1-C2 по системе Уитмора-Джеветта, и стадию заболевания T3-T4 и N+ по системе TNM (опухоль, узел, метастаз). Обычно пациентам с местнораспространенным заболеванием операция не рекомендована, и эти пациенты имеют по существу менее благоприятные исходы по сравнению с пациентами с клинически локализованной (в рамках одного органа) злокачественной опухолью.

[0039] Термин "алкил" сам по себе или как часть другого термина относится к насыщенному углеводороду C₁-C₁₂, который содержит нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода. В частности, алкильными группами являются те группы, которые имеют от 1 до 8 атомов углерода, от 1 до 6 атомов углерода, или от 1 до 4 атомов углерода. Примеры алкильных групп в качестве неограничивающих примеров включают: метил (Me), этил (Et), н-пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил (tBu), н-пентил, изопентил, трет-пентил, и н-гексил, изогексил. В определенных вариантах осуществления алкильная группа имеет нормальные, вторичные или третичные атомы углерода и не имеет циклических атомов углерода.

[0040] Термин "алкенил" сам по себе или как часть другого термина относится к углеводороду C₂-C₁₂, который содержит нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, по меньшей мере, с одним ненасыщенным участком, т.е. углерод-углерод, двойная связь sp². В частности, алкенильными группами являются те группы, которые имеют от 2 до 8 атомов углерода, от 2 до 6 атомов углерода, или от 2 до 4 атомов углерода. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают: винил (-CH=CH₂), аллил (-CH₂CH₂=CH₂), циклопентенил (-C₅H₇) и 5-гексенил (-CH₂CH₂CH₂CH₂CH=CH₂). В определенных вариантах осуществления алкенильная группа имеет нормальные, вторичные или третичные атомы углерода и не имеет циклических атомов углерода.

[0041] Термин "алкинил" сам по себе или как часть другого термина относится к углеводороду C₂-C₁₂, который содержит нормальные, вторичные, третичные или циклические атомы углерода, по меньшей мере, с одним ненасыщенным участком, т.е., углерод-углерод, тройная связь sp. В частности, алкинильными группами являются те группы, которые имеют от 2 до 8 атомов углерода, от 2 до 6 атомов углерода, или от 2 до 4 атомов углерода. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают: этинил (-C≡CH) и 2-пропинил (-CH₂C≡CH). В определенных вариантах осуществления алкинильная группа имеет нормальные, вторичные или третичные атомы углерода и не имеет циклических атомов углерода.

[0042] Термин "алкокси" относится к -O-алкильной группе, где O является точкой присоединения остальной части молекулы, и алкил определен выше.

[0043] Термин "гетероциклоалкил" относится к моноциклической, или слитой, в виде мостика, или спиральной полициклической кольцевой структуре, которая является насыщенной или частично насыщенной и имеет от от 3 до 12 атомов кольца на кольцевую структуру, выбранных из атомов углерода и до трех гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. В частности, гетероциклоалкильными группами являются те группы, которые имеют от 3 до 8 атомов кольца или от 5 до 7 атомов кольца на кольцевую структуру. Кольцевая структура может необязательно содержать до двух оксогрупп на углероде или сере в составе кольца. Иллюстративные объекты, в форме соответствующим образом связанных компонентов, включают:

[0044] Термин "гетероарил" относится к моноциклическому, слитому бициклическому, или слитому полициклическому ароматическому гетероциклу (кольцевой структуре с атомами кольца, выбранными из атомов углерода и вплоть до четырех гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы), имеющему от 3 до 12 атомов кольца на гетероцикл. В частности, гетероарильными группами являются те группы, которые имеют от 3 до 8 атомов кольца или от 5 до 7 атомов кольца на кольцевую структуру. Иллюстративные примеры гетероарильных групп включают следующие объекты в форме соответствующим образом связанных компонентов:

[0045] Термины "гетероцикл" "гетероциклический" или "гетероциклил", используемые в настоящем документе, охватывают и "гетероциклоалкильные" и "гетероарильные" компоненты, определенные выше.

[0046] Специалистам в данной области понятно, что виды перечисленных или проиллюстрированных выше гетероциклильных, гетероарильных и гетероциклоалкильных групп не являются исчерпывающими, и также можно выбрать дополнительные виды в объеме этих определенных терминов.

[0047] Термин "галоген" относится к хлору, фтору, брому или йоду. Термин "галогенсодержащий" относится к хлор-, фтор-, бром- или йодсодержащим молекулам.

[0048] Термин "замещенный" означает, что указанная группа или компонент содержат один или несколько заместителей. Термин "незамещенный" означает, что указанная группа не содержит заместителей. Термин "необязательно замещенный" означает, что указанная группа не замещена или замещена одним или несколькими заместителями. Когда термин "замещенный" используют для описания структурной системы, это значит, что замещение происходит по любому положению системы, где это позволяет валентность.

[0049] Любая формула, приведенная в настоящем документе, предназначена для представления соединений, имеющих структуры, изображенные структурной формулой, а также определенных вариаций или форм. В частности, соединения с любой формулой, приведенной в настоящем документе, могут иметь центры ассиметрии и, таким образом, существовать в различных энантиомерных формах. Все оптические изомеры и стереоизомеры соединений из общей формулы, и их смеси, рассматриваются в объеме формулы. Таким образом, любая формула, приведенная в настоящем документе, предназначена для представления рацемата, одной или нескольких энантиомерных форм, одной или нескольких диастереоизомерных форм, одной или нескольких атропоизомерных форм и их смесей. Кроме того, определенные структуры могут существовать в виде геометрических изомеров (т.е. цис- и трансизомеров), в виде таутомеров, или в виде атропоизомеров. Кроме того, любая формула, приведенная в настоящем документе, относится также к любому из гидратов, сольватов и аморфных и полиморфных форм таких соединений, и их смеси, даже если такие формы явно не перечислены. В определенных вариантах осуществления растворитель представляет собой воду и сольваты представляют собой гидраты.

[0050] Любая формула, приведенная в настоящем документе, также предназначена для представления немеченых форм, а также форм соединений, меченных изотопами. Соединения, меченные изотопами, имеют структуры, изображенные посредством формул, приведенных в настоящем документе, за исключением одного или нескольких атомов, которые замещены атомом с выбранной атомной массой или массовым числом. Примеры изотопов, которые можно вводить в соединения, описываемые в настоящем документе, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора, хлора и йода, такие как ²H, ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸О, ¹⁷О, ³¹P, ³²P, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl и ¹²⁵I, соответственно. Такие соединения, меченные изотопами, подходят для метаболических исследований (предпочтительно с ¹⁴C), исследования кинетических реакций (например, с ²H или ³H), способов детекции или визуализации [таких как позитронно-эмиссионная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT)], включая анализы распределения в ткани лекарственного средства или субстрата, или для радиоактивного лечения пациентов. В частности, соединение, меченое ¹⁸F или ¹¹C, может быть особенно предпочтительным для исследований PET или SPECT. Кроме того, замена более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий (т.е. ²H) может давать определенные терапевтические преимущества в результате более высокой метаболической стабильности, например, повышенного времени полужизни in vivo или пониженных требований к дозированию. Соединения, меченные изотопами, которые описаны в настоящем документе, и их пролекарственные средства, как правило, можно получать, способами, описанными в схемах или в примерах и получении препаратов, описанных ниже, путем замены легкодоступным реагентом, меченным изотопом, реагента, не меченного изотопом.

[0051] При обращении к любой формуле, приведенной в настоящем документе, выбор конкретного компонента из списка возможных видов для указанной переменной не означает такой же выбор видов для переменной, появляющейся в другом месте. Другими словами, там, где переменная появляется больше одного раза, выбор видов из указанного списка является независимым от выбора видов для той же самой переменной в другом месте формулы, если не указано иначе.

[0052] Номенклатура "С_i-j", где j>i по отношению к классу заместителей в настоящем документе предназначена для обозначения вариантов осуществления любых композиций, применений или способов, описываемых в настоящем документе, для которых независимо реализуются все и каждое число углеродных единиц, от i до j, включая i и j. В качестве примера, термин C_1-3 относится независимо к вариантам осуществления, которые имеют одну углеродную единицу (C₁), вариантам осуществления, которые имеют две углеродных единицы (C₂), и вариантам осуществления, которые имеют три углеродных единицы (C₃).

[0053] Термин C_n-m-алкил относится к неразветвленной или разветвленной алифатической цепи с общим количеством N углеродных единиц в цепи, которое отвечает требованиям n≤N≤m, где m>n.

[0054] Химические наименования, перечисляемые в настоящем документе, получали с использованием программного обеспечения AutoNOM™. Если есть расхождение между химической структурой и названием, определенным для этой структуры, преимущество у структуры.

[0055] Согласно вышеуказанным соображениям об интерпретации присваивания значений и номенклатуры, следует понимать, что прямая ссылка в настоящем документе на множество подразумевает, химически значимую, и если не указано иначе, независимую ссылку на варианты осуществления такого набора, и ссылка на все и каждый из возможных вариантов осуществления подмножеств такого множества является явно указанной.

[0056] Термин "изменение паттерна природного гликозилирования" в настоящем документе предназначен для обозначения удаления одной или нескольких углеводных групп, которые встречаются в нативной последовательности FLT3 (или путем удаления исходного участка гликозилирования или путем удаления гликозилирования химическими и/или ферментативными способами), и/или добавления одного или нескольких участков гликозилирования, которые отсутствуют в нативной последовательности FLT3, где "паттерн природного гликозилирования" относится к природному посттрансляционному паттерну гликозилирования, который является результатом конкретной комбинации последовательности FLT-3, типа клеток и использованных условий роста. Кроме того, фраза включает в себя качественные изменения в гликозилировании нативных белков, включающие изменения природы и соотношений различных присутствующих углеводных групп.

[0057] Термин "аналог" относится к молекуле, которая структурно подобна или разделяет сходство или соответствующие признаки с другой молекулой (например, родственным FLT3 белком). Например, аналог белка FLT3 мог бы специфически связываться с антителом или T-клеткой, которые специфически связываются с FLT3.

[0058] Термин "антитело" используют в самом широком смысле, если явно не указано иное. Таким образом, "антитело" может быть природным или синтетическим, таким как моноклональные антитела, произведенные общепринятой технологией гибридомы или трансгенными мышами. Антитела к FLT3 включают моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен и/или одну или несколько определяющих комплементарность областей этих антител. Применяемый в настоящем документе термин "антитело" относится к любой форме антитела или его фрагмента, которая специфически связывается с FLT3 и/или демонстрирует желаемую биологическую активность, и конкретно включает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они специфически связываются с FLT3 и/или демонстрируют желаемую биологическую активность. Любое специфическое антитело можно использовать в способах и композициях, предлагаемых в настоящем документе. Таким образом, в одном из вариантов осуществления термин "антитело" включает молекулу, которая содержит, по меньшей мере, одну вариабельную область из легкой цепи молекулы иммуноглобулина и, по меньшей мере, одну вариабельную область из тяжелой цепи молекулы, которые в комбинации формируют участок специфического связывания для антигена-мишени. В одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело IgG. Например, антитело представляет собой антитело IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела, подходящие для настоящих способов и композиций, можно получать в культуре клеток, в фаге, или различных животных, включая в качестве неограничивающих примеров коров, кроликов, коз, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, овец, собак, кошек, нечеловекообразных обезьян, шимпанзе и человекообразных обезьян. Таким образом, в одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело млекопитающего. Способы на основе фагов можно использовать для выделения исходного антитела или для создания вариантов с измененной характеристиками специфичности или авидности. Такие способы являются обычными и хорошо известными в данной области. В одном из вариантов осуществления антитело произведено рекомбинантными способами, известными в данной области. Например, рекомбинантное антитело можно получать путем трансфекции клетки-хозяина вектором, который содержит последовательность ДНК, кодирующую антитело. Можно использовать один или несколько векторов для трансфекции последовательности ДНК, экспрессирующей, по меньшей мере, одну область VL и, по меньшей мере, одну область VH в клетке-хозяине. Иллюстративные описания рекомбинантных способов для создания и продукции антител включают Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); и CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, самое последнее издание). Антитело по настоящему изобретению можно модифицировать рекомбинантными способами, чтобы повысить эффективность антитела в опосредовании желаемой функции. Таким образом, в пределах объема изобретения находится то, что антитела можно модифицировать путем замен с использованием рекомбинантных способов. Как правило, замены будут консервативными заменами. Например, по меньшей мере, одна аминокислота в константной области антитела может быть замещена другим остатком. См., например, патент США № 5624821, патент США № 6194551, заявку № WO 9958572; и Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). Модификация в аминокислотах включает делеции, добавления и замены аминокислот. В некоторых случаях, такие замены сделаны для уменьшения нежелательных действий, например, обусловленной комплементом цитотоксичности. Часто антитела метят, ковалентно или нековалентно присоединяя вещество, которое обеспечивает детектируемый сигнал. Известен и широко описан в научной и патентной литературе широкий спектр меток и способов конъюгации. Можно проводить отбор этих антител по связыванию с нормальным или дефектным FLT3. См. например, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996). Подходящие антитела с желаемым биологическим действием можно идентифицировать с использованием следующих анализов in vitro, включая в качестве неограничивающих примеров анализы пролиферации, миграции, адгезии, роста на мягком агаре, ангиогенеза, межклеточного взаимодействия, апоптоза, транспорта, передачи сигнала, и следующих анализов in vivo, таких как ингибирование роста опухоли. Антитела, предлагаемые в настоящем документе, могут также быть полезными для диагностического применения. В качестве захватывающих или не-нейтрализующих антител, можно проводить отбор антител по их способности связываться со специфическим антигеном без ингибирования связывания с рецептором или биологической активности антигена. В качестве нейтрализующих антител, антитела могут быть полезны в анализах конкурентного связывания. Их также можно использовать для количественной оценки FLT3 или его рецептора.

[0059] Термин "антигенсвязывающий фрагмент" или "фрагмент антитела" из антитела (или просто "часть антитела"), применяемый в настоящем документе, относится к одному или нескольким фрагментам антитела к FLT3, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, FLT3 и вариантами; см., фигуру 1). Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела можно выполнять при помощи фрагментов полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, которые включены в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd состоящий из доменов V_H и C_HI; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H домены из одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена V_H; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются раздельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов при помощи синтетического линкера, который позволяет им производиться в виде единой белковой цепи, в которой области V_L и V_H соединены для образования одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включены в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Эти фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и производят отбор фрагментов для использования таким же образом, что и интактные антитела.

[0060] Термин "Fc", применяемый в настоящем документе, относится к области, содержащей шарнирную область, домены CH2 и/или CH3.

[0061] Как применяют в настоящем документе, любую форму "антигена" можно использовать для получения антитела, которое будет специфично к FLT3. Таким образом, активирующий антиген может быть единичным эпитопом, несколькими эпитопами или целым белком по отдельности или в комбинации с одним или несколькими веществами, усиливающими иммуногенность, известными в данной области. Активирующий антиген может быть выделенным полноразмерным белком, белком клеточной поверхности (например, иммунизация клетками, трансфицированными, по меньшей мере, частью антигена), или растворимым белком (например, иммунизация только частью с внеклеточным доменом белка). Антиген можно получать в генетически модифицированной клетке. ДНК, кодирующая антиген может быть геномной или не геномной (например, кДНК) и кодирует, по меньшей мере, часть внеклеточного домена. Применяемый в настоящем документе термин "часть", в отношении антигена, относится к минимальному числу аминокислот или нуклеиновых кислот, при необходимости, которое составляет иммуногенный эпитоп антигена, представляющего интерес. Можно использовать любые генетические векторы, подходящие для трансформации клеток, представляющих интерес, включая в качестве неограничивающих примеров, аденовирусные векторы, плазмиды, и невирусные векторы, такие как катионные липиды. В одном из вариантов осуществления антитело из способов и композиций в настоящем документе специфически связывается, по меньшей мере, с частью внеклеточного домена FLT3, представляющего интерес.

[0062] Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предлагаемые в настоящем документе, могут составлять "биоактивное средство" или быть частью "биоактивного средства". Применяемый в настоящем документе термин "биоактивное средство" относится к любому синтетическому или природному соединению, которое связывается с антигеном и/или усиливает или опосредует желаемое биологическое действие для усиления токсинов, убивающих клетки. В одном из вариантов осуществления связывающие фрагменты, подходящие для настоящего изобретения, представляют собой биологически активные фрагменты. Применяемый в настоящем документе термин "биологически активный" относится к антителу или фрагменту антител, которые способны связываться с желаемым антигенным эпитопом и прямо или опосредованно вызывать биологическое воздействие. Прямые воздействия в качестве неограничивающих примеров включают модулирование, стимуляцию и/ или ингибирование ростового сигнала, модулирование, стимуляцию и/ или ингибирование противоапоптозного сигнала, модулирование, стимуляцию и/ или ингибирование апоптозного сигнала или сигнала для некроза, модулирование, стимуляцию и/ или ингибирование каскада ADCC, и модулирование, стимуляцию и/ или ингибирование каскада CDC.

[0063] Аффинность связывания антигенсвязывающего белка определяют при помощи константы ассоциации (Ka) и константы диссоциации (Kd) (KD=Kd/Ka). Аффинность связывания можно измерять при помощи BIACORE, например, путем захвата исследуемого антитела на сенсорную поверхность, покрытую белком А, и наливания FLT3 на эту поверхность. Альтернативно, аффинность связывания можно измерять при помощи FORTEBIO, например, с рецептором для исследуемого антитела, захваченным на иглу, покрытую белком А, и наливания FLT3 на эту поверхность. Специалист в данной области может идентифицировать другие подходящие анализы, известные в данной области для измерения аффинности связывания.

[0064] Термин "специфически связывается", применяемый в настоящем документе по отношению к антигенсвязывающим белкам, означает, что антигенсвязывающий белок связывается с FLT3, а также с определенным доменом, или определенной аминокислотной последовательностью в пределах FLT3 без связывания или с незначительным связыванием с другими (например, неродственными) белками. Однако этот термин не исключает тот факт, что антитела или их связывающие фрагменты также могут перекрестно реагировать с близкородственными молекулами. Антитела и их фрагменты, а также конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие антитела, описываемые в настоящем документе, могут специфически связываться с FLT3, с аффинностью, по меньшей мере, в 2, 5, 10, 50, 100 или 1000 раз более высокой, чем они связываются с близкородственными молекулами.

[0065] При связывании любого из антител, описываемых в настоящем документе, в какой бы ни было форме, например, в конъюгате антитела с лекарственным средством, с FLT3 можно было бы ожидать частичного или полного блокирования связывания FL с FLT3. Однако в настоящем документе присутствуют антитела к FLT3, которые по существу не ингибируют связывание FL с FLT3. Для того чтобы "по существу ингибировать" связывание, следует ожидать выявляемого количества снижения связывания за пределами минимального изменения; небольшое изменение в связывании, которое эквивалентно не более, чем минимальному количеству связывания, которого можно ожидать при случайных белок-белковых взаимодействиях или при неспецифических взаимодействиях антитело-антиген, не охватывается термином. Измерение того, ингибирует ли антитело по существу связывание другой молекулы с антигеном-мишенью, можно проводить с использованием биофизического измерения или функционального измерения при помощи способов, известных в данной области. Например, взаимодействие двух белков можно измерять напрямую в физическом анализе связывания (например, см. пример 14, ниже), или опосредованно через функциональный анализ, которые измеряет воздействия, возникающие после взаимодействия белков, такие как передача сигнала через рецептор или последующие клеточные эффекты, такие как рост или ингибирование роста клеток. Таким образом, антитела к FLT3, описываемые в настоящем документе, которые по существу не ингибируют связывание FL с FLT3, не вызывают значительного снижения связывания FL с FLT3, и выявляется передача сигнала при связывании FL через FLT3.

[0066] "Биспецифические" антитела также являются полезными для настоящих способов и композиций. Применяемый в настоящем документе термин "биспецифическое антитело" относится к антителу, как правило, моноклональному антителу со специфичностью связывания, по меньшей мере, к двум различным антигенным эпитопам. В одном из вариантов осуществления эпитопы относятся к одному антигену. В другом варианте осуществления эпитопы относятся к различным антигенам. Способы для получения биспецифических антител известны в данной области. Например, биспецифические антитела можно получать рекомбинантно с использованием совместной экспрессии двух пар тяжела цепь иммуноглобулина/легкая цепь. См., например, Milstein et al., Nature 305:537-39 (1983). Альтернативно, биспецифические антитела можно получать с использованием химической связи. См., например, Brennan, et al., Science 229:81 (1985). Биспецифические антитела включают фрагменты биспецифических антител. См., например, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).

[0067] Моноклональные антитела, описываемые в настоящем документе, конкретно включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то врмя как остальная часть цепи/цепей идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они специфически связываются с антигеном-мишенью и/или демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

[0068] Как используют в настоящем документе, термины "злокачественная опухоль", "неоплазия" и "опухоль" используют взаимозаменяемо, и в форме единственного или множественного числа они относятся к клеткам, которые подверглись злокачественной трансформации, которая сделала их патологическими по отношению к организму-хозяину. Первичные злокачественные клетки (которые являются клетками, полученными из участка, рядом с участком злокачественной трансформации) можно легко отличить от не злокачественных клеток при помощи общепризнанных способов, в частности, гистологического исследования. Определение злокачественной клетки, применяемое в настоящем документе, включает не только первичную злокачественную клетку, но также любую клетку, полученную из злокачественной клетки-предшественника. Эти клетки включают метастазированные злокачественные клетки, и культуры и линии клеток in vitro, полученные из злокачественных клеток. По отношению к типу злокачественной опухоли, которая обычно манифестирует в виде as солидной опухоли, "клинически выявляемая" опухоль представляет собой опухоль, которую можно выявить на основании массы опухоли; например, при помощи способов, таких как компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, рентген, ультразвук или пальпация, и/или которую можно выявить по экспрессии одного или нескольких опухоль-специфических антигенов в образце, полученном от пациента. Опухоли могут быть опухолями гемопоэтического происхождения, например, опухолями клеток крови или т.п., т.е. жидкими опухолями. Конкретные примеры клинических состояний на основе такой опухоли включают лейкоз, такой как хронический миелоцитарный лейкоз или острый миелоцитарный лейкоз; миелому, такую как множественная миелома; лимфома и т.п.

[0069] Термин "терапевтическое средство" относится ко всем веществам, которые обеспечивают терапевтическую выгоду и/или являются терапевтически эффективными, как определено в настоящем документе. Терапевтическое средство может, например, обращать вспять, улучшать состояние, уменьшать, замедлять или ограничивать прогрессирование, или уменьшать тяжесть заболевания, нарушения или состояния, или воздействовать или улучшать или облегчать один или несколько симптомов заболевания, такого как злокачественная опухоль. Такое вещество может быть цитотоксическим или цитостатическим. Термин в качестве неограничивающих примеров включает, химиотерапевтические средства, противоопухолевые средства и вещества "группа лекарственного средства", определенные в настоящем документе.

[0070] Термин "противоопухолевое средство" относится ко всем веществам, которые обеспечивают терапевтическую выгоду и/или являются терапевтически эффективными, как определено в настоящем документе, при лечении неоплазии или злокачественной опухоли.

[0071] В определенных вариантах осуществления использование любого из конъюгатов антитела с лекарственным средством и их фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, конъюгата антитела с лекарственным средством, содержащего терапевтическое средство, и его фармацевтических композиций, также является эффективным для лечения предракового состояния или по меньшей мере одной предзлокачественной клетки, например, профилактики злокачественной трансформации в злокачественную клетку. В других вариантах осуществления одно или несколько противоопухолевых средств также эффективны при лечении предракового состояния или, по меньшей мере, один пре-злокачественной клетки, например, профилактика злокачественной трансформации в злокачественную клетку.

[0072] Термин "химиотерапевтическое средство" относится ко всем химическим соединениям, которые эффективны для ингибирования роста опухоли. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства; например, азотистые иприты, этилениминовые соединения и алкилсульфонаты; антиметаболиты, например, фолиевую кислоту, антагонисты пурина или пиримидина; ингибиторы митоза, например, антитубулиновые вещества, такие как алкалоиды барвинка, ауристатины и производные подофиллотоксина; цитотоксические антибиотики; соединения, которые разрушают или мешают репликации или экспрессии ДНК, например, средства, связывающиеся с малой канавкой ДНК; и антагонисты рецепторов для факторов роста. Кроме того, химиотерапевтические средства включают цитотоксические средства (как определено в настоящем документе), антитела, биологические молекулы и низкомолекулярные соединения.

[0073] Термин "соединение" относится собственно к химическим соединениям, а также, указано ли это явно или нет, и если не ясно из контекста, что последующие должны быть исключены, к аморфным и кристаллическим формам соединений, включая полиморфные формы, при этом эти формы могут быть частью смеси или по отдельности; к соединениям в форме свободных кислот и свободных оснований, которые, как правило, являются формами, показанными в структурах, предлагаемых в настоящем документе; к изомерам соединений, который обозначают оптические изомеры, и таутомерные изомеры, при этом оптические изомеры включают энантиомеры и диастереомеры, хиральные изомеры и нехиральные изомеры, и оптические изомеры включают выделенные оптические изомеры, а также смеси оптических изомеров, включая рацемические и не-рацемические смеси; где изомер может быть в выделенной форме или в смеси с одним или несколькими другими изомерами; к изотопным соединениям, включая дейтерий- и тритий-содержащие соединения, и включая соединения, содержащие радиоактивные изотопы, включая терапевтически и диагностически эффективные радиоактивные изотопы; к мультимерным формам соединений, включая димерные, тримерные и т.д. формы; к солям соединений, предпочтительно фармацевтически приемлемым солям, включая соли присоединения кислот и соли присоединения оснований, включая соли с органическими противоионами и неорганическими противоионами, и включая цвиттер-ионные формы, где если соединение ассоциировано с двумя или более противоионами, два или более противоионов могут быть одинаковыми или различными; и к сольватам соединений, включая гемисольваты, моносольваты, дисольваты, и т.д., включая органические сольваты и неорганические сольваты, указанные неорганические сольваты включают гидраты; где если соединение ассоциировано с двумя или более молекулами растворителя, две или более молекулы растворителя молекулы могут быть одинаковыми или различными. В некоторых случаях, ссылка в настоящем документе на соединение по изобретению будет включать прямую ссылку на одну или вышеукзанные формы, например, соли и/или сольваты; однако эта ссылка предназначена только для особого внимания, и не должна рассматриваться как исключающая другие из вышеуказанных форм, определенных выше.

[0074] Термины "определяющая комплементарность область" и "CDR" известны в данной области, как относящиеся к непрерывной последовательности аминокислот в пределах вариабельных областей антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Как правило, существуют три (3) CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три (3) CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3).

[0075] Точные границы аминокислотной последовательности указанной CDR можно легко определить при помощи любой из ряда хорошо известных систем, включая системы, описанные Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5^th Ed. Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (система нумерации "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (система нумерации "Chothia"), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography". Mol. Biol. 262, 732-745". (система нумерации Contact"), Lefranc MP et al., "EVIGT unique numbering for immunoglobulin and T-ctll receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains" Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(l):55-77 (система нумерации "IMGT"), и Honegger A и Pliickthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (система нумерации AHo).

[0076] Границы указанной CDR могут варьировать в зависимости от системы, использованной для идентификации. Например, система Kabat основана на структурном выравнивании, в то время как система Chothia основана на структурной информации. Нумерация по обеим системам Kabat и Chothia основана на наиболее распространенных длинах последовательностей областей антител со вставками, отмеченными вставленными буквами, например, "30a", и делециями, появляющимися в некоторых антителах. Две системы располагают определенные вставки и делеции ("indel") в различных положениях, что приводит к различной нумерации. Система Contact основана на анализе сложных кристаллических структур и во многом похожа на систему нумерации Chothia. Таблица V, ниже, перечисляет положения CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, идентифицированные по системам Kabat, Chothia и Contact, соответственно. Для CDR-H1, нумерация остатков дана и по системе нумерации Kabat, и по Chothia.

[0077] Таким образом, если не указано иначе, термины "CDR" и "определяющая комплементарность область" указанного антитела или его области, такой как вариабельная область, а также отдельные CDR (например, "CDR-H1", "CDR-H2") антитела или его области, следует понимать как включающие в себя определяющую комплементарность область, определенную по любой из известных систем, описанных выше в настоящем документе. В некоторых случаях, обозначена система для идентификации CDR или нескольких CDR, таким образом как CDR, которая определена по способу Kabat, Chothia, или Contact. В других случаях, приведена конкретная аминокислотная последовательность CDR. См., например, Таблицу V.

[0078] Как используют в настоящем документе, термин "консервативная замена" относится к заменам аминокислот и/или аминокислотных последовательностей, которые известны специалистам в данной области и могут быть произведены, как правило, без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалисты в данной области осознают, что, в основном, единичные замены аминокислот в несущественных областях полипептида по существу не меняют биологическую активность (см., например, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^th Edition 1987)). Такие иллюстративные замены предпочтительно производят в соответствии с заменами, указанными в таблице II и Таблице/таблицах Ill(a-b). Например, такие замены включают замену любой из изолейцина (I), валина (V), и лейцина (L) на любую другую из этих гидрофобных аминокислот; аспарагиновой кислоты (D) на глутаминовую кислоту (E) и наоборот; глутамина (Q) на аспарагин (N) и наоборот; и серина (S) на треонин (T) и наоборот. Другие замены могут также рассматриваться как консервативные, в зависимости от окружения конкретной аминокислоты и ее роли в трехмерной структуре белка. Например, глицин (G) и аланин (A) часто могут быть взаимозаменяемыми, также как и аланин (A) с валином (V). Метионин (M), который является относительно гидрофобным, может часто быть заменен лейцином и изолейцином, и иногда валином. Лизин (K) и аргинин (R) часто взаимозаменяемы в положениях, где значимой чертой аминокислотного остатка является его заряд и и различающиеся pK этих двух аминокислотных остатков не важны. Еще другие замены могут рассматриваться как "консервативные" в конкретном окружении (см., например, Таблица III(a) в настоящем документе; страницы 13-15 "Biochemistry" 2^nd ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20): 11882-6). Другие замены также допустимы, и их можно определять эмпирическим путем или или в соответствии с известными консервативными заменами.

[0079] Термин "цитотоксическое средство" относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает экспрессионную активность клеток, функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин включает радиоактивные изотопы, химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты. Примеры цитотоксических средств в качестве неограничивающих примеров включают ауристатины (например, ауристатин E, ауристатин F, MMAE и MMAF), ауромицины, майтанзиноиды, рицин, А-цепь рицина, комбрестатин, дуокармицины, доластатины, доксорубицин, даунорубицин, таксолы, цисплатин, ccl065, бромистый этидий, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, дигидроксиантрациндион, актиномицин, дифтерийный токсин, экзотоксин А Pseudomonas (PE), PE40, абрин, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, курицин, кротин, калихимицин, ингибитор Sapaonaria officinalis, и глюкокортикоиды и другие химиотерапевтическ средства, а также радиоактивные изотопы, такие как At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹² или ²¹³, P³², радиоактивные изотопы Lu, включая Lu¹⁷⁷, и токсины по настоящему изобретению, обозначаемые AGD-0182.

[0080] Антитела, включая антитела по изобретению, также могут быть конъюгированы с любыми из указанных выше цитотоксических средств и также с ферментом, активирующим противоопухолевое пролекарство, способным переводить пролекарство в его активную форму.

[0081] Применяемый в настоящем документе термин "диатела" относится к малым фрагментам антител с двумя участками связывания антигена, чьи фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной полипептидной цепи (V_H-V_L). При помощи линкера, который слишком короткий, чтобы позволить спариваться двум доменам одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Диатела описаны более полно, например, в EP 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).

[0082] Термин "истощение" в отношении воздействия FLT3-связывающего средства на FLT3-экспрессирующие клетки, относится к снижению числа или устранению FLT3-экспрессирующих клеток. Для целей настоящего изобретения, FLT3, также известный как рецептор Fms-подобной тирозинкиназы 3, также известный как Flk2 (киназа 2 зародышевой печени), STK1 (тирозинкиназа 1 стволовых клеток) и CD135, является представителем семейства рецепторов типа III тирозинкиназы (RTK). FLT3 человека кодирует RTK длиной 993 аминокислот, который содержит мембраносвязанный рецептор с пятью иммуноглобулин-подобными внеклеточными доменами и двумя внутриклеточными тирозинкиназными доменами (TKD), связанными при помощи киназного домена-вставки (Stirewalt D L et al.; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). Ген FLT3 человека (ID № гена 2322 (национальный центр биотехнологической информации)) расположен на хромосоме 13q12 и имеет 85% гомологии аминокислотной последовательности с мышиным FLT3 (Rosnet O et al.; Oncogene 8:173-179 (1993). FLT3 экспрессирован в нормальных миелоидных и лимфоидных клетках-предшественниках и в лейкозных клетках у 70-90% пациентов с ОМЛ (Carow, C.E et al.; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet O et al.; Leukemia 10:238-248 (1996), а также при ОЛЛ.

[0083] Термин "продукт гена" используют в настоящем документе для указания на пептид/белок или мРНК. Например, "продукт гена по изобретению" иногда в настоящем документе относится к "аминокислотной последовательности злокачественной опухоли", "белку злокачественной опухоли", "белку злокачественной опухоли, указанной в таблице I", "мРНК злокачественной опухоли", "мРНК злокачественной опухоли, указанной в таблице I", и т.д. В одном из вариантов осуществления белок злокачественной опухоль белок кодирует нуклеиновая кислота по фигуре 1. Белок злокачественной опухоли может быть фрагментом, или альтернативно, может быть полноразмерным белком, кодируемым нуклеиновыми кислотами с фигуры 1. В одном из вариантов осуществления аминокислотную последовательность злокачественной опухоли используют для определения идентичности или сходства последовательностей. В другом варианте осуществления последовательности представляют собой природные аллельные варианты белка, кодируемого нуклеиновой кислотой с фигуры 1. В другом варианте осуществления последовательности представляют собой варианты последовательности, как дополнительно описано в настоящем документе.

[0084] "Гетероконъюгаты" антител подходят для настоящих способов и композиций. Применяемый в настоящем документе термин "гетероконъюгированное антитело" относится к двум ковалентно соединенным антителам. Такие антитела можно получать с применением способов, известных в химии белкового синтеза, включая использование агентов для перекрестного сшивания. См., например, патент США № 4676980.

[0085] Термин "гомолог" относится к молекуле, которая демонстрирует гомологию с другой молекулой, например, за счет наличия последовательностей химических остатков, которые являются одинаковыми или аналогичными в соответствующих положениях.

[0086] Термин "идентичный" или "идентичность последовательностей" указывает на степень идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями, которые выравнивали оптимальным образом и сравнивали с соответствующими вставками или делециями.

[0087] "Процент идентичности" между двумя последовательностями является функцией от числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности=числу идентичных положений/общее число положений × 100), с учетом числа пропусков, и длины каждого пропуска, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно проводить с использованием математического алгоритма, как описано ниже.

[0088] Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определять с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG, с использованием матрицы NWSgapdna. CMP и штрафа за делецию 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за продолжение делеции 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей также можно определять с использованием алгоритма Meyers, et al., Comput. Appi. Biosci., 4: 11-17 (1988), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов остатков PAM120, штрафом за длину делеции 12 и штрафом за делецию 4. Кроме того, процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определять с использованием алгоритма Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970), который встроен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG, с использованием матрицы Blossum 62 или PAM250 и штрафа за делецию 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за продолжение делеции 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

[0089] В качестве примера, полинуклеотидная последовательность может быть идентична референтной полинуклеотидной последовательности, что значит, на 100% идентичной референтной последовательности, или она может включать нуклеотидные замены вплоть до определенного целого числа по сравнению с референтной последовательностью, и быть, по меньшей мере, на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичной. Такие изменения выбраны, по меньшей мере, из одной нуклеотидной делеции, замены, включая транзицию и трансверсию, или вставку, и где указанные изменения могут происходить в 5'- или 3'-концевых положениях референтной нуклеотидной последовательности или в любом месте между концевыми положениями, чередуясь или отдельно среди нуклеотидов в референтной последовательности или в одной или нескольких непрерывных группах внутри референтной последовательности. Число нуклеотидных изменений определяют, умножая общее число нуклеотидов в референтной полинуклеотидной последовательности, описанной в настоящем документе, на числовой процент соответствующего процента идентичности (деленного на 100) и вычитая полученное число из указанного общего числа нуклеотидов в референсной полинуклеотидной последовательности, или: n.sub.а.ltoreq.x.sub.а-(x.sub.аy), где n.sub.n представляет собой число нуклеотидных изменений, x.sub.n представляет собой общее число нуклеотидов в референсной полинуклеотидной последовательности, описанной в настоящем документе (см. последовательности нуклеиновой кислоты в "Списке последовательностей" для примера референтной полинуклеотидной последовательности), и y является 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99 для 99% или 1,00 для 100%, представляет собой символ для знака умножения, и где любое не целое число x.sub.n и y округляют до ближайшего целого числа перед тем как отнять его от x.sub.n.

[0090] Аналогично, полипептидная последовательность может быть идентична референтной полипептидной последовательности, описанной в настоящем документе (см. аминокислотные последовательности в "Списке последовательностей" для примеров референтных полипептидных последовательностей), что значит, на 100% идентичной референтной последовательности, или она может включать аминокислотные замены вплоть до определенного целого числа по сравнению с референтной последовательностью, таким образом, что идентичность составляет меньше 100%, и является, по меньшей мере, на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичной. Такие замены выбраны из группы, состоящей, из по меньшей мере, из одной аминокислотной делеции, замены, включая консервативную и неконсервативную замену, или вставку, и где указанные изменения могут происходить по амино- или карбоксиконцевым положениям в референтной полипептидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, чередуясь или отдельно среди аминокислот в референтной последовательности или в одной или нескольких непрерывных группах внутри референтной последовательности. Число аминокислотных изменений для данного процента идентичности определяют, умножая общее число аминокислот в полипептидной последовательности, кодируемой полинуклеотидной референтной последовательностью, на числовой процент соответствующего процента идентичности (деленного на 100), а затем вычитая полученное число из указанного общего числа аминокислот в полипептидной референтной последовательности, описанной в настоящем документе (см., например, SEQ ID NO: 1-21), или: n.sub.a.ltoreq.x.sub.a-(x.sub.ay), где n.sub.a представляет собой число аминокислотных изменений, x.sub.a представляет собой общее число аминокислот в полипептидной референтной последовательности, и y является 0,50 для 50%, 0,60 для 60%, 0,70 для 70%, 0,75 для 75%, 0,80 для 80%, 0,85 для 85%, 0,90 для 90%, 0,95 для 95%, 0,98 для 98%, 0,99 для 99% или 1,00 для 100%, представляет собой символ для знака умножения, и где любое не целое число x.sub.a и y округляют до ближайшего целого числа перед тем как отнять его от x.sub.a.

[0091] Процент идентичности можно определять по длине последовательностей. Как определено в настоящем документе, термин "более 75% идентичности" включает более 75%, 80%, 85%, 95% и 99% идентичности, а также все отдельные значения и отдельные поддиапазоны в этом диапазоне.

[0092] В одном из вариантов осуществления антитело, предлагаемое в настоящем документе, представляет собой "антитело человека". Применяемый в настоящем документе термин "антитело человека" относится к антителу, в котором по существу полные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи, включая определяющие комплементарность области (CDR), происходят из генов человека. В одном из вариантов осуществления моноклональные антитела человека получают способом триомы, способом с B-клетками человека (см., например, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), способ трансформации при помощи вируса Эпштейна-Барра (см., например, Cole et al. MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)), или с использованием фагового дисплея (см., например, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). В конкретном варианте осуществления антитело человека получают в трансгенной мыши. Способы получения таких частично или полностью человеческих антител известны в данной области и можно использовать любые такие способы. Согласно одному, особенно предпочтительному варианту осуществления, полные последовательности антитела человека производятся в трансгенной мыши, сконструированной для экспрессии генов тяжелой и легкой цепей антитела человека. Иллюстративное описание получения трансгенных мышей, которые производят антитела человека, можно найти в заявке №. WO 02/43478 и патенте США 6657103 (Abgenix) и в дочерних патентах. B-клетки от трансгенных мышей, которые производят желаемое антитело, можно затем сливать для получения линий гибридомных клеток для постоянной продукции антитела. См., например, патенты США №№ 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; и 5545806; и Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al, J. Exp. Med. 188:483-95 (1998).

[0093] Применяемый в настоящем документе термин "гуманизированное антитело" относится к формам антител, которые содержат последовательности из не принадлежащих человеку {например, мышиных) антител, а также антител человека. Такие антитела являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из, по меньшей мере, одного, и как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют петлям не принадлежащего человеку иммуноглобулина и все или по существу все из областей FR имеют последовательность из иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека. См. например, патент США № 4816567, выданный Cabilly; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033; и ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996).

[0094] Термины "ингибировать" или "ингибирование", применяемые в настоящем документе, означают снижение измеряемого количества, или полное предотвращение.

[0095] Фразы "выделенный" или "биологически чистый" относятся к материалу, который значительно или существенно свободен от компонентов, которые обычно сопровождают материал, когда он находится в нативном состоянии. Таким образом, выделенные пептиды по изобретению предпочтительно не содержат материалов, обычно связанных с пептидами в их окружении in situ. Например, полинуклеотид будет "выделенным", когда он по существу отделен от загрязняющих полинуклеотидов, которые соответствуют или комплементарны генам, иным чем гены FLT3, или которые кодируют полипептиды, иные чем продукт гена FLT3 или его фрагменты. Специалист в данной области может легко использовать способы для выделения нуклеиновых кислот для получения выделенного полинуклеотида FLT3. Белок будет "выделенным", например, когда используют физические, механические или химические способы для удаления белков FLT3 из клеточных компонентов, которые обычно ассоциированы с белком. Специалист в данной области может легко использовать стандартные способы очистки для получения выделенного белка FLT3. Альтернативно, выделенный белок можно получать химическими способами.

[0096] Подходящие "метки" включают радионуклиды, ферменты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, флуоресцентные молекулы, хемилюминесцентные молекулы, магнитные частицы, и т.п. Патенты, описывающие применение таких меток, включают патенты США №№ 3817837; 3850752; 3939350; 3996345; 4277437; 4275149; и 4366241. Кроме того, антитела, предлагаемые в настоящем документе, могут быть полезны в качестве антигенсвязывающего компонента флуоротел. См. например, Zeytun et al, Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003).

[0097] Термин "млекопитающее" относится к любому организму, классифицированному как млекопитающее, включая мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, коров, лошадей и людей. В одном из вариантов осуществления изобретения млекопитающее представляет собой мышь. В другом варианте осуществления изобретения млекопитающее представляет собой человека.

[0098] Термины "метастатическая злокачественная опухоль" и "метастатическое заболевание" означают злокачественные опухоли, которые распространились в региональные лимфоузлы или в отдаленные участки, и включают стадию заболевания D по системе AUA и стадию T×N×M+ по системе TNM.

[0099] Термин "модифицированный", применяемый в настоящем документе, относится к наличию изменения в природной аминокислоте, не природной аминокислоте, природном аминокислотном полипептиде или неприродном аминокислотном полипептиде. Такие изменения или модификации можно получать путем постсинтетических модификаций природных аминокислот, неприродных аминокислот, природных аминокислотных полипептидов или неприродных аминокислотных полипептидов, или путем со-трансляции, или путем посттрансляционных модификаций природной аминокислоты, не природной аминокислоты, природного аминокислотного полипептида или неприродного аминокислотного полипептида.

[0100] Термин "модулятор" или "тестируемое соединение" или "кандидатное лекарственное средство" или грамматические эквиваленты, используемые в настоящем документе, описывают любую молекулу, например, белок, олигопептид, малую органическую молекулу, полисахарид, полинуклеотид, и т.д., которую исследуют на способность прямо или опосредованно изменять фенотип злокачественной опухоли или экспрессию опухолевых последовательностей, например, последовательностей нуклеиновых кислот или белков, или эффекты опухолевых последовательностей (например, передачу сигнала, экспрессию гена, взаимодействие белка и т.д.) В одном из аспектов модулятор будет нейтрализовать эффект опухолевого белка по изобретению. Под "нейтрализацией" подразумевают ингибирование или блокирование действия белка, наряду с последующим влиянием на клетку. В другом аспекте модулятор будет нейтрализовать эффект гена по изобретению, и его соответствующего белка, путем нормализации уровней указанного белка. В предпочтительных вариантах осуществления модуляторы изменяют профили экспрессии, или профиль экспрессии нуклеиновых кислот или белков, предлагаемых в настоящем документе, или нижерасположенные эффекторные пути. В одном из вариантов осуществления модулятор подавляет фенотип злокачественной опухоли, например, до характерных признаков нормальной ткани. В другом варианте осуществления модулятор вызывает опухолевый фенотип. Как правило, множество анализируемых смесей исследуют параллельно с различными концентрациями вещества для получения различных ответов на различные концентрации. Как правило, одна из этих концентраций служит отрицательным контролем, т.е. нулевая концентрация или ниже уровня детекции.

[0101] Модуляторы, кандидатные лекарственные средства или тестируемые соединения охватывают многочисленные химические классы, хотя, как правило, они представляют собой органические молекулы, предпочтительно, малые органические соединения с молекулярной массой более чем 100 и менее чем приблизительно 2,500 Дальтон. Предпочтительно, низкомолекулярные соединения имеют массу, менее чем 2000, или, менее чем 1500 или, менее чем 1000 или, менее чем 500 Дальтон. Кандидатные вещества содержат функциональные группы, необходимые для структурного взаимодействия с белками, в частности, для образования водородных связей, и, как правило, включают, по меньшей мере, аминовую, карбонильную, гидроксильную или карбоксильную группу, предпочтительно, по меньшей мере, две из функциональных химических групп. Кандидатные вещества часто содержат циклический углерод или гетероциклические структуры и/или ароматические или полиароматические структуры, замещенные одной или несколькими вышеуказанными функциональными группами. Модуляторы также содержат биомолекулы, такие как пептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, производные, структурные аналоги или их сочетания. Особенно предпочтительными являются пептиды. Одним из классов модуляторов являются пептиды, например, из приблизительно от пяти до приблизительно 35 аминокислот, предпочтительно приблизительно от пяти до приблизительно 20 аминокислот, и особенно предпочтительно, приблизительно от 7 до приблизительно 15 аминокислот. Предпочтительно, белок-модулятор опухоли является растворимым, включает не-трансмембранную область, и/или имеет N-концевой Cys для облегчения растворимости. В одном из вариантов осуществления C-конец фрагмента сохраняется в виде свободной кислоты и N-конец представляет собой амин для облегчения присоединения, т.е. к цистеину. В одном из вариантов осуществления белок-модулятор опухоли по изобретению конъюгирован с иммуногенным веществом, как обсуждается в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления белок-модулятор опухоли конъюгирован с BSA. Пептиды по изобретению, например, предпочтительных длин, могут быть связаны друг с другом или с другими аминокислотами для создания более длинного пептида/белка. Пептиды-модуляторы могут быть продуктами расщепления природных белков, как указано выше, случайными пептидами или "смещенными" случайными пептидами. В предпочтительном варианте осуществления модуляторы на основе пептида/белка представляют собой антитела и их фрагменты, как определено в настоящем документе.

[0102] Термин "моноклональное антитело", применяемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного эпитопа. Напротив, общепринятые (поликлональные) препараты антител, как правило, включают множество антител, направленных против (или специфичных) различных эпитопов. В одном из вариантов осуществления поликлональное антитело содержит множество моноклональных антител с различными эпитопными специфичностями, аффинностями или авидностями в пределах одного антигена, который содержит несколько антигенных эпитопов. Модификатор "моноклональный" указывает на признак антитела, как полученного по существу из гомогенной популяции антител, и не должен быть истолкован, как требующий производства антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением можно получать гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), или можно получать способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также можно изолировать из фаговых библиотек антител при помощи способов, описанных в Clackson et al, Nature 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), например. Эти моноклональные антитела будут, как правило, связываться, по меньшей мере, с Kd приблизительно 1 мкΜ, как правило, по меньшей мере, приблизительно 300 нМ, как правило, по меньшей мере, приблизительно 30 нМ, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 10 нМ, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 3 нМ или или лучше, как правило, при определении путем ELISA.

[0103] Термин "моноклональное антитело", применяемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного эпитопа. Напротив, общепринятые (поликлональные) препараты антител, как правило, включают множество антител, направленных против (или специфичных) различных эпитопов. В одном из вариантов осуществления поликлональное антитело содержит множество моноклональных антител с различными эпитопными специфичностями, аффинностями или авидностями в пределах одного антигена, который содержит несколько антигенных эпитопов. Модификатор "моноклональный" указывает на признак антитела, как полученного по существу из гомогенной популяции антител, и не должен быть истолкован, как требующий производства антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением можно получать гибридомным способом, впервые описанным Kohler et al, Nature 256: 495 (1975), или можно получать способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также можно изолировать из фаговых библиотек антител при помощи способов, описанных в Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), например. Эти моноклональные антитела будут, как правило, связываться, по меньшей мере, с Kd приблизительно 1 мкΜ, как правило, по меньшей мере, приблизительно 300 нМ, как правило, по меньшей мере, приблизительно 30 нМ, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 10 нМ, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 3 нМ или или лучше, как правило, при определении путем ELISA.

[0104] "Неприродная аминокислота" или иначе обозначаемая как "nnAA" относится к аминокислоте, которая не является одной из двадцати (20) основных аминокислот или пиролизином, или селеноцистеином. Другими терминами, которые можно использовать в качестве синонимов для термина nnAA, являются "не кодируемая в природе аминокислота", "аминокислота не природного происхождения", "не встречающаяся в природе аминокислота". Кроме того, термин nnAA в качестве неограничивающих примеров включает аминокислоты, которые не встречаются в природе и которые можно получать синтетическим путем или можно получать путем модификации неприродных аминокислот. Например, в контексте настоящего изобретения, пара-ацетилфенилаланин рассматривается как nnAA.

[0105] Термин "пара-ацетилфенилаланин" или "pAF" означает 3-(4-ацетилфенил)-2-аминопропионовую кислоту, обозначенную следующей химической структурой:

[0106] "Фармацевтический эксципиент" включает материал, такой как адъювант, носитель, pH-корректирующие и буферные средства, вещества, корректирующие тоничность, средства для смачивания, консервант, и т.п.

[0107] "Фармацевтически приемлемый" относится к нетоксическому, инертному материалу и/или композиции, которые физиологически совместимы с людьми или другими млекопитающими.

[0108] Термин "полинуклеотид" означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере, из 10 оснований или пар оснований в длину, или рибонуклеотидов, или дезоксинуклеотидов, или модифицированной формы любого из типов нуклеотидов, и включает одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК и/или РНК. В данной области, этот термин часто используют взаимозаменяемо с "олигонуклеотидом". Полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, описываемую в настоящем документе, где тимидин (T), как показано, например, на фигуре 1, может также быть урацилом (U); это определение относится к различиям между химическими структурами ДНК и РНК, в частности, к наблюдению, что одним из четырех основных оснований в РНК является урацил (U) вместо тимидина (T).

[0109] Термин "полипептид" означает полимер, по меньшей мере, приблизительно из 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислот. На всем протяжении описания, используют стандартные трехбуквенные (см., Таблицу III) или однобуквенные обозначения для аминокислот. В данной области, В данной области, этот термин часто используют взаимозаменяемо с "пептидом" или "белком".

[0110] "Рекомбинантная" ДНК или молекула РНК представляет собой ДНК или молекулу РНК, которые подвергались молекулярному воздействию in vitro.

[0111] Применяемый в настоящем документе термин "одноцепочечный Fv" или "scFv" или "одноцепочечное" антитело относится к фрагментам антител, содержащим домены V_H и V_L антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет sFv формировать необходимую структуру для связывания антигена. Для обзора sFv, см. Plückthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg и Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0112] Применяемые в настоящем документе термины "специфический", "специфически связывается" и "связывается специфическим образом" относятся к селективному связыванию антитела с эпитопом антигена-мишени. Антитела можно тестировать на специфичность связывания путем сравнения связывания с соответствующим антигеном со связыванием с неродственным антигеном или смесью антигенов при заданном наборе условий. Если антитело связывается с соответствующим антигеном, по меньшей мере, в 2, 5, 7, и предпочтительно 10 раз больше, чем с неродственным антигеном или смесью антигенов, то но считается специфическим. В одном из вариантов осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается только с антигеном FLT3, но не связывается с неродственным антигеном. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается только с антигеном FLT3 человека, но не связывается с не принадлежащим человеку антигеном FLT3 с 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей аминокислотной гомологией с антигеном FLT3. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается только с антигеном FLT3 человека, но не связывается с не принадлежащим человеку антигеном FLT3 с 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большим процентом идентичности с аминокислотной последовательностью антигена FLT3. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается с антигеном FLT3 человека и связывается с мышиным антигеном FLT3, но в большей степени связывается с антигеном человека. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается с антигеном FLT3 человека и связывается с антигеном FLT3 примата, но в большей степени связывается с антигеном человека. В другом варианте осуществления специфическое антитело представляет собой антитело, которое связывается с антигеном FLT3 человека и с любым не принадлежащим человеку антигеном FLT3, но в большей степени связывается с антигеном человека или любых их сочетанием.

[0113] Применяемые в настоящем документе "лечить" или "терапевтический" и грамматически родственные термины относятся к улучшению любого последствия заболевания, такому как удлиненное выживание, меньшая заболеваемость, и/или уменьшение побочных эффектов, которые являются побочными продуктами альтернативного терапевтического способа воздействия; специалисту в данной области легко будет понятно, что полное излечение заболевания является предпочтительным, хотя и не обязательным для лечения.

[0114] Термин "вариант" относится к молекуле, которая демонстрирует отклонение от описанного типа или нормы, такое как белок, который имеет один или несколько различных аминокислотных остатков в соответствующих положениях конкретно описанного белка (например, белка FLT3, показанного на фигуре 1). Аналог представляет собой пример вариантного белка. Сплайсинговые изоформы и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) являются дополнительными примерами вариантов.

[0115] "Белки FLT3" и/или "белки, родственные FLT3" по изобретению включают белки, конкретно идентифицированные в настоящем документе (см., фигуру 1), а также аллельные варианты, варианты с консервативными заменами, аналоги и гомологи, которые можно выделять/создавать и охарактеризовывать без излишнего экспериментирования при помощи способов, изложенных в настоящем документе или легкодоступных в данной области. Также термин включает слитые белки, которые сочетают части различных белков FLT3 или их фрагментов, а также слитые белки из белка FLT3 и гетерологичного полипептида. Такие белки FLT3, в совокупности обозначают как белки, родственные FLT3, белки по изобретению, или FLT3. Термин "белок, родственный FLT3" относится к полипептидному фрагменту или последовательности белка FLT3 из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, или более чем 25 аминокислот; или, по меньшей мере, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 991, 992 или 993 или более аминокислот.

II.) Антитела к FLT3

[0116] В другом аспекте изобретения предлагаются антитела, которые связываются с белками, родственными FLT3 (см. фигуру 1). В одном из вариантов осуществления антитело, которое связывается с белками, родственными FLT3, представляет собой антитело, которое специфически связывается с белком FLT3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2. Антитело, которое специфически связывается с белком FLT3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2, включает антитела, которые могут связываться с другими белками, родственными FLT3. Например, антитела, которые связываются с белком FLT3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2, могут связываться с белками, родственными FLT3, такими как варианты FLT3, и их аналоги и гомологи.

[0117] Антитела к FLT3 по изобретению особенно подходят для злокачественной опухоли (см., например, Таблицу I), для прогностических анализов, визуализации, диагностики и терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления описан анализ связывания FLT3 для применения для выявления злокачественной опухоли, например, при иммунологическом анализе. Аналогично, такие антитела подходят (например, в комбинации с терапевтическим средством, в ADC), для лечения и/или прогноза острого миелолейкоза ("ОМЛ") и острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), и других злокачественных опухолей, в тех случаях, когда FLT3 также экспрессируется или сверхэкспрессируется в этих других злокачественных опухолях. Кроме того, внутриклеточно экспрессируемые антитела (например, одноцепочечные антитела) являются терапевтически полезными для лечения злокачественных опухолей, в которые вовлечена экспрессия FLT3, такие как прогрессирующий или метастатический ОМЛ или ОЛЛ или другие прогрессирующие или метастатические злокачественные опухоли.

[0118] В данной области хорошо известны различные способы получения антител, в частности, моноклональных антител. Например, антитела можно получать, иммунизируя подходящее млекопитающее-хозяина при помощи белка, родственного FLT3, пептида, или фрагмента, в выделенной форме или в форме иммуноконъюгата (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Кроме того, также можно использовать слитые белки FLT3, такие как слитый белок FLT3-GST. В конкретном варианте осуществления производят белок, слитый с GST и содержащий всю или большую часть аминокислотной последовательности с фигуры 1, а затем используют в качестве иммуногена для получения соответствующих антител. В другом варианте осуществления синтезируют белок, родственный FLT3, и используют в качестве иммуногена.

[0119] Кроме того, используют способы иммунизации с "голой" ДНК, известные в данной области (с наличием или отсутствием белка, родственного FLT3, или клеток, экспрессирующих FLT3) для получения иммунного ответа к кодируемому иммуногену (для обзора, см. Donnelly et al, 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

[0120] Аминокислотную последовательность белка FLT3, показанную на фигуре 1, можно анализировать для выбора конкретных областей белка FLT3 для получения антител. Например, используют анализы гидрофобности и гидрофильности аминокислотной последовательности FLT3 для выявления гидрофильных областей в структуре FLT3. Области белка FLT3, которые демонстрируют иммуногенную структуру, а также другие области и домены, можно легко выявлять с использованием других различных известных в данной области способов, таких как анализы Чоу-Фасмана, Гарнье-Робсона, Кайт-Дулитл, Эйзенберга, Карплюса-Шульца или Джеймсона-Вольфа. Профили гидрофильности можно получать с использованием способа Hopp, T.P. and Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Профили гидропатичности можно получать с использованием способа Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Профили процента доступных остатков можно получать с использованием способа Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Профили средней гибкости можно получать с использованием способа Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Профили бета-изгиба можно получать с использованием способа Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Таким образом, каждая область, идентифицированная при помощи любой из этих программ или способов, входит в объем настоящего изобретения. Предпочтительные способы для получения антител к FLT3 далее проиллюстрированы посредством примеров, предлагаемых в настоящем документе. Способы получения белка или полипептида для применения в качестве иммуногена хорошо известны в данной области. Также хорошо известны в данной области способы получения иммуногенных конъюгатов белка с носителем, таким как БСА, KLH или другим белком-носителем. В некоторых обстоятельствах, используют прямую конъюгацию, например, с использованием карбодиимидных реагентов; в других случаях эффективными являются связывающие реагенты, такие как реагенты, поставляемые Pierce Chemical Co., Rockford, IL. Введение иммуноген FLT3 часто проводят путем инъекции в течение подходящего периода времени и с использованием подходящего адъюванта, как понимают в данной области. Во время схемы иммунизации, можно отбирать титры антител для определения адекватности образования антител.

[0121] Моноклональные антитела FLT3 можно получать различными способами, хорошо известными в данной области. Например, иммортализованные линии клеток, которые секретируют желаемое моноклональное антитело, получают с использованием стандартной гибридомной технологии по Кохлер и Мильштейну или модификациям, которые иммортализуют антитело-продуцирующие B-клетки, что является общеизвестным. Иммортализованные линии клеток, которые секретируют желаемые антитела, отбирают путем иммунологического анализа, в котором антигеном является белок, родственный FLT3. Когда выявляют соответствующую иммортализованную культуру клеток, клетки можно наращивать и получать антитела или из культур in vitro, или из асцитной жидкости.

[0122] Антитела или фрагменты по изобретению также можно получать рекомбинантными способами. Области, которые специфически связываются с желаемыми областями белка FLT3, также можно получать в рамках химерных антител или антител с привитой областью, определяющей комплементарность (CDR), происходящих из разных видов. Также можно получать гуманизированные или человеческие антитела к FLT3, и они являются предпочтительными для применения в терапевтическом контексте. Хорошо известны способы для гуманизации мышиных и других не принадлежащих человеку антител путем замены одной или нескольких не принадлежащих человеческому антителу CDR на соответствующие последовательности антитела человека (см. например, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Также см., Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 и Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.

[0123] В предпочтительном варианте осуществления моноклональные антитела человека по изобретению можно получать с использованием мышей VelocImmune мыши, у которых геномные последовательности, несущие мышиные эндогенные локусы вариабельных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина (сегменты VH, DH и JH) и/или легкой цепи каппа (VK и JK), были заменены, полностью или частично, геномными последовательностями человека, несущими неарранжированные локусы вариабельных сегментов тяжелой цепи иммуноглобулина человека (VH, DH, и JH) и/или легкой цепи каппа (VK и JK) (Regeneron, Tarrytown, NY) зародышевой линии. См., например, патенты США №№. 6586251, 6596541, 7105348, 6528313, 6638768 и 6528314.

[0124] Кроме того, антитела человека по изобретению можно получать с использованием мыши HuMAb мышь (Medarex, Inc.), которая содержит минилокусы генов иммуноглобулина человека, которые кодируют неарранжированные последовательности тяжелых (мю и гамма) и легкой каппа цепей иммуноглобулинов человека, вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цепей мю и каппа (см. например, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859).

[0125] В другом варианте осуществления полноразмерные антитела человека по изобретению можно индуцировать с использованием мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека в трансгенах и трансхромосомах, такой как мышь, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому с легкой цепью человека. Такие мыши в настоящем документе обозначены как "мыши KM", такие мыши описаны у Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 и в публикации PCT WO 02/43478 для Tomizuka, et al.

[0126] Моноклональные антитела человека по изобретению также можно получать с использованием способов фагового дисплея для скрининга библиотек генов иммуноглобулина человека. Такие способы фагового дисплея для выделения антител человека хорошо известны в данной области. См. например: патенты США №№ 5223409; 5403484; и 5571698 to Ladner et al.; патенты США №№ 5427908 и 5580717 для Dower et al.; патенты США №№ 5969108 и 6172197 для McCafferty et al.; и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 для Griffiths et al.

[0127] Моноклональные антитела человека по изобретению также можно получать с использованием мышей SCID, в которых были восстановлены иммунные клетки человека таким образом, что можно получать антительный ответ человека после иммунизации. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5476996 и 5698767 для Wilson, et al.

[0128] Кроме того, антитела человека по настоящему изобретению можно получать способами с использованием трансгенных мышей, обозначаемых Xenomouse, инактивированных для продукции антител, сконструированных при помощи локусов тяжелых и легких цепей человека (Amgen Fremont, Inc., ранее Abgenix, Inc.). Иллюстративные описания получения трансгенных мышей, которые производят антитела человека, можно найти в патенте США 6657103. См., также, патенты США №№ 5569825; 5625126; 5633425; 5661016; и 5545806; и Mendez, et al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002).

[0129] Любые из вышеуказанных способов производства приводят в результате к антителам, которые имеют определенную способность связываться с FLT3, или гомологами, или фрагментами или последовательностями полипептидов с 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательностей с FLT3. Аффинность связывания (K_D) антител, их связывающих фрагментов и конъюгатов антитела с лекарственным средством, содержащих такие же антитела для FLT3, может составлять 1 мМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 2 нМ или менее или 1 нМ или менее. Альтернативно, K_D может составлять от 5 до 10 нМ; или от 1 до 2 нМ. K_D может находиться в пределах от 1 микромоля до 500 микромоль или в пределах от 500 микромоль до 1 нМ.

[0130] Аффинность связывания антигенсвязывающего белка определяют путем константы ассоциации (Ka) и константы диссоциации (Kd) (KD=Kd/Ka). Аффинность связывания можно измерять при помощи BIACORE, например, путем захвата исследуемого антитела на сенсорную поверхность, покрытую белком А, и наливания FLT3 на эту поверхность. Альтернативно, аффинность связывания можно измерять при помощи FORTEBIO, например, с рецептором для исследуемого антитела, захваченным на иглу, покрытую белком А, и наливания FLT3 на эту поверхность. Специалист в данной области может идентифицировать другие подходящие анализы, известные в данной области для измерения аффинности связывания.

[0131] Термин "специфически связывается", применяемый в настоящем документе по отношению к антигенсвязывающим белкам, означает, что антигенсвязывающий белок связывается с FLT3, а также с определенным доменом, или определенной аминокислотной последовательностью в пределах FLT3 без связывания или с незначительным связыванием с другими (например, неродственными) белками. Этот термин, однако не исключает тот факт, что антитела или их связывающие фрагменты также могут перекрестно реагировать с близкородственными молекулами. Антитела и их фрагменты, а также конъюгаты антитело-лекарственное средство, содержащие антитела, описываемые в настоящем документе, могут специфически связываться с FLT3, с аффинностью, по меньшей мере, в 2, 5, 10, 50, 100 или 1000 раз более высокой, чем они связываются с близкородственными молекулами.

[0132] В предпочтительном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, обозначенного CHv62.21 и производимого клетками китайского хомяка (CHO), находящимися на хранении в Американской коллекции типовых культур (ATCC), номер доступа PTA-121831 (см., фигуру 3 A и/или 3B), или вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны аминокислотным последовательностям вариабельных областей тяжелой и легкой цепей CHv62.21, и где антитела сохраняют желаемые функциональные свойства МАТ к FLT3 по изобретению. Вариабельная область тяжелой цепи CHv62.21 состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи CHv62.21 состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 108 (R) SEQ ID NO: 10. CDR 1-3 (по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи CHv62.21 состоят из аминокислотной последовательности в диапазоне от 31-35, от 50-65, и от 95-102 f SEQ ID NO: 9, соответственно, и CDR 1-3 (по Kabat или Chothia) вариабельной области легкой цепи CHv62.21 состоят из аминокислотной последовательности в диапазоне от 24- 34, от 50-56, и от 89-97 SEQ ID NO: 10, соответственно (см., фигуру 4 и Таблицу V). В качестве константной области антитела по изобретению можно выбирать любой подкласс константной области. В одном из вариантов осуществления можно использовать константную область IgG1 человека в качестве константной области тяжелой цепи и константную область каппа Ig человека в качестве константной области легкой цепи.

[0133] Например, изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

[0134] (a) вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, изложенной на фигуре 3A и/или 3B; и

[0135] (b) вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, изложенной на фигуре 3A и/или 3B.

[0136] В других вариантах осуществления аминокислотные последовательности VH и/или VL на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям V_H и V_L, изложенным на фигуре 3A и/или 3B. Описание в настоящем документе также предлагает полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие или b, или последовательности VH или VL, изложенные на фигуре 3A и/или 3B, а также полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, которые на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны этим.

[0137] В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающей части, содержащему гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи и гуманизированную вариабельную область легкой цепи, где:

[0138] (a) вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR) с аминокислотными последовательностями CDR вариабельной области тяжелой цепи, изложенными на фигуре 3A и/или 3B;

[0139] (b) вариабельная область легкой цепи содержит определяющие комплементарность области (CDR) с аминокислотными последовательностями CDR вариабельной области легкой цепи, изложенными на фигуре 3A и/или 3B.

[0140] Сконструированные антитела по изобретению включают антитела, в которых были сделаны модификации в каркасных остатках в пределах V_H и/или V_L (например, для улучшения свойств антитела). Как правило, такие модификации каркаса делают для снижения иммуногенности антитела. Например, один из способов предназначен для "обратной мутации" одного или нескольких каркасных остатков до соответствующей последовательности зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое подверглось соматической мутации, может содержать каркасные остатки, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которой получено антитело. Такие остатки можно выявлять, сравнивая каркасные последовательности антитела с последовательностями зародышевой линии, из которой получено антитело. Для возвращения последовательностей каркасной области к конфигурации зародышевой линии, соматические мутации могут быть "обратно мутированы" до последовательности зародышевой линии, например, путем сайт-специфического мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенез (например "обратно мутированы" из лейцина в метионин). Такие "обратно мутированные" антитела также включены в изобретение.

[0141] Другой тип модификации каркаса включает мутирование одного или нескольких остатков внутри каркасной области, или даже внутри одной или нескольких областей CDR, для удаления T-клеточных эпитопов и, таким образом, снижения потенциальной иммуногенности антитела. Этот способ также обозначают как "деиммунизация", и он дополнительно подробно описан в патентной публикации США № 2003/0153043 Carr et al.

[0142] Кроме того или альтернативно, для модификаций в каркасе или областях CDR, антитела по изобретению могут быть сконструированы для включения модификаций в пределах Fc-области, как правило, для изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полувыведения из сыворотки, фиксация комплемента, связывание с Fc-рецептором, и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность. Кроме того, МАТ к FLT3 по изобретению можно химически модифицировать (например, можно присоединить одну или несколько химических групп к антителу) или модифицировать для изменения его гликозилирования, опять для изменения одного или нескольких функциональных свойств МАТ. Каждый из этих вариантов осуществления описан в дополнительных деталях ниже.

[0143] В одном из вариантов осуществления шарнирная область CH1 модифицирована таким образом, что число остатков цистеина в шарнирной области изменено, например, увеличено или уменьшено. Этот способ дополнительно описан в патенте США № 5677425, выданном Bodmer et al. Число остатков цистеина в шарнирной области CH1 изменено, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для повышения или снижения стабильности МАТ к FLT3.

[0144] В другом варианте осуществления шарнирная область Fc антитела мутирована для снижения биологического времени полужизни МАТ для FLT3. Более конкретно, одну или несколько аминокислотных мутаций вводят в область поверхностного участка доменов CH2-CH3 Fc-шарнирного фрагмента таким образом, что антитело имеет нарушенное связывание с белком А стафилококка (SpA) относительно нативного домена связывания с SpA Fc-шарнира. Этот способ дополнительно описан в патенте США № 6165745, выданном Ward et al.

[0145] В другом варианте осуществления МАТ к FLT3 модифицировано для увеличения его биологического времени полужизни. Возможны различные способы. Например, мутации можно вводить, как описано в патенте США № 6277375, выданном Ward. Альтернативно, для увеличения биологического времени полужизни антитело можно изменять в пределах области CH1 или CL для включения эпитопа связывания рецептора спасения, который взят из двух петель домена CH2 Fc-области IgG, как описано в патентах США №№ 5869046 и 6121022, выданном Presta et al.

[0146] В других вариантах осуществления Fc-область изменена путем замены, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для изменения эффекторной функции/функций МАТ к FLT3. Например, можно замещать одну или несколько аминокислот, выбранных из конкретных аминокислотных остатков, другим аминокислотным остатком, таким образом, что антитело имеет измененную аффинность для эффекторного лиганда, но сохраняет антигенсвязывающую способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, аффинность к которому изменяют, может быть, например Fc-рецептором или компонентом C1 комплемента. Этот способ дополнительно описан в патентах США №№ 5624821 и 5648260, оба выданы Winter, et al.

[0147] В другом варианте осуществления тяжелая цепь изменена путем замены, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка неприродной аминокислотой при помощи технологии ReCODE, разработанной Ambrx (La Jolla, CA). Одним из примеров неприродной аминокислоты является пар-ацетилфенилаланин.

[0148] Реактивность антител к FLT3 с белком, родственным FLT3, можно устанавливать при помощи ряда хорошо известных способов, включая Вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, ELISA, и анализы FACS, с использованием, при необходимости, белков, родственных FLT3, клеток, экспрессирующих FLT3 или их экстрактов. Антитело к FLT3 или его фрагмент можно метить детектируемым маркером или конъюгировать со второй молекулой. Подходящие детектируемые маркеры в качестве неограничивающих примеров включают радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминисцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металлов или фермент. Кроме того, биспецифические антитела, специфические для двух или более эпитопов FLT3, получают с использованием способов, общеизвестных в данной области. Гомодимерные антитела можно также получать при помощи способов перекрестного сшивания, известных в данной области (например, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).

[0149] В еще одном предпочтительном варианте осуществления, МАТ к FLT3 по изобретению представляет собой антитело, содержащее тяжелые и легкие цепи антитела, обозначенного CHv62.21. Тяжелая цепь CHv62.21 состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, и легкая цепь CHv62.21 состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO: 10. Их последовательность представлена на фигуре 2A и/или 2B и фигуре 3A и/или 3B. В предпочтительном варианте осуществления CHv62.21 модифицировано неприродной аминокислотой ("nnAA") и конъюгировано с цитотоксическим средством. В одном из вариантов осуществления nnAA представляет собой pAF. В предпочтительном варианте осуществления цитотоксическое средство специфически конъюгировано к nnAA.

[0150] В еще одном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению произведено способом производства антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включающим культивирование клетки-хозяина, которое позволяет экспрессироваться антителу или антигенсвязывающему фрагменту, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из следующих клеток-хозяев от (a) до (c):

(a) клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 9, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10;

(b) клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 9, и экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10; и

(c) клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 9, и клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10.

[0151] В еще одном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению произведено способом производства антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включающим культивирование клетки-хозяина, которое позволяет экспрессироваться антителу или антигенсвязывающему фрагменту, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из следующих клеток-хозяев от (a) до (c):

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 9, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 9, и экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 9, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10.

[0152] Клетки китайского хомяка (CHO), продуцирующие антитело, обозначенное CHv62.21, были отправлены (через Federal Express) в американскую коллекцию типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 09 декабря 2014 года, и им присвоен номер доступа PTA-121831.

[0153] Альтернативно или дополнительно, в другом варианте осуществления изобретения МАТ, которое связывается с FLT3, в этом случае, МАТ CHv62.21 может подвергаться посттрансляционным модификациям, известным в данной области. Примеры посттрансляционных модификаций в качестве неограничивающих примеров включают химические модификации, такие как дисульфидные связи, олигосахариды, образование N-концевого пироглутамината, процессинг C-концевого лизина, деамидирование, изомеризацию, окисление, гликирование, расщепление пептидной связи, необратимая перекрестная сшивка, укорочение и другие, известные в данной области. См., Liu, et. ah, Heterogeneity of monoclonal antibodies, J. Pharma. Sci. vol. 97, no. 7, pp. 2426-2447 (июль 2008 года). Другие типы модификаций включают нековалентное взаимодействие, конформационную гетерогенность и агрегацию (там же).

[0154] В дополнительном варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит циклизацию глутамината в остатке 1 N-конца тяжелой цепи в пироглутаминат. Специалисту в данной области будет понятно и ясно, что такая циклизация происходит спонтанно. См., Dick, et al., Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in of monoclonal antibodies using Model Peptides, Biotechnology и Bioengineering, vol. 97, no. 3, pp 544-553 (June 15, 2007).

[0155] Дополнительно или альтернативно, аминокислоты МАТ CHv62.21 могут подвергаться дополнительным посттрансляционным модификациям, включая в качестве неограничивающих примеров, деамидирование, изомеризацию, гликирование и/или окисление. Полипептиды по изобретению или их фрагменты могут подвергаться дополнительным посттрансляционным модификациям, включая гликозилирование, например, N-связанных или O-связанных участков гликозилирования, которые хорошо известны в данной области. Как описано ранее, можно производить изменения в аминокислотной последовательности полипептида или условиях способа (таких как изменения в культуре, очистка, и/или условия хранения) для исключения или сведении к минимуму таких изменений, или для облегчения их в таких обстоятельствах, когда такая обработка является выгодной. Кроме того, такие препараты могут содержать полипептид, которые имеют варьирующие уровни более чем одного типа модификаций, связанных с процессингом, например, у полипептида могут быть удалены несколько, большая часть или по существу все C-концевые лизины и/или несколько, большая часть или по существу все N-концевые аминокислоты превращены в пироглутаминовую кислоту (например, полипептиды, показанные на фигуре 2A и/или 2B или фигуре 3A и/или 3B, или в консенсусной последовательности или антигенсвязывающих фрагментах). Условия процесса, такие как различный состав буферов и температура, могут оказывать достоверное воздействие на степень таких модификаций.

[0156] В дополнительном варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит укорочение по C-концевому лизину в остатке 453 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 9.

[0157] В дополнительном варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит добавление гликозилирования по аспарагину в остатке 303 тяжелой цепи, включая в качестве неограничивающих примеров, G0(асиало-, агалакто, афукозилированный двухантеннарный N-гликан составного типа); G0F (асиало-, агалакто- двухантеннарный N-гликан составного типа с коровой фукозой); Манноза-5 (N-связанная олигоманноза-5); GIF (асиало-, моногалакто, двухантеннарный N-гликан составного типа с коровой фукозой); G2 (асиало-, бигалакто-, афукозилированный двухантеннарный N-гликан составного типа); G2F (асиало-, бигалакто-, двухантеннарный N-гликан составного типа с коровой фукозой); A1 (моносиалированный, двухантеннарный N-связанный олигосахарид, 5-ацетилнейраминовая кислота); и/или A2 (дисиалированный, двухантеннарный N-связанный олигосахарид5-ацетилнейраминовая кислота).

[0158] Дополнительно или альтернативно в другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит добавление гликирования по одному или нескольким остаткам серина легкой цепи. Как правило, гликирование происходит из-за неферментативной реакции между восстанавливающими сахарами и N-концевым первичным амином или аминовой группой боковых цепей лизина. Специалисту в данной области будет понятно и ясно, что гликирование может маскировать положительный заряд на N-концевой первичной аминокислотной группе или боковой цепи остатков лизина, чо будет делать антитело более кислым.

[0159] Аминокислотную последовательность полипептидов по изобретению можно проверять любыми способами, известными в данной области (например, масс-спектрометрией), и она может быть идентична последовательностям, описываемым в настоящем документе (см., фигуру 2A и/или 2B и фигуру 3A и/или 3B) или может отличаться от этих последовательностей по одному или нескольким аминокислотным остаткам в результате процессинга с посттрансляционными модификациями. В качестве неограничивающего примера, у всех или части по существу гомогенных полипептидов, может быть удалена C-концевая аминокислота или у легкой цепи или тяжелой цепи путем протеолитической обработки или другой обработки, которая происходит в процессе культивирования. Аналогично, могут отсутствовать N-концевые аминокислоты, например, могут отсутствовать одна (1), две (2), три (3), четыре (4), или пять (5) N-концевых аминокислот.

[0160] В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи МАТ CHv62.21 выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту.

[0161] В другом варианте осуществления тяжелая цепь МАТ CHv62.21 выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где C-концевой остаток 453 (K) удален, и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, и C-концевой остаток 453 (K) удален.

[0162] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой смесь рекомбинантно произведенных белков, полученных путем экспрессии в клетке-хозяине, где вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 9 и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту.

[0163] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой смесь рекомбинантно произведенных белков, полученных путем экспрессии в клетке-хозяине, где тяжелая цепь антитела выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где C-концевой остаток 453 (K) удален, и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 9, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту и C-концевой остаток 453 (K) удален.

[0164] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 9, где 1E модифицирован до пироглутамината, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0165] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0166] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 9, где 1E модифицирован до пироглутамината, и C-концевой остаток 453K удален, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0167] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21 содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 9, где C-концевой остаток 453K удален, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0168] В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения МАТ к FLT3 по изобретению, и конкретно, МАТ, обозначенное CHv62.21, модифицировано неприродной аминокислотой ("nnAA") в тяжелой цепи. В предпочтительном варианте осуществления амбер кодон расположен в аминокислотном положении 124 SEQ ID NO: 11 для вставки nnAA, обозначенной пара-ацетилфенилаланин (фигура 3C). Модифицированное CHv62.21 в рамках настоящего изобретения обозначают CHv62.21pAF.

[0169] Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения CHv62.21pAF включает следующее:

[0170] Вариабельная область тяжелой цепи состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 108 (R) SEQ ID NO: 10. CDR 1-3 (по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи состоят из аминокислотной последовательности в диапазоне от 31-35, от 50-65, и от 95-102 SEQ ID NO: 11, соответственно, и CDR 1-3 (по Kabat или Chothia) вариабельной области легкой цепи состоят из аминокислотной последовательности в диапазоне от 24-34, 50-56, и 89-97 SEQ ID NO: 10 соответственно (см. фигуру 3B, фигуру 3C и таблицу V).

[0171] Тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11 с nnAA пара-ацетилфенилаланином, вставленной по остатку 124 SEQ ID NO: 11, и легкая цепь CHv62.21 состоит из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO: 10. Последовательности этих цепей изложены на фигуре 2B и/или 2C и фигуре 3B и/или 3C. В предпочтительном варианте осуществления CHv62.21pAF конъюгирован с цитотоксическим средством.

[0172] В еще одном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению произведено способом для производства антитела или антигенсвязывающего фрагмента, включающим культивирование клетки-хозяина с возможностью экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из следующих клеток-хозяев от (a) до (c):

(a) клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 11, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10;

(b) клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 11, и экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10; и

(c) клетка-хозяин трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S в SEQ ID NO: 11, клетка-хозяин, трансфицированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R в SEQ ID NO: 10.

[00100] В еще одном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению произведено способом для производства антитела, включающим культивирование клетки-хозяина с возможностью экспрессии антитела, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из следующих клеток-хозяев от (a) до (c):

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10; и

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10.

[0173] В еще одном варианте осуществления МАТ к FLT3 по изобретению произведено способом для производства антитела, включающим культивирование клетки-хозяина с возможностью экспрессии антитела, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из следующих клеток-хозяев от (a) до (d):

(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10;

(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10;

(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453К в SEQ ID NO: 11, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, который содержит полинуклеотид, включающий последовательность оснований, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 452G SEQ ID NO: 11, где 1E модифицирован до пироглутамината, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214С в SEQ ID NO: 10.

[0174] В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи МАТ CHv62.21pAF выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 11 и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту.

[0175] В другом варианте осуществления тяжелая цепь МАТ CHv62.21pAF выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где C-концевой остаток 453 (K) удален, и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, и C-концевой остаток 453 (K) удален.

[0176] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой смесь рекомбинантно произведенных белков, полученных путем экспрессии в клетке-хозяине, где вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 11 и аминокислотной последовательности от остатка 1 (E) до остатка 123 (S) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту.

[0177] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF представляет собой смесь рекомбинантно произведенных белков, полученных путем экспрессии в клетке-хозяине, где тяжелая цепь выбрана из группы, состоящей из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где C-концевой остаток 453 (K) удален, и аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO: 11, где N-концевой остаток 1 (E) превращен в пироглутаминовую кислоту, и C-концевой остаток 453 (K) удален.

[0178] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 11, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0179] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 11, где 1E модифицирован до пироглутамината, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0180] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 11, где 1E модифицирован до пироглутамината и C-концевой остаток 453K удален, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0181] В другом варианте осуществления МАТ CHv62.21pAF содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO: 11, где C-концевой остаток 453K удален, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO: 10.

[0182] Клетки китайского хомяка (CHO), продуцирующие антитело, обозначенное CHv62.21pAF, отправлены (посредством Federal Express) в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 09 декабря 2014 года, и ему присвоен номер доступа PTA-121836.

III.) Конъюгаты антитело-лекарственное средство в общих чертах

[0183] В другом аспекте изобретение относится к конъюгатам антитела с лекарственным средством (ADC), которые содержат антитело, конъюгированное с терапевтическим средством. Терапевтическое средство может быть цитотоксическим средством, цитостатическим веществом, химиотерапевтическим средством, лекарственным средством, средством, ингибирующим рост, токсином (например, ферментативно активным токсином бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагментами), или радиоактивным изотопом (т.е., радиоконъюгатом). В другом аспекте изобретение дополнительно относится к способам с использованием ADC. В одном из аспектов ADC содержит любое из вышеописанных МАТ к FLT3, ковалентно присоединенное или присоединенное через оксимовую связь к цитотоксическому средству или детектируемому средству.

[0184] Применение конъюгатов антитела с лекарственным средством для местной доставки цитотоксических или цитостатических веществ, т.е. лекарственных средств для уничтожения или ингибирования опухолевых клеток при лечении злокачественной опухоли (Syrigos и Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz и Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; патент США 4975278) позволяет направленно доставлять компонент лекарственного средства к опухолям, и осуществлять его внутриклеточное накопление, при этом системное введение этих неконъюгированных лекарственных веществ может приводить к неприемлемым уровням токсичности для нормальных клеток, и также как и опухолевые клетки, их можно уничтожить (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody carriers Of Cytotoxic agents In cancer Therapy: A Review" in Monoclonal antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). В сязи с этим пытались добиться максимальной эффективности с минимальной токсичностью. Были описаны и поликлональные антитела, и моноклональные антитела, полезные для этих стратегий (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Лекарственные средства, применяемые в этих способах включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат и виндезин (Rowland et al., (1986) выше). Токсины, применяемые в конъюгатах антитело-токсин включают бактериальные токсины, такие как дифтерийный токсин, растительные токсины, такие как рицин, низкомолекулярные токсины, такие как гелданамицин (Mandler et al. (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), майтанзиноиды (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) и калихимицин (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Токсины могут реализовывать свои цитотоксические и цитостатические воздействия при помощи механизмов, включающих связывание с тубулином, связывание с ДНК или ингибирование топоизомеразы. Некоторые цитотоксические лекарственные средства проявляют тенденцию к неактивности или к снижению активности, когда они конъюгированы с большими антителами или лигандами белковых рецепторов.

[0185] Примерами конъюгатов антитела с лекарственным средством являются ЗЕВАЛИН® (ибритумомаб тиуксетан, Biogen/Idec), который представляет собой конъюгат антитело-радиоактивный, состоящий из моноклонального антитела каппа IgG1 мыши, направленного против антигена CD20, находящегося на поверхности нормальных и злокачественных B-лимфоцитов, и радиоактивного изотопа ¹¹¹In или ⁹⁰Y, связанного путем линкера-хелатора из тиомочевины (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69).

[0186] Также, в 2000 году для лечения острого миелолейкоза путем инъекции одобрен МИЛОТАРГ™ (гемтузумаб озогамицин, Wyeth Pharmaceuticals), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huCD33, связанного с калихимицином (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; патенты США №№ 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001).

[0187] Кроме того, ранее оценены антитела к FLT3 человека в качестве потенциальных терапевтических средств для миелолейкоза. Например, IMC-EB 10, антитело против FLT3, было разработано Imclone. Это антитело представляет собой блокатор лиганда, который ингибирует FLT3-опосредованную активацию ниже расположенных киназ (MAPK, Akt и Stat5). Антитело также ингибирует пролиферацию лейкозных клеток in vitro; и известно, что оно действует через антителозависимую клеточную токсичность (ADCC). EB10 вызывало длительное выживание лейкозных ксенотрансплантатов при лечении им по отдельности и в комбинации с метотрексатом (см. WO2009/155015 и US2011/0008355). Это антитело также оценивали в клинических испытаниях у людей (NCT00887926), но испытания были прекращены из-за отсутствия эффективности. Также см. EB10, конъгированное с MMAF, было разработано ImClone (см. Proc Amer Assoc Cancer Res, 46 Volume 2005 года).

[0188] В данной области известно, что антитела-агонисты, разработанные против FLT3, могут усиливать пролиферацию и/ дифференцировку недифференцированных гемопоэтических клеток (см. WO 95/27062).

[0189] В дополнение к биологическим было разработано множество низкомолекулярных ингибиторов и исследовано в клинических испытаниях у людей. Большинство из этих ингибиторов направлено к FLT3 и другим киназам и, таким образом, они не являются специфическими только в отношении киназы FLT3. В большинстве случаев эти ингибиторы направлены к FLT3-ITD и возможно к FLT-TKD. Таким образом, доступных ингибиторов, направленных только к FLT3 дикого типа нет. Низкомолекулярные ингибиторы, о которых известно, что они вошли в клинические испытания у людей, представляют собой:

[0190] Мидостаурин или PKC-412 (Novartis), квизартиниб или AC220 (Ambit), нексавар (Onyx/Bayer), AZD1152 или барасертиб (Astrazeneca), кренолиниб (Arog), плексикон (Daichii Sankyo) и ASP2215 (Astellas). Как правило, большинство из клинических испытаний у людей все еще продолжаются. В большинстве случаев наблюдали побочные эффекты в виде тромбоцитопении, нейтропении, анемии.

[0191] Кроме того, в испытания фазы II перешел мертанзин кантузумаба (Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из антитела huC242, связанного через дисульфидный линкер SPP с лекарственной группой майтанзиноида, DM1, для лечения злокачественных опухолей, которые экспрессируют CanAg, таких как опухоли толстого кишечника, поджелудочной железы, желудка и другие.

[0192] Кроме того, в разработке находится MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologies, Immunogen, Inc.), конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из моноклонального антитела к специфическому мембранному антигену (PSMA) предстательной железы, связанного с лекарственной группой майтанзиноида, DM1, для потенциального лечения опухолей предстательной железы.

[0193] Наконец, ауристатиновые пептиды, ауристатин E (AE) и монометилауристатин (MMAE), синтетические аналоги доластатина, были конъюгированы с химерными моноклональными антителами cBR96 (специфичными к антигену Льюиса Y на карциномах) и cAC10 (специфичное к CD30 на гемобластозах) (Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784).

[0194] МАТ к CD30, конъюгированное с MMAE, сейчас коммерчески доступно как ADCETRIS (Seattle Genetics, Bothell, WA). ADCETRIS (ведотин брентуксимаба) представляет собой направленный на CD30 конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из трех компонентов: 1) химерного антитела IgG1, обозначенного cAC10, специфичного к человеческому CD30, 2) вещества, разрушающего микротрубочки MMAE, и 3) линкера, расщепляемого протеазой, который ковалентно присоединяет MMAE к cAC10. См. инструкцию по применению препарата ADCENTRIS.

[0195] Кроме того, в настоящем документе описаны терапевтические средства, которые включают в качестве неограничивающих примеров химиотерапевтические средства, подходящие для создания ADC. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерии, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica Charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria Officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины. См., например, WO 93/21232, опубликованный 28 октября 1993 года. Различные радионуклиды доступны для производства радиоконъюгированных антител. Примеры включают ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y и ¹⁸⁶Re. Конъюгаты антитела и цитотоксического средства производят с использованием различных бифункциональных белок-связывающих веществ, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол) пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональных производных имидоэфиров таких как диметил адипимидат HCl), активных сложных эфиров (таких как дисукцинимидил суберат), альдегидов (таких как глутаральдегид), бис-азидо соединений (таких как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производных бис-диазония (таких как бис-(p-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианатов (таких как толуол 2,6-диизоцианат), и бис-активных соединений фтора (таких как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицина можно получать, как описано в Vitetta et al. (1987) Science, 238: 1098. 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилен триаминпентауксусная кислота (MX-DTPA), меченая углеродом-14, представляет собой пример хелатирующего средства для конъюгации радионуклида с антителом (WO94/11026).

[0196] Конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихимицин, майтанзиноиды, доластатины, ауристатины, трихотецен и CC1065, и производных этих токсинов, которые имеют активность токсина, также рассматриваются в настоящем документе.

III(A). Майтанзиноиды

[0197] Соединения майтанзина, подходящие для использования в качестве лекарственной группы майтанзиноидов, хорошо известны в данной области, и их можно выделять из природных источников в соответствии с известными способами, производить с использованием способов генетической инженерии (см. Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973), или получать майтанзинол и аналоги майтанзинола синтетическим путем в соответствии с известными способами.

[0198] Иллюстративные лекарственные группы майтанзиноидов включают группы с модифицированным ароматическим кольцом, такие как: C-19-дехлор (US 4256746) (полученная путем восстановления ансамитоцина P2 при помощи литий алюмогидрида); C-20-гидрокси (или C-20-деметил) +/-C-19-дехлор (патенты США №№ 4361650 и 4307016) (полученная путем деметилирования с использованием Streptomyces или Actinomyces или дехлорирования с использованием литий алюмогидрида (LAH)); и C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США № 4294757) (полученная путем ацилирования с использованием ацилхлоридов), и группы с модификациями в других положениях.

[0199] Иллюстративные лекарственные группы майтанзиноидов также включают группы с такими модификациями как: C-9-SH (US 4424219) (полученная путем реакции майтанзинола с H₂S или P₂S₅); C-14-алкоксиметил(деметокси/CH₂OR)(US 4331598); C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CH₂OH или CH₂OAc) (US 4450254) (полученная из Nocardia); C-15-гидрокси/ацилокси (US 4364866) (полученная путем конверсии майтанзинол при помощи Streptomyces); C-15-метокси (патенты США №№ 4313946 и 4315929) (выделенная из Trewia nudlflora); C-18-N-деметил (патенты США №№ 4362663 и 4322348) (полученная путем деметилирования майтанзинола при помощи Streptomyces); и 4,5-дезокси (US 4371533) (полученная путем восстановления майтанзинола при помощи трихлорида титана/LAH).

[0200] ADC, содержащие майтанзиноиды, способы их получения и их терапевтическое применение описаны, например, в патентах США №№ 5208020; 5416064; 6441163 и европейском патенте EP 0425235B1, описания которых явно включены в настоящий документ в качестве ссылки. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) описали ADC, содержащие майтанзиноид, обозначенный DM1, связанный с моноклональным антителом C242, направленным против колоректального рака человека. Было обнаружено, что конъюгат проявляет высокую токсичность по отношению к культивируемым клеткам рака толстого кишечника и показывает противоопухолевую активность в анализе роста опухоли in vivo. Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) описывают ADC, в которых майтанзиноид был конъюгирован через дисульфидный линкер с антителом мыши A7, которое связывается с антигеном линии клеток рака толстого кишечника человека, или с другим мышиным моноклональным антителом TA.1, которое связывается с онкогеном HER-2/neu. Цитотоксичность конъюгата TA.1-майтанзиноид тестировали in vitro на линии злокачественных клеток молочной железы человека SK-BR-3, которая экспрессирует 3×10⁵ поверхностных антигенов HER-2 на клетку. Конъюгат с лекарственным средством достиг степени цитотоксичности, сходной со свободным майтанзиноидом, которая может увеличиваться с увеличением числа молекул майтанзиноида на молекулу антитела. Конъюгат A7-майтанзиноид показал низкую системную цитотоксичность у мышей.

III(B). Ауристатины и доластатины

[0201] В определенных вариантах осуществления ADC содержит антитело по изобретению, конъюгированное с доластатинами или пептидными аналогами и производными доластатинов, ауристатинами (патенты США №№ 5635483; 5780588). Было показано, что доластатины и ауристатины препятствуют динамике микротрубочек, гидролизу ГТФ и делению ядра и клеточному делению (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), и имеют противораковую (US 5663149) и противогрибковую активность (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Лекарственную группу доластатинов или ауристатинов можно присоединить к антителу через N(амино)-конец или C(карбокси) конец пептидной лекарственной группы (WO 02/088172).

[0202] Примеры вариантов осуществления с ауристатином включают связанные по N-концу монометилауристатиновые лекарственные группы DE и DF, описанные в "Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, представленной 28 марта 2004 года, и описанные в патентной публикации США No. 2005/0238649, содержание которой полностью явно включено в качестве ссылки.

[0203] Как правило, лекарственные группы на основе пептидов можно получать путем образования пептидной связи между двумя или более аминокислотами и/или пептидными фрагментами. Такие пептидные связи можно получать, например, способом жидкофазного синтеза (см. E. Schroder и K. Liibke, "Пептиды", volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press), который хорошо известен в области химии пептидов. Лекарственные группы с ауристатином/доластатином можно получать способами из US 5635483; US 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; и Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778- 784.

III(C). Калихимицин

[0204] В других вариантах осуществления ADC содержит антитело по изобретению, конъюгированное с одним или несколькими молекулами калихимицина. Семейства калихимициновых антибиотиков способны к образованию двухцепочечных разрывов ДНК в субпикомолярных концентрациях. Для получения конъюгатов семейства калихимицина, см. патенты США 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (все выданы American Cyanamid Company). Структурные аналоги калихимицина, которые можно использовать, в качестве неограничивающих примеров включают γ₁^I, α₂^I, α₃^I, N-ацетил-γ₁^I, PSAG и θ₁^I (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и указанные выше патенты США для American Cyanamid). Другим противоопухолевым лекарственным средством, с которым может быть конъюгировано антитело, является QFA, который представляет собой антифолат. И калихимицин, и QFA имеют внутриклеточные участки действия и с трудом пересекают плазматическую мембрану. Таким образом, клеточный захват этих веществ путем интернализации, опосредованной антителом, значительно усиливает их цитотоксические эффекты.

III(D). Другие цитотоксические средства

[0205] Другие противоопухолевые средства, которые можно конъюгировать с антителами по изобретению, включают BCNU, стрептозоицин, винкристин и 5-фторурацил, семейство веществ, совместно известных как комплекс LL-E33288, описанное в патентах США 5053394, 5770710, а также эсперамицины (патент США 5877296).

[0206] Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь А дифтерии, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь A рицина, цепь A абрина, цепь A модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, и трихотецины. См., например, WO 93/21232 (опубликованную 28 октября 1993 года).

[0207] Настоящее изобретение дополнительно относится к ADC, образованному между антителом и соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеазой или ДНК-эндонуклеазой, такой как дезоксирибонуклеаза; ДНКаза).

[0208] Для селективного разрушения опухоли, антитело может включать высокорадиоактивный атом. Различные радионуклиды доступны для производства радиоконъюгированных антител. Примеры включают At²¹¹, ¹³¹I, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если конъюгат используют для детекции, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Tc⁹⁹ или I¹²³, или спиновую метку для визуализации путем ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) (также известной как визуализация путем магнитного резонанса, mri), такую как опять йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

[0209] Радио- или другие метки можно вводить в конъюгат известными способами. Например, пептид может быть синтезирован биологическим путем или может быть синтезирован при помощи химического синтеза аминокислот с использованием подходящих аминокислот предшественников, содержащих, например, фтор-19 вместо водорода. Метки, такие как Tc⁹⁹ или I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ и In¹¹¹ можно присоединять через остаток цистеина к пептиду. Иттрий-90 можно присоединять через остаток лизина. Можно использовать способ IODOGEN (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) для вставки йода-123. "Monoclonal antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) подробно описывает другие способы.

IV.) Соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство, которые связываются с FLT3

[0210] Настоящее изобретение относится, в числе прочего, к соединениям конъюгатов антитело-лекарственное средство для направленной доставки терапевтических средств. Авторы изобретения сделали открытие, что соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство имеют мощную цитотоксическую и/или цитостатическую активность против клеток, экспрессирующих FLT3.

[0211] Такие конъюгаты антитело-лекарственное средство не блокируют связывание FL с FLT3, так что FL может передавать сигнал через FLT3, даже когда связывается антитело. Такие антитела демонстрируют цитотоксическую активность, которая не снижается в присутствии FL (где конъюгат антитело к FLT3/ лекарственное средство, который не блокирует связывание FL с FLT3, демонстрирует сниженную цитотоксичность в присутствии FL). В предпочтительных вариантах осуществления конъюгаты с лекарственным средством против FLT3, описываемые в настоящем документе, по существу не ингибируют связывание FL с FLT3.

[0212] Соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство содержат группу антитела, ковалентно связанную, по меньшей мере, с одной группой лекарственного средства. Группы лекарственного средства могут быть ковалентно связаны непосредственно с группой антитела или через линкерную группу (-LU-).

[0213] В определенных вариантах осуществления соединение конъюгата антитела с лекарственным средством имеет следующую формулу:

L-(LU-D)_p (I)

или ее фармацевтически приемлемую соль или сольват; где:

L представляет собой группу антитела, например, МАТ к FLT3 по настоящему изобретению, такое как CHv62.21 или CHv62.21pAF, и

(LU-D) представляет собой компонент линкерная группа-группа лекарственного средства, где:

LU- представляет собой линкерную группу, и

-D представляет собой группу лекарственного средства с цитостатической или цитотоксической активностью против клетки-мишени; и

p находится в диапазоне от 1 до 20.

[0214] В определенных вариантах осуществления p находится в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В определенных вариантах осуществления p находится в диапазоне от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления p представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В определенных вариантах осуществления p представляет собой 2 или 4. В определенных вариантах осуществления p представляет собой целое число. В других вариантах осуществления p измеряют в виде среднего соотношения лекарственного средства к антителу, и оно может представлять собой целое или дробное число.

[0215] В определенных вариантах осуществления соединение конъюгата антитела с лекарственным средством имеет следующую формулу:

L-(A_a-W_w-Y_y-D)_p (II)

или ее фармацевтически приемлемую соль или сольват, где:

L представляет собой группу антитела, например, МАТ к FLT3, такое как CHv62.21 или CHv62.21pAF; и -A_a-W_w-Y_y- представляет собой линкерную группу (LU), где:

-A- представляет собой растягивающей группой,

a представляет собой 0 или 1 или 2 или 3,

каждая -W- независимо представляет собой аминокислотную группу,

w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12,

-Y- представляет собой саморасщепляющуюся спейсерную группу,

y представляет собой 0, 1 или 2;

-D представляет собой группы лекарственного средства с цитостатической или цитотоксической активностью против клетки-мишени; и

p представляет собой целое число от 1 до 20.

[0216] В определенных вариантах осуществления a представляет собой 0 или 1, w представляет собой 0 или 1, и y представляет собой 0, 1 или 2. В определенных вариантах осуществления a представляет собой 0 или 1, w представляет собой 0 или 1, и y представляет собой 0 или 1. В определенных вариантах осуществления p находится в диапазоне от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В определенных вариантах осуществления p находится в диапазоне от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6, от 2 до 5, от 2 до 4 или от 2 до 3. В других вариантах осуществления p представляет собой 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В определенных вариантах осуществления p представляет собой 2 или 4. В определенных вариантах осуществления, когда w не равно нулю, y представляет собой 1 или 2. В определенных вариантах осуществления, когда w составляет от 1 до 12, y представляет собой 1 или 2. В определенных вариантах осуществления w составляет от 2 до 12, и y представляет собой 1 или 2. В определенных вариантах осуществления a представляет собой 1, и w и y представляют собой 0.

[0217] Для композиций, которые содержат множество антител, содержание лекарственного средства представлено p, средним числом молекул лекарственного средства на антитело. Содержание лекарственного средства может находится в диапазоне от 1 до 20 лекарственных средств (D) на антитело. Среднее число лекарственных средств на антитело в препарате, полученном при реакциях конъюгации, можно характеризовать общепринятыми способами, такими как масс-спектроскопия, анализ ELISA и ВЭЖХ. Можно также определять количественное распределение антитело-лекарственное средство в конъюгатах относительно p. В некоторых случаях, отделение, очистку и характеристику гомогенных конъюгатов антитело-лекарственное средство, где p имеет определенную величину, от конъюгатов антитело-лекарственное средство с другим содержанием лекарственных средств можно производить такими способами, как обратно-фазовая ВЭЖХ или электрофорез. В иллюстративных вариантах осуществления p составляет от 2 до 8.

[0218] Получение соединений конъюгатов антитело-лекарственное средство можно проводить любым способом, известным специалисту в данной области. В кратком изложении, Соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство содержат МАТ к FLT3 по изобретению в качестве группы антитела, лекарственное средство и необязательно линкер, который соединяет лекарственное средство и связывающее средство. В предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой МАТ к FLT3, которое содержит вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела, обозначенного CHv62.21 и описанного выше. В более предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой МАТ к FLT3, которое содержит тяжелые и легкие цепи антитела, обозначенного CHv62.21pAF и описанного выше (см., формулу (I)).

[0219] Доступен ряд различных реакций для ковалентного присоединения лекарственных средств и/или линкеров к связывающим средствам. Это часто достигается реакцией аминокислотных остатков связывающего средства, например, молекулы антитела, включая аминогруппы лизина, свободные группы карбоновых кислот глутаминовой и аспарагиновой кислоты, сульфгидрильные группы цистеина и различные группы ароматических аминокислот. Один из наиболее общепринятых неспецифических способов ковалентного присоединения представляет собой карбодиимидную реакцию для связывания карбокси (или амино) групп соединений с амино (или карбокси) группами антитела. Кроме того, для связи аминогрупп соединений с аминогруппами молекулы антитела использовали бифункциональные вещества, такие как диальдегиды или имидоэфиры. Также возможно присоединять лекарственные средства к связывающим средствам путем реакции с основанием Шиффа. Этот способ включает йоднокислое окисление лекарственного средства, которое содержит гликоль или гидроксигруппы, таким образом, образуется альдегид, который затем реагирует со связывающим средством. Присоединение происходит посредством образования основания Шиффа с аминогруппами связывающего средства. Изотиоцианаты также можно использовать в качестве связывающих веществ для ковалентного присоединения лекарственных средств к связывающим средствам. Другие способы известны специалисту в данной области и находятся в объеме настоящего изобретения.

[0220] В определенных вариантах осуществления промежуточное соединение, которое является предшественником линкера, реагирует с лекарственным средством при подходящих условиях. В определенных вариантах осуществления используют реакционноспособные группы на лекарственном средстве и/или промежуточном соединении. Продукт реакции между лекарственным средством и промежуточным соединением, или дериватизированное лекарственное средство затем реагирует с МАТ к FLT3 при подходящих условиях.

V.) Линкерные группы

[0221] Как правило, соединения конъюгатов антитело-лекарственное средство содержат линкерную группу между группой лекарственного средства и группой антитела. В определенных вариантах осуществления линкер расщепляется при внутриклеточных условиях, таким образом, что расщепление линкера высвобождает группу лекарственного средства из антитела во внутриклеточном окружении. В других вариантах осуществления линкерная группа не расщепляется и лекарственное средство высвобождается, например, при разрушении антитела.

[0222] В определенных вариантах осуществления линкер расщепляется расщепляющим веществом, которое присутствует во внутриклеточном окружении (например, внутри лизосомы или эндосомы или кавеолы). Линкер может быть, например, пептидным линкером, который расщепляется внутриклеточной пептидазой или протеазным ферментом, включая в качестве неограничивающих примеров, лизосомальную или эндосомальную протеазу. Линкер также можно расщеплять расщепляющим веществом, которое присутствует во внеклеточном окружении (например, в непосредственной близости к клеточной мембране или в тканевом пространстве). Линкер может быть, например, пептидным линкером, который расщепляется внеклеточной пептидазой или протеазным ферментом, включая в качестве неограничивающих примеров, ферменты катепсинового семейства или матриксные металлопротеиназы). В определенных вариантах осуществления пептидный линкер имеет, по меньшей мере, два аминокислоты в длину или, по меньшей мере, три аминокислоты в длину. В предпочтительном варианте осуществления пептидный линкер содержит, по меньшей мере, одну амино-окси кислотную группу (Ambrx, Inc., La Jolla, CA). Расщепляющие вещества могут включать вещества, известные в данной области (см., например, Dubowchik и Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 и патент США №: 6214345). Одним из преимуществ использования внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического средства является то, что вещество, как правило, ослаблено, когда конъюгировано, и стабильность конъюгатов в сыворотке, как правило, высокая.

[0223] В других вариантах осуществления расщепляемый линкер является pH-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях pH. Как правило, pH-чувствительный линкер гидролизуется при кислых условиях. Например, можно использовать кислото-неустойчивый линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, оксим, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитный амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь, или т.п.), (см., например, патенты США №№ 5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik и Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661). Такие линкеры относительно стабильны при нейтральных условиях pH, таких как, условия в крови, но нестабильны или менее стабильны при pH ниже 5,5 или 5,0, приблизительной pH лизосомы. В определенных вариантах осуществления гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому средству через ацилгидразоновую связь (см., например, патент США № 5622929).

[0224] В других вариантах осуществления линкер расщепляется при восстановительных условиях, известных в данной области. (см., например, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Также см. патент США № 4880935). Линкер также может расщепляться при восстановительных условиях внутриклеточно (или внеклеточно). Например, в предпочтительном варианте осуществления конкретная линкерная связь N-О может быть формально восстановлена и разрушена, что в результате приводит к расщеплению линкера.

[0225] В других вариантах осуществления линкерная группа не расщепляется и лекарственное средство высвобождается при разрушении антитела. (См. публикацию PCT № WO2012/166560 (Ambrx, Inc.), полностью включенную в настоящий документ в качестве ссылки, и для всех целей).

[0226] В других невзаимоисключающих вариантах осуществления, линкер способствует клеточной интернализации, как известно в данной области.

[0227] Множество иллюстративных линкеров, которые можно использовать с настоящими композициями и способами, описано в WO 2004/010957, публикации США No. 2006/0074008, публикации США No. 20050238649, и публикации США No. 2006/0024317 (каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки полностью и для всех целей).

[0228] В предпочтительном варианте осуществления LU по настоящему изобретению обозначена AGL и общеизвестна как 2-(аминоокси)уксусная кислота или C₂H₅NO₃.

VI.) Удлиняющая группа

[0229] Удлиняющая группа (A), если присутствует, способна связывать группу антитела с аминокислотной группой (-W-), если присутствует, со спейсерной группой (-Y-), если присутствует; или с группой лекарственного средства(-D). Подходящие функциональные группы, которые могут присутствовать на МАТ к FLT3 (например, CHv62.21 или CHv62.21pAF), или природным образом или путем химических манипуляций, в качестве неограничивающих примеров включают кетогруппу, альдегид, сульфгидрил, аминогруппу, гидроксил, аномерную гидроксильную группу углевода, и карбоксил. Подходящие функциональные группы представляют собой кетогруппу, альдегид, сульфгидрил и аминогруппу. В одном из примеров кетогруппа находится на неприродной аминокислоте (nnAA), введенной в МАТ по изобретению. В дополнительном примере, альдегидная группа находится на nnAA, введенной в МАТ по изобретению. В другом примере, сульфгидрильные группы можно получать путем восстановления внутримолекулярных дисульфидных связей МАТ к FLT3. В другом варианте осуществления сульфгидрильные группы можно получать при реакции аминогруппы of лизина на МАТ к FLT3 с 2-иминотиоланом (реагентом Траута) или с другими реагентами, образующими сульфгидрил. В определенных вариантах осуществления МАТ к FLT3 является рекомбинантным антителом и сконструировано с содержанием одного или нескольких лизинов. В других определенных вариантах осуществления рекомбинантное МАТ к FLT3 сконструировано с содержанием дополнительных сульфгидрильных групп, например, дополнительных цистеинов.

[0230] В одном из вариантов осуществления удлиняющая группа формирует оксимную связь с кетогруппой группы антитела. Кетогруппа присутствует на nnAA, введенной в МАТ.

[0231] Следует понимать по всем иллюстративным вариантам осуществления, что даже если не обозначено явно, к антителу можно присоединять от 1 до 20 молекул лекарственного средства (p=1-20).

[0232] Аминокислотная группа

[0233] Аминокислотная группа (-W-), если присутствует, связывает удлиняющую группу со спейсерной группой, если спейсерная группа присутствует, связывает удлиняющую группу с группой лекарственного средства, если спейсерная группа отсутствует, и связывает группу антитела с группой лекарственного средства, если удлиняющая группа и спейсерная группа отсутствуют.

[0234] Ww- может представлять собой, например, монопептид, дипептид, трипептид, тетрапептид, пентапептид, гексапептид, гептапептид, октапептид, нонапептид, декапептид, ундекапептид или додекапептид. Каждая -W-группа независимо имеет формулу, изложенную ниже в квадратных скобках, и w представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 12:

[0235] или

[0236] где R19 в качестве неограничивающих примеров включает водород, метил, изопропил, изобутил, втор-бутил, бензил, п-гидроксибензил, -CH₂ОH, -CH(OH)CH₃, -CH₂CH₂SCH₃, -CH₂CONH₂, - CH₂COOH, -CH₂CH₂CONH₂, -CH₂CH₂COOH, -(CH₂)₃NHC(=NH)NH₂, -(CH₂)₃NH₂, -(CH₂)₃NHCOCH₃, -(CH₂)₃NHCHO, -(CH₂)₄NHC(=NH)NH₂, -(CH₂)₄NH₂, -(CH₂)₄NHCOCH₃, -(CH₂)₄NHCHO, -(CH₂)₃NHCONH₂, -(CH₂)₄NHCONH₂, -CH₂CH₂CH(OH)CH₂NH₂, 2-пиридилметил-, 3-пиридилметил-, 4-пиридилметил-, фенил, циклогексил. Для дополнительной ссылки, см. US2014/0072586 и WO2012/047724, которые полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

[0237] В определенных вариантах осуществления аминокислотная группа может содержать природные аминокислоты. В других вариантах осуществления Аминокислотная группа может содержать неприродные аминокислоты.

[0238] В определенных вариантах осуществления аминокислотную группу можно ферментативно расщеплять одним или несколькими ферментами, включая протеазу, ассоциированную с опухолью, для высвобождения группы лекарственного средства (-D), которая в одном из вариантов осуществления протонируется in vivo после освобождения для получения лекарственного средства (D).

[0239] В одном из аспектов аминокислотная группа является валином-цитруллином (vc или val-cit). В другом аспекте аминокислотная группа является фенилаланином-лизином (т.е. fk). В еще одном аспекте аминокислотная группа является N-метилвалином-цитруллином.

VII.) Спейсерная группа

[0240] Спейсерная группа (-Y-), если присутствует, связывает аминокислотную группу с групой лекарственного средства, когда аминокислотная группа присутствует. Альтернативно, спейсерная группа связывает удлиняющую группу с группой лекарственного средства, когда аминокислотная группа отсутствует. Спейсерная группа также связывает группу лекарственного средства с группой антитела, когда и аминокислотная группа, и удлиняющая группа отсутствуют. Спейсерные группы представляют собой два общих типа: несаморасщепляющиеся или саморасщепляющиеся. Примеры возможных спейсеров по изобретению известны в данной области. См., Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67: 1866-1872 и Nature Biotechnology 21(7):778- 784).

[0241] Другие примеры саморасщепляющихся спейсеров в качестве неограничивающих примеров включают, ароматические соединения, которые в электронном виде аналогичны группе PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подверглись циклизации после гидролиза амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), соответствующим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] циклические системы (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты амиды(Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Удаление аминосодержащих лекарственных средств, которые замещены по α-положению глицина (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) также являются примерами саморасщепляющихся спейсеров.

VIII.) Группа лекарственного средства

[0242] Группа лекарственного средства(D) может быть любым терапевтическим средством. Например, группа лекарственного средства может быть группой, которая является цитотоксическим, цитостатическим или иммуномодуляторным (например, иммуносупрессивным) или химиотерапевтическим средством. D представляет собой группу лекарственного средства (молекулу) с атомом, который может образовывать связь со спейсерной группой (если присутствует), с аминокислотной группой (если присутствует), с удлиняющей группой (если присутствует) или с группой антитела. В определенных вариантах осуществления группа лекарственного средства D имеет атом азота, который может образовывать связь со спейсерной группой (если ее используют). Применяемые в настоящем документе термины "группа лекарственного средства " и "молекула лекарственного средства" являются синонимами и используются взаимозаменяемо.

[0243] Пригодные классы цитотоксических или иммуномодуляторных средств включают, например, антитубулиновые средства, средства, связывающиеся с малой канавкой ДНК, ингибиторы репликации ДНК и алкилирующие средства. В определенных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой ауристатин, такой как ауристатин E (также известный в данной области как производное доластатина-10) или его производное. Другие типичные ауристатины включают AFP, MMAF, и MMAE. Синтез и структура иллюстративных ауристатинов описаны в патентах США №№ 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444; и 4486414, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки полностью и для всех целей.

[0244] В определенных вариантах осуществления группа лекарственного средства представляет собой калихимицин, камптотецин, майтанзиноид или антрациклин. В определенных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой таксан, ингибитор топоизомеразы, алкалоид барвинка, или т.п.

[0245] В определенных типичных вариантах осуществления, подходящие цитотоксические средства включают, например, средства, связывающиеся с малой канавкой ДНК (например, энедины и лекситропсины, соединение CBI; также см. патент США № 6130237), дуокармицины, таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел), пуромицины, и алкалоиды барвинка. Другие цитотоксические средства включают, например, CC-1065, SN-38, топотекан, морфолино-доксорубицин, ризоксин, цианоморфолино-доксорубицин, эхиномицин, комбретастатин, нетропсин, эпотилон A и B, эстрамустин, криптофизины, цематодин, майтанзиноиды, дискодермолид, элеутеробин, и митоксантрон.

[0246] В определенных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой антитубулиновое средство. Примеры антитубулиновых средств включают, ауристатины, таксаны (например, Таксол® (паклитаксел), Таксотер® (доцетаксел)), T67 (Туларик) и алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин, и винорелбин). Другие антитубулиновые средства включают, например, производные баккатина, аналоги таксана (например, эпотилон A и B), нокодазол, колхицин и колцимид, эстрамустин, криптофизины, цематодин, майтанзиноиды, комбретастатины, дискодермолид и элеутеробин.

[0247] В определенных вариантах осуществления цитотоксическое средство представляет собой майтанзиноид, другую группу антитубулиновых средств. Например, в конкретных вариантах осуществления майтанзиноид является майтанзином или DM-1 (Immunogene, Inc.; также см. Chari et al., 1992, Cancer Res. 52: 127-131).

[0248] В определенных вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство представляет собой доластатин. В определенных вариантах осуществления цитотоксическое или цитостатическое средство относится к классу ауристатина.

[0249] В дополнительном варианте осуществления группы лекарственного средства представляют собой новые пептидные аналоги долапролина-долаизолейцина. Таким образом, в настоящем документе предоставлены соединения формулы (I):

где

каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или алкил;

X представляет собой -О-, -NR^Z-, -S- или отсутствует;

где R^Z представляет собой -H или алкил;

R³ представляет собой группу с формулой:

где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, алкил, алкенил, алкинил, -алкил-N₃;

R⁴ представляет собой группу с формулой:

где каждая из R¹⁷ и R¹⁸ независимо представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N, -CО₂H, алкил, алкенил, алкинил, -алкил-OH, -алкил-NH₂, -алкил-SH, -алкил-N₃ или -алкил-CO₂H

R⁵ представляет собой втор-бутил или изобутил;

R⁶ представляет собой -H или алкил;

каждая из R⁷ и R⁸ независимо представляет собой -H, алкил, -CО₂R^a, CONR^bR^c, замещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

где R^a представляет собой -H или алкил;

каждая из R^b и R^c независимо представляет собой H или алкил;

R⁹ представляет собой -H или алкил; или R⁹ вместе с R⁴ и атомами, с которыми они связаны, образуют замещенное или незамещенное гетероциклоалкильное кольцо;

R¹⁰ представляет собой -H или алкил;

R¹¹ представляет собой -H или алкил;

R¹² представляет собой -H или алкил;

R¹³ представляет собой -H или алкил; и

R¹⁴ представляет собой -H, -OH или алкил;

при условии, что когда X отсутствует и каждая из R¹⁵, R¹⁶, R¹⁷ и R¹⁸ представляет собой метил, тогда R⁸ представляет собой незамещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

или их фармацевтически приемлемые соли.

[0250] В определенных вариантах осуществления каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹ и R² независимо представляет собой алкил. В определенных вариантах осуществления обе R¹ и R² представляют собой метил. В определенных вариантах осуществления обе R¹ и R² представляют собой -H.

[0251] В определенных вариантах осуществления X отсутствует. В других вариантах осуществления X представляет собой -О-. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹ и R² независимо представляет собой алкил, а X отсутствует. В определенных вариантах осуществления обе R¹ и R² представляют собой метил, а X отсутствует. В других вариантах осуществления обе R¹ и R² представляют собой -H, а X представляет собой -О-. В определенных вариантах осуществления X представляет собой -NR^Z-, где R^Z представляет собой -H или алкил. В определенных вариантах осуществления R^Z представляет собой -H. В определенных вариантах осуществления X представляет собой R^Z, который представляет собой алкил, например, C_1-6-алкил или метил.

[0252] В определенных вариантах осуществления R³ представляет собой , где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, алкил, алкенил, алкинил, -алкил-OH, -алкил-NH₂, -алкил-SH или -алкил-N₃. В других вариантах осуществления каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, алкил, -(CH₂)_0-6C=CH, -(CH₂)_0-6CH=CH₂, -(CH₂)_0-6OH, -(CH₂)_0-6NH₂, -(CH₂)_0-6SH или -(CH₂)_0-6N₃. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или алкил. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или метил. В определенных вариантах осуществления R¹⁵ представляет собой -OH, а R¹⁶ представляет собой водород. В определенных вариантах осуществления R¹⁵ представляет собой -OH, а R¹⁶ представляет собой метил.

[0253] В определенных вариантах осуществления R³ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R³ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы. В определенных вариантах осуществления группа R³ сама содержит один или несколько хиральных центров, и каждый из этих стереохимических центров независимо находится в конфигурации R или S.

[0254] В определенных вариантах осуществления R⁴ представляет собой , где каждая из R¹⁷ и R¹⁸ независимо представляет собой-H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, -CО₂H, алкил, алкенил, алкинил, -алкил-OH, -алкил-NH₂, -алкил-SH, -алкил-N₃ или -алкил-CО₂H. В других вариантах осуществления R⁴ представляет собой , где R¹⁷ представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, - CО₂H, алкил, алкенил, алкинил, -алкил-OH, -алкил-NH₂, -алкил-SH, -алкил-N₃ или -алкил-CО₂H, и R¹⁸ представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, -CО₂H, алкенил, алкинил, -алкил-OH, -алкил-NH₂, -алкил-SH, -алкил-N₃ или -алкил-CО₂H. В других вариантах осуществления каждая из R¹⁷ и R¹⁸ независимо представляет собой -H, алкил, -(CH₂)_0-6C≡CH, -(CH₂)_0-6CH=CH₂, -(CH₂)_0-6OH, -(CH₂)_0-6NH₂, (CH₂)_0-6SH или -(CH₂)_0-6N₃. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹⁷ и R¹⁸ независимо представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, -N₃, -CО₂H, алкил, -алкил-NH₂ или -алкил-N₃. В определенных вариантах осуществления каждая из R¹⁷ и R¹⁸ независимо представляет собой -H, -OH, -NH₂, -SH, - N₃, -CО₂H, метил, -CH₂NH₂ или -CH₂N₃.

[0255] В определенных вариантах осуществления R⁴ вместе с R⁹ и атомами, с которыми они связаны, образуют замещенное или незамещенное гетероциклоалкильное кольцо. В определенных вариантах осуществления R⁴ вместе с R⁹ и атомами, с которыми они связаны, образуют 5-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, которое может быть незамещенным или замещенным одной или несколькими группами, выбранными из -OH, -NH₂, -SH и -N₃. В определенных вариантах осуществления гетероциклоалкильное кольцо представляет собой пирролидиновое кольцо, которое может быть незамещенным или замещенным одной или несколькими группами, выбранными из -OH, -NH₂, -SH и -N₃.

[0256] В определенных вариантах осуществления R⁴ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R⁴ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы. В определенных вариантах осуществления группа R⁴ сама содержит один или несколько хиральных центров, и каждый из этих стереохимических центров независимо находится в конфигурации R или S.

[0257] В определенных вариантах осуществления R⁵ представляет собой втор-бутил. В других вариантах осуществления R⁵ представляет собой изобутил. В определенных вариантах осуществления R⁵ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R⁵ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы. В определенных вариантах осуществления хиральный центр в группе R⁵ находится в конфигурации R, а в других вариантах осуществления этот центр находится в конфигурации S.

[0258] В определенных вариантах осуществления R⁶ представляет собой -H. В других вариантах осуществления R⁶ представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил.

[0259] В определенных вариантах осуществления каждая из R⁷ и R⁸ независимо представляет собой -H, алкил, -CO₂R^a или -CONR^bR^c; где R^a представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; и каждая из R^b и R^c независимо представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил.

[0260] В определенных вариантах осуществления каждая из R⁷ и R⁸ независимо представляет собой замещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо, где фенил или гетероциклическое кольцо могут быть замещенными одной или несколькими группами, выбранными из галогена, оксо, гидрокси, амино, алкила и алкокси. В других определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой незамещенное 3-8-членное гетероциклическое кольцо. В других определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой замещенное 3-8-членное гетероциклическое кольцо. В других определенных вариантах осуществления R⁸ представляет собой фенил, который необязательно замещен галогеном.

[0261] В определенных вариантах осуществления R⁷ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R⁷ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы.

[0262] В определенных вариантах осуществления R⁸ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R⁸ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы.

[0263] В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой -CO₂R^a -CONR^bR^c; тетразолил или тиазолил, где R^a представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; и каждая из R^b и R^c независимо представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; и R⁸ представляет собой фенил, который необязательно замещен галогеном.

[0264] В определенных вариантах осуществления R⁹ представляет собой -H. В других вариантах осуществления R⁹ представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R⁹ представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления R⁹ представляет собой метил.

[0265] В определенных вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой -H. В других вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления R¹⁰ представляет собой метил.

[0266] В определенных вариантах осуществления R¹¹ представляет собой -H. В других вариантах осуществления R¹¹ представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R¹¹ представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления R¹¹ представляет собой метил.

[0267] В определенных вариантах осуществления R¹² представляет собой -H. В других вариантах осуществления R¹² представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R¹² представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления R¹² представляет собой метил.

[0268] В определенных вариантах осуществления R¹³ представляет собой -H. В других вариантах осуществления R¹³ представляет собой алкил, например, C_1-8-алкил, C_1-4-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R¹³ представляет собой -H или метил. В определенных вариантах осуществления R¹³ представляет собой метил.

[0269] В определенных вариантах осуществления R¹⁴ представляет собой -H. В определенных вариантах осуществления R¹⁴ представляет собой алкил, например, C_1-6-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R¹⁴ представляет собой -OH.

[0270] В определенных вариантах осуществления R¹⁴ находится в стехиометрической конфигурации R относительно остальной молекулы. В других вариантах осуществления R¹⁴ находится в стехиометрической конфигурации S относительно остальной молекулы.

[0271] В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой -CO₂R^a, где R^a представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; R⁸ представляет собой фенил; и R¹⁴ представляет собой -H. В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой -CONR^bR^c, где каждая из R^b и R^c независимо представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; R⁸ представляет собой фенил; и R¹⁴ представляет собой -H. В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой алкил, например, C_1-6-алкил или метил; R⁸ представляет собой фенил; и R¹⁴ представляет собой -OH. В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой метил, R⁸ представляет собой фенил, и R¹⁴ представляет собой -OH. В определенных вариантах осуществления обе R⁷ и R¹⁴ представляют собой -H, и R⁸ представляет собой пиридинил, пиперидинил, незамещенный фенил или фенил, замещенный галогеном, например, фтор, хлор или бром. В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой -CO₂R^a, где R^a представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; R⁸ представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; и R¹⁴ представляет собой алкил, например, C_1-6-алкил, метил или этил. В определенных вариантах осуществления R⁷ представляет собой -CO₂R^a, где R^a представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; R⁸ представляет собой -H или алкил, например, C_1-6-алкил или метил; и R¹⁴ представляет собой -OH.

[0272] В определенных вариантах осуществления

каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или C_1-6-алкил;

X представляет собой -O- или отсутствует;

R³ представляет собой ; где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой ; где R¹⁷ представляет собой -OH, -NH₂, -SH, -N₃, -CO₂H, -C_1-6-алкил-NH₂, алкинил, алкенил или -C_1-6-алкил-N₃; и R¹⁸ представляет собой -H или C_1-6-алкил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -H, C_1-6-алкил, -CO₂R^a, -CONR^bR^c, тетразолил или тиазолил; где R^a представляет собой -H или C_1-6-алкил; и каждая из R^b и R^c представляет собой -H или C_1-6-алкил;

R⁸ представляет собой -H, C_1-6-алкил, замещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ независимо представляет собой C_1-6-алкил; и

R¹⁴ представляет собой -H, C_1-6-алкил или -OH.

[0273] В определенных вариантах осуществления

каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или метил;

X представляет собой -O- или отсутствует;

R³ представляет собой ; где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или метил;

R⁴ представляет собой ; где R¹⁷ представляет собой -OH, -NH₂, -SH, -N₃, -CO₂H, аминометил, алкинил, алкенил или азидометил; и R¹⁸ представляет собой -H или метил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -H, метил, -CO₂R^a или -CONR^bR^c; где R^a представляет собой -H или метил; и каждая из R^b и R^c представляет собой -H или метил;

R⁸ представляет собой -H, метил, этил, пиридинил, пиперидинил, незамещенный фенил, фенил, замещенный галогеном; R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ представляет собой метил; и

R¹⁴ представляет собой -H, метил или -OH.

[0274] В определенных вариантах осуществления

каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или C_1-6-алкил;

X отсутствует;

R³ представляет собой ; где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой ; где R¹⁷ представляет собой -N₃, и R¹⁸ представляет собой -H или метил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -H, C_1-6-алкил, -CO₂R^a, -CONR^bR^c, тетразолил или тиазолил; где R^a представляет собой -H или C_1-6-алкил; и каждая из R^b и R^c представляет собой -H или C_1-6-алкил;

R⁸ представляет собой -H, C_1-6-алкил, замещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ независимо представляет собой C_1-6-алкил; и

R¹⁴ представляет собой -H, C_1-6-алкил или -OH.

[0275] В определенных вариантах осуществления

каждая из R¹ и R² независимо представляет собой -H или C_1-6-алкил;

X представляет собой -O-;

R³ представляет собой ; где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ независимо представляет собой -H, -OH или C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой ; где R¹⁷ представляет собой -N₃, и R¹⁸ представляет собой -H или метил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -H, C_1-6-алкил, -CO₂R^a, -CONR^bR^c, тетразолил или тиазолил; где R^a представляет собой -H или C_1-6-алкил; и каждая из R^b и R^c представляет собой -H или C_1-6-алкил;

R⁸ представляет собой -H, C_1-6-алкил, замещенный или незамещенный фенил или замещенное или незамещенное гетероциклическое кольцо;

R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ независимо представляет собой C_1-6-алкил; и

R¹⁴ представляет собой -H, C_1-6-алкил или -OH.

[0276] В определенных вариантах осуществления формулы (I), где

каждая из R¹ и R² представляет собой метил;

X отсутствует;

R³ представляет собой группу формулы: ;

где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ представляет собой метил;

R⁴ представляет собой группу формулы: ;

где R¹⁷ представляет собой -N₃, -NH₂, -OH, -SH, и R¹⁸ представляет собой -H или метил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -CO₂R^a или CONR^bR^c,

где R^a представляет собой -H или C_1-6-алкил;

каждая из R^b и R^c независимо представляет собой H или C_1-6-алкил;

R⁸ представляет собой фенил;

R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ независимо представляет собой метил; и

R¹⁴ представляет собой -H.

[0277] В определенных вариантах осуществления формулы (I), где

каждая из R¹ и R² представляет собой -H;

X представляет собой -O-;

R³ представляет собой группу формулы: ;

где каждая из R¹⁵ и R¹⁶ представляет собой метил;

R⁴ представляет собой группу формулы: ;

где R¹⁷ is -N₃, и R¹⁸ представляет собой -H или метил;

R⁵ представляет собой втор-бутил;

R⁶ представляет собой -H;

R⁷ представляет собой -CO₂R^a или CONR^bR^c,

где R^a представляет собой -H или C_1-6-алкил;

каждая из R^b и R^c независимо представляет собой H или C_1-6-алкил;

R⁸ представляет собой фенил;

R⁹ представляет собой -H;

каждая из R¹⁰, R¹¹, R¹² и R¹³ независимо представляет собой метил; и

R¹⁴ представляет собой -H.

[0278] Следует понимать, что любое определение вариабельной группы, приводимое в настоящем документе, можно использовать в комбинации с любым другим определением вариабельной группы, приводимым в настоящем документе, так, что предусмотрены все возможные комбинации и перестановки вариабельных групп, приводимых в настоящем документе, которые химически возможны.

[0279] В определенных вариантах осуществления соединения формулы (I) выбраны из группы, состоящей из:

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-2-(диметиламино)-N-((S)-3-гидрокси-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиридин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамида;

(2S,3R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиридин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S)-2-(диметиламино)-N-(((2S)-3-гидрокси-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиперидин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-3-метилбутанамида;

(2S,3R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-(((2S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиперидин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-N-((S)-3-амино-1-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиридин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-1-оксопропан-2-ил)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамида;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-2-((S)-2-(аминоокси)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиридин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамида;

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-гидроксипропанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина;

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(диметиламино)-3-гидроксибутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина;

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты;

(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((2S,3R)-2-(диметиламино)-3-гидроксибутанамидо)-N,3-диметилбутанамида;

(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-гидроксипропанамидо)-N,3-диметилбутанамида;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-меркапто-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-меркапто-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты;

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-метилпропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты;

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((25,3R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-гидроксипропанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(диметиламино)-3-гидроксибутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноата;

(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропионовой кислоты;

(2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(фенэтиламино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-N-(3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-N-(3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(фенэтиламино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((15,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-амино-A^/-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-амино-N-(3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(S)-4-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(фенэтиламино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(S)-4-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((15,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(S)-4-амино-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(S)-4-амино-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-хлорфенэтил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилпент-4-инамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-((2-(пиридин-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутиламино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-валината;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-6-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилгексанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((25,45)-4-азидо-1-(диметил-L-валил)-N-метилпирролидин-2-карбоксамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

(S)-3-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-4-(((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-3-(((S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-4-оксобутановой кислоты;

(2S,3R)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-3-гидрокси-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((15,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-серината;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-изолейцината;

(2S,3S)-3-амино-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-амино-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутиламино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамида;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)пропанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамида;

((2S,3S)-3-азидо-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(трет-бутиламино)-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамида;

трет-бутил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина;

трет-бутил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

(2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(1H-тетразол-5-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(1H-тетразол-5-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамида;

(2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида;

трет-бутил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината;

(2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(1H-тетразол-5-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида; и

(2S,3S)-3-амино-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N-метилбутанамида и их фармацевтически приемлемых солей.

[0280] Также в настоящем документе предоставлены фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I), предпочтительно соединений, описанных выше и конкретных соединений, приводимых в качестве примеров в настоящем документе, фармацевтические композиции, содержащие такие соли, и способы применения таких солей.

[0281] "Фармацевтически приемлемая соль" предназначена для обозначения соли свободных кислоты или основания соединения, предоставляемого в настоящем документе, которая является нетоксической, биологически приемлемой или в других отношениях биологически пригодной для введения индивидууму. В основном см., S.M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19. Предпочтительные фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые являются фармакологически эффективными и подходящими для контакта с тканями индивидуумов без неприемлемой токсичности, раздражения или аллергического ответа. Соединение, описываемое в настоящем документе, может содержать достаточно кислотную группу, достаточно основную группу или оба типа функциональных групп и, таким образом, реагировать с рядом неорганических или органических оснований и неорганических и органических кислот с формированием фармацевтически приемлемой соли. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли присоединения кислот, такие как сульфаты, пиросульфаты, бисульфаты, сульфиты, бисульфиты, фосфаты, моногидрофосфаты, дигидрофосфаты, метафосфаты, пирофосфаты, хлориды, бромиды, йодиды, ацетаты, пропионаты, деканоаты, каприлаты, акрилаты, формиаты, изобутираты, капроаты, гептаноаты, пропиолаты, оксалаты, малонаты, сукцинаты, субераты, себацинаты, фумараты, малеаты, бутин-1,4-диоаты, гексин-1,6-диоаты, бензоаты, хлорбензоаты, метилбензоаты, динитробензоаты, гидроксибензоаты, метоксибензоаты, фталаты, сульфонаты, метилсульфонаты, пропилсульфонаты, безилаты, ксилолсульфонаты, нафталин-1-сульфонаты, нафталин-2-сульфонаты, фенилацетаты, фенилпропионаты, фенилбутираты, цитраты, лактаты, γ-гидроксибутираты, гликоляты, тартраты и соли миндальной кислоты, и соли с неорганическими основаниями, такими как натрий, калий, магний, кальций, алюминий и т.п., или органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин, орнитин и т.п., соли с различными аминокислотами или производными аминокислот, такие как ацетиллейцин и т.п., аммонийные соли и т.д.

[0282] Для целей лечения фармацевтические композиции, содержащие соединения, описываемые в настоящем документе, могут дополнительно содержать один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Фармацевтически приемлемый эксципиент представляет собой вещество, которое является нетоксическим и иным образом биологически приемлемым для введения индивидууму. Такие эксципиенты облегчают составление и введение соединений, описываемых в настоящем документе, и совместимы с активным ингредиентом. Примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов включают стабилизаторы, смазочные средства, поверхностно-активные вещества, разбавители, антиоксиданты, связывающие средства, красители, эмульгаторы или модифицирующие вкус средства. В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтические композиции представляют собой стерильные композиции.

[0283] Фармацевтические композиции, описываемые в настоящем документе, можно формулировать в виде растворов, эмульсий, суспензий или дисперсий в подходящих фармацевтических растворителях или носителях или в виде пилюль, таблеток, таблеток-леденцов, суппозиториев, порошков для восстановления или капсул вместе с твердыми носителями общеизвестными в данной области способами получения различных лекарственных форм. Для местного применения соединения, описываем в настоящем документе, предпочтительно формулируют в виде кремов или мазей или со сходным носителем, подходящим для местного применения. Фармацевтические композиции и соединения, описываемые в настоящем документе, можно вводить способами по изобретению подходящим маршрутом доставки, например, пероральным, назальным, парентеральным, ректальным, местным, глазным или посредством ингаляции.

[0284] Как используют в настоящем документе, термин "лечить" или "лечение" предназначен для обозначения введения индивидууму соединения, описываемого в настоящем документе, с целью обеспечения положительного терапевтического действия. Лечение включает реверсию, улучшение состояния, облегчение, подавление прогресса или снижение тяжести заболевания, нарушения или патологического состояния или одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли. Термин "индивидуум" относится к пациенту-млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, такому как человек.

[0285] В способах лечения, приводимых в настоящем документе, "эффективное количество" означает количество или дозу, достаточные для общего обеспечения требуемого положительного терапевтического действия у индивидуумов с необходимостью такого лечения. Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" означает любое количество которое, при сравнении с соответствующим индивидуумом, не получавшим такого количества, в качестве неограничивающих примеров, приводит к выздоровлению, предотвращению ли улучшению состояния заболевания, нарушения или побочного эффекта или к снижению скорости прогрессирования заболевания или нарушения. Термин также включает в свой объем количества, эффективные для улучшения нормальной физиологической функции, а также количества, эффективные для обеспечения физиологической функции у индивидуума, например, человека, которая усиливает или помогает терапевтическому действию второго фармацевтического средства. Эффективные количества, включая терапевтически эффективные количества или дозы соединений, описываемых в настоящем документе, можно определять общепринятыми способами, такими как моделирование, увеличение дозы или клинические испытания, учитывая стандартные факторы, например, способ или маршрут введения или доставки лекарственного средства, фармакокинетику средства, тяжесть и течение инфекции, состояние здоровья, патологическое состояние и массу индивидуума и решение лечащего врача. Иллюстративная доза конъюгатов антител c лекарственными средствами, описываемых в настоящем документе, находится в диапазоне приблизительно от 1 мкг до 2 мг активного соединения на килограмм массы тела индивидуума в сутки, предпочтительно приблизительно от 0,05 до 100 мг/кг/сутки, или приблизительно от 1 до 35 мг/кг/сутки, или приблизительно от 0,1 до 10 мг/кг/сутки. Общую дозу можно вводить в виде одной или разделенных единиц дозирования (например, дважды в сутки, трижды в сутки, четырежды в сутки).

[0286] Соединения, описываемые в настоящем документе, при лечении злокачественной опухоли можно использовать в фармацевтических композициях или способах в комбинации с дополнительными активными ингредиентами. Дополнительные активные ингредиенты можно вводить отдельно от соединения, описываемого в настоящем документе, или их можно включать с соединением, описываемым в настоящем документе, в фармацевтическую композицию, предоставляемую по настоящему документу. Например, дополнительные активные ингредиенты представляют собой ингредиенты, известные или выявленные как эффективные при лечении злокачественных опухолей, включая средства, активные против другой мишени, ассоциированной со злокачественной опухолью, например, но не ограничиваясь ими, велкейд, ритуксимаб, метотрексат, герцептин, винкристин, преднизон, иринотекан или т.п. или их сочетание. Такая комбинация может служить для увеличения эффективности, снижения одного или нескольких побочных эффектов или снижения требуемой дозы описываемого соединения.

[0287] Далее соединения формулы (I) описаны по отношению к иллюстративным синтетическим схемам для их общего получения, приведенным ниже, и следующим далее примерам. Специалистам в данной области понятно, что для получения различных соединений по настоящему документу исходные вещества можно соответственно выбирать так, что конечные требуемые заместители переходили по схеме реакции с защитой или без защиты по необходимости с выходом требуемого продукта. Альтернативно, необходимым или желательным может являться применение вместо конечного требуемого заместителя, подходящей группы, которая может переходить по схеме реакции и при необходимости быть замещена требуемым заместителем. Кроме того, специалисту в данной области понятно, что для защиты определенных функциональных групп (амино, карбокси или группы боковых цепей) от условий реакции можно использовать защитные группы, и что при необходимости такие группы удаляют в стандартных условиях. Каждую из реакция, приводимых на схеме A предпочтительно проводят при температуре приблизительно от комнатной температуры до температуры кипения используемого органического растворителя с обратным холодильником. Если не указано иначе, переменные являются такими, как определено выше в отношении формулы (I).

Схема A

[0288] При обращении к схеме A, получение соединений формулы (I) начинается с защищенной формы кислоты долаизолейцина (Dil), обозначенной (A) (см. Pettit et al. (1994) J. Org. Chem. 59:1796-1800). Соединение (A) приведено с защитной группой сложного трет-бутилового эфира, но специалист в данной области может выбрать подходящую замену. Связывание с защищенным по азоту производным валина или изолейцина (B), где PG представляет собой подходящую защитную аминогруппа, такую как группа Boc (t-бутоксикарбонил) или флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), проводят в стандартных условиях образования пептидной связи. Например, реакции проводят в присутствии диэтилцианофосфоната (DEPC), PyBrOP, PyBOP, BOP, диизопропилкарбодиимида (DIC), дициклогексилкарбодиимида (DCC), гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (EDCI), 1-гидроксибензотриазола (HOBt), 1-гидрокси-7-аза-бензотриазола (HOAt), HBTU (гексафторфосфата O-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилурония), HATU (гексафторфосфата O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония) и т.п. или их сочетания. Как правило, реакции проводят в присутствии третичного аминового основания, такого как диизопропилэтиламин. Подходящие растворители включают дихлорметан, Ν,Ν-диметилформамид (DMF), диметилсульфоксид (DMSO), этилацетат и т.п. Защитную аминогруппу на полученном дипептиде (C) удаляют посредством снятия защиты в подходящих условиях. Например, когда PG представляет собой группу Boc, соединение (C) обрабатывают трифторуксусной кислотой с формированием свободного амина (D). Когда PG представляет собой группу Fmoc, соединение (C) обрабатывают пиперидином или диэтиламином с получением соединения (D). Затем соединение (D) связывают с производным аминокислоты (E), если необходимо в защищенной форме, в условиях образования пептидной связи, как описано выше, с получением трипептида (F). Обработка кислотой удаляет защитную карбоксигруппу с получением свободной кислоты (G).

Схема B

[0289] При обращении к схеме B, защищенный по аминогруппе долапролин (Dap), обозначенный как (H) (см. Pettit et al. (1994) J. Org. Chem. 59:6287-6295) связывают с амином (J) (который получают способами, известными специалисту в данной области) в условиях образования пептидной связи, как описано выше. У полученного дипептида (K) снимают защиту, как описано для схемы A, с получением соединения (L).

Схема C

[0290] При обращении к схеме C, кислоту (G) и амин (L) связывают в условиях образования пептидной связи, как указано выше, с получением соединений формулы (I). Когда результатом реакции является защищенная форма формулы (I), для получения намеченного соединения используют подходящие условия снятия защиты.

[0291] Также по настоящему документу предоставлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый эксципиент.

[0292] Также по настоящему документу предоставлен способ лечения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью или с диагностированной злокачественной опухолью, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества по меньшей мере одного из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.

[0293] Также по настоящему документу предоставлено применение по меньшей мере одного из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в таком лечении.

[0294] Также по настоящему документу предоставлен применение по меньшей мере одного из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли в производстве лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в таком лечении.

[0295] Также по настоящему документу предоставлен набор, содержащий по меньшей мере одно из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в лечении злокачественной опухоли у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, и инструкции для применения.

[0296] Также по настоящему документу предоставлено промышленное изделие, содержащее по меньшей мере одно из соединений формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, для применения в лечении злокачественной опухоль у индивидуума, нуждающегося в таком лечении.

[0297] Также в настоящем документе предоставлены конъюгаты антител c лекарственными средствами (ADC), где соединение формулы (I) конъюгировано с антителом.

[0298] Иллюстративные ADC, где использована формула (I), имеют приводимые ниже структуры, где "L" или "mAb-s-" представляют МАТ к FLT3, обозначаемое CHv62.21, приведенное в настоящем документе.

[0299] Кроме того, дополнительные иллюстративные ADC, где использована формула (I), имеют приводимые ниже структуры, где "L" или "mAb-s-" представляют МАТ к FLT3, обозначаемое CHv62.21pAF, приводимое в настоящем документе.

[0300] В предпочтительном варианте осуществления соединения формулы (I) содержат группы лекарственных средств, содержащие соединение, обозначенное (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид.

[0301] В предпочтительном варианте осуществления соединения формулы (I) содержат группы лекарственных средств, содержащие соединение, указанное ниже как формула (II):

[0302]

IX.) Содержание лекарственного средства

[0303] Содержание лекарственного средства обозначено буквой p и представляет собой среднее молекул количество лекарственного средства на антитело в молекуле. Содержание лекарственного средства может находиться в диапазоне от 1 до 20 молекул лекарственного средства (D) на антитело. ADC по изобретению включают группу антител, конъюгированных с диапазоном молекул лекарственных средств от 1 до 20. Среднее количество молекул лекарственного средства на антитело в препаратах ADC после реакций конъюгации можно определять общепринятыми способами, такими как анализы масс-спектроскопия и ELISA. Также можно определять количественное распределение ADC относительно p. В некоторых случаях отделение, очистку и характеристику гомогенных ADC, где p представляет собой определенное значение, от ADC с другим содержанием лекарственных средства можно проводить такими способами, как электрофорез.

[0304] Для определенных конъюгатов антитело-лекарственное средство p может быть ограничен количеством участков связывания на антителе. Например, когда связывания происходит по тиолу цистеина, антитело может содержать только одну или несколько тиольных групп цистеина или может содержать только одну или несколько достаточно реакционноспособных тиольных групп, с которыми можно связывать линкер. В определенных вариантах осуществления повышенное содержание лекарственного средства, например, p>5, может обеспечить определенным конъюгатам антитело-лекарственное средство агрегацию, нерастворимость, токсичность или потерю клеточной проницаемости. В определенных вариантах осуществления содержание лекарственного средства ADC по изобретению находится в диапазоне от 1 до приблизительно 8; приблизительно от 2 до приблизительно 6; приблизительно от 3 до приблизительно 5; приблизительно от 3 до приблизительно 4; приблизительно от 3,1 до приблизительно 3,9; приблизительно от 3,2 до приблизительно 3,8; приблизительно от 3,2 до приблизительно 3,7; приблизительно от 3,2 до приблизительно 3,6; приблизительно от 3,3 до приблизительно 3,8 или приблизительно от 3,3 до приблизительно 3,7. Фактически, показано, что для определенных ADC оптимальное отношение молекул лекарственного средства и антитела может составлять менее 8 и может составлять приблизительно от 2 до приблизительно 5.

[0305] В определенных вариантах осуществления с антителом при реакции конъюгации конъюгируется меньше теоретического максимума молекул лекарственного средства. Например, антитело может содержать остатки лизина, которые не реагируют с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом, как описано ниже. Как правило, антитела не содержат много свободных и реакционноспособных тиольных групп цистеина, которые можно связывать с молекулой лекарственного средства; фактически большинство тиольных остатков цистеина в антителах находятся в виде дисульфидных мостиков. В определенных вариантах осуществления антитело можно восстанавливать восстановителем, таким как дитиотреитол (DTT) или трикарбонилэтилфосфин (TCEP) в частичных или полностью восстановительных условиях с получением реакционноспособных тиольных групп цистеина. В определенных вариантах осуществления антитело подвергают действию денатурирующих условий с высвобождением реакционноспособных нуклеофильных групп, таких как лизин или цистеин.

[0306] Содержание (отношение лекарственное средство/антитело) в ADC можно контролировать различными способами, например, посредством: (i) ограничения молярного избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер или линкерного реагента относительно антитела, (ii) ограничения времени или температуры реакции конъюгации, (iii) частичных или ограничивающих восстановительных условий для модификации тиолов цистеин, (iv) конструирование рекомбинантными способами аминокислотной последовательности антитела так, чтобы количество и положение остатков цистеина изменялось с контролем количества и/или положения связываний линкера-лекарственного средства (например, thioMab или thioFab, полученные, как описано в настоящем документе и в W02006/034488 (полностью включенном в настоящий документ в качестве ссылки)).

[0307] Следует понимать, что когда с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или линкерным реагентом с последующим реагентом молекулы лекарственного средства реагирует более одной нуклеофильной группы, то получаемый продукт представляет собой смесь соединений ADC с распределением одной или нескольких молекул лекарственного средства, связанных с антителом. Среднее количество лекарственных средств на антитело можно рассчитывать в смеси посредством двойного анализа ELISA антитела, который специфичен к антителу и специфичен к лекарственному средству. Конкретные молекулы ADC в смеси можно идентифицировать посредством масс-спектроскопии и разделять посредством ВЭЖХ, например, посредством хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий (см., например, Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates", Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). В определенных вариантах осуществления гомогенные ADC с одним значением содержания можно выделять из смеси после конъюгации посредством электрофореза или хроматографии.

X.) Способы определения цитотоксического эффекта ADC

[0308] Способы определения, проявляет ли лекарственное средство или конъюгат антитело-лекарственное средство цитостатическое и/или цитотоксическое действие на клетки, известны. Как правило, цитотоксическую или цитостатическую активность конъюгата антитела c лекарственным средством можно определять: обрабатывая клетки млекопитающих, экспрессирующие белок-мишень конъюгата антитела c лекарственным средством в среде для культивирования клеток; культивируя клетки в течение периода приблизительно от 6 часов до приблизительно 5 суток и определяя жизнеспособность клеток. Для определения жизнеспособности (пролиферации), цитотоксичности и индукции апоптоза (активация каспаз) конъюгата антитела c лекарственным средством можно использовать основанные на клетках анализы in vitro.

[0309] Для определения того, проявляет ли конъюгат антитела c лекарственным средством цитостатическое действие, можно использовать анализ встраивания тимидина. Например, злокачественные клетки, экспрессирующие антиген-мишень, при плотности 5000 клеток/лунку в 96-луночном планшете можно культивировать в течение периода 72 часов и подвергать действию 0,5 мкКи ³H-тимидина в течение последних 8 часов периода 72 часов. Встраивание ³H-тимидина в клетки культуры измеряют в присутствии и отсутствие конъюгата антитела c лекарственным средством.

[0310] Для определения цитотоксичности можно определять некроз или апоптоз (программируемую гибель клеток). Как правило, некроз сопровождается увеличением проницаемости плазматической мембраны; набуханием клеток и разрывами плазматической мембраны. Как правило, апоптоз характеризуется пузырением мембраны, конденсацией цитоплазмы и активацией эндогенных эндонуклеаз. Определение любого из этих явлений у злокачественных клеток означает, что конъюгат антитела c лекарственным средством пригоден при лечении злокачественных опухолей.

[0311] Жизнеспособность клеток можно измерять, определяя захват клетками красителей, таких как нейтральный красный, трипановый синий или ALAMAR™ синий (см., например, Page et al., 1993, Inti. J. Oncology 3:473-476). В таком анализе клетки инкубируют в среде, содержащей краситель, клетки отмывают и оставшийся краситель, отражающий захват красителя клетками, измеряют спектрофотометрически. Для определения цитотоксичности также можно использовать связывающийся с белками краситель сульфородамин B (SRB) (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:1107-12).

[0312] Альтернативно, в количественном колориметрическом анализе жизнеспособности клеток млекопитающих и пролиферации используют соль тетразолия, такую как MTT, детектируя жизнеспособные, но не погибшие клетки (см., например, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63).

[0313] Апоптоз можно количественно определять, определяя, например, фрагментацию ДНК. Для количественного определения фрагментации ДНК in vitro Доступны коммерческие фотометрические способы. Примеры таких анализов, включая TUNEL (где детектируют встраивание меченых нуклеотидов во фрагментированную ДНК) и анализы на основе ELISA, описаны в Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).

[0314] Также апоптоз можно определять, определяя морфологические изменения в клетке. Например, как и в случае некроза, можно определять потерю целостности плазматической мембраны, выявляя захват определенных красителей (например, флуоресцентный краситель, например, такой как акридиновый оранжевый или бромистый этидий). Способ определения количества апоптотических клеток описан в Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Также клетки можно метить красителем ДНК (например, акридиновым оранжевым, бромистым этидием или йодистым пропидием) и выявлять в клетках конденсацию и скопление хроматина у внутренней ядерной мембраны. Другие морфологические изменения, которые можно определять для выявления апоптоза, включают, например, конденсацию цитоплазмы, увеличенное пузырение мембраны и сжатие клетки.

[0315] Присутствие апоптотических клеток можно определять в прикрепленном и "свободном" компартментах культур. Например, оба компартмента можно собирать, удаляя супернатант, трипсинизируя прикрепленные клетки, комбинируя препараты после этапа промывки центрифугированием (например, 10 минут при 2000 об/мин) и детектируя апоптоз (например, определяя фрагментацию ДНК). (см., например, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).

[0316] In vivo действие терапевтической композиции к FLT3 можно оценивать в подходящей модели на животных. Например, можно использовать модели ксеногенных злокачественных опухолей, где эксплантаты злокачественных опухолей или культивируемые ткани ксенотрансплантатов вводят животным с ослабленным иммунитетом, таким как "голые" мыши или мыши SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Например, в патентной заявке PCT W098/16628 и патенте США № 6107540 описаны различные модели ксенотрансплантатов рака предстательной железы человека, способные воспроизводить развитие первичных опухолей, микрометастазирование и формирование остеобластических метастазов, характерных для поздней стадии заболевания. Эффективность можно прогнозировать с использованием анализов, в которых определяют ингибирование формирования опухоли, регресса опухоли или метастазирования и т.п.

[0317] Для оценки терапевтических композиций пригодны анализы in vivo, в которых определяют стимуляцию апоптоза. В одном из вариантов осуществления в ксенотрансплантатах мышей с опухолью, обработанных терапевтической композицией, можно проверять присутствие фокусов апоптоза и сравнивать с необработанными контрольными несущими ксенотрансплантаты мышами. Показателем терапевтической эффективности композиции является уровень выявляемых в опухолях обработанных мышей фокусов апоптоза.

[0318] Терапевтические композиции, используемые в практическом осуществлении указанных выше способов, можно формулировать в фармацевтические композиции, содержащие носитель, подходящий для желаемого способа доставки. Подходящие носители включают любой материал, который при комбинации с терапевтической композицией сохраняет противоопухолевое действие терапевтической композиции и, как правило, он не реагирует с иммунной системой пациента. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают любой из ряда стандартных фармацевтических носителей, таких как стерильные растворы фосфатно-солевого буфера, бактериостатическую воду и т.п. (в основном см. Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th Edition, A. Osal., Ed., 1980).

[0319] Терапевтические составы можно растворять и вводить любым маршрутом, которым можно доставить терапевтическую композицию в участок опухоли. Потенциально эффективные маршруты введения в качестве неограничивающих примеров включают внутривенный, парентеральный, интраперитонеальный, внутримышечный, внутриопухолевый, интрадермальный, внутриорганный, ортотопический и т.п. Предпочтительный состав для внутривенной инъекции содержит терапевтическую композицию в растворе бактериостатической воды с добавлением консервантов, стерильной воды без добавления консервантов и/или разбавленную в поливинилхлоридных или полиэтиленовых мешках, содержащих 0,9% стерильный хлорид натрия для инъекций, USP. Терапевтические препараты белков можно лиофилизировать и хранить в виде стерильных порошков, предпочтительно при пониженном давлении, а затем перед инъекцией восстанавливать в бактериостатической воде (содержащей например, консервант бензиловый спирт) или в стерильной воде.

[0320] Дозы и протоколы введения для лечения злокачественных опухолей указанными выше способами варьируют в зависимости от способа и злокачественной опухоли-мишени и, как правило, зависят от ряда других факторов, известных в данной области.

[0321] В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать более одной разновидности ADC по изобретению вследствие модификации МАТ CHv62.21 или МАТ CHv62.21pAF. Например, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ADC по изобретению, где МАТ CHv62.21 представляет собой антитело без C-концевого лизина тяжелой цепи, антитело с N-концевой посттрансляционной модификацией, антитело без C-концевого лизина тяжелой цепи и с N-концевой посттрансляционной модификацией и/или антитело с C-концевым лизином тяжелой цепи и без N-концевой посттрансляционной модификации.

[0322] Например, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей две или более разновидности ADC по изобретению, где МАТ CHv62.21 ADC выбрано из группы следующих 1)-4):

1) МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10;

2) МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10;

3) МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где C-концевой остаток 453 (K) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10; и

4) МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту и C-концевой остаток 453 (K) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

[0323] В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10, и МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где C-концевой остаток 453 (K) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

[0324] В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где C-концевой остаток 453 (K) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10, и МАТ CHv62.21, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:9, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту и C-концевой остаток 453 (K) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

[0325] В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей две или более разновидности ADC по изобретению, где МАТ CHv62.21pAF ADC выбрано из группы следующих 1)-4):

1) МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10;

2) МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10;

3) МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где C-концевой остаток 443 (T) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10; и

4) МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту и C-концевой остаток 443 (T) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10, и МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где C-концевой остаток 443 (T) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению относится к фармацевтической композиции, содержащей МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (Q) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где C-концевой остаток 443 (T) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10, и МАТ CHv62.21pAF, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (E) до остатка 453 (K) SEQ ID NO:11, где N-концевой остаток 1 (E) преобразован в пироглутаминовую кислоту и C-концевой остаток 443 (T) удаляют, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от остатка 1 (D) до остатка 214 (C) SEQ ID NO:10.

XI.) Лечение злокачественной опухоли/опухолей, экспрессирующих FLT3

[0326] Идентификация FLT3 как белка, который в норме экспрессирован в ограниченном множестве тканей или клеток, но который также экспрессирован в злокачественных опухолях, таких как опухоли, перечисленные в таблице I, отрывает ряд терапевтических способов лечения таких злокачественных опухолей.

[0327] Следует отметить, что направленные противоопухолевые средства пригодны даже тогда, когда белок-мишень экспрессирован в нормальных тканях или клетках, даже в тканях жизненно важных органов. Жизненно важный орган представляет собой орган, который необходим для поддержания жизни, например, сердце или толстая кишка. Не являющийся жизненно важным орган представляет собой орган, который можно удалить и при этом индивидуум все еще сможет продолжать жить. Примерами не являющихся жизненно важными органов являются яичник, молочная железа и предстательная железа.

[0328] Экспрессия белка-мишень в нормальной ткани, даже жизненно важной нормальной ткани, не отменяет пригодности направленного к белку средства в качестве терапевтического средства для определенных опухолей, в которых этот белок также сверхэкспрессирован. Например, экспрессия в жизненно важных органах сама по себе не вредна. Кроме того, органы, рассматриваемые как необязательные, такие как предстательная железа и яичник, можно удалить без влияния на смертность. Наконец, некоторые жизненно важные органы при нормальной экспрессии в органах не затрагиваются вследствие иммунопривилегированности. Иммунопривилегированные органы представляют собой органы, которые защищены от крови гематоорганными барьерами и, таким образом, недоступны для иммунотерапии. Примерами иммунопривилегированных органов являются головной мозг и семенник.

[0329] Таким образом, терапевтические способы, ингибирующие активность белка FLT3 пригодны для пациентов, страдающих злокачественной опухолью, экспрессирующей FLT3 (например, такие как злокачественные опухоли, приведенные в таблице I). Как правило, эти терапевтические способы подразделяются на три класса. Первый класс модулирует функцию FLT3, так как она относится к росту опухолевых клеток, что приводит к ингибированию или замедлению роста опухолевых клеток или индукции их уничтожения. Второй класс включает различные способы ингибирования связывания или ассоциации белка FLT3 с его партнером по связыванию или с другими белками. Третий класс включает ряд способов ингибирования транскрипции гена FLT3 или трансляции иРНК FLT3.

[0330] Таким образом, пациентов со злокачественными опухолями можно оценивать на наличие и уровень экспрессии FLT3, предпочтительно используя иммуногистохимические оценки опухолевой ткани, количественную томографию FLT3 или другие способы, надежно указывающие на наличие и степень экспрессии FLT3. Для этой цели по возможности предпочтителен иммуногистохимический анализ биопсий опухолей или хирургических образцов. Способы иммуногистохимического анализа опухолевых тканей хорошо известны в данной области.

XIII.) FLT3 в качестве мишени для терапии на основе антител

[0331] FLT3 представляет собой привлекательную мишень для терапевтических стратегий на основе антител. В данной области для направленного воздействия на внеклеточные и внутриклеточные молекулы известен ряд стратегий на основе антител (см., например, опосредованное комплементом и ADCC уничтожение, а также использование интраантител). Так как FLT3 экспрессируют злокачественные клетки различных относительно соответствующих нормальных клеток линий дифференцировки, проводят системное введение иммунореактивных относительно FLT3 композиций, которое демонстрирует превосходную чувствительность без токсического, неспецифического и/или побочного действия, вызываемого связыванием иммунореактивной композиции с не являющимися мишенями органами и тканями. Антитела специфически реагирующие с доменами FLT3 пригодны для системного лечения экспрессирующих FLT3 злокачественных опухолей, предпочтительно в виде конъюгатов антител c лекарственными средствами (т.е. ADC), где конъюгат получен с токсином или терапевтическим средством.

[0332] Специалистам в данной области понятно, что антитела можно использовать для специфического направления и связывания с иммуногенными молекулами, такими как иммуногенная область последовательности FLT3, представленная на фигуре 1. Кроме того, специалистам в данной области понятно, что конъюгация антител с цитотоксическими средствами является стандартным способом (см., например, Slevers et al. Blood 93:11 3678-3684 (June 1, 1999)). Когда цитотоксические и/или терапевтические средства доставляют непосредственно в клетки, например, конъюгируя их с антителами, специфичными к молекуле, экспрессируемой этими клетками (например, FLT3), цитотоксическое средство оказывает свое известное биологическое действие (т.е. цитотоксичность) на эти клетки.

[0333] В данной области известен широкий спектр композиций и способов применения конъюгатов антител с цитотоксическими средствами для уничтожения клеток. В контексте злокачественных опухолей типичные способы включают введение млекопитающему с опухолью биологически эффективного количества конъюгата, содержащего выбранное цитотоксическое и/или терапевтическое средство, связанное с направленным средством (например, МАТ к FLT3, предпочтительно CHv62.21 или CHv62.21pAF), которое связывается с экспрессируемым, доступным для связывания или локализованным на клеточной поверхности антигеном (например, FLT3). Типичным вариантом осуществления является способ доставки цитотоксического и/или терапевтического средства в экспрессирующую FLT3 клетку, включающий конъюгацию цитотоксического средства с антителом, которое иммуноспецифически связывается с эпитопом FLT3, и обработку клетки конъюгатом антитела c лекарственным средством (ADC). Другим иллюстративным вариантом осуществления является способ лечения индивидуума, у которого полагают наличие метастазирующей злокачественной опухоли, включающий этап парентерального введения указанному индивидууму фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела, конъюгированного с цитотоксическим и/или терапевтическим средством.

[0334] Иммунотерапию злокачественных опухолей с использованием антител к FLT3 можно проводить различными способами, которые успешно применяли при лечении других типов злокачественных опухолей, включая в качестве неограничивающих примеров рак толстого кишечника (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), множественную миелому (Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), рак желудка (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), B-клеточную лимфому (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), лейкоз (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), колоректальный рак (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) и рак молочной железы (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Определенные терапевтические способы включают конъюгацию свободного антитела с токсином или радиоактивным изотопом, такие как конъюгация Y⁹¹ или I¹³¹ с антителами к CD20 (например, зевалин™, IDEC Pharmaceuticals Corp или бексар™, Coulter Pharmaceuticals) соответственно, тогда как другие включают совместное введение антител и других терапевтических средств, таких как герцептин™ (трастузумаб) с паклитакселом (Genentech, Inc.). В предпочтительном варианте осуществления антитела конъюгируют с цитотоксическим средством, выше, предпочтительно производным ауристатина обозначенным MMAE (Seattle Genetics).

[0335] Хотя терапия антителами к FLT3 пригодна для всех стадий злокачественных опухолей, терапия антителами может быть особенно подходящей при злокачественных опухолях на поздних стадиях или метастатических злокачественных опухолях. Лечение посредством терапии антителами по изобретению показано пациентам, прошедшим один или несколько циклов химиотерапии. Альтернативно, у пациентов, которые не получали химиотерапевтического лечения, терапию антителами по изобретению комбинируют со схемами лечения химиотерапевтическими средствами или радиацией. Кроме того, терапия антителами может обеспечить использование меньших доз сопутствующего химиотерапевтического средства, в частности, у пациентов плохо переносящих токсичность химиотерапевтического средства. В Fan et al. (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett et al. (International J. of Onco. 9:217-224, 1996) и Hancock et al. (Cancer Res. 51:4575-4580, 1991) описано использование различных антител совместно с химиотерапевтическими средствами.

[0336] Моноклональные антитела к FLT3, способные к лечению злокачественных опухолей, приведенные в таблице I, включают антитела, которые инициируют сильный иммунный ответ против опухоли, или антитела, которые являются непосредственно цитотоксическими. В этом отношении моноклональные антитела к FLT3 (МАТ) могут вызывать лизис опухолевых клеток посредством механизмов опосредованной комплементом или опосредованной антителами клеточной цитотоксичности (ADCC), которые оба требуют интактной Fc-части молекулы иммуноглобулина для взаимодействия с участками взаимодействия с рецепторами Fc эффекторных клеток на белках комплемента. Кроме того, для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих FLT3, пригодны МАТ к FLT3, проявляющие прямое биологическое действие на рост опухоли. Механизмы, которыми действуют непосредственно цитотоксические МАТ, включают: ингибирование роста клеток, модуляцию клеточной дифференцировки, модуляцию профиля факторов ангиогенеза опухоли и индукцию апоптоза. Механизм(ы), посредством которого конкретные МАТ к FLT3 проявляют противоопухолевое действие, оценивают с использованием любого ряда анализов in vitro, посредством которых можно оценивать гибель клеток, таких как ADCC, опосредованный комплементом лизис клеток и т.д., как общеизвестно в данной области.

[0337] Таким образом, предпочтительные моноклональные антитела, используемые в терапевтических способах по изобретению, представляют собой любые антитела, которые полностью принадлежат человеку и которые специфически связываются с антигеном-мишенью FLT3 с высокой аффинностью.

XIV.) Смеси ADC к FLT3

[0338] Терапевтические способы по изобретению предусматривают введение одних ADC к FLT3, а также комбинаций или смесей различных МАТ (т.е. МАТ к FLT3 или МАТ, которые связывают другие белки). Такие смеси МАТ могут обладать определенными преимуществами, поскольку они содержат МАТ, которые направлены к различным эпитопам, эксплуатируют различные эффекторные механизмы или комбинируют непосредственно цитотоксические МАТ с МАТ, которые зависят от функциональности эффекторов. Такие МАТ в комбинации могут оказывать синергическое терапевтическое действие. Кроме того, МАТ к FLT3 можно вводить совместно с другими терапевтическими средствами, включая в качестве неограничивающих примеров различные химиотерапевтические и биологические средства, блокаторы андрогенов, иммуномодуляторы (например, IL-2, GM-CSF), хирургию или радиацию. В предпочтительном варианте осуществления МАТ к FLT3 вводят в конъюгированной форме.

[0339] Составы ADC к FLT3 вводят любым маршрутом, обеспечивающим доставку антител к опухолевым клеткам. Маршруты введения в качестве неограничивающих примеров включают внутривенный, интраперитонеальный, внутримышечный, внутриопухолевый, интрадермальный и т.п. Как правило, лечение включает повторное введение препарата ADC к FLT3 подходящим маршрутом введения, таким как внутривенная инъекция (в/в), как правило, в дозе в диапазоне, включем в качестве неограничивающих примеров 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 мг/кг массы тела. Как правило, дозы в диапазоне 10-1000 мг МАТ в неделю являются эффективными и хорошо переносимыми.

[0340] На основе клинической практики с использованием герцептина® (трастузумаба) при лечении метастатического рака молочной железы приемлемой схемой лечения является исходная ударная доза приблизительно 4 мг/кг массы тела пациента в/в с последующими еженедельными дозами приблизительно 2 мг/кг в/в препарата МАТ. Предпочтительно, исходную ударную дозу вводят в виде инфузии длительностью 90 минут или долее. Периодическую поддерживающую дозу вводят в виде инфузии длительностью 30 минут или долее при условии, что исходная доза была хорошо перенесена. Как понятно специалистам в данной области, в каждом конкретном случае на идеальную схему лечения могут влиять различные факторы. Например, такие факторы включают, аффинность связывания и время полужизни используемых МАТ, степень экспрессии FLT3 у пациента, уровень циркулирующего свободного антигена FLT3, желаемый уровень стабильной концентрации антитела, частота лечения и влияние химиотерапевтических или других средств, используемых в комбинации со способом лечения по изобретению, а также состояние здоровья конкретного пациента.

[0341] Необязательно, для помощи в определении наиболее эффективной схемы лечения и т.д. пациентов следует оценивать на уровни FLT3 в данном образце (например, уровни циркулирующего антигена FLT3 и/или экспрессирующие FLT3 клетки). Такие оценки также используют с целью мониторинга на всем протяжении лечения, и они пригодны для определения терапевтической успешности в комбинации с оценкой других параметров (например, цитология мочи и/или уровни иммуноцитов при лечении рака мочевого пузыря или, по аналогии, уровни PSA в сыворотке при лечении рака предстательной железы).

[0342] Целью настоящего изобретения является предоставление ADC к FLT3, которые ингибируют или задерживают рост опухолевых клеток, экспрессирующих FLT3. Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление способов ингибирования ангиогенеза и других биологических функций и, таким образом, снижение роста опухолей у млекопитающих, предпочтительно людей, с использованием таких ADC к FLT3, и, в частности, использованием таких ADC к FLT3 в комбинации с другими лекарственными средствами или иммунологически активными лечебными средствами.

XV.) Комбинированное лечение

[0343] В одном из вариантов осуществления, когда опухоли, включая опухоли человека, обрабатывают ADC к FLT3 в сочетании с химиотерапевтическими средствами или радиацией или их сочетанием, существует синергия. Другими словами, при комбинации с химиотерапевтическими средствами или радиацией или их сочетаниями ингибирование роста опухоли ADC к FLT3 усиливается больше, чем ожидалось. Синергию можно продемонстрировать, например, увеличенным ингибированием роста опухоли при комбинированном лечении, по сравнению с тем, что можно было бы ожидать при лечении только ADC к FLT3 или аддитивным действием лечения ADC к FLT3 и химиотерапевтическим средством или радиацией. Предпочтительно, синергию демонстрируют ремиссией злокачественной опухоли, когда ремиссии на основе лечения только ADC к FLT3 или лечения аддитивной комбинацией ADC к FLT3 и химиотерапевтического средства или радиации не ожидалось.

[0344] Способ ингибирования роста опухолевых клеток с использованием ADC к FLT3 и комбинации химиотерапии или радиации или обоих включает введение ADC к FLT3 перед, в течение или после начала химиотерапии или лучевой терапии, а также любого их сочетания (например, перед и в течение, перед и после, в течение и после или перед, в течение и после начала химиотерапии и/или лучевой терапии). Например, как правило, ADC к FLT3 вводят за 1-60 суток, предпочтительно 3-40 суток, более предпочтительно 5-12 суток до начала лучевой терапии и/или химиотерапии. Однако в зависимости от протокола лечения и конкретных потребностей пациента, способ проводят способом, который обеспечивает наиболее эффективное лечение и, в конечном итоге, продлевает жизнь пациента.

[0345] Введение химиотерапевтических средств можно проводить различными способами, включая системное парентеральными и энтеральными маршрутами. В одном из вариантов осуществления ADC к FLT3 и химиотерапевтическое средство вводят в виде раздельных молекул. Конкретные примеры химиотерапевтических средств или химиотерапии включают цисплатин, дакарбазин (DTIC), дактиномицин, мехлоретамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, прокарбазин, митомицин, цитарабин, этопозид, метотрексат, 5-фторурацил, винбластин, винкристин, блеомицин, паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), альдеслейкин, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, кладрибин, дакарбазин, флоксуридин, флударабин, гидроксимочевина, ифосфамид, интерферон альфа, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пэгаспаргазу, пентостатин, пипоброман, пликамицин, стрептозоцин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепуа, урамустин, винорелбин, гемцитабин, хлорамбуцил, таксол и их сочетания.

[0346] Источник радиации, используемый в комбинации с ADC к FLT3, может являться для подвергаемого лечению пациента наружным или внутренним. Когда источник является для пациента наружным, лечение известно как наружная дистанционная лучевая терапия (EBRT). Когда источник радиации является для пациента внутренним, лечение называют брахитерапией (BT).

[0347] Дополнительно описанные выше схемы лечения можно комбинировать с дополнительными лечебными средствами и/или схемами лечения против злокачественных опухолей, например, дополнительными химиотерапевтическими средствами, вакцинами против злокачественных опухолей, ингибиторами передачи сигнала, средствами, пригодными для лечения аномального роста клеток или злокачественных опухолей, антителами (например, антителами к CTLA-4, как описано в WO/2005/092380 (Pfizer)) или другими лигандами, которые ингибируют рост опухоли, связываясь с IGF-1R, и цитокинами.

[0348] Когда млекопитающих подвергают дополнительной химиотерапии, можно использовать химиотерапевтические средства, описанные выше. Кроме того, можно использовать ингибиторы факторов роста, модификаторы биологического ответа, противогормональную терапию, селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), ингибиторы ангиогенеза и антиандрогены. Например, можно использовать антигормональные средства, например, антиэстрогены, такие как нолвадекс (тамоксифен), или антиандрогены, такие как казодекс (4'-циано-3-(4-фторфенилсульфонил)-2-гидрокси-2-метил-3'-(трифторметил)пропионанилид).

[0349] Указанные выше терапевтические способы можно комбинировать с любой из широкого спектра хирургических, химиотерапевтических или лучевых схем лечения. Терапевтические способы по изобретению могут обеспечивать использование более низких доз химиотерапевтических средств (или других терапевтических средств) и/или менее частое введение, преимущество для всех пациентов, а конкретно особенно для тех, кто плохо переносит токсичность химиотерапевтического средства.

XVI.) Наборы/промышленные изделия

[0350] Для применения в лабораторных, прогностических, профилактических, диагностических и терапевтических приложениях, описываемых в настоящем документе, в объем изобретения входят наборы. Такие наборы могут содержат носитель, упаковку или контейнер, которые разделены для помещения одного или нескольких контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., где каждый из контейнеров содержит один из различных элементов используемых в способе, вместе с ярлыком или вкладкой, содержащим инструкции по применению, такое как применение, описываемое в настоящем документе. Например, контейнер(ы) может содержать антитело, которое мечено детектируемой меткой или можно метить детектируемой меткой. Наборы могут содержать контейнер, содержащий молекулу лекарственного средства. Набор могут содержать всю или часть аминокислотной последовательности, указанной на фигурах 2A, 2B и/или 2C или фигурах 3A, 3B и/или 3C или ее аналоги, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такие аминокислотные последовательности.

[0351] Как правило, набор по изобретению содержит контейнер, описанный выше, и один или несколько других контейнеров, ассоциированных с ним, которые содержат материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы; носитель, упаковку, контейнер, флакон и/или ярлыки пробирок с перечислением содержания и/или инструкции по применению, и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.

[0352] На контейнере или при контейнере может находиться ярлык, указывая на то, что композицию используют для конкретного терапевтического или нетерапевтического применения, такого как прогностическое, профилактическое, диагностическое или лабораторное применение, а также может указывать назначения для применения in vivo или in vitro, такие как назначения, описываемые в настоящем документе. Назначения и/или другая информация также можно включать на вкладку(и) или ярлык(и), которые включены в набор. Ярлык может находиться на контейнере или прилагаться к контейнеру. Ярлык может находиться на контейнере, когда буквы, числа или другие символы, формирующие ярлык вплавлены или выгравированы на самом контейнере; ярлык может прилагаться к контейнеру, когда он находится в таре или средстве транспортировки, которые также содержат контейнер, например, в виде вкладыша в упаковку. Ярлык может указывать, что композицию используют для диагностики, лечения, профилактики или прогноза патологического состояния, такого как злокачественные опухоли тканей, приведенные в таблице I.

[0353] Термины "набор" и "промышленное изделие" можно использовать в качестве синонимов.

[0354] В другом варианте осуществления изобретения предоставлено промышленное изделие(я), содержащее композиции, такие как антитело(а) или конъюгаты антител c лекарственными средствами (ADC), например, материалы, пригодные для диагностики, прогноза, профилактики и/или лечения злокачественных опухолей тканей, таких как приведены в таблице I. Как правило, промышленное изделие содержит по меньшей мере один контейнер и по меньшей мере один ярлык. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и тестовые пробирки. Контейнеры можно формировать из множества материалов, таких как стекло, металл или пластик. Контейнер может содержать аминокислотную последовательность(и), низкомолекулярное соединение(я), последовательности нуклеиновых кислот(ы), популяцию(и) клеток и/или антитело(а). В другом варианте осуществления контейнер содержит антитело, его связывающий фрагмент или специфичный связывающий белок для применения в оценки экспрессии белка FLT3 в клетках и тканях, или для соответствующих лабораторных, прогностических, диагностических, профилактических и терапевтических целей; на такой контейнер можно помещать или прилагать к нему указания и/или показания для таких применений, что также можно делать для реагентов и других композиций или средств, используемых для этих целей.

[0355] Альтернативно контейнер может содержать композицию, которая эффективна для лечения, диагностики, прогноза или профилактики патологического состояния и может содержать стерильное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон с пробкой, протыкаемой иглой для подкожных инъекций). Активные средства в композиции могут представлять собой антитело, способное к специфическому связыванию с FLT3, или конъюгат антитела c лекарственным средством, специфически связывающийся с FLT3.

[0356] Промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и/или раствор декстрозы. Также оно может содержать другие материалы желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, мешалки, иглы, шприцы и/или вкладыши в упаковку с указаниями и/или инструкциями по применению.

[0357] Дополнительные варианты осуществления изобретения, описываемого в настоящем документе, включают варианты осуществления, описанные в приводимых ниже пунктах:

[0358] Пункт 1 представляет собой вариант осуществления антитела, где антитело содержит CDRH1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:23, CDRH2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:29, CDRH3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:32, CDRL1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, CDRL2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 и CDRL3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:20. В альтернативном варианте осуществления антитело содержит CDR, как определено способом Chothia, как представлено в таблице V. В другом альтернативном варианте осуществления антитело содержит CDR, как определено способом Contact, как представлено в таблице V.

[0359] Пункт 2 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по п. 1, и где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 123S SEQ ID NO:11, и содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 108R SEQ ID NO:10.

[0360] Пункт 3 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-2, и где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831, и содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831; или где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836, и содержит вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836.

[0361] Пункт 4 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-3, и где антитело содержит Fc-область, которая принадлежит подтипу IgG.

[0362] Пункт 5 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по п. 4, и где Fc-область содержит замену неприродной аминокислоты в аминокислотном положении 124 тяжелой цепи, и где неприродная аминокислота представляет собой пара-ацетилфенилаланин (pAF).

[0363] Пункт 6 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-5, и где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности с номерами аминокислот от 1 до 452 SEQ ID NO:11, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214 SEQ ID NO:10. В альтернативном варианте осуществления п. 6 антитело представляет собой антитело по п. 1 или п. 2, где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности с номерами аминокислот от 1 до 452 SEQ ID NO:11, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214 SEQ ID NO:10.

[0364] Пункт 7 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-6, и где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO:11, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO:10. В альтернативном варианте осуществления п. 7 антитело представляет собой антитело по п. 1 или п. 2, где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 453K SEQ ID NO:11, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO:10.

[0365] Пункт 8 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-7, и где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа американской коллекции типовых культур (ATCC) PTA-121831, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831. Альтернативный вариант осуществления п. 8 представляет собой антитело по п. 5, где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа американской коллекции типовых культур (ATCC) PTA-121831, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831.

[0366] Пункт 9 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-8, и где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836. Альтернативный вариант осуществления п. 9 представляет собой антитело по любому из пп. 1-5, где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836, и содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836.

[0367] Пункт 10 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-9, и где 1E вариабельной области тяжелой цепи или тяжелой цепи замещен пироглутаминатом.

[0368] Пункт 11 представляет собой дополнительный вариант осуществления, где антитело представляет собой антитело по любому из пп. 1-5, и где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 452G SEQ ID NO:11, и где 1E вариабельной области тяжелой цепи или тяжелой цепи модифицирован до пироглутамината, и где антитело содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO:10. Альтернативный вариант осуществления п. 11 представляет собой антитело по любому из пп. 1-6, где антитело содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1E до 452G SEQ ID NO:11, и где 1E вариабельной области тяжелой цепи или тяжелой цепи модифицирован до пироглутамината, и где антитело содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1D до 214C SEQ ID NO:10.

[0369] Пункт 12 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, содержащий CDR антител по любому из пп. 1-11, и где антигенсвязывающий фрагмент связывается с FLT3.

[0370] Пункт 13 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой антигенсвязывающий фрагмент по п. 12, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, выделенного VH и выделенного VL.

[0371] Пункт 14 представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий фрагмент по п. 12 или п. 13.

[0372] Пункт 15 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой антитело с 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с антителом по любому из пп. 1-10 или 14, и где антитело содержит CDR антитела по любому из пп. 1-14.

[0373] Пункт 16 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой антитело по п. 15, которое связывается с FLT3 с той же аффинностью что и соответствующее антитело по п. 15, и по существу не ингибирует связывание FL с FLT3.

[0374] Пункт 17 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело по любому из пп. 1-10 или 14.

[0375] Пункт 18 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело или их фрагменты по пп. 12 или 13.

[0376] Пункт 19 представляет собой дополнительный вариант осуществления нуклеиновых кислот п. 17 или 18 с 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательностей с нуклеиновыми кислотами по соответствующим пунктам.

[0377] Пункт 20 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой один или несколько экспрессирующих векторов, содержащих одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот по п. 17, или п. 18, или п. 19. В одном из вариантов осуществления п. 20, предоставлен один экспрессирующий вектор, который экспрессирует тяжелые и легкие цепи антитела по любому из пп. 1-19. В дополнительном варианте осуществления экспрессирующий вектор по п. 20 содержит два промотора. В альтернативном варианте осуществления экспрессирующий вектор по п. 20 содержит один промотор. В другом варианте осуществления п. 20, предоставлены два экспрессирующих вектора, один из которых экспрессирует тяжелую цепь, а другой экспрессирует легкую цепь. В дополнительном варианте осуществления каждый экспрессирующий вектор по п. 20 содержит один и тот же промотор. В еще одном дополнительном варианте осуществления каждый из экспрессирующих векторов по п. 20 содержит отличающийся промотор.

[0378] Пункт 21 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую один или несколько экспрессирующих векторов по п. 20.

[0379] Пункт 22 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой антитело, продуцируемое посредством культивирования рекомбинантных клеток-хозяев по п. 21.

[0380] Пункт 23 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством, содержащий антитело по п. 22 и терапевтическое средство.

[0381] Пункт 24 представляет собой вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством, который содержит антитело, которое связывается с FLT3, и терапевтическое средство, где конъюгат антитела c лекарственным средством по существу не ингибирует связывание FLT3 с лигандом FLT3 (FL).

[0382] Пункт 25 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 23 или п. 24, дополнительно содержащий линкер, связывающий антитело и терапевтическое средство.

[0383] Пункт 26 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 25, где линкер представляет собой нерасщепляемый линкер.

[0384] Пункт 27 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 26, где линкер представляет собой 2-(аминоокси)уксусную кислоту.

[0385] Пункт 28 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по любому из пп. 23-27, где терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство.

[0386] Пункт 29 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по любому из пп. 23-28, где терапевтическое средство представляет собой (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид.

[0387] Пункт 30 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством, где конъюгат антитела c лекарственным средством представляет собой любой из конъюгатов антител c лекарственным средством по пп. 23-29, и где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу:

антитело-(линкер-терапевтическое средство)_p,

где линкер представляет собой 2-(аминоокси)уксусную кислоту, и где терапевтическое средство представляет собой (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид, и где p выбран из группы, состоящей из 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3.

[0388] Пункт 31 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 30, где p выбран из группы, состоящей из 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3.

[0389] Пункт 32 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 31, где p выбран из группы, состоящей из 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5.

[0390] Пункт 33 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой конъюгат антитела c лекарственным средством по п. 32, где p выбран из группы, состоящей из 1,8, 1,9 и 2.

[0391] Пункт 34 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество конъюгата антитела c лекарственным средством по любому из пп. 23-33.

[0392] Пункт 35 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой фармацевтическую композицию по п. 34 для применения в терапии.

[0393] Пункт 36 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию по п. 35, где применение в терапии представляет собой лечение злокачественной опухоли.

[0394] Пункт 37 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой фармацевтическую композицию, где фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию по любому из пп. 34-36, в комбинации с одним или несколькими противоопухолевыми средствами.

[0395] Пункт 38 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества конъюгата антитела c лекарственным средством по любому из пп. 23-33 или его фармацевтической композиции. Другой вариант осуществления п. 37 представляет собой вариант осуществления, который представляет собой способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, где способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума включает введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 33-37.

[0396] Пункт 39 представляет собой дополнительный вариант осуществления, который представляет собой фармацевтическую композицию по любому из пп. 33-37 или способ по п. 38, где злокачественная опухоль содержит одну или несколько клеток, которые экспрессируют FLT3 на повышенном по сравнению с незлокачественной клеткой уровне.

ПРИМЕРЫ

[0397] Различные аспекты изобретения дополнительно описаны и проиллюстрированы посредством нескольких примеров, которые приведены ниже, ни один из которых не предназначен для ограничения объема изобретения.

Пример 1

Антиген FLT3

[0398] FLT3, рецептор Fms-подобной тирозинкиназа 3, также известный как Flk2 (киназа 2 зародышевой печени), STK1 (тирозинкиназа 1 стволовых клеток) и CD135, является представителем семейства рецепторов типа III тирозинкиназы (RTK). FLT3 человека кодирует RTK длиной 993 аминокислот, который содержит мембраносвязанный рецептор с пятью иммуноглобулин-подобными внеклеточными доменами и двумя внутриклеточными тирозинкиназными доменами (TKD), связанными при помощи киназного домена-вставки (Stirewalt D.L. et al.; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). Ген FLT3 человека (ID № гена 2322 (национальный центр биотехнологической информации)) расположен на хромосоме 13q12 и имеет 85% гомологии аминокислотной последовательности с FLT3 мыши (Rosnet O. et al.; Oncogene 8:173-179 (1993). FLT3 экспрессирован в нормальных миелоидных и лимфоидных клетках-предшественниках и в лейкозных клетках у 70-90% пациентов с ОМЛ (Carow, C.E. et al.; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet O. et al.; Leukemia 10:238-248 (1996), а также при ОЛЛ. Известно, что FLT3 вовлечен в пролиферацию, дифференцировку и апоптоз гемопоэтических клеток. Лиганд FLT3 (FLT3L), который стимулирует димеризацию и активацию рецептора, таким образом, индуцируя сигнальный каскад по путям PI3киназы и MAPK (Stirewalt D.L. et al.; Nat. Rev. Cancer; 650-665(2003) продуцирует множество гемопоэтических клеток. Приблизительно, у 30% пациентов с ОМЛ выявлены мутации внутренней тандемной дупликации (ITD) FLT3, которые обеспечивают конститутивную активацию рецепторов и нисходящий сигнальный каскад, ассоциированный с плохим исходом заболевания (Gunawardane R.N. et al.; Mom Cancer Ther 12:438-447 (2013). Для обзора иллюстративных вариантов осуществления антигена FLT3, см. фигуру 1.

Пример 2

Получение моноклональных антител (МАТ) к FLT3

[0399] В одном из вариантов осуществления терапевтические моноклональные антитела ("МАТ") к FLT3 включают МАТ, которые реагируют с эпитопами, специфичными для FLT3, которые связываются с FLT3, экспрессируемым на клетках. Иммуногены для получения таких МАТ включают иммуногены, сконструированные так, чтобы кодировать или содержать внеклеточные домены или целую последовательность белка FLT3, области, теоретически рассчитанные как содержащие функциональные мотивы, и области FLT3 теоретически рассчитанные как антигенные посредством компьютерного анализа аминокислотной последовательности. Иммуногены включают пептиды, рекомбинантные белки и клетки (которые эндогенно экспрессируют FLT3 или которые сконструированы для экспрессии FLT3).

[0400] МАТ к FLT3 получали с использованием технологии Veloclmmune® (Regeneron, Tarrytown, NY), где генетически сконструированные мыши генерировали антитела, которые имеют полностью принадлежащие человеку вариабельные области и константные области мышь. МАТ, обозначаемое v62-1b21 (также известное как AGS62.21) получали после иммунизации мышей Veloclmmune® рекомбинантным белком FLT3 человека. МАТ к FLT3, v62-1b21, специфически связывается с белком FLT3 и экспрессирующими FLT3 клетками (рекомбинантный и эндогенный).

[0401] После отбора v62-1b21 (продуцируемый естественным образом линией гибридомных клеток) преобразовывали в экспрессируемое CHO полностью принадлежащее человеку нативное антитело посредством комбинирования последовательностей вариабельных областей человека антитела Veloclmmune® (см. пример 3 - Экспрессия CHv62.21 способами рекомбинантных ДНК), но с константными областями человека, включающими неприродную аминокислоту в положении 124 тяжелой цепи технологией ReCODE, разработанной Ambrx (La Jolla, CA) (см. пример 4 - Экспрессия CHv62.21pAF человека способами рекомбинантных ДНК).

[0402] ДНК, кодирующие последовательности v62-1b21 определяли после выделения иРНК продуцирующих v62-1b21 гибридомных клеток. Последовательности нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелых и легких цепей v62-1b21 к Flt3 получали из гибридомных клеток с использованием приводимого ниже протокола. Секретирующие v62-1b21 гибридомные клетки лизировали реагентом тризолом (Life Technologies, Gibco BRL). Выделяли тотальную РНК и из тотальной РНК получали первую цепь кДНК с применением олигопраймеров (dT)12-18, используя систему амплификации Gibco-BRL Superscript Pre. Затем первую цепь кДНК амплифицировали с использованием праймеров для вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и праймеры для вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека. Продукты ПЦР секвенировали и определяли вариабельные области тяжелой и легкой цепи.

[0403] Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей приведены на фигурах 2A и/или 2B и фигурах 3A и/или 3B. Выравнивание МАТ CHv62.21 с зародышевой линией Ig человека приведено на фигурах 4A-4B.

Пример 3

Экспрессия CHv62.21 способами рекомбинантных ДНК

[0404] Для рекомбинантной экспрессии МАТ CHv62.21 в трансфицированных клетках, последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей МАТ гибридомы v62.21 клонировали выше константных областей тяжелой цепи IgG1 человека и легкой цепи IgK человека, соответственно. Полные кассеты тяжелой цепи и легкой цепи человека МАТ CHv62.21 клонировали в клонирующий вектор ниже промотора/энхансера CMV. Рекомбинантную экспрессирующую конструкцию МАТ CHv62.21 трансфицировали в клетки CHO для стабильной экспрессии в системе Lonza GS (Lonza, Basel, Switzerland). МАТ CHv62.21, секретируемый рекомбинантными клетками CHO, выделяли и оценивали на связывание с FLT3 клеточной поверхности посредством проточной цитометрии. Результаты демонстрируют, что рекомбинантное антитело CHv62.21, экспрессируемое в клетках CHO, связывается FLT3 на клеточной поверхности.

[0405] Результаты также демонстрируют, что рекомбинантно экспрессируемое CHv62.21, экспрессируемое в клетках CHO, связывается с FLT3 подобно v62.21, выделенному из гибридомы. МАТ CHv62.21, секретируемое рекомбинантными клетками, также оценивали на связывание с рекомбинантным белком FLT3 посредством ELISA. Связывание CHv62.21 с белком FLT3 у МАТ, полученного из CHO и из гибридомных клеток, являлось идентичным.

[0406] Клетки китайского хомяка (CHO), продуцирующие антитело, обозначенное CHv62.21, были отправлены (через Federal Express) в американскую коллекцию типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 09-декабря-2014, и им присвоен номер доступа PTA-121831.

[0407] Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей приведены на фигурах 2A и/или 2B и фигурах 3A и/или 3B.

[0408] В результате экспериментального анализа известными в данной области способами (например, расщепление протеазами, анализа LCMS и т.д.) модификации(й) аминокислот МАТ CHv62.21, получаемого из клеток CHO, продемонстрировано, что в большинстве выделенного МАТ CHv62.21 происходит делеция лизина на C-конце тяжелой цепи, а в части выделенного МАТ CHv62.21 происходит пироглутамилирование на N-конце тяжелой цепи и делеция лизина на C-конце тяжелой цепи.

Пример 4

Экспрессия CHv62.21pAF человека способами рекомбинантных ДНК

[0409] Для рекомбинантной экспрессии CHv62.21pAF в трансфицированных клетках последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей МАТ гибридомы v62-1b21 клонировали выше константных областей тяжелой цепи IgG1 человека и легкой цепи IgK человека, соответственно. Полные кассеты тяжелой цепи и легкой цепи человека МАТ CHv62.21 клонировали в клонирующий вектор ниже промотора/энхансера CMV. Рекомбинантную экспрессирующую конструкцию МАТ CHv62.21 трансфицировали в клетки CHO pAFsupl-4E2 (Ambrx, La Jolla, CA), которые стабильно экспрессируют супрессорную тРНК амбер и специфичную для pAF аминоацил-тРНК-синтетазу, с получением стабильных клонов. Стабильные клоны продуцируют CHv62.21pAF при встраивании pAF в МАТ. Стабильные клоны подвергали амплификации генов с последующим субклонированием. CHv62.21pAF, секретируемый стабильным субклоном, выделяли и оценивали на связывание to FLT3 клеточной поверхности посредством проточной цитометрии. Результаты демонстрируют, что рекомбинантное антитело CHv62.21pAF, экспрессируемое клетками CHO, связывается с FLT3 на клеточной поверхности.

[0410] Клетки китайского хомяка (CHO), продуцирующие антитело, обозначенное CHv62.21pAF, были отправлены (через Federal Express) в американскую коллекцию типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 09-декабря-2014, и им присвоен номер доступа PTA-121836.

[0411] Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей приведены на фигурах 2C и/или 2B и фигурах 3C и/или 3B.

[0412] В результате экспериментального анализа известными в данной области способами (например, расщепление протеазами, анализа LCMS и т.д.) модификации(й) аминокислот МАТ CHv62.21pAF, получаемого из клеток CHO, продемонстрировано, что в большинстве выделенного МАТ CHv62.21pAF происходит делеция лизина на C-конце тяжелой цепи, а в части выделенного МАТ CHv62.21pAF происходит пироглутамилирование на N-конце тяжелой цепи и делеция лизина на C-конце тяжелой цепи.

Пример 5

Получение линкерной группы AGL

[0413] В предпочтительном варианте осуществления линкерная группа по настоящему изобретению, обозначаемая AGL, используемая для связывания МАТ к FLT3 по настоящему изобретению, предпочтительно CHv62.21pAF, с группой лекарственного средства по настоящему изобретению, предпочтительно AGD-0182, общеизвестна как 2-(аминоокси)уксусная кислота (Chem-Impex International, Inc., Wood Dale, IL).

[0414] В дополнительном варианте осуществления линкерная группа AGL по настоящему изобретению имеет следующую формулу:

2-(аминоокси)уксусная кислота

Химическая формула: C₂H₆NO₃

Точная масса: 91,0269

Молекулярная масса: 91,0660

масса/заряд: 91,0269 (100,0%), 92,0303 (2,2%)

Пример 6

Получение и синтез группы лекарственного средства AGD-0182

[0415] Группу лекарственного средства, приведенную в формуле (II), получали указанным далее способом. Сначала к перемешиваемой при 23°C суспензии дициклогексиламина Boc-Dap-OH (10,0 г, 21,3 ммоль) и соли HCl H-Phe-NH₂ (6,42 г, 32,0 ммоль) в CH₂Cl₂ (20,0 мл) добавляли DIEA (11,0 г, 14,9 мл, 85,3 ммоль) с последующим добавлением DEPC (5,19 г, 4,80 мл, 0,032 моль). Через 10 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Неочищенную реакционную смесь промывали H₂O (25 мл×2) с последующим насыщенным солевым раствором (25 мл×2). Органическую фракцию сушили над слоем сульфата магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное оранжевое масло очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель 40 pm, 60 Å, размер) с использованием в качестве элюента метанола в CH₂Cl₂ от 2% до 10%. Всего получали 7,25 г Boc-Dap-Phe-NH₂ (16,7 ммоль, 78%) в виде желтого масла. LCMS RT=1,28 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 434,19 [M+H]⁺.

[0416] Далее к перемешиваемой при 23°C суспензии Boc-Dap-Phe-NH₂ (7,25 г, 16,7 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляли TFA (10 мл). Через 5 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Летучие органические вещества выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который использовали без дополнительной очистки. Всего получали 6,00 г H-Dap-Phe-NH₂ в виде оранжевого твердого вещества (13,4 ммоль, 80%). LCMS RT=0,691 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 334,17 [M+H]⁺.

[0417] Затем к перемешиваемой при 23°C суспензии соли TFA Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-OH (456 мг, 0,586 ммоль) и соли TFA H-Dap-Phe-NH₂ (457 мг, 1,02 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли DIEA (0,350 г, 0,500 мл, 2,74 ммоль) с последующим добавлением HATU (0,520 г, 1,37 ммоль). Через 10 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Неочищенную реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки Phenomenex Gemini NX-C18 10мкм 110 Å (150×30 мм) с использованием в качестве элюента от 10% до 90% MeCN в 0,1% водной муравьиной кислоте. Всего получали 526 мг Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ в виде соли муравьиной кислоты (0,513 ммоль, 75%). LCMS RT=1,81 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 980,39 [M+H]⁺.

[0418] В заключение к перемешиваемому при 23°C раствору Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ (525 мг, 0,513 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляли пиперидин (5 мл). Через 2 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. К неочищенному раствору реакционной смеси добавляли гексан (15 мл×3). Слой ацетонитрила концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное масло очищали препаративной ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки Phenomenex Gemini NX-C18 10мкм 110 Å (150×30 мм) с использованием в качестве элюента от 5% до 95% MeCN в 0,1% водном TFA. Всего получали 354 мг указанного в заголовке соединения в виде соли TFA (0,406 ммоль, 79%). LCMS RT=1,15 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 758,24 [M+H]⁺; масса/заряд при HRMS 758,4915 [C₃₈H₆₃N₉O₇+H]⁺.

[0419] Указанным выше синтезом получали следующую группу лекарственного средства, обозначаемую (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид, которая приведена в виде формулы (II):

[0420]

Пример 7

Синтез линкера лекарственного средства AGL и группы лекарственного средства AGD-0182

[0421] Синтез линкерной группы AGL и группы лекарственного средства AGD-0182 проводили указанным далее образом.

[0422] Способ A описан с использованием следующих способов и протоколов:

[0423] 0-0,50 минут: изократически 80 воды/10 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде; 0,50-3,50 минут: линейный градиент от 80 воды/10 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде до 0 воды/90 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде; 3,50-3,99 минут изократически 0 воды/90 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде; 3,99-4,00 минут линейный градиент от 0 воды/90 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде до 80 воды/10 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде.

[0424] Способ B описан с использованием следующих способов и протоколов:

[0425] 0-0,50 минут: изократически 85 воды/5 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде; 0,50-1,60 минут: линейный градиент от 85 воды/5 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде до 0 воды/98 ацетонитрила/2 1% муравьиной кислоты в воде; 1,60-1,80 минут изократически 0 воды/98 ацетонитрила/2 1% муравьиной кислоты в воде; 1,80-1,90 минут линейный градиент от 0 воды/98 ацетонитрила/2 1% муравьиной кислоты в воде до 85 воды/5 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде; 1,90-2,00 минут изократически 85 воды/5 ацетонитрила/10 1% муравьиной кислоты в воде.

[0426] Указанными выше способами синтез проводили следующим образом:

[0427] К перемешиваемой при 23°C суспензии дициклогексиламина Boc-Dap-OH (10,0 г, 21,3 ммоль) и соли HCl H-Phe-NH₂ (6,42 г, 32,0 ммоль) в CH₂Cl₂ (20,0 мл) добавляли DIEA (11,0 г, 14,9 мл, 85,3 ммоль) с последующим добавлением DEPC (5,19 г, 4,80 мл, 0,032 моль). Через 10 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Неочищенную реакционную смесь промывали H₂O (25 мл×2) с последующим насыщенным солевым раствором (25 мл×2). Органическую фракцию сушили над слоем сульфата магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное оранжевое масло очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель 40 мкм, 60 Å, размер) с использованием в качестве элюента от 2% до 10% метанола в CH₂Cl₂. Всего получали 7,25 г Boc-Dap-Phe-NH₂ (16,7 ммоль, 78%) в виде желтого масла. LCMS RT=1,28 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 434,19 [M+H]⁺.

[0428] К перемешиваемой при 23°C суспензии Boc-Dap-Phe-NH₂ (7,25 г, 16,7 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляли TFA (10 мл). Через 5 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Летучие органические соединения выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который использовали без дополнительной очистки. Всего получали 6,00 г H-Dap-Phe-NH₂ в виде оранжевого твердого вещества (13,4 ммоль, 80%). LCMS RT=0,691 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 334,17 [M+H]⁺.

[0429] К перемешиваемой при 23°C суспензии соли TFA Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-OH (456 мг, 0,586 ммоль) и соли TFA H-Dap-Phe-NH₂ (457 мг, 1,02 ммоль) в DMF (10 мл) добавляли DIEA (0,350 г, 0,500 мл, 2,74 ммоль) с последующим добавлением HATU (0,520 г, 1,37 ммоль). Через 10 часов анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. Неочищенную реакционную смесь очищали препаративной ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки Phenomenex Gemini NX-C18 10мкм 110 Å (150×30 мм) с использованием в качестве элюента от 10% до 90% MeCN в 0,1% водной муравьиной кислоты. Всего получали 526 мг Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ в виде соли муравьиной кислоты (0,513 ммоль, 75%). LCMS RT=1,81 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 980,39 [M+H]⁺.

[0430] К перемешиваемому при 23°C раствору Fmoc-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ (525 мг, 0,513 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляли пиперидин (5 мл). Через 2 часа анализ LCMS демонстрировал завершение реакции. К раствору неочищенной реакционной смеси добавляли гексан (15 мл×3). Слой ацетонитрила концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное масло очищали препаративной ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки Phenomenex Gemini NX-C18 10мкм 110 Å (150×30 мм) с использованием в качестве элюента от 5% до 95% MeCN в 0,1% водном TFA. Всего получали 354 мг конечного соединения (MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NFL) в виде соли TFA (0,406 ммоль, 79%). LCMS RT =1,15 минут (способ B); масса/заряд при ESI-MS 758,24 [M+H]⁺; масса/заряд при HRMS 758,4915 C₃₈H₆₃N₉O₇+H]⁺

[0431] К перемешиваемому при 23°C раствору MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ (2,0 г, 2,64 ммоль) и Boc-Aoa (0,53 г, 2,77 ммоль) в DMF (7,0 мл) и DCM (15,0 мл) добавляли HATU (1,05 г, 2,77 ммоль) с последующим добавлением DIPEA (0,51 мл, 2,92 ммоль). Через 1 час реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного раствора в DMF, который дополнительно разбавляли 150 мл EtOAc. Неочищенную реакционную смесь промывали 100 мл насыщенного NaHCO₃ с последующим 100 мл насыщенного солевого раствора. Органическую фракцию сушили над слоем сульфата магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ очищали посредством флэш-хроматографии (силикагель 40 мкм, 60Å, размер) с использованием в качестве элюента от 0% до 5% метанола в CH₂Cl₂. Всего получали 2,13 г Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ (2,29 ммоль, 87%) в виде бежевого твердого вещества. LCMS RT=1,46 минут (способ A); масса/заряд при ESI-MS 931,46 [M+H]⁺.

[0432] К перемешиваемому при 23°C раствору Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N₃)-Dil-Dap-Phe-NH₂ (2,1 г, 2,26 ммоль) в диоксане (15,0 мл) добавляли 4 M HCl в диоксане (10,0 мл, 40,0 ммоль). Через 0,5 часа реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного бледно-желтого масла. Неочищенное бледно-желтое масло растворяли в 6 мл метанола и медленно добавляли (капельно) к энергично перемешиваемому раствору 150 мл EtOAc. В растворе получали белый осадок. Белый осадок из раствора собирали посредством фильтрования и супернатант концентрировали до твердого вещества. Белый осадок и концентрированный супернатант очищали несколькими порциями посредством препаративной ВЭЖХ-ОФ с использованием колонки Phenomenex Gemini 10 мкм, C18 110 Å (150 × 30 мм) с использованием в качестве элюента от 5% до 95% MeCN в 0,001 M соляной кислоте.

[0433] Фракции конечного продукта комбинировали, концентрировали и сушили при пониженном давлении в течение 18 часов с получением белого твердого вещества. Всего получали 1,31 г AGL-0182-30-HCl (1,51 ммоль, 67%). LCMS RT=1,16 минут (способ A); масса/заряд при ESI-MS 831,27 [M+H]⁺.(в целом см. таблицу IV).

[0434] В предпочтительном варианте осуществления AGL-0182-30 имеет следующую формулу:

[0435]

Пример 8

Конъюгация антитела МАТ CHv62.21pAF с лекарственным средством

[0436] МАТ CHv62.21pAF конъюгировали с содержащим долаизолейцин-долапролин пептидом, обозначаемым AGL-0182-30 с использованием алкоксиаминового линкера, описываемого в настоящем документе, с получением конъюгата антитела c лекарственным средством (ADC) по изобретению, обозначаемого CHv62.21pAF-AGL-0182-30, по приведенным ниже протоколам.

[0437] Синтез линкер лекарственного средства AGL-0182-30 проводили способами, описанными в примере 7, озаглавленном "Синтез линкера лекарственного средства AGL и группы лекарственного средства AGD-0182".

[0438] Затем получали конъюгат антитела c лекарственным средством (ADC) по изобретению, обозначаемый CHv62.21pAF-AGL-0182-30, по приводимым ниже протоколам.

[0439] В кратком изложении, 215,5 мл МАТ CHv62.21pAF в концентрации 17,17 мг/мл, сформулированного в 50 мМ цитратном буфере, содержащим 500 мМ NaCl при конечном pH 4,0, добавляют в 9,7 мл 50 мМ цитратного буфера, содержащего 500 мМ NaCl при конечном pH 4,0, 9,1 мл 1,35 M уксусного гидразида (растворенного в воде), 7,26 мл DMSO и 5,08 мл 50 мМ раствора AGL-0182-30 (растворенного в DMSO). Конъюгации позволяют проходить при 28°C в течение 16-24 часов. Избыток AGL-0182-30 и других низкомолекулярных компонентов реакции удаляют посредством ультрафильтрации/диафильтрация с 12 диаобъемами 20 мМ гистидина pH 6,0, содержащего 5% трегалозы.

[0440] Конечный конъюгат антитела c лекарственным средством (ADC) обозначен CHv62.21pAF-AGL-0182-30 и имеет следующую формулу:

[0441]

[0442] где МАТ представляет собой CHv62.21pAF и p составляет от 1,8 до 2,0. Среднее значение p конъюгата антитела c лекарственным средством приведенное в этом примере при масс-спектрометрическом анализе составляло приблизительно 1,9. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения значение p составляет от 1,5 до 2,5.

[0443] Конечный ADC по настоящему изобретению включает в компонент антитела ADC nnAA, при этом линкер лекарственного средства конъюгирован посредством оксимной связи, и его используют для терапевтического лечения злокачественных опухолей, приведенных в таблице I.

Пример 9

Характеристика МАТ CHv62.21

[0444] МАТ, которые связывают FLT3, получали способами, приведенными в примере, озаглавленном "Получение моноклональных антител (МАТ) к FLT3", и подвергали скринингу, идентифицировали и характеризовали с использованием комбинации анализов, известных в данной области.

A. Связывание FACS

[0445] CHv62.21 тестировали на связывание с линиями клеток ОМЛ и B-ОЛЛ, выращиваемыми in vitro. (см., таблицу VII). В кратком изложении CHv62.21 и совпадающее по изотипу контрольное антитело биотинилировали с использованием NHS-LC-биотина. Для всех экспериментов использовали экспоненциально растущие линии злокачественных клеток in vitro. Клетки собирали и отмывали посредством центрифугирования. Клеткам блокировали Fc для снижения неспецифического связывания. Антитела разбавляли до конечной концентрации 10 мкг/мл и совместно инкубировали с клетками при 4°C в течение 1 часа. В конце инкубации клетки отмывали и инкубировали со вторичным детектирующим антителом к стрептавидину-PE с конечным разведением 1:200 (2,5 мкг/мл) в течение 1 часа при 4°C. После отмывки несвязанного вторичного антитела клетки анализировали посредством FACS и определяли и записывали геометрическую среднюю флуоресценцию. Отношение флуоресценции рассчитывали следующим образом: геометрическ. среднее CHv62.21/геометрическ. среднее изотипического контроля=MFR, мера кратности экспрессии по сравнению с изотипическим контролем.

[0446] Получали значения геометрического среднего и средние отношения флуоресценции (MFR) (таблица VI) и приведены гистограммы (таблица VII). Результаты демонстрируют, что CHv62.21 связывается с несколькими линиями злокачественных клеток человека, экспрессирующими ОМЛ и B-ОЛЛ.

B. Активность ADCC

[0447] CHv62.21 и CHv62.21pAF тестировали на активность ADCC in vitro. В кратком изложении, свободные моноклональные антитела и антитела в ADC к FLT3, CHv62.21 и CHv62.21pAF, тестировали на их способность опосредовать зависимую от антител цитотоксическую активность (ADCC) с использованием линий клеток-мишеней EOL-1 и SEM в присутствии эффекторных клеток, нормальных PBMC человека, с использованием нерадиоактивного анализа цитотоксичности CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, G1780).

[0448] За одни (1) сутки до проведения анализа, три (3) флакона эффекторных клеток, нормальных PBMC человека (Hemacare, ID донора: 1888), размораживали, промывали и высевали в колбы для культивирования клеток T-175 в RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сывороткой. Колбы содержали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂ в течение ночи. На следующие сутки PBMC собирали из флаконов для культивирования с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА (Gibco) и промывали и высевали в концентрации 1,0×10⁶ клеток/лунку в буфере для анализа (RPMI1640+0,1%FBS). Клетки-мишени SEM и EOL-1 вместе с линией клеток положительного контроля, Raji, собирали, промывали и высевали в концентрации 2,010⁵ клеток/лунку с использованием буфера для анализа.

[0449] Каждый из тестируемых образцов разбавляли в буфере для анализа до конечной концентрации 2,5 мкг/мл. В лунки 96-луночного круглодонного планшета в трех повторениях добавляли равные объемы клеток-мишеней, тестируемого образца и эффекторных клеток. Планшет осторожно центрифугировали и инкубировали в течение 4 часов во влажном инкубаторе при 37°C. Через четыре (4) часа инкубации анализируемые планшеты центрифугировали и собирали объем 50 мкл супернатанта и переносили в свежий 96-луночный планшет. Определяли активность лактатдегидрогеназы в супернатанте и использованием набора для колориметрической детекции LDH; CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega) с получением показателей оптической плотности при 490 нм.

[0450] Данные анализировали, вычитая сначала среднее значений оптической плотности фона среды для культивирования лунок из всех значений оптической плотности экспериментальных лунок, лунок только с эффекторными клетками, только с мишенью и максимумом мишени. Затем среднее значение показателей оптической плотности нормализовали и активность ADCC рассчитывали с использованием следующей формулы:

[0451] Результаты на фигуре 7 демонстрируют, что МАТ CHv62.21 и CHv62.21pAF не проявляют активности ADCC. Однако положительный контроль, ритуксимаб, подтверждает активность ADCC в линии клеток Raji.

Пример 10

CHv62.21pAF-AGL-0182-30 ингибируют рост опухолей in vivo

[0452] Значительная экспрессия FLT3 в опухолевых клетках вместе с ограниченной экспрессией в нормальных клетках делает FLT3 хорошей мишенью для терапии антителами и, подобным образом, терапии посредством ADC. Таким образом, оценивают терапевтическую эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в моделях ксенотрансплантатов злокачественных опухолей ОЛЛ, ОМЛ и B-ЛЛ человека на мышах.

[0453] Исследуют эффективность действия конъюгата антитела c лекарственным средством на рост опухоли и формирование метастазов в моделях ксенотрансплантатов (например, подкожных и ортотопических) злокачественных опухолей на мышах.

[0454] Подкожные (п/к) опухоли получают посредством инъекции 5×10⁴-10⁶ злокачественных клеток, смешанных при разведении 1:1 с матригелем (Collaborative Research) в правый бок самцов мышей SCID. Для тестирования эффективности действия ADC на формирование опухоли, т.е. инъекции ADC начинали на те же сутки, что и инъекции опухолевых клеток. В качестве контроля мышам инъецировали очищенные IgG человека или PBS; или очищенные МАТ, которые распознают не имеющий значения антиген неэкспрессируемый в клетках человека. В предварительных исследованиях различий в действии на рост опухоли между контрольными IgG или PBS не выявлено. Размеры опухолей определяют посредством измерений циркулем, а объемы опухолей рассчитывают как ширина² × длина/2, где ширина представляет собой наименьший размер, а длина представляет собой наибольший размер. Мышей с подкожными опухолями с диаметром более 1,5 см умерщвляли.

[0455] Преимуществом моделей ксенотрансплантатов злокачественных опухолей является возможность исследовать неоваскуляризацию и ангиогенез. Рост опухоли частично зависит от развития новых кровеносных сосудов. Хотя капиллярная система и развивающаяся кровеносная сеть происходят от хозяина, инициацию и конфигурацию новообразованных сосудов регулирует ксенотрансплантат опухоли (Davidoff et al., Clin Cancer Res. (2001) 7:2870; Solesvik et al., Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20:1295). Действие антитела и низкомолекулярного соединения на неоваскуляризацию исследуют способами, известными в данной области, такими как IHC анализ опухолевых тканей и их микроокружения.

[0456] ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30 ингибирует формирование линии(й) злокачественных клеток, обозначаемых MV4-11, в ксенотрансплантаты подкожных злокачественных опухолей на поздней стадии. Эти результаты указывают на пригодность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 при лечении локальных и продвинутых стадий злокачественных опухолей и, предпочтительно, злокачественных опухолей, приведенных в таблице I.

ADC к FLT3

[0457] Моноклональные антитела индуцировали к FLT3, как описано в примере, озаглавленном entitled "Получение моноклональных антител (МАТ) к FLT3". Далее МАТ конъюгируют с токсином, как описано в примере, озаглавленном "Конъюгация антитела МАТ CHv62.21pAF с лекарственным средством" с получением CHv62.21pAF-AGL-0182-30. CHv62.21pAF и CHv62.21pAF-AGL-0182-30 характеризуют посредством FACS и других известных в данной области способов, определяя его способность связываться с FLT3.

Линии клеток и ксенотрансплантаты

[0458] Клетки поддерживают в DMEM, дополненной L-глутамином и 10% FBS, как известно в данной области. Ксенотрансплантаты MV4-11 поддерживают посредством серийного размножения у мышей SCID.

Эффективность и титрование дозы CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в модели развивающегося подкожно ксенотрансплантата линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантированной мышам CB17/SCID.

[0459] В этом эксперименте клетки MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека (3,0×10⁶ клеток на мышь) инъецировали в бока отдельных мышей SCID и позволяли опухолям расти. Когда средние объемы опухолей достигали предопределенного размера (200 мм³), животных подбирали по размеру опухоли и случайно распределяли в группу обработки и контрольную группу с примерно равным средним размером опухоли и отклонением в каждой группе с использованием программного обеспечения Study Director Software (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Всем исследуем мышам предварительно вводили блокатор Fc (mLYS-lc3.1-hIgG1) в дозе 20 мг/кг посредством интраперитонеальной инъекции в полдень за сутки перед введением лекарственного средства.

[0460] CHv62.21pAF-AGL-0182-30 дозировали на 3 различных уровнях дозирования (0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг) в виде одного болюсного введения посредством внутривенной инъекции. В качестве носителя и контроля ADC использовали 20 мМ гистидин/5% трегалозу, pH 6,0 и 91.1-AGL-0182-30, соответственно. Все средства вводили в зависимости от индивидуальной массы каждого животного, определяемой непосредственно перед каждым дозированием. Рост опухоли в каждой группе проверяли дважды в неделю с использованием измерений циркулем до прекращения исследования. Статистический анализ данных по объему опухоли в течение последних суток до умерщвления животных проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса. Попарные сравнения проводили с использованием критерия Тьюки (2-стороннего) с сохранением экспериментальной погрешности.

[0461] В данном исследовании оценивали эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 и сравнивали ее с контрольным ADC (91.1-AGL-0182-30) в модели ксенотрансплантата В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека MV4-11, подкожно развивающегося у мышей CB17/SCID. CHv62.21pAF-AGL-0182-30 вводили на 3 различных уровнях дозирования (0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг) в виде однократной дозы посредством внутривенной (в/в) болюсной инъекции. В качестве контрольного ADC дозировали 91.1-AGL-0182-30 на уровне 2 мг/кг посредством в/в инъекции. И в качестве контроля носителя использовали 20 мМ гистидин/5% трегалозу, pH 6,0.

[0462] Результаты свидетельствуют об отсутствии статистических различий между обработкой носителем и контрольным ACD (p>0,9999). CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на уровне 2,0 мг/кг статистически значимо вызывал регрессию опухоли на 100% (p<0,0001), по сравнению с исходным размером опухоли в начале дозирования. По сравнению с контролем носителя CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на уровне 1,0 мг/кг статистически значимо ингибировал рост опухоли на 78,1% (p<0,0001). CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в этой модели не продемонстрировал никакой эффективности при дозе 0,5 мг/кг (p=0,5344). (фигура 5).

Эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC1 и CHv62.21pAF (свободное антитело) в модели подкожно развивающегося ксенотрансплантата линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантируемой мышам CB 17 SCID.

[0463] В другом эксперименте клетки MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека (3,0×10⁶ клеток на мышь) инъецировали в бока отдельных мышей SCID и позволяли опухолям расти. Когда средние объемы опухолей достигали предопределенного размера (200 мм³), животных подбирали по размеру опухоли и случайно распределяли в группу обработки и контрольную группу с примерно равным средним размером опухоли и отклонением в каждой группе с использованием программного обеспечения Study Director Software (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Всем исследуем мышам предварительно вводили блокатор Fc (mLYS-lc3.1-hIgG1) в дозе 20 мг/кг посредством интраперитонеальной инъекции в полдень за сутки перед введением лекарственного средства. CHv62.21pAF-AGL-0182-30 и контрольное ADC (91.1-AGL-0182-30) дозировали на уровне 1 мг/кг в виде одного болюсного введения посредством внутривенной инъекции. AGS62P (также известное как CHv62.21pAF) и свободное контрольное антитело (91.1-pAF) дозировали на уровне 2 мг/кг в виде одного болюсного введения посредством внутривенной инъекции. Все средства вводили в зависимости от индивидуальной массы каждого животного, определяемой непосредственно перед каждым дозированием. Рост опухоли в каждой группе проверяли дважды в неделю с использованием измерений циркулем до прекращения исследования. Статистический анализ данных по объему опухоли в течение последних суток до умерщвления животных проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса. Попарные сравнения проводили с использованием критерия Тьюки (2-стороннего) с сохранением экспериментальной погрешности.

[0464] В данном исследовании оценивали эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) и CHv62.21pAF (свободного антитела).

[0465] Результаты демонстрируют, что по сравнению с контрольным ADC (91.1-AGL-0182,30), CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на уровне 1,0 мг/кг в виде однократной дозы посредством внутривенной инъекции статистически значимо ингибировал рост опухоли на 51,4% (p=0,0010). По сравнению со свободным контрольным антителом (91.1-pAF), CHv62.21pAF на уровне 2,0 мг/кг в виде однократной дозы посредством внутривенной инъекции не продемонстрировало статистического различия (p=0,6570). Кроме того, результаты свидетельствуют, что CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на уровне 1,0 мг/кг статистически значимо ингибировал рост опухоли на 54,3%, по сравнению с CHv62.21pAF на уровне 2,0 мг/кг (p=0,0134). (фигура 6).

Эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) и CHv62.21pAF (свободное антитело) в модель подкожно развивающегося ксенотрансплантата линии клеток MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека, имплантированной мышам CB 17 SCID.

[0466] В другом эксперименте клетки MV4-11 В-клеточного миеломоноцитарного лейкоза человека (3,0×10⁶ клеток на мышь) инъецировали в бока отдельных мышей SCID и позволяли опухолям расти. Когда средние объемы опухолей достигали предопределенного размера (200 мм³), животных подбирали по размеру опухоли и случайно распределяли в группу обработки и контрольную группу с примерно равным средним размером опухоли и отклонением в каждой группе с использованием программного обеспечения Study Director Software (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Всем исследуем мышам предварительно вводили блокатор Fc (mLYS-lc3.1-hIgG1) в дозе 20 мг/кг посредством интраперитонеальной инъекции в полдень за сутки перед введением лекарственного средства. CHv62.21 pAF-AGL-0182-30 и контрольное ADC (91.1-AGL-0182-30) дозировали на уровне 2 мг/кг четырежды в неделю в течение 2 недель посредством внутривенной инъекции. AGS62P (также известное как CHv62.21pAF) и свободное контрольное антитело (91.1-pAF) дозировали на уровне 2 мг/кг четырежды в неделю в течение недели посредством внутривенной инъекции. Все средства вводили в зависимости от индивидуальной массы каждого животного, определяемой непосредственно перед каждым дозированием. Рост опухоли в каждой группе проверяли дважды в неделю с использованием измерений циркулем до прекращения исследования. Статистический анализ данных по объему опухоли в течение последних суток до умерщвления животных проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса. Попарные сравнения проводили с использованием критерия Тьюки (2-стороннего) с сохранением экспериментальной погрешности.

[0467] В данном исследовании оценивали эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) и CHv62.21pAF (свободного антитела) с использованием схемы с несколькими дозами в течение периода 2 недели.

[0468] Результаты демонстрируют, что по сравнению с контрольным ADC (91.1-AGL-0182,30), CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на уровне 2,0 мг/кг в виде нескольких доз посредством внутривенной инъекции статистически значимо ингибировал рост опухоли со 100% регрессом опухоли на сутки 17 (p=0,0001). По сравнению со свободным контрольным антителом (91.1-pAF) CHv62.21pAF на уровне 2,0 мг/кг в виде нескольких доз посредством внутривенной инъекции не продемонстрировало статистического различия (фигура 13).

Эффективность CHv62.21pAF-AGL-0182-30 в модели подкожно развивающегося ксенотрансплантата SEM-xcl у мышей CB 17 SCID

[0469] В другом эксперименте, клетки острого лимфобластного лейкоза человека SEM-xcl (1,0×10⁶ клеток на мышь) инъецировали в бока отдельных мышей SCID и позволяли опухолям расти. Когда средние объемы опухолей достигали предопределенного размера (200 мм3), животных подбирали по размеру опухоли и случайно распределяли в группу обработки и контрольную группу с примерно равным средним размером опухоли и отклонением в каждой группе с использованием программного обеспечения Study Director Software (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA).

[0470] CHv62.21pAF-AGL-0182-30 дозировали на уровнях 5,0 мг/кг, 2,0 мг/кг или 1,0 мг/кг в виде одной болюсной дозы на сутки 0 посредством внутривенной инъекции. Контрольное ADC, AGS91.1-pAF-AGL-0182-30, дозировали на уровне 5,0 мг/кг с использованием тех же маршрута и схемы дозирования. В качестве носителя использовали 20 мМ гистидин/5% трегалоза, pH 5,2. Все средства вводили в зависимости от индивидуальной массы каждого животного, определяемой непосредственно перед каждым дозированием. Рост опухоли в каждой группе проверяли дважды в неделю с использованием измерений циркулем до прекращения исследования. Статистический анализ данных по объему опухоли в течение последних суток до умерщвления животных проводили с использованием критерия Крускала-Уоллиса. Попарные сравнения проводили с использованием критерия Тьюки (2-стороннего) с сохранением экспериментальной погрешности.

[0471] Результаты демонстрируют, что CHv62.21pAF-AGL-0182-30 на всех трех уровнях дозирования (5,0, 2,0 и 1,0 мг/кг) продемонстрировал сильную противоопухолевую активность по сравнению с контрольным ADC, AGS91.1-pAF-AGL-0182-30, или с контролем носителя (p<0,0001), в целом приводя более чем к 75% ингибирования роста опухоли. Кроме того, при дозировании на уровне 5,0 мг/кг CHv62.21pAF-AGL-0182-30 приводил к значимому регрессу опухоли на 57,3% по сравнению с исходным начальным объемом опухоли. Наблюдали статистически значимое отличие эффективности между 5,0 мг/кг и 2,0 мг/кг или 1,0 мг/кг. (фигура 14).

Заключение

[0472] В итоге фигуры 5, 6, 13 и 14 демонстрируют, что ADC к FLT3, называемый CHv62.21pAF-AGL-0182-30, значимо ингибировал рост опухолевых клеток, экспрессирующих FLT3 по сравнению с контрольными ADC и свободными антителами, которые связываются с FLT3. Таким образом, CHv62.21pAF-AGL-0182-30 можно использовать в терапевтических целях для лечения и контроля злокачественных опухолей, приведенных в таблице I.

Пример 11

Клинические испытания у человека для лечения и диагностики карциномы человека с использованием ADC к FLT3

[0473] Используют ADC к FLT3 по настоящему изобретению, которое специфически связывается с FLT3, и его используют при лечении определенных опухолей, предпочтительно опухолей, приведенных в таблице I. В отношении каждого из этих показаний успешно используют два клинических подхода.

[0474] I.) Вспомогательная терапия: при вспомогательной терапии пациентов обрабатывают ADC к FLT3 в комбинации с химиотерапевтическим или противоопухолевым средством и/или лучевой терапией или их сочетанием. Первичные злокачественные опухоли-мишени, такие как опухоли, приведенные в таблице I, обрабатывают по стандартным протоколам посредством добавления ADC к FLT3 к стандартной терапии первой и второй линии. В структурах протоколов анализируют эффективность, оцениваемую в приводимых ниже примерах, включая в качестве неограничивающих примеров, снижение массы опухоли первичных или метастатических очагов, увеличенную выживаемость без прогрессирования, общую выживаемость, улучшенное здоровье пациентов, стабилизацию заболевания, а также способность снижать обычные дозы стандартных химиотерапевтических средств и других биологических средств. Эти снижения доз позволяют проведение дополнительной и/или более длительной терапии, снижая дозозависимую токсичность химиотерапевтического или биологического средства. ADC к FLT3 используют в нескольких клинических испытаниях вспомогательной терапии в комбинации с химиотерапевтическими или противоопухолевыми средствами.

[0475] II.) Монотерапия: в рамках использования ADC к FLT3 в монотерапии опухолей, ADC к FLT3 вводят пациентам без химиотерапевтического или противоопухолевого средства. В одном из вариантов осуществления монотерапию проводят клинически у пациентов со злокачественными опухолями на последней стадии с обширным метастатическим заболеванием. В структурах протоколов анализируют эффективность, оцениваемую в приводимых ниже примерах, включая в качестве неограничивающих примеров, снижение массы опухоли первичных или метастатических очагов, увеличенную выживаемость без прогрессирования, общую выживаемость, улучшенное здоровье пациентов, стабилизацию заболевания, а также способность снижать обычные дозы стандартных химиотерапевтических средств и других биологических средств.

Дозировка

[0476] Для обеспечения оптимального желаемого ответа режимы дозирования можно регулировать. Например, можно проводить одно болюсное введение, можно вводить несколько дробных доз с течением времени или дозу можно пропорционально снижать или увеличивать, как показано требованиями терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно формулировать парентеральные композиции в стандартную лекарственную форму для простоты введения и постоянства дозирования. Как используют в настоящем документе, стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для лечения индивидуальных млекопитающих; где каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное так, чтобы обеспечивать требуемое терапевтическое действие, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Описание стандартных лекарственных форм по изобретению продиктовано и непосредственно зависит от (a) уникальных характеристик антител и/или ADC и конкретного терапевтического или профилактического действия, которого необходимо достичь, и (b) ограничений свойственных данной области составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.

[0477] Иллюстративный неограничивающий диапазон терапевтически эффективного количества ADC к FLT3, вводимого в комбинации по изобретению, составляет приблизительно от 0,5 до приблизительно 10 мг/кг, приблизительно от 1 до приблизительно 5 мг/кг, по меньшей мере 1 мг/кг, по меньшей мере 2 мг/кг, по меньшей мере 3 мг/кг или по меньшей мере 4 мг/кг. Другие иллюстративные неограничивающие диапазоны представляют собой, например, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5 мг/кг, или, например, приблизительно от 0,8 до приблизительно 5 мг/кг, или, например, приблизительно от 1 до приблизительно 7,5 мг/кг. Вариант осуществления изобретения с высокой дозой относится к дозе более 10 мг/кг. Следует отметить, что значения доз могут варьировать в зависимости от типа и тяжести облегчаемого патологического состояния, и могут включать одну или несколько доз. Также дополнительно следует понимать, что для любого конкретного индивидуума конкретные режимы дозирования с течением времени следует корректировать в соответствии с потребностями индивидуума и профессиональным решением лица, осуществляющего введение или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, приводимые в настоящем документе, являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или практического применения заявляемой композиции.

План клинического испытания (CDP)

[0478] CDP сопровождает и раскрывает лекарственные средства ADC к FLT3 в отношении вспомогательной терапии или монотерапии. Испытания исходно демонстрируют безопасность, а затем подтверждают эффективность при повторном дозировании. Испытания являются открытыми испытаниями, где сравнивают стандартную химиотерапию со стандартной терапией и ADC к FLT3. Следует понимать, что одним из неограничивающих критериев, который можно использовть для включения пациентов, являются уровни экспрессии FLT3 их опухолей, что определяют посредством биопсии.

[0479] Как и для любого основанного на инфузии белка или антитела терапевтического средства, факторы опасности связаны преимущественно с (i) синдромом высвобождения цитокинов, например, пониженным давлением, лихорадкой, тремором, ознобом; (ii) развитием иммунного ответа на материал (т.е. образование у пациента антител человека на терапевтическое антитело или ответ HAMA); и (iii) токсичностью в отношении нормальных клеток, которые экспрессируют FLT3. Для контроля каждого из этих факторов опасности используют стандартные тесты и наблюдение. Выявлено, что ADC к FLT3 является безопасным при введении человеку.

Пример 12

Детекция белка FLT3 в образцах нормы и полученных у пациентов со злокачественной опухолью

[0480] Детекцию белка FLT3 в злокачественной опухоли с использованием антител к FLT3 оценивали в образцах PBMC периферической крови пациентов с острым лимфоцитарным лейкозом в популяциях миелоидных (ОМЛ) клеток.

A. Материалы и способы для связывания FACS

[0481] В этом эксперименте образцы инкубировали с комбинацией CD45, CD33, CD34, CD3, CD20, CD38 и с МАТ к Flt3-биотином или изотипическим МАТ-биотином. Вторичную детекцию биотинилированных МАТ проводили с использованием стрептавидина-PE. Получали смеси для контроля флуоресценции без одной из меток (FMO) с реагентом для детекции стрептавидином-PE (SAv-PE) и использовали для установки окна для популяций клеток. Для получения данных использовали проточный цитометр LSRII (BD Biosciences).

[0482] Для лимфоцитов окно устанавливали по популяции CD45⁺ в которой идентифицировали четыре различных популяции, CD33⁺/3^-/20^- (миелобласты), CD33⁺/3^-/34⁺/38^- (стволовые клетки), CD33^-/3⁺ (T-клетки) и CD33^-/20⁺ (B-клетки). Анализ проводили с использованием программного обеспечения Flowjo версии 9.5.4 (Tri-Star, Ashland, OR). Значения флуоресценции регистрировали в виде геометрического среднего (MFI).

B. Результаты

[0483] Результаты, приведенные в таблице VIII для образцов, полученных у пациентов с ОМЛ, демонстрируют, что МАТ к FLT3 связывается с популяциями миелоидных клеток, стволовых клеток, T- и B-клеток всех тестируемых образцов.

[0484] Кроме того, как представлено в таблице VIII, диаграммы распределения MFIR для всех тестируемых образцов демонстрируют небольшую вариабельность в популяциях миелоидных клеток, стволовых клеток и B-клеток, тогда как у T-клеток вариабельность MFIR является меньшей. Для ОМЛ среднее MFIR для миелобластов составляло приблизительно 963,1, тогда как среднее MFIR для стволовых клеток составляло 318,2, при этом среднее MFIR для T-клеток составляло 9,842, в то время как MFIR для B-клеток составляло 72,60. Среднее MFIR для образцов нормы составляло 642,4 для миелоидных клеток, 68,29 для стволовых клеток, 11,66 для T-клеток и 13,73 для B-клеток.

[0485] Вся совокупность результатов, приведенных в таблице VIII, демонстрирует, что посредством МАТ к FLT3, таких как МАТ CHv62.21 и МАТ CHv62.21pAF по изобретению, можно детектировать белок FLT3, сверхэкспрессированный при ОМЛ.

Пример 13

Клеточная цитотоксичность in vitro , опосредуемая CHv62.21pAF и CHv62.21pAF-AGL-0182-30

[0486] Способность антитела к FLT3 (CHv62.21pAF) и ADC к FLT3 (CHv62.21pAF-AGF-0182-30) опосредовать зависимую от FLT3 цитотоксичность оценивали с использованием линий клеток лейкоза человека MV-4-11 и MOFM-13, которые эндогенно экспрессируют FLT3, и линии клеток лейкоза человека Karpas299, которая не экспрессирует FLT3.

[0487] В кратком изложении, клетки MV-4-11, MOFM-13 и Karpas299 высевали в 50 мкл полной среды при плотности 1500, 2000 и 3000 клеток/лунку, соответственно, в 96-луночные планшеты и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. На следующие сутки у клеток блокировали Fc в объеме 25 мкл на лунку для снижения неспецифического связывания, и получали 4× исходный раствор CHv62.21pAF-AGF-0182-30, изотипического контрольного антитела, конъюгированного с AGD-0182 (91.1pAF-AGF-0182-30), CHv62.21pAF и изотипического контрольного антитела (91.1pAF) в полных средах, и в соответствующи лунки добавляли 25 мкл серийных разведений ADC и антител. Клетки обрабатывали CHv62.21pAF-AGL-0182-30, 91.1pAF-AGL-0182-30, CHv62.21pAF и 91.1pAF в течение 5 суток в инкубаторе для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. В конце периода инкубации в каждую лунку добавляли 20 мкл Presto Blue и инкубировали в течение 2 часов. Планшеты считывали с использованием планшетного спектрофотометра BioTek Synergy H4 с использованием длины волны возбуждения 540 нм и длины волны испускания 590 нм.

[0488] Результаты в таблице IX демонстрируют, что ADC к FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30) может селективно индуцировать цитотоксичность в отношении экспрессирующих FLT3 линий клеток MOFM-13 и MV-4-11, при этом он не может индуцировать цитотоксичность в отношении неэкспрессирующей FLT3 линии клеток Karpas299. Антитело к FLT3 (CHv62.21pAF) не индуцирует цитотоксичность в отношении линий клеток MOLM-13 и MV-4-11. Таким образом, эти данные демонстрируют, что само МАТ к FLT3 CHv62.21pAF не индуцирует цитотоксичность в отношении клеток. Напротив, только ADC к FLT3 CHv62.21pAF-AGF-0182-30 может селективно уничтожать экспрессирующие FLT3 клетки MOFM-13 и MV-4-11, при этом он не действует на неэкспрессирующие FLT3 клетки Karpas299.

Пример 14

Преимущества CHv62.21pAF по сравнению с МАТ к FLT3 предшествующего уровня техники

[0489] МАТ CHv62.21pAF по изобретению по сравнению с другими МАТ, которые связывают FLT3, предоставляют несколько преимуществ. Особенно когда их рассматривают в свете терапевтической пригодности ADC по изобретению. Например, на предшествующем уровне техники известно, что после лечения пациентов с ОМЛ посредством химиотерапии, происходит повышение экспрессии плазматического лиганда FLT3 ("FL"), см. Takashi, et. al., Blood vol. 117(12) (March 2011). Кроме того, показано, что повышенный FL значимо снижает активность ингибиторов FLT, там же. В качестве ADC, содержащего антитело к FLT3 человека, зарегистрировано EB10, конъюгированное с монометилауристатином F (EB10-MMAF), (см. Proc Amer Assoc Cancer Res, Volume 46, 2005). Показано, что EB10 блокирует FL. См., патент США № 8071099 (Imclone). Таким образом, целью настоящего изобретения является конструирование МАТ, связывающих антиген FLT3, но не связывающих FL.

[0490] В одном из экспериментов подтверждено, что МАТ CHv62.21 по изобретению не блокирует FL. В кратком изложении, рекомбинантный FLT3-Fc человека приобретали в R and D Systems. Этот белок иммобилизовали на поверхности активированных микросфер Luminex с использованием стандартной химии сульфо-NHS/EDC способом, предоставляемым Luminex. С микросферами Luminex, наряду с несколькими другими белками, конъюгировали меченную His версию белка, и это служило в этом способе в качестве контроля.

[0491] Кроме того, в R and D Systems также приобретали лиганд FLT3. Лиганд биотинилировали с использованием Thermo Scientific EZ-Link Sulfo-NHS-LC-биотина, No-Weigh Formula по рекомендациям производителя. Через два (2) часа реакции белка с Sulfo-NHS-LC-биотином невключившийся биотин удаляли посредством диализа против DPBS.

[0492] Оценивали способность FLT3, иммобилизованного на поверхности микросфер, связываться с его биотинилированным лигандом посредством реакции микросфер с различными концентрациями биотинилированного лиганда, полученного в буфере, содержащем PBS, 2% BSA, 0,05% Tween 20 и 0,1% азид натрия, в течение 120 минут при комнатной температуре со слабым перемешиванием. В конце инкубации микросферы аспирировали и промывали. Биотинилированный лиганд FLT3, связанный с его иммобилизованным рецептором детектировали стрептавидином-R-фикоэритрином (Moss, Inc.). Флуоресценцию, ассоциированную с микросферами, определяли на устройстве Luminex. Это определение выявило, что концентрации биотинилированного лиганда FLT3 5 нг/мл было достаточно для получения устойчивого сигнала, но она не насыщала FLT3, ассоциированный с микросферами.

[0493] Наконец, для оценки способности антител к FLT3 в потенциале блокировать лиганд, получали смеси, содержащие биотинилированный лиганд FLT3 в концентрации 5 нг/мл и различных исследуемых антител в концентрации 10 пг/мл. Эти смеси применяли для FLT3, иммобилизованного на микросферах, и инкубировали в течение 60 минут. В конце инкубации микросферы аспирировали и промывали. Биотинилированный лиганд FLT3, связанный с его иммобилизованным рецептором детектировали стрептавидином-R-фикоэритрином (Moss, Inc.). Флуоресценцию, ассоциированную с микросферами, определяли на устройстве Luminex. Антитела со способностью блокировать лиганд наблюдали по снижению MFI (средней интенсивности флуоресценции).

[0494] Результаты на фигуре 8 подтверждают, что МАТ к FLT3 CHv62.21 не блокирует FL, и другое МАТ к FLT3, обозначаемое v62-1b37.1 (таблица X) блокирует FL, подобно МАТ к FLT3 на предшествующем уровне техники, обозначенному EB10 (см., патент США № 8071099).

[0495] Оценивали способность антител к FLT3 (CHv62.21 и v62-1b37.1) опосредовать действие лиганда FLT3 человека с использованием линии клеток лейкоза человека EOL-1, которая эндогенно экспрессирует FLT3. Также использовали изотипическое контрольное антитело (mLys-lc3.1). Клетки EOL-1 высевали в 50 мкл полной среды при плотности 2000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. На следующие сутки клетки обрабатывали 50, 10 или 5 нг/мл лиганда FLT3 человека (в 25 мкл полной среды) и 10, 1, 0,1 и 0 пг/мл тестируемого антитела (в 25 мкл полной среды). В качестве необработанного контроля использовали только среду. Клетки обрабатывали в течение 5 суток в инкубаторе для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. В конце периода инкубации в каждую лунку добавляли 100 мкл Cell Titer Glo и инкубировали в течение 30 минут с перемешиванием при комнатной температуре. Планшеты считывали с использованием планшетного спектрофотометра BioTek Synergy H4 с использованием люминесценции и строили графики с использованием программного обеспечения Graphpad Prism.

[0496] Результаты на фигуре 9 демонстрируют, что v62-1b37.1 ингибирует рост при высоких концентрациях в присутствии лиганда FLT3, а CHv62.21 не оказывает никакого влияния на рост. Лиганд FLT3 человека отдельно влияния на рост линии клеток EOL-1 не оказывает.

[0497] На основе сведений, что после химиотерапии для лечения злокачественных опухолей концентрация FL в плазме возрастает (см., Takashi et. al., выше), показано, что существуют преимущества, когда МАТ к FLT3 по изобретению не блокирует FL. Для подтверждения этой точки зрения показано, что в то время как цитотоксическая активность блокирующих лиганд МАТ в присутствии FL снижена, цитотоксическая активность не блокирующих лиганд МАТ в присутствии FL не снижена.

[0498] Оценивали способность ADC к FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30 и v62-1b21.1-AGL-0129-08) опосредовать зависимую от FLT3 цитотоксичность в отсутствие и в присутствии лиганда FLT3 человека (hFL) с использованием линии клеток лейкоза человека RS-4-11, которая эндогенно экспрессирует FLT3.

[0499] В кратком изложении, клетки RS-4-11 высевали в 50 мкл полной среды при плотности 3000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. На следующие сутки получали ADC в полных средах в концентрации 10 пг/мл и серийно разводили 1:5 всего в 9 точках. Добавляли по 25 мкл серийных разведений ADC в соответствующие лунки с лигандом FLT3 человека и без (100 нг/мл добавляли в 25 мкл на лунку). Клетки обрабатывали v62-1b21.1-AGL-0129-08 (таблица XI, см., WO2015/183978, Agensys, Inc.) и v62-1b37.1-AGL-0129-08 с лигандом FLT3 человека и без в течение 5 суток в инкубаторе для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. В конце периода инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл Presto Blue и инкубировали в течение 2 часов. Планшеты считывали с использованием планшетного спектрофотометра BioTek Synergy H4 с использованием длины волны возбуждения 540 нм и длины волны испускания 590 нм и наносили на графики с использованием программного обеспечения Graphpad Prism.

[0500] Результаты на фигуре 10(A) и 10(B) демонстрируют, что ADC к FLT3 (v62-1b21.1-AGL-0129-08 и v62-1b37.1-AGL-0129-08) могут индуцировать цитотоксичность в отношении экспрессирующей FLT3 линии клеток RS-4-11. ADC к FLT3 v62-1b21.1-AGL-0129-08 обладает сходным уровнем цитотоксичности в присутствии и отсутствии лиганда FLT3 человека. Однако цитотоксическая активность ADC к FLT3 v62-1b37.1-AGL-0129-08 в присутствии лиганда FLT3 человека по сравнению с обработкой ADC без лиганда снижена.

[0501] В другом эксперименте оценивали способность антител к FLT3 CHv62.21 и v62-1b37.1 связываться с FLT3, экспрессированном на поверхности линии клеток лейкоза человека MOLM-13 в присутствии лиганда FLT3 человек (hFL). В качестве отрицательного контроля использовали изотипическое контрольное антитело AGS91.1-pAF.

[0502] В кратком изложении, клетки MOLM-13 высевали при плотности 50000 клеток на лунку в круглодонные 96-луночные планшеты. Планшеты один раз промывали PBS в объеме 150 мкл на лунку. У клеток блокировали Fc (20 мкг/мл) в объеме 50 мкл на лунку в буфере для FACS (PBS+2% FBS+0,1% азид натрия) для снижения неспецифического связывания. Клетки инкубировали при 4°C в течение 15 минут. В соответствующие лунки добавляли лиганд FLT3 человека в концентрации 100 нг/мл и серийно разводили 1:2 в планшете всего в 11 точках. Клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°C с последующим добавлением биотинилированных антител к FLT3. После инкубации получали биотинилированные антитела к FLT3 и изотипическое контрольное антитело в буфере для FACS в концентрации 10 мкг/мл и 1 мкг/мл и в лунки добавляли по 25 мкл и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. Клетки два раза промывали буфером для FACS и добавляли стрептавидин-PE (Jackson immune) по 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа при 4°C. Клетки два раза промывали буфером для FACS и считывали на Attune Cytometer (Life technologies) и анализировали в программном обеспечении FlowJo (Tree Star).

[0503] Результаты на фигуре 11(A) демонстрируют, что лиганд FLT3 человека не препятствует связыванию антитела к FLT3 AGS62P с клетками MOLM-13. Однако лиганд FLT3 человека препятствует связыванию антитела к FLT3 cHv62-1b37.1 с клетками MOLM-13 зависимым от дозы способом.

[0504] В заключение оценивали способность ADC к FLT3 AGS62P1 опосредовать зависимую от FLT3 цитотоксичность в отсутствие и присутствии лиганда FLT3 человека (hFL) с использованием линии клеток лейкоза человека MOLM-13, которая эндогенно экспрессирует FLT3. В качестве отрицательного контроля использовали изотипический контрольный ADC AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30.

[0505] В кратком изложении, клетки MOLM-13 высевали в 50 мкл полной среды при плотности 2000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и помещали в инкубатор для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. На следующие сутки у клеток блокировали Fc в объеме 25 мкл на лунку для снижения неспецифического связывания. Получали ADC в полных средах в конечной концентрации 10 пг/мл и серийно разводили 1:5 всего в 9 точках. 12,5 мкл серийных разведений ADC добавляли в соответствующие лунки с лигандом FLT3 человека и без (100 нг/мл добавляли 12,5 мкл на лунку). Клетки обрабатывали AGS62P1 и AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30 с лигандом FLT3 человека и без в течение 5 суток в инкубаторе для тканевых культур при 37°C; 5% CO₂. В конце периода инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл Presto Blue и инкубировали в течение 2 часов. Планшеты считывали с использованием планшетного спектрофотометр BioTek Synergy H4 с использованием длины волны возбуждения 540 нм и длины волны испускания 590 нм и наносили на графики с использованием программного обеспечения Graphpad Prism.

[0506] Результат на фигуре 11(B) демонстрирует, что лиганд FLT3 человека не препятствует опосредованной ADC к FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30) цитотоксичности в отношении клеток MOLM-13.

[0507] Таким образом, хотя МАТ к FLT3 можно использовать в терапевтическом контексте, не все МАТ к FLT3 являются одинаковыми. Результаты на фигурах 8-11 демонстрируют, что МАТ к FLT3, которые не связываются с FL, предоставляют заметные преимущества по сравнению с МАТ к FLT3, для которых показано, что они связываются с FL. Кроме того, в свете терапевтической пригодности ADC по изобретению, результаты демонстрируют, что ADC, содержащие неблокирующие лиганд МАТ к FLT3, такие как CHv62.21pAF-AGL-0182-30, сохраняют противоопухолевое действие по сравнению с ADC, содержащим блокирующее лиганд МАТ к FLT3 в присутствии FL. Специалистам в данной области понятно, что, как известно, присутствие FL после хемотерапевтического лечения увеличивается. Кроме того, известно, что увеличенное присутствие FL, как показано, снижает активность ингибиторов FLT3. Таким образом, результаты на фигурах 8-11 позволяют предполагать, что ADC, содержащее неблокирующее лиганд МАТ к FLT3, у пациентов со злокачественными опухолями обладает лучшим терапевтическим индексом и противоопухолевым действием по сравнению с ADC, содержащим блокирующее лиганд МАТ к FLT3.

Пример 15

Тест стабильности CHv62.21pAF-AGL-0182-30

[0508] In vitro оценивали стабильность ADC к FLT3 CHv62.21pAF-AGL-0182-30 и других ADC к FLT3 с использованием другого цитотоксического соединения, обозначаемого AGL-0301-20 (см., W02014/043403, Agensys, Inc.). В этом эксперименте в сыворотку человека (Millipore) добавляли 0,4 мг/мл каждого из ADC и фосфат pH 7,3 в конечной концентрации 50 мМ и инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37°C. Собирали 100 мкл аликвот и замораживали при -80°C на 5 минут, 3 часа, 25,25 часов, 51,25 часов и 171,2 часов. Затем все образцы собирали, проводили ELISA для количественного определения компонентов антител и лекарственных средств каждого из ADC.

[0509] Результаты демонстрируют, что связь лекарственного средства и антитела в CHv62.21pAF-AGL-0182-30 является стабильной в течение эксперимента, фигура 12(A). Однако на фигуре 12(B) показано, что связь лекарственное средство-антитело в v62-1b21-AGL-0301-20 является неустойчивой, приводя к значительной деконъюгации в течение эксперимента.

[0510] На всем протяжении настоящей заявки приводятся ссылки на содержание веб-сайтов, публикации, патентные заявки и патенты (ссылки на веб-приводят по их унифицированному локатору ресурса или URL, адресам в всемирной компьютерной сети.) Таким образом, описания каждой из этих ссылок полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.

[0511] Настоящее изобретение не ограничено в объеме описываемыми в настоящем документе вариантами осуществления, которые предназначены только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения и любое, что является их функциональным эквивалентом, находится в объеме изобретения. Специалистам в данной области на основе приведенного выше описания и указаний, в дополнение к описываемым в настоящем документе, очевидны различные модификации моделей и способов по изобретению, и, подобным образом, они находятся в объеме изобретения. Такие модификации или другие варианты осуществления можно осуществлять на практике без отклонения от реального объема и сущности изобретения.

Таблицы

Таблица I: Ткани/клетки, экспрессирующие FLT3 при озлокачествлении

Острый миелолейкоз ("ОМЛ");

Острый лимфобластный лейкоз ("ОЛЛ")

B-клеточный лимфобластный лейкоз;

Лимфобластный лейкоз предшественников B-клеток.

ТАБЛИЦА II: Сокращения аминокислот

ОДНОБУКВЕННОЕ ТРЕХБУКВЕННОЕ ПОЛНОЕ НАИМЕНОВАНИЕ F Phe фенилаланин L Leu лейцин S Ser серин Y Tyr тирозин C Cys цистеин W Trp триптофан P Pro пролин H His гистидин Q Gin глутамин R Arg аргинин 1 lie изолейцин M Met метионин T Thr треонин N Asn аспарагин K Lys лизин V Val валин A Ala аланин D Asp аспарагиновая кислота E Glu глутаминовая кислота G Gly глицин

ТАБЛИЦА III: Матрица замен аминокислот

Адаптировано на основе матрицы замены аминокислот GCG Software 9,0 BLOSUM62 (матрицы замены блоков). Чем большим является значение, тем с большей вероятностью выявляется замена в родственных природных белках.

A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y . 4 0 -2 -1 -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 A 9 -3 -4 -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 C 6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 D 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E 6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 F 6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G 8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H 4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I 5 -2 -1 0 -1 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K 4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L 5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M 6 -2 0 0 1 0 -3 -4 -2 N 7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P 5 1 0 -1 -2 -2 -1 Q 5 -1 -1 -3 -3 -2 R 4 1 -2 -3 -2 S 5 0 -2 -2 T 4 -3 -1 V 11 2 w 7 Y

Таблица IV. Общий способ синтеза AGL-0182-30

Общий способ синтез AGL-0182-30

Где AA1=Аминокислота 1

AA2=Аминокислота 2

AA5=Аминокислота 5

Dil=Долаизолейцин

Dap=Долапролин

Линкер=Аминооксиацетил

Таблица V. Положения CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, идентифицированные по схемам Kabat, Chothia и Contact, соответственно. Для CDR-H1, нумерация остатков приведена с использованием обеих систем нумерации Kabat и Chothia

CDR Kabat Chothia Contact CDR-L1 L24-L34 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:14) L24-L34 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO:15) L30-L36 RNDLGWY (SEQ ID NO:16) CDR-L2 L50-L56 AASSLQS (SEQ ID NO:17) L50-L56 AASSLQS (SEQ ID NO:18) L46-L55 RLIYAASSLQ (SEQ ID NO:19) CDR-L3 L89-L97 LQHNGFPYT (SEQ ID NO:20) L89-L97 LQHNGFPYT (SEQ ID NO:21) L89-L96 LQHNGFPYT (SEQ ID NO:22) CDR-H1* H31-H35 GYSIN (SEQ ID NO:23) H26-H32 GFTFSGY (SEQ ID NO:24) H30-H35 SGYSIN (SEQ ID NO:25) CDR-H1** H31-H35 GYSIN (SEQ ID NO:26) H26-H32 GFTFSGY (SEQ ID NO:27) H30-H35 SGYSIN (SEQ ID NO:28) CDR-H2 H50-H65 SISSSSNYIYYADSVKG (SEQ ID NO:29) H52-H56 SSSSN (SEQ ID NO:30) H47-H58 WVSSISSSSNYI (SEQ ID NO:31) CDR-H3 H95-H102 EGFIAGTTFDAFDI (SEQ ID NO:32) H95-H102 EGFIAGTTFDAFDI (SEQ ID NO:33) H93-H101 AREGFIAGTTFDAFD (SEQ ID NO:34)

*нумерация по Kabat

**нумерация по Chothia

Таблица VI. Таблица значений геометрических средних и значения средних отношений флуоресценции (MFR) при анализе FACS

Линия клеток Тип злокачественной опухоли Источник Неокрашенные Вторичная детекция Изотип cHv62-1b21.1 MFR Karpas-299 ALCL DSMZ 623 596 569 634 1 REH ОЛЛ ATCC 220 236 235 16200 69 EOL-1 ОМЛ Sigma/HPA 282 292 281 14000 50 MOLM-13 ОМЛ DSMZ 303 313 320 14000 44 MONOMAC-1 ОМЛ Creative Bioarray 315 348 338 11400 34 MV-4-11 ОМЛ ATCC 344 355 366 2875 8 OCI-AML2 ОМЛ DSMZ 343 337 329 5646 17 PL-21 ОМЛ DSMZ 598 584 570 3715 7 SKM-1 ОМЛ DSMZ 465 449 445 3208 7 THP-1 ОМЛ ATCC 486 475 474 19700 42 RS4;11 B-ОЛЛ ATCC 184 213 213 18400 86 SEM B-ОЛЛ DSMZ 181 207 212 132000 623 NALM-1 ХМЛ ATCC 197 254 262 12900 49

Таблица VII. Гистограммы, демонстрирующие результаты связывания FACS для каждой линии клеток

Таблица VIII. Экспрессия FLT3 в образцах первичного ОМЛ и нормы

Экспрессия в образцах ОМЛ

Экспрессия FLT3 в образцах ОМЛ

Образцы ОМЛ

Миелоидные клетки Стволовые клетки T-клетки B-клетки Mean 963,1 318,3 9,842 72,60

Экспрессия в образцах нормы

Экспрессия FLT3 в образцах нормы

9 образцов пуповинной крови/1 нормальный костный мозг

Миелоидные клетки Стволовые клетки T-клетки B-клетки Mean 642,4 68,29 11,66 13,73

Таблица IX. Оценка цитотоксичности CHv62.21 pAF-AGL-0182-30 и CHv62.21 pAF в отношении клеток MOLM-13, MV-4-11 и Karpas299 in vitro

Цитотоксичность в отношении MOLM-13

Цитотоксичность в отношении MV-4-11

Цитотоксичность в отношении Karpas299

Таблица X. Последовательность антитела v62-1b37.1

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи v62-1b37.1 (SEQ ID NO:12).

1 EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSG

51 INWNGGSTGYADSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARDG

101 YTYGPFDNWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD

151 YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTY

201 ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

251 DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

301 TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV

351 YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

401 DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Аминокислотная последовательность легкой цепи v62-1b37.1 (SEQ IS NO: 13).

1 DIQMTQSPSS L SASVGDRVTIT CRAS QGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYA

51 ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPYTFGQ

101 GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV

151 DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG

201 LSSPVTKSFNRGEC

Таблица XI. Химический состав AGL-0129-08.

0129-08 означает (S)-метил-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-азидо-2-((S)-2-(диметиламино)-3-метилбутанамидо)-N-метилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), которые связываются с белком FLT3 и его вариантами. FLT3 имеет четко выраженный и ограниченный профиль экспрессии в нормальной ткани/тканях у взрослых, и его экспрессия изменена в злокачественных опухолях, приведенных в таблице I. Таким образом, ADC по изобретению обеспечивают терапевтическую композицию для лечения злокачественной опухоли. 8 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 табл., 15 пр., 14 ил.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с FLT3, содержащее CDRH1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:23, CDRH2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:29, CDRH3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:32, CDRL1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:14, CDRL2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 и CDRL3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:20,

где антигенсвязывающий фрагмент, необязательно, выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv, выделенного VH и выделенного VL;

где, необязательно, антитело содержит Fc-область, которая относится к подтипу IgG; и

где необязательно, антитело содержит Fc-область, которая содержит замену неприродной аминокислотой в аминокислотном положении 124 тяжелой цепи, и

где неприродная аминокислота представляет собой пара-ацетилфенилаланин (pAF).

2. Антитело по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й E до 123-й S SEQ ID NO:11, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й D до 108-й R SEQ ID NO:10;

(ii) тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й E до 452-й SEQ ID NO:11, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й D до 214-й C SEQ ID NO:10;

(iii) тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й E до 453-й K SEQ ID NO:11, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й D до 214-й C SEQ ID NO:10;

(iv) тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 2-й V до 452-й G SEQ ID NO:11, и где 1-я аминокислота тяжелой цепи представляет собой пироглутаминат, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности в диапазоне от 1-й D до 214-й C SEQ ID NO:10;

(v) тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121831; или

(vi) тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности легкой цепи антитела, продуцируемого клеткой китайского хомяка (CHO), которая депонирована под номером доступа ATCC PTA-121836.

3. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2.

4. Вектор экспрессии, содержащий одну или несколько выделенных нуклеиновых кислот по п.3.

5. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.4, для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или 2.

6. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, продуцируемое путем культивирования рекомбинантных клеток-хозяев по п.5, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с FLT-3.

7. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1, 2 и 6, конъюгированное с терапевтическим средством посредством линкера.

8. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FLT3, но по существу не ингибируют связывание FLT3 с лигандом FLT3 (FL).

9. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.7 или 8, где линкер представляет собой нерасщепляемый линкер.

10. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.9, где нерасщепляемый линкер представляет собой 2-(аминоокси)уксусную кислоту.

11. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-10, где терапевтическое средство представляет собой (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид.

12. Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-11, где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу:

антитело-(линкер-терапевтическое средство)_p,

где линкер представляет собой 2-(аминоокси)уксусную кислоту, где терапевтическое средство представляет собой (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-амино-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-3-азидо-N-метил-2-((S)-3-метил-2-(метиламино)бутанамидо)бутанамид, и

где p выбран из группы, состоящей из 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-12,

где фармацевтическая композиция предназначена для терапии злокачественных опухолей и где злокачественная опухоль содержит одну или несколько клеток, которые экспрессируют FLT3.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, где

(a) злокачественная опухоль содержит одну или несколько клеток, которые экспрессируют FLT3 на повышенном уровне по сравнению с не являющейся злокачественной клеткой;

(b) злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из острого миелолейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), B-клеточного лимфобластного лейкоза и лимфобластного лейкоза предшественников B-клеток.

15. Фармацевтическая композиция по п.13 или 14, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит одно или несколько противоопухолевых средств.

16. Способ лечения злокачественной опухоли у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пп.7-12 или фармацевтической композиции по пп.13-15.

17. Способ по п.16, где индивидуум представляет собой человека.

18. Способ по п.16 или 17, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из острого миелолейкоза (ОМЛ), острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), B-клеточного лимфобластного лейкоза и лимфобластного лейкоза предшественников B-клеток.