Родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/347476, поданной 8 июня 2016 г.; и предварительной заявкой на выдачу патента США № 62/366511, поданной 25 июля 2016 г. Полное содержание каждой из вышеуказанных заявок явным образом включено в данный документ с помощью ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был предоставлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 7 июня 2017 года, называется 117813-12620_ST25.txt и имеет размер 159744 байта.
Предпосылки изобретения
Белок B7 гомолог 3 (B7-H3) (также известный как CD276 и B7RP-2 и упоминаемый в данном документе как "B7-H3") представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I суперсемейства иммуноглобулинов. B7-H3 человека содержит предполагаемый сигнальный пептид, V-подобные и C-подобные домены Ig, трансмембранную область и цитоплазматический домен. Дупликация экзонов у человека приводит в результате к экспрессии двух изоформ B7-H3, имеющих либо один IgV-IgC-подобный домен (изоформа 2IgB7-H3), либо IgV-IgC-IgV-IgC-подобный домен (изоформа 4IgB7-H3), содержащий несколько консервативных остатков цистеина. Преобладающая изоформа B7-H3 в тканях и линиях клеток человека представляет собой изоформу 4IgB7-H3 (Steinberger et al., J. Immunol. 172(4): 2352-9 (2004)).
Сообщается, что B7-H3 обладает как костимулирующими, так и коингибирующими сигнальными функциями (см., например, Chapoval et al., Nat. Immunol. 2: 269-74 (2001); Suh et al., Nat. Immunol. 4: 899-906 (2003); Prasad et al., J. Immunol. 173: 2500-6 (2004); и Wang et al., Eur. J. Immunol. 35: 428-38 (2005)). Например, исследования in vitro показали костимулирующую функцию B7-H3, так как B7-H3 был способен увеличить пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и активировать выработку интерферона гамма (IFN-γ) в присутствии антитела к CD3 для имитации сигнала рецептора Т-клеток (Chapoval et al., 2001). Кроме того, исследования in vivo с применением кардиоаллотрансплантатов у мышей B7-H3 -/- показали снижение выработки ключевого цитокина, хемокина и транскриптов mRNA хемокинового рецептора (например, IL-2, IFN-γ, моноцитарного хемоаттрактантного белка (MCP-1) и IFN (IP)-10) по сравнению с контролем дикого типа (Wang et al., 2005). Напротив, коингибирующую функцию B7-H3 наблюдали, например, у мышей, где белок B7-H3 подавлял активацию Т-клеток и выработку эффекторных цитокинов (Suh et al., 2003). Несмотря на то, что для B7-H3 человека не было идентифицированных лигандов, обнаружили, что B7-H3 мыши связывается с триггерным рецептором, экспрессируемым на миелоидных клетках (TREM-), как транскрипт 2 (TLT-2), модулятор клеточных ответов врожденного иммунитета. Связывание B7-H3 мыши с TLT-2 на Т-клетках CD8+ усиливает эффекторные функции Т-клеток, такие как пролиферация, цитотоксичность и выработка цитокинов (Hashiguchi et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 105(30): 10495-500 (2008)).
B7-H3 экспрессируется не конститутивно во многих иммунных клетках (например, естественных клетках-киллерах (NK), Т-клетках и антигенпрезентирующих клетках (APC)), однако его экспрессия может быть индуцирована. Кроме того, экспрессия B7-H3 не ограничивается иммунными клетками. Транскрипты B7-H3 экспрессируются в различных тканях человека, в том числе толстой кишке, сердце, печени, плаценте, предстательной железе, тонком кишечнике, яичках и матке, а также остеобластах, фибробластах, эпителиальных клетках и других клетках нелимфоидной линии, потенциально определяя иммунологические и неиммунологические функции (Nygren et al. Front Biosci. 3:989-93 (2011)). Однако экспрессия белка в нормальной ткани обычно поддерживается на низком уровне и, следовательно, может подвергаться посттранскрипционной регуляции.
B7-H3 также экспрессируется при различных видах рака человека, в том числе рак предстательной железы, светлоклеточная почечно-клеточная карцинома, глиома, меланома, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, рак желудка, острый миелоидный лейкоз (AML), неходжкинская лимфома (NHL), рак яичника, колоректальный рак, рак толстой кишки, почечный рак, гепатоцеллюлярная карцинома, рак почки, рак головы и шеи, гипофарингеальная сквамозная карцинома, глиобластома, нейробластома, рак молочной железы, рак эндометрия и уротелиально-клеточная карцинома. Хотя роль B7-H3 в раковых клетках неясна, его экспрессия может инициировать события передачи сигнала, которые могут защитить раковые клетки от врожденных и адаптивных иммунных реакций. Например, B7-H3 сверхэкспрессируется при высокой интраэпителиальной неоплазии предстательной железы высокой степени и аденокарциноме простаты, а высокие уровни экспрессии B7-H3 в этих раковых клетках связаны с повышенным риском прогрессирования рака после хирургического вмешательства (Roth et al. Cancer Res. 67(16): 7893-900 (2007)). Кроме того, экспрессия B7-H3 в опухоли при NSCLC обратно коррелировала с количеством лимфоцитов, инфильтрующих опухоли, и значительно коррелировала с метастазами в лимфатических узлах (Sun et al. Lung Cancer 53(2): 143-51 (2006)). Уровень циркулирующего растворимого B7-H3 у пациентов с NSCLC также был связан с более поздней стадией опухоли, размером опухоли, метастазами в лимфатических узлах и отдаленными метастазами (Yamato et al., Br. J. Cancer 101(10):1709-16 (2009)).
B7-H3 также может играть важную роль в опосредованных Т-клетками противоопухолевых ответах контекстно-зависимым образом. Например, экспрессия B7-H3 в опухолевых клетках рака желудка положительно коррелирует со временем выживания, глубиной проникновения и типом ткани (Wu et al., World J. Gastroenterol. 12(3): 457-9 (2006)). Кроме того, высокий уровень экспрессии B7-H3 в опухолевых клетках поджелудочной железы был связан с выживанием пациентов после хирургической резекции и достоверно коррелировал с количеством T-клеток CD8+, инфильтрующих опухоль (Loos et al., BMC Cancer 9:463 (2009).
Конъюгаты антитела и лекарственного средства (ADC) представляют собой относительно новый класс терапевтических средств, содержащих антитело, конъюгированное с цитотоксичным лекарственным средством посредством химического линкера. Терапевтическая концепция ADC состоит в объединении способностей к связыванию антитела с лекарственным средством, где антитело применяют для доставки лекарственного средства к опухолевой клетке посредством связывания с целевой поверхностью антигена, в том числе целевой поверхности антигенов, которые сверхэкспрессируются в опухолевых клетках.
В данной области техники существует потребность в антителах к B7-H3 и ADC с антителом к B7-H3, которые можно применять в терапевтических целях при лечении рака.
Краткое описание изобретения
В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает антитела и конъюгаты антитела и лекарственного средства (ADC), которые специфически связываются с B7-H3 человека. В некоторых аспектах настоящее изобретение предусматривает новые ADC, которые могут селективно доставлять ингибиторы Bcl-xL к целевым раковым клеткам, например, экспрессирующим B7-H3 клеткам.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с B7-H3 человека (hB7-H3), где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 15.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 140, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под либо SEQ ID NO: 136 или 138.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с B7-H3 человека (hB7-H3), где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 39.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 34, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 38.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под либо SEQ ID NO: 37.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть относятся к изотипу IgG.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть относятся к изотипу IgG1 или IgG4.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть характеризуются KD 1,5×10-8 или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с hB7-H3, при этом указанное антитело или его антигенсвязывающая часть содержат либо (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 10, 11 и 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 14, 7 и 15, либо (ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 33, 34 и 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 37, 38 и 39.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое связывается с B7-H3 (hB7-H3) человека, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 15.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 140, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под либо SEQ ID NO: 136 или 138.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое связывается с B7-H3 (hB7-H3) человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 39.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 34, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 38.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под либо SEQ ID NO: 37.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 относится к изотипу IgG.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 относится к изотипу IgG1 или IgG4.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 характеризуется KD 1,5×10-8 или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое связывается с hB7-H3, при этом указанное антитело содержит либо (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 10, 11 и 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 14, 7 и 15, либо (ii) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 33, 34 и 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 37, 38 и 39.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть являются гуманизированными.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержат акцепторную каркасную область человека. В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 155,156, 164, 165, 166 и 167. В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность каркасной области на по меньшей мере 65% идентична последовательности указанной акцепторной каркасной области человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных указанной акцепторной каркасной области человека.
В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области по ключевому остатку, причем указанный ключевой остаток выбран из группы, состоящей из остатка, смежного с CDR; остатка в пределах сайта гликозилирования; редкого остатка; остатка, способного взаимодействовать с B7-H3 человека; остатка, способного взаимодействовать с CDR; канонического остатка; контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи; остатка в пределах зоны Vernier; и остатка в области, которая перекрывается между CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определенной по Chothia, и первой каркасной областью тяжелой цепи, определенной по Kabat. В одном варианте осуществления ключевой остаток выбран из группы, состоящей из 48H, 67H, 69H, 71H, 73H, 94H и 2L. В одном варианте осуществления замена ключевого остатка осуществляется в вариабельной области тяжелой цепи и выбрана из группы, состоящей из M48I, V67A, I69L, A71V, K73R и R94G. В одном варианте осуществления замена ключевого остатка осуществляется в вариабельной области легкой цепи и представляет собой I2V.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые связываются с hB7-H3, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 25, 26 и 27, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 29, 30 и 31. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть являются гуманизированными. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержат акцепторную каркасную область человека.
В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 155-158. В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность каркасной области на по меньшей мере 65% идентична последовательности указанной акцепторной каркасной области человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных указанной акцепторной каркасной области человека. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность каркасной области на по меньшей мере 85% идентична, на 90% идентична, на 95% идентична, на 96% идентична, на 97% идентична, на 98% идентична или на 99% идентична последовательности указанной акцепторной каркасной области человека и содержит по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85 аминокислотных остатков, идентичных акцепторной каркасной области человека.
В одном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области по ключевому остатку, причем указанный ключевой остаток выбран из группы, состоящей из остатка, смежного с CDR; остатка в пределах сайта гликозилирования; редкого остатка; остатка, способного взаимодействовать с B7-H3 человека; остатка, способного взаимодействовать с CDR; канонического остатка; контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи; остатка в пределах зоны Vernier; и остатка в области, которая перекрывается между CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определенной по Chothia, и первой каркасной областью тяжелой цепи, определенной по Kabat. В одном варианте осуществления ключевой остаток выбран из группы, состоящей из 69H, 46L, 47L, 64L и 71L. В одном варианте осуществления замена ключевого остатка осуществляется в вариабельной области тяжелой цепи и представляет собой L69I. В одном варианте осуществления замена ключевого остатка осуществляется в вариабельной области легкой цепи и выбрана из группы, состоящей из L46P, L47W, G64V и F71H.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающую часть, содержащие CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136 или 138, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающую часть, содержащие CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть, содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 139, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 135.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть, содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 139, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть, содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 147, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 144.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к hB7-H3, содержащее CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136 или 138, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к hB7-H3, содержащее CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 139, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 135.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 139, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 137.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144.
В одном аспекте антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 147, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 144.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат набор CDR тяжелой цепи, в соответствии с антителом huAb13v1, и набор CDR легкой цепи, в соответствии с антителом huAb13v1. В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, в соответствии с антителом huAb13v1, и вариабельную область легкой цепи, в соответствии с антителом huAb13v1.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат набор CDR тяжелой цепи, в соответствии с антителом huAb3v2.5, и набор CDR легкой цепи, в соответствии с антителом huAb3v2.5. В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, в соответствии с антителом huAb3v2.5, и вариабельную область легкой цепи, в соответствии с антителом huAb3v2.5.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с B7-H3 макака-крабоеда.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть характеризуются константой диссоциации (KD) с hB7-H3, выбранной из группы, состоящей из не более приблизительно 10-7 M; не более приблизительно 10-8 M; не более приблизительно 10-9 M; не более приблизительно 10-10 M; не более приблизительно 10-11 M; не более приблизительно 10-12 M и не более 10-13 M.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть содержат константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина из константного домена IgM человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgG2 человека, константного домена IgG3 человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgA человека или константного домена IgE человека.
В одном варианте осуществления антитело представляет собой IgG, содержащий четыре полипептидные цепи, которые представляют собой
две тяжелые и две легкие цепи.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть содержат константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, который представляет собой константный домен IgG1 человека. В одном варианте осуществления константный домен IgG1 человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 159 или под SEQ ID NO: 160.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающую часть, которая связывается с B7-H3 (hB7-H3) человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 169.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающую часть, которая связывается с B7-H3 (hB7-H3) человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 170 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 171.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает выделенное антитело или его антигенсвязывающую часть, которая связывается с B7-H3 (hB7-H3) человека, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 172, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 173.
В одном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть дополнительно содержат константный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий константный домен каппа-цепи Ig человека или константный домен лямбда-цепи Ig человека.
В одном варианте осуществления антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающая часть конкурируют с антителом или его антигенсвязывающей частью, любым из антител к hB7-H3, или его антигенсвязывающих частей, раскрытых в данном документе.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к hB7-H3 или его антигенсвязывающую часть, как описано в данном документе, а также фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает конъюгат антитела к hB7-H3 и лекарственного средства (ADC), содержащий антитело к hB7-H3, раскрытое в данном документе, конъюгированное с лекарственным средством посредством линкера. В одном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой ауристатин или пирролобензодиазепин (PBD). В одном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой ингибитор Bcl-xL.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает конъюгат (ADC) антитела к hB7-H3 и лекарственного средства, содержащий лекарственное средство, связанное с антителом к B7-H3 человека (hB7-H3) посредством линкера, где лекарственное средство представляет собой ингибитор Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa), (IIb), (IIc) или (IId):
,
,
,
,
где
Ar1 выбран из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила;
Ar2 выбран из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
или их N-оксида и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- или #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен; Z1 выбран из N, CH, C-галоген, C-CH3 и C-CN; каждый из Z2a и Z2b независимо друг от друга выбран из связи, NR6, CR6aR6b, O, S, S(O), S(O)2, -NR6C(O)-,-NR6aC(O)NR6b- и -NR6C(O)O-;
R' представляет собой 
или 
, где #, в случае присоединения к R', присоединен к R' при любом атоме R', который может быть замещен; X' в каждом случае выбран из -N(R10)-, -N(R10)C(O)-, -N(R10)S(O)2-, -S(O)2N(R10)- и -O-; n выбран из 0-3; R10 в каждом случае независимо выбран из водорода, низшего алкила, гетероцикла, аминоалкила, G-алкила и -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2; G в каждом случае независимо выбран из полиола, полиэтиленгликоля с 4-30 повторяющимися звеньями, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH; SPa в каждом случае независимо выбран из кислорода, -S(O)2N(H)-, -N(H)S(O)2-, -N(H)C(O)-, -C(O)N(H) -, -N(H)-, арилена, гетероциклена и необязательно замещенного метилена; где метилен необязательно замещен одним или несколькими из -NH(CH2)2G, NH2, C1-8алкила и карбонила; m2 выбран 0-12; R1 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила, этила и циано; R2 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила и циано; R3 выбран из водорода, метила, этила, галогенметила и галогенэтила; R4 выбран из водорода, низшего алкила и низшего гетероалкила или взят вместе с атомом R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего 3-7 атомов в кольце; каждый из R6, R6a и R6b независимо друг от друга выбран из водорода, необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного низшего гетероалкила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного гетероциклила или взят вместе с атомом из R4 и атомом из R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего 3-7 атомов в кольце; каждый из R11a и R11b независимо друг от друга выбран из водорода, галогена, метила, этила, галогенметила, гидроксила, метокси, CN и SCH3; R12 необязательно представляет собой R' или выбран из водорода, галогена, циано, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного гетероалкила, необязательно замещенного гетероциклила и необязательно замещенного циклоалкила; R13 выбран из необязательно замещенного C1-8алкилена, необязательно замещенного гетероалкилена, необязательно замещенного гетероциклена и необязательно замещенного циклоалкилена; и # представляет собой точку присоединения к линкеру; и где антитело к hB7-H3 связывается с B7-H3 (SEQ ID NO: 149) с константой диссоциации (Kd), составляющей приблизительно 1×10-6 M или меньше. В дополнительном варианте осуществления антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144; и связывается с B7-H3 (SEQ ID NO: 149) с константой диссоциации (Kd), составляющей приблизительно 1×10-6 M или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса; и/или подавляет рост опухоли в анализе ксенотрансплантата немелкоклеточной карциномы легкого (SCLC) человека in vivo с подавлением роста опухоли в % (TGI%), составляющим по меньшей мере приблизительно 50% относительно антитела к IgG человека, которое не является специфическим в отношении B7-H3, где антитело к IgG человека вводят в ходе анализа ксенотрансплантата SCLC в той же дозе и с той же частотой, что и антитело к hB7-H3.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (I):
,
где D представляет собой лекарственное средство, являющееся ингибитором Bcl-xL формулы (IIa), (IIb), (IIc) или (IId); Ab представляет собой антитело к hB7-H3; LK представляет собой ковалентную связь, связывающую линкер (L) с антителом (Ab) к hB7-H3; m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 20.
В одном варианте осуществления G в каждом случае представляет собой соль или фрагмент, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В одном варианте осуществления G в каждом случае представляет собой карбоксилатную, сульфонатную, фосфонатную или аммониевую соль.
В одном варианте осуществления G в каждом случае представляет собой фрагмент, который является заряженным при физиологическом значении pH, выбранный из группы, состоящей из карбоксилата, сульфоната, фосфоната и амина.
В одном варианте осуществления G в каждом случае представляет собой фрагмент, предусматривающий полиэтиленгликоль с 4-30 повторяющимися звеньями или полиол.
В одном варианте осуществления полиол представляет собой сахар.
В одном варианте осуществления ADC представлен формулой (IIa) или формулой (IId), и R' содержит по меньшей мере один замещаемый атом азота, подходящий для присоединения к линкеру.
В одном варианте осуществления G в каждом случае выбран из
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
, где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион.
В одном варианте осуществления R' выбран из 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
,
, 
, 
и 
, где # представляет собой либо атом водорода в содержащемся в ADC лекарственном средстве, представляющем собой ингибитор Bcl-xL формулы (IIb) или (IIc), либо точку присоединения в содержащемся в ADC лекарственном средстве, представляющем собой ингибитор Bcl-xL формулы (IIa) или (IId), к линкеру L.
В одном варианте осуществления Ar1 выбран из , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, циано, метила и галогенметила.
В одном варианте осуществления Ar1 представляет собой .
В одном варианте осуществления Ar2 представляет собой 
, необязательно замещенный одним или несколькими заместителями.
В одном варианте осуществления Ar2 выбран из , , 
, , , , , 
, 
и 
и необязательно замещен одним или несколькими заместителями.
В одном варианте осуществления Ar2 замещен одной или несколькими солюбилизирующими группами.
В одном варианте осуществления каждая солюбилизирующая группа независимо от других выбрана из фрагмента, предусматривающего полиол, полиэтиленгликоль с 4-30 повторяющимися звеньями, соли или фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В одном варианте осуществления Ar2 замещен одной или несколькими солюбилизирующими группами.
В одном варианте осуществления каждая солюбилизирующая группа независимо от других выбрана из фрагмента, предусматривающего полиол, полиэтиленгликоль с 4-30 повторяющимися звеньями, соли или фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В одном варианте осуществления Z1 представляет собой N.
В одном варианте осуществления Z2a представляет собой О.
В одном варианте осуществления R1 представляет собой метил или хлор.
В одном варианте осуществления R2 представляет собой водород или метил.
В одном варианте осуществления R2 представляет собой водород.
В одном варианте осуществления Z2b представляет собой O.
В одном варианте осуществления Z2b представляет собой NH или CH2.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIa):
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIa), которое содержит остов, выбранный из структур (C.1) - (C.21):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIa.1):
(IIa.1),
где Y представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен; r равняется 0 или 1; и s равняется 1, 2 и 3.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIa.2):
(IIa.2),
где U выбран из N, O и CH, при условии, что если U представляет собой O, то Va и R21a отсутствуют; R20 выбран из H и C1-C4алкила; каждый из R21a и R21b независимо друг от друга отсутствует или выбран из H, C1-C4алкила и G, где G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH; каждый из Va и Vb независимо друг от друга отсутствует или выбран из связи и необязательно замещенного алкилена; R20 выбран из H и C1-C4алкила; и s равняется 1, 2 и 3.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIa.3):
(IIa.3),
где Rb выбран из H, C1-C4алкила и Jb-G или необязательно взят вместе с атомом T с образованием кольца, содержащего 3-7 атомов; каждый из Ja и Jb независимо друг от друга выбран из необязательно замещенного C1-C8алкилена и необязательно замещенного фенилена; T выбран из необязательно замещенного C1-C8алкилена, CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2, CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2 и полиэтиленгликоля, содержащего 4-10 этиленгликолевых звеньев; G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH; и s равняется 1, 2 или 3.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIb):
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIb.1):
(IIb.1),
где Y представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен; G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH; r равняется 0 или 1; и s равняется 1, 2 или 3.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIс):
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIc.1):
(IIc.1),
где Ya необязательно замещен C1-C8алкиленом; Yb необязательно замещен C1-C8алкиленом; R23 выбран из H и C1-C4алкила; и G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В одном варианте осуществления ADC представляет собой соединение согласно структурной формуле (IIc.2):
(IIc.2),
где Ya необязательно замещен C1-C8алкиленом; Yb необязательно замещен C1-C8алкиленом; Yc необязательно замещен C1-C8алкиленом; R23 выбран из H и C1-C4алкила; R25 представляет собой Yb-G или взят вместе с атомом Yc с образованием кольца, содержащего 4-6 атомов в кольце; G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В одном варианте осуществления ингибитор Bcl-xL выбран из группы, состоящей из следующих соединений, модифицированных таким образом, что водород, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал:
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({2-[2-(карбоксиметокси)этокси]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
2-{[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}этил)сульфонил]амино}-2-дезокси-D-глюкопираноза;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(4-{[(3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил]метил}бензил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2,3-дигидроксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
2-({[4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил]сульфонил}амино)-2-дезокси-бета-D-глюкопираноза;
8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({2-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин;
3-[1-({3-[2-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-{4-[({2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино)метил]бензил}-2,6-ангидро-L-гулоновая кислота;
4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенилгексопиранозидуроновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[D-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[1-(карбоксиметил)пиперидин-4-ил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[(5S)-5-амино-6-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-6-оксогексил]-N,N-диметилметанаминий;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[пиперидин-4-ил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[N-(2-карбоксиэтил)-L-альфа-аспартил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(2-аминоэтил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этил}(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил){2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
(1ξ)-1-({2-[5-(1-{[3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-карбоксипиридин-2-ил]-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил}метил)-1,5-ангидро-D-глюцит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-глюкопиранoзилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(N6,N6-диметил-L-лизил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
N6-(37-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-L-лизил-N-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-L-аланинамид;
метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин;
6-[7-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-6-[3-(метиламино)пропил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
5-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-5-дезокси-D-арабинит;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{[(2S,3S)-2,3,4-тригидроксибутил]амино}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S,3S,4R,5R,6R)-2,3,4,5,6,7-гексагидроксигептил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({3-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]пропил}сульфонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-дигидроксибутил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-оксидоизохинолин-6-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-({2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}сульфанил)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота и
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{3-[(2-сульфоэтил)амино]пропил}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота.
В одном варианте осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом. В одном варианте осуществления лизосомальный фермент представляет собой катепсин B.
В одном варианте осуществления линкер предусматривает сегмент согласно структурным формулам (IVa), (IVb), (IVc) или (IVd):
,
,
,
,
где пептид представляет собой пептид (показанный N→C, где пептид включает амино- и карбоксильный "концы"), расщепляемый лизосомным ферментом; Т представляет собой полимер, содержащий одно или несколько этиленгликолевых звеньев или алкиленовую цепь или их комбинации;
Ra выбран из водорода, C1-6алкила, SO3H и CH2SO3H; Ry представляет собой водород или C1-4алкил-(O)r-(C1-4алкилен)s-G1 или C1-4алкил-(N)-[(C1-4алкилен)-G1]2; Rz представляет собой C1-4алкил-(O)r-(C1-4алкилен)s-G2; G1 представляет собой SO3H, CO2H, PEG 4-32 или сахарный фрагмент; G2 представляет собой SO3H, CO2H или PEG 4-32 фрагмент; r равняется 0 или 1; s равняется 0 или 1; p представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 5; q равняется 0 или 1; x равняется 0 или 1; y равняется 0 или 1; 
представляет собой точку присоединения линкера к ингибитору Bcl-xL; и * представляет собой точку присоединения линкера к остальной части.
В одном варианте осуществления пептид выбран из группы, состоящей из Val-Cit; Cit-Val; Ala-Ala; Ala-Cit; Cit-Ala; Asn-Cit; Cit-Asn; Cit-Cit; Val-Glu; Glu-Val; Ser-Cit; Cit-Ser; Lys-Cit; Cit-Lys; Asp-Cit; Cit-Asp; Ala-Val; Val-Ala; Phe-Lys; Lys-Phe; Val-Lys; Lys-Val; Ala-Lys; Lys-Ala; Phe-Cit; Cit-Phe; Leu-Cit; Cit-Leu; Ile-Cit; Cit-Ile; Phe-Arg; Arg-Phe; Cit-Trp и Trp-Cit.
В одном варианте осуществления лизосомальный фермент представляет собой β-глюкуронидазу или β-галактозидазу.
В одном варианте осуществления линкер предусматривает сегмент согласно структурным формулам (Va), (Vb), (Vc), (Vd) или (Ve):
,
,
,
,
,
где q равняется 0 или 1; r равняется 0 или 1; X1 представляет собой CH2, O или NH; представляет собой точку присоединения линкера к лекарственному средству; и * представляет собой точку присоединения линкера к остальной части.
В одном варианте осуществления линкер предусматривает сегмент согласно структурным формулам (VIIIa), (VIIIb) или (VIIIc):
или его гидролизованное производное, где Rq представляет собой H или -O-(CH2CH2O)11-CH3; x равняется 0 или 1; y равняется 0 или 1; G3 представляет собой -CH2CH2CH2SO3H или -CH2CH2O-(CH2CH2O)11-CH3; Rw представляет собой -O-CH2CH2SO3H или -NH(CO)-CH2CH2O-(CH2CH2O)12-CH3; * представляет собой точку присоединения линкера к остальной части; и представляет собой точку присоединения линкера к антителу.
В одном варианте осуществления линкер содержит полиэтиленгликолевый сегмент, содержащий 1-6 этиленгликолевых звеньев.
В одном варианте осуществления m равняется 2, 3 или 4.
В одном варианте осуществления линкер L выбран из IVa или IVb.
В одном варианте осуществления линкер L выбран из группы, состоящей из IVa.1-IVa.8, IVb.1-IVb.19, IVc.1-IVc.7, IVd.1-IVd.4, Va.1-Va.12, Vb.1-Vb.10, Vc.1-Vc.11, Vd.1-Vd.6, Ve.1-Ve.2, VIa.1, VIc.1-V1c.2, VId.1-VId.4, VIIa.1-VIIa.4, VIIb.1-VIIb.8, VIIc.1-VIIc.6 в закрытой либо открытой форме.
В одном варианте осуществления линкер L выбран из группы, состоящей из IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVc.7, IVd.4, Vb.9, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4 и VIIc.5, где малеимид из каждого линкера прореагировал с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) либо сукцинамида (открытая форма).
В одном варианте осуществления линкер L выбран из группы, состоящей из IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVd.4, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4, VIIc.5, где малеимид из каждого линкера прореагировал с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) либо сукцинамида (открытая форма).
В одном варианте осуществления линкер L выбран из группы, состоящей из IVb.2, VIIa.3, IVc.6 и VIIc.1, где 
представляет собой точку присоединения к лекарственному средству D, и @ представляет собой точку присоединения к LK, где в случае, если линкер представлен в открытой форме, показанной ниже, @ может находиться в α-положении либо β-положении по отношению к карбоновой кислоте, смежной с ним:
и
.
В одном варианте осуществления LK представляет собой связь, образованную с помощью аминогруппы антитела Ab к hB7-H3.
В одном варианте осуществления LK представляет собой амид или тиoмочевину.
В одном варианте осуществления LK представляет собой связь, образованную с помощью сульфгидрильной группы антитела Ab к hB7-H3.
В одном варианте осуществления LK представляет собой простой тиоэфир.
В одном варианте осуществления LK выбран из группы, состоящей из амида, тиомочевины и простого тиоэфира; и m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 8.
В одном варианте осуществления D представляет собой ингибитор Bcl-xL, как описано в данном документе; L выбран из группы, состоящей из линкеров IVa.1-IVa.8, IVb.1-IVb.19, IVc.1-IVc.7, IVd.1-IVd.4, Va.1-Va.12, Vb.1-Vb.10, Vc.1-Vc.11, Vd.1-Vd.6, Ve.1-Ve.2, VIa.1, VIc.1-V1c.2, VId.1-VId.4, VIIa.1-VIIa.4, VIIb.1-VIIb.8 и VIIc.1-VIIc.6, где каждый линкер вступает в реакцию с антителом Ab с образованием ковалентно присоединяемого фрагмента; LK представляет собой простой тиоэфир; и m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 8.
В одном варианте осуществления D представляет собой ингибитор Bcl-xL, выбранный из группы, состоящей из следующих соединений, модифицированных таким образом, что водород, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал:
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота и
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-дигидроксибутил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
L выбран из группы, состоящей из линкеров IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVc.7, IVd.4, Vb.9, Vc.11, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4 и VIIc.5 в закрытой форме либо в открытой форме;
LK представляет собой простой тиоэфир; и
m представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 4.
В одном варианте осуществления ADC выбран из группы, состоящей из формул i-vi:
(i),
(ii),
(iii),
(iv),
(v) и
(vi),
где m представляет собой целое число от 1 до 6. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен СDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен СDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 160, и/или константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 161. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен СDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен СDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 160, и/или константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 161. В одном варианте осуществления Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления m представляет собой целое число от 2 до 6. В одном варианте осуществления m равняется 2.
В одном варианте осуществления ADC содержит антитело к hB7-H3, содержащее домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен СDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен СDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136 или 138.
В одном варианте осуществления ADC содержит антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В одном варианте осуществления ADC содержит антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В одном варианте осуществления ADC содержит антитело, содержащее домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен СDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, и домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен СDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33.
В одном варианте осуществления ADC содержит антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144.
В одном варианте осуществления ADC выбран из группы, состоящей из huAb3v2.5-CZ, huAb3v2.5-TX, huAb3v2.5-TV, huAb3v2.5-YY, huAb3v2.5-AAA, huAb3v2.5-AAD, huAb3v2.6-CZ, huAb3v2.6-TX, huAb3v2.6-TV, huAb3v2.6-YY, huAb3v2.6-AAD, huAb13v1-CZ, huAb13v1-TX, huAb13v1-TV, huAb13v1-YY, huAb13v1-AAA, huAb13v1-AAD, где CZ, TX, TV, YY, AAA и AAD представляют собой синтоны, раскрытые в таблице B, и где конъюгированные синтоны представлены в открытой либо закрытой форме.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество ADC, описанного в данном документе, а также фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую смесь ADC, которая содержит множество ADC, описанных в данном документе, а также фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления смесь ADC характеризуется средним соотношением лекарственного средства и антитела (DAR), составляющим от 1,5 до 4.
В одном варианте осуществления смесь ADC содержит ADC, каждый из которых характеризуется DAR, составляющим от 1,5 до 8.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения рака, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества ADC, описанного в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.
В одном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака яичника, глиобластомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, меланомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака головы и шеи, рака почки, лейкоза, например, острого миелоидного лейкоза (AML), также лимфомы, например, неходжкинской лимфомы (NHL).
В одном варианте осуществления рак представляет собой плоскоклеточную карциному. В одном варианте осуществления плоскоклеточная карцинома представляет собой плоскоклеточный рак легкого или плоскоклеточный рак головы и шеи.
В одном варианте осуществления рак представляет собой трижды негативный рак молочной железы.
В одном варианте осуществления рак представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
В одном варианте осуществления рак характеризуется как несущий мутацию, приводящую к активации EGFR. В одном варианте осуществления мутация, приводящая к активации EGFR, выбрана из группы, состоящей из мутации, представляющей собой делецию в экзоне 19, одноточечной мутации по типу замены L858R в экзоне 21, точечной мутации T790M и их комбинаций.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ подавления или уменьшения роста солидной опухоли у субъекта, у которого имеется солидная опухоль, при этом указанный способ предусматривает введение эффективного количества ADC, описанного в данном документе, субъекту, у которого имеется солидная опухоль, за счет чего рост солидной опухоли подавляется или уменьшается.
В одном варианте осуществления солидная опухоль представляет собой немелкоклеточную карциному легкого.
В одном варианте осуществления ADC вводят в комбинации с дополнительным средством или дополнительным средством терапии.
В одном варианте осуществления дополнительное средство выбрано из группы, состоящей из антитела к PD1 (например, пембролизумаб), антитела к PD-L1 (например, атезолизумаб), антитела к CTLA-4 (например, ипилимумаб), ингибитора MEK (например, траметиниб), ингибитора ERK, ингибитора BRAF (например, дабрафениб), озимертиниба, эрлотиниба, гефитиниба, сорафениба, ингибитора CDK9 (например, динациклиб), ингибитора MCL-1, темозоломида, ингибитора Bcl-2 (например, венетоклакс), ингибитора Bcl-xL, ибрутиниба, ингибитора mTOR (например, эверолимус), ингибитора PI3K (например, бупарлисиб), дувелисиба, иделалисиба, ингибитора AKT, ингибитора HER2 (например, лапатиниб), таксана (например, доцетаксел, паклитаксел, наб-паклитаксел), ADC, содержащего ауристатин, ADC, содержащего PBD (например, ровалпитузумаба тезирин), ADC, содержащего майтанзиноид (например, TDM1), агониста TRAIL, ингибитора протеосом (например, бортезомиб) и ингибитора никотинамидфосфорилбозилтрансферазы (NAMPT).
В одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению вводят в комбинации с венетоклаксом субъекту-человеку для лечения мелкоклеточного рака легкого (SCLC).
В одном варианте осуществления дополнительное средство терапии представляет собой облучение.
В одном варианте осуществления дополнительное средство представляет собой химиотерапевтическое средство.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения ADC согласно структурной формуле (I):
,
где
D представляет собой лекарственное средство, представляющее собой ингибитор Bcl-xL формулы (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), раскрытых в данном документе;
L представляет собой линкер, раскрытый в данном документе;
Ab представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит CDR тяжелой и легкой цепей huAb3v2.5, huAb3v2.6 или huAb13v1;
LK представляет собой ковалентную связь, связывающую линкер L с антителом Ab; и
m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 20;
при этом способ включает:
обработку антитела в водном растворе с помощью эффективного количества восстанавливающего дисульфидные связи средства при 30-40°C в течение по меньшей мере 15 минут, а затем охлаждение раствора антитела до 20-27°C;
добавление к раствору восстановленного антитела раствора воды/диметилсульфоксида, содержащего синтон, выбранный из группы 2.1-2.176 (таблица B);
регулирование рН раствора до значения рН, составляющего 7,5-8,5;
обеспечение протекания реакции в течение 48-80 часов с образованием ADC;
где масса изменяется на 18±2 а. е. м. для каждого случая гидролиза сукцинимида до сукцинамида, как измерено посредством масс-спектрометрии с ионизацией распылением в электрическом поле; и
где ADC необязательно очищают посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия.
В одном варианте осуществления m равняется 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает ADC, полученный с помощью способа, описанного выше.
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1 показано графическое представление эпитопной группировки гибридомных антител к B7-H3 мыши, как определено с помощью попарных экспериментов по связыванию.
На фигуре 2 показано восстановление антитела, модификация с помощью производного малеимида с получением тиосукцинимидного промежуточного соединения и последующего гидролиза тиосукцинимидного фрагмента.
На фигуре 3 показана структура ADC антитело-малеимидокапроил-vc-PABA-MMAE.
На фигуре 4 показана структура димера PBD (SGD-1882), конъюгированного с антителом (Ab) с помощью малеимидокапроил-валин-аланинового линкера (в совокупности называемого SGD-1910).
На фигуре 5 показано получение характеристик MS легкой цепи и тяжелой цепи huAb13v1 1) перед конъюгацией; 2) после конъюгации с производным малеимида с получением тиосукцинимидного промежуточного соединения и 3) после опосредованного рН 8 гидролиза тиосукцинимидного кольца.
Подробное описание изобретения
Различные аспекты настоящего изобретения относятся к антителам к B7-H3 и фрагментам антител, ADC с антителом к B7-H3, а также к фармацевтическим композициям на их основе, а также нуклеиновым кислотам, рекомбинантным векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для получения таких антител и фрагментов. Способы применения антител, фрагментов и ADC, описанных в данном документе, для выявления B7-H3 человека, подавления активности B7-H3 человека (in vitro или in vivo) и для лечения видов рака также охватываются настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает ADC с антителами к B7-H3, в том числе ADC, содержащие ингибиторы Bcl-xL, синтоны, пригодные для синтеза ADC, композиции, содержащие ADC, способы получения ADC, а также различные способы применения ADC.
Как будет понятно специалистам в данной области, раскрытые в данном документе ADC являются "модульными" по своей природе. Во всем настоящем изобретении описаны различные конкретные варианты осуществления различных "модулей", содержащих ADC, а также синтонов, применимых для синтеза ADC. В качестве конкретных неограничивающих примеров описаны конкретные варианты осуществления антител, линкеров и ингибиторов Bcl-xL, которые могут содержать ADC и синтоны. Предполагается, что все описанные конкретные варианты осуществления можно комбинировать друг с другом, как если бы каждая конкретная комбинация была явно описана отдельно.
Специалистам в данной области техники также будет понятно, что различные описанные в данном документе ADC или синтоны ADC могут быть представлены в форме солей, а в определенных вариантах осуществления, в частности, фармацевтически приемлемых солей. Соединения согласно настоящему изобретению, которые содержат достаточно кислые, достаточно основные или как те, так и другие функциональные группы, могут реагировать с любым из ряда неорганических оснований, а также неорганических и органических кислот с образованием соли. Альтернативно, соединения, которые по своей природе являются заряженными, например, соединения с четвертичным атомом азота, могут образовывать соль с соответствующим противоионом, например, галогенидом, таким как бромид, хлорид или фторид.
Кислоты, обычно используемые для образования солей присоединения кислоты, представляют собой неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т. п., и органические кислоты, такие как п-толуолсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, п-бромфенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота и т. д. К солям присоединения основания относятся соли, полученные из неорганических оснований, таких как гидроксиды, карбонаты, бикарбонаты и т. п. аммония и щелочных или щелочноземельных металлов.
В настоящем изобретении ниже в случае, если включены как структурные схемы, так и номенклатура, и номенклатура противоречит структурной схеме, данная структурная схема имеет преимущественную силу.
Ниже приведена схема подробного описания настоящего изобретения.
I. Определения
II. Антитела к B7-H3
II.A. Химерные антитела к B7-H3
II.B. Гуманизированные антитела к B7-H3
III. Конъюгаты антитела к B7-H3 и лекарственного средства (ADC)
III.A. ADC с антителом к B7-H3 и ингибитором Bcl-xL
III.A.1. Ингибиторы Bcl-xL
III.A.2 Линкеры Bcl-xL
Расщепляемые линкеры
Нерасщепляемые линкеры
Группы, применяемые для присоединения линкеров к антителам B7-H3
Соображения по выбору линкера
III.A.3. Синтоны Bcl-xL ADC
III.A.4 Способы синтеза Bcl-xL ADC
III.A.5. Общие способы синтеза ингибиторов Bcl-xL
III.A.6. Общие способы синтеза синтонов
III.A.7. Общие способы синтеза ADC с антителом к B7-H3
III.B. ADC с антителом к B7-H3. Другие иллюстративные лекарственные средства для конъюгации
III.C. ADC с антителом к B7-H3. Другие иллюстративные линкеры
IV. Очистка ADC с антителом к B7-H3
V. Пути применения антител к B7-H3 и ADC с антителом к B7-H3
VI. Фармацевтические композиции
I. Определения
Для более легкого понимания настоящего изобретения сначала приведены определения некоторых терминов. Кроме того, следует отметить, что во всех случаях перечисления значения или диапазона значений параметра подразумевают, что значения и диапазоны, промежуточные по отношению к перечисленным значениям, также подразумеваются как часть настоящего изобретения.
Под "антителом к B7-H3" подразумевают антитело, которое специфически связывается с B7-H3. Антитело, "которое связывается" с антигеном, представляющим интерес, т. е. B7-H3, способно связывать данный антиген с достаточной аффинностью, так что антитело является пригодным для нацеливания на клетку, экспрессирующую данный антиген. В предпочтительных вариантах осуществления антитело специфически связывается с антителом к B7-H3 человека (hB7-H3). Примеры антител к B7-H3 раскрыты в примерах ниже. Если не указано иное, термин "антитело к B7-H3" предназначен для обозначения антитела, которое связывается с B7-H3 дикого типа (например, 4IgB7-H3 изоформой B7-H3) или любым вариантом B7-H3. Аминокислотная последовательность B7-H3 человека дикого типа представлена ниже под SEQ ID NO: 149, где сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-28) подчеркнут.
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA (SEQ ID NO: 149)
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело или ADC связывается с B7-H3 человека, как определено под SEQ ID NO: 149. Внеклеточный домен (ECD) B7-H3 человека представлен под SEQ ID NO: 152 (включая His-метку). Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело ADC связывается с ECD B7-H3 человека, как описано в ECD под SEQ ID NO: 152.
Термины "специфическое связывание" или "специфически связывается", используемые в данном документе в отношении взаимодействия антитела или ADC со второй химической молекулой, означают, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химической молекуле; например, антитело распознает специфическую белковую структуру и связывается с ней, а не с белками в целом. Если антитело или ADC является специфическим в отношении эпитопа "A", то присутствие молекулы, содержащей эпитоп A (или свободного немеченого A), в реакции, в которой участвуют меченый "A" и антитело, будет снижать количество меченого A, связывающегося с антителом или ADC. В качестве примера, антитело "специфически связывается" с мишенью, если антитело, если оно помечено, может конкурировать с его мишенью с помощью соответствующего немеченого антитела. В одном варианте осуществления антитело специфически связывается с мишенью, например, B7-H3, если антитело характеризуется KD по отношению к мишени, составляющей по меньшей мере приблизительно 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M или меньше (меньше значения, которое составляет менее 10-12, например, 10-13). В одном варианте осуществления термин "специфическое связывание с B7-H3" или "специфически связывается с B7-H3", как используется в данном документе, относится к антителу или ADC, которое связывается с B7-H3 и характеризуется константой диссоциации (KD), составлющей 1,0×10-7 M или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Однако следует понимать, что антитело или ADC могут быть способны специфически связываться с двумя или более антигенами, родственными по последовательности. Например, в одном варианте осуществления антитело может специфически связываться с ортологами B7-H3 как человека, так и животного, отличного от человека (например, мыши или отличного от человека примата).
Термин "антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном и содержит тяжелую(тяжелые) (H) цепь(цепи) и легкую(легкие) (L) цепь(цепи). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном документе как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена - CL. VH- и VL-области могут дополнительно подразделяться на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитело может принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.
Хотя термин "антитело" не подразумевает включение антигенсвязывающих частей антитела (определенных ниже), в определенных вариантах осуществления подразумевается включение небольшого количества делеций аминокислот с карбоксильного конца тяжелой(тяжелых) цепи(цепей). В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, имеющую 1-5 делеций аминокислот с карбоксильного конца тяжелой цепи. В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело, которое представляет собой IgG с четырьмя полипептидными цепями: двумя тяжелыми (H) цепями и двумя легкими (L цепи), которые могут связываться с hB7-H3. В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело IgG, содержащее легкую лямбда- или каппа-цепь.
Используемый в данном документе термин "антигенсвязывающая часть" или "антигенсвязывающий фрагмент" антитела (или просто "часть антитела" или "фрагмент антитела") обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hB7-H3). Было показано, что антигенсвязывающую функцию антитела могут осуществлять фрагменты полноразмерного антитела. Такие варианты осуществления антитела также могут иметь форматы биспецифического антитела, антитела с двойной специфичностью или мультиспецифического антитела; в которых они специфически связываются с двумя или более различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., публикация согласно PCT WO 90/05144 A1, включенная в данный документ посредством ссылки), который содержит один вариабельный домен; и (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с применением рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой VL- и VH-области образуют пару с формированием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающая часть" антитела. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы scFv могут быть включены в состав слитого белка. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых VH- и VL-домены экспрессируются на единой полипептидной цепи, но с помощью линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить возможность образования пары между двумя доменами одной цепи, тем самым заставляя домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антиген-связывающих сайта (см. например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Такие связывающие части антител известны из уровня техники (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
IgG представляет собой класс антител, содержащих две тяжелые цепи и две легкие цепи, расположенные в форме Y. Константный домен IgG обозначает константный домен тяжелой или легкой цепи. Иллюстративные аминокислотные последовательности константных доменов тяжелой цепи и легкой цепи IgG человека известны из уровня техники и представлены в таблице А.
Таблица A. Последовательности константных доменов тяжелой цепи и константных доменов легкой цепи IgG человека
Подразумевается, что используемое в данном документе выражение "выделенное антитело" обозначает антитело, которое практически не содержит других антител с иной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывает B7-H3 практически не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от B7-H3). Однако выделенное антитело, которое специфически связывает B7-H3, может характеризоваться перекрестной реактивностью в отношении других антигенов, таких как молекулы B7-H3 от других видов. Более того, выделенное антитело может по сути не содержать других клеточных материалов и/или химических веществ.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей от видов, отличных от человека (например, мыши), но в которых по меньшей мере часть последовательности VH и/или VL была изменена так, чтобы она была более "похожей на человеческую", т. е. более сходной с вариабельными последовательностями человека зародышевого типа. В частности, термин "гуманизированное антитело" означает антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, который иммуноспецифически связывается с представляющим интерес антигеном и который содержит каркасную (FR) область с аминокислотной последовательностью, по сути являющейся последовательностью антитела человека, и область, определяющую комплементарность (CDR), с аминокислотной последовательностью, по сути являющейся последовательностью антитела от вида, отличного от человека. Используемый в данном документе термин "по сути" в контексте CDR относится к CDR с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 80%, предпочтительно на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99% идентична аминокислотной последовательности CDR из антитела от вида, отличного от человека. Гуманизированное антитело содержит по сути все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух, вариабельных доменов (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv), в которых все или по сути все CDR-области соответствуют CDR-областям из иммуноглобулина от вида, отличного от человека (т. e. донорного антитела), и все или по сути все каркасные области представляют собой каркасные области с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также предпочтительно содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит как легкую цепь, так и по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может содержать CH1-, шарнирную, CH2-, CH3- и CH4-области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В других вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.
Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, в том числе IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, в том числе без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа, и для оптимизации желаемых эффекторных функций могут быть выбраны конкретные константные домены с применением методик, хорошо известных из уровня техники.
Термины "нумерация по Kabat", "определения по Kabat" и "мечение по Kabat" используются в данном документе взаимозаменяемо. Эти термины, которые приняты в данной области техники, обозначают систему нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т. e. гипервариабельными), чем остальные аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 и Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В случае с вариабельной областью тяжелой цепи гипервариабельная область расположена в пределах аминокислотных положений 31-35 для CDR1, аминокислотных положений 50-65 для CDR2 и аминокислотных положений 95-102 для CDR3. В случае с вариабельной областью легкой цепи гипервариабельная область расположена в пределах аминокислотных положений 24-34 для CDR1, аминокислотных положений 50-56 для CDR2 и аминокислотных положений 89-97 для CDR3.
Используемый в данном документе термин "CDR" обозначает область, определяющую комплементарность, в пределах вариабельных последовательностей антитела. В каждой вариабельной области тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) имеется по три CDR, которые обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3 (или, в частности, CDR1 HC, CDR2 HC, CDR3 HC, CDR1 LC, CDR2 LC и CDR3 LC) в каждой вариабельной области. Используемый в данном документе термин "набор CDR" обозначает группу из трех CDR, которые находятся в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы этих CDR были по-разному определены в различных системах. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) и (1991)), не только обеспечивает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также обеспечивает обозначение точных границ остатков, определяющих три CDR. Эти CDR могут обозначаться как CDR по Kabat. Chothia и сотрудники (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) и Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) обнаружили, что определенные субфрагменты в пределах CDR по Kabat принимают практически идентичные конформации пептидного остова, несмотря на то, что характеризуются большим разнообразием на уровне аминокислотной последовательности. Эти субфрагменты были обозначены как L1, L2 и L3 или H1, H2 и H3, где "L" и "H" обозначают соответственно области легкой цепи и тяжелой цепи. Эти области могут обозначаться как CDR по Chothia, которые имеют границы, перекрывающиеся с CDR по Kabat. Другие границы, определяющие CDR, которые перекрываются с CDR по Kabat, были описаны в Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) и MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Границы CDR согласно прочим определениям могут не строго следовать одной из вышеперечисленных систем, но, тем не менее, будут перекрываться с CDR по Kabat, хотя они могут быть укорочены или удлинены в свете прогнозов или экспериментальных сведений о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже CDR в целом значительно не воздействуют на связывание антигена. В способах, применяемых в данном документе, могут использоваться CDR, определенные согласно любой из этих систем, хотя в предпочтительных вариантах осуществления применяются CDR, определенные по Kabat или Chothia.
Используемый в данном документе термин "каркасная область" или "последовательность каркасной области" обозначает остальные последовательности вариабельной области за исключением CDR. Поскольку точное определение последовательности CDR может быть обусловлено различными системами, смысл выражения "последовательность каркасной области" устанавливается в соответствии с различными интерпретациями. Шесть CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 легкой цепи и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи) также делят каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) в каждой цепи, в которых CDR1 расположена между FR1 и FR2, CDR2 между FR2 и FR3, а CDR3 между FR3 и FR4. Без указания конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4 каркасная область, как обозначено в других случаях, представляет объединенные FR в пределах вариабельной области одной встречающейся в природе цепи иммуноглобулина. Используемое в данном документе выражение "одна FR" представляет одну из четырех подобластей, а "несколько FR" представляют две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.
Каркасная область и CDR-области гуманизированного антитела не должны точно соответствовать исходным последовательностям, например, CDR донорного антитела или консенсусная каркасная область могут быть подвергнуты мутагенезу путем замены, вставки и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка таким образом, что остаток CDR или каркасной области в данном участке не соответствует ни донорному антителу, ни консенсусной каркасной области. Однако в предпочтительном варианте осуществления такие мутации не будут распространенными. Обычно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% остатков в гуманизированном антителе будут соответствовать остаткам в последовательностях исходных FR и CDR. Используемый в данном документе термин "консенсусная каркасная область" относится к каркасной области в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин "консенсусная последовательность иммуноглобулина" относится к последовательности, образованной из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей иммуноглобулина (см. например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В семействе иммуноглобулинов каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, которая встречается наиболее часто в данном положении у данного семейства. Если две аминокислоты встречаются с одинаковой частотой, любая из них может быть включена в консенсусную последовательность.
Термин "акцепторная каркасная область человека", используемый в данном документе, предназначен для обозначения каркасной области антитела или его фрагмента, содержащей аминокислотную последовательность каркасной области VH или VL, полученной из антитела человека или его фрагмента, или консенсусную последовательность каркасной области человека, в которую могут быть включены CDR от видов, отличных от человека.
Выражение "процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" относительно пептидной или полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в конкретной пептидной или полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые входят в компетенцию специалиста в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, изложенной под любым из SEQ ID NO: 1-148.
Термин "поливалентное антитело" используется в данном документе для обозначения антитела, содержащего два или более антигенсвязывающих участка. В определенных вариантах осуществления поливалентное антитело может быть сконструировано так, чтобы оно имело три или более антигенсвязывающих участка, и оно обычно представляет собой не встречающееся в природе антитело.
Термин "мультиспецифическое антитело" относится к антителу, способному связывать два или больше неродственных антигенов. В одном варианте осуществления мультиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое способно связываться с двумя неродственными антигенами, например, биспецифическим антителом или его антигенсвязывающей частью, которые связываются с B7-H3 и CD3.
Термин "двойной вариабельный домен" или "DVD", как используется взаимозаменяемо в данном документе, представляет собой антигенсвязывающие белки, которые содержат два или более антигенсвязывающих сайтов и являются тетравалентными или мультивалентными связывающими белками. Такие DVD могут быть моноспецифическими, т. е. способными связывать один антиген, или мультиспецифическими, т. е. способными связывать два или более антигенов. DVD-связывающие белки, содержащие два DVD-полипептида тяжелой цепи и два DVD-полипептида легкой цепи, обозначаются как DVD-Ig. Каждая половина DVD-Ig содержит DVD-полипептид тяжелой цепи и DVD-полипептид легкой цепи, а также два антигенсвязывающих сайта. Каждый связывающий участок содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, содержащие в общей сложности 6 CDR, вовлеченных в связывание антигена, на антигенсвязывающий участок. В одном варианте осуществления CDR, описанные в данном документе, используют в DVD антитела к B7-H3.
Термин "рецептор химерного антигена" или "CAR" относится к рекомбинантному белку, содержащему по меньшей мере (1) антигенсвязывающую область, например, вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела, (2) трансмембранный домен для заякоривания CAR в Т-клетке и (3) один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов.
Термин "активность" включает виды активности, такие как специфичность/аффинность связывания антитела или ADC с антигеном, например антитела к hB7-H3, которое связывается с антигеном hB7-H3 и/или нейтрализующая активность антитела, например, антитела к hB7-H3, связывание которого с hB7-H3 подавляет биологическую активность hB7-H3, например, подавление пролиферации линий клеток, экспрессирующих B7-H3, например клеток H146 карциномы легкого человека, клеток H1650 карциномы легкого человека или клеток EBC1 карциномы легкого человека.
Термин "анализ ксенотрансплантата немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC)", используемый в данном документе, относится к анализу in vivo, используемому для определения того, могут ли антитело к B7-H3 или ADC подавлять рост опухоли (например, дальнейший рост) и/или уменьшать рост опухоли, полученной в результате трансплантации клеток NSCLC мыши с иммунодефицитом. Анализ ксенотрансплантата NSCLC включает трансплантацию клеток NSCLC мыши с иммунодефицитом таким образом, чтобы опухоль росла до желаемого размера, например, 200-250 мм3, после чего мыши вводят антитело или ADC, чтобы определить, может ли антитело или ADC ингибировать рост опухоли и/или уменьшать его темпы. В определенных вариантах осуществления активность антитела или ADC определяют согласно проценту ингибирования роста опухоли (% TGI) по сравнению с контрольным антителом, например, антителом IgG человека (или их группой), которое не связывает специфически опухолевые клетки, например, направлено на антиген, не ассоциированный с раком или полученный из источника, который не является раковым (например, из нормальной сыворотки человека). В таких вариантах осуществления антитело (или ADC) и контрольное антитело вводят мыши в одной и той же дозе с одной и той же частотой и одним и тем же путем. В одном варианте осуществления мышь, используемая в анализе ксенотрансплантата NSCLC представляет собой мышь с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) и/или бестимусную голую мышь CD-1. Примеры клеток NSCLC, которые можно использовать в анализе ксенотрансплантата NSCLC, включают без ограничения клетки H1299 (NCI-H1299 [H-1299] (ATCC® CRL-5803)), клетки H1975 (клетки NCI-H1975 [H1975] (ATCC® CRL-5908™)) и клетки EBC-1.
Термин "анализ ксенотрансплантата мелкоклеточной карциномы легкого (SCLC)", используемый в данном документе, относится к анализу in vivo, используемому для определения того, могут ли антитело к B7-H3 или ADC подавлять рост опухоли (например, дальнейший рост) и/или уменьшать рост опухоли, полученной в результате трансплантации клеток SCLC мыши с иммунодефицитом. Анализ ксенотрансплантата SCLC предусматривает трансплантацию клеток SCLC мыши с иммунодефицитом таким образом, чтобы опухоль росла до желаемого размера, например, 200-250 мм3, после чего мыши вводят антитело или ADC, чтобы определить, могут ли антитело или ADC подавлять и/или уменьшать рост опухоли. В определенных вариантах осуществления активность антитела или ADC определяют в соответствии с процентом подавления роста опухоли (% TGI) по сравнению с контрольным антителом, например, антителом IgG человека (или их группой), которое не связывает специфически опухолевые клетки, например, направлено на антиген, не ассоциированный с раком, или полученный из источника, который не является раковым (например, нормальная сыворотка человека). В таких вариантах осуществления антитело (или ADC) и контрольное антитело вводят мыши в одной и той же дозе с одной и той же частотой и одним и тем же путем. В одном варианте осуществления мышь, используемая в анализе ксенотрансплантата NSCLC представляет собой мышь с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) и/или бестимусную голую мышь CD-1. Примеры клеток SCLC, которые можно использовать в анализе ксенотрансплантата SCLC, включают без ограничения клетки H146 (NCI-H146 [H146] (ATCC® HTB-173™)), клетки H847 (клетки NCI-H847 [H847] (ATCC® CRL-5846™)). Термин "эпитоп" относится к области антигена, которая связывается антителом или ADC. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают в себя химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильная или сульфонильная группы, и в определенных вариантах осуществления могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры и/или специфическими характеристиками заряда. В определенных вариантах осуществления говорят, что антитело специфически связывает антиген, если оно преимущественно распознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Используемый в данном документе термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое обеспечивает возможность анализа биоспецифических взаимодействий в режиме реального времени путем выявления изменений концентраций белка в пределах матрицы биосенсора, например, с применением системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Уппсала, Швеция и Пискатауэй, Нью-Джерси). Более подробные описания см. в Jönsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. В одном варианте осуществления поверхностный плазмонный резонанс определяют согласно способам, описанным в примере 2.
Подразумевается, что термин "kon" или "ka", используемый в данном документе, относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном с образованием комплекса антитело/антиген.
Подразумевается, что термин "koff" или "kd", используемый в данном документе, относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.
Подразумевается, что термин "KD", используемый в данном документе, обозначает равновесную константу диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген (например, антитела huAb13 и B7-H3). KD рассчитывается как ka/kd.
Используемый в данном документе термин "конкурентное связывание" относится к ситуации, в которой первое антитело конкурирует со вторым антителом за участок связывания в третьей молекуле, например, антигене. В одном варианте осуществления конкурентное связывание двух антител определяют с использованием анализа по методу FACS.
Термин "анализ конкурентного связывания" означает анализ, применяемый для определения того, связываются ли два или более антитела с одним и тем же эпитопом. В одном варианте осуществления анализ конкурентного связывания представляет собой конкурентный анализ по методу сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS), который используют для определения того, связываются ли два или более антитела с одним и тем же эпитопом, путем определения того, ослабляется ли флуоресцентный сигнал меченого антитела вследствие введения немеченого антитела, где конкуренция за один и тот же эпитоп будет снижать уровень флуоресценции.
Используемый в данном документе термин "меченое антитело" обозначает антитело или его антигенсвязывающую часть с включенной меткой, которая обеспечивает идентификацию антитела или связывающего белка, например антитела. Предпочтительно метка представляет собой детектируемый маркер, например, включение аминокислоты с радиоактивной меткой или прикрепление к полипептиду биотинилированных фрагментов, которые могут быть обнаружены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые можно обнаружить с помощью оптических или колориметрических способов). Примеры меток для полипептидов включают без ограничения следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho или 153Sm); флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, люциферазу, щелочную фосфатазу); хемилюминесцентные маркеры; биотинилированные группы; заранее установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновых застежек, связывающие сайты для вторичных антител, металл-связывающие домены, эпитопные метки); и магнитные средства, такие как хелаты гадолиния.
Термин "конъюгат антитела и лекарственного средства" или "ADC" относится к связывающему белку, такому как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, химически связанному с одним или несколькими химическими лекарственными препаратами (также называемыми в данном документе средством(средствами), действующим(действующими) средством(средствами) и полезной(полезными) нагрузкой(нагрузками)), которые могут необязательно являться терапевтическими или цитотоксическими средствами. В предпочтительном варианте осуществления ADC содержит антитело, лекарственное средство (например, цитотоксическое лекарственное средство) и линкер, который обеспечивает присоединение лекарственного средства к антителу или их конъюгацию. ADC, как правило, имеет в любом случае от 1 до 8 молекул лекарственного средства, конъюгированных с антителом, включая формы, нагруженные 2, 4, 6 или 8 молекулами лекарственного средства. Неограничивающие примеры лекарственных средств, которые могут быть включены в ADC, представляют собой ингибиторы митоза, противоопухолевые антибиотики, иммуномодулирующие средства, векторы для генной терапии, алкилирующие средства, антиангиогенные средства, антиметаболиты, борсодержащие средства, хемопротекторные средства, гормоны, антигормональные средства, кортикостероиды, фотоактивные терапевтические средства, олигонуклеотиды, радионуклидные средства, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы киназ (например, ингибиторы киназ семейства TEC и ингибиторы серин-треониновых киназ) и радиосенсибилизаторы. В одном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой ингибитор Bcl-xL.
Термины "конъюгат лекарственного средства и антитела к B7-H3" или "ADC с антителом к B7-H3", используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к ADC, содержащему антитело, которое специфически связывается с B7-H3, при этом антитело конъюгировано с одним или несколькими химическими средствами. В одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 содержит антитело huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, конъюгированное с ауристатином, например, MMAE или MMAF. В одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 содержит антитело huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL. В предпочтительном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 связывается с B7-H3 человека (hB7-H3).
Термин "ингибитор Bcl-xL", используемый в данном документе, относится к соединению, которое противодействует активности Bcl-xL в клетке. В одном варианте осуществления ингибитор Bcl-xL способствует апоптозу клеток посредством подавления активности Bcl-xL.
Используемый в данном документе термин "ауристатин" относится к семейству антимитотических средств. Производные ауристатина также включены в определение термина "ауристатин". Примеры ауристатина включают без ограничения ауристатин E (AE), монометилауристатин E (MMAE), монометилауристатин F (MMAF) и синтетические аналоги доластатина. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3, описанное в данном документе, конъюгировано с ауристатином с образованием ADC с антителом к B7-H3.
Используемый в данном документе термин "Ab-vcMMAE" используется для обозначения ADC, содержащего антитело, конъюгированное с монометилауристатином E (MMAE) с помощью малеимидокапроил-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбамильного (PABA) линкера.
Используемый в данном документе термин "mcMMAF" используется для обозначения комбинации линкер/лекарственное средство малеимидокапроил-монометилауристатина F (MMAF).
Термин "соотношение лекарственного средства и антитела" или "DAR" относится к количеству молекул лекарственного средства, например, ингибитора Bcl-xL, присоединенных к антителу в ADC. DAR для ADC может находиться в диапазоне от 1 до 8, хотя более высокие нагрузки, например 20, также возможны в зависимости от количества участков связывания на антителе. Термин "DAR" может использоваться в отношении количества молекул лекарственного средства, нагружаемых на отдельное антитело, или, альтернативно, может использоваться в отношении усредненного или среднего значения DAR для группы ADC.
Используемый в данном документе термин "нежелательные формы ADC" относится к любой форме, нагруженной лекарственным средством, которая должна быть отделена от форм ADC, имеющих другую лекарственную нагрузку. В одном варианте осуществления термин "нежелательные формы ADC" может относиться к форме, нагруженной 6 или более молекулами лекарственного средства, т. е. к ADC с DAR 6 или более, в том числе DAR6, DAR7, DAR8 и DAR более 8 (т. е. к форме, нагруженной 6, 7, 8 или более чем 8 молекулами лекарственного средства). В отдельном варианте осуществления термин "нежелательные формы ADC" может относиться к форме, нагруженной 8 или более молекулами лекарственного средства, т. e. ADC с DAR 8 или более, в том числе DAR8 и DAR более 8 (т. е. к форме, нагруженной 8 или более чем 8 молекулами лекарственного средства).
Используемый в данном документе термин "смесь ADC" относится к композиции, содержащей ADC с неоднородным распределением DAR. В одном варианте осуществления смесь ADC содержит ADC с распределением DAR от 1 до 8, например, 1,5, 2, 4, 6 и 8 (т. е. формы, нагруженные 2, 4, 6 и 8 молекулами лекарственного средства). Примечательно, что могут появляться продукты распада, так что DAR 1, 3, 5 и 7 также могут быть включены в смесь. Кроме того, ADC в смеси могут также иметь DAR более 8. Смесь ADC образуется в результате восстановления межцепочечных дисульфидных связей с последующей конъюгацией. В одном варианте осуществления смесь ADC содержит как ADC с DAR 4 или меньше (т. e. формы, нагруженные 4 или меньше молекулами лекарственного средства), так и ADC с DAR 6 или больше (т. e. формы, нагруженные 6 или больше молекулами лекарственного средства).
Используемый в данном документе термин "анализ ксенотрансплантата" относится к анализу ксенотрансплантата опухоли человека, в котором клетки опухоли человека трансплантируют либо под кожу, либо в орган того типа, из которого происходит опухоль, мышам с ослабленным иммунитетом, которые не отторгают клетки человека.
Термин "рак" предназначен для обозначения или описания физиологического состояния у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких видов рака включают глиобластому, острый миелоидный лейкоз (AML), неходжкинскую лимфому (NHL), немелкоклеточный рак легкого, рак легкого, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак головы и шеи, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), рак поджелудочной железы, плоскоклеточные опухоли, плоскоклеточную карциному (например, плоскоклеточный рак легкого или плоскоклеточный рак головы и шеи), рак анального канала, рак кожи и рак вульвы. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему опухоль(опухоли), которая характеризуется сверхэкспрессией B7-H3. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, у которого имеется солидная опухоль, характеризующаяся вероятной сверхэкспрессией B7-H3. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему плоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, у которого имеются солидные опухоли, в том числе солидные опухоли на поздней стадии. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак предстательной железы. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему немелкоклеточный рак легкого. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему глиобластому. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак толстой кишки. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак головы и шеи. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак почки. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему светлоклеточную почечно-клеточную карциному. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему глиому. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему меланому. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак поджелудочной железы. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак желудка. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак яичника. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему колоректальный рак. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему почечный рак. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему мелкоклеточный рак легкого. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему гепатоцеллюлярную карциному. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему гипофарингеальную сквамозную карциному. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему нейробластому. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак молочной железы. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему рак эндометрия. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему уротелиально-клеточную карциному. В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему острый миелоидный лейкоз (AML). В одном варианте осуществления антитела или ADC по настоящему изобретению вводят пациенту, имеющему неходжкинскую лимфому (NHL).
Термин "опухоль, экспрессирующая B7-H3", используемый в данном документе, относится к опухоли, которая экспрессирует белок B7-H3. В одном варианте осуществления экспрессию B7-H3 в опухоли определяют с использованием иммуногистохимического окрашивания мембран опухолевых клеток, где любое иммуногистохимическое окрашивание выше фонового уровня в образце опухоли указывает на то, что опухоль представляет собой опухоль, экспрессирующую B7-H3. Способы выявления экспрессии B7-H3 в опухоли известны из уровня техники и включают иммуногистохимические анализы. Напротив, "B7-H3-отрицательная опухоль" определяется как опухоль, характеризующаяся отсутствием зависимого от B7-H3 окрашивания мембраны выше фонового уровня в образце опухоли, что определяется с помощью иммуногистохимических методик.
Термины "сверхэкспрессировать", "сверхэкспрессия" или "сверхэкспрессированный" взаимозаменяемо относятся к гену, который транскрибируется или транслируется на выявляемом более высоком уровне, обычно в раковой клетке, по сравнению с нормальной клеткой. Таким образом, сверхэкспрессия относится к сверхэкспрессии как белка, так и РНК (вследствие увеличения транскрипции, посттранскрипционного процессинга, трансляции, посттрансляционного процессинга, изменения стабильности и изменения распада белка), а также локальной сверхэкспрессии вследствие изменения режимов транспорта белка (увеличения ядерной локализации) и усиления функциональной активности, например, как в случае увеличения ферментативного гидролиза субстрата. Таким образом, сверхэкспрессия относится к уровням белка либо РНК. Сверхэкспрессия также может означать увеличение на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше по сравнению с нормальной клеткой или клеткой сравнения. В определенных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или ADC по настоящему изобретению применяют для лечения солидных опухолей, характеризующихся вероятной сверхэкспрессией B7-H3.
Используемый в данном документе термин "амплификация гена" относится к клеточному процессу, характеризующемуся образованием нескольких копий любого конкретного фрагмента ДНК. Например, опухолевая клетка может амплифицировать или копировать хромосомные сегменты в результате воздействия клеточных сигналов и иногда окружающих событий. Процесс амплификации гена приводит к получению дополнительных копий гена. В одном варианте осуществления ген представляет собой B7-H3, т. е. "амплификат B7-H3". В одном варианте осуществления композиции и способы, раскрытые в данном документе, применяют для лечения пациента, у которого имеется рак с амплификацией B7-H3.
Используемый в данном документе термин "введение" предназначен для обозначения доставки вещества (например, антитела к B7-H3 или ADC) для достижения терапевтической цели (например, лечения ассоциированного с B7-H3 нарушения). Способ введения может быть парентеральным, энтеральным и местным. Парентеральное введение обычно осуществляется путем инъекции и включает без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.
Термин "комбинированная терапия" или "комбинация" в контексте терапевтического способа (например, способ лечения), как используется в данном документе, относится к введению двух или более терапевтических веществ, например, антитела к B7-H3 или ADC и дополнительного терапевтического средства. Дополнительное терапевтическое средство можно вводить одновременно с введением антитела к В7-Н3 или ADC, до них или после них.
Используемый в данном документе термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, например, антитела или ADC, которое является достаточным для снижения или облегчения тяжести и/или периода протекания нарушения, например, рака, или одного или нескольких его симптомов, предупреждения продвижения нарушения, обеспечения регрессии нарушения, предупреждения рецидива, развития, проявления или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, выявления нарушения или усиления или улучшения профилактического(профилактических) или терапевтического(терапевтических) эффекта(эффектов) другого средства терапии (например, профилактического или терапевтического средства). Эффективное количество антитела или ADC может, например, ингибировать рост опухоли (например, ингибировать увеличение объема опухоли), уменьшать темпы роста опухоли (например, уменьшать объем опухоли), снижать количество раковых клеток и/или в некоторой степени облегчать один или несколько симптомов, ассоциированных с раком. Эффективное количество может, например, улучшать выживаемость без признаков заболевания (DFS), улучшать общую выживаемость (OS) или уменьшать вероятность рецидива.
Различные химические заместители определены ниже. В некоторых случаях количество атомов углерода в заместителе (например, алкильном, алканильном, алкенильном, алкинильном, циклоалкильном, гетероциклильном, гетероарильном и арильном) указано с помощью приставки "Cx-Cy" или "Cx-y", где x - минимальное, а y - максимальное количество атомов углерода. Так, например, "C1-C6алкил" относится к алкилу, содержащему от 1 до 6 атомов углерода. В качестве дополнительной иллюстрации, "C3-C8циклоалкил" означает насыщенное гидрокарбильное кольцо, содержащее от 3 до 8 атомов углерода. Если заместитель описывается как "замещенный", то атом водорода при атоме углерода или азота замещен группой, отличной от атома водорода. Например, замещенный алкильный заместитель представляет собой алкильный заместитель, в котором по меньшей мере один атом водорода в алкиле замещен группой, отличной от атома водорода. Для иллюстрации, монофторалкил представляет собой алкил, замещенный фтор-радикалом, а дифторалкил представляет собой алкил, замещенный двумя фтор-радикалами. Следует отметить, что, если заместитель имеет более одного замещения, то все замещения могут быть одинаковыми или различными (если не указано иное). Если заместитель описан как "необязательно замещенный", то заместитель может являться либо (1) незамещенным, либо (2) замещенным. Возможные заместители включают без ограничения C1-C6алкил, C2-C6алкенил, C2-C6алкинил, арил, циклоалкил, гетероциклил, гетероарил, галоген, C1-C6галогеналкил, оксо, -CN, NO2, -ORxa, -OC(O)Rxz, -OC(O)N(Rxa)2, -SRxa, -S(O)2Rxa, -S(O)2N(Rxa)2, -C(O)Rxa, -C(O)ORxa, -C(O)N(Rxa)2, -C(O)N(Rxa)S(O)2Rxz, -N(Rxa)2, -N(Rxa)C(O)Rxz, -N(Rxa)S(O)2Rxz, -N(Rxa)C(O)O(Rxz), -N(Rxa)C(O)N(Rxa)2, -N(Rxa)S(O)2N(Rxa)2, -(C1-C6алкиленил)-CN, -(C1-C6алкиленил)-ORxa, -(C1-C6алкиленил)-OC(O)Rxz, -(C1-C6алкиленил)-OC(O)N(Rxa)2, -(C1-C6алкиленил)-SRxa, -(C1-C6алкиленил)-S(O)2Rxa, -(C1-C6алкиленил)-S(O)2N(Rxa)2, -(C1-C6алкиленил)-C(O)Rxa, -(C1-C6алкиленил)-C(O)ORxa, -(C1-C6алкиленил)-C(O)N(Rxa)2, -(C1-C6алкиленил)-C(O)N(Rxa)S(O)2Rxz, -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)2, -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)C(O)Rxz, -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)S(O)2Rxz, -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)C(O)O(Rxz), -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)C(O)N(Rxa)2 или -(C1-C6алкиленил)-N(Rxa)S(O)2N(Rxa)2; где Rxa в каждом случае независимо представляет собой водород, арил, циклоалкил, гетероциклил, гетероарил, C1-C6алкил или C1-C6галогеналкил, и Rxz в каждом случае независимо представляет собой арил, циклоалкил, гетероциклил, гетероарил, C1-C6алкил или C1-C6галогеналкил.
Различные ADC, синтоны и ингибиторы Bcl-xL, содержащие ADC и/или синтоны, описаны в некоторых вариантах осуществления в данном документе со ссылкой на структурные формулы, содержащие заместители. Следует понимать, что различные группы, содержащие заместители, можно комбинировать так, как позволяет валентность и стабильность. В настоящем изобретении предусмотрены только те комбинации заместителей и переменных, которые приводят к образованию стабильных соединений. Используемый в данном документе термин "стабильный" относится к соединениям, которые обладают стабильностью, достаточной для обеспечения производства, и которые сохраняют целостность соединения в течение достаточного периода времени, чтобы быть применимыми для цели, подробно описанной в данном документе.
Подразумевается, что используемые в данном документе следующие термины имеют следующие значения.
Термин "алкокси" относится к группе формулы -ORxa, где Rxa представляет собой алкильную группу. Типичные алкоксигруппы включают метокси, этокси, пропокси, трет-бутокси и т. п.
Термин "алкоксиалкил" относится к алкильной группе, замещенной алкоксигруппой, и может быть представлен общей формулой -RbORxa, где Rb представляет собой алкиленовую группу, и Rxa представляет собой алкильную группу. Термин "алкил" сам по себе или как часть другого заместителя относится к насыщенному или ненасыщенному разветвленному, неразветвленному или циклическому одновалентному углеводородному радикалу, полученному путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода исходного алкана, алкена или алкина. Типичные алкильные группы включают без ограничения метил; этильные группы, такие как этанил, этенил, этинил; пропильные группы, такие как пропан-1-ил, пропан-2-ил, циклопропан-1-ил, проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т. д.; бутильные группы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил, 2-метилпропан-1-ил, 2-метилпропан-2-ил, циклобутан-1-ил, бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил, бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т. д.; и т. п. Там, где подразумеваются конкретные уровни насыщения, используют номенклатуру "алканил", "алкенил" и/или "алкинил", как определено ниже. Термин "низший алкил" относится к алкильным группам с 1-6 атомами углерода.
Термин "алканил" сам по себе или как часть другого заместителя относится к насыщенному разветвленному, неразветвленному или циклическому алкилу, полученному путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода исходного алкана. Типичные алканильные группы включают без ограничения метил; этанил; пропанильные группы, такие как пропан-1-ил, пропан-2-ил (изопропил), циклопропан-1-ил и т. д.; бутанильные группы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил (втор-бутил), 2-метилпропан-1-ил (изобутил), 2-метилпропан-2-ил (трет-бутил), циклобутан-1-ил и т. д.; и т. п.
Термин "алкенил" сам по себе или как часть другого заместителя относится к ненасыщенному разветвленному, неразветвленному или циклическому алкилу, имеющему по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, полученному путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода исходного алкена. Типичные алкенильные группы включают без ограничения этенил; пропенильные группы, такие как проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, проп-2-ен-2-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил; бутенильные группы, такие как бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил и т. д.; и т. п.
Термин "алкинил" сам по себе или как часть другого заместителя относится к ненасыщенному разветвленному, неразветвленному или циклическому алкилу, имеющему по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, полученному путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода исходного алкина. Типичные алкинильные группы включают без ограничения этинил; пропинильные группы, такие как проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т. д.; бутинильные группы, такие как бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т. д.; и т. п.
Термин "алкиламин" относится к группе формулы -NHRxa, а "диалкиламин" относится к группе формулы -NRxaRxa, где каждый Rxa независимо от других представляет собой алкильную группу.
Термин "алкилен" относится к алкановой, алкеновой или алкиновой группе, имеющей два концевых одновалентных радикальных центра, полученных путем удаления одного атома водорода от каждого из двух концевых атомов углерода. Типичные алкиленовые группы включают без ограничения метилен; а также насыщенный или ненасыщенный этилен; пропилен; бутилен и т. п. Термин "низший алкилен" относится к алкиленовым группам с 1-6 атомами углерода.
Термин "гетероалкилен" относится к двухвалентному алкилену, имеющему одну или несколько групп -CH2-, замещенных тио, окси или -NRx3-, где Rx3 выбран из водорода, низшего алкила и низшего гетероалкила. Гетероалкилен может быть линейным, разветвленным, циклическим, бициклическим или их комбинацией и может содержать до 10 атомов углерода и до 4 гетероатомов. Термин "низший гетероалкилен" относится к алкиленовым группам с 1-4 атомами углерода и 1-3 гетероатомами.
Термин "арил" означает ароматический карбоциклил, содержащий от 6 до 14 атомов углерода кольца. Арил может быть моноциклическим или полициклическим (т. е. может содержать более одного кольца). В случае полициклических ароматических колец только одно кольцо полициклической системы должно быть ароматическим, в то время как остальное(остальные) кольцо(кольца) могут быть насыщенными, частично насыщенными или ненасыщенными. Примеры арильных групп включают фенил, нафталинил, инденил, инданил и тетрагидронафтил.
Термин "арилен" относится к арильной группе, имеющей два одновалентных радикальных центра, полученных путем удаления одного атома водорода от каждого из двух атомов углерода кольца. Иллюстративной ариленовой группой является фенилен.
Алкильная группа может быть замещена "карбонилом", что означает, что два атома водорода удалены от одного атома углерода алканилена и заменены двойной связью с атомом кислорода.
Приставка "галоген" указывает на то, что заместитель, содержащий приставку, замещен одним или несколькими независимо выбранными галогеновыми радикалами. Например, галогеналкил означает алкильный заместитель, в котором по меньшей мере один водородный радикал замещен галогеновым радикалом. Типичные галогеновые радикалы включают хлор, фтор, бром и йод. Примеры галогеналкилов включают хлорметил, 1-бромэтил, фторметил, дифторметил, трифторметил и 1,1,1-трифторэтил. Следует понимать, что если заместитель замещен более чем одним галогеновым радикалом, то эти галогеновые радикалы могут быть одинаковыми или разными (если не указано иное).
Термин "галогеналкокси" относится к группе формулы -ORc, где Rc представляет собой галогеналкил.
Термины "гетероалкил", "гетероалканил", "гетероалкенил", "гетероалкинил" и "гетероалкилен" относятся соответственно к алкильной, алканильной, алкенильной, алкинильной и алкиленовой группам, в которых каждый из одного или нескольких атомов углерода, например, 1, 2 или 3 атомов углерода, независимо заменен одинаковыми или разными гетероатомами или гетероатомными группами. Типичные гетероатомы и/или гетероатомные группы, которые могут заменять атомы углерода, включают без ограничения -O-, -S-, -S-O-, -NRc-, -PH, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)NRc-, -S(O)2NRc- и т. п., в том числе их комбинации, где каждый Rc независимо представляет собой водород или C1-C6алкил. Термин "низший гетероалкил" означает от 1 до 4 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов.
Термины "циклоалкил" и "гетероциклил" относятся к циклическим вариантам соответственно "алкильной" и "гетероалкильной" групп. В гетероциклильных группах гетероатом может занимать положение, в котором он присоединен к остальной части молекулы. Циклоалкильное или гетероциклильное кольцо может быть однокольцевым (моноциклическим) или иметь два или более кольца (бициклическое или полициклическое).
Моноциклические циклоалкильные и гетероциклильные группы обычно содержат от 3 до 7 атомов кольца, в более типичном случае от 3 до 6 атомов кольца и в еще более типичном случае от 5 до 6 атомов кольца. Примеры циклоалкильных групп включают без ограничения циклопропил; циклобутильные группы, такие как циклобутанил и циклобутенил; циклопентильные группы, такие как циклопентанил и циклопентенил; циклогексильные группы, такие как циклогексанил и циклогексенил; и т. п. Примеры моноциклических гетероциклилов включают без ограничения оксетан, фуранил, дигидрофуранил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тиофенил (тиофуранил), дигидротиофенил, тетрагидротиофенил, пирролил, пирролинил, пирролидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиразолил, пиразолинил, пиразолидинил, триазолил, тетразолил, оксазолил, оксазолидинил, изоксазолидинил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, тиазолинил, изотиазолинил, тиазолидинил, изотиазолидинил, тиодиазолил, оксадиазолил (в том числе 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил (фуразанил) или 1,3,4-оксадиазолил), оксатриазолил (в том числе 1,2,3,4-оксатриазолил или 1,2,3,5-оксатриазолил), диоксазолил (в том числе 1,2,3-диоксазолил, 1,2,4-диоксазолил, 1,3,2-диоксазолил или 1,3,4-диоксазолил), 1,4-диоксанил, диоксотиоморфолинил, оксатиазолил, оксатиолил, оксатиоланил, пиранил, дигидропиранил, тиопиранил, тетрагидротиопиранил, пиридинил (азинил), пиперидинил, диазинил (в том числе пиридазинил (1,2-диазинил), пиримидинил (1,3-диазинил) или пиразинил (1,4-диазинил)), пиперазинил, триазинил (в том числе 1,3,5-триазинил, 1,2,4-триазинил и 1,2,3-триазинил)), оксазинил (в том числе 1,2-оксазинил, 1,3-оксазинил или 1,4-оксазинил)), оксатиазинил (в том числе 1,2,3-оксатиазинил, 1,2,4-оксатиазинил, 1,2,5-оксатиазинил или 1,2,6-оксатиазинил)), оксадиазинил (в том числе 1,2,3-оксадиазинил, 1,2,4-оксадиазинил, 1,4,2-оксадиазинил или 1,3,5-оксадиазинил)), морфолинил, азепинил, оксепинил, тиепинил, диазепинил, пиридонил (в том числе пирид-2(1Н)-онил и пирид-4(1Н)-онил), фуран-2(5Н)-онил, пиримидонил (в том числе пиримид-2(1H)-онил и пиримид-4(3H)-онил), оксазол-2(3H)-онил, 1H-имидазол-2(3H)-онил, пиридазин-3(2H)-онил и пиразин-2(1H)-онил.
Полициклические циклоалкильные и гетероциклильные группы содержат более одного кольца, а бициклические циклоалкильные и гетероциклильные группы содержат два кольца. Кольца могут находиться в мостиковой, конденсированной или спиро-ориентации. Полициклические циклоалкильные и гетероциклильные группы могут содержать комбинации мостиковых, конденсированных и/или спироколец. В спироциклическом циклоалкиле или гетероциклиле один атом является общим для двух разных колец. Примером спироциклоалкила является спиро[4.5]декан, а примером спирогетероциклилов является спиропиразолин.
В мостиковом циклоалкиле или гетероциклиле кольца имеют по меньшей мере два общих несмежных атома. Примеры мостиковых циклоалкилов включают без ограничения адамантильное и норборнанильное кольца. Примеры мостиковых гетероциклилов включают без ограничения 2-оксатрицикло[3.3.1.13,7]деканил.
В циклоалкиле или гетероциклиле с конденсированными кольцами два или более колец конденсированы друг с другом, так что два кольца имеют одну общую связь. Примеры циклоалкилов с конденсированными кольцами включают декалин, нафтилен, тетралин и антрацен. Примеры гетероциклилов с конденсированными кольцами, содержащих два или три кольца, включают имидазопиразинил (в том числе имидазо[1,2-a]пиразинил), имидазопиридинил (в том числе имидазо[1,2-a]пиридинил), имидазопиридазинил (в том числе имидазо[1,2-b]пиридазинил), тиазолопиридинил (в том числе тиазоло[5,4-c]пиридинил, тиазоло[5,4-b]пиридинил, тиазоло[4,5-b]пиридинил и тиазоло[4,5-c]пиридинил), индолизинил, пиранопирролил, 4H-хинолизинил, пуринил, нафтиридинил, пиридопиридинил (в том числе пиридо[3,4-b]-пиридинил, пиридо[3,2-b]-пиридинил или пиридо[4,3-b]-пиридинил) и птеридинил. Другие примеры гетероциклилов с конденсированными кольцами включают бензоконденсированные гетероциклилы, такие как дигидрохроменил, тетрагидроизохинолинил, индолил, изоиндолил (изобензазолил, псевдоизоиндолил), индоленинил (псевдоиндолил), изоиндазолил (бензпиразолил), бензазинил (в том числе хинолинил (1-бензазинил) или изохинолинил (2-бензазинил)), фталазинил, хиноксалинил, хиназолинил, бензодиазинил (в том числе циннолинил (1,2-бензодиазинил) или хиназолинил (1,3-бензодиазинил)), бензопиранил (в том числе хроманил или изохроманил), бензоксазинил (в том числе 1,3,2-бензоксазинил, 1,4,2-бензоксазинил, 2,3,1-бензоксазинил или 3,1,4-бензоксазинил), бензо[d]тиазолил и бензизоксазинил (в том числе 1,2-бензизоксазинил или 1,4-бензизоксазинил).
Термин "циклоалкилен" относится к циклоалкильной группе, имеющей два одновалентных радикальных центра, полученных путем удаления одного атома водорода от каждого из двух атомов углерода кольца. Иллюстративные циклоалкиленовые группы включают 
, 
и 
.
Термин "гетероарил" относится к ароматическому гетероциклилу, содержащему от 5 до 14 атомов кольца. Гетероарил может представлять собой одно кольцо или 2 или 3 конденсированных кольца. Примеры гетероарилов включают 6-членные кольца, такие как пиридил, пиразил, пиримидинил, пиридазинил и 1,3,5-, 1,2,4- или 1,2,3-триазинил; 5-членные кольцевые заместители, такие как триазолил, пирролил, имидазил, фуранил, тиофенил, пиразолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, 1,2,3-, 1,2,4-, 1,2,5- или 1,3,4-оксадиазолил и изотиазолил; 6/5-членные конденсированные кольцевые заместители, такие как имидазопиразинил (в том числе имидазо[1,2-a]пиразинил), имидазопиридинил (в том числе имидазо[1,2-a]пиридинил), имидазопиридазинил (в том числе имидазо[1,2-b]пиридазинил), тиазолопиридинил (в том числе тиазоло[5,4-c]пиридинил, тиазоло[5,4-b]пиридинил, тиазоло[4,5-b]пиридинил и тиазоло[4,5-c]пиридинил), бензо[d]тиазолил, бензотиофуранил, бензизоксазолил, бензоксазолил, пуринил и антранилил; и 6/6-членные конденсированные кольца, такие как бензопиранил, хинолинил, изохинолинил, циннолинил, хиназолинил и бензоксазинил. Гетероарилы также могут представлять собой гетероциклы, содержащие ароматические (с 4N+2 пи-электронами) резонансные структуры, такие как пиридонил (в том числе пирид-2(1H)-онил и пирид-4(1H)-онил), пиримидонил (в том числе пиримид-2(1H)-онил и пиримид-4(3H)-онил), пиридазин-3(2H)-онил и пиразин-2(1H)-онил.
Используемый в данном документе термин "сульфонат" означает соль или сложный эфир сульфоновой кислоты.
Используемый в данном документе термин "метилсульфонат" означает метиловый сложный эфир группы сульфоновой кислоты.
Используемый в данном документе термин "карбоксилат" означает соль или сложный эфир карбоновой кислоты.
Используемый в данном документе термин "полиол" означает группу, содержащую более двух гидроксильных групп независимо или в виде части мономерного звена. Полиолы включают без ограничения восстановленные C2-C6углеводы, этиленгликоль и глицерин.
Термин "сахар" при использовании в контексте "G1" включает O-гликозидные, N-гликозидные, S-гликозидные и C-гликозидные (C-гликозильные) производные углеводов из класса моносахаридов или дисахаридов, которые могут происходить из природных источников или быть синтетическими по происхождению. Например, "сахар" при использовании в контексте "G1" включает производные, такие как, без ограничения, производные глюкуроновой кислоты, галактуроновой кислоты, галактозы и глюкозы среди прочих. Подходящие заместители сахаров включают без ограничения гидроксил, амин, карбоновую кислоту, сульфоновую кислоту, фосфоновую кислоту, сложные эфиры и простые эфиры.
Термин "сложный NHS-эфир" означает N-гидроксисукцинимидное сложноэфирное производное карбоновой кислоты.
Термин "амин" включает первичные, вторичные и третичные алифатические амины, в том числе их циклические варианты.
Термин "соль" при использовании в контексте "или его соли" включает соли, обычно используемые для образования солей щелочных металлов и для образования солей присоединения свободных кислот или свободных оснований. В целом, эти соли, как правило, можно получить традиционными способами путем осуществления реакции, например, подходящей кислоты или основания с соединением согласно настоящему изобретению.
Если соль предназначена для введения пациенту (в отличие, например, от применения в контексте in vitro), соль предпочтительно является фармацевтически приемлемой и/или физиологически совместимой. Термин "фармацевтически приемлемый" используется в качестве прилагательного в данной патентной заявке и означает, что модифицированное существительное подходит для применения в качестве фармацевтического продукта или в качестве части фармацевтического продукта. Термин "фармацевтически приемлемая соль" включает соли, обычно используемые для образования солей щелочных металлов и для образования солей присоединения свободных кислот или свободных оснований. В целом, эти соли, как правило, можно получить традиционными способами путем осуществления реакции, например, подходящей кислоты или основания с соединением согласно настоящему изобретению.
Различные аспекты настоящего изобретения более подробно описаны в следующих подразделах.
II. Антитела к B7-H3
В одном аспекте настоящего изобретения предусматривают антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие части. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает химерные антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие части. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает гуманизированные антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие части. В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгаты антитела и лекарственного средства (АDC), содержащие антитело к B7-H3, описанное в данном документе, и по меньшей мере одно лекарственное(лекарственные) средство(средства), такое как без ограничения ингибитор Bcl-xL или ауристатин. Антитела или ADC по настоящему изобретению обладают характеристиками, включающими без ограничения связывание с B7-H3 человека дикого типа in vitro, связывание с B7-H3 человека дикого типа на опухолевых клетках, экспрессирующих B7-H3, и снижение или подавление роста ксенотрансплантатной опухоли в мышиной модели.
Один аспект настоящего изобретения обеспечивает конъюгат лекарственного средства и антитела с антителом к B7-H3 человека (антитело к hB7-H3), содержащий антитело к hB7-H3, конъюгированное с лекарственным средством посредством линкера, где лекарственным средством является ингибитор Bcl-xL. Иллюстративные антитела к B7-H3 (и их последовательности), которые можно применять в ADC, описаны в данном документе.
Антитела к B7-H3, описанные в данном документе, обеспечивают ADC по настоящему изобретению со способностью связываться с B7-H3, так что цитотоксическое лекарственное средство Bcl-xL, присоединенное к антителу, может быть доставлено в клетку, экспрессирующую B7-H3, в частности раковую клетку, экспрессирующую B7-H3.
Несмотря на то, что по всему документу используют термин "антитело", следует отметить, что фрагменты антител (т. е. антигенсвязывающие части антител к B7-H3) также включены в настоящее изобретение и могут быть включены в варианты осуществления (способы и композиции), описанные по всему документу. Например, с описанными в данном документе ингибиторами Bcl-xL может быть конъюгирован фрагмент антитела к B7-H3. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят определенные варианты осуществления, в которых фрагменты антител к B7-H3, описанных в данном документе, конъюгированы с ингибиторами Bcl-xL (в том числе описанными ниже в разделе III.A) посредством линкеров (в том числе описанных ниже в разделе III.A). В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающая часть антитела к B7-H3 представляет собой Fab, Fab', F(ab')2, Fv, стабилизированный дисульфидными связями Fv, scFv, однодоменное антитело или диатело.
II.A. Химерные антитела к B7-H3
Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части антитела происходят от разных видов животных, например, антитела с вариабельной областью, происходящей из мышиного моноклонального антитела, и константной областью иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны из уровня техники. См., например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №№ 5807715; 4816567 и 4816397, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В дополнение, можно применять методики, разработанные для получения "химерных антител" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), заключающиеся в сплайсинге генов молекулы антитела мыши с соответствующей антигенной специфичностью с генами молекулы антитела человека с соответствующей биологической активностью.
Как описано в примере 3, идентифицировали восемнадцать антител мыши к B7-H3, обладающих высокой активностью специфического связывания с B7-H3 человека и макака-крабоеда. Химерные антитела в контексте константной области иммуноглобулина человека были получены из этих восемнадцати антител.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1, 9, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 87, 95, 101 или 108; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5, 13, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 91, 98, 105 или 112.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 2; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 3; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 4; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14 (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 16, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 20.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 18; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 19; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 22; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 23.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 24, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 26; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 32, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 36.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 33; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 34; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 37; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 38; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 182.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 44.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 41; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 42; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 43; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 46; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 47.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 52.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 50; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 51; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 53; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 54; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 55.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 60.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 57; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 58; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 59; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 61; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 62; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 63.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 68.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 65; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 66; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 67; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 69; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 70; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 71.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 72, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 76.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 73; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 74; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 75; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 77; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 78; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 79.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 80, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 84.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 81; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 82; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 83; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 85; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 86.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 87, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 91.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 88; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 89; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 90; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 92; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 93; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 94.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 95, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 98.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 96; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 97; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 99; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 93; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 100.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 101, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 105.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 102; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 103; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 104; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 106; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 46; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 107.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 108, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 112.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 109; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 110; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 111; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 113; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 114; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 115.
II.B. Гуманизированные антитела к B7-H3
Для получения гуманизированных антител к B7-H3 можно использовать химерные антитела, описанные в данном документе. Например, после получения и определения характеристик химерных антител к B7-H3 chAb1-chAb18 для гуманизации выбирали антитела chAb3, chAb13 и chAb18. В частности, создали шесть различных гуманизированных антител на основе chAb3 (называемые в данном документе huAb3v1, huAb3v2, huAb3v3, huAb3v4, huAb3v5 и huAb3v6 (см. примеры 12 и 13), создали девять различных гуманизированных антител на основе chAb13 (называемые в данном документе huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3, huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8, huAb13v9) и десять различных гуманизированных антител создали на основе chAb18 (называемые в данном документе huAb18v1, huAb18v2, huAb18v3, huAb18v4, huAb18v5, huAb18v6, huAb18v7, huAb18v8, huAb18v9 и huAb18v10 (см. примеры 9 и 10)). В таблицах 8, 12, 16, 18 и 19 представлены аминокислотные последовательности CDR, VH- и VL-областей гуманизированных chAb3, chAb13 и chAb18 соответственно.
Как правило, гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител, полученные с применением антитела от вида, отличного от человека, которое связывает необходимый антиген, имеющие одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), из антитела от вида, отличного от человека, и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Известные последовательности Ig человека раскрыты, например, в www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), каждый включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Такие импортированные последовательности можно применять для снижения иммуногенности или снижения, усиления или модифицирования связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других соответствующих характеристик, известных из уровня техники.
Остатки каркасной области в каркасных областях человека могут быть заменены на соответствующий остаток из CDR-донорного антитела для изменения, предпочтительно усиления, связывания антигена. Эти замены в каркасной области идентифицируют с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например, с помощью моделирования взаимодействия CDR и остатков каркасной области, чтобы идентифицировать остатки каркасной области, важные для связывания антигена, и путем сравнения последовательностей, чтобы идентифицировать необычные остатки каркасной области в конкретных положениях. (См., например, Queen et al., патент США № 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Общедоступными являются трехмерные модели иммуноглобулинов, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные структуры трехмерной конформации выбранных последовательностей кандидатных иммуноглобулинов. Просмотр этих отображений обеспечивает анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности кандидатного иммуноглобулина, т. е. анализ остатков, которые воздействуют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген. Таким образом, FR-остатки можно отбирать из консенсусной и импортированной последовательностей и комбинировать, чтобы достигнуть необходимой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность в отношении антигена(антигенов)-мишени(мишеней). Как правило, CDR-остатки непосредственно и наиболее существенно вовлечены в воздействие на связывание антигена. Антитела можно гуманизировать с применением целого ряда методик, известных из уровня техники, таких как без ограничения описанные в Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); публикация согласно PCT WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592106; EP 519596, EP 239400, патенты США №№ 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме, в том числе библиографические ссылки, процитированные в них.
Гуманизированные антитела к B7-H3, полученные из chAb3
На основе chAb3 создали шесть гуманизированных антител. Последовательности каждого являются следующими:
A) huAb3v1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 125, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 128, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно);
B) huAb3v2 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 127, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 128, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно);
C) huAb3v3 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 126, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 129, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно);
D) huAb3v4 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 125, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 130, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно);
E) huAb3v5 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 127, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 130, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно); и
F) huAb3v6 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 126, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 130, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 14, 7 и 15 соответственно).
Из шести гуманизированных вариантов chAb3 huAb3v2 было отобрано для дополнительной модификации, чтобы удалить потенциальные сайты дезамидирования или изомеризации в CDR1 легкой цепи или CDR2 тяжелой цепи. Создавали девять вариантов гуманизированного антитела huAb3v2, и упоминаются в данном документе как huAb3v2.1, huAb3v2.2, huAb3v2.3, huAb3v2.4, huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.7, huAb3v2.8 и huAb3v2.9 (CDR и последовательности вариабельного домена приведены в таблице 16). Девять вариантов антитела huAb3v2 включают следующие:
A) huAb3v2.1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 131, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 132 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 133, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 134, 7 и 15 соответственно);
B) huAb3v2.2 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 131, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 132 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 135, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 136, 7 и 15 соответственно);
C) huAb3v2.3 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 131, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 132 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 137, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 138, 7 и 15 соответственно);
D) huAb3v2.4 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 139, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 140 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 133, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 134, 7 и 15 соответственно);
E) huAb3v2.5 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 139, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 140 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 135, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 136, 7 и 15 соответственно);
F) huAb3v2.6 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 139, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 140 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 137, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 138, 7 и 15 соответственно);
G) huAb3v2.7 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 141, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 142 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 133, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 134, 7 и 15 соответственно);
H) huAb3v2.8 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 141, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 142 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 135, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 136, 7 и 15 соответственно); и
I) huAb3v2.9 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 141, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 10, 142 и 12 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 137, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 138, 7 и 15 соответственно).
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитела, содержащие последовательности вариабельной области и/или CDR гуманизированного антитела, полученного из chAb3. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает антитела к B7-H3, которые получены из Ab3, имеют улучшенные характеристики, например, улучшенную аффинность связывания с выделенным белком B7-H3 и улучшенное связывание с клетками, экспрессирующими B7-H3, как описано в примерах ниже. В совокупности эти новые антитела упоминаются в данном документе как "антитела варианта Ab3". Как правило, антитела варианта Ab3 сохраняют такую же специфичность эпитопа, как Ab3. В различных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению способны модулировать биологическую функцию B7-H3.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 125, 126, 127, 131, 139 или 141; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 128, 129, 130, 133, 135 или 137.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат по настоящему изобретению вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11, 132, 140 или 142, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14, 134, 136 или 138, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 125, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 128.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 127, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 128.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 126, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 129.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 125, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 130.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 127, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 130.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 126, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 130.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 133.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 131, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 133.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 170 и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 171.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 172, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 173. В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 133.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 141, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 137.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
Гуманизированные антитела к B7-H3, полученные из chAb13
Девять различных гуманизированных антител, созданных на основе chAb13, включают следующие:
A) huAb13v1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 147, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 144, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
B) huAb13v2 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 146, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 143, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
C) huAb13v3 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 146, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 144, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
D) huAb13v4 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 146, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 145, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
E) huAb13v5 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 147, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 143, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
F) huAb13v6 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 147, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 145, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
G) huAb13v7 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 148, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 143, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
H) huAb13v8 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 148, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 144, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно);
I) huAb13v9 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 148, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 33, 34 и 35 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 145, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 37, 38 и 39 соответственно).
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитела, содержащие последовательности вариабельной области и/или CDR гуманизированного антитела, полученного из chAb13. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает антитела к B7-H3, которые получены из chAb13, имеют улучшенные характеристики, например, улучшенную аффинность связывания с выделенным белком B7-H3 и улучшенное связывание с клетками, экспрессирующими B7-H3, как описано в примерах ниже. В совокупности эти новые антитела упоминаются в данном документе как "антитела варианта Ab13". Как правило, антитела варианта Ab13 сохраняют такую же специфичность эпитопа, как Ab13. В различных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению способны модулировать биологическую функцию B7-H3.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 146, 147 или 148; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 143, 144 или 145.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат по настоящему изобретению вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 33, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 34, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 37, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 38, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 39.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, содержащее последовательности CDR, изложенные в вариабельных областях huAb13v1 (SEQ ID NO: 144 и 147).
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 169.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 146, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 143.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 146, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 146, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 145.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 143.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 145.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 148, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 143.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 148, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 148, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 145.
Гуманизированные антитела к B7-H3, полученные из chAb18
Десять различных гуманизированных антител, созданных на основе chAb18, включают следующие:
A) huAb18v1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 116, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 120, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
B) huAb18v2 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 118, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 119 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 120, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
C) huAb18v3 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 117, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 121, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
D) huAb18v4 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 118, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 119 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 121, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
E) huAb18v5 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 116, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 123, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
F) huAb18v6 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 118, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 119 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 123, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
G) huAb18v7 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 118, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 119 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 124, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
H) huAb18v8 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 117, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 122, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно);
I) huAb18v9 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 117, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 26 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 124, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно); и
J) huAb18v10 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 118, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 25, 119 и 27 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 122, и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 29, 30 и 31 соответственно).
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает антитела, содержащие последовательности вариабельной области и/или CDR гуманизированного антитела, полученного из chAb18. В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает антитела к B7-H3, которые получены из Ab18, имеют улучшенные характеристики, например, улучшенную аффинность связывания с выделенным белком B7-H3 и улучшенное связывание с клетками, экспрессирующими B7-H3, как описано в примерах ниже. В совокупности эти новые антитела упоминаются в данном документе как "антитела варианта Ab18". Как правило, антитела варианта Ab18 сохраняют такую же специфичность эпитопа, как Ab18. В различных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению способны модулировать биологическую функцию B7-H3.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 116, 117 или 118; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 120, 121, 122, 123 или 124.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат по настоящему изобретению вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 26 или 119, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 116, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 120.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 26; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 120.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на гуманизированное антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 119; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 117, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 121.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 121.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 116, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 123.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 123.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 124.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 117, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 122.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 117, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 124.
В одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 118, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 122.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает гуманизированное антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 116, 117, 118, 146, 147, 148, 125, 126, 127, 131, 139 или 141; и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 120, 121, 122, 123, 124, 143, 144, 145, 128, 129, 130, 133, 135 или 137.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, которые содержат по настоящему изобретению вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10, 25 или 33, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11, 26, 34, 119, 132, 140 или 142; и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12, 27 или 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14, 29, 37, 134, 136 или 138; домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7, 30 или 38, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15, 31 или 39.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически конкурируют с антителом к B7-H3 или его фрагментом, как описано в данном документе, где указанная конкуренция может быть выявлена в анализе конкурентного связывания с использованием указанного антитела, полипептида B7-H3 человека и антитела к B7-H3 или его фрагмента.
В конкретных вариантах осуществления конкурирующее антитело или его антигенсвязывающая часть представляют собой антитело или его антигенсвязывающую часть, которые конкурируют с huAb3v2.5, huAb3v2.6 и huAb13v1.
В одном варианте осуществления антитела к B7-H3 или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению связываются с внеклеточным доменом B7-H3 человека (SEQ ID NO: 152) с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 1×10-6 M или меньше, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Альтернативно, антитела или их антигенсвязывающие части связываются с B7-H3 человека с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 М до приблизительно 1×10-11 М, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. В дополнительном альтернативном случае антитела или их антигенсвязывающие части связываются с B7-H3 человека с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 М до приблизительно 1×10-7 М, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса. Альтернативно, антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению связываются с B7-H3 человека с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 5×10-11 M, от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 5×10-10 M; с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 1×10-9 M; с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 5×10-9 M; с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 1×10-8 M; с KD, составляющей от приблизительно 1×10-6 M до приблизительно 5×10-8 M; с KD, составляющей от приблизительно 1×10-7 M до приблизительно 3,4×10-11 M; с KD, составляющей от приблизительно 5,9×10-7 M до приблизительно 2,2×10-7 M, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса.
В одном варианте осуществления антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению связываются с B7-H3 человека (SEQ ID NO: 149) с KD, составляющей приблизительно 1×10-6 M или меньше, определенной посредством поверхностного плазмонного резонанса. Альтернативно, антитела или их антигенсвязывающие части по настоящему изобретению связываются с B7-H3 человека (SEQ ID NO: 149) с KD, составляющей от приблизительно 8,2×10-9 M до приблизительно 6,3×10-10 M; с KD, составляющей от приблизительно 8,2×10-9 M до приблизительно 2,0×10-9 M; с KD, составляющей от приблизительно 2,3×10-9 M до приблизительно 1,5×10-10 M, как определено посредством поверхностного плазмонного резонанса.
Вышеизложенное установленное новое семейство B7-H3-связывающих белков, выделяемых в соответствии с настоящим изобретением, и включающих антигенсвязывающие полипептиды, которые содержат последовательности CDR, перечисленные в таблице последовательностей, приведенной в данном документе.
Антитела к B7-H3, предусмотренные в данном документе, могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где одна или несколько этих последовательностей CDR содержат указанные аминокислотные последовательности на основе антител, описанных в данном документе (например, huAb13v1 или huAb3v2.5), или их консервативные модификации, при этом антитела сохраняют необходимые функциональные свойства антител к B7-H3, описанных в данном документе. Соответственно, антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть могут содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где (а) последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 12 или 35, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены; (b) последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 15 или 39, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены; (c) антитело специфически связывается с B7-H3, и (d) антитело проявляет 1, 2, 3, 4, 5, 6 или все из следующих функциональных свойств, описанных в данном документе, например, связывание с растворимым B7-H3 человека. В одном варианте осуществления последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 140 или 34, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены; (b) последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 7 или 38, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены. В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 10 или 33, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены; (b) последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит SEQ ID NO: 136, 138 или 37, а также ее консервативные модификации, например, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 или 1-5 консервативные аминокислотные замены.
Консервативные аминокислотные замены также могут быть произведены в частях антител, отличных от CDR или в дополнение к ним. Например, консервативные аминокислотные модификации могут быть произведены в каркасной области или Fc-области. Вариабельная область или тяжелая или легкая цепи могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 или 1-50 консервативных аминокислотных замен относительно последовательности антитела к B7-H3, описанной в данном документе. В определенных вариантах осуществления антитела к B7-H3 содержат комбинацию консервативных и неконсервативных аминокислотных модификаций.
Для получения и отбора CDR, характеризующихся предпочтительным связыванием B7-H3 и/или нейтрализующей активностью в отношении hB7-H3, можно применять известные из уровня техники стандартные способы получения антител или их антигенсвязывающих частей и оценки характеристик связывания и/или нейтрализации B7-H3 у этих антител или их антигенсвязывающих частей, в том числе без ограничения конкретно описанные в данном документе.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. В определенных вариантах осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из константного домена IgG человека, константного домена IgМ человека, константного домена IgЕ человека и константного домена IgА человека. В дополнительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть имеет константную область тяжелой цепи IgG1, константную область тяжелой цепи IgG2, константную область IgG3 или константную область тяжелой цепи IgG4. Константная область тяжелой цепи предпочтительно представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может содержать константную область легкой цепи, которая представляет собой константную область легкой каппа-цепи либо константную область легкой лямбда-цепи. Предпочтительно антитело содержит константную область легкой каппа-цепи. В качестве альтернативы, часть антитела может представлять собой, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающая часть антитела к B7-H3 представляет собой Fab, Fab', F(ab')2, Fv, стабилизированный дисульфидными связями Fv, scFv, однодоменное антитело или диатело.
В определенных вариантах осуществления антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть представляют собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело.
Были описаны замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела (Winter, et al. патенты США №№ 5648260; 5624821, включенные в данный документ посредством ссылки). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например, индукцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и период полужизни/иммунный клиренс антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции являются желательными для терапевтического антитела, но в других случаях могут быть ненужными или даже вредными, в зависимости от терапевтических целей. Определенные изотипы IgG человека, в частности, IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC путем связывания соответственно с FcγR и компонентом C1q системы комплемента. Неонатальные Fc-рецепторы (FcRn) представляют собой важнейшие компоненты, определяющие период полужизни антител в кровотоке. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен в константной области антитела, например, Fc-области антитела, вследствие чего эффекторные функции антитела изменяются.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен рекомбинантный рецептор химерного антигена (CAR), содержащий области связывания описанных в данном документе антител, например, CDR тяжелых и/или легких цепей huAb13v1. Рекомбинантный CAR, описанный в данном документе, можно использовать для перенаправления специфичности Т-клеток на антиген независимым от человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) образом. Таким образом, CAR по настоящему изобретению можно использовать в иммунотерапии, для помощи в конструировании собственных иммунных клеток субъекта-человека, с целью распознавания и воздействия на опухоль субъекта (см., например, патент США №№ 6410319, 8389282, 8822647, 8906682, 8911993, 8916381, 8975071 и публикацию заявки на патент США № US20140322275, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в соответствии с технологией CAR). Этот тип иммунотерапии называется адоптивным переносом клеток (ACT) и может использоваться для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом.
CAR к B7-H3 по настоящему изобретению предпочтительно содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, специфичный для B7-H3, трансмембранный домен, который используется для заякоривания CAR в Т-клетке и один или несколько внутриклеточных сигнальных доменов. В одном варианте осуществления настоящего изобретения CAR включает трансмембранный домен, который содержит трансмембранный домен белка, выбранного из группы, состоящей из альфа-, бета- или зета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 и CD154. В одном варианте осуществления настоящего изобретения CAR содержит костимулирующий домен, например, костимулирующий домен, содержащий функциональный сигнальный домен белка, выбранного из группы, состоящей из OX40, CD2, CD27, CD28, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) и 4-1BB (CD137). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит scFv, содержащий CDR или вариабельные области, описанные данном документе, например, CDR или вариабельные области из антитела huAb13v1, трансмембранный домен, костимулирующий домен (например, функциональный сигнальный домен из CD28 или 4-1BB) и сигнальный домен, содержащий функциональный сигнальный домен из CD3 (например, CD3-зета).
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает Т-клетку, содержащую CAR (также называемую CAR T-клеткой), содержащую антигенсвязывающие области, например, CDR, описанных в данном документе антител или scFv, описанных в данном документе.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10, 25 или 33, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11, 26, 34, 119, 132, 140 или 142; и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12, 27 или 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14, 29, 37, 134, 136 или 138; домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7, 30 или 38; и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15, 31 или 39.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 14; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 132; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 140; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 134; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 136; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 142; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 138; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 33, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 34, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 37, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 38, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 39.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 26 или 119, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29, и домен CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30, и домен CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 26; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 25; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 119; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 27; и вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 29; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 30; и (c) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 31.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено меченое антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающую часть, где антитело является дериватизированным или связанным с одной или несколькими функциональными молекулами (например, другим пептидом или белком). Например, меченое антитело можно получить путем функционального связывания антитела или части антитела согласно настоящему изобретению (путем соединения химической связью, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным способом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемое средство, фармацевтическое средство, белок или пептид, которые могут опосредовать ассоциацию антитела или части антитела с другой молекулой (такой как стрептавидиновая сердцевинная область или полигистидиновая метка), и/или цитотоксическое или терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора митоза, противоопухолевого антибиотика, иммуномодулирующего средства, вектора для генной терапии, алкилирующего средства, антиангиогенного средства, антиметаболита, борсодержащего средства, хемопротективного средства, гормона, антигормонального средства, кортикостероида, фотоактивного терапевтического средства, олигонуклеотида, радионуклидного средства, ингибитора топоизомеразы, ингибитора киназы, радиосенсибилизатора и их комбинации.
Пригодные детектируемые средства, с помощью которых антитело или его часть могут быть дериватизированы, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые средства включают флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и т. п. Антитело может также быть дериватизировано с помощью детектируемых ферментов, таких как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т. п. Если антитело дериватизировано с помощью детектируемого фермента, его выявляют путем добавления дополнительных реагентов, которые фермент использует для выработки детектируемого продукта реакции. Например, если присутствует детектируемое средство пероксидаза хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к образованию окрашенного продукта реакции, который является детектируемым. Антитело также можно дериватизировать с помощью биотина и выявлять с помощью непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.
В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению конъюгировано с визуализирующим средством. Примеры визуализирующих средств, которые можно использовать в композициях и способах, описанных в данном документе, включают без ограничения радиоактивную метку (например, индий), фермент, флуоресцентную метку, люминесцентную метку, биолюминесцентную метку, магнитную метку и биотин.
В одном варианте осуществления антитела или ADC связаны с радиоактивной меткой, такой как без ограничения индий (111In). 111Индий можно использовать для мечения антител и ADC, описанных в данном документе, для применения при идентификации B7-H3-положительных опухолей. В определенном варианте осуществления антитела к B7-H3 (или ADC), описанные в данном документе, мечены 111I посредством бифункционального хелатообразователя, который представляет собой бифункциональный хелат циклогексилдиэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) (см. патенты США №№ 5124471, 5434287 и 5286850, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен гликозилированный связывающий белок, где антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающая часть содержат один или несколько углеводных остатков. Растущая в ходе образования in vivo белковая цепь может подвергаться дополнительному процессингу, известному как посттрансляционная модификация. В частности, ферментативным путем могут быть добавлены остатки сахаров (гликозильные группы), и этот процесс известен как гликозилирование. Полученные белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи, известны как гликозилированные белки или гликопротеины. Антитела представляют собой гликопротеины с одним или несколькими углеводными остатками в Fc-домене, а также в вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc-домене оказывают важное влияние на эффекторную функцию Fc-домена при минимальном влиянии на связывание антигена или период полужизни антитела (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). В отличие от этого, гликозилирование вариабельного домена может оказывать влияние на активность связывания антигена у антитела. Гликозилирование в вариабельном домене может отрицательно влиять на аффинность связывания антител, вероятно, из-за стерического затруднения (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), или приводить к увеличению аффинности к антигену (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
Один аспект настоящего изобретения направлен на получение мутантных форм по сайту гликозилирования, в которых мутации был подвергнут сайт O- или N-связанного гликозилирования. Специалист в данной области может получать такие мутантные формы с применением стандартных хорошо известных методов. Мутантные формы по сайту гликозилирования, которые сохраняют биологическую активность, но характеризуются повышенной или сниженной активностью связывания, представляют собой другой предмет настоящего изобретения.
В еще одном варианте осуществления гликозилирование антитела к B7-H3 или антигенсвязывающей части по настоящему изобретению является модифицированным. Например, можно получать агликозилированное антитело (т. е. антитело, в котором отсутствует гликозилирование). Гликозилирование может быть измененным, например, для повышения аффинности антитела к антигену. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, путем изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, можно сделать одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к устранению одного или нескольких сайтов гликозилирования вариабельной области, чтобы тем самым устранить гликозилирование в данном сайте. Такое aгликозилирование может повышать аффинность антитела к антигену. Такой подход описан более подробно в публикации согласно PCT WO2003016466A2 и патентах США №№ 5714350 и 6350861, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В качестве дополнения или альтернативы, можно получать модифицированное антитело к B7-H3 по настоящему изобретению, которое характеризуется измененным типом гликозилирования, как, например, гипофукозилированное антитело со сниженным количеством фукозильных остатков или антитело с повышенным содержанием структур с GlcNAc в точках ветвления. Было продемонстрировано, что такие измененные паттерны гликозилирования повышают способность антител к ADCC. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования были описаны в уровне техники, и их можно применять в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела согласно настоящему изобретению с получением, таким образом, антитела с измененным гликозилированием. См., например, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также европейский патент № EP 1176195; публикации согласно PCT WO 03/035835; WO 99/54342 80, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Гликозилирование белка зависит от аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, а также клетки-хозяина, в которой белок экспрессируется. Различные организмы могут вырабатывать различные гликозилирующие ферменты (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и имеют различные доступные субстраты (сахарные фрагменты нуклеотидов). Вследствие таких факторов паттерн гликозилирования белка и состав гликозильных остатков могут отличаться в зависимости от системы хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильные остатки, применимые в настоящем изобретении, могут включать без ограничения глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту. Гликозилированный связывающий белок предпочтительно содержит такие гликозильные остатки, что паттерн гликозилирования характерен для молекул человека.
Различия в гликозилировании белка могут приводить к различиям в характеристиках белка. Например, эффективность терапевтического белка, полученного в хозяине-микроорганизме, таком как дрожжи, и гликозилированного с использованием эндогенного пути дрожжей, может быть сниженной по сравнению с эффективностью такого же белка, экспрессированного в клетке млекопитающего, как, например, в линии клеток CHO. Такие гликопротеины также могут быть иммуногенными для человека и демонстрировать уменьшенный период полужизни in vivo после введения. Специфические рецепторы у человека и других животных могут распознавать специфические гликозильные остатки и способствовать быстрому клиренсу белка из кровотока. Другие неблагоприятные эффекты могут включать изменения сворачивания белка, его растворимости, восприимчивости к протеазам, миграции, транспорта, компартментализации, секреции, распознавания другими белками или факторами, антигенности или аллергенности. Соответственно, специалист-практик может предпочитать терапевтический белок с конкретным составом и паттерном гликозилирования, например, составом и паттерном гликозилирования, идентичным или по меньшей мере аналогичным тому, который образуется в клетках человека или в видоспецифических клетках предполагаемого субъекта-животного.
Экспрессия гликозилированных белков, отличных от образуемых клеткой-хозяином, может быть достигнута путем генетической модификации клетки-хозяина таким образом, чтобы она экспрессировала гетерологичные гликозилирующие ферменты. С помощью рекомбинантных методик специалист-практик может получать антитела или их антигенсвязывающие части, демонстрирующие гликозилирование, характерное для белков человека. Например, штаммы дрожжей были генетически модифицированы для экспрессии не встречающихся в природе гликозилирующих ферментов, вследствие чего гликозилированные белки (гликопротеины), вырабатываемые в этих штаммах дрожжей, демонстрируют гликозилирование белков, идентичное наблюдаемому в клетках животных, в частности, в клетках человека (публикации заявок на патент США №№ 20040018590 и 20020137134 и публикация согласно PCT WO2005100584 A2).
Антитела можно получить с помощью любой из ряда методик. Например, с помощью экспрессии в клетках-хозяевах, при этом вектор(векторы) экспрессии, кодирующий(кодирующие) тяжелую и легкую цепи, вводят путем трансфекции в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. Подразумевается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают широкий спектр методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, осаждение с помощью фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, и т. п. Хотя экспрессировать антитела возможно и в прокариотических, и в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках является предпочтительной, и наиболее предпочтительной - в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего, поскольку такие эукариотические клетки (и, в частности, клетки млекопитающего) с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, могут собирать и секретировать правильно свернутое и иммунологически активное антитело.
Предпочтительные клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, для экспрессии рекомбинантных антител согласно настоящему изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (CHO) (в том числе DHFR- клетки CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, применяемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2. В случаях, когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции антитела в среду для культивирования, в которой клетки-хозяева выращиваются. Антитела можно извлекать из среды для культивирования с помощью стандартных способов очистки белка.
Клетки-хозяева также можно применять для получения функциональных фрагментов антитела, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Будет понятно, что видоизменения вышеописанной процедуры находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, может быть желательно трансфицировать клетку-хозяина с помощью ДНК, кодирующей функциональные фрагменты одной из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела согласно настоящему изобретению. Технологию рекомбинантных ДНК также можно применять для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих какую-либо одну или обе из легкой и тяжелой цепей, которые не являются необходимыми для связывания представляющих интерес антигенов. Антитела согласно настоящему изобретению также охватывают молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК. В дополнение, можно получать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь принадлежат к антителу согласно настоящему изобретению, а другие тяжелая и легкая цепи являются специфическими в отношении антигена, отличного от представляющих интерес антигенов, путем сшивания антитела согласно настоящему изобретению со вторым антителом с помощью стандартных способов химического сшивания.
В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в DHFR- клетки CHO c помощью трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP, которые управляют высокими уровнями транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген DHFR, который обеспечивает возможность отбора клеток CHO, которые были трансфицированы вектором, с применением отбора/амплификации под воздействием метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют, чтобы обеспечить экспрессию тяжелой и легкой цепей антитела, и целое антитело извлекают из среды для культивирования. Применяют стандартные методики молекулярной биологии, чтобы получать рекомбинантный вектор экспрессии, трансфицировать клетки-хозяева, производить отбор трансформантов, культивировать клетки-хозяева и извлекать антитело из среды для культивирования. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ синтеза рекомбинантного антитела согласно настоящему изобретению путем культивирования клетки-хозяина в подходящей среде для культивирования до тех пор, пока не синтезируется рекомбинантное антитело. Рекомбинантные антитела по настоящему изобретению можно получать с применением молекул нуклеиновой кислоты, соответствующих аминокислотным последовательностям, раскрытым в данном документе. Способ может дополнительно предусматривать выделение рекомбинантного антитела из культуральной среды.
N- и С-концы полипептидных цепей антител по настоящему изобретению могут отличаться от ожидаемой последовательности из-за обычно наблюдаемых посттрансляционных модификаций. Например, C-концевые лизиновые остатки часто отсутствуют в тяжелых цепях антител. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. N-концевые глутаминовые остатки и в меньшей степени глутаматные остатки часто превращаются в пироглутаматные остатки как на легких, так и на тяжелых цепях терапевтических антител. Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) JBC 28611211; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211.
III. Конъюгаты антитела к B7-H3 и лекарственного средства (ADC)
Антитела к B7-H3, описанные в данном документе, могут быть конъюгированы с фрагментом в виде лекарственного средства с образованием конъюгата лекарственного средства и антитела к B7-H3 (ADC). Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) могут повышать терапевтическую эффективность антител при лечении заболеваний, например рака, что обусловлено способностью ADC к селективной доставке одного или нескольких фрагментов в виде лекарственного средства к целевым тканям, таким как опухоли, в которых экспрессируется опухоль-ассоциированный антиген, например B7-H3. Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает ADC с антителом к B7-H3 для терапевтического применения, например лечения рака.
ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению содержат антитело к B7-H3, т. е. антитело, которое специфически связывается с B7-H3, связанное с одним или несколькими фрагментами в виде лекарственного средства. Специфичность ADC определяется специфичностью антитела, т. е. антитела к B7-H3. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 связано с одним или несколькими цитотоксическими лекарственными средствами, которые доставляются внутрь трансформированной раковой клетки, экспрессирующей B7-H3.
Примеры лекарственных средств, которые можно применять в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, а также линкеры, которые можно применять для конъюгации антитела и одного или нескольких лекарственных средств, приведены ниже. Термины "лекарственное средство", "средство" и "фрагмент в виде лекарственного средства" используются в данном документе взаимозаменяемо. Термины "связанный" и "конъюгированный" также используются в данном документе взаимозаменяемо и указывают на то, что антитело и фрагмент ковалентно связаны.
В некоторых вариантах осуществления ADC имеет следующую формулу (формула I):
,
где Ab представляет собой антитело, например антитело к B7-H3 huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, и (L) представляет собой линкер, (D) представляет собой лекарственное средство, а LK представляет собой ковалентную связь, связывающую линкер L с антителом Ab; и m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 20. D представляет собой фрагмент в виде лекарственного средства, характеризующийся, например, цитостатической, цитотоксической или иной терапевтической активностью в отношении клетки-мишени, например клетки, экспрессирующей B7-H3. В некоторых вариантах осуществления m находится в диапазоне от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 2 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2, от 1,5 до 8, от 1,5 до 7, от 1,5 до 6, от 1,5 до 5, от 1,5 до 4, от 2 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или от 2 до 4. DAR для ADC эквивалентно "m", указанному в формуле I. В одном варианте осуществления ADC имеет формулу Ab-(LK-LD)m, где Ab представляет собой антитело к B7-H3, например, huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, L представляет собой линкер, D представляет собой лекарственное средство, например, ингибитор Bcl-xL или ауристатин, такой как MMAF или MMAE, и m равняется от 2 до 4 (что эквивалентно DAR 2-4). Дополнительные подробности относительно лекарственных средств (D из формулы I) и линкеров (L из формулы I), которые можно использовать в ADC согласно настоящему изобретению, а также альтернативные структуры ADC описаны ниже.
III. A. ADC с антителом к B7-H3: Ингибиторы Bcl-xL, линкеры, синтоны и способы их получения
Патология рака также подразумевает нарушение апоптотических путей. Подразумеваемое вовлечение подавления апоптоза (и, в частности, семейства белков Bcl-2) в возникновение злокачественных новообразований позволило выявить новый способ направленного воздействия на это все еще трудное для понимания заболевание. Исследования показали, например, что антиапоптотические белки Bcl 2 и Bcl-xL сверхэкспрессируются во многих типах раковых клеток. См. Zhang, 2002, Nature Reviews/Drug Discovery 1:101; Kirkin et al., 2004, Biochimica Biophysica Acta 1644:229-249; и Amundson et al., 2000, Cancer Research 60:6101-6110. Эффектом этой дерегуляции является выживание измененных клеток, которые в иных обстоятельствах подверглись бы апоптозу в нормальных условиях. Считается, что повторяемость этих дефектов, ассоциированных с нерегулируемой пролиферацией, является отправной точкой развития рака.
Аспекты настоящего изобретения касаются ADC с антителом к hB7-H3, содержащих антитело к hB7-H3 конъюгированное с лекарственным средством посредством линкера, где лекарственное средство представляет собой ингибитор Bcl-xL. В конкретных вариантах осуществления ADC представляют собой соединения согласно структурной формуле (I) ниже или их фармацевтически приемлемую соль, где Ab представляет антитело к hB7-H3, D представляет собой лекарственное средство, являющееся ингибитором Bcl-xL (т. е. соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), как показано ниже), L представляет собой линкер, LK представляет собой ковалентную связь, связывающую линкер (L) с антителом к hB7-H3 (Ab) и m представляет число звеньев DL-LK, связанных с антителом, которое представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 20. В определенных вариантах осуществления m равняется 2, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления m находится в диапазоне от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 2 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 2 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или составляет 1.
,
Конкретные варианты осуществления различных ингибиторов Bcl-xL как таковых и различных ингибиторов Bcl-xL (D), линкеров (L) и антител к B7-H3 (Ab), которые могут содержаться в описанных в данном документе ADC, а также ряд ингибиторов Bcl -xL, связанных с ADC, описаны более подробно ниже.
Примеры ингибиторов Bcl-xL, которые можно применять в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, приведены ниже, а также линкеры, которые можно применять для конъюгации антитела и одного или нескольких ингибиторов Bcl-xL. Термины "связанный" и "конъюгированный" также используются в данном документе взаимозаменяемо и указывают на то, что антитело и фрагмент ковалентно связаны.
III.A.1. Ингибиторы Bcl-xL
Один аспект настоящего изобретения относится к ингибиторам Bcl-xL, которые характеризуются низкой способностью к прониканию в клетки. Соединения, как правило, являются гетероциклическими по своей природе и содержат одну или несколько солюбилизирующих групп, которые придают соединениям высокую растворимость в воде и низкую способность к прониканию в клетки. Солюбилизирующие группы, как правило, представляют собой группы, которые способны образовывать водородную связь за счет возникновения диполь-дипольных взаимодействий и/или которые предусматривают полимер, представляющий собой полиэтиленгликоль, содержащий от 1 до 30 звеньев, один или несколько полиолов, одну или несколько солей или одну или несколько групп, которые являются заряженными при физиологическом значении pH.
Ингибиторы Bcl-xL могут применяться в виде соединений или солей per se в различных способах, описанных в данном документе, или могут быть включены в качестве составной части ADC.
Конкретные варианты осуществления ингибиторов Bcl-xL, которые могут применяться в неконъюгированной форме или которые могут быть включены в качестве части ADC, включают соединения согласно структурным формулам (IIa), (IIb), (IIc) или (IId). В настоящем изобретении в случае, если ингибиторы Bcl-xL включены в качестве части ADC, #, показанный в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId) ниже, представляет собой точку присоединения к линкеру, что указывает на то, что они представлены в форме монорадикала:
,,,,
или его фармацевтически приемлемой соли, где
Ar1 выбран из , , , , , , , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила;
Ar2 выбран из, , , , , , , , 
, и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- или #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен;
Z1 выбран из N, CH, C-галоген, C-CH3 и C-CN;
каждый из Z2a и Z2b независимо друг от друга выбран из связи, NR6, CR6aR6b, O, S, S(O), S(O)2, -NR6C(O)-, -NR6aC(O)NR6b- и -NR6C(O)O-;
R' представляет собой алкилен, гетероалкилен, циклоалкилен, гетероциклен, арил или гетероарил, независимо замещенный при одном или нескольких атомах углерода или гетероатомах солюбилизирующим фрагментом, предусматривающим группу, выбранную из полиола, полиэтиленгликоля, содержащего от 4 до 30 этиленгликолевых звеньев, соли и группы, которая является заряженной при физиологическом значении pH, и их комбинаций, где #, в случае присоединения к R', присоединен к R' при любом атоме R', который может быть замещен;
R1 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила, этила и циано;
R2 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила и циано;
R3 выбран из водорода, метила, этила, галогенметила и галогенэтила;
R4 выбран из водорода, низшего алкила и низшего гетероалкила или взят вместе с атомом R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце;
каждый из R6, R6a и R6b независимо друг от друга выбран из водорода, необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного низшего гетероалкила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного гетероциклила или взят вместе с атомом из R4 и атомом из R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце;
каждый из R11a и R11b независимо друг от друга выбран из водорода, галогена, метила, этила, галогенметила, гидроксила, метокси, CN и SCH3;
R12 необязательно представляет собой R' или выбран из водорода, галогена, циано, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного гетероалкила, необязательно замещенного гетероциклила и необязательно замещенного циклоалкила;
R13 выбран из необязательно замещенного C1-8алкилена, необязательно замещенного гетероалкилена, необязательно замещенного гетероциклена и необязательно замещенного циклоалкилена; и
# представляет собой точку присоединения к линкеру L.
Один вариант осуществления ингибиторов Bcl-xL, которые могут применяться в неконъюгированной форме или которые могут быть включены в качестве части ADC, включает соединения согласно структурным формулам (IIa), (IIb), (IIc) или (IId):
,,,,
или их фармацевтически приемлемую соль, где
Ar1 выбран из , , , , , , , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила;
Ar2 выбран из , , , , , , , , , и или их N-оксида и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси, нитро, низшего алкила, низшего гетероалкила, C1-4алкокси, амино, циано и галогенметила, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- или #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен;
Z1 выбран из N, CH, C-галоген, C-CH3 и C-CN;
каждый из Z2a и Z2b независимо друг от друга выбран из связи, NR6, CR6aR6b, O, S, S(O), S(O)2, -NR6C(O)-, -NR6aC(O)NR6b- и -NR6C(O)O-;
R' представляет собой или , где #, в случае присоединения к R', присоединен к R' при любом атоме R', который может быть замещен;
X' в каждом случае выбран из -N(R10)-, -N(R10)C(O)-, -N(R10)S(O)2-, -S(O)2N(R10)- и -O-;
n выбран из 0-3;
R10 в каждом случае независимо выбран из водорода, низшего алкила, гетероцикла, аминоалкила, G-алкила и -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2;
G в каждом случае независимо выбран из полиола, полиэтиленгликоля с 4-30 повторяющимися звеньями, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
SPa в каждом случае независимо выбран из кислорода, -S(O)2N(H)-, -N(H)S(O)2-, -N(H)C(O)-, -C(O)N(H)-, -N(H)-, арилена, гетероциклена и необязательно замещенного метилена; где метилен необязательно замещен одним или несколькими из -NH(CH2)2G, NH2, C1-8алкила и карбонила;
m2 выбран из 0-12;
R1 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила, этила и циано;
R2 выбран из водорода, метила, галогена, галогенметила и циано;
R3 выбран из водорода, метила, этила, галогенметила и галогенэтила;
R4 выбран из водорода, низшего алкила и низшего гетероалкила или взят вместе с атомом R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце;
каждый из R6, R6a и R6b независимо друг от друга выбран из водорода, необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного низшего гетероалкила, необязательно замещенного циклоалкила и необязательно замещенного гетероциклила или взят вместе с атомом из R4 и атомом из R13 с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце;
каждый из R11a и R11b независимо друг от друга выбран из водорода, галогена, метила, этила, галогенметила, гидроксила, метокси, CN и SCH3;
R12 необязательно представляет собой R' или выбран из водорода, галогена, циано, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного гетероалкила, необязательно замещенного гетероциклила и необязательно замещенного циклоалкила;
R13 выбран из необязательно замещенного C1-8алкилена, необязательно замещенного гетероалкилена, необязательно замещенного гетероциклена и необязательно замещенного циклоалкилена; и
# представляет собой точку присоединения к линкеру L.
В случае, если ингибитор Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa) - (IId) не является компонентом ADC, # в формулах (IIa) - (IId) представляет собой точку присоединения к атому водорода. В случае, если ингибитор Bcl-xL представляет собой компонент ADC, # в формулах (IIa) - (IId) представляет собой точку присоединения к линкеру. В случае, если ингибитор Bcl-xL представляет собой компонент ADC, ADC может содержать один или несколько ингибиторов Bcl-xL, которые могут быть одинаковыми или различными, но, как правило, они являются одинаковыми.
В определенных вариантах осуществления R' представляет собой C2-C8гетероалкилен, замещенный одним или несколькими фрагментами, предусматривающими соль и/или группу, которая является заряженной при физиологическом значении pH. Соль может быть выбрана, например, из карбоксилатной, сульфонатной, фосфонатной соли и соли с ионом аммония. Например, соль может представлять собой карбоксилатную, сульфонатную или фосфонатную соль натрия или калия или хлоридную соль с ионом аммония. Группа, которая является заряженной при физиологическом значении pH, может представлять собой любую группу, которая является заряженной при физиологическом значении pH, в том числе, в качестве примера и без ограничения, цвиттер-ионную группу. В определенных вариантах осуществления группа, которая представляет собой соль, представляет собой диполярный фрагмент, такой как без ограничения N-оксиды аминов, в том числе определенных гетероциклилов, таких как без ограничения пиридин и хинолин. В конкретных вариантах осуществления группа, которая является заряженной при физиологическом значении pH, в каждом случае независимо выбрана из карбоксилата, сульфоната, фосфоната и амина.
В определенных вариантах осуществления R' представляет собой C2-C8гетероалкилен, замещенный одним или несколькими фрагментами, предусматривающими полиэтиленгликоль или полиол, такой как диол или сахарный фрагмент.
В определенных вариантах осуществления R' может быть замещен некоторыми группами в дополнение к солюбилизирующему фрагменту. Например, R' может быть замещен одной или несколькими одинаковыми или различными алкильными, гетероалкильными, циклоалкильными, гетероциклильными, арильными, гетероарильными группами или группами, представляющими собой атом галогена.
В определенных вариантах осуществления R' представлен формулой:
или соответствующей ей фармацевтически приемлемой соли, где
X' в каждом случае выбран из -N(R10)- и -O-;
n выбран из 1-3;
R10 независимо выбран в каждом случае из водорода, алкила, гетероцикла, аминоалкила, G-алкила, гетероцикла и -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2;
G в каждом случае независимо выбран из полиола, полиэтиленгликоля с 4-30 повторяющимися звеньями (называемого в данном документе PEG4-30), соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
SPa в каждом случае независимо выбран из кислорода, сульфонамида, арилена, гетероциклена и необязательно замещенного метилена; где метилен необязательно замещен одним или несколькими из -NH(CH2)2G, амина и карбонила; и
m2 выбран из 0-6,
при этом в R', который присоединяется к линкеру или атому водорода при замещаемом атоме азота R', присутствует по меньшей мере один замещаемый атом азота.
В определенных вариантах осуществления R' представляет собой или ;
X' в каждом случае выбран из -N(R10)-, -N(R10)C(O)-, -N(R10)S(O)2-, -S(O)2N(R10)- и -O-;
n выбран из 0-3;
R10 в каждом случае независимо выбран из водорода, алкила, гетероцикла, аминоалкила, G-алкила, гетероцикла и -(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH2;
G в каждом случае независимо выбран из полиола, полиэтиленгликоля с 4-30 повторяющимися звеньями, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
SPa в каждом случае независимо выбран из кислорода, -S(O)2N(H)-, -N(H)S(O)2-, -N(H)C(O)-, -C(O)N(H)-, -N(H)-, арилена, гетероциклена и необязательно замещенного метилена; где метилен необязательно замещен одним или несколькими из -NH(CH2)2G, амина, алкила и карбонила;
m2 выбран из 0-12, и
#, в случае присоединения к R', присоединен к R' при любом атоме R', который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае представляет собой соль или фрагмент, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае представляет собой карбоксилатную, сульфонатную, фосфонатную или аммониевую соль.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае представляет собой фрагмент, который является заряженным при физиологическом значении pH, выбранный из группы, состоящей из карбоксилата, сульфоната, фосфоната и амина.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае представляет собой фрагмент, предусматривающий полиэтиленгликоль с 4-30 повторяющимися звеньями или полиол.
В определенных вариантах осуществления полиол представляет собой сахар.
В определенных вариантах осуществления R' в формуле (IIa) или (IId) включает по меньшей мере один замещаемый атом азота, подходящий для присоединения к линкеру.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае независимо выбран из
, , , , , , ,, и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В определенных вариантах осуществления M представляет собой Na+, K+ или Li+. В определенных вариантах осуществления M представляет собой водород. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления G в каждом случае независимо выбран из
, , , , , , , , , , , , , , 
, 
и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В определенных вариантах осуществления M представляет собой водород. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления R' выбран из
, 
, 
, 
, 
,
, 
, 
, 
, 
, 
, 
,
, 
, 
, 
, 
,
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
и 
или их соли.
В случае, если ингибиторы Bcl-xL согласно данному варианту осуществления включены в ADC, линкер в ADC связан с атомом азота доступной группы первичного или вторичного амина.
В определенных вариантах осуществления R' выбран из
, , , , ,, , , , , , ,, , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
, 
,
, 
, 
, 
, 
или их соли.
В случае, если ингибиторы Bcl-xL согласно данному варианту осуществления включены в ADC, линкер в ADC связан с атомом азота доступной группы первичного или вторичного амина.
В определенных вариантах осуществления R' выбран из , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,, , и , где # представляет собой либо атом водорода в содержащемся в ADC лекарственном средстве, представляющем собой ингибитор Bcl-xL формулы (IIb) или (IIc), либо точку присоединения в содержащемся в ADC лекарственном средстве, представляющем собой ингибитор Bcl-xL формулы (IIa) или (IId), к линкеру L.
В определенных вариантах осуществления Ar1 в формулах (IIa) - (IId) выбран из , и . В определенных вариантах осуществления Ar1 в формулах (IIa) - (IId) выбран из , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, независимо выбранными из галогена, циано, метила и галогенметила. В конкретных вариантах осуществления Ar1 представляет собой .
В определенных вариантах осуществления Ar2 представляет собой необязательно замещенный одним или несколькими заместителями, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- или #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен;
В определенных вариантах осуществления Ar2 выбран из , , , , , , , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- и #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления Ar2 выбран из , , , , , , , и и необязательно замещен одним или несколькими заместителями, где заместители R12-Z2b-, R'-Z2b-, #-N(R4)-R13-Z2b- и #-R'-Z2b- присоединяются к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления Ar2 замещен одной или несколькими солюбилизирующими группами. В определенных вариантах осуществления каждая солюбилизирующая группа независимо от других выбрана из фрагмента, предусматривающего полиол, полиэтиленгликоль с 4-30 повторяющимися звеньями, соли или фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В определенных вариантах осуществления Z1 в формулах (IIa) - (IId) представляет собой N.
В определенных вариантах осуществления Z2a в формулах (IIa) - (IId) представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формулах (IIa) - (IId) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формулах (IIa) - (IId) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формулах (IIa) - (IId) представляет собой -NR6C(O)-. В конкретных вариантах осуществления R6 представляет собой водород.
В определенных вариантах осуществления Z2b в формулах (IIa) - (IId) представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2b в формулах (IIa) - (IId) представляет собой NH или CH2.
В определенных вариантах осуществления R1 в формулах (IIa) - (IId) выбран из метила и хлора.
В определенных вариантах осуществления R2 в формулах (IIa) - (IId) выбран из водорода и метила. В конкретных вариантах осуществления R2 представляет собой водород.
В определенных вариантах осуществления ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa). В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa), соединение характеризуется структурной формулой (IIa.1):
(IIa.1),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R11a, R11b, R12, G и # определены выше;
Y представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
r равняется 0 или 1; и
s равняется 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), r равняется 0, и s равняется 1.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), r равняется 0, и s равняется 2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), r равняется 1, и s равняется 2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Z2a выбран из O, NH, CH2 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.1) представляет собой -CR6aR6b-. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.1) представляет собой CH2. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.1) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.1) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Y выбран из этилена, пропилена и бутилена. В конкретных вариантах осуществления Y выбран из этилена и пропилена.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), G выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой 
. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Ar2 представляет собой 
. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Ar2 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Z2b-R12 выбран из H, F, CN, OCH3, OH, NH2, OCH2CH2OCH3, N(CH3)C(=O)CH3, CH2N(CH3)C(=O)CH3SCH3, C(=O)N(CH3)2 и OCH2CH2N(CH3)(C(=O)CH3). В конкретных вариантах осуществления Z2b-R12 выбран из H, F и CN. В конкретных вариантах осуществления Z2b-R12 представляет собой H.
В вариантах осуществления, где Z2b-R12 замещен гидроксилом (OH), атом кислорода может служить в качестве точки присоединения к связывающей группе (см. раздел 4.4.1.1).
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.1), группа 
присоединенная к адамантановому кольцу, выбрана из
В определенных вариантах осуществления соединение формулы (IIa.1) может быть превращено в соединение формулы IIa.1.1, где n выбран из 1-3:
IIa.1.1.
В определенных вариантах осуществления соединение формулы IIa.1.1 может быть превращено в соединение формулы IIa.1.2, где L представляет собой линкер, и LK представляет собой связь, образованную между реакционноспособной функциональной группой линкера L и комплементарной функциональной группой антитела.
IIa.1.2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa), соединение характеризуется структурной формулой (IIa.2):
(IIa.2),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R11a, R11b, R12 и # определены выше;
U выбран из N, O и CH, при условии, что если U представляет собой O, то Va и R21a отсутствуют;
R20 выбран из H и C1-C4алкила;
каждый из R21a и R21b независимо друг от друга отсутствует или выбран из H, C1-C4алкила и G, где G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
каждый из Va и Vb независимо друг от друга отсутствует или выбран из связи и необязательно замещенного алкилена;
R20 выбран из H и C1-C4алкила; и
s равняется 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), s равняется 2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Z2a выбран из O, NH, CH2 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.2) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.2) представляет собой CH2. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.2) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.2) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), U выбран из N и O. В конкретных вариантах осуществления U представляет собой O.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Va представляет собой связь, R21a представляет собой C1-C4алкильную группу, Vb выбран из метилена и этилена, и R21b представляет собой G. В конкретных вариантах осуществления Va представляет собой связь, R21a представляет собой метильную группу, и Vb выбран из метилена и этилена, и R21b представляет собой G.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Va выбран из метилена и этилена, R21a представляет собой G, Vb выбран из метилена и этилена, и R21b представляет собой G. В конкретных вариантах осуществления Va представляет собой этилен, R21a представляет собой G, Vb выбран из метилена и этилена, и R21b представляет собой G.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), G выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой . В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), R20 выбран из водорода и метильной группы.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Ar2 представляет собой 
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Z2b-R12 выбран из H, F, CN, OCH3, OH, NH2, OCH2CH2OCH3, N(CH3)C(=O)CH3, CH2N(CH3)C(=O)CH3SCH3, C(=O)N(CH3)2 и OCH2CH2N(CH3)(C(=O)CH3). В конкретных вариантах осуществления Z2b-R12 выбран из H, F и CN. В определенных вариантах осуществления Z2b-R12 представляет собой H. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Ar1 представляет собой 
. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.2), Ar2 представляет собой 
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa), соединение характеризуется структурной формулой (IIa.3):
(IIa.3),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R11a, R11b, R12 и # определены выше;
Rb выбран из H, C1-C4алкила и Jb-G или необязательно взят вместе с атомом T с образованием кольца, содержащего от 3 до 7 атомов;
каждый из Ja и Jb независимо друг от друга выбран из необязательно замещенного C1-C8алкилена и необязательно замещенного фенилена;
T выбран из необязательно замещенного C1-C8алкилена, CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2, CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2 и полиэтиленгликоля, содержащего от 4 до 10 этиленгликолевых звеньев;
G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH; и
s равняется 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), s равняется 1. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), s равняется 2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Z2a выбран из O, CH2 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a формулы (IIa.3) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.3) представляет собой CH2. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.3) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIa.3) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ja выбран из метилена и этилена, и Rb представляет собой Jb-G, где Jb представляет собой метилен или этилен. В некоторых таких вариантах осуществления T представляет собой этилен. В других таких вариантах осуществления T представляет собой CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2. В других таких вариантах осуществления T представляет собой полиэтиленгликоль, содержащий от 4 до 10 этиленгликолевых звеньев.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ja выбран из метилена и этилена, и Rb взят вместе с атомом T с образованием кольца, содержащего 4-6 атомов в кольце.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ja выбран из метилена и этилена, и Rb представляет собой H или алкил. В некоторых таких вариантах осуществления T представляет собой этилен. В других таких вариантах осуществления T представляет собой CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), G выбран из 
, где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой 
. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), R20 выбран из водорода и метильной группы.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ar2 представляет собой 
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ar2 выбран из
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ar2 представляет собой 
, где заместитель R12-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Z2b-R12 выбран из H, F, CN, OCH3, OH, NH2, OCH2CH2OCH3, N(CH3)C(=O)CH3, CH2N(CH3)C(=O)CH3SCH3, C(=O)N(CH3)2 и OCH2CH2N(CH3)(C(=O)CH3). В конкретных вариантах осуществления Z2b-R12 выбран из H, F и CN. В конкретных вариантах осуществления Z2b-R12 представляет собой H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), группа 
выбрана из
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIa.3), группа 
выбрана из
В определенных вариантах осуществления ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb). В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb), соединение характеризуется структурной формулой (IIb.1):
(IIb.1),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R4, R11a, R11b и # определены выше;
Y представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
r равняется 0 или 1; и
s равняется 1, 2 или 3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), s равняется 1. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), s равняется 2. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), s равняется 3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Z2a выбран из O, CH2, NH и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIb.1) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIb.1) представляет собой CH2. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIb.1) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIb.1) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Z2b выбран из O, CH2, NH, NCH3 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой O. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NH. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NCH3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Y представляет собой этилен, и r равняется 0.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Y представляет собой этилен, и r равняется 1.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), R4 представляет собой H или метил. В конкретных вариантах осуществления R4 представляет собой метил. В других вариантах осуществления R4 представляет собой H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), R4 взят вместе с атомом Y с образованием кольца, содержащего 4-6 атомов в кольце. В конкретных вариантах осуществления кольцо представляет собой циклобутановое кольцо. В других вариантах осуществления кольцо представляет собой пиперазиновое кольцо. В других вариантах осуществления кольцо представляет собой морфолиновое кольцо.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), G выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой . В других вариантах осуществления G представляет собой SO3H. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой NH2. В других вариантах осуществления G представляет собой PO3H2. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой NH2. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой C(O)OH. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой полиол.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Ar2 выбран из
, где заместитель G-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель G-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Ar2 выбран из
, где заместитель G-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель G-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), группа 
выбрана из
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), группа 
выбрана из
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIb.1), группа выбрана из
В определенных вариантах осуществления ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc). В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc), соединение характеризуется структурной формулой (IIc.1):
(IIc.1),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R4, R11a, R11b и # определены выше;
Ya представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
Yb представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
R23 выбран из H и C1-C4алкила; и
G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Z2a выбран из O, CH2, NH и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.1) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.1) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.1) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Z2b выбран из O, CH2, NH, NCH3 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой O. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NH. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NCH3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Z2b представляет собой связь. В некоторых таких вариантах осуществления Ya представляет собой метилен или этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Z2b представляет собой O. В некоторых таких вариантах осуществления Ya представляет собой метилен, этилен или пропилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Z2b представляет собой NR6, где R6 определен выше. В некоторых таких вариантах осуществления R6 взят вместе с атомом из Ya с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце. В некоторых таких вариантах осуществления кольцо содержит 5 атомов.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ya представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ya представляет собой метилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ya представляет собой пропилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), R4 представляет собой H или метил. В конкретных вариантах осуществления R4 представляет собой H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Yb представляет собой этилен или пропилен. В конкретных вариантах осуществления Yb представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), R23 представляет собой метил.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), R23 представляет собой H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), G выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой . В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ar2 выбран из 
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ar2 выбран из
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), группа 
выбрана из
.
В других вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.1), группа выбрана из
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc), соединение характеризуется структурной формулой (IIc.2):
(IIc.2),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R4, R11a, R11b и # определены выше;
Ya представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
Yb представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
Yc представляет собой необязательно замещенный C1-C8алкилен;
R23 выбран из H и C1-C4алкила;
R25 представляет собой Yb-G или взят вместе с атомом Yc с образованием кольца, содержащего 4-6 атомов в кольце; и
G выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Z2a выбран из O, CH2, NH и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.2) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.2) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IIc.2) представляет собой -NR6C(O)-. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Z2b выбран из O, CH2, NH, NCH3 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой O. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NH. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой NCH3.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Z2b представляет собой связь. В некоторых таких вариантах осуществления Ya представляет собой метилен или этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Z2b представляет собой NR6, где R6 определен выше. В некоторых таких вариантах осуществления R6 взят вместе с атомом из Ya с образованием циклоалкильного или гетероциклильного кольца, содержащего от 3 до 7 атомов в кольце. В некоторых таких вариантах осуществления кольцо содержит 5 атомов.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ya представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ya представляет собой метилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), R4 представляет собой H или метил.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Yb представляет собой этилен или пропилен. В конкретных вариантах осуществления Yb представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Yc представляет собой этилен или пропилен. В конкретных вариантах осуществления Yb представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), R25 взят вместе с атомом Yc с образованием кольца, содержащего 4 или 5 атомов в кольце.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), R23 представляет собой метил.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), G выбран из 
, где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой 
. В конкретных вариантах осуществления G представляет собой SO3H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ar2 выбран из
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ar2 представляет собой 
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ar2 выбран из
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ar2 представляет собой 
, где заместитель #-N(R4)-Ya-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IIc.2), группа 
выбрана из
.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId), соединение характеризуется структурной формулой (IId.1):
(IId.1),
или его соли, где
Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R1, R2, R11a, R11b и # определены выше;
Ya представляет собой необязательно замещенный алкилен;
Yb представляет собой необязательно замещенный алкилен;
R23 выбран из H и C1-C4алкила;
Ga выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
Gb выбран из полиола, PEG4-30, соли и фрагмента, который является заряженным при физиологическом значении pH;
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), s равняется 1.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), s равняется 2.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Z2a выбран из O, NH, CH2 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2a представляет собой O. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IId.1) представляет собой CR6aR6b. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IId.1) представляет собой S. В определенных вариантах осуществления Z2a в формуле (IId.1) представляет собой -NR6C(O)-.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Z2b выбран из O, NH, CH2 и S. В конкретных вариантах осуществления Z2b представляет собой O.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ya выбран из этилена, пропилена и бутилена. В конкретных вариантах осуществления Y представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ya выбран из этилена, пропилена и бутилена. В конкретных вариантах осуществления Y представляет собой этилен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ga выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления Ga представляет собой . В конкретных вариантах осуществления Ga представляет собой SO3H. В конкретных вариантах осуществления Ga представляет собой CO2H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Gb выбран из , , и , где M представляет собой водород или положительно заряженный противоион. В конкретных вариантах осуществления Gb представляет собой . В конкретных вариантах осуществления Gb представляет собой SO3H. В конкретных вариантах осуществления Gb представляет собой CO2H.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), R23 представляет собой метил.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ar2 выбран из
, где заместитель Ga-Ya-N(#)-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель Ga-Ya-N(#)-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ar2 выбран из
, где заместитель Ga-Ya-N(#)-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен. В конкретных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ar2 представляет собой 
, где заместитель Ga-Ya-N(#)-(CH2)s-Z2b- присоединен к Ar2 при любом атоме Ar2, который может быть замещен.
В определенных вариантах осуществления, в которых ингибитор Bcl-xL представляет собой соединение формулы (IId.1), Ar1 представляет собой 
.
В определенных вариантах осуществления R11a и R11b в формулах (IIa) - (IId) являются одинаковыми. В конкретном варианте осуществления каждый из R11a и R11b представляет собой метил.
В определенных вариантах осуществления соединения формул (IIa) - (IId) содержат один из следующих остовов (C.1) - (C.21):
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
,
Иллюстративные ингибиторы Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa) - (IId), которые могут применяться в способах, описанных в данном документе, в неконъюгированной форме и/или могут быть включены в ADC, описанные в данном документе, включают следующие соединения и/или их соли:
Стоит отметить, что в случае, если ингибитор Bcl-xL согласно настоящей заявке находится в конъюгированной форме, атом водорода, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa) - (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал. Например, соединение W2.01 (пример 1.1) представляет собой 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({2-[2-(карбоксиметокси)этокси]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновую кислоту.
В случае, если данное соединение находится в неконъюгированной форме, то оно характеризуется следующей структурой:
.
В случае, если аналогичное соединение включено в ADC, как показано в структурной формуле (IIa) или (IIb), то атом водорода, соответствующий положению #, отсутствует, при этом образуется монорадикал.
.
В определенных вариантах осуществления ингибиторы Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa) - (IId), выбраны из группы, состоящей из W2.01, W2.02, W2.03, W2.04, W2.05, W2.06, W2.07, W2.08, W2.09, W2.10, W2.11, W2.12, W2.13, W2.14, W2.15, W2.16, W2.17, W2.18, W2.19, W2.20, W2.21, W2.22, W2.23, W2.24, W2.25, W2.26, W2.27, W2.28, W2.29, W2.30, W2.31, W2.32, W2.33, W2.34, W2.35, W2.36, W2.37, W2.38, W2.39, W2.40, W2.41, W2.42, W2.43, W2.44, W2.45, W2.46, W2.47, W2.48, W2.49, W2.50, W2.51, W2.52, W2.53, W2.54, W2.55, W2.56, W2.57, W2.58, W2.59, W2.60, W2.61, W2.62, W2.63, W2.64, W2.65, W2.66, W2.67, W2.68, W2.69, W2.70, W2.71, W2.72, W2.73, W2.74, W2.75, W2.76, W2.77, W2.78, W2.79, W2.80, W2.81, W2.82, W2.83, W2.84, W2.85, W2.86, W2.87, W2.88, W2.89, W2.90 и W2.91 или их фармацевтически приемлемых солей.
В определенных вариантах осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль содержит лекарственное средство, связанное с антителом посредством линкера, где лекарственное средство представляет собой ингибитор Bcl-xL, выбранный из группы, состоящей из W2.01, W2.02, W2.03, W2.04, W2.05, W2.06, W2.07, W2.08, W2.09, W2.10, W2.11, W2.12, W2.13, W2.14, W2.15, W2.16, W2.17, W2.18, W2.19, W2.20, W2.21, W2.22, W2.23, W2.24, W2.25, W2.26, W2.27, W2.28, W2.29, W2.30, W2.31, W2.32, W2.33, W2.34, W2.35, W2.36, W2.37, W2.38, W2.39, W2.40, W2.41, W2.42, W2.43, W2.44, W2.45, W2.46, W2.47, W2.48, W2.49, W2.50, W2.51, W2.52, W2.53, W2.54, W2.55, W2.56, W2.57, W2.58, W2.59, W2.60, W2.61, W2.62, W2.63, W2.64, W2.65, W2.66, W2.67, W2.68, W2.69, W2.70, W2.71, W2.72, W2.73, W2.74, W2.75, W2.76, W2.77, W2.78, W2.79, W2.80, W2.81, W2.82, W2.83, W2.84, W2.85, W2.86, W2.87, W2.88, W2.89, W2.90 и W2.91.
В определенных вариантах осуществления ADC или его фармацевтически приемлемой соли ингибитор Bcl-xL выбран из группы, состоящей из следующих соединений, модифицированных таким образом, что атом водорода, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал:
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({2-[2-(карбоксиметокси)этокси]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
2-{[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}этил)сульфонил]амино}-2-дезокси-D-глюкопираноза;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(4-{[(3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил]метил}бензил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2,3-дигидроксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
2-({[4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил]сульфонил}амино)-2-дезокси-бета-D-глюкопираноза;
8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({2-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин;
3-[1-({3-[2-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-{4-[({2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино)метил]бензил}-2,6-ангидро-L-гулоновая кислота;
4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенилгексопиранозидуроновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[D-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[1-(карбоксиметил)пиперидин-4-ил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[(5S)-5-амино-6-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-6-оксогексил]-N,N-диметилметанаминий;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[пиперидин-4-ил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[N-(2-карбоксиэтил)-L-альфа-аспартил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(2-аминоэтил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этил}(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил){2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
(1ξ)-1-({2-[5-(1-{[3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-карбоксипиридин-2-ил]-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил}метил)-1,5-ангидро-D-глюцит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-глюкопиранoзилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(N6,N6-диметил-L-лизил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
N6-(37-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-L-лизил-N-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-L-аланинамид;
метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин;
6-[7-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-6-[3-(метиламино)пропил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
5-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-5-дезокси-D-арабинит;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{[(2S,3S)-2,3,4-тригидроксибутил]амино}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S,3S,4R,5R,6R)-2,3,4,5,6,7-гексагидроксигептил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({3-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]пропил}сульфонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-дигидроксибутил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-оксидоизохинолин-6-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-({2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}сульфанил)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота и
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{3-[(2-сульфоэтил)амино]пропил}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
и их фармацевтически приемлемая соль.
Ингибиторы Bcl-xL связываются с антиапоптотическими белками Bcl-xL и ингибируют их, индуцируя апоптоз. Способность специфических ингибиторов Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa) - (IId) к связыванию с Bcl-xL и ингибированию его активности может быть подтверждена с помощью стандартных анализов связывания и активности, включая, например, анализы связывания Bcl-xL с помощью TR-FRET, описанные в Tao et al., 2014, ACS Med. Chem. Lett., 5:1088-1093. Специфический анализ связывания Bcl-xL с помощью TR-FRET, который может использоваться для подтверждения связывания Bcl-xL, представлен в примере 4 ниже. Как правило, ингибиторы Bcl-xL, применимые в качестве ингибиторов per se и в ADC, описанных в данном документе, будут характеризоваться значением Ki в анализе связывания согласно примеру 5, составляющим менее приблизительно 1 нM, но они могут характеризоваться значительно более низким значением Ki, например, значением Ki, составляющим менее приблизительно 1, 0,1 или даже 0,01 нM.
Ингибирующая активность в отношении Bcl-xL также может быть подтверждена в стандартных анализах клеточной цитотоксичности, таких как анализы цитотоксичности с использованием клеток FL5.12 и Molt-4, описанные в Tao et al., 2014, ACS Med. Chem. Lett., 5:1088-1093. Специфический анализ цитотоксичности с использованием клеток Molt-4, который может применяться для подтверждения ингибирующей активности в отношении Bcl-xL специфических ингибиторов Bcl-xL, которые способны проникать через клеточные мембраны, представлен в примерах 5 и 6 ниже. Как правило, такие способные проникать в клетку ингибиторы Bcl-xL будут характеризоваться значением EC50, составляющим менее приблизительно 500 нM, в анализе цитотоксичности с использованием клеток Molt-4 согласно примерам 5 и 6, но они могут характеризоваться значительно более низким значением EC50, например, значением EC50, составляющим менее приблизительно 250, 100, 50, 20, 10 или даже 5 нM.
Благодаря наличию солюбилизирующих групп, ожидается, что многие из ингибиторов Bcl-xL, описанных в данном документе, будут характеризоваться низкой или очень низкой способностью проникать в клетки, и, следовательно, в определенных клеточных анализах не будет получена значительная активность вследствие неспособности соединения пересекать клеточную мембрану, в том числе в анализе токсичности с использованием клеток Molt-4 согласно примерам 5 и 6. Ингибирующая активность в отношении Bcl-xL соединений, которые свободно не пересекают клеточные мембраны, может быть подтверждена в клеточных анализах с использованием пермеабилизированных клеток. Процесс проницаемости наружной митохондриальной мембраны (MOMP) регулируется белками семейства Bcl-2. Конкретно, MOMP стимулируется проапоптотическими белками Bax и Bak семейства Bcl-2, которые при активации олигомеризуются на наружной митохондриальной мембране и образуют поры, что приводит к высвобождению цитохрома c (cyt c). Высвобождение cyt c инициирует образование апоптосомы, которая, в свою очередь, приводит к активации каспаз и другим явлениям, которые способствуют запрограммированной клеточной гибели клетки (см. Goldstein et al., 2005, Cell Death and Differentiation 12:453-462). На олигомеризующее действие Bax и Bak оказывают антагонистическое влияние представители антиапоптотического семейства Bcl-2, в том числе Bcl-2 и Bcl-xL. Ингибиторы Bcl-xL в клетках, выживаемость которых зависит от Bcl-xL, могут обуславливать активацию Bax и/или Bak, MOMP, высвобождение cyt c и последующие явления, приводящие к апоптозу. Процесс высвобождения cyt c может быть измерен посредством вестерн-блоттинга в отношении митохондриальной и цитозольной фракций клеток и может применяться в качестве предварительного показателя апоптоза в клетках.
В качестве средства выявления ингибирующей активности в отношении Bcl-xL и последующего высвобождения cyt c для ингибиторов Bcl-xL с низкой способностью проникать в клетки, клетки можно обрабатывать средством, которое вызывает селективное образование пор в плазматической, но не митохондриальной, мембране. Конкретно, соотношение холестерин/фосфолипид является намного более высоким в плазматической мембране, чем в митохондриальной мембране. В результате этого, кратковременное инкубирование с использованием низких концентраций дигитонина, детергента направленного действия в отношении холестерина, обеспечивает селективную проницаемость плазматической мембраны, не оказывая значительного влияния на митохондриальную мембрану. Данное средство образует нерастворимые комплексы с холестерином, приводя к отделению холестерина от его нормальных сайтов связывания с фосфолипидами. Данное действие, в свою очередь, приводит к образованию отверстий шириной приблизительно 40-50 Å в липидном бислое. После того, как плазматическая мембрана становиться проницаемой, компоненты цитозоля, способные проникать через образованные дигитонином отверстия, могут вымываться, в том числе цитохром C, который высвободился из митохондрий в цитозоль в апоптотических клетках (Campos, 2006, Cytometry A 69(6):515-523).
Как правило, ингибиторы Bcl-xL будут характеризоваться значением EC50, составляющим менее приблизительно 10 нM, в анализе уровня cyt c с использованием пермеабилизированных клеток Molt-4 согласно примерам 5 и 6, хотя соединения могут характеризоваться значительно более низкими значениями EC50, например, менее приблизительно 5, 1 или даже 0,5 нM. Как показано в примере 6, ингибиторы Bcl-xL, характеризующиеся низкой или очень низкой способностью проникать в клетки, которые не проявляют активность в стандартном анализе токсичности с использованием клеток Molt-4 в случае непермеабилизированных клеток, проявляют сильную функциональную активность, измеренную посредством высвобождения cyt c, в анализах клеточной цитотоксичности с использованием пермеабилизированных клеток. В дополнение к высвобождению цитохрома c у митохондрий, подвергающихся апоптозу, часто теряется их трансмембранный потенциал митохондриальной мембраны (Bouchier-Hayes et al., 2008, Methods 44(3): 222-228). JC-1 представляет собой катионный карбоцианиновый краситель, который накапливается в митохондриях и демонстрирует красную флуоресценцию в случае, если митохондрии являются нормальными, и она утрачивается в случае, если митохондриальная мембрана является поврежденной (процентное значение деполяризации; Smiley et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 3671-3675; Reers et al., 1991: Biochemistry, 30: 4480-4486). Данная потеря сигнала может быть выявлена в пермеабилизированных клетках с применением флуориметра (возбуждение при 545 нм и излучение при 590 нм), и, следовательно, ее можно полностью количественно определить, что увеличивает как воспроизводимости, так и пропускную способность. Как правило, ингибиторы Bcl-xL будут характеризоваться значением EC50, составляющим менее приблизительно 10 нM, в анализе с помощью JC-1 с использованием пермеабилизированных клеток Molt-4 согласно примерам 5 и 6, хотя соединения могут характеризоваться значительно более низкими значениями EC50, например, менее приблизительно 5, 1, 0,5 или даже 0,05 нM. Как продемонстрировано в примере 6, ингибиторы Bcl-xL, характеризующиеся низкой или очень низкой способностью проникать в клетки, которые не проявляют активности в стандартном анализе токсичности с использованием клеток Molt-4 в случае непермеабилизированных клеток, проявляют сильную функциональную активность, измеренную по потере их трансмембранного потенциала митохондриальной мембраны в анализе с помощью JC-1, в анализах клеточной цитотоксичности с использованием пермеабилизированных клеток. Ингибиторы Bcl-xL с низкой способностью проникать в клетки также проявляют сильную активность при введении в клетки в форме ADC (см., например, пример 8).
Хотя многие из ингибиторов Bcl-xL структурных формул (IIa) - (IId) селективно или специфически ингибируют Bcl-xL по сравнению с другими антиапоптотическими белками семейства Bcl-2, селективное и/или специфическое ингибирование Bcl-xL не является необходимым. Ингибиторы Bcl-xL и ADC, содержащие данные соединения, в дополнение к ингибированию Bcl-xL также могут ингибировать один или несколько других антиапоптотических белков семейства Bcl-2, таких как, например Bcl-2. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы Bcl-xL и/или ADC являются селективными и/или специфическими в отношении Bcl-xL. Под специфическим или селективным подразумевается, что конкретный ингибитор Bcl-xL и/или ADC связывают или ингибируют Bcl-xL в более высокой степени, чем Bcl-2 при эквивалентных условиях анализа. В конкретных вариантах осуществления ингибиторы Bcl-xL и/или ADC характеризуются значением специфичности или селективности в отношении Bcl-xL, находящимся в диапазоне 10-кратных, 100-кратных или даже более высоких значений, чем Bcl-2 в анализах связывания.
III.A.2. Линкеры Bcl-xL
В ADC, описанных в данном документе, ингибиторы Bcl-xL связаны с антителом посредством линкеров. Линкер, связывающий ингибитор Bcl-xL и антитело в ADC, может быть коротким, длинным, гидрофобным, гидрофильным, гибким или жестким или может состоять из сегментов, каждый из которых независимо характеризуется одним или несколькими из вышеуказанных свойств, вследствие чего линкер может включать сегменты, характеризующиеся разными свойствами. Линкеры могут быть многовалентными, за счет чего они ковалентно связывают более одного ингибитора Bcl-xL с одним сайтом антитела, или одновалентными, за счет чего они ковалентно связывают один ингибитор Bcl-xL с одним сайтом антитела.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что линкеры связывают ингибиторы Bcl-xL с антителом путем образования ковалентной связи с ингибитором Bcl-xL в одном местоположении и ковалентной связи с антителом в другом. Ковалентные связи образуются за счет реакции между функциональными группами линкера и функциональными группами ингибиторов и антитела. Используемое в данном документе выражение "линкер" подразумевает включение (i) неконъюгированных форм линкера, которые содержат функциональную группу, способную к ковалентному связыванию линкера с ингибитором Bcl-xL, и функциональную группу, способную к ковалентному связыванию линкера с антителом; (ii) частично конъюгированных форм линкера, которые содержат функциональную группу, способную к ковалентному связыванию линкера с антителом, и которая ковалентно связана с ингибитором Bcl-xL, или наоборот; и (iii) полностью конъюгированных форм линкера, которые ковалентно связаны и с ингибитором Bcl-xL, и с антителом. В некоторых конкретных вариантах осуществления описанных в данном документе промежуточных соединений синтонов и ADC, фрагменты, содержащие функциональные группы на линкере, и ковалентные связи, образованные между линкером и антителом, конкретно проиллюстрированы соответственно в виде Rx и XY.
Линкеры являются предпочтительно, но не обязательно, химически устойчивыми к внеклеточным условиям и могут быть сконструированы с возможностью специфического расщепления, отщепления и/или разрушения иным образом внутри клетки. Альтернативно можно использовать линкеры, которые сконструированы с отсутствием возможности специфического расщепления или разрушения внутри клетки. Из уровня техники известен широкий спектр линкеров, применимых для связывания лекарственных средств с антителами в контексте ADC. Для связывания ингибиторов Bcl-xL с антителом описываемых в данном документе ADC можно использовать любой из этих линкеров, а также другие линкеры.
Иллюстративные многовалентные линкеры, которые можно использовать для связывания множества ингибиторов Bcl-xL с антителом, описаны, например, в патенте США № 8399512; опубликованной заявке на патент США № 2010/0152725; патенте США № 8524214; патенте США № 8349308; опубликованной заявке на патент США № 2013/189218; опубликованной заявке на патент США № 2014/017265; WO 2014/093379; WO 2014/093394; WO 2014/093640, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Например, технология линкеров Fleximer®, разработанная Mersana и соавт., обладает потенциалом обеспечивать высокое значение DAR для ADC с надлежащими физико-химическими свойствами. Как показано ниже, технология линкеров Fleximer® основана на встраивании молекул лекарственных средств в солюбилизирующий полиацетальный каркас посредством последовательности сложноэфирных связей. Данная методики обеспечивает получение ADC с высокой нагрузкой (DAR не более 20) при одновременном сохранении надлежащих физико-химических свойств. Данная методика может быть использована с ингибиторами Bcl-xL, как показано на схеме ниже.
Для использования линкера по технологии Fleximer®, изображенной на схеме выше, алифатический спирт может присутствовать или может быть введен в ингибитор Bcl-xL. Фрагмент спирта затем конъюгируют с фрагментом аланина, который затем встраивают синтетическим способом в линкер Fleximer®. Обработка липосомами ADC in vitro обеспечивает высвобождение исходного спиртосодержащего лекарственного средства.
Дополнительные примеры линкеров дендритного типа можно найти в US 2006/116422; US 2005/271615; de Groot et al., (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494; Amir et al., (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499; Shamis et al., (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731; Sun et al., (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al., (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al., (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990.
Иллюстративные одновалентные линкеры, которые можно использовать, описаны, например, в Nolting, 2013, Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology 1045:71-100; Kitson et al., 2013, CROs/CMOs - Chemica Oggi - Chemistry Today 31(4): 30-36; Ducry et al., 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13; Zhao et al., 2011, J. Med. Chem. 54:3606-3623; патенте США № 7223837; патенте США № 8568728; патенте США № 8535678 и в WO2004010957, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В качестве примера и без ограничения некоторые расщепляемые и нерасщепляемые линкеры, которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, описаны ниже.
Расщепляемые линкеры
В определенных вариантах осуществления выбранный линкер является расщепляемым in vitro и in vivo. Расщепляемые линкеры могут содержать химически или ферментативно неустойчивые или поддающиеся разрушению связи. В случае расщепляемых линкеров высвобождение лекарственного средства, как правило, зависит от процессов внутри клетки, таких как восстановление в цитоплазме, воздействие кислых условий в лизосоме или расщепление специфическими протеазами или другими ферментами внутри клетки. Расщепляемые линкеры, как правило, включают одну или несколько химических связей, которые могут быть или химически, или ферментативно расщепляемыми, тогда как остальная часть линкера является нерасщепляемой.
В определенных вариантах осуществления линкер содержит химически нестойкую группу, такую как гидразоновая и/или дисульфидная группы. Линкеры, содержащие химически нестойкие группы, используют отличающиеся свойства плазмы крови и некоторых цитоплазматических компартментов. Внутриклеточными условиями, способствующими высвобождению лекарственного средства в случае линкеров, содержащих гидразоновые группы, являются кислая среда эндосом и лизосом, тогда как линкеры, содержащие дисульфидные группы, восстанавливаются в цитозоле, который содержит высокие концентрации тиолов, например глутатиона. В определенных вариантах осуществления устойчивость линкера, содержащего химически нестойкую группу, в плазме крови можно увеличить путем введения стерического затруднения с помощью заместителей вблизи химически нестойкой группы.
Кислотно-нестойкие группы, такие как гидразоновая, остаются целыми во время пребывания в системном кровотоке в среде с нейтральным показателем рН (рН 7,3-7,5) и подвергаются гидролизу и высвобождают лекарственное средство после того, как ADC интернализируется в слабокислый эндосомальный (рН 5,0-6,5) и лизосомальный (рН 4,5-5,0) компартменты клетки. Данный рН-зависимый механизм высвобождения был ассоциирован с неспецифическим высвобождением лекарственного средства. Для повышения устойчивости гидразоновой группы в линкере линкер можно изменить путем химической модификации, например замещением, что позволяет достигнуть более эффективного высвобождения в лизосоме с минимальной потерей в кровотоке.
Содержащие гидразоновые группы линкеры могут содержать дополнительные сайты расщепления, такие как дополнительные кислотно-нестойкие сайты расщепления и/или ферментативно нестойкие сайты расщепления. ADC, включающие иллюстративные линкеры, содержащие гидразоновые группы, включают следующие структуры:
,
,
,
где D и Ab представляют собой соответственно лекарственное средство и Ab, а n представляет собой количество лекарственных средств-линкеров, связанных с антителом. В определенных линкерах, таких как линкер (Ig), линкер содержит две расщепляемые группы - дисульфидный и гидразоновый фрагмент. В случае таких линкеров для эффективного высвобождения немодифицированного свободного лекарственного средства требуется кислый показатель рН или восстановление дисульфидной группы и кислый показатель рН. Было показано, что такие линкеры, как (Ih) и (Ii), являются эффективными с одним гидразоновым сайтом расщепления.
Другие кислотно-нестойкие группы, которые могут быть включены в линкеры, включают цис-акотитил-содержащие линкеры. Химия цис-аконитиловых групп предусматривает использование группы карбоновой кислоты, соединенной амидной связью для ускорения гидролиза амидной группы в кислых условиях.
Расщепляемые линкеры также могут содержать дисульфидную группу. Дисульфиды термодинамически устойчивы при физиологическом значении pH и предназначены для высвобождения лекарственного средства после интернализации внутрь клеток, где цитозоль обеспечивает значительно более восстанавливающую среду по сравнению с внеклеточной средой. Для разрыва дисульфидных связей, как правило, требуется наличие цитоплазматического тиолового кофактора, такого как (восстановленный) глутатион (GSH), так что линкеры, содержащие дисульфидные группы, являются достаточно устойчивыми в кровотоке, избирательно высвобождая лекарственное средство в цитозоле. Внутриклеточный белок-фермент дисульфидизомераза или подобные ферменты, которые могут расщеплять дисульфидные связи, также могут способствовать преимущественному расщеплению дисульфидных связей внутри клеток. Сообщалось, что GSH присутствует в клетках в диапазоне концентраций 0,5-10 мМ по сравнению со значительно более низкой концентрацией GSH или цистеина, наиболее распространенного низкомолекулярного тиола, в кровотоке в количестве примерно 5 мкМ. Опухолевые клетки, где нерегулярный ток крови приводит к гипоксическому состоянию, приводят в результате к повышенной активности восстанавливающих ферментов и, следовательно, к еще более высоким концентрациям глутатиона. В определенных вариантах осуществления устойчивость in vivo линкера, содержащего дисульфидные группы, можно усилить путем химической модификации линкера, например, путем использования стерического затруднения, прилегающего к дисульфидной связи.
ADC, включающие иллюстративные линкеры, содержащие дисульфидные группы, включают следующие структуры:
,
,
,
где D и Ab представляют собой соответственно лекарственное средство и антитело, n представляет собой количество лекарственных средств-линкеров, связанных с антителом, и R в каждом случае независимо выбран, например, из водорода или алкила. В определенных вариантах осуществления увеличение стерического затруднения, прилегающего к дисульфидной связи, увеличивает устойчивость линкера. Такие структуры, как (Ij) и (Il), демонстрируют повышенную устойчивость in vivo, когда одна или несколько групп R выбраны из низшего алкила, такого как метил.
Другим типом линкера, который можно применять, является линкер, который специфически расщепляется ферментом. Такие линкеры обычно имеют пептидную основу или включают пептидные области, которые выступают в роли субстратов для ферментов. Линкеры на основе пептидов, как правило, более устойчивы в плазме крови и внеклеточной среде, чем химически неустойчивые линкеры. Пептидные связи, как правило, имеют хорошую устойчивость в сыворотке крови, так как лизосомальные протеолитические ферменты обладают очень низкой активностью в крови из-за эндогенных ингибиторов и неблагоприятно высокого значения pH крови по сравнению с лизосомами. Высвобождение лекарственного средства от антитела происходит специфически в результате действия лизосомальных протеаз, например, катепсина и плазмина. Данные протеазы могут присутствовать при повышенных уровнях в определенных опухолевых тканях. В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом. В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом, и лизосомальный фермент представляет собой катепсин B. В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом, и лизосомальный фермент представляет собой β-глюкуронидазу или β-галактозидазу. В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом, и лизосомальный фермент представляет собой β-глюкуронидазу. В определенных вариантах осуществления линкер является расщепляемым лизосомальным ферментом, и лизосомальный фермент представляет собой β-галактозидазу.
Специалисты в данной области техники осознают важность расщепляемых линкеров, которые устойчивы в плазме крови и при этом легко расщепляются лизосомальным ферментом. В данном документе в определенных вариантах осуществления раскрыты линкеры, расщепляемые лизосомальными ферментами β-глюкуронидазой или β-галактозидазой, которые проявляют улучшенную стабильность в плазме крови и сниженное неспецифическое высвобождение низкомолекулярного лекарственного средства.
В иллюстративных вариантах осуществления расщепляемый пептид выбран из тетрапептидов, таких как Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, или дипептидов, таких как Val-Cit, Val-Ala и Phe-Lys. В определенных вариантах осуществления предпочтительными являются дипептиды, а не более длинные полипептиды, в связи с гидрофобностью более длинных пептидов.
Были описаны различные расщепляемые линкеры на основе дипептидов, пригодные для связывания лекарственных средств, таких как доксорубицин, митомицин, камототецин, таллисомицин и ауристатин/представители семейства ауристатинов, с антителами (см., Dubowchik et al., 1998, J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik et al., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:3341-3346; Walker et al., 2002, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:217-219; Walker et al., 2004, Bioorg. Med. Chem. Lett.14:4323-4327; и Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Все данные дипептидные линкеры или модифицированные варианты данных дипептидных линкеров можно применять в ADC, описанных в данном документе. Другие дипептидные линкеры, которые можно применять, включают линкеры, которые встречаются в таких ADC, как брентуксимаба вендотин-SGN-35 (Adcetris™) от Seattle Genetics, SGN-75 (антитело к CD-70, MC-монометилауристатин F (MMAF), глембатумумаб (CDX-011) (антитело к NMB, Val-Cit-монометилауристатин E (MMAE) от Celldex Therapeutics и PSMA-ADC (PSMA-ADC-1301) (антитело к PSMA, Val-Cit-MMAE) от Cytogen.
Ферментативно расщепляемые линкеры могут включать самоотщепляющийся спейсер для пространственного отделения лекарственного средства от сайта ферментативного расщепления. Непосредственное присоединение лекарственного средства к пептидному линкеру может привести к протеолитическому высвобождению аминокислотного аддукта с лекарственным средством, что ухудшает его активность. Применение самоотщепляющегося спейсера обеспечивает возможность отделения полностью активного химически немодифицированного лекарственного средства при гидролизе амидной связи.
Одним самоотщепляющимся спейсером является бифункциональная группа пара-аминобензилового спирта, которая связана с пептидом посредством аминогруппы, образуя амидную связь, тогда как аминсодержащие лекарственные средства могут быть присоединены посредством карбаматных функциональных групп к бензиловой гидроксильной группе линкера (с получением п-амидобензилкарбамата, PABC). Полученные в результате пролекарства активируются при опосредованном протеазой расщеплении, что приводит к 1,6-элиминирующей реакции, обеспечивающей высвобождение немодифицированного лекарственного средства, диоксида углерода и остатков линкерной группы. На следующей схеме изображена фрагментация п-амидобензилкарбамата и высвобождение лекарственного средства:
где X-D представляет собой немодифицированное лекарственное средство. Также были описаны гетероциклические варианты данной самоотщепляющейся группы. См. патент США № 7989434.
В определенных вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер представляет собой линкер, расщепление которого основывается на β-глюкуроновой кислоте. Легкое высвобождение лекарственного средства может осуществляться посредством расщепления гликозидной связи β-глюкуронида лизосомальным ферментом β-глюкуронидазой. Данный фермент присутствует в избытке в лизосомах и сверхэкспрессируется в некоторых типах опухолей, при этом активность данного фермента вне клеток является низкой. Линкеры на основе β-глюкуроновой кислоты можно применять для того, чтобы обойти тенденцию ADC подвергаться агрегации вследствие гидрофильной природы β-глюкуронидов. В определенных вариантах осуществления линкеры на основе β-глюкуроновой кислоты предпочтительны в качестве линкеров для ADC, связанных с гидрофобными лекарственными средствами. Следующая схема описывает высвобождение лекарственного средства из ADC, содержащего линкер на основе β-глюкуроновой кислоты:
Были описаны различные расщепляемые линкеры на основе β-глюкуроновой кислоты, пригодные для связывания лекарственных средств, таких как ауристатины, аналоги камптотецина и доксорубицина, связывающие малую борозду средства на основе CBI и псимберин, с антителами (см. Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17:831-840; Jeffrey et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280; и Jiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Все данные линкеры на основе β-глюкуроновой кислоты можно применять в описанных в данном документе ADC. В определенных вариантах осуществления ферментативно расщепляемый линкер представляет собой линкер на основе β-галактозида. β-галактозид в избытке присутствует в лизосомах, при этом активность фермента вне клетки является низкой. Кроме того, ингибиторы Bc1-xL, содержащие фенольную группу, можно ковалентно связать с линкером посредством атома кислорода фенола. В основе одного такого линкера, описанного в опубликованной заявке США № 2009/0318668, лежит методика, в которой диаминоэтан "SpaceLink" применяют в сочетании с традиционными самоотщепляющимися группами на основе "PABO" для доставки фенолов. Расщепление линкера схематически изображено ниже с применением ингибитора Bcl-xL по настоящему изобретению.
Расщепляемые линкеры могут включать нерасщепляемые части или сегменты, и/или расщепляемые сегменты или части могут быть включены в иной нерасщепляемый линкер с тем, чтобы сделать его расщепляемым. Лишь в качестве примера, полиэтиленгликоль (PEG) и родственные ему полимеры могут включать расщепляемые группы в полимерном каркасе. Например, полиэтиленгликолевый или полимерный линкер может включать одну или несколько расщепляемых групп, таких как дисульфидная, гидразоновая или дипептидная.
Другие разрушаемые связи, которые могут быть включены в линкеры, включают сложноэфирные связи, образованные в результате реакции PEG-карбоновых кислот или активированных PEG-карбоновых кислот со спиртовыми группами биологически активного средства, при этом такие сложноэфирные группы, как правило, гидролизуются в физиологических условиях с высвобождением биологически активного средства. Гидролитически разрушаемые связи включают без ограничения карбонатные связи; иминовые связи, образованные в результате реакции амина и альдегида; фосфатные сложноэфирные связи, образованные в результате реакции спирта с фосфатной группой; ацетальные связи, которые являются продуктом реакции альдегида и спирта; сложные ортоэфирные связи, которые являются продуктом реакции формата и спирта; и олигонуклеотидные связи, образованные фосфорамидитной группой, в том числе без ограничения, которая находится на конце полимера, и 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемый пептидный фрагмент, например, линкер, предусматривающий структурную формулу (IVa), (IVb), (IVc) или (IVd):
,
,
,
,
или его фармацевтически приемлемую соль, где
пептид представляет собой пептид (проиллюстрированный N→C, где пептид включает амино- и карбокси-"концы"), расщепляемый лизосомальным ферментом;
Т представляет собой полимер, содержащий одно или несколько этиленгликолевых звеньев или алкиленовую цепь или их комбинации;
Ra выбран из водорода, C1-6алкила, SO3H и CH2SO3H;
Ry представляет собой водород, или C1-4алкил-(O)r-(C1-4алкилен)s-G1, или C1-4алкил-(N)-[(C1-4алкилен)-G1]2;
Rz представляет собой C1-4алкил-(O)r-(C1-4алкилен)s-G2;
G1 представляет собой фрагмент, представляющий собой SO3H, CO2H, PEG4-32 или сахар;
G2 представляет собой фрагмент, представляющий собой SO3H, CO2H или PEG4-32;
r равняется 0 или 1;
s равняется 0 или 1;
p представляет собой целое число в диапазоне от 0 до 5;
q равняется 0 или 1;
x равняется 0 или 1;
y равняется 0 или 1;
представляет собой точку присоединения линкера к ингибитору Bcl-xL; и
* представляет собой точку присоединения линкера к остальной части.
В определенных вариантах осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемый пептидный фрагмент, например, линкер, предусматривающий структурную формулу (IVa), (IVb), (IVc) или (IVd), или его фармацевтически приемлемую соль.
В определенных вариантах осуществления пептид выбран из трипептида или дипептида. В конкретных вариантах осуществления дипептид выбран из Val-Cit; Cit-Val; Ala-Ala; Ala-Cit; Cit-Ala; Asn-Cit; Cit-Asn; Cit-Cit; Val-Glu; Glu-Val; Ser-Cit; Cit-Ser; Lys-Cit; Cit-Lys; Asp-Cit; Cit-Asp; Ala-Val; Val-Ala; Phe-Lys; Lys-Phe; Val-Lys; Lys-Val; Ala-Lys; Lys-Ala; Phe-Cit; Cit-Phe; Leu-Cit; Cit-Leu; Ile-Cit; Cit-Ile; Phe-Arg; Arg-Phe; Cit-Trp и Trp-Cit или их фармацевтически приемлемой соли.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (IVa), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурным формулам (IVb), (IVc) или (IVd), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
В определенных вариантах осуществления линкер содержит ферментативно расщепляемый сахарный фрагмент, например, линкер, предусматривающий структурную формулу (Va), (Vb), (Vc), (Vd) или (Ve):
,,
,
,
,
или его фармацевтически приемлемую соль, где
q равняется 0 или 1;
r равняется 0 или 1;
X1 представляет собой CH2, O или NH;
представляет собой точку присоединения линкера к лекарственному средству; и
* представляет собой точку присоединения линкера к остальной части.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (Va), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (Vb), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (Vc), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (Vd), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (Ve), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры включают группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
.
Нерасщепляемые линкеры
Хотя расщепляемые линкеры могут обеспечивать определенные преимущества, линкеры, входящие в состав описанных в данном документе ADC, необязательно должны быть расщепляемыми. В случае нерасщепляемых линкеров высвобождение лекарственного средства не зависит от отличающихся свойств у плазмы крови и некоторых цитоплазматических компартментов. Предполагается, что высвобождение лекарственного средства происходит после интернализации ADC посредством антиген-опосредованного эндоцитоза и доставки в лизосомальный компартмент, при этом антитело разрушается до уровня аминокислот посредством внутриклеточного протеолитического разрушения. Данный процесс обеспечивает высвобождение производного лекарственного средства, которое образовано лекарственным средством, линкером и аминокислотным остатком, к которому был ковалентно присоединен линкер. Аминокислотные метаболиты с лекарственным средством из конъюгатов с нерасщепляемыми линкерами являются более гидрофильными и, как правило, характеризуются меньшей способностью проникать через мембрану, что приводит к меньшему количеству эффектов, оказываемых на близлежащие случайные клетки, и меньшей неспецифической токсичности по сравнению с конъюгатами с расщепляемым линкером. В целом, ADC с нерасщепляемыми линкерами характеризуются большей устойчивостью в кровотоке, чем ADC с расщепляемыми линкерами. Нерасщепляемые линкеры могут представлять собой алкиленовые цепи или могут быть полимерными по своей природе, как, например, линкеры, в основе которых лежат полиалкиленгликолевые полимеры, амидные полимеры, или могут включать сегменты алкиленовых цепей, полиалкиленгликолей и/или амидных полимеров. В определенных вариантах осуществления линкер содержит полиэтиленгликолевый сегмент, содержащий от 1 до 6 этиленгликолевых звеньев.
Было описано множество нерасщепляемых линкеров, применяемых для связывания лекарственных средств с антителами. (См. Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17;831-840; Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280; и Jiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Все данные линкеры могут быть включены в описанные в данном документе ADC.
В определенных вариантах осуществления, линкер является нерасщепляемым in vivo, например линкер согласно структурным формулам (VIa), (VIb), (VIc) или (VId) (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
или его фармацевтически приемлемая соль, где
Ra выбран из водорода, алкила, сульфоната и метилсульфоната;
Rx представляет собой фрагмент, включающий функциональную группу, способную ковалентно связывать линкер с антителом; и
представляет собой точку присоединения линкера к ингибитору Bcl-xL.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурным формулам (VIa) - (VId), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом, и "" представляет собой точку присоединения к ингибитору Bcl-xL):
,
,
,
,
,
,
,
Группы, применяемые для присоединения линкеров к антителам B7-H3
Группы присоединения могут быть электрофильными по своей природе и включают малеимидные группы, активированные дисульфидные группы, активные сложноэфирные группы, такие как сложноэфирные группы NHS и сложноэфирные группы HOBt, галогенформиатные, галогенангидридные, алкил- и бензилгалогенидные, такие как галогенацетамидные. Как обсуждается ниже, существуют также перспективные технологии, связанные с "самостабилизирующимися" малеимидными группами и "образующими мостиковую связь дисульфидными группами", которые можно применять согласно настоящему изобретению.
Потеря лекарственного средства-линкера из ADC наблюдалась в результате процесса обмена малеимидной группы на альбумин, цистеин или глутатион (Alley et al., 2008, Bioconjugate Chem. 19: 759-769). Это особенно распространено в отношении высокогидрофильных сайтов конъюгации, при этом сайты, которые характеризуются частичной доступностью и имеют положительно заряженное окружение, способствуют гидролизу малеимидного кольца (Junutula et al., 2008, Nat. Biotechnol. 26: 925-932). Признанным решением является гидролиз сукцинимида, образующегося в результате конъюгации, поскольку это обеспечивает устойчивость к деконъюгации от антитела, тем самым делая ADC стабильным в сыворотке крови. Ранее сообщалось, что сукцинимидное кольцо будет подвергаться гидролизу в щелочных условиях (Kalia et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17: 6286-6289). На приведенной ниже схеме изображен один пример "самостабилизирующейся" малеимидной группы, которая самопроизвольно гидролизируется в условиях конъюгации антител с образованием форм ADC с улучшенной устойчивостью. См. опубликованную заявку на патент США № 2013/0309256, публикацию международной заявки № WO 2013/173337, Tumey et al., 2014, Bioconjugate Chem. 25: 1871-1880, и Lyon et al., 2014, Nat. Biotechnol. 32: 1059-1062. Таким образом, малеимидная группа присоединения вступает в реакцию с сульфгидрильной группой антитела с получением промежуточного сукцинимидного кольца. Гидролизованная форма группы присоединения является устойчивой к деконъюгации в присутствии белков плазмы крови.
Как показано выше, малеимидное кольцо линкера может вступать в реакцию с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) либо сукцинамида (открытая форма).
Polytherics раскрыл способ образования мостиковой связи в паре сульфгидрильных групп, полученных в результате восстановления нативной дисульфидной связи в шарнире. См. Badescu et al., 2014, Bioconjugate Chem. 25:1124-1136. Реакция показана на приведенной ниже схеме. Преимуществом данной методологии является возможность синтезировать гомогенные ADC с DAR 4 путем полного восстановления IgG (с получением 4 пар сульфгидрильных групп) с последующей реакцией с 4 эквивалентами алкилирующего средства. ADC, содержащие "образующие мостиковую связь дисульфидные группы", также заявлены как имеющие повышенную устойчивость.
Аналогично, как показано ниже, было разработано производное малеимида, которое может образовывать мостиковую связь в паре сульфгидрильных групп. См. опубликованную заявку США № 2013/0224228.
В определенных вариантах осуществления присоединяемый фрагмент предусматривает структурные формулы (VIIa), (VIIb) или (VIIc):
,
,
,
или его фармацевтически приемлемую соль, где
Rq представляет собой H или -O-(CH2CH2O)11-CH3;
x равняется 0 или 1;
y равняется 0 или 1;
G3 представляет собой -CH2CH2CH2SO3H или -CH2CH2O-(CH2CH2O)11-CH3;
Rw представляет собой -O-CH2CH2SO3H или -NH(CO)-CH2CH2O-(CH2CH2O)12-CH3; и
* представляет собой точку присоединения линкера к остальной части.
В определенных вариантах осуществления линкер предусматривает сегмент согласно структурным формулам (VIIIa), (VIIIb) или (VIIIc):
или его гидролизованное производное или фармацевтически приемлемую соль, где:
Rq представляет собой H или -O-(CH2CH2O)11-CH3;
x равняется 0 или 1;
y равняется 0 или 1;
G3 представляет собой -CH2CH2CH2SO3H или -CH2CH2O-(CH2CH2O)11-CH3;
Rw представляет собой -O-CH2CH2SO3H или -NH(CO)-CH2CH2O-(CH2CH2O)12-CH3;
* представляет собой точку присоединения линкера к остальной части; и
представляет собой точку присоединения линкера к антителу.
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурным формулам (VIIa) и (VIIb), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
Иллюстративные варианты осуществления линкеров согласно структурной формуле (VIIc), которые могут быть включены в описанные в данном документе ADC, включают линкеры, проиллюстрированные ниже (как проиллюстрировано, линкеры содержат группу, подходящую для ковалентного связывания линкера с антителом):
,
,
,
,
,
.
В определенных вариантах осуществления L выбран из группы, состоящей из IVa.1-IVa.8, IVb.1-IVb.19, IVc.1-IVc.7, IVd.1-IVd.4, Va.1-Va.12, Vb.1-Vb.10, Vc.1-Vc.11, Vd.1-Vd.6, Ve.1-Ve.2, VIa.1, VIc.1-V1c.2, VId.1-VId.4, VIIa.1-VIIa.4, VIIb.1-VIIb.8, VIIc.1-VIIc.6 в закрытой либо открытой форме и их фармацевтически приемлемой соли.
В определенных вариантах осуществления L выбран из группы, состоящей из IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVc.7, IVd.4, Vb.9, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4 и VIIc.5, где малеимид из каждого линкера прореагировал с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) либо сукцинамида (открытая форма) и их фармацевтически приемлемой соли.
В определенных вариантах осуществления L выбран из группы, состоящей из IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVd.4, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4, VIIc.5, где малеимид из каждого линкера прореагировал с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) или сукцинамида (открытая форма) и его фармацевтически приемлемой соли.
В определенных вариантах осуществления L выбран из группы, состоящей из IVb.2, VIIa.3, IVc.6 и VIIc.1, где представляет собой точку присоединения к лекарственному средству D, и @ представляет собой точку присоединения к LK, где в случае, если линкер представлен в открытой форме, показанной ниже, @ может находиться в α-положении либо β-положении по отношению к карбоновой кислоте, смежной с ним:
Соображения по выбору линкера Bcl-xL
Как известно специалистам в данной области техники, на линкер, выбранный для конкретного ADC, может влиять множество факторов, включая без ограничения сайт присоединения к антителу (например, lys, cys или другие аминокислотные остатки), структурные ограничения фармакофора лекарственного средства и липофильность лекарственного средства. Конкретный линкер, выбранный для ADC, должен пытаться сбалансировать эти различные факторы для конкретной комбинации антитело/лекарственное средство. Обзор факторов, на которые влияет выбор линкеров в ADC, см. в Nolting, раздел 5 "Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates" в: Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013.
Например, наблюдалось, что ADC оказывают влияние на уничтожение близлежащих случайных антиген-отрицательных клеток, присутствующих в непосредственной близости от антиген-положительных опухолевых клеток. Механизм уничтожения близлежащих случайных клеток с помощью ADC показал, что продукты метаболизма, образующиеся при внутриклеточной обработке ADC, могут играть определенную роль. Нейтральные цитотоксические метаболиты, образующиеся в результате метаболизма ADC в антиген-положительных клетках, по-видимому, играют роль в уничтожении близлежащих случайных клеток, тогда как заряженные метаболиты не могут диффундировать через мембрану в среду и, следовательно, не могут оказывать влияние на уничтожение близлежащих случайных клеток. В определенных вариантах осуществления линкер выбран для ослабления эффекта, заключающегося в уничтожении близлежащих случайных клеток, обусловленного клеточными метаболитами ADC. В определенных вариантах осуществления линкер выбран для увеличения эффекта, заключающегося в уничтожении близлежащих случайных клеток.
Свойства линкера могут также влиять на агрегацию ADC в условиях применения и/или хранения. Как правило, упоминаемые в литературе ADC содержат не более 3-4 молекул лекарственного средства на молекулу антитела (см., например, Chari, 2008, Acc Chem Res 41:98-107). Попытки получить более высокие соотношения лекарственного средства и антитела ("DAR") часто были неудачными, особенно если как лекарственное средство, так и линкер были гидрофобными, из-за агрегации ADC (см. King et al., 2002, J Med Chem 45:4336-4343; Hollander et al., 2008, Bioconjugate Chem 19:358-361; Burke et al., 2009 Bioconjugate Chem 20:1242-1250). Во многих случаях DAR выше 3-4 могут быть полезными в качестве средства увеличения эффективности. В случаях, если ингибитор Bcl-xL является гидрофобным по своей природе, целесообразным может быть выбор линкеров, которые являются относительно гидрофильными, в качестве средства уменьшения агрегации ADC, особенно в случаях, когда требуются DAR больше 3-4. Таким образом, в определенных вариантах осуществления линкер содержит химические фрагменты, которые уменьшают агрегацию ADC во время хранения и/или применения. Для уменьшения агрегации ADC линкер может содержать полярные или гидрофильные группы, такие как заряженные группы или группы, которые становятся заряженными при физиологическом значении рН. Например, линкер может содержать заряженные группы, такие как соли, или группы, которые депротонируют, например карбоксилатные, или протонируют, например амины, при физиологическом значении рН.
Иллюстративные многовалентные линкеры, которые, как сообщалось, обеспечивают значения DAR вплоть до 20, которые можно применять для связывания множества ингибиторов Bcl-xL с антителом, описаны в патенте США № 8399512; опубликованной заявке на патент США № 2010/0152725; патенте США № 8524214; патенте США № 8349308; опубликованной заявке на патент США № 2013/189218; опубликованной заявке на патент США № 2014/017265; WO 2014/093379; WO 2014/093394; WO 2014/093640, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В конкретных вариантах осуществления агрегация ADC во время хранения или применения составляет менее приблизительно 40%, как определено с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). В конкретных вариантах осуществления агрегация ADC во время хранения или применения составляет менее 35%, например, менее приблизительно 30%, например, менее приблизительно 25%, например, менее приблизительно 20%, например, менее приблизительно 15%, например, менее приблизительно 10%, например, менее приблизительно 5%, например, менее приблизительно 4% или даже меньше, как определено с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC).
III.A.3. Синтоны Bcl-xL ADC
Синтоны конъюгатов антитело-лекарственное средство представляют собой синтетические промежуточные соединения, применяемые для образования ADC. Синтоны, как правило, представляют собой соединения согласно структурной формуле (III):
,
или их фармацевтически приемлемую соль, где D представляет собой ингибитор Bcl-xL, описанный ранее, L представляет собой линкер, описанный ранее, и Rx представляет собой реакционноспособную группу, подходящую для связывания синтона с антителом.
В конкретных вариантах осуществления синтоны, представляющие собой промежуточные соединения, являются соединениями согласно приведенным ниже структурным формулам (IIIa), (IIIb), (IIIc) и (IIId) или их фармацевтически приемлемой солью, где различные заместители Ar1, Ar2, Z1, Z2a, Z2b, R', R1, R2, R4, R11a, R11b, R12 и R13 определены ранее в отношении структурных формул (IIa), (IIb), (IIc) и (IId) соответственно, L представляет собой линкер, описанный ранее, и Rx представляет собой функциональную группу, как описано выше:
,
,
,
.
Для синтеза ADC синтон, представляющий собой промежуточное соединение согласно структурной формуле (III) или его соль, приводят в контакт с антителом, представляющим интерес, в условиях, при которых функциональная группа Rx вступает в реакцию с "комплементарной" функциональной группой антитела Fx с образованием ковалентной связи.
Типы групп Rx и Fx будут зависеть от химического способа, применяемого для связывания синтона с антителом. В целом, применяемый химический способ не должен приводить к изменению целостности антитела, например, его способности связывать свою мишень. Предпочтительно, свойства связывания конъюгированного антитела будут очень напоминать свойства связывания неконъюгированного антитела. Из уровня техники известен ряд химических способов и методик для конъюгации молекул с биологическими молекулами, такими как антитела, и, в частности, с антителами. См., например, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", в: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" в: Controlled Drug Delivery, Robinson et al., Eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd Ed. 1987; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., Eds., 1985; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., Eds., Academic Press, 1985; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; публикацию согласно PCT WO 89/12624. Для связывания синтонов с антителом можно применять любой из данных химических способов.
Обычно синтоны связывают с боковыми цепями аминокислотных остатков антитела, включая, например, первичную аминогруппу доступных лизиновых остатков или сульфгидрильную группу доступных цистеиновых остатков. Свободные сульфгидрильные группы можно получить путем восстановления межцепочечных дисульфидных связей. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой связь, образованную с помощью аминогруппы антитела Ab к hB7-H3. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой амид, простой тиоэфир или тиомочевину. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой амид или тиомочевину. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой связь, образованную с помощью сульфгидрильной группы антитела Ab к hB7-H3. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой простой тиоэфир. В определенных вариантах осуществления LK представляет собой амид, простой тиоэфир или тиомочевину; и m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 8.
Известен ряд функциональных групп Rx и химических способов, пригодных для связывания синтонов с доступными лизиновыми остатками, и они включают в качестве примера, а не ограничения сложноэфирные группы NHS и изотиоцианатные группы.
Известен ряд функциональных групп Rx и химических способов, пригодных для связывания синтонов с доступными свободными сульфгидрильными группами цистеиновых остатков, и они включают в качестве примера, а не ограничения галогенацетильные группы и малеимидные группы.
Тем не менее, химические способы конъюгации не ограничены доступными группами боковых цепей. Боковые цепи, такие как амины, можно превращать в другие пригодные группы, такие как гидроксильные, путем связывания соответствующей малой молекулы с амином. Данную стратегию можно применять для увеличения количества доступных сайтов связывания на антителе путем конъюгации многофункциональных малых молекул с боковыми цепями доступных аминокислотных остатков антитела. Затем в синтоны включают функциональные группы Rx, подходящие для ковалентного связывания синтонов с этими "превращенными" функциональными группами.
Антитело также можно конструировать так, чтобы оно включало аминокислотные остатки для конъюгации. Подход по конструированию антител так, чтобы они включали аминокислотные остатки, кодируемые не генетическим кодом, пригодные для конъюгации лекарственных средств в контексте ADC, описан у Axup et al., 2003, Proc Natl Acad Sci 109:16101-16106 и Tian et al., 2014, Proc Natl Acad Sci 111:1776-1771, а также там описаны химические способы и функциональные группы, пригодные для связывания синтонов с не закодированными аминокислотами.
Иллюстративные синтоны, пригодные для получения ADC, описанных в данном документе, включают без ограничения следующие синтоны, перечисленные ниже в таблице B.
Таблица B
В определенных вариантах осуществления синтон выбран из группы, состоящей из примеров синтона 2.1, 2.2, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 2.10, 2.11, 2.12, 2.13, 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.19, 2.20, 2.21, 2.22, 2.23, 2.24, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28, 2.29, 2.30, 2.31, 2.32, 2.33, 2.34, 2.35, 2.36, 2.37, 2.38, 2.39, 2.40, 2.41, 2.42, 2.43, 2.44, 2.45, 2.46, 2.47, 2.48, 2.49, 2.50, 2.51, 2.52, 2.53, 2.54, 2.55, 2.56, 2.57, 2.58, 2.59, 2.60, 2.61, 2.62, 2.63, 2.64, 2.65, 2.66, 2.67, 2.68, 2.69, 2.77, 2.78, 2.79, 2.80, 2.81, 2.82, 2.83, 2.84, 2.85, 2.86, 2.87, 2.88, 2.89, 2.90, 2.91, 2.92, 2.93, 2.94, 2.95, 2.96, 2.97, 2.98, 2.101, 2.102, 2.103, 2.104, 2.105, 2.106, 2.107, 2.108, 2.109, 2.110, 2.111, 2.112, 2.113, 2.114, 2.115, 2.116, 2.117, 2.118, 2.119, 2.120, 2.121, 2.122, 2.123, 2.124, 2.125, 2.126, 2.127, 2.128, 2.129, 2.130, 2.131, 2.132, 2.133, 2.134, 2.135, 2.136, 2.137, 2.138, 2.139, 2.140, 2.141, 2.142, 2.143, 2.144, 2.145, 2.146, 2.147, 2.148, 2.149, 2.150, 2.151, 2.152, 2.153, 2.154, 2.155, 2.156, 2.157, 2.158, 2.159, 2.160, 2.161, 2.162, 2.163, 2.164, 2.166, 2.167, 2.168, 2.169, 2.170, 2.171, 2.172, 2.173, 2.174, 2.175 и 2.176 или их фармацевтически приемлемой соли. Названия соединений этих синтонов представлены ниже:
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-сульфопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]({[4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитил}амино)бензил]окси}карбонил)амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-(4-{[([2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]{3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}карбамоил)окси]метил}фенил)-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][4-(бета-D-глюкопиранoзилокси)бензил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил][2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}(3-фосфонопропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}(3-фосфонопропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-3-карбокси-2-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)пропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][4-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2R)-3-карбокси-2-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)пропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][1-(карбоксиметил)пиперидин-4-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
(S)-6-((2-((3-((4-(6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)(метил)амино)-5-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-N,N,N-триметил-6-оксогексан-1-аминия соль;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамид;
N-{6-[(хлорацетил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)амино}этил)(2-карбоксиэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({(2S)-2-[{[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентанoил]амино}бензил)окси]карбонил}(2-карбоксиэтил)амино]-3-карбоксипропанoил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-2-({[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентанoил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)-3-карбоксипропанoил](2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-карбоксипропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)амино}этил)(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{6-[(хлорацетил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)(2-карбоксиэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-2-({[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}пропаноил)амино]бензил)окси]карбонил}амино)-3-сульфопропанoил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)({[(2E)-3-(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}пропаноил)амино]фенил)проп-2-ен-1-ил]окси}карбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил){[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-2-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(этенилсульфонил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазолo[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-3-сульфо-L-аланил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил](2-сульфоэтил)амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил](2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-21-оксо-22-(2-сульфоэтил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22-азатетракозан-24-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-21-оксо-22-(2-сульфоэтил)-3,6,9,12,15,18,25-гептаокса-22-азагептакозан-27-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[6-(этенилсульфонил)гексанoил](2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{6-[(хлорацетил)амино]гексанoил}(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-карбоксипропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{6-[(бромацетил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-карбоксипропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-карбоксипропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](3-сульфопропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)амино}азетидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-8,24-диоксо-3-(2-сульфоэтил)-11,14,17,20-тетраокса-3,7,23-триазагексакоз-1-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)амино}пропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{6-[(йодацетил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{6-[(этенилсульфонил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{6-[(этенилсульфонил)амино]гексанoил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-{[6-(этенилсульфонил)гексанoил]амино}пропил)(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил){[(2-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-3-сульфо-L-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[(43S,46S)-43-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)-46-метил-37,44,47-триоксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса-38,45,48-триазапентаконтан-50-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил){[(2-{[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[7-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[{3-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил]пропил}(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-(6-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}гексанoил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][3-(бета-L-глюкопирануронозилокси)пропил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-альфа-глутамил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-альфа-глутамил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]({[4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-D-валил-N5-карбамоил-D-орнитил}амино)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-оксидоизохинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]({[4-(4-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
N-{[(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[4-({(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}амино)бутил]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота;
6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-4-(4-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)бутил)бензил)окси)карбонил)(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[4-({(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}амино)бутил]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(4-карбоксибутил)фенил}-L-аланинамид;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({[2-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)бензил]окси}карбонил)(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-4-(4-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)бутил)бензил)окси)карбонил)(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)фенил}-L-аланинамид;
N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамид;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентит;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриaконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамид;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2S)-3-[3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-илокси)фенил]-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамид;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриaконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамид;
N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-[2-(2-сульфоэтокси)этил]-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота;
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидроксиоксан-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-{4-[(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-ил)окси]фенил}пропаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}фенил)метокси]карбонил}[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота;
4-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]этокси}этокси)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
2,6-ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[(79S,82S)-74-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-82-метил-77,80,83-триоксо-79-(пропан-2-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-тетракозаокса-74,78,81-триазатриоктаконтан-83-ил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота;
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3-{2-[{[(4-{[(2S,5S)-2-[3-(карбамоиламино)пропил]-10-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-4,7-диоксо-5-(пропан-2-ил)-15-сульфо-13-окса-3,6,10-триазапентадеканан-1-oил]амино}фенил)метокси]карбонил}(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота;
2,6-ангидро-8-(2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}фенил)-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота;
2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{4-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]бутил}фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3-{2-[{[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентанoил]амино}фенил)метокси]карбонил}(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}сульфанил)этил](2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoил]-L-валил-N-[4-({[(3-{3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}пропил)(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамид;
2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-{4-[({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)амино]бутил}фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота;
2,6-ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[N-({(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-L-аланил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота;
2,6-ангидро-8-{2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-[(N-{[(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-(41-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-тридекаокса-42-азатритетраконтан-43-ил)пирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота;
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриaконтан-34-ил)-b-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота и
(6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил][(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-[2-(2-сульфоэтокси)этил]-b-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота.
В определенных вариантах осуществления ADC или его фармацевтически приемлемой соли
D представляет собой ингибитор Bcl-xL, выбранный из группы, состоящей из следующих соединений, модифицированных таким образом, что атом водорода, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал:
W2.01, W2.02, W2.03, W2.04, W2.05, W2.06, W2.07, W2.08, W2.09, W2.10, W2.11, W2.12, W2.13, W2.14, W2.15, W2.16, W2.17, W2.18, W2.19, W2.20, W2.21, W2.22, W2.23, W2.24, W2.25, W2.26, W2.27, W2.28, W2.29, W2.30, W2.31, W2.32, W2.33, W2.34, W2.35, W2.36, W2.37, W2.38, W2.39, W2.40, W2.41, W2.42, W2.43, W2.44, W2.45, W2.46, W2.47, W2.48, W2.49, W2.50, W2.51, W2.52, W2.53, W2.54, W2.55, W2.56, W2.57, W2.58, W2.59, W2.60, W2.61, W2.62, W2.63, W2.64, W2.65, W2.66, W2.67, W2.68, W2.69, W2.70, W2.71, W2.72, W2.73, W2.74, W2.75, W2.76, W2.77, W2.78, W2.79, W2.80, W2.81, W2.82, W2.83, W2.84, W2.85, W2.86, W2.87, W2.88, W2.89, W2.90 и W2.91 и их фармацевтически приемлемая соль;
L выбран из группы, состоящей из линкеров IVa.1-IVa.8, IVb.1-IVb.19, IVc.1-IVc.7, IVd.1-IVd.4, Va.1-Va.12, Vb.1-Vb.10, Vc.1-Vc.11, Vd.1-Vd.6, Ve.1-Ve.2, VIa.1, VIc.1-V1c.2, VId.1-VId.4, VIIa.1-VIIa.4, VIIb.1-VIIb.8, VIIc.1-VIIc.6, где каждый линкер прореагировал с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента;
LK представляет собой простой тиоэфир; и
m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 8.
В определенных вариантах осуществления ADC или его фармацевтически приемлемой соли
D представляет собой ингибитор Bcl-xL, выбранный из группы, состоящей из следующих соединений, модифицированных таким образом, что атом водорода, соответствующий положению # в структурных формулах (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), отсутствует, при этом образуется монорадикал:
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота;
1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота;
6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-дигидроксибутил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
и их фармацевтически приемлемые соли;
L выбран из группы, состоящей из линкеров IVb.2, IVc.5, IVc.6, IVc.7, IVd.4, Vb.9, Vc.11, VIIa.1, VIIa.3, VIIc.1, VIIc.4 и VIIc.5 в закрытой форме либо в открытой форме и их фармацевтически приемлемой соли;
LK представляет собой простой тиоэфир; и
m представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 4.
Для образования ADC малеимидное кольцо синтона (например, синтонов, перечисленных в таблице В) может вступать в реакцию с антителом Ab с образованием ковалентно присоединяемого фрагмента в виде сукцинимида (закрытая форма) либо сукцинамида (открытая форма). Аналогично другие функциональные группы, например, ацетилгалогенид или винилсульфон, могут вступать в реакцию с антителом Ab с образованием ковалентно присоединенного фрагмента.
В определенных вариантах осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль выбраны из группы, состоящей из AbA-CZ, AbA-TX, AbA-TV, AbA-YY, AbA-AAA, AbA-AAD, AbB-CZ, AbB-TX, AbB-TV, AbB-YY, AbB-AAD, AbG-CZ, AbG-TX, AbG-TV, AbG-YY, AbG-AAA, AbG-AAD, AbK-CZ, AbK-TX, AbK-TV, AbK-YY, AbK-AAA, AbK-AAD, где CZ, TX, TV, YY, AAA и AAD представляют собой синтоны, раскрытые в таблице В, и при этом конъюгированные синтоны находятся в открытой либо закрытой форме.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(i),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(i),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(ii),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(ii),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(iii),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(iii),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(iv),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(iv),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(v),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(v),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(vi),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 34, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 33, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 38, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 37, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 147, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 144, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 169.
В одном варианте осуществления ADC или его фармацевтически приемлемая соль представляют собой
(vi),
где m равняется 2, Ab представляет собой или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 140, и домен СDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, и домен СDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 136, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 135, или антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 170, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 171.
Ингибиторы Bcl-xL, в том числе действующие средства и синтоны, и способы их получения описаны в US 2016/0339117 (AbbVie Inc.), которая включена в данный документ посредством ссылки.
III.A.4. Способы синтеза Bcl-xL ADC
Ингибиторы Bcl-xL и синтоны, описанные в данном документе, можно синтезировать с применением стандартных известных методик органической химии. Общие схемы синтеза ингибиторов Bcl-xL и синтонов, которые могут применяться как таковые или в модифицированном виде для синтеза в полном объеме ингибиторов Bcl-xL и синтонов, описанных в данном документе, представлены ниже. Конкретные способы синтеза иллюстративных ингибиторов Bcl-xL и синтонов, которые могут быть применимы в качестве руководства, представлены в разделе "Примеры". Подобным образом, ADC могут быть получены с помощью стандартных способов, таких как способы, аналогичные описанным у Hamblett et al., 2004, "Effects of Drug Loading on the Antitumor Activity of a Monoclonal Antibody Drug Conjugate", Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Doronina et al., 2003, "Development of potent and highly efficacious monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy", Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; и Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465. Например, ADC с четырьмя молекулами лекарственного средства на антитело можно получать с помощью частичного восстановления антитела избытком восстанавливающего реагента, такого как DTT или TCEP, при 37°C в течение 30 мин., затем замены буфера путем элюирования через смолу SEPHADEX® G-25 с применением 1 мM DTPA в DPBS. Элюент разбавляют дополнительным количеством DPBS, и концентрацию тиолов антитела можно измерить с применением 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) [реагент Эллмана]. Добавляют избыток, например 5-кратный, синтона линкер-лекарственное средство при 4°C на 1 ч., и реакцию конъюгации можно гасить с помощью добавления значительного избытка, например 20-кратного, цистеина. Полученную в результате смесь ADC можно очищать с помощью SEPHADEX G-25, уравновешенной в PBS, для удаления непрореагировавших синтонов, обессоливать при необходимости и очищать с помощью эксклюзионной хроматографии. Полученные в результате ADC затем можно подвергать стерилизующей фильтрации, например через 0,2 мкм фильтр, и при необходимости лиофилизировать для хранения. В определенных вариантах осуществления все межцепочечные цистеиновые дисульфидные связи заменяются конъюгатами линкер-лекарственное средство. Один вариант осуществления относится к способу получения ADC, предусматривающему приведение в контакт синтона, описанного в данном документе, с антителом в условиях, при которых синтон ковалентно связывается с антителом.
Примеры вышеуказанных ингибиторов Bcl-xL, линкеров и их синтонов, а также способы их получения можно найти в публикации патента США № US 2016/0339117, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Конкретные способы синтеза иллюстративных ADC, которые можно применять для синтеза полного набора ADC, описанных в данном документе, представлены в разделе "Примеры".
III.A.5. Общие способы синтеза ингибиторов Bcl-xL
На схемах ниже различные заместители Ar1, Ar2, Z1, R4, R10, R11a и R11b определены в разделе "Подробное описание".
5.1.1. Синтез соединения (6)
Синтез промежуточного соединения (6) описан на схеме 1. Соединение (1) можно обрабатывать с помощью BH3⋅THF с получением соединения (2). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. Соединение (3) можно получить путем обработки соединения (2) с помощью 
в присутствии цианометилентрибутилфосфорана. Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения толуол. Соединение (3) можно обрабатывать этан-1,2-диолом в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин, с получением соединения (4). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре, и реакцию можно осуществлять в условиях микроволнового излучения. Соединение (4) можно обрабатывать с помощью сильного основания, такого как без ограничения н-бутиллитий, с последующим добавлением йодметана с получением соединения (5). Добавление и реакцию обычно осуществляют в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, при пониженной температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды в целях обработки. Соединение (5) можно обрабатывать N-йодсукцинимидом с получением соединения (6). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.1.2. Синтез соединения (12)
Синтез промежуточного соединения (12) описан на схеме 2. Соединение (3) можно обрабатывать с помощью три-н-бутилаллилстаннана в присутствии ZnCl2⋅Et2O или N,N'-азоизобутиронитрила (AIBN) с получением соединения (10) (Yamamoto et al., 1998, Heterocycles 47:765-780). Обычно реакцию осуществляют при -78°C в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (10) можно обрабатывать в стандартных условиях, известных из уровня техники, для гидроборирования/окисления с получением соединения (11). Например, обработка соединения (10) реагентом, таким как BH3⋅THF, в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, с последующей обработкой промежуточного алкилборанового аддукта окислителем, таким как без ограничения пероксид водорода, в присутствии основания, такого как без ограничения гидроксид натрия, обеспечит получение соединения (11) (Brown et al., 1968, J. Am. Chem. Soc. 86:397). Обычно добавление BH3⋅THF осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды, за которым следует добавление пероксида водорода и гидроксида натрия с получением спиртового продукта. Соединение (12) можно получить согласно схеме 1, описанной ранее для соединения (6).
5.1.3. Синтез соединения (15)
Синтез промежуточного соединения (15) описан на схеме 3. Соединение (3) можно вводить в реакцию с тиомочевиной в смеси растворителей из уксусной кислоты и 48% водного раствора HBr при 100°C с получением промежуточного соединения, которое можно впоследствии обрабатывать гидроксидом натрия в смеси растворителей, таких как без ограничения 20% об./об. этанол в воде, с получением соединения (13). Соединение (13) можно вводить в реакцию с 2-хлорэтанолом в присутствии основания, такого как без ограничения этоксид натрия, с получением соединения (14). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды или повышенных температурах в растворителе, таком как без ограничения этанол. Соединение (15) можно получить согласно схеме 1, описанной ранее для соединения (6).
5.1.4. Синтез соединения (22)
Синтез соединения (22) описан на схеме 4. Соединение (16) можно вводить в реакцию с йодметаном в присутствии основания, такого как без ограничения карбонат калия, с получением соединения (17). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды или повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения ацетон или N,N-диметилформамид. Соединение (17) можно вводить в реакцию в фотохимических условиях с тозилцианидом в присутствии бензофенона с получением соединения (18) (см. Kamijo et al., 2011, Org. Lett., 13:5928-5931). Обычно реакцию проводят при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил или бензол, с применением ртутной лампы со средним давлением Riko 100 Вт в качестве источника света. Соединение (18) можно вводить в реакцию с гидроксидом лития в системе растворителей, такой как без ограничения смеси воды и тетрагидрофурана или воды и метанола, с получением соединения (19). Соединение (19) можно обрабатывать с помощью BH3⋅THF с получением соединения (20). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. Соединение (21) можно получить путем обработки соединения (20) с помощью 
в присутствии цианометилентрибутилфосфорана. Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения толуол. Соединение (21) можно обрабатывать N-йодсукцинимидом с получением соединения (22). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.1.5. Синтез соединения (24)
Схема 5
Синтез пиразольного соединения (24) описан на схеме 5. Соединение (22) можно обрабатывать восстанавливающим средством, таким как без ограничения алюмогидрид лития, в растворителе, таком как без ограничения простой диэтиловый эфир или тетрагидрофуран, с получением соединения (23). Обычно реакцию осуществляют при 0°C перед нагреванием до температуры окружающей среды или повышенной температуры. Соединение (23) можно вводить в реакцию с ди-трет-бутилдикарбонатом при стандартных условиях, описанных в данном документе или в литературе, с получением соединения (24).
5.1.6. Синтез соединения (24a)
Схема 6
Синтез промежуточного соединения (24a) описан на схеме 6. Соединение (22a) можно подвергать гидролизу с применением условий, описанных в литературе, с получением соединения (23a). Обычно реакцию проводят в присутствии гидроксида калия в растворителе, таком как без ограничения этиленгликоль, при повышенных температурах (см. Roberts et al., 1994, J. Org. Chem. 59:6464-6469; Yang et al, 2013, Org. Lett., 15:690-693). Соединение (24a) можно получить из соединения (23a) с помощью перегруппировки Курциуса с применением условий, описанных в литературе. Например, соединение (23a) можно вводить в реакцию с азидом натрия в присутствии бромида тетрабутиламмония, трифлата цинка(II) и ди-трет-бутилдикарбоната с получением соединения (24a) (см. Lebel et al., Org. Lett., 2005, 7:4107-4110). Обычно реакцию проводят при повышенных температурах, предпочтительно при 40-50°C, в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран.
5.1.7. Синтез соединения (29)
Схема 7
Как показано на схеме 7, соединения формулы (27) можно получить путем осуществления реакции соединений формулы (25) с трет-бутил-3-бром-6-фторпиколинатом (26) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин или триэтиламин. Обычно реакцию осуществляют в инертной атмосфере при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения диметилсульфоксид. Соединения формулы (27) можно вводить в реакцию с 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксабороланом (28) в условиях борилирования, описанных в данном документе или в литературе, с получением соединений формулы (29).
5.1.8. Синтез соединения (38)
Схема 8
На схеме 8 описан способ получения промежуточных соединений, которые содержат -Nu (нуклеофил), привязанный к адамантану и пиколинату, защищенным в виде сложного трет-бутилового эфира. Соединение (30) можно вводить в реакцию с соединением (31) в условиях реакции сочетания Сузуки, описанных в данном документе или в литературе, с получением метильного соединения (32). Соединение (32) можно обрабатывать основанием, таким как без ограничения триэтиламин, затем метансульфонилхлоридом с получением соединения (33). Обычно добавление осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (33) можно вводить в реакцию с нуклеофилом (Nu) формулы (34) с получением соединения (35). Примеры нуклеофилов включают без ограничения азид натрия, метиламин, аммиак и ди-трет-бутилиминодикарбонат. Соединение (17) можно вводить в реакцию с гидроксидом лития с получением соединения (36). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, метанол, вода или их смеси. Соединение (36) можно вводить в реакцию с соединением (37) в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединений формулы (38).5.1.9. Синтез соединений (42) и (43)
Схема 9
На схеме 9 показаны иллюстративные способы, применяемые для получения солюбилизированных ингибиторов Bcl-xL. Ингибиторы Bcl-xL можно синтезировать с применением общего подхода модифицирования первичного амина с помощью солюбилизирующей группы, а затем присоединения полученного в результате вторичного амина к линкеру, как описано на последующих схемах. Например, соединение (41) можно получить путем осуществления реакции соединения (39) с соединением (40). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (41) можно вводить в реакцию с трифторуксусной кислотой с получением соединения (43). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Другой пример, показанный на схеме 9, представляет собой реакцию соединения (39) с диэтилвинилфосфонатом с последующей реакцией с бромтриметилсиланом и аллилтриметилсиланом с получением соединения (42). Другие примеры введения солюбилизирующих групп в ингибиторы Bcl-xL, описанные в данном документе, включают без ограничения реакции восстановительного аминирования, реакции алкилирования и реакции амидирования.
5.1.10. Синтез соединения (47)
Схема 10
На схеме 10 показано введение солюбилизирующей группы с помощью реакции амидирования. Ингибиторы Bcl-xL можно синтезировать с применением общего подхода модифицирования первичного или вторичного амина с помощью солюбилизирующей группы, а затем присоединения полученного в результате амина к линкеру, как описано на последующих схемах. Например, соединение (45) можно последовательно обрабатывать с помощью HATU и соединения (44) с получением соединения (46). Соединение (46) можно обрабатывать с помощью диэтиламина в растворителях, таких как без ограничения N,N-диметилформамид, с получением соединения (47).
5.1.11. Синтез соединения (51)
Схема 11
На схеме 11 показаны иллюстративные способы получения солюбилизированных ингибиторов Bcl-xL. Ингибиторы Bcl-xL можно синтезировать с применением общего подхода модифицирования первичного амина с помощью спейсера с получением дифференциально защищенного диамина. Незащищенный вторичный амин может быть модифицирован с помощью солюбилизирующей группы. Удаление защитной группы из защищенного амина затем приводит к открытию сайта для присоединения линкера, как описано на последующих схемах. Например, соединение (39) можно подвергать восстанавливающему алкилированию с помощью реагентов, таких как без ограничения трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилат (48), в условиях, известных из уровня техники, с получением вторичного амина (49). Соединение (50) можно получить путем осуществления реакции соединения (49) с 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонатом (40). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (40) можно вводить в реакцию с трифторуксусной кислотой с получением соединения (51). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан.
5.1.12. Синтез соединения (61)
На схеме 12 описан способ синтеза солюбилизированных ингибиторов Bcl-xL. Соединение (52) можно вводить в реакцию с метансульфонилхлоридом в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин, с получением соединения (53). Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (53) можно обрабатывать аммиаком в метаноле с получением соединения (54). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре, и реакцию можно осуществлять в условиях микроволнового излучения. Соединение (56) можно получить путем осуществления реакции соединения (55) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (56) можно обрабатывать ди-трет-бутилдикарбонатом и 4-(диметиламино)пиридином с получением соединения (57). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. Соединение (59) можно получить путем осуществления реакции соединения (57) со сложным боронатным эфиром (или эквивалентом бороновой кислоты) формулы (58) в условиях реакции сочетания Сузуки, описанных в данном документе или в литературе. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат можно вводить в реакцию с соединением (37) с последующей реакцией с соединением (59) с получением соединения (60). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. Соединение (61) можно получить путем обработки соединения (60) трифторуксусной кислотой. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан.
5.1.13. Синтез соединения (70)
На схеме 13 описан синтез 5-гидрокситетрагидроизохинолиновых промежуточных соединений. Соединение (63) можно получить путем обработки соединения (62) N-бромсукцинимидом. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (63) можно вводить в реакцию с бензилбромидом в присутствии основания, такого как без ограничения карбонат калия, с получением соединения (64). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения ацетон. Соединение (64) можно обрабатывать монооксидом углерода и метанолом в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин, и катализатора, такого как без ограничения соединение (65). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в инертной атмосфере. Соединение (65) можно обрабатывать кислотой, такой как без ограничения хлористоводородная кислота в диоксане, с получением соединения (66). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. Соединение (67) можно получить путем осуществления реакции соединения (66) с трет-бутил-3-бром-6-фторпиколинатом в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин. Обычно реакцию осуществляют в инертной атмосфере при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения диметилсульфоксид. Соединение (67) можно вводить в реакцию с бороновой кислотой формулы (68), где Ad представляет собой метиладамантановый фрагмент соединений по настоящему изобретению (например, соединений формул (IIa) - (IId)), в условиях реакции сочетания Сузуки, описанных в данном документе или в литературе, с получением соединения (69). Соединение (70) можно получить путем осуществления реакции соединения (69) с водородом в присутствии Pd(OH)2. Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран.
5.1.14. Синтез соединения (75)
На схеме 14 показаны иллюстративные способы, применяемые для получения солюбилизированных ингибиторов Bcl-xL. Ингибиторы Bcl-xL можно синтезировать с применением общего подхода модифицирования заместителя Ar2 с помощью солюбилизирующей группы, а затем присоединения амина к линкеру, как описано на последующих схемах. Например, соединение (71) можно вводить в реакцию с трет-бутил-2-бромацетатом в присутствии основания, такого как без ограничения карбонат калия, в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (72) можно обрабатывать водным раствором гидроксида лития в растворителе, таком как без ограничения метанол, тетрагидрофуран или их смеси, с получением соединения (73). Соединение (74) можно получать путем амидирования соединения (73) с помощью соединения (37) в условиях, описанных ранее. Соединение (74) можно обрабатывать кислотами, такими как без ограничения трифторуксусная кислота или HCl, с получением ингибитора Bcl-xL формулы (75). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителях, таких как без ограничения дихлорметан или 1,4-диоксан.
III.A.6. Общие способы синтеза синтонов Bcl-xL
На схемах ниже различные заместители Ar1, Ar2, Z1, Y, G, R11a и R11b определены в разделе "Подробное описание".
5.2.1. Синтез соединения (89)
Как показано на схеме 15, соединения формулы (77), где PG представляет собой подходящую нестойкую в присутствии основания защитную группу, и AA(2) представляет собой Cit, Ala или Lys, можно вводить в реакцию с 4-(аминофенил)метанолом (78) в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединения (79). Соединение (80) моно получить путем осуществления реакции соединения (79) с основанием, таким как без ограничения диэтиламин. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (81), где PG представляет собой подходящую нестойкую в присутствии основания или кислоты защитную группу, и AA(1) представляет собой Val или Phe, можно вводить в реакцию с соединением (80), в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединения (82). Соединение (83) можно получить путем обработки соединения (82) диэтиламином или трифторуксусной кислотой, в зависимости от конкретного случая. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (84), где Sp представляет собой спейсер, можно вводить в реакцию с соединением (83) с получением соединения (85). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (85) можно вводить в реакцию с бис(4-нитрофенил)карбонатом (86) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением соединений (87). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединения (87) можно вводить в реакцию с соединением (88) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением соединения (89). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.2.2. Синтез соединений (94) и (96)
На схеме 16 описана процедура альтернативных вариантов присоединения mAb-линкера с дипептидными синтонами. Соединение (88) можно вводить в реакцию с соединением (90) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропиламин, с получением соединения (91). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (92) можно получать путем осуществления реакции соединения (91) с диэтиламином. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (93), где X1 представляет собой Cl, Br или I, можно вводить в реакцию с соединением (92) в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединения (94). Соединение (92) можно вводить в реакцию с соединениями формулы (95) в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединения (96).
5.2.3. Синтез соединения (106)
На схеме 17 описан синтез промежуточных соединений и синтонов с винилглюкуронидным линкером. (2R,3R,4S,5S,6S)-2-Бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (97) можно обрабатывать оксидом серебра, а затем 4-бром-2-нитрофенолом (98) с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-бром-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (99). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-Бром-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (99) можно вводить в реакцию с (E)-трет-бутилдиметил((3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)аллил)окси)силаном (100) в присутствии основания, такого как без ограничения карбонат натрия, и катализатора, такого как без ограничения трис(дибензилиденацетон)дипалладий (Pd2(dba)3), с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((E)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)проп-1-ен-1-ил)-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (101). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-Амино-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (102) можно получать путем осуществления реакции (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((E)-3-((трет-бутилдиметилсилил)окси)проп-1-ен-1-ил)-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (101) с цинком в присутствии кислоты, такой как без ограничения хлористоводородная кислота. Обычно добавление осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, вода или их смеси. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-Амино-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (102) можно вводить в реакцию с (9H-флуорен-9-ил)метил(3-хлор-3-оксопропил)карбаматом (103) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (104). Обычно добавление осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (88) можно вводить в реакцию с (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетатом (104) в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин, с последующей обработкой и осуществлением реакции с соединением (105) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением соединения (106). Обычно реакции осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.2.4. Синтез соединения (115)
На схеме 18 описан синтез иллюстративного промежуточного соединения и синтона с 2-эфирглюкуронидным линкером. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-Бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (97) можно вводить в реакцию с 2,4-дигидроксибензальдегидом (107) в присутствии карбоната серебра с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-формил-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (108). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-формил-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (108) можно обрабатывать борогидридом натрия с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-гидрокси-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (109). Обычно добавление осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, метанол или их смеси. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(((Трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (110) можно получить путем осуществления реакции (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-гидрокси-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (109) с трет-бутилдиметилсилилхлоридом в присутствии имидазола. Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (111) можно получить путем осуществления реакции (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (110) с (9H-флуорен-9-ил)метил(2-(2-гидроксиэтокси)этил)карбаматом в присутствии трифенилфосфина и азодикарбоксилата, такого как без ограничения ди-трет-бутилдиазен-1,2-дикарбоксилат. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения толуол. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (111) можно обрабатывать уксусной кислотой с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (112). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения вода, тетрагидрофуран или их смеси. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (113) может быть получен путем осуществления реакции (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (112) с бис(4-нитрофенил)карбонатом в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (113) можно обрабатывать соединением (88) в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин, с последующей обработкой гидроксидом лития с получением соединения (114). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид, тетрагидрофуран, метанол или их смеси. Соединение (115) можно получить путем осуществления реакции соединения (114) с соединением (84) в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.2.5. Синтез соединения (119)
На схеме 19 описано введение второй солюбилизирующей группы в линкер на основе сахара. Соединение (116) можно вводить в реакцию с (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-сульфопропановой кислотой (117) в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с последующей обработкой основанием, таким как без ограничения диэтиламин, с получением соединения (118). Соединение (118) можно вводить в реакцию с соединением (84), где Sp представляет собой спейсер, в условиях амидирования, описанных в данном документе или легко доступных в литературе, с получением соединения (119).
5.2.6. Синтез соединения (129)
Схема 20
На схеме 20 описан синтез промежуточных соединений и синтонов с 4-эфирглюкуронидным линкером. 4-(2-(2-Бромэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегид (122) можно получить путем осуществления реакции 2,4-дигидроксибензальдегида (120) с 1-бром-2-(2-бромэтокси)этаном (121) в присутствии основания, такого как без ограничения карбонат калия. Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. 4-(2-(2-Бромэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегид (122) можно обрабатывать азидом натрия с получением 4-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегида (123). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-2-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (125) можно получать путем осуществления реакции 4-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегида (123) с (3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетатом (124) в присутствии оксида серебра. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. Гидрогенизация (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-2-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (125) в присутствии Pd/C будет обеспечивать получение (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-аминоэтокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (126). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (127) можно получить путем обработки (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-аминоэтокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (126) с помощью (9H-флуорен-9-ил)метилхлорформиата в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин. Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. Соединение (88) можно вводить в реакцию с (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетатом (127) в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин, с последующей обработкой гидроксидом лития с получением соединения (128). Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. Соединение (129) можно получить путем осуществления реакции соединения (128) с соединением (84) в присутствии основания, такого как без ограничения N-этил-N-изопропилпропан-2-амин. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.2.7. Синтез соединения (139)
Схема 21
На схеме 21 описан синтез карбаматглюкуронидных промежуточных соединений и синтонов. 2-Амино-5-(гидроксиметил)фенол (130) можно обрабатывать гидридом натрия и затем вводить в реакцию с 2-(2-азидоэтокси)этил-4-метилбензолсульфонатом (131) с получением (4-амино-3-(2-(2-азидоэтокси)этокси)фенил)метанола (132). Обычно реакцию осуществляют при повышенной температуре в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. 2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)анилин (133) можно получить путем осуществления реакции (4-амино-3-(2-(2-азидоэтокси)этокси)фенил)метанола (132) с трет-бутилдиметилхлорсиланом в присутствии имидазола. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. 2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)анилин (133) можно обрабатывать фосгеном в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин, с последующим осуществлением реакции с (3R,4S,5S,6S)-2-гидрокси-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетатом (134) в присутствии основания, такого как без ограничения триэтиламин, с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (135). Обычно реакцию осуществляют в растворителе, таком как без ограничения толуол, и добавления обычно осуществляют при низкой температуре перед нагреванием до температуры окружающей среды после добавления фосгена и нагревания при повышенной температуре после добавления (3R,4S,5S,6S)-2-гидрокси-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (134). (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-4-(гидроксиметил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (136) можно получать путем осуществления реакции (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (135) с моногидратом п-толуолсульфоновой кислоты. Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения метанол. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-4-(гидроксиметил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (136) можно вводить в реакцию с бис(4-нитрофенил)карбонатом в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (137). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(((2-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)карбамоил)окси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (137) можно вводить в реакцию с соединением в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с последующей обработкой водным раствором гидроксида лития с получением соединения (138). Первую стадию обычно проводят при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид, а вторую стадию обычно проводят при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения метанол. Соединение (138) можно обрабатывать трис(2-карбоксиэтил))фосфингидрохлоридом с последующим осуществлением реакции с соединением (84) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением соединения (139). Реакцию с трис(2-карбоксиэтил))фосфингидрохлоридом обычно осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, вода или их смеси, а реакцию с N-сукцинимидил-6-малеимидогексаноатом обычно осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
5.2.8. Синтез соединения (149)
На схеме 22 описан синтез промежуточных соединений и синтонов с галактозидным линкером. (2S,3R,4S,5S,6R)-6-(Ацетоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2,3,4,5-тетраилтетраацетат (140) можно обрабатывать с помощью HBr в уксусной кислоте с получением (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-бромтетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (141). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в атмосфере азота. (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(Ацетоксиметил)-6-(4-формил-2-нитрофенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (143) можно получить путем обработки (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-бромтетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (141) оксидом серебра(I) в присутствии 4-гидрокси-3-нитробензальдегида (142). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения ацетонитрил. (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(Ацетоксиметил)-6-(4-формил-2-нитрофенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (143) можно обрабатывать борогидридом натрия с получением (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(4-(гидроксиметил)-2-нитрофенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (144). Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран, метанол или их смеси. (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(Ацетоксиметил)-6-(2-амино-4-(гидроксиметил)фенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (145) можно получить путем обработки (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(4-(гидроксиметил)-2-нитрофенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (144) цинком в присутствии хлористоводородной кислоты. Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в атмосфере азота в растворителе, таком как без ограничения тетрагидрофуран. (2S,3R,4S,5S,6R)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(ацетоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (146) можно получить путем осуществления реакции (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(ацетоксиметил)-6-(2-амино-4-(гидроксиметил)фенокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (145) с (9H-флуорен-9-ил)метил(3-хлор-3-оксопропил)карбаматом (103) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин. Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения дихлорметан. (2S,3R,4S,5S,6R)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(ацетоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (146) можно вводить в реакцию с бис(4-нитрофенил)карбонатом в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением (2S,3R,4S,5S,6R)-2-(2-(3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(ацетоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (147). Обычно реакцию осуществляют при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид. (2S,3R,4S,5S,6R)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(ацетоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (147) можно вводить в реакцию с соединением (88) в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с последующей обработкой гидроксидом лития с получением соединения (148). Первую стадию обычно проводят при низкой температуре в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид, а вторую стадию обычно проводят при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения метанол. Соединение (148) можно обрабатывать с помощью соединения (84), где Sp представляет собой спейсер, в присутствии основания, такого как без ограничения N,N-диизопропилэтиламин, с получением соединения (149). Обычно реакцию осуществляют при температуре окружающей среды в растворителе, таком как без ограничения N,N-диметилформамид.
III.A.7. Общие способы синтеза ADC с антителом к B7-H3
В настоящем изобретении также раскрыт способ получения ADC с антителом к B7-H3 согласно структурной формуле (I):
,
где D, L, LK, Ab и m определены в разделе "Подробное описание". Способ включает
обработку антитела в водном растворе с помощью эффективного количества восстанавливающего дисульфидные связи средства при 30-40°C в течение по меньшей мере 15 минут, а затем охлаждение раствора антитела до 20-27°C;
добавление к раствору восстановленного антитела раствора воды/диметилсульфоксида, содержащего синтон, выбранный из группы 2.1-2.176 (таблица B);
регулирование рН раствора до значения рН, составляющего 7,5-8,5;
обеспечение протекания реакции в течение 48-80 часов с образованием ADC;
где масса изменяется на 18±2 а. е. м. для каждого случая гидролиза сукцинимида до сукцинамида, как измерено посредством масс-спектрометрии с ионизацией распылением в электрическом поле; и
где ADC необязательно очищают посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия.
В определенных вариантах осуществления антитело представляет собой антитело к hB7-H3, где антитело к hB7-H3 содержит CDR тяжелой и легкой цепей huAb3v2.5, huAb3v2.6 или huAb13v1.
Настоящее изобретение также направлено на ADC с антителом к B7-H3, полученный с помощь вышеописанного способа.
В определенных вариантах осуществления ADC с антителом к B7-H3, раскрытый в настоящей заявке, образуется путем приведения в контакт антитела, которое связывает рецептор клеточной поверхности hB7-H3 или антиген, ассоциированный с опухолью, на опухолевой клетке, с синтоном лекарственное средство-линкер в условиях, при которых синтон лекарственное средство-линкер ковалентно связывается с антителом посредством малеимидного фрагмента, как показано в формулах (IIe) и (IIf), или посредством ацетилгалогенида, как показано в (IIg), или посредством винилсульфона, как показано в (IIh).
(IIe) 
, (IIf) 
,
(IIg) 
, (IIh)
,
где D представляет собой лекарственное средство, которое является ингибитором Bcl-xL согласно структурным формулам (IIa), (IIb), (IIc) или (IId), описанным выше, и L1 представляет собой часть линкера, не образованную благодаря малеимиду, ацетилгалогениду или винилсульфону при присоединении синтона к антителу; и где синтон лекарственное средство-линкер выбран из группы, состоящей из примеров синтонов 2.1-2.176 (таблица В), или его фармацевтически приемлемую соль.
В определенных вариантах осуществления стадию приведения в контакт проводят при таких условиях, чтобы ADC с антителом к B7-H3, характеризовался DAR, составляющим 2, 3 или 4.
III.B. ADC с антителом к B7-H3. Другие иллюстративные лекарственные средства для конъюгации
Антитела к B7-H3 в ADC могут быть использованы для нацеливания одного или нескольких лекарственных средств на клетку, представляющую интерес, например раковую клетку, экспрессирующую B7-H3. ADC с антителами к B7-H3 по настоящему изобретению обеспечивают целенаправленную терапию, с помощью которой можно, например, уменьшать побочные эффекты, часто наблюдаемые при противораковой терапии, поскольку одно или несколько лекарственных средств доставляются в определенную клетку.
Ауристатины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению, например, антитело huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним ауристатином. Ауристатины представляют собой группу аналогов доластатина, которые, как в целом было показано, обладают противораковой активностью, нарушая динамику микротрубочек и гидролиз GTP, за счет чего обеспечивается подавление клеточного деления. Например, ауристатин E (патент США № 5635483) представляет собой синтетический аналог морского природного вещества доластатина 10, соединения, которое подавляет полимеризацию тубулина путем связывания с одним и тем же сайтом на тубулине в качестве противоракового лекарственного средства винкристина (G.R. Pettit, Prog. Chem. Org. Nat. Prod, 70: 1-79 (1997)). Доластатин 10, ауристатин PE и ауристатин E представляют собой линейные пептиды, имеющие четыре аминокислоты, три из которых являются уникальными для класса соединений доластатина. Иллюстративные варианты осуществления ингибиторов митоза подкласса ауристатина включают без ограничения монометилауристатин D (MMAD или производное ауристатина D), монометилауристатин E (производное MMAE или ауристатина E), монометилауристатин F (MMAF или производное ауристатина F), ауристатин F-фенилендиамин(AFP), ауристатин EB (AEB), аристатин EFP (AEFP) и сложный эфир 5-бензоилвалериановой кислоты-AE (AEVB). Синтез и структура производных ауристатина описаны в публикациях заявки на патент США №№ 2003-0083263, 2005-0238649 и 2005-0009751; международной публикации на патент № WO 04/010957, международной публикации на патент № WO 02/088172 и патентах США № № 6323315; 6239104; 6034065; 5780588; 5665860; 5663149; 5635483; 5599902; 5554725; 5530097; 5521284; 5504191; 5410024; 5138036; 5076973; 4986988; 4978744; 4879278; 4816444 и 4486414, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления антитела к B7-H3 по настоящему изобретению, например huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, конъюгированы по меньшей мере с одним MMAE (монометилауристатин E). Монометилауристатин E (MMAE, ведотин) подавляет деление клеток путем блокирования полимеризации тубулина. Однако из-за своей сверхтоксичности ауристатин Е не может использоваться в качестве лекарственного средства сам по себе. Ауристатин E может быть связан с моноклональным антителом (mAb), которое распознает специфическую экспрессию маркера в раковых клетках и направляет MMAE на раковые клетки. В одном варианте осуществления линкер, связывающий MMAE с антителом к B7-H3, является стабильным во внеклеточной жидкости (т. е. среде или окружающей среде, которая является внешней по отношению к клеткам), но расщепляется с помощью катепсина после того, как ADC связывается с конкретным антигеном раковой клетки и приникает в раковую клетку, за счет чего обеспечивается высвобождение токсичного MMAE и активация мощного антимитотического механизма.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3, описанное в данном документе, например huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6 конъюгировано по меньшей мере с одним MMAF (монометилауристатин F). Монометилауристатин F (MMAF) подавляет деление клеток путем блокирования полимеризации тубулина. Он имеет заряженный C-концевой фенилаланиновый остаток, который ослабляет его цитотоксическую активность по сравнению с его незаряженным аналогом MMAE. Однако из-за своей сверхтоксичности ауристатин F нельзя использовать в качестве лекарственного средства сам по себе, но его можно связывать с моноклональным антителом (mAb), которое направляет его в раковые клетки. В одном варианте осуществления линкер к антителу к B7-H3 является стабильным во внеклеточной жидкости, но расщепляется с помощью катепсина, когда конъюгат проникает в опухолевую клетку, за счет чего обеспечивается активация антимитотического механизма.
Структуры MMAF и MMAE представлены ниже.
Примеры huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6-vcMMAE также представлены на фигуре 3. Следует отметить, что на фигуре 3 показана ситуация, когда антитело (например, huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6) связано с одним лекарственным средством и, следовательно, характеризуется DAR, составляющим 1. В определенных вариантах осуществления ADC будет характеризоваться DAR от 2 до 8 или, в качестве альтернативы, от 2 до 4.
Другие лекарственные средства для конъюгации
Примеры лекарственных средств, которые могут быть использованы в ADC, т. е. лекарственные средства, которые могут быть конъюгированы с антителами к B7-H3 по настоящему изобретению, приведены ниже и включают ингибиторы митоза, противоопухолевые антибиотики, иммуномодулирующие средства, векторы генной терапии, алкилирующие средства, антиангиогенные средства, антиметаболиты, борсодержащие средства, хемопротекторные средства, гормональные средства, глюкокортикоиды, фотоактивные терапевтические средства, олигонуклеотиды, радиоактивные изотопы, радиосенсибилизаторы, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы киназы и их комбинации.
1. Ингибиторы митоза
В одном аспекте антитела к B7-H3 могут быть конъюгированы с одним или несколькими ингибиторами митоза с получением ADC для лечения рака. Используемый в данном документе термин "ингибитор митоза" относится к цитотоксическому и/или терапевтическому средству, которое блокирует митоз или деление клеток, биологический процесс, особенно важный для раковых клеток. Ингибитор митоза нарушает микротрубочки таким образом, что предотвращается деление клеток, часто путем влияния на полимеризацию микротрубочек (например, подавление полимеризации микротрубочек) или деполимеризацию микротрубочек (например, стабилизация цитоскелета микротрубочек, предотвращая деполимеризацию). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано с одним или несколькими ингибиторами митоза, которые нарушают образование микротрубочек путем подавления полимеризации тубулина. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано с одним или несколькими ингибиторами митоза, которые стабилизируют цитоскелет микротрубочек, предотвращая деполимеризацию. В одном варианте осуществления ингибитор митоза, используемый в ADC по настоящему изобретению, представляет собой Ixempra (иксабепилон). Примеры ингибиторов митоза, которые можно использовать в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, приведены ниже. В род ингибиторов митоза включены ауристатины, описанные выше.
a. Доластатины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним доластатином с образованием ADC. Доластатины представляют собой короткие пептидные соединения, выделенные у морского зайца в Индийском океане Dolabella auricularia (см. Pettit et al., J. Am. Chem. Soc., 1976, 98, 4677). Примеры доластатинов включают доластатин 10 и доластатин 15. Доластатин 15, депсипептид из семи субъединиц, полученный из Dolabella auricularia, является мощным антимитотическим средством, структурно связанным с антитубулиновым средством доластатином 10, пептидом из пяти субъединиц, полученным из того же организма. Таким образом, в одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению содержит антитело к B7-H3, как описано в данном документе, и по меньшей мере один доластатин. Ауристатины, описанные выше, являются синтетическими производными доластатина 10.
b. Майтанзиноиды
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним майтанзиноидом с образованием ADC. Майтанзиноиды являются мощными противоопухолевыми средствами, которые первоначально были выделены из представителей семейств высших растений Celastraceae, Rhamnaceae и Euphorbiacea, а также некоторых видов мха (Kupchan et al., J. Am. Chem., Soc., 94: 1354-1356 [1972], Wani et al., J. Chem. Soc. Chem., Commun., 390: [1973]; Powell et al, J. Nat. Prod. 46:660-666 [1983]; Sakai et al, J. Nat. Prod. 51:845-850 [1988]; и Suwanborirux et al, Experientia 46:117-120 [1990]). Данные свидетельствуют о том, что майтанзиноиды подавляют митоз посредством подавления полимеризации белка микротрубочек тубулина, за счет чего обеспечивается предотвращение образования микротрубочек (см., например, патент США № 6441163 и Remillard et al., Science, 189, 1002-1005 (1975)). Было показано, что майтанзиноиды подавляют рост опухолевых клеток in vitro с использованием моделей клеточной культуры и in vivo с использованием систем лабораторных животных. Кроме того, цитотоксичность майтанзиноидов в 1000 раз выше, чем у традиционных химиотерапевтических средств, таких как, например, метотрексат, даунорубицин и винкристин (см., например, патент США № 5208020).
Майтанзиноиды включают майтанзины, майтанзинол, С-3 сложные эфиры майтанзинола и другие аналоги и производные майтанзинола (см., например, патенты США №№ 5208020 и 6441163, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). С-3 сложные эфиры майтанзинола могут встречаться в природе или получены синтетически. Более того, как встречающиеся в природе, так и синтетические C-3 сложные эфиры майтанзинола можно классифицировать на С-3 сложный эфир простых карбоновых кислот или С-3 сложный эфир с производными N-метил-L-аланина, причем последний является более цитотоксичным, чем предыдущий. Синтетические аналоги майтанзиноида описаны, например, в Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978).
Подходящие майтанзиноиды для применения в ADC по настоящему изобретению могут быть выделены из природных источников, получены синтетическим или полусинтетическим путем. Кроме того, майтанзиноид можно модифицировать любым подходящим способом, при условии, что в конечной молекуле конъюгата сохраняется достаточная цитотоксичность. В связи с этим майтанзиноиды не имеют подходящих функциональных групп, с которыми могут связываться антитела. Желательно использовать связывающий фрагмент для связывания майтанзиноида с антителом для образования конъюгата, что более подробно описано ниже в разделе, касающемся линкера. Ниже представлена структура иллюстративного майтанзиноида, мертанзина (DM1).
Типичные примеры майтанзиноидов включают без ограничения DM1 ((N2'-деацетил-N2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин, также называемый мертанзином, лекарственное средство майтанзиноид 1, ImmunoGen, Inc.; см. также Chari et al. (1992) Cancer Res 52: 127), DM2, DM3 (N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-1-оксопентил)майтанзин), DM4 (4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтинзин) и майтанзинол (синтетический аналог майтанзиноида). Другие примеры майтанзиноидов описаны в патенте США № 8142784, включенном в данным документ посредством ссылки.
Ансамитоцины представляют собой группу майтанзиноидных антибиотиков, которые были выделены из различных бактериальных источников. Эти соединения обладают сильной противоопухолевой активностью. Типичные примеры включают без ограничения ансамитоцин Р1, ансамитоцин Р2, ансамитоцин Р3 и ансамитоцин Р4.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к B7-H3 конъюгировано по меньшей мере с одним DM1. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 конъюгировано по меньшей мере с одним DM2. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 конъюгировано по меньшей мере с одним DM3. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 конъюгировано по меньшей мере с одним DM4.
d. Растительные алкалоиды
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним растительным алкалоидом, например таксановым алкалоидом или алкалоидом барвинка. Растительные алкалоиды представляют собой химиотерапевтические средства лечения, которые обеспечивают при получении из определенных типов растений. Алкалоиды барвинка получают из растения барвинка (catharanthus rosea), тогда как таксаны получают из коры дерева тиса тихого (taxus). Как алкалоиды барвинка, так и таксаны также известны как антимикротубулиновые средства и описаны более подробно ниже.
Таксаны
Антитела к B7-H3, описанные в данном документе, могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним таксаном. Используемый в данном документе термин "таксан" относится к классу антинеопластических средств, характеризующихся механизмом действия на микротрубочки, и имеющих структуру, которая включает структуру таксанового кольца и стереоспецифическую боковую цепь, которая необходима для цитостатической активности. Также термин "таксан" охватывает ряд известных производных, в том числе гидрофильные производные и гидрофобные производные. Производные таксана включают без ограничения производные галактозы и маннозы, описанные в международной заявке на патент № WO 99/18113; пиперазино и другие производные, описанные в WO 99/14209; производные таксана, описанные в WO 99/09021, WO 98/22451 и патенте США № 5869680; 6-тиопроизводные, описанные в WO 98/28288; сульфенамидные производные, описанные в патенте США № № 5821263; и таксоловые производные, описанные в патенте США № 5415869, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки. Таксановые соединения также ранее были описаны в патентах США № № 5641803, 5665671, 5380751, 5728687, 5415869, 5407683, 5399363, 5424073, 5157049, 5773464, 5821263, 5840929, 4814470, 5438072, 5403858, 4960790, 5433364, 4942184, 5362831, 5705503 и 5278324, все из которых в явной форме включены посредством ссылки. Другие примеры таксанов включают без ограничения доцетаксел (Taxotere; Sanofi Aventis), паклитаксел (Abraxane or Taxol; Abraxis Oncology), карбазитаксел, тезетаксел, опаксио, ларотаксел, таксопрексин, BMS-184476, hongdoushan A, hongdoushan B и hongdoushan C, а также паклитаксел в наночастицах (ABI-007/Abraxene, Abraxis Bioscience).
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой доцетаксела. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одной молекулой паклитаксела.
Алкалоиды барвинка
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 конъюгировано по меньшей мере с одним алкалоидом барвинка. Алкалоиды барвинка представляют собой класс специфических в отношении клеточного цикла лекарственных средств, которые действуют путем подавления способности раковых клеток делиться, воздействуя на тубулин и препятствуя образованию микротрубочек. Примеры алкалоидов барвинка, которые могут быть использованы в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения виндезинсульфат, винкристин, винбластин и винорелбин.
2. Противоопухолевые антибиотики
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с одним или несколькими противоопухолевыми антибиотиками для лечения рака. Используемый в данном документе термин "противоопухолевый антибиотик" означает противоопухолевое лекарственное средство, которое блокирует рост клеток путем нарушения ДНК и, которое получают из микроорганизма. Часто противоопухолевые антибиотики либо разрывают нити ДНК, либо замедляют или останавливают синтез ДНК. Примеры противоопухолевых антибиотиков, которые могут быть включены в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, включают без ограничения актиномицины (например, пирроло[2,1-c][1,4]бензодиазепины), антрациклины, калихеамицины и дуокармицины, описанные более подробно ниже.
a. Актиномицины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним актиномицином. Актиномицины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. Типичные примеры актиномицинов включают без ограничения актиномицин D (Cosmegen [также известный как актиномицин, дактиномицин, актиномицин IV, актиномицин C1], Lundbeck, Inc.), антрамицин, шикамицин A, DC-81, мазэтрамицин, неотрамицин A, неотрамицин В, поротрамицин, протракарцин В, SG2285, сибаномицин, сибиромицин и томаймицин. В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним пирролобензодиазепином (PBD). Примеры PBD включают без ограничения антрамицин, шикамицин A, DC-81, мазэтрамицин, неотрамицин A, неотрамицин B, поротрамицин, протракарцин B, SG2000 (SJG-136), SG2202 (ZC-207), SG2285 (ZC -423), сибаномицин, сибиромицин и томаймицин. Таким образом, в одном варианте осуществления антитела к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгированы по меньшей мере с одним актиномицином, например актиномицином D, или по меньшей мере с одним PBD, например димером пирролобензодиазепина (PBD).
Структуры PBD можно найти, например, в публикациях заявки на патент США №№ 2013/0028917 и 2013/0028919 и в WO 2011/130598 A1, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Ниже приводится общая структура PBD.
PBD отличаются по числу, типу и положению заместителей, как в своих ароматических A-кольцах, так и в пиррольных C-кольцах, а также по степени насыщения C-кольца. В положении N10-C11 B-кольца обычно находится имин (N=C), карбиноламин (NH-CH(OH)) или карбиноламинметиловый эфир (NH-CH(OMe)), причем это положение является электрофильным центром, ответственным за алкилирование ДНК. Все из известных природных продуктов имеют (S)-конфигурацию в хиральном положении C11α, что обеспечивает им правосторонний повтор, если смотреть со стороны C-кольца на A-кольцо. Приведенные в данном документе примеры PBD можно конъюгировать с антителами к B7-H3 по настоящему изобретению. Другие примеры PBD, которые можно конъюгировать с антителами к B7-H3 по настоящему изобретению, могут быть найдены, например, в публикациях заявки на патент США №№ 2013/0028917 A1 и 2013/0028919 A1, в патенте США № 7741319 B2 и в WO 2011/130598 A1, и WO 2006/111759 A1, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.
Типичный димер PBD, характеризующийся следующей формулой XXX, можно конъюгировать с антителами к B7-H3 по настоящему изобретению:
(XXX),
где
R30 представлен в формуле XXXI:
(XXXI),
где A представляет собой C5-7арильную группу, X представляет собой группу, конъюгированную с линкерной единицей, выбранную из группы, состоящей из -O-, -S-, -C(O)O-, -C(O)-, -NH(C=O)- и -N(RN)-, где RN выбран из группы, состоящей из H, C1-4алкила и (C2H4O)mCH3, где s равняется от 1 до 3, а также или
(i) Q1 представляет собой одинарную связь и Q2 выбран из группы, состоящей из одинарной связи и -Z-(CH2)n-, где Z выбран из группы, состоящей из одинарной связи, O, S и NH, а n равняется от 1 до 3; или
(ii) Q1 представляет собой -CH=CH- и Q2 представляет собой одинарную связь;
R130 представляет собой C5-10арильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, циано, C1-12алкокси, C3-20гетероциклоалкокси, C5-20арилокси, гетероарилокси, алкилалкокси, арилалкокси, алкиларилокси, гетероарилалкокси, алкилгетероарилокси, C1-7алкила, C3-7гетероциклила и бис-окси-C1-3алкилена;
R31 и R33 независимо выбраны из группы, состоящей из H, Rx, OH, ORx, SH, SRx, NH2, NHRx, NRxRxx′, нитро, Me3Sn и галогена;
где R и R′ независимо выбраны из группы, состоящей из необязательно замещенного C1-12алкила, C3-20гетероциклила и C5-20арильных групп;
R32 выбран из группы, состоящей из H, Rx, OH, ORx, SH, SRx, NH2, NHRx, NHRxRxx, нитро, Me3Sn и галогена;
или
(a) R34 представляет собой H, и R11 представляет собой OH, ORxA, где RxA представляет собой C1-4алкил;
(b) R34 и R35 образуют азотно-углеродную двойную связь между атомами азота и углерода, к которым они присоединяются; или
(c) R34представляет собой H и R35 представляет собой SOzM, где z равняется 2 или 3;
Rxxx представляет собой группу C3-12алкилена, цепь которой может прерываться одним или несколькими гетероатомами, выбранными из группы, состоящей из O, S, NH и ароматического кольца;
Yx и Yx′ выбраны из группы, состоящей из O, S и NH;
R31′, R32′, R33′ выбраны из таких же групп, как R31, R32 и R33 соответственно, а R34′ и R35′ являются такими же как R34 и R35, и каждый M представляет собой моновалентный фармацевтически приемлемый катион или обе M группы вместе представляют собой бивалентный фармацевтически приемлемый катион.
C1-12алкил. Используемый в данном документе термин "C1-12алкил" относится к моновалентному фрагменту, полученному посредством удаления атома водорода от атома углерода в углеводородном соединении, имеющем от 1 до 12 атомов углерода, который может быть алифатическим или алициклическим, и который может быть насыщенным или ненасыщенным (например, частично ненасыщенным, полностью ненасыщенным). Таким образом, термин "алкил" включает подклассы алкенилов, алкинилов, циклоалкилов и т. д., обсуждаемые ниже.
Примеры насыщенных алкильных групп включают без ограничения метил (C1), этил (C2), пропил (C3), бутил (C4), пентил (C5), гексил (C6) и гептил (C7).
Примеры насыщенных линейных алкильных групп включают без ограничения метил (C1), этил (C2), н-пропил (C3), н-бутил (C4), н-пентил (амил) (C5), н-гексил (C6) и н-гептил (C7).
Примеры насыщенных разветвленных алкильных групп включают без ограничения изопропил (C3), изобутил (C4), втор-бутил (C4), трет-бутил (C4), изопентил (C5) и неопентил (C5).
C3-20гетероциклил. Используемый в данном документе термин "C3-20гетероциклил" относится к моновалентному фрагменту, полученному посредством удаления атома водорода от атомов в кольце гетероциклического соединения, причем этот фрагмент имеет от 3 до 20 атомов в кольце, из которых от 1 до 10 являются гетероатомами в кольце. Предпочтительно каждое кольцо имеет от 3 до 7 атомов в кольце, из которых от 1 до 4 являются гетероатомами в кольце.
В данном контексте префиксы (например, C3-20, C3-7, C5-6 и т. д.) обозначают количество атомов в кольце или диапазон числа атомов в кольце, будь то атомы углерода или гетероатомы. Например, термин "C5-6гетероциклил", используемый в данном документе, относится к гетероциклильной группе, содержащей 5 или 6 атомов в кольце.
Примеры моноциклических гетероциклильных групп включают без ограничения полученные из
N1: азиридин (C3), азетидин (C4), пирролидин (тетрагидропиррол) (C5), пирролин (например, 3-пирролин, 2,5-дигидропиррол) (C5), 2H-пиррол или 3H-пиррол (изопиррол, изоазол) (C5), пиперидин (C6), дигидропиридин (C6), тетрагидропиридин (C6), азепин (C7); O1: оксиран (C3), оксетан (C4), оксолан (тетрагидрофуран) (C5), оксол (дигидрофуран) (C5), оксан (тетрагидропиран) (C6), дигидропиран (C6), пиран (C6), оксепин (C7); S1: тииран (C3), тиэтан (C4), тиолан (тетрагидротиофен) (C5), тиан (тетрагидротиопиран) (C6), тиэпан (C7); O2: диоксолан (C5), диоксан (C6) и диоксепан (C7); O3: триоксан (C6); N2: имидазолин (C5), пиразолидин (диазолидин) (C5), имидазолин (C5), пиразолин (дигидропиразол) (C5), пиперазин (C6); N1O1: тетрагидрооксазол (C5), дигидрооксазол (C5), тетрагидроизоксазол (C5), дигидроизоксазол (C5), морфолин (C6), тетрагидрооксазин (C6), дигидрооксазин (C6), оксазин (C6); N1S1: тиазолин (C5), тиазолидин (C5), тиоморфолин (C6); N2O1: оксадиазин (C6); O1S1: оксатиол (C5) и оксатиан (тиоксан) (C6); а также N1O1S1: оксатиазин (C6).
Примеры замещенных моноциклических гетероциклильных групп включают те, которые получены из сахаридов, в циклической форме, например фуранозы (C5), такие как арабинофураноза, ликсофураноза, рибофураноза и ксилофураноза, и пиранозы (C6), такие как аллопираноза, альтропираноза, глюкопираноза, маннопираноза, гулопираноза, идопираноза, галактопираноза и талопираноза.
C5-20арил. Используемый в данном документе термин "C5-20арил" относится к моновалентному фрагменту, полученному посредством удаления атома водорода от атомов в ароматическом кольце ароматического соединения, причем этот фрагмент имеет от 3 до 20 атомов в кольце. Предпочтительно каждое кольцо имеет от 5 до 7 атомов в кольце.
В данном контексте префиксы (например, C3-20, C5-7, C5-6 и т. д.) обозначают количество атомов в кольце или диапазон числа атомов в кольце, будь то атомы углерода или гетероатомы. Например, термин "C5-6арил", используемый в данном документе, относится к арильной группе, содержащей 5 или 6 атомов в кольце.
В одном варианте осуществления антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать с димером PBD, характеризующимся следующей формулой XXXIa:
(XXXIa),
где указанная выше структура описывает димер PBD SG2202 (ZC-207) и конъюгирована с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению посредством линкера L. SG2202 (ZC-207) раскрыт, например, в публикации заявки на патент США № 2007/0173497, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В другом варианте осуществления димер PBD, SGD-1882, конъюгирован с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению посредством линкера лекарственного средства, как показано на фигуре 4. SGD-1882 раскрыт в Sutherland et al. (2013) Blood 122(8):1455 и в публикации заявки на патент США № 2013/0028919, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Как описано на фигуре 4, димер PBD SGD-1882 можно конъюгировать с антителом посредством линкера mc-val-ala-дипептида (в совокупности обозначенный как SGD-1910 на фигуре 4). В определенном варианте осуществления антитело к B7-H3, как описано в данном документе, конъюгировано с димером PBD, описанным на фигуре 4. Таким образом, в дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, как описано в данном документе, конъюгированное с димером PBD посредством линкера mc-val-ala-дипептида, как описано на фигуре 4. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 35, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 34 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 39, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 38 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 37, конъюгированное с PBD, в том числе без ограничения димером PBD, показанным на фигуре 4. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 140 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 136, конъюгированное с PBD, в том числе без ограничения димером PBD, показанным на фигуре 4. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 140 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 15, домен CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 7 и домен CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 138, конъюгированное с PBD, в том числе без ограничения димером PBD, показанным на фигуре 4. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело к B7-H3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи huAb13v1, как определено аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 147 или huAb3v2.5, или huAb3v2.6, как определено аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 139, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 144, 135 или 137, в соответствии с huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, соответственно, где антитело конъюгируют с PBD, таким как без ограничения иллюстративный димер PBD, показанный на фигуре 4.
b. Антрациклины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним антрациклином. Антрациклины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. Типичные примеры включают без ограничения даунорубицин (Cerubidine, Bedford Laboratories), доксорубицин (Adriamycin, Bedford Laboratories; также называемый гидрохлоридом доксорубицина, дигидроксидаунорубицин и Rubex), эпирубицин (Ellence, Pfizer) и идарубицин (Idamycin; Pfizer Inc.). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним антрациклином, например, доксорубицином.
c. Калихеамицины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним калихеамицином. Калихеамицины представляют собой семейство энедеииновых антибиотиков, полученных из организма почвы Micromonospora echinospora. Калихеамицинысвязываются с малой бороздой ДНК и вызывают двухнитевые разрывы ДНК, приводя в результате к гибели клеток с эффективностью в 100 раз выше по сравнению с другими химиотерапевтическими средствами (Damle et al. (2003) Curr Opin Pharmacol 3:386). Получение калихеамицинов, которые можно использовать в качестве конъюгатов лекарственных средств по настоящему изобретению, описано в патентах США №№ 5712374; 5714586; 5739116; 5767285; 5770701; 5770710; 5773001 и 5877296. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают без ограничения γ1I, α2I, α3I, N-ацетил-γ1I, PSAG и θI1 (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) и вышеупомянутые патенты США№№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним калихеамицином.
d. Дуокармицины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним дуокармицином. Дуокармицины представляют собой подкласс противоопухолевых антибиотиков, выделенных из бактерий рода Streptomyces. (см. Nagamura and Saito (1998) Chemistry of Heterocyclic Compounds, Vol. 34, No. 12). Дуокармицины связываются с малой бороздой ДНК и алкилируют адениновое нуклеиновое основание в положении N3 (Boger (1993) Pure and Appl Chem 65(6):1123; and Boger and Johnson (1995) PNAS USA 92:3642). Синтетические аналоги дуокармицинов включают без ограничения адозелезин, бизелезин и карцелезин. Таким образом, в одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одним дуокармицином.
e. Другие противоопухолевые антибиотики
В дополнение к вышесказанному, дополнительные противоопухолевые антибиотики, которые можно использовать в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, включают блеомицин (Blenoxane, Bristol-Myers Squibb), митомицин и пликамицин (также известный как митрамицин).
3. Иммуномодулирующие средства
В одном аспекте антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним иммуномодулирующим средством. Используемый в данном документе термин "иммуномодулирующее средство" относится к средству, которое может стимулировать или модифицировать иммунный ответ. В одном варианте осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой иммуностимулятор, который усиливает иммунный ответ субъекта. В другом варианте осуществления иммуномодулирующее средство представляет собой иммунодепрессант, который ослабляет иммунный ответ субъекта. Иммуномодулирующее средство может модулировать миелоидные клетки (моноциты, макрофаги, дендритные клетки, мегакариоциты и гранулоциты) или лимфоидные клетки (Т-клетки, В-клетки и клетки-естественные киллеры (NK)) и их любую другую дифференцированную клетку. Типичные примеры включают без ограничения бациллу Кальметта-Герена (BCG) и левамизол (Эргамизол). Другие примеры иммуномодулирующих средств, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения противораковые вакцины, цитокины и иммуномодулирующую генную терапию.
a. Противораковые вакцины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с противораковой вакциной. Используемый в данном документе термин "противораковая вакцина" относится к композиции (например, опухолевому антигену и цитокину), который вызывает опухолеспецифичный иммунный ответ. Ответ возникает благодаря собственной иммунной системе субъекта при введении противоопухолевой вакцины или, в случае по настоящему изобретению, при введении ADC, содержащего антитело к В7-Н3 и противораковую вакцину. В предпочтительных вариантах осуществления иммунный ответ приводит в результате к уничтожению опухолевых клеток в организме (например, первичных или метастатических опухолевых клеток). Применение противораковых вакцин обычно включает введение определенного антигена или группы антигенов, которые, например, присутствуют на поверхности в конкретной раковой клетки или присутствуют на поверхности конкретного инфекционного агента, которые, как было показано, содействуют возникновению рака. В некоторых вариантах осуществления применение противораковых вакцин предназначено для профилактических целей, в то время как в других вариантах осуществления применение предназначено для терапевтических целей. Неограничивающие примеры противоопухолевых вакцин, которые можно использовать в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, включают рекомбинантную бивалентную вакцину против вируса папилломы человека (HPV) типов 16 и 18 (Cervarix, GlaxoSmithKline), рекомбинантную четырехвалентную вакцину против вируса папилломы человека (HPV) типов 6, 11, 16 и 18 (Gardasil, Merck & Company) и сипулейцел-Т (Provenge, Dendreon). Таким образом, в одном варианте осуществления антитело к B7-H3 по настоящему изобретению конъюгировано по меньшей мере с одной противораковой вакциной, которая является либо иммуностимулятором, либо иммунодепрессантом.
b. Цитокины
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним цитокином. Термин "цитокин" как правило относится к белкам, высвобождаемым одной популяцией клеток, которые действуют на другую клетку как межклеточные медиаторы. Цитокины непосредственно стимулируют иммунные эффекторные клетки и стромальные клетки в месте локализации опухоли и усиливают распознавание опухолевых клеток цитотоксическими эффекторными клетками (Lee and Margolin (2011) Cancers 3:3856). Многочисленные исследования опухолей на животных моделях продемонстрировали, что цитокины обладают широким спектром противоопухолевой активности, и это было использовано в ряде подходов терапии рака на основе цитокинов (Lee and Margoli, выше). В последние годы ряд цитокинов, в том числе GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-21, входят в клинические испытания для пациентов с раком на поздней стадии (Lee and Margoli, выше).
Примеры цитокинов, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропный гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); фактор роста печени; фактор роста фибробластов; пролактин; плацентарный лактоген; фактор некроза опухоли; мюллеров ингибирующий фактор; пептид, связанный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТРО); факторы роста нервов, такие как NGF; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF); инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (ЕРО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон α, β и γ, колониестимулирующие факторы (CSF); гранулоцитарно-макрофагальный-С-SF (GM-CSF) и гранулоцитарно-CSF (G-CSF); интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; фактор некроза опухоли и другие полипептидные факторы, в том числе LIF и kit-лиганд (KL). Используемый в данном документе термин цитокин включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает ADC, содержащий антитело к В7-Н3, описанное в данном документе, и цитокин.
c. Колониестимулирующие факторы (CSF)
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним колониестимулирующим фактором (CSF). Колониестимулирующие факторы (CSF), представляют собой факторы роста, которые способствуют выработке лейкоцитов в костном мозге. Некоторые виды лечения рака (например, химиотерапия) могут влиять на лейкоциты (которые помогают бороться с инфекцией); в связи с этим можно вводить колониестимулирующие факторы для обеспечения поддержки уровней лейкоцитов и укрепления иммунной системы. Колониестимулирующие факторы также можно использовать после трансплантации костного мозга, чтобы помочь новому костному мозгу начать вырабатывать лейкоциты. Типичные примеры CSF, которые можно использовать в ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению, включают без ограничения эритропоэтин (Epoetin), филграстим (Neopogen (также известный как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), Amgen, Inc.), сарграмостим (leukine (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и GM-CSF), Genzyme Corporation), промегапоэтин и опрелвекин (рекомбинантный IL-11, Pfizer, Inc.). Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает ADC, содержащий антитело к В7-Н3, описанное в данном документе, и CSF.
4. Генная терапия
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению может быть конъюгировано по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой (прямо или опосредованно посредством носителя) для генной терапии. Генная терапия обычно относится к введению генетического материала в клетку, где генетический материал предназначен для лечения заболевания. Поскольку это относится к иммуномодулирующим средствам, генную терапию используют для стимуляции естественной способности субъекта подавлять пролиферацию раковых клеток или уничтожать раковые клетки. В одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный терапевтический ген, который используется для замены подвергнутого мутации или иным образом нарушенного (например, усеченного) гена, ассоциированного с раком. В других вариантах осуществления ADC с антителом к B7-H3 по настоящему изобретению содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует или иным образом обеспечивает получение терапевтического белка для лечения рака. Нуклеиновую кислоту, которая кодирует терапевтический ген, можно непосредственно конъюгировать с антителом к B7-H3 или, альтернативно, можно конъюгировать с антителом к B7-H3 посредством носителя. Примеры носителей, которые можно использовать для доставки нуклеиновой кислоты для генной терапии, включают без ограничения вирусные векторы или липосомы.
5. Алкилирующие средства
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с одним или несколькими алкилирующими средствами. Алкилирующие средства представляют собой класс противоопухолевых соединений, которые присоединяют алкильную группу к ДНК. Примеры алкилирующих средств, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения алкилсульфонаты, этиленимины, производные метиламина, эпоксиды, азотистые иприты, нитрозомочевины, триазины и гидразины.
a. Алкилсульфонаты
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним алкилсульфонатом. Алкилсульфонаты представляют собой подкласс алкилирующих средств общей формулы: R-SO2-O-R1, где R и R1 представляют собой типичные алкильные или арильные группы. Типичные примеры алкилсульфонатов включают без ограничения бусульфан (Myleran, GlaxoSmithKline; Busulfex IV, PDL BioPharma, Inc.).
b. Азотистые иприты
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним азотистым ипритом. Типичные примеры этого подкласса противоопухолевых соединений включают без ограничения хлорамбуцил (Leukeran, GlaxoSmithKline), циклофосфамид (Cytoxan, Bristol-Myers Squibb; Neosar, Pfizer, Inc.), эстрамустин (эстрамустина фосфат натрия или Estracyt), Pfizer, Inc.), ифосфамид (Ifex, Bristol-Myers Squibb), мехлорэтамин (Mustargen, Lundbeck Inc.) и мелфалан (Alkeran или L-Pam или фенилаланиновый иприт; GlaxoSmithKline).
c. Нитрозомочевины
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одной нитрозомочевиной. Нитрозомочевины представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые являются растворимыми в липидах. Типичные примеры включают без ограничения кармустин (BCNU [также известный как BiCNU, N,N-бис (2-хлорэтил)-N-нитрозомочевина или 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина], Bristol-Myers Squibb), фотемустин (также известный как Muphoran), ломустин (CCNU или 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина, Bristol-Myers Squibb), нимустин (также известный как ACNU) и стрептозоцин (Zanosar, Teva Pharmaceuticals).
d. Триазины и гидразины
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним триазином или гидразином. Триазины и гидразины представляют собой подкласс азотсодержащих алкилирующих средств. В некоторых вариантах осуществления данные соединения самопроизвольно разлагаются или могут быть метаболизированы с получением промежуточных продуктов алкилдиазония, которые облегчают перенос алкильной группы в нуклеиновые кислоты, пептиды и/или полипептиды, за счет чего обеспечиваются мутагенные, канцерогенные или цитотоксические эффекты. Типичные примеры включают без ограничения дакарбазин (DTIC-Dome, Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc.), прокарбазин (Mutalane, Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc.) и темозоломид (Temodar, Schering Plough).
e. Другие алкилирующие средства
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним этиленимином, производным метиламина или эпоксидом. Этиленимины представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые обычно содержат по меньшей мере одно азиридиновое кольцо. Эпоксиды представляют собой подкласс алкилирующих средств, которые характеризуются как циклические простые эфиры только с тремя атомами в кольце.
Типичные примеры этилениминов включают без ограничения тиопета (Thioplex, Amgen), диазикон (также известный как азиридинилбензохинон (AZQ)) и митомицин С. Митомицин С представляет собой природный продукт, который содержит азиридиновое кольцо и, по-видимому, вызывает цитотоксичность посредством сшивки ДНК (Dorr RT, et al. Cancer Res. 1985;45:3510; Kennedy KA, et al Cancer Res. 1985;45:3541). Типичными примерами производных метиламина и их аналогов являются без ограничения альтретамин (Hexalen, MGI Pharma, Inc.), который также известен как гексаметиламин и гексастат. Типичные примеры эпоксидов этого класса противораковых соединений включают без ограничения диангидрогалактит. Диангидрогалактит (1,2:5,6-диангидродульцит) химически родственный азиридинам и, как правило, облегчает перенос алкильной группы с помощью аналогичного механизма, как описано выше. Дибромдульцит гидролизуют до диангидрогалактита и, таким образом, он представляет собой пролекарство для эпоксида (Sellei C, et al. Cancer Chemother Rep. 1969;53:377).
6. Антиангиогенные средства
В одном аспекте антитела к B7-H3, описанные в данном документе, конъюгируют по меньшей мере с одним антиангиогенным средством. Антиангиогенные средства подавляют рост новых кровеносных сосудов. Антиангиогенные средства оказывают свое действие различными способами. В некоторых вариантах осуществления такие средства препятствуют способности фактора роста достичь своей цели. Например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является одним из первичных белков, участвующих в инициировании ангиогенеза путем связывания с конкретными рецепторами на поверхности клеток. Таким образом, некоторые антиангиогенные средства, которые препятствуют взаимодействию VEGF с его родственным рецептором, не позволяют VEGF инициировать ангиогенез. В других вариантах осуществления такие средства препятствуют внутриклеточным сигнальным каскадам. Например, в случае инициирования конкретного рецептора на поверхности клетки, инициируется каскад других химических сигналов, чтобы способствовать росту кровеносных сосудов. Таким образом, некоторые ферменты, например, некоторые тирозинкиназы, которые, как известно, принимают участие во внутриклеточных сигнальных каскадах, которые способствуют, например, пролиферации клеток, являются мишенями при лечении рака. В других вариантах осуществления такие средства препятствуют внутриклеточным сигнальным каскадам. В еще других вариантах осуществления такие средства блокируют конкретные мишени, которые активируют и способствуют росту клеток, или непосредственно препятствуют росту клеток кровеносных сосудов. Свойства подавления ангиогенеза были обнаружены в более чем 300 веществах с многочисленными прямыми и непрямыми подавляющими эффектами.
Типичные примеры антиангиогенных средств, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения ангиостатин, ABX EGF, C1-1033, PKI-166, EGF-вакцину, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225 (Erbitux, ZD1839 (Iressa), OSI-774, эрлотиниб (tarceva), ангиостатин, аррестин, эндостатин, BAY 12-9566 и фторурацил или доксорубицин, канстатин, карбоксиамидотриозол и с паклитакселом, EMD121974, S-24, витаксин, диметилксантенон уксусная кислота, IM862, интерлейкин-12, интерлейкин-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, ангиозим (рибозим), IMC-1C11, Neovastat, маримстат, приномастат, BMS -275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, с паклитакселом, с гемцитабином и цисплатином, с иринотеканом и цисплатином и с облучением, текогалан, темозоломид и PEG-интерферон α2b, тетратиомолибдат, TNP-470, талидомид, CC-5013 и с таксотером, тумстатин, 2-метоксиэстрадиол, ловушка VEGF, ингибиторы mTOR (дефоролимус, эверолимус (Afinitor, Novartis Pharmaceutical Corporation) и темзиролимус (Torisel, Pfizer, Inc.)), ингибиторы киназ (например, эрлотиниб (Tarceva, Genentech, Inc.), иматиниб (Gleevec, Novartis Pharmaceutical Corporation), гефитиниб (Iressa, AstraZeneca Pharmaceuticals), дазатиниб (Sprycel, Brystol-Myers Squibb), сунитиниб (Sutent, Pfizer, Inc.), нилотиниб (Tasigna, Novartis Pharmaceutical Corporation), лапатиниб (Tykerb, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals), сорафениб (Nexavar, Bayer и Onyx), фосфоинозитид 3-киназы (PI3K), озимертиниб, кобиметиниб, траметиниб, дабрафениб, динациклиб).
7. Антиметаболиты
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним антиметаболитом. Антиметаболиты представляют собой виды химиотерапевтических средств лечения, которые очень схожи с нормальными веществами внутри клетки. При включении антиметаболита в клеточный метаболизм, результат для клетки является отрицательным, например, клетка оказывается неспособной к делению. Антиметаболиты классифицируют в соответствии с веществами, действию которых они препятствуют. Примеры антиметаболитов, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения антагонист фолиевой кислоты (например, метотрексат), антагонист пиримидина (например, 5-фторурацил, флоксуридин, цитарабин, капецитабин и гемцитабин), антагонист пурина (например, 6-меркаптопурин и 6-тиогуанин) и ингибитор аденозиндезаминазы (например, кладрибин, флударабин, неларабин и пентостатин), более подробно описанные ниже.
a. Антифолаты
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним антифолатом. Антифолаты представляют собой подкласс антиметаболитов, структурно сходных с фолатом. Типичные примеры включают без ограничения метотрексат, 4-аминофолиевую кислоту (также известную как аминоптерин и 4-аминоптеровая кислота), лометрексол (LMTX), пеметрексед (Alimpta, Eli Lilly and Company) и триметрексат (Neutrexin, Ben Venue Laboratories, Inc.)
b. Антагонисты пурина
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним антагонистом пурина. Аналоги пурина являются подклассом антиметаболитов, которые структурно схожи с группой соединений, известных как пурины. Типичные примеры антагонистов пурина включают без ограничения азатиоприн (Azasan, Salix; Imuran, GlaxoSmithKline), кладрибин (Leustatin [также известный как 2-CdA], Janssen Biotech, Inc.), меркаптопурин (Purinethol [также известный как 6-меркаптоэтанол], GlaxoSmithKline), флударабин (Fludara, Genzyme Corporation), пентостатин (Nipent, также известный как 2'-дезоксикоформицин (DCF)), 6-тиогуанин (Lanvis [также известный как тиогуанин], GlaxoSmithKline).
c. Антагонисты пиримидина
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним антагонистом пиримидина. Аналоги пиримидина являются подклассом антиметаболитов, которые структурно схожи с группой соединений, известных как пурины. Типичные примеры антагонистов пиримидина включают без ограничения азацитидин (Vidaza, Celgene Corporation), капецитабин (Xeloda, Roche Laboratories), цитарабин (также известный как цитозин-арабинозид и арабинозилцитозин, Bedford Laboratories), децитабин (Dacogen, Eisai Pharmaceuticals), 5-фторурацил (Adrucil, Teva Pharmaceuticals, Efudex, Valeant Pharmaceuticals, Inc), 5-фтор-2'-дезоксиуридин 5'-фосфат (FdUMP), 5-фторудинтрифосфат и гемцитабин (Gemzar, Eli Lilly and Company).
8. Борсодержащие средства
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним борсодержащим средством. Борсодержащие средства включают класс терапевтических соединений для лечения рака, которые препятствуют пролиферации клеток. Типичные примеры борсодержащих средств включают без ограничения борофицин и бортезомиб (Velcade, Millenium Pharmaceuticals).
9. Хемопротекторные средства
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним хемопротекторным средством. Хемопротекторные лекарственные средства представляют собой класс соединений, которые способствовать защите организма от специфических токсических эффектов химиотерапии. Хемопротекторные средства можно вводить с различными видами химиотерапии для защиты здоровых клеток от токсических эффектов химиотерапевтических лекарственных средств, одновременно обеспечивая лечение раковых клеток с помощью вводимого химиотерапевтического средства. Типичные хемопротекторные средства включаю без ограничения амифостин (Ethyol, Medimmune, Inc.), который используют для снижения нефротоксичности, связанной с накопленными дозами цисплатина, дексразоксана (Totect, Apricus Pharma, Zinecard) для лечения кровоизлияния, вызванного введением антрациклина (Totect) и для лечения осложнений, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, вызванных введением противоопухолевого антибиотика доксорубицина (Zinecard) и месны (Mesnex, Bristol-Myers Squibb), который используют для предотвращения геморрагического цистита в ходе химиотерапевтического лечения с использованием ифосфамида.
10. Гормональные средства
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним гормональным средством. Гормональное средство (в том числе синтетические гормоны) представляет собой соединение, которое препятствует выработке или активности эндогенно вырабатываемых гормонов эндокринной системы. В некоторых вариантах осуществления такие соединения препятствуют росту клеток или производят цитотоксический эффект. Неограничивающие примеры включают андрогены, эстрогены, медроксипрогестерона ацетат (Provera, Pfizer, Inc.) и прогестины.
11. Антигормональные средства
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним антигормональным средством. "Антигормональным" средством является средство, которое подавляет выработку и/или предотвращает функцию некоторых эндогенных гормонов. В одном варианте осуществления антигормональное средство препятствует активности гормона, выбранного из группы, состоящей из андрогенов, эстрогенов, прогестерона и гонадотропин-высвобождающего гормона, за счет чего обеспечивается препятствие росту различных раковых клеток. Типичные примеры антигормональных средств включают без ограничения аминоглютетимид, анастрозол (Arimidex, AstraZeneca Pharmaceuticals), бикалютамид (Casodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), ципротерон ацетат (Cyprostat, Bayer PLC), дегареликс (Firmagon, Ferring Pharmaceuticals), эксеместан (Aromasin, Pfizer Inc.), флутамид (Drogenil, Schering-Plough Ltd), фулвестрант (Faslodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), госерелин (Zolodex, AstraZeneca Pharmaceuticals), летрозол (Femara, Novartis Pharmaceuticals Corporation), лейпролид (Prostap), люпрон, медроксипрогестерон ацетат (Provera, Pfizer Inc.), мегестрол ацетат (Megace, Bristol-Myers Squibb Company), тамоксифен (Nolvadex, AstraZeneca Pharmaceuticals) и трипторелин (Decapetyl, Ferring).
12. Кортикостероиды
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним кортикостероидом. Кортикостероиды можно использовать в ADC по настоящему изобретению для уменьшения воспаления. Пример кортикостероида включает без ограничения глюкокортикоид, например, преднизон (Deltasone, Pharmacia & Upjohn Company, подразделение Pfizer, Inc.).
13. Фотоактивные терапевтические средства
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним фотоактивным терапевтическим средством. Фотоактивные терапевтические средства включают соединения, которые можно использовать для уничтожения обработанных клеток при воздействии электромагнитного излучения определенной длины волны. Терапевтически релевантные соединения поглощают электромагнитное излучение на длинах волн, которые проникают в ткань. В предпочтительных вариантах осуществления соединение вводят в нетоксичной форме, которая способна обеспечивать фотохимический эффект, который является токсичным для клеток или ткани при достаточной активации. В других предпочтительных вариантах осуществления эти соединения удерживаются в раковой ткани и легко очищаются из нормальных тканей. Неограничивающие примеры включают различные хромагены и красители.
14. Олигонуклеотиды
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним олигонуклеотидом. Олигонуклеотиды получают из коротких цепей нуклеиновых кислот, принцип работы которых заключается в предотвращении процессинга генетической информации. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды для применения в ADC представляют собой немодифицированные однонитевые и/или двухнитевые молекулы ДНК или РНК, тогда как в других вариантах осуществления эти терапевтические олигонуклеотиды представляют собой химически модифицированные однонитевые и/или двухнитевые молекулы ДНК или РНК. В одном варианте осуществления, олигонуклеотиды используемые в ADC, являются относительно короткими (19-25 нуклеотидов) и гибридизуются с уникальной последовательностью нуклеиновой кислоты в общем пуле нуклеиновых кислот-мишеней, присутствующих в клетках. Некоторые из важных олигонуклеотидных технологий включают антисмысловые олигонуклеотиды (включая РНК-интерференцию (RNAi)), аптамеры, олигонуклеотиды CpG и рибозимы.
a. Антисмысловые олигонуклеотиды
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом. Антисмысловые олигонуклеотиды разработаны для связывания с РНК посредством гибридизации Уотсона-Крика. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид является комплементарным нуклеотиду, кодирующему область, домен, часть или сегмент B7-H3. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит от приблизительно 5 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 10 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 12 до приблизительно 35 нуклеотидов, от приблизительно 18 до приблизительно 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид является на по меньшей мере 50%, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98%, на по меньшей мере 99% или на по меньшей мере 100% гомологичным области, части, домену или сегменту гена B7-H3. В некоторых вариантах осуществления существует значительная гомология последовательности по меньшей мере в 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или 100 последовательных нуклеотидах гена B7-H3. В предпочтительных вариантах осуществления размер таких антисмысловых олигонуклеотидов составляет от 12 до 25 нуклеотидов в длину, причем большинство антисмысловых олигонуклеотидов составляет от 18 до 21 нуклеотида в длину. Существует множество механизмов, которые могут быть использованы для подавления функции РНК после связывания олигонуклеотида с целевой РНК (Crooke ST. (1999). Biochim. Biophys. Acta, 1489, 30-42). В наиболее полно охарактеризованном антисмысловом механизме происходит расщепление целевой РНК эндогенными клеточными нуклеазами, такими как РНКаза Н или нуклеаза, связанная с механизмом интерференции РНК. Однако олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию целевого гена посредством некаталитических механизмов, таких как модуляция сплайсинга или остановки переноса, также могут быть мощными и селективными модуляторами функции гена.
Другим независимым от РНКазы антисмысловым механизмом, который недавно получил большое внимание, является RNAi (Fire et al. (1998). Nature, 391, 806-811.; Zamore PD. (2002). Science, 296, 1265-1269.). РНК-интерференция (RNAi) представляет собой посттранскрипционный процесс, где двухцепочечная РНК ингибирует экспрессию гена специфическим в отношении последовательности образом. В некоторых вариантах осуществления эффект RNAi достигается за счет введения относительно длинной двухнитевой РНК (dsRNA), в то время как в предпочтительных вариантах осуществления этот эффект RNAi достигается за счет введения более коротких двухнитевых РНК, например, малой интерферирующей РНК (siRNA) и/или микроРНК (miRNA). В еще одном варианте осуществления RNAi также может быть достигнута путем введения плазмиды, которая образует dsRNA, комплементарную целевому гену. В каждом из вышеприведенных вариантов осуществления двухнитевая РНК предназначена для препятствования генной экспрессии конкретной целевой последовательности в клетках. Как правило, этот механизм включает превращение dsRNA в короткие РНК, которые направляют рибонуклеазы к гомологичным целевым mRNA (обобщенно, Ruvkun, Science 2294:797 (2001)), которые затем разрушают соответствующую эндогенную mRNA, тем самым приводя к модуляции генной экспрессии. Примечательно, что dsRNA, как сообщается, обладает антипролиферативными свойствами, что позволяет также предусмотреть терапевтическое применение (Aubel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:906 (1991)). Например, синтетическая dsRNA, которая, как было показано, подавляет рост опухоли у мышей (Levy et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62:357-361 (1969)), является активной при лечении лейкемии у мышей (Zeleznick et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 130:126-128 (1969)), а также подавляет химически-индуцированное образование опухолей кожи у мышей (Gelboin et al., Science 167:205-207 (1970)). Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение антисмысловых олигонуклеотидов в ADC для лечения рака молочной железы. В других вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает композиции и способы инициирования лечения с помощью антисмыслового олигонуклеотида, где dsRNA препятствует экспрессии B7-H3 в целевых клетках на уровне mRNA. dsRNA, описанная выше, относится к встречающейся в природе РНК, частично очищенной РНК, рекомбинантно продуцируемой РНК, синтетической РНК, а также к измененной РНК, которая отличается от встречающейся в природе РНК за счет включения нестандартных нуклеотидов, материалу, отличному от нуклеотидного, нуклеотидным аналогам (например, запертой нуклеиновой кислоте (LNA)), дезоксирибонуклеотидам и любой их комбинации. РНК согласно настоящему изобретению должна быть достаточно схожей с природной РНК, для того, чтоб обладать способностью опосредовать описанную в данном документе модуляцию на основе антисмысловых олигонуклеотидов.
b. Аптамеры
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним аптамером. Аптамер представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая выбрана из случайных пулов на основе ее способности связывать другие молекулы. Подобно антителам, аптамеры могут связывать целевые молекулы с чрезвычайной аффинностью и специфичностью. Во многих вариантах осуществления аптамеры принимают сложные, зависящие от последовательности трехмерные формы, которые позволяют им взаимодействовать с целевым белком, что приводит в результате к образованию плотно связанного комплекса, аналогичного взаимодействию антитело-антиген, тем самым препятствуя функции указанного белка. Конкретная способность аптамеров связываться плотно и специфически с их целевым белком указывает на их потенциал в качестве видов целевой молекулярной терапии.
c. Олигонуклеотиды CpG
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним олигонуклеотидом CpG. Известно, что бактериальная и вирусная ДНК являются сильными активаторами как врожденного, так и специфического иммунитета у людей. Такие иммунологические характеристики связаны с неметилированными мотивами CpG-динуклеотида, обнаруженными в бактериальной ДНК. В связи с тем, что у людей такие мотивы встречаются редко, иммунная система человека развила способность распознавать эти мотивы как ранний признак инфекции и впоследствии инициировать иммунные реакции. Поэтому олигонуклеотиды, содержащие такой мотив CpG, можно применять для инициирования противоопухолевого иммунного ответа.
d. Рибозимы
Антитело к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним рибозимом. Рибозимы представляют собой каталитические молекулы РНК в диапазоне от приблизительно от 40 до 155 нуклеотидов в длину. Способность рибозимов распознавать и разрезать определенные молекулы РНК делает их потенциальными кандидатами для терапии. Типичный пример включает ангиозим.
15. Радионуклидные средства (радиоактивные изотопы)
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению можно конъюгировать по меньшей мере с одним радионуклидным средством. Радионуклидные средства включают средства, которые характеризуются нестабильным ядром, которое способно подвергаться радиоактивному распаду. Основа успешного лечения радионуклидами зависит от достаточной концентрации и длительного удерживания радионуклида раковой клеткой. Другие факторы, которые следует учитывать, включают период полужизни радионуклидов, энергию излучаемых частиц и максимальный диапазон, в течение которого излучаемая частица может перемещаться. В предпочтительных вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой радионуклид, выбранный из группы, состоящей из 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, I25I, I31I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au и 211Pb. Также предпочтительными являются радионуклиды, которые по существу распадаются с оже-излучаемыми частицами. Например, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111 1, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m и Ir-192. Энергии распада пригодных излучающих бета-частицы нуклидов предпочтительно представляют собой Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-21 1, Ac-225, Fr-221, At -217, Bi-213 и Fm-255. Энергии распада пригодных радионуклидов, излучающих альфа-частицы, составляют предпочтительно 2000-10 000 кэВ, более предпочтительно 3000-8000 кэВ и наиболее предпочтительно 4000-7000 кэВ. Дополнительные потенциальные для применения радиоизотопы включают 11C, 13N, 150, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, I03Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe,122mTe, 125mTe, 165Tm, I67Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb и подобные.
16. Радиосенсибилизаторы
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним радиосенсибилизатором. Используемый в данном документе термин "радиосенсибилизатор" определяется как молекула, предпочтительно молекула с низкой молекулярной массой, вводимая животным в терапевтически эффективных количествах для повышения чувствительности клеток, подлежащих радиосенсибилизации, к электромагнитному излучению, и/или для содействия лечению заболеваний, поддающихся лечению электромагнитным излучением. Радиосенсибилизаторы представляют собой средства, которые делают раковые клетки более чувствительными к лучевой терапии, хотя обычно гораздо меньше влияют на нормальные клетки. Таким образом, радиосенсибилизатор можно использовать в комбинации с радиоактивно меченым антителом или ADC. Добавление радиосенсибилизатора может привести в результате к повышению эффективности по сравнению с лечением посредством только радиоактивно меченого антитела или фрагмента антитела. Радиосенсибилизаторы описаны в D. M. Goldberg (ed.), Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, CRC Press (1995). Примеры радиосенсибилизаторов включают гемцитабин, 5-фторурацил, таксан и цисплатин.
Радиосенсибилизаторы могут быть активированы электромагнитным излучением рентгеновских лучей. Типичными примерами активированных рентгеновскими лучами радиосенсибилизаторов являются без ограничения следующие: метронидазол, мизонидазол, дезметилмизонидазол, пимонидазол, этанидазол, ниморазол, митомицин С, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (BUdR), 5-йоддезоксиуридин (IUdR), бромдезоксицитидин, фтордезоксиуридин (FUdR), гидроксимочевина, цисплатин и терапевтически эффективные аналоги и их производные. Альтернативно, радиосенсибилизаторы можно активировать с использованием фотодинамической терапии (PDT). Типичные примеры фотодинамических радиосенсибилизаторов включают без ограничения производные гематопорфирина, фотофрин (r), производные бензопорфирина, NPe6, олово-этиопорфирин (SnET2), феоборбид a, бактериохлорофилл a, нафталоцианины, фталоцианины, фталоцианин цинка и их терапевтически эффективные аналоги и производные.
16. Ингибиторы топоизомеразы
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним ингибитором топоизомеразы. Ингибиторы топоизомеразы представляют собой химиотерапевтические средства, предназначенные для нарушения действия ферментов топоизомераз (топоизомераза I и II), которые являются ферментами, контролирующими изменения в структуре ДНК путем катализа разрушения и восстановления фосфодиэфирного остова нитей ДНК в ходе нормального клеточного цикла. Типичные примеры ингибиторов ДНК-топоизомеразы I включают без ограничения камптотецины и их производные, иринотекан (CPT-11, Camptosar, Pfizer, Inc.) и топотекан (Hycamtin, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals). Типичные примеры ингибиторов ДНК-топоизомеразы II включают без ограничения амсакрин, даунорубицин, доксотрубицин, эпиподофиллотоксины, эллиптицины, эпирубицин, этопозид, разоксан и тенипозид.
17. Ингибиторы киназ
Антитела к B7-H3 по настоящему изобретению могут быть конъюгированы по меньшей мере с одним ингибитором киназ. Рост опухоли можно подавлять посредством блокирования способности протеинкиназ функционировать. Примеры ингибиторов киназ, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения акситиниб, бозутиниб, цедираниб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб, осимертиниб, кобиметиниб, траметиниб, дабрафениб, динациклиб и вандетаниб.
18. Другие средства
Примеры других средств, которые можно использовать в ADC по настоящему изобретению, включают без ограничения абрин (например, цепь А абрина), альфа-токсин, белки Aleurites fordii, аматоксин, кротин, курцин, диантиновые белки, дифтерийный токсин (например, цепь А дифтерийного токсина и несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина), дезоксирибонуклеаза (Dnase), гелонин, митогеллин, цепь А модессина, ингибитор момордики харантской, неомицин, онконаза, феномицин, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), противовирусный белок лаконоса, эндотоксин Pseudomonas, экзотоксин Pseudomonas (например, цепь A экзотоксина (Pseudomonas aeruginosa)), рестриктоцин, цепь A рицина, рибонуклеаза (РНКаза), ингибитор Sapaonaria officinalis, сапорин, альфа-сарцин, стафилококковый энтеротоксин-A, столбнячный токсин, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин (Eloxatin, Sanofi Aventis), протеасомные ингибиторы (например, PS-341 [бортезомиб или Velcade]), ингибиторы HDAC (вориностат (Zolinza, Merck & Company, Inc.)), белиностат, энтиностат, моцетиностат и панобиностат), ингибиторы COX-2, замещенные мочевины, ингибиторы белков теплового шока (например, гелданамицин и его многочисленные аналоги), адренокортикальные супрессанты и трикотецены. (См., например, WO 93/21232). Другие средства также включают аспарагиназу (Espar, Lundbeck Inc.), гидроксимочевину, левамизол, митотан (Lysodren, Bristol-Myers Squibb) и третиноин (Renova, Valeant Pharmaceuticals Inc.).
III.C. ADC с антителом к B7-H3. Другие иллюстративные линкеры
В дополнение к линкерам, упомянутым выше, другие иллюстративные линкеры включают без ограничения 6-малеимидокапроил, малеимидопропаноил ("MP"), валин-цитруллин ("val-cit" или "vc"), аланин-фенилаланин ("ala-phe"), п-аминобензилоксикарбонил ("PAB"), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат ("SPP") и 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат ("MCC").
В одном аспекте антитело к B7-H3 конъюгируют с лекарственным средством (таким как ауристатин, например, MMAE), посредством линкера, содержащего малеимидокапроил ("mc"), валин-цитруллин (val-cit или "vc") и PABA (упоминается как "линкер mc-vc-PABA"). Малеимидокапроил действует как линкер к антителу к B7-H3 и является нерасщепляемым. Val-cit представляет собой дипептид, который является аминокислотным звеном линкера и обеспечивает расщепление линкера протеазой, в частности, протеазой катепсина B. Таким образом, компонент линкера val-cit обеспечивает средство для высвобождения ауристатина из ADC при воздействии внутриклеточной среды. Внутри линкера п-аминобензиловый спирт (PABA) действует как спейсер и является самоотщепляемым, что обеспечивает высвобождение MMAE. Структура линкера mc-vc-PABA-MMAE представлена на фигуре 3.
Как описано выше, подходящие линкеры включают, например, расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение лекарственного средства. Неограничивающие иллюстративные расщепляемые линкеры нестабильные в кислотных условиях линкеры (например, содержащие гидразон), чувствительные к протеазе (например, чувствительные к пептидазе) линкеры, фотолабильные линкеры или дисульфидсодержащие линкеры (Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); патент США № 5208020). Расщепляемый линкер обычно чувствителен к расщеплению во внутриклеточных условиях. Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как лизосомальная протеаза или эндосомальная протеаза. В иллюстративных вариантах осуществления линкером может быть дипептидный линкер, такой как валин-цитруллиновый (val-cit) или фенилаланин-лизиновый (phe-lys) линкеры.
Линкеры предпочтительно стабильны во внеклеточной среде достаточным образом, чтобы быть терапевтически эффективными. Перед транспортировкой или доставкой в клетку ADC предпочтительно является стабильным и остается интактным, т. е. антитело остается конъюгированным с фрагментом в виде лекарственного средства. Линкеры, которые являются стабильными вне целевой клетки, можно расщеплять один раз с некоторой эффективной скоростью внутри клетки. Таким образом, эффективный линкер будет (i) поддерживать специфические свойства связывания антитела; (ii) создавать возможность для доставки, например, внутриклеточной доставки фрагмента в виде лекарственного средства; и (iii) поддерживать терапевтический эффект, например, цитотоксический эффект фрагмента в виде лекарственного средства.
В одном варианте осуществления линкер является расщепляемым во внутриклеточных условиях, таким образом, что расщепление линкера обеспечивает высвобождение лекарственного средства от связи с антителом во внутриклеточной среде, в достаточной мере для его терапевтической эффективности. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т. е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Как правило, рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Например, можно применять нестабильный в кислотных условиях линкер, который подвергается гидролизу в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, амид цис-аконитовой кислоты, сложный ортоэфир, ацеталь, кеталь или т. п.). См., например, патенты США №№ 5122368, 5824805, 5622929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Эти линкеры являются относительно стабильными в условиях нейтрального pH, таких, которые наблюдаются в крови, но являются нестабильными при pH ниже 5,5 или 5,0, что является примерным pH в лизосоме. В определенных вариантах осуществления гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к терапевтическому средству посредством ацилгидразоновой связи (см., например, патент США № 5622929).
В других вариантах осуществления линкер является расщепляемым в восстановительных условиях (например, дисульфидный линкер). Целый ряд дисульфидных линкеров известен из уровня техники, в том числе, например, линкеры, которые могут быть образованы с применением SATA (N-сукцинимидил-5-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол), SPDB и SMPT. (См., например, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., в Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. См. также патент США № 4880935).
В некоторых вариантах осуществления линкер является расщепляемым под действием расщепляющего средства, например, фермента, который присутствует во внутриклеточной среде (например, внутри лизосомы, или эндосомы, или кавеолы). Например, линкер может представлять собой пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным ферментом пептидазой или протеазой, в том числе без ограничения лизосомальной или эндосомальной протеазой. В некоторых вариантах осуществления пептидильный линкер состоит по меньшей мере из двух аминокислот или по меньшей мере из трех аминокислот. Расщепляющие средства могут включать катепсины В и D и плазмин, все из которых, как известно, гидролизуют дипептидные производные лекарственных средств, что приводит к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней (см., например, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Наиболее типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, которые присутствуют в клетках, экспрессирующих B7-H3. Примеры таких линкеров описаны, например, в патенте США № 6214345, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей. В конкретном варианте осуществления пептидильным линкером, расщепляемым под действием внутриклеточной протеазы, является линкер Val-Cit или линкер Phe-Lys (см., например, патент США № 6214345, в котором описан синтез доксорубицина с линкером val-cit). Одно преимущество применения внутриклеточного протеолитического высвобождения терапевтического средства заключается в том, что средство, как правило, ослабляется при конъюгировании, а стабильность конъюгатов в сыворотке крови, как правило, высокая.
В других вариантах осуществления линкер представляет собой малонатный линкер (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), малеимидобензоильный линкер (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem.. 3(10):1299-1304) или 3′-N-амидный аналог (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem.. 3(10):1305-12). 1305-12).
В других вариантах осуществления линкерное звено не расщепляется, и лекарственное средство высвобождается, например, путем разрушения антитела. См. публикацию заявки на патент США № 20050238649, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. ADC, содержащий нерасщепляемый линкер, может быть сконструирован таким образом, что ADC остается по существу вне клетки и взаимодействует с определенными рецепторами на поверхности целевой клетки так, что связывание ADC инициирует (или предотвращает) конкретный клеточный сигнальный путь.
В некоторых вариантах осуществления линкер представляет собой по существу гидрофильный линкер (например, PEG4Mal и сульфо-SPDB). Гидрофильный линкер можно использовать для уменьшения степени, с которой лекарственное средство может выходить из резистентных раковых клеток посредством MDR (множественная лекарственная устойчивость) или функционально схожих транспортеров.
В других вариантах осуществления при расщеплении линкер функционирует для прямого или опосредованного подавления роста клеток и/или пролиферации клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления линкер при расщеплении может функционировать как интеркалирующее средство, за счет чего обеспечивается подавление биосинтеза макромолекул (например, репликации ДНК, транскрипции РНК и/или синтеза белка).
В других вариантах осуществления линкер предназначен для облегчения уничтожения близлежащих случайных клеток (уничтожения соседних клеток) путем диффузии линкера с лекарственным средством и/или только лекарственного средства к соседним клеткам. В других вариантах осуществления линкер способствует клеточной интернализации.
Наличие стерически затрудненного дисульфида может повысить стабильность конкретной дисульфидной связи, повышая эффективность ADC. Таким образом, в одном варианте осуществления линкер включает стерически затрудненную дисульфидную связь. Стерически затрудненный дисульфид относится к дисульфидной связи, присутствующей в определенном молекулярном окружении, где окружение характеризуется конкретным пространственным расположением или ориентацией атомов, как правило, внутри той же молекулы или соединения, которые предотвращают или по меньшей мере частично подавляют восстановление дисульфидной связи. Таким образом, наличие объемных (или стерически затрудненных) химических фрагментов и/или объемных боковых цепей аминокислот, ближайших к дисульфидной связи, предотвращает или по меньшей мере частично подавляет потенциальные взаимодействия дисульфидной связи, которые приводят к восстановлению дисульфидной связи.
Примечательно, что вышеупомянутые типы линкеров не являются взаимоисключающими. Например, в одном варианте осуществления линкер, используемый в описанных в данном документе ADC с антителом к B7-H3, представляет собой нерасщепляемый линкер, который способствует клеточной интернализации.
В некоторых вариантах осуществления линкерный компонент содержит "вставочное звено", которое связывает антитело с другим линкерным компонентом или с фрагментом в виде лекарственного средства. Иллюстративное вставочное звено описано в патенте США № 8309093, который включен посредством ссылки в данный документ. В определенных вариантах осуществления вставочное звено соединено с антителом к B7-H3 посредством дисульфидной связи между атомом серы звена антитела к B7-H3 и атомом серы вставочного звена. Иллюстративное вставочное звено по данному варианту осуществления описано в патенте США № 8309093, который включен в данный документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления вставочное звено содержит реакционноспособный сайт, который может образовывать связь с первичной или вторичной аминогруппой антитела. Примеры таких реакционноспособных сайтов включают без ограничения активированные сложные эфиры, такие как сложные эфиры сукцинимида, сложные 4-нитрофениловые эфиры, сложные пентафторфениловые эфиры, сложные тетрафторфениловые эфиры, ангидриды, хлорангидриды, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты. Иллюстративные вставочные звенья по данному варианту осуществления описаны в патенте США № 8309093, который включен в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления вставочное звено содержит реакционноспособный сайт, который вступает в реакцию с модифицированной группой углеводов (-CHO), которая может присутствовать на антителе. Например, углевод может быть слабо окислен с использованием реагента, такого как периодат натрия, и полученное (-CHO) звено окисленного углевода может быть конденсировано с помощью вставочного звена, которое содержит такие функциональные группы, как гидразид, оксим, первичный или вторичный амин, гидразин, тиосемикарбазон, гидразинкарбоксилат и арилгидразид, такие как описанные Kaneko et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2:133-41. Иллюстративные вставочные звенья по данному варианту осуществления описаны в патенте США № 8309093, который включен в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления линкерный компонент содержит "аминокислотное звено". В некоторых таких вариантах осуществления аминокислотное звено обеспечивает расщепление линкера протеазой, за счет чего обеспечивается облегчение высвобождения лекарственного средства из иммуноконъюгата при воздействии внутриклеточных протеаз, таких как лизосомальные ферменты (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Иллюстративные аминокислотные звенья включают без ограничения дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и пентапептиды. Иллюстративные дипептиды включают без ограничения валин-цитруллин (vc или val-cit), аланин-фенилаланин (af или ala-phe); фенилаланин-лизин (fk или phe-lys); фенилаланин-гомолизин (phe-homolys) и N-метил-валин-цитруллин (Me-val-cit). Иллюстративные трипептиды включают без ограничения глицин-валин-цитруллин (gly-val-cit) и глицин-глицин-глицин (gly-gly-gly). Аминокислотное звено может содержать аминокислотные остатки, которые встречаются в природе и/или минорные аминокислоты и/или отличные от встречающихся в природе аминокислотные аналоги, такие как цитруллин. Аминокислотные звенья можно конструировать и оптимизировать для ферментативного расщепления с помощью конкретного фермента, например, с помощью ассоциированной с опухолью протеазы, катепсина В, С и D или плазминовой протеазы.
В одном варианте осуществления аминокислотное звено представляет собой валин-цитруллин (vc или val-cit). В другом аспекте аминокислотное звено представляет собой фенилаланин-лизин (т. е. fk). В еще другом аспекте аминокислотного звена, аминокислотное звено представляет собой N-метил-валин-цитруллин. В еще другом аспекте аминокислотное звено представляет собой 5-аминовалериановую кислоту, гомофенилаланин-лизин, тетраизохинолинкарбоксилат лизин, циклогексилаланин-лизин, изонипекотиновую кислоту лизина кислоту, бета-аланин-лизин, глицин-валин-глутамин и изонипекотиновую кислоту.
Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления аминокислотное звено заменяют на глюкуронидное звено, которое связывает вставочное звено со спейсерным звеном, если имеются вставочные и спейсерные звенья, связывает вставочное звено с фрагментом в виде лекарственного средства, если отсутствует спейсерное звено, и связывает линкерное звено с лекарственным средством, если вставочное звено и спейсерное звено отсутствуют. Глюкуронидное звено включает сайт, который может быть расщеплен ферментом β-глюкуронидаза (см. также US 2012/0107332, включенный в данный документ посредством ссылки). В некоторых вариантах осуществления глюкуронидное звено содержит сахарный фрагмент (Su), связанный посредством гликозидной связи (-O'-) с самоотщепляющейся группой (Z) формулы, как показано ниже (см. также US 2012/0107332, включенный в данный документ посредством ссылки).
Гликозидная связь (-O'-) обычно представляет собой сайт расщепления β-глюкуронидазы, такой как связь, расщепляемая лизосомальной β-глюкуронидазой человека. В контексте глюкуронидного звена термин "самоотщепляющаяся группа" относится к ди- или трифункциональному химическому фрагменту, который способен ковалентно связывать два или три разнесенных химических фрагмента (т. е. сахарный фрагмент (посредством гликозидной связи), фрагмент в виде лекарственного средства (прямо или опосредованно посредством спейсерного звена), а в некоторых вариантах осуществления - линкер (прямо или опосредованно посредством вставочного звена) в стабильную молекулу. Самоотщепляющаяся группа будет спонтанно отделяться от первого химического фрагмента (например, спейсера или лекарственной единицы), если ее связь с сахарным фрагментом расщепляется.
В некоторых вариантах осуществления сахарный фрагмент (Su) представляет собой циклическую гексозу, такую как пираноза, или циклическую пентозу, такую как фураноза. В некоторых вариантах осуществления пираноза представляет собой глюкуронид или гексозу. Сахарный фрагмент обычно находится в β-D-конформации. В конкретном варианте осуществления пираноза представляет собой β-D-глюкуронидный фрагмент (т. е. β-D-глюкуроновую кислоту, связанную с самоотщепляющейся группой -Z- посредством гликозидной связи, которая расщепляется β-глюкуронидазой). В некоторых вариантах осуществления сахарный фрагмент является незамещенным (например, встречающаяся в природе циклическая гексоза или циклическая пентоза). В других вариантах осуществления сахарный фрагмент может быть замещенным β-D-глюкуронидом (т. е. глюкуроновой кислотой, замещенной одной или несколькими группами, такими как водород, гидроксил, галоген, сера, азот или низший алкил. В некоторых вариантах осуществления глюкуронидное звено характеризуется одной из формул, описанных в US 2012/0107332, включенном в данный документ посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления линкер содержит спейсерное звено (-Y-), которое, если присутствует, связывает аминокислотное звено (или глюкуронидное звено, см. также US 2012/0107332, включенный в данный документ посредством ссылки) с фрагментом в виде лекарственного средства, в случае, если присутствует аминокислотное звено. Альтернативно, спейсерное звено соединяет вставочное звено с фрагментом в виде лекарственного средства, если аминокислотное звено отсутствует. Спейсерное звено также может связывать звено лекарственного средства со звеном антитела, если отсутствуют как аминокислотное звено, так и вставочное звено.
Спейсерные звенья имеют два основных типа: не самоотщепляющиеся или самоотщепляющиеся. Не самоотщепляющимся спейсерным звеном является звено, в котором часть или все спейсерное звено остается связанным с фрагментом в виде лекарственного средства после расщепления, в частности ферментативного, аминокислотного звена (или глюкуронидного звена) из конъюгата антитело-лекарственное средство. Примеры не самоотщепляющегося спейсерного звена включают без ограничения (глицин-глицин)-спейсерное звено и глицин-спейсерное звено (см. US 8309093, включенный в данный документ посредством ссылки)). Другие примеры самоотщепляющихся спейсеров включают без ограничения ароматические соединения, которые электронно схожи с группой PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (Hay et al., 1999, Bioorg, Med. Chem. Lett., 9: 2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2: 223), соответственно замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Элиминация аминосодержащих лекарственных средств, которые замещены в α-положении глицином (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem., 27: 1447), также являются примерами самоотщепляющихся спейсеров.
Другие примеры самоотщепляющихся спейсеров включают без ограничения ароматические соединения, которые электронно схожи с группой PAB, такие как производные 2-аминоимидазол-5-метанола (см., например, Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) и орто- или пара-аминобензилацетали. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты (см., например, Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2: 223), соответственно замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы (см., например, Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты (см., например, Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Элиминация аминосодержащих лекарственных средств, которые замещены в α-положении глицином (см., например, Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem., 27: 1447), также являются примерами самоотщепляющихся спейсеров.
Другие подходящие спейсерные звенья описаны в опубликованной заявке на патент США № 2005-0238649, раскрытие которой включено в данном документе посредством ссылки.
Другой подход для получения ADC включает применение гетеробифункциональных сшивающих средств, которые связывают антитело к B7-H3 с фрагментом в виде лекарственного средства. Примеры сшивающих средств, которые можно использовать, включают N-сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат или высокорастворимый в воде аналог N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат, N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутират (SPDB), N-сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)бутират (SNPB) и N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)бутират (SSNPB), N-сукцинимидил-4-метил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат (SMNP), N-сукцинимидил-4-(5-N,N-диметилкарбоксамидо-2-пиридилдитио)бутират (SCPB) или N-сульфосукцинимидил-4-(5-N,N-диметилкарбоксамидо-2-пиридилдитио)бутират (SSCPB)). Антитела по настоящему изобретению можно модифицировать посредством следующих сшивающих средств: N-сукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат, N-сульфосукцинимидил-4-(5-нитро-2-пиридилдитио)пентаноат, SPDB, SNPB, SSNPB, SMNP, SCPB или SSCPB могут затем вступать в реакцию с небольшим избытком конкретного лекарственного средства, которое содержит тиольный фрагмент с получением высоких выходов ADC. Предпочтительно сшивающие средства представляют собой соединения формулы, показанные в патенте США № 6913748, включенном в данный документ посредством ссылки.
В одном варианте осуществления заряженные линкеры (также называемые прозаряженными линкерами) используются для конъюгации антител к B7-H3 с лекарственными средствами с образованием ADC. Заряженные линкеры включают линкеры, которые становятся заряженными после обработки клеток. Наличие заряженной группы(групп) в линкере конкретного ADC или лекарственного средства после клеточной обработки обеспечивает несколько преимуществ, таких как (i) хорошая растворимость ADC в воде, (ii) способность действовать при более высокой концентрации в водных растворах (iii) способность связывать большее количество молекул лекарственного средства на антитело, что потенциально приводит в результате к более высокой эффективности, (iv) потенциал сохранения заряженных конъюгатов в целевой клетке, что приводит в результате к более высокой эффективности, и (v) улучшенная чувствительность клеток с устойчивостью ко многим лекарственным средствам, которые не способны экспортировать заряженные частицы лекарственного средства из клетки. Примеры некоторых подходящих заряженных или прозаряженных сшивающих средств и их синтез показаны на фигурах 1-10 в патенте США № 8236319 и включены в данный документ посредством ссылки. Предпочтительно заряженные или прозаряженные сшивающие средства представляют собой соединения, содержащие сульфонатные, фосфатные, карбоксильные или четвертичные аминные заместители, которые значительно повышают растворимость ADC, в частности ADC с 2-20 конъюгированными лекарственными средствами. Конъюгаты, полученные с помощью линкеров, содержащих прозаряженный фрагмент, будут вырабатывать один или несколько заряженных фрагментов после того, как конъюгат метаболизируется в клетке.
Дополнительные примеры линкеров, которые можно использовать в композициях и способах, включают валин-цитруллин; малеимидокапроил; аминобензойные кислоты; п-аминобензилкарбамоил (PAB); лизосомально-расщепляемые линкеры; малеимидокапроил-полиэтиленгликоль (MC(PEG)6-OH); N-метилвалин-цитруллин; N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) и N-сукцинимидил-4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) (см. также US 2011/0076232). Другой линкер для применения по настоящему изобретению предусматривает связь авидин-биотин для получения авидин-биотинсодержащего ADC (см. также патент США № 4676980, публикации согласно PCT №№WO1992/022332A2, WO1994/016729A1, WO1995/015770A1, WO1997/031655A2, WO1998/035704A1, WO1999/019500A1, WO2001/09785A2, WO2001/090198A1, WO2003/093793A2, WO2004/050016A2, WO2005/081898A2, WO2006/083562A2, WO2006/089668A1, WO2007/150020A1, WO2008/135237A1, WO2010/111198A1, WO2011/057216A1, WO2011/058321A1, WO2012/027494A1 и EP77671B1), где некоторые такие линкеры устойчивы к расщеплению биотинидазой. Дополнительные линкеры, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают пару когезин/докерин, для обеспечения ADC, содержащих когезин-докерин (см. публикации согласно PCT №№ WO2008/097866A2, WO2008/097870A2, WO2008/103947A2 и WO2008/103953A2).
Дополнительные линкеры для применения в настоящем изобретении могут содержать непептидные полимеры (примеры включают без ограничения полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полиоксиэтилированные полиолы, поливиниловый спирт, полисахариды, декстран, поливинилэтиловый эфир, PLA (поли(молочная кислота)), PLGA (поли(молочная кислота-гликолевая кислота)) и их комбинации, где предпочтительным полимером является полиэтиленгликоль) (см. также публикацию согласно PCT № WO2011/000370). Дополнительные линкеры также описаны в WO 2004010957, публикации заявки на патент США № 20060074008, публикации заявки на патент США № 20050238649 и публикации заявки на патент США № 20060024317, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
Для ADC, содержащего майтанзиноид, многие положения на майтанзиноидах могут служить как положения для химического связывания связывающего фрагмента. В одном варианте осуществления майтанзиноиды содержат связывающий фрагмент, который содержит реакционноспособную химическую группу, представляют собой С-3 сложные эфиры майтанзинола и его аналогов, где связывающий фрагмент содержит дисульфидную связь, а химическая реакционноспособная группа содержит N-сукцинимидиловый или N-сульфосукцинимидиловый сложный эфир. Например, пригодными являются все из положения C-3 с гидроксильной группой, положения C-14, модифицированного гидроксиметилом, положения C-15, модифицированного гидроксильной группой, и положения C-20 с гидроксильной группой. Связывающий фрагмент наиболее предпочтительно связан с положением С-3 майтанзинола.
Конъюгацию лекарственного средства с антителом посредством линкера можно осуществить с помощью любой методики, известной из уровня техники. Существует ряд различных реакций для ковалентного присоединения лекарственных средств и линкеров к антителам. Это может быть достигнуто путем осуществления реакции аминокислотных остатков антитела, в том числе аминогрупп лизина, свободных карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильных групп цистеина и различных фрагментов ароматических аминокислот. Одним из наиболее часто используемых неспецифических способов ковалентного присоединения является карбодиимидная реакция со связыванием карбокси- (или амино-) группы соединения с амино- (или карбокси-) группами антитела. Кроме того, бифункциональные средства, такие как диальдегиды или сложные имидоэфиры, используют для связывания аминогруппы соединения с аминогруппами антитела. Также для прикрепления лекарственных средств к антителам доступна реакция основания Шиффа. Этот способ предусматривает окисление периодатом лекарственного средства, которое содержит гликольные или гидроксигруппы, с образованием таким образом альдегида, которые затем подвергают реакции со связывающим средством. Присоединение происходит путем образования основания Шиффа с аминогруппами антитела. Изотиоцианаты также можно использовать в качестве связывающих средств для ковалентного прикрепления лекарственных средств к антителам. Другие методики известны специалисту в данной области техники и находятся в пределах объема настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления осуществляют реакцию промежуточного соединения, которое является предшественником линкера, с лекарственным средством в соответствующих условиях. В определенных вариантах осуществления используют реактивные группы на лекарственном средстве или промежуточном соединении. Затем осуществляют реакцию продукта реакции между лекарственным средством и промежуточным соединением или дериватизированным лекарственным средством с антителом к B7-H3 в соответствующих условиях. Синтез и структура иллюстративных линкеров, вставочных звеньев, аминокислотных звеньев, самоотщепляющихся спейсерных звеньев описаны в публикациях заявки на патент США №№ 20030083263, 20050238649 и 20050009751, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.
Стабильность ADC можно измерить стандартными аналитическими методиками, такими как масс-спектроскопия, HPLC и методика разделения/анализа с помощью LC/MS.
IV. Очистка ADC с антителом к B7-H3
Очистку ADC можно осуществлять таким образом, чтобы собирать ADC, характеризующиеся определенными значениями DAR. Например, можно применять смолу для HIC для отделения ADC с высокой нагрузкой лекарственным средством от ADC, характеризующихся оптимальными значениями соотношения лекарственного средства и антитела (значения DAR), например, DAR 4 или меньше. В одном варианте осуществления гидрофобную смолу добавляют к смеси ADC с тем, чтобы нежелательные ADC, т. е. ADC с высокой нагрузкой лекарственным средством, связывались со смолой и могли быть селективно удалены из смеси. В определенных вариантах осуществления разделения ADC можно достичь путем приведения в контакт смеси ADC (например, смеси, содержащей формы ADC, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы ADC, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства) с гидрофобной смолой, где количество смолы является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных лекарственным средством, подлежащих удалению из смеси ADC. Смолу и смесь ADC смешивают вместе таким образом, чтобы формы ADC, подлежащие удалению (например, формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства), связывались со смолой и могли быть отделены от других форм ADC в смеси ADC. Количество смолы, применяемой согласно способу, зависит от весового соотношения форм, подлежащих удалению, и смолы, где количество применяемой смолы не допускает значительного связывания форм, нагруженных лекарственным средством, которые являются необходимыми. Таким образом, можно применять способы для уменьшения среднего значения DAR до менее 4. Кроме того, для выделения ADC, характеризующихся нагрузкой лекарственным средством в любом необходимом диапазоне, например, форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства, форм, нагруженных 3 или менее молекулами лекарственного средства, форм, нагруженных 2 или менее молекулами лекарственного средства, форм, нагруженных 1 или менее молекулами лекарственного средства, можно применять описанные в данном документе способы очистки.
Определенные формы молекулы(молекул) связываются с поверхностью за счет гидрофобных взаимодействий между формами и гидрофобной смолой. В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению относится к способу очистки, который основан на перемешивании гидрофобной смолы и смеси ADC, где количество смолы, добавляемое к смеси, определяет то, какие формы (например, ADC с DAR 6 или больше) будут связываться. После получения и очистки антитела из системы экспрессии (например, системы экспрессии на основе клеток млекопитающего) антитело восстанавливают и связывают с лекарственным средством посредством реакции конъюгации. Полученная в результате смесь ADC зачастую содержит ADC, характеризующиеся диапазоном значений DAR, например от 1 до 8. В одном варианте осуществления смесь ADC содержит формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства. Согласно способам по настоящему изобретению смесь ADC можно очищать с помощью способа, такого как без ограничения периодический способ, таким образом, чтобы ADC, характеризующиеся нагрузкой 4 или менее молекулами лекарственного средства, были выбраны и отделены от ADC, характеризующихся более высокой нагрузкой лекарственным средством (например, ADC, характеризующихся нагрузкой 6 или более молекулами лекарственного средства). Следует отметить, способы очистки, описанные в данном документе, могут применяться для выделения ADC, характеризующихся любым необходимым диапазоном значений DAR, например, DAR, составляющим 4 или меньше, DAR, составляющим 3 или меньше, DAR, составляющим 2 или меньше.
Таким образом, в одном варианте осуществления смесь ADC, содержащую формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, можно приводить в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и можно обеспечивать удаление гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL. В отдельном варианте осуществления способ по настоящему изобретению включает приведение смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и удаление гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL, где вес гидрофобной смолы превышает в 3-12 раз вес форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, в смеси ADC.
Способ разделения ADC, описанный в данном документе способ, можно осуществлять с помощью периодического способа очистки. Периодический способ очистки в целом включает добавление смеси ADC к гидрофобной смоле в сосуде, смешивание и последующее отделение смолы от супернатанта. Например, в контексте периодической очистки гидрофобную смолу можно получать в необходимом уравновешивающем буфере или уравновешивать с помощью него. Таким образом можно получить взвесь гидрофобной смолы. Затем смесь ADC можно приводить в контакт со взвесью для адсорбции конкретных форм ADC, которые необходимо отделить с помощью гидрофобной смолы. Затем раствор, содержащий необходимые ADC, которые не связались с материалом, представляющим собой гидрофобную смолу, можно отделить от взвеси, например, с помощью фильтрации или обеспечения осаждения взвеси и удаления супернатанта. Полученную в результате взвесь можно подвергнуть одной или нескольким стадиям промывки. С целью элюирования связавшихся ADC концентрация соли может быть уменьшена. В одном варианте осуществления способ, применяемый согласно настоящему изобретению, предусматривает не более 50 г гидрофобной смолы.
Таким образом, можно применять периодический способ с приведением смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и удалением гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL. В отдельном варианте осуществления применяется периодический способ с приведением смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и удалением гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL, где вес гидрофобной смолы превышает в 3-12 раз вес форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, в смеси ADC.
В качестве альтернативы в отдельном варианте осуществления очистку можно проводить с применением циркуляционного способа, где смолу упаковывают в контейнер, и смесь ADC пропускают через слой гидрофобной смолы до тех пор, пока конкретные формы ADC, которые необходимо отделить, не будут удалены. Затем супернатант (содержащий необходимые формы ADC) откачивают из контейнера, а слой смолы может быть подвергнут стадиям промывки.
Можно применять циркуляционный способ с приведением смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и удалением гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL. В отдельном варианте осуществления применяется циркуляционный способ с приведением смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой с образованием смеси со смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства; и удалением гидрофобной смолы из смеси ADC с получением таким образом композиции, содержащей ADC, где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL, где вес гидрофобной смолы превышает в 3-12 раз вес форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, в смеси ADC.
В качестве альтернативы может применяться проточный способ очистки смеси ADC для получения композиции, содержащей по большей части ADC, характеризующиеся определенным необходимым DAR. При проточном способе смолу упаковывают в контейнер, например колонку, и смесь ADC пропускают через упакованную смолу так, что необходимые формы ADC практически не связываются со смолой и проходят через смолу, а нежелательные формы ADC связываются со смолой. Проточный способ можно осуществлять в однопроходном режиме (где формы ADC, представляющие интерес, получают в результате одного прохода через смолу в контейнере) или в многопроходном режиме (где формы ADC, представляющие интерес, получают в результате нескольких проходов через смолу в контейнере). Проточный способ осуществляют таким образом, что выбранный вес смолы обеспечивает связывание популяции нежелательных ADC, а необходимые ADC (например, с DAR 2-4) проходят через смолу, и их собирают в виде элюата после одного или нескольких проходов.
Проточный способ можно применять с приведением смеси ADC, содержащей формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, и формы, нагруженные 6 или более молекулами лекарственного средства, в контакт с гидрофобной смолой, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания форм, нагруженных 4 или менее молекулами лекарственного средства, где формы, нагруженные 4 или менее молекулами лекарственного средства, проходят через смолу, и их впоследствии собирают после одного или нескольких проходов, за счет чего получают композицию, содержащую необходимые ADC (например, с DAR 2-4), где композиция содержит менее 15% форм, нагруженных 6 или более молекулами лекарственного средства, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с ингибитором Bcl-xL. В отдельном варианте осуществления применяют проточный способ с приведением смеси ADC, содержащей частицы с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 4 или меньше, и частицы с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 6 или больше, в контакт с гидрофобной смолой путем пропускания смеси ADC через смолу, где количество гидрофобной смолы, приведенной в контакт со смесью ADC, является достаточным для обеспечения связывания частиц с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 6 или больше, со смолой, но при этом не допускает значительного связывания частиц с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 4 или меньше, где частицы с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 4 или меньше, проходят через смолу, и их впоследствии собирают после одного или нескольких проходов, за счет чего получают композицию, содержащую ADC, где композиция содержит менее 15% частиц с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 6 или больше, и где ADC содержит антитело, конъюгированное с лекарственным средством, например, ингибитором Bcl-xL, при этом количество по весу гидрофобной смолы превышает в 3-12 раз вес частиц с нагрузкой лекарственным средством, составляющей 6 или больше, в смеси ADC.
После осуществления проточного способа смолу можно промывать посредством одной или нескольких промывок, выполняемых с целью дополнительного извлечения ADC, характеризующихся необходимым диапазоном DAR (находящихся в промывочном фильтрате). Например, можно применять множество промывок, характеризующихся уменьшающейся проводимостью, для дополнительного извлечения ADC, характеризующихся DAR, представляющим интерес. Элюированный материал, полученный в результате промывки смолы, можно впоследствии объединять с фильтратом, полученным из проточного способа, для улучшения извлечения ADC, характеризующихся DAR, представляющим интерес.
Вышеуказанные способы очистки, представляющие собой периодический, циркуляционный и проточный способ, основаны на применении гидрофобной смолы для отделения форм ADC с высокой нагрузкой лекарственным средством от форм с низкой нагрузкой лекарственным средством. Гидрофобная смола содержит гидрофобные группы, которые взаимодействуют с ADC за счет их гидрофобных свойств. Гидрофобные группы ADC взаимодействуют с гидрофобными группами гидрофобной смолы. Чем более гидрофобным является белок, тем активнее он будет взаимодействовать с гидрофобной смолой.
Гидрофобная смола, как правило, содержит основную матрицу (например, сшитую агарозу или материал, представляющий собой синтетический сополимер), с которой связываются гидрофобные лиганды (например, алкильные или арильные группы). Множество гидрофобных смол являются коммерчески доступными. Примеры включают без ограничения Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow с низкой или высокой степенью замещения (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); Phenyl SepharoseTM High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); Octyl SepharoseTM High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); колонки FractogelTM EMD с пропильными группами или FractogelTM EMD с фенильными группами (E. Merck, Германия); подложки Macro-PrepTM с метильными группами или Macro-PrepTM с трет-бутильными группами (Bio-Rad, Калифорния); WP HI-Propyl (C3)TM (J. T. Baker, Нью-Джерси); и ToyopearlTM с эфирными, гексильными, фенильными или бутильными группами (TosoHaas, Пенсильвания). В одном варианте осуществления гидрофобная смола представляет собой бутиловую гидрофобную смолу. В другом варианте осуществления гидрофобная смола представляет собой фениловую гидрофобную смолу. В другом варианте осуществления гидрофобная смола представляет собой гексиловую гидрофобную смолу, октиловую гидрофобную смолу или дециловую гидрофобную смолу. В одном варианте осуществления гидрофобная смола представляет собой метакриловый полимер, имеющий н-бутил-лиганды (например, TOYOPEARL® Butyl-600M).
Дополнительные способы очистки смесей ADC для получения композиции, характеризующейся необходимым DAR, описаны в заявке США № 14/210602 (публикация заявки на патент США № US 2014/0286968), включенной посредством ссылки во всей своей полноте.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения описанные в данном документе ADC, характеризующиеся DAR 2, очищают от ADC, характеризующихся более высокими или более низкими значениями DAR. Такие очищенные ADC с DAR 2 называются в данном документе "E2". Способы очистки для получения композиции, содержащей ADC E2 с антителом к B7-H3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, содержащая смесь ADC, где по меньшей мере 75% ADC представляют собой ADC с антителом к B7-H3 (как таковые, которые описаны в данном документе), характеризующиеся DAR 2. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию, содержащую смесь ADC, где по меньшей мере 80% ADC представляют собой ADC с антителом к B7-H3 (как таковые, которые описаны в данном документе), характеризующиеся DAR 2. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию, содержащую смесь ADC, где по меньшей мере 85% ADC представляют собой ADC с антителом к B7-H3 (как таковые, которые описаны в данном документе), характеризующиеся DAR 2. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает композицию, содержащую смесь ADC, где по меньшей мере 90% ADC представляют собой ADC с антителом к B7-H3 (как таковые, которые описаны в данном документе), характеризующиеся DAR 2.
V. Пути применения антител к B7-H3 и ADC с антителом к B7-H3
Антитела и ADC по настоящему изобретению предпочтительно способны к нейтрализации активности B7-H3 человека как in vivo, так и in vitro. Соответственно, такие антитела и ADC по настоящему изобретению можно применять для подавления активности hB7-H3, например, в культуре клеток, содержащих hB7-H3, у субъектов-людей или у других субъектов-млекопитающих, имеющих B7-H3, с которым перекрестно реагирует антитело по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления активности hB7-H3, предусматривающий приведение hB7-H3 в контакт с антителом или ADC по настоящему изобретению, вследствие чего активность hB7-H3 подавляется. Например, в случае культуры клеток, содержащих или предположительно содержащих hB7-H3, антитело или часть антитела по настоящему изобретению можно добавлять в среду для культивирования, чтобы подавить активность hB7-H3 в культуре.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ снижения активности hB7-H3 у субъекта, преимущественно у субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, при которых активность B7-H3 оказывает негативное воздействие. Настоящее изобретение предусматривает способы снижения активности B7-H3 у субъекта, страдающего таким заболеванием или нарушением, при этом способ предусматривает введение субъекту антитела или ADC по настоящему изобретению, вследствие чего активность B7-H3 у субъекта снижается. Предпочтительно B7-H3 представляет собой B7-H3 человека, а субъект представляет собой субъекта-человека. В качестве альтернативы, субъект может представлять собой млекопитающее, экспрессирующее B7-H3, с которым способны связываться антитела по настоящему изобретению. Более того, субъект может представлять собой млекопитающее, в которое B7-H3 был внедрен (например, путем введения B7-H3 или путем экспрессии трансгена B7-H3). Антитела или ADC по настоящему изобретению можно вводить субъекту-человеку в терапевтических целях. Кроме того, антитела или ADC по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему, отличному от человека, экспрессирующему B7-H3, с которым данное антитело способно связываться, в ветеринарных целях или в качестве животной модели заболевания человека. Что касается последнего, такие животные модели могут быть пригодны для оценки терапевтической эффективности антител по настоящему изобретению (например, тестирования доз и периодов времени введения).
Подразумевается, что используемый в данном документе термин "нарушение, при котором экспрессия B7-H3 оказывает негативное воздействие", включает заболевания и другие нарушения, при которых присутствие B7-H3 у субъекта, страдающего нарушением, как было показано, при его экспрессии, является или предположительно является либо ответственным за патофизиологию нарушения, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение нарушения. Например, ADC по настоящему изобретению можно использовать для нацеливания на опухолевые клетки, которые экспрессируют B7-H3. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно подвергать лечению с помощью ADC по настоящему изобретению, например ADC, содержащих huAb13v1, включают без ограничения различные виды рака, в том числе без ограничения мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, глиому, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак головы и шеи, лейкемию, например, острый миелоидный лейкоз (AML), лимфому, например, неходжкинскую лимфому (NHL) и рак почки. Другие примеры рака, который можно лечить с применением композиций и способов, раскрытых в данном документе, включают плоскоклеточную карциному (например, плоскоклеточный рак легкого или плоскоклеточный рак головы и шеи), трижды негативный рак молочной железы, немелкоклеточный рак легкого, колоректальный рак и мезотелиому. В одном варианте осуществления антитела или ADC, раскрытые в данном документе, применяют для лечения солидной опухоли, например, подавления роста или уменьшения размера солидной опухоли, сверхэкспрессирующей B7-H3, или которая является B7-H3-позитивной. В одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на лечение плоскоклеточного рака легкого, связанного с экспрессией B7-H3. В другом варианте осуществления антитела и ADC, раскрытые в данном документе, применяются для лечения трижды негативного рака молочной железы (TNBC). Заболевания и нарушения, описанные в данном документе, можно лечить с помощью антител к B7-H3 или ADC по настоящему изобретению, а также с помощью фармацевтических композиций, содержащих такие антитела к B7-H3 или ADC.
В определенных вариантах осуществления рак может характеризоваться сверхэкспрессией EGFR. В одном варианте осуществления ADC по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака, связанного с мутацией, приводящей к активации EGFR. Примеры таких мутаций включают без ограничения мутацию, представляющую собой делецию в экзоне 19, одноточечную мутацию по типу замены L858R в экзоне 21, точечную мутацию T790M и их комбинации.
В определенных вариантах осуществления антитела или ADC, раскрытые в данном документе, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, с целью лечения типов солидных опухолей на поздней стадии, вероятно, проявляющих повышенные уровни B7-H3. Примеры таких опухолей включают без ограничения мелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого, тройной негативный рак молочной железы, колоректальную карциному и мультиформную глиобластому.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления или уменьшения роста солидной опухоли у субъекта, у которого имеется солидная опухоль, при этом указанный способ предусматривает введение антитела к B7-H3 или ADC, описанных в данном документе, субъекту, у которого имеется солидная опухоль, за счет чего рост солидной опухоли подавляется или уменьшается. В определенных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой немелкоклеточную карциному легкого или глиобластому. В дополнительных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой солидные опухоли, экспрессирующие B7-H3. В дополнительных вариантах осуществления солидная опухоль представляет собой солидные опухоли, сверхэкспрессирующие B7-H3. В определенных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, вводят субъекту, у которого имеется мультиформная глиобластома, в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например, облучением и/или темозоломидом.
В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе ADC с антителами к B7-H3 вводят субъекту, у которого имеется мелкоклеточный рак легкого, в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например, ABT-199 (венетоклакс).
В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе ADC с антителами к B7-H3 вводят субъекту, у которого имеется немелкоклеточный рак легкого, в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например, таксаном. В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к B7-H3 или ADC вводят субъекту, у которого имеется рак молочной железы, в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например, таксаном. В определенных вариантах осуществления описанные в данном документе антитела к B7-H3 или ADC вводят субъекту, у которого имеется рак яичника, в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например, таксаном.
Другие виды комбинированной терапии, которые предусмотрены по настоящему изобретению, представляют собой введение ADC с антителом к B7-H3 со средством, выбранным из группы, состоящей из антитела к PD1 (например, пембролизумаб), антитела к PD-L1 (например, атезолизумаб), антитела к CTLA-4 (например, ипилимумаб), ингибитора MEK (например, траметиниб), ингибитора ERK, ингибитора BRAF (например, дабрафениб), осимертиниба, эрлотиниба, гефитиниба, сорафениба, ингибитора CDK9 (например, динациклиб), ингибитора MCL-1, темозоломида, ингибитора Bcl-xL, ингибитора Bcl-2 (например, венетоклакс), ибрутиниба, ингибитора mTOR (например, эверолимус), ингибитора PI3K (например, бупарлисиб), дувелисиба, иделалисиба, ингибитора AKT, ингибитора HER2 (например, лапатиниб), таксана (например, доцетаксел, паклитаксел, наб-паклитаксел), венетоклакс, ADC, содержащего ауристатин, ADC, содержащего PBD (например, ровалпитузумаб тесирин), ADC, содержащего майтанзиноид (например, TDM1), агониста TRAIL, ингибитора протеасом (например, бортезомиб) и ингибитора никотинамидфосфорибозилтрансферазы (NAMPT).
Виды комбинированной терапии предусматривают введение ADC по настоящему изобретению одновременного с введением дополнительного терапевтического средства, в том числе описанных выше, до него или после него.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ подавления или уменьшения роста солидной опухоли у субъекта, у которого имеется солидная опухоль, которая идентифицирована как опухоль, экспрессирующая B7-H3 или сверхэкспрессирующей B7-H3 опухолью, при этом указанный способ предусматривает введение антитела к B7-H3 или ADC, описанных в данном документе, субъекту с солидной опухолью, так что рост солидной опухоли ингибируется или уменьшается. Способы идентификации опухолей, экспрессирующих B7-H3 (например, опухолей, сверхэкспрессирующих B7-H3) известны из уровня техники и включают одобренные FDA тесты и подтверждающие анализы. Например, анализ по выявлению экспрессии B7-H3 представляет собой набор, представляющий собой систему качественного иммуногистохимического (IHC) исследования, который применяют для определения экспрессии B7-H3 в нормальных и неопластических тканях, фиксированных обычным способом для гистологической оценки. Кроме того, для идентификации опухолей, сверхэкспрессирующих B7-H3, также можно применять анализы на основе ПЦР. Амлифицированные продукты ПЦР можно впоследствии анализировать, например с помощью гель-электрофореза, с применением стандартных способов, известных из уровня техники, для определения размера продуктов ПЦР. Такие тесты можно применять для идентификации опухолей, которые можно обрабатывать с применением способов и композиций, описанных в данном документе.
Любой из способов генной терапии, доступных из уровня техники, можно применять согласно настоящему изобретению. Общие обзоры способов генной терапии см. в Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); и Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантной ДНК, которые можно применять, описаны в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Подробное описание различных способов генной терапии представлено в US20050042664 A1, который включен в данный документ посредством ссылки.
В другом аспекте в настоящей заявке описан способ лечения (например, излечения, подавления, облегчения тяжести, отсрочки или предупреждения возникновения или предупреждения повторного появления или рецидива) или предупреждения нарушения, ассоциированного с B7-H3, у субъекта. Способ предусматривает введение субъекту B7-H3-связывающего средства, например, антитела к B7-H3 или его фрагмента, описанных в данном документе, в количестве, достаточном для лечения или предупреждения нарушения, ассоциированного с B7-H3. Антагонист B7-H3, например антитело к B7-H3 или его фрагмент, можно вводить субъекту в отдельности или в комбинации с другими вариантами терапевтического воздействия, описанными в данном документе.
Антитела или ADC по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части можно применять в отдельности или в комбинации для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающую часть можно применять в отдельности или в комбинации с дополнительным средством, например терапевтическим средством, причем указанное терапевтическое средство выбирает специалист в данной области техники, исходя из его целевого назначения. Например, дополнительное средство может представлять собой терапевтическое средство, считающееся в данной области техники пригодным для лечения заболевания или состояния, которое лечат с помощью антитела по настоящему изобретению. Дополнительное средство также может представлять собой средство, которое придает полезное свойство терапевтической композиции, например средство, которое влияет на вязкость композиции.
Также следует понимать, что комбинации, которые должны быть включены в настоящее изобретение, представляют собой те комбинации, которые пригодны для их предполагаемой цели. Средства, изложенные ниже, приводятся с целью иллюстрации и не подразумеваются как ограничивающие. Комбинации, которые представляют собой часть настоящего изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из нижеуказанных перечней. Комбинация также может включать более одного дополнительного средства, например два или три дополнительных средства, если комбинация является такой, что образованная композиция может выполнять свою предполагаемую функцию.
Комбинированная терапия может предусматривать один или несколько антагонистов B7-H3, например антитела к B7-H3 или их фрагменты, составленные и/или вводимые совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например одним или несколькими ингибиторами цитокинов и факторов роста, иммуносупрессорами, противовоспалительными средствами (например, системными противовоспалительными средствами), противофиброзными средствами, ингибиторами метаболизма, ингибиторами ферментов и/или цитотоксическими или цитостатическими средствами, ингибиторами митоза, противоопухолевыми антибиотиками, иммуномодулирующими средствами, векторами для генной терапии, алкилирующими средствами, антиангиогенными средствами, антиметаболитами, борсодержащими средствами, хемопротекторными средствами, гормонами, антигормональными средствами, кортикостероидами, фотоактивными терапевтическими средствами, олигонуклеотидами, радионуклидными средствами, ингибиторами топоизомеразы, ингибиторами киназы или радиосенсибилизаторами, как описано более подробно в данном документе.
В конкретном варианте осуществления B7-H3-связывающие белки, описанные в данном документе, например, антитела к B7-H3, используются в комбинации с противораковым средством или антинеопластическим средством. Термины "противораковое средство" и "антинеопластическое средство" относятся к лекарственным средствам, применяемым для лечения злокачественных новообразований, таких как ракoвые образования. Терапию лекарственным средством может применяться в отдельности или в комбинации с другими средствами лечения, такими как хирургическое вмешательство или лучевая терапия. Несколько классов лекарственных средств могут применяться в лечении рака, в зависимости от природы вовлеченного органа. Например, при разновидностях рака молочной железы обычно происходит стимуляция эстрогенами, и их можно лечить с помощью лекарственных средств, которые инактивируют половые гормоны. Подобным образом, рак предстательной железы можно лечить с помощью лекарственных средств, которые инактивируют андрогены, мужские половые гормоны. Противораковые средства, которые можно применять в сочетании с антителами к B7-H3 или ADC по настоящему изобретению, включают, помимо прочего, антитело к PD1 (например, пембролизумаб), антитело к PD-L1 (например, атезолизумаб), антитело к CTLA-4 (например, ипилимумаб), ингибитор MEK (например, траметиниб), ингибитор ERK, ингибитор BRAF (например, дабрафениб), осимертиниба (AZD9291), эрлотиниба, гефитиниба, сорафениба, ингибитор CDK9 (например, динациклиб), ингибитор MCL-1, темозоломид, ингибитор Bcl-xL, ингибитор Bcl-2 (например, венетоклакс), ибрутиниб, ингибитор mTOR (например, эверолимус), ингибитор PI3K (например, бупарлисиб), дувелисиб, иделалисиб, ингибитор AKT, ингибитор HER2 (например, лапатиниб), таксан (например, доцетаксел, паклитаксел, наб-паклитаксел), ADC, содержащий ауристатин, ADC, содержащий PBD (например, ровалпитузумаб тесирин), ADC, содержащий майтанзиноид (например, TDM1), агонист TRAIL, ингибитор протеасом (например, бортезомиб) и ингибитор никотинамидфосфорибозилтрансферазы (NAMPT), а также следующие средства:
Антитела, которые связывают EGFR; мутации, влияющие на экспрессию EGFR или активность, могут приводить к раку
__________________
Антитела, которые связывают сMET (фактор мезенхимально-эпителиального перехода); представитель семейства МЕТ рецепторных тирозинкиназ)
Антитела к ErbB3
19D12 (полностью гуманизированное mAb)
Cp751-871 (полностью гуманизированное mAb)
H7C10 (гуманизированное mAb)
альфа-IR3 (мышиное)
ScFV/FC (химера мыши/человека)
EM/164 (мышиное)
Матузумаб (EMD72000)
Erbitux®/цетуксимаб (Imclone)
Vectibix®/панитумумаб (Amgen)
mAb 806
Нимотуксумаб (TheraCIM)
AVEO (AV299) (AVEO)
AMG102 (Amgen)
5D5 (OA-5d5) (Genentech)
H244G11 (Pierre Fabre)
Ab № 14 (MM 121-14)
Herceptin® (трастузумаб; Genentech)
1B4C3; 2D1D12 (U3 Pharma AG)
BMS-536924 (1H-бензоимидазол-2-ил)-1H-пиридин-2-он)
BMS-554417
Циклолиган
TAE226
PQ401
сверхэкспрессия или мутации, влияющие на экспрессию или активность EGFR, могут приводить к раку.
CI-1033 (PD 183805) (Pfizer)
Лапатиниб (GW-572016) (GlaxoSmithKline)
Tykerb®/лапатиниба дитозилат (Smith Kline Beecham)
Tarceva®/эрлотиниб HCL (OSI-774) (OSI Pharma)
PKI-166 (Novartis)
PD-158780
EKB-569
Тирфостин AG 1478 (4-(3-хлораниллино)-6,7-диметоксихиназолин)
ARQ 197
Капецитабин/XELODA® (HLR Roche)
5-Трифторметил-2'-дезоксиуридин
Метотрексат натрия (Trexall) (Barr)
Ралтитрексед/Tomudex® (AstraZeneca)
Пеметрексед/Alimta® (Lilly)
Тегафур
Цитозин-арабинозид (Цитарабин, Ara-C)/Thioguanine® (GlaxoSmithKline)
5-Азацитидин
6-Меркаптопурин (меркаптопурин, 6-MP)
Азатиоприн/Azasan® (AAIPHARMA LLC)
6-Тиогуанин (6-TG)/Purinethol® (TEVA)
Пентостатин/Nipent® (Hospira Inc.)
Флударабина фосфат/Fludara® (Bayer Health Care)
Кладрибин (2-CdA, 2-хлордезоксиаденозин)/Leustatin® (Ortho Biotech)
Циклофосфамид/цитоксан (BMS)
Неосар (TEVA)
Ифосфамид/Mitoxana® (ASTA Medica)
Тиотепа (Bedford, Abraxis, Teva)
BCNU→ 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина
CCNU→ 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина (метил-CCNU)
Гексаметилмеламин (Алтретамин, HMM)/Hexalen® (MGI Pharma Inc.)
Бусульфан/милeран (GlaxoSmithKline)
Прокарбазин HCL/матулан (Sigma Tau Pharmaceuticals, Inc.)
Дакарбазин (DTIC)
Хлорамбуцил/Leukara® (SmithKline Beecham)
Мелфалан/Alkeran® (GlaxoSmithKline)
Цисплатин (цисплатин, CDDP)/платинол (Bristol Myers)
Карбоплатин/параплатин (BMS)
Оксалиплатин/Eloxitan® (Sanofi-Aventis US)
Даунорубицина цитрат/Daunoxome® (Gilead) Митоксантрон HCL/новантрон (EMD Serono)
Актиномицин D
Этопозид/Vepesid® (BMS)/Etopophos® (Hospira, Bedford, Teva Parenteral и т. д.)
Топотекан HCL/Hycamtin®
(GlaxoSmithKline)
Тенипозид (VM-26)/Vumon® (BMS)
Иринотекан HCL (CPT-11)/Camptosar® (Pharmacia & Upjohn)
Винбластина сульфат/Velban® (снят с производства) (Lilly)
Винорелбина тартрат/Navelbine® (PierreFabre)
Виндезина сульфат/Eldisine® (Lilly)
Паклитаксел/Taxol® (BMS)
Доцетаксел/Taxotere® (Sanofi Aventis US)
Паклитаксел в виде наночастиц (ABI-007)/Abraxane® (Abraxis BioScience, Inc.)
Иксабепилон/IXEMPRA™ (BMS)
Сунитиниба малат/Sutent® (Pfizer)
Сорафениба тозилат/Nexavar® (Bayer)
Нилотиниба гидрохлорида моногидрат/Tasigna® (Novartis), осимертиниб, кобиметиниб, траметиниб, дабрафениб, динациклиб
Антитело/низкомолекулярные модуляторы иммунных контрольных точек
Ингибитор ангиогенеза/Avastin® (Genentech)
IL-2→ Интерлейкин 2 (Альдеслейкин)/Proleukin® (Chiron)
IL-12→ Интерлейкин 12
Средства терапии на основе антител к CTLA-4 и PR-1
Yervoy® (ипилимумаб; Bristol-Myers Squibb)
Opdivo® (ниволумаб; Bristol-Myers Squibb)
Keytrada® (пембролизумаб; Merck)
Фулвестрант/Faslodex® (AstraZeneca)
Ралоксифен HCL/Evista® (Lilly)
Анастразол/Arimidex® (AstraZeneca)
Летрозол/Femara® (Novartis)
Фадрозол (CGS 16949A)
Эксеместан/Aromasin® (Pharmacia & Upjohn)
Лейпролида ацетат/Eligard® (QTL USA)
Lupron® (TAP Pharm)
Гозерелина ацетат/Zoladex® (AstraZeneca)
Трипторелина памоат/Trelstar® (Watson Labs)
Бусерелин/Suprefact® (Sanofi Aventis)
Нафарелин/Synarel® (Pfizer)
Цетрореликс/Cetrotide® (EMD Serono)
Бикалутамид/Casodex® (AstraZeneca)
Нилутамид/Nilandron® (Aventis Pharm.)
Мегестрола ацетат/Megace® (BMS)
Аналоги соматостатина (октреотида ацетат/
Sandostatin® (Novartis)
Дексаметазон/Decadron® (Wyeth)
Темсиролимус (CCI-779)/Torisel® (Wyeth)
Дефоролимус (AP23573)/(Ariad Pharm.)
Эверолимус (RAD00I)/Certican® (Novartis)
Помимо вышеуказанных противораковых средств, антитела к B7-H3 и ADC, описанные в данном документе, можно вводить в комбинации с описанными в данном документе средствами. Кроме того, вышеуказанные противораковые средства также можно применять в ADC по настоящему изобретению.
В конкретных вариантах осуществления антитела к B7-H3 или ADC можно вводить в отдельности или с другим противораковым средством, которое действует совместно или с синергетически с антителом, для лечения заболевания, ассоциированного с активностью B7-H3. Такие противораковые средства включают, например, средства, хорошо известные из уровня техники (например, цитотоксины, химиотерапевтические средства, малые молекулы и облучение). Примеры противораковых средств включают без ограничения панорекс (Glaxo-Welcome), ритуксан (IDEC/Genentech/Hoffman la Roche), милoтарг (Wyeth), кампат (Millennium), зевалин (IDEC и Schering AG), бексар (Corixa/GSK), эрбитукс (Imclone/BMS), авастин (Genentech) и герцептин (Genentech/Hoffman la Roche). Другие противораковые средства включают без ограничения средства, раскрытые в патенте США № 7598028 и международной публикации № WO2008/100624, содержание которых тем самым включено посредством ссылки. Одно или несколько противораковых средств можно вводить либо одновременно с антителом или его антигенсвязывающей частью по настоящему изобретению, либо до или после их введения.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с апоптотическим средством, таким как ингибитор Bcl-xL или ингибитор Bcl-2 (B-клеточная лимфома 2) (например, ABT-199 (венетоклакс)) для лечения рака, такого как лейкоз, у субъекта. В одном варианте осуществления антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с ингибитором Bcl-xL для лечения рака. В одном варианте осуществления антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с венетоклаксом для лечения рака.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с ингибитором NAMPT (см. примеры ингибиторов в US 2013/0303509; AbbVie, Inc., включенном в данный документ посредством ссылки) для лечения субъекта, нуждающегося в этом. NAMPT (также известный как пре-B-клеточный колониестимулирующий фактор (PBEF) и висфатин) представляет собой фермент, который катализирует фосфорибозилирование никотинамида, и является ферментом, лимитирующим скорость в одном из двух путей, в которых реутилизируется NAD. В одном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к B7-H3 и ADC, описанные в данном документе, вводят в комбинации с ингибитором NAMPT для лечения рака у субъекта.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с SN-38, который представляет собой активный метаболит ингибитора топоизомеразы иринотекана.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, можно применять в комбинированной терапии с ингибитором PARP (поли-ADP-рибозополимеразы), например, велипарибом, для лечения рака, в том числе разновидностей рака молочной железы, яичника и немелкоклеточного рака легкого.
Дополнительные примеры дополнительных терапевтических средств, которые можно совместно вводить или составлять с антителами к B7-H3 или ADC с антителами к B7-H3, описанными в данном документе, включают без ограничения одно или несколько из следующего: вдыхаемые стероиды; бета-агонисты, например, бета-агонисты кратковременного или длительного действия; антагонисты лейкотриенов или рецепторов лейкотриенов; комбинация лекарственных средств, такая как ADVAIR; ингибиторы IgE, например, антитела к IgE (например, XOLAIR®, омализумаб); ингибиторы фосфодиэстеразы (например, ингибиторы PDE4); ксантины; антихолинергические лекарственные средства; средства, стабилизирующие тучные клетки, такие как кромолин; ингибиторы IL-4; ингибиторы IL-5; ингибиторы эотаксина/CCR3; антагонисты гистамина или его рецепторов, в том числе H1, H2, H3 и H4, а также антагонисты простогландина D или его рецепторов (DP1 и CRTH2). Такие комбинации можно применять для лечения, например, астмы и других респираторных нарушений. Другие примеры дополнительных терапевтических средств, которые можно совместно вводить и/или составлять с антителами к B7-H3 или ADC с антителами к B7-H3, описанными в данном документе, включают без ограничения одно или несколько из антитела к PD1 (например, пембролизумаб), антитела к PD-L1 (например, атезолизумаб), антитела к CTLA-4 (например, ипилимумаб), ингибитора MEK (например, траметиниб), ингибитора ERK, ингибитора BRAF (например, дабрафениб), осимертиниба (AZD9291), эрлотиниба, гефитиниба, сорафениба, ингибитора CDK9 (например, динациклиб), ингибитора MCL-1, темозоломида, ингибитора Bcl-xL, ингибитора Bcl-2 (например, венетоклакс), ибрутиниба, ингибитора mTOR (например, эверолимус), ингибитора PI3K (например, бупарлисиб), дувелисиба, иделалисиба, ингибитора AKT, ингибитора HER2 (например, лапатиниб), таксана (например, доцетаксел, паклитаксел, наб-паклитаксел), ADC, содержащего ауристатин, ADC, содержащего PBD (например, ровалпитузумаб тесирин), ADC, содержащего майтанзиноид (например, TDM1), агониста TRAIL, ингибитора протеасом (например, бортезомиб) и ингибитора никотинамидфосфорибозилтрансферазы (NAMPT). Дополнительные примеры терапевтических средств, которые можно вводить совместно и/или составлять с одним или несколькими антителами к B7-H3 или их фрагментами включают одно или несколько из антагонистов TNF (например, растворимого фрагмента рецептора TNF, например, рецептора p55 или p75 TNF человека или их производных, например, TNFR-IgG размером 75 кДа (слитый белок рецептор TNF-IgG размером 75 кДа, ENBREL)); антагонистов ферментов TNF, например, ингибиторов TNF-превращающего фермента (TACE); антагонистов мускаринового рецептора; антагонистов TGF-бета; интерферона гамма; перфенидона; химиотерапевтических средств, например, метотрексата, лефлуномида или сиролимуса (рапамицина) или их аналога, например, ингибиторов CCI-779; COX2 и cPLA2; NSAID; иммуномодуляторов; ингибиторов p38, ингибиторов TPL-2, MK-2 и NFkB.
Другими предпочтительными комбинациями являются цитокинсупрессивное(цитокинсупрессивные) противовоспалительное(противовоспалительные) лекарственное(лекарственные) средство(средства) (CSAID); антитела к другим цитокинам или факторам роста человека, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, интерферонам, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF и эндотелину-1, а также рецепторам таких цитокинов и факторов роста, или их антагонисты. Антитела по настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части можно комбинировать с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA, CTLA-4, PD-1, или их лигандам, в том числе CD154 (gp39 или CD40L).
Предпочтительные комбинации терапевтических средств могут обеспечивать нарушение в различных точках воспалительного каскада; предпочтительные примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела к TNF, адалимумаб (HUMIRA; D2E7; публикация согласно PCT № WO 97/29131 и патент США № 6090382, включенные в данный документ посредством ссылки), CA2 (RemicadeTM), CDP 571 и растворимые рецепторы TNF p55 или p75, их производные (p75TNFR1gG (EnbrelTM) или p55TNFR1gG (Lenercept)), а также ингибиторы TNF-превращающего фермента (TACE); аналогично ингибиторы IL-1 (ингибиторы интерлейкин-1-превращающего фермента, IL-1RA и т. д.) могут быть эффективными по той же причине. Другие предпочтительные комбинации включают интерлейкин 4.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или части антитела по настоящему изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое при необходимых дозах и периодах времени является эффективным для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может определить специалист в данной области техники, и оно может изменяться в соответствии с факторами, такими как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума и способность антитела или части антитела вызывать необходимый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является таким, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела, перевешиваются терапевтически полезными эффектами. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, которое при необходимых дозах и периодах времени является эффективным для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до проявления заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Схемы приема доз можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный требуемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ). Например, можно вводить одну болюсную дозу, несколько разделенных доз можно вводить в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать согласно требованиям терапевтической ситуации. Особенно целесообразно составлять парентеральные композиции в единичную лекарственную форму для простоты введения и однородного дозирования. Единичная лекарственная форма, как используется в данном документе, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных доз для субъектов-млекопитающих, подлежащих лечению; причем каждая единица содержит предварительно определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для единичной лекарственной формы по настоящему изобретению обусловлена и напрямую зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который нужно достигнуть, и (b) ограничений, свойственных для области техники составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Иллюстративный неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества ADC, антитела или части антитела по изобретению составляет 0,1-20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг. В одном варианте осуществления доза антитела или ADC, описанных в данном документе, составляет от 1 до 6 мг/кг, в том числе отдельные дозы, перечисленные в данном диапазоне, например, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг и 6 мг/кг. В другом варианте осуществления доза антитела или ADC, описанных в данном документе, составляет от 1 до 200 мкг/кг, том числе отдельные дозы, перечисленные в данном диапазоне, например, 1 мкг/кг, 2 мкг/кг, 3 мкг/кг, 4 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг, 30 мкг/кг, 40 мкг/кг, 50 мкг/кг, 60 мкг/кг, 80 мкг/кг, 100 мкг/кг, 120 мкг/кг, 140 мкг/кг, 160 мкг/кг, 180 мкг/кг и 200 мкг/кг. Следует отметить, что величины дозы могут варьировать в зависимости от типа и тяжести состояния, которое требуется ослабить. Также следует понимать, что для любого конкретного субъекта определенные схемы приема доз следует корректировать в зависимости от времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным мнением лица, осуществляющего введение или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, изложенные в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленной композиции на практике.
В одном варианте осуществления ADC с антителом к B7-H3, в том числе ADC, содержащий антитело huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в дозе от 0,1 до 30 мг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе 1-15 мг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе 1-10 мг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе 2-3. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе 1-4 мг/кг.
В одном варианте осуществления антитело к B7-H3 или ADC, описанные в данном документе, например, huAb13v1, huAb3v2.5 или huAb3v2.6, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например, субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 1 до 200 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 150 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 100 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 90 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 80 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 70 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 5 до 60 мкг/кг. В другом варианте осуществления антитело к B7-H3, например huAb13v1, huAb3v2.5, huAb3v2.6 или его антигенсвязывающую часть, вводят субъекту, нуждающемуся в этом, например субъекту, у которого имеется рак, в виде ADC в дозе от 10 до 80 мкг/кг.
Дозы, описанные выше, могут быть пригодны для введения либо ADC с антителом к B7-H3, либо антител, описанных в данном документе.
В другом аспекте в настоящей заявке предусмотрен способ выявления присутствия B7-H3 в образце in vitro (например, биологическом образце, таком как сыворотка крови, плазма, ткань, биоптат). Заявленный способ можно применять для диагностики нарушения, например рака. Способ предусматривает (i) приведение образца или контрольного образца в контакт с антителом к B7-H3 или его фрагментом, описываемыми в данном документе; и (ii) выявление образования комплекса между антителом к B7-H3 или его фрагментом и образцом или контрольным образцом, где статистически значимое изменение в отношении образования комплекса с образцом относительно контрольного образца указывает на присутствие B7-H3 в образце.
Исходя из их способности связываться с B7-H3 человека, антитела к B7-H3 человека или их части по настоящему изобретению (а также их ADC) можно применять для выявления B7-H3 человека (например, в биологическом образце, таком как сыворотка крови или плазма) с применением традиционного иммунологического анализа, такого как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или иммуногистохимия тканей. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ выявления B7-H3 человека в биологическом образце, предусматривающий приведение биологического образца в контакт с антителом или частью антитела по настоящему изобретению и выявление либо антитела (или части антитела), связанного с B7-H3 человека, либо несвязанного антитела (или части антитела), с выявлением таким образом B7-H3 человека в биологическом образце. Антитело непосредственно или опосредованно метят с помощью выявляемого вещества, чтобы упростить выявление связанного или несвязанного антитела. Подходящие выявляемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры подходящего радиоактивного материала включают 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho или 153Sm.
В качестве альтернативы мечению антитела B7-H3 человека можно количественно оценивать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммунологического анализа с использованием стандартов rhB7-H3, меченых детектируемым веществом, и немеченого антитела к B7-H3 человека. В данном анализе объединяют биологический образец, меченые стандарты rhB7-H3 и антитело к B7-H3 человека и определяют количество меченого стандарта rhB7-H3, связавшегося с немеченым антителом. Количество B7-H3 человека в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhB7-H3, связавшегося с антителом к B7-H3. Аналогично B7-H3 человека также можно количественно оценивать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммунологического анализа с использованием стандартов rhB7-H3, меченых детектируемым веществом, и немеченого антитела к B7-H3 человека.
В еще одном аспекте настоящей заявки предусмотрен способ выявления присутствия B7-H3 in vivo (например, in vivo визуализация у субъекта). Заявленный способ можно применять для диагностики нарушения, например B7-H3-ассоциированного нарушения. Способ предусматривает (i) введение антитела к B7-H3 или его фрагмента, описываемых в данном документе, субъекту или контрольному субъекту в условиях, которые обеспечивают возможность связывания антитела или фрагмента с B7-H3; и (ii) выявление образования комплекса между антителом или фрагментом и B7-H3, где статистически значимое изменение в образовании комплекса у субъекта относительно контрольного субъекта указывает на присутствие B7-H3.
VI. Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающую часть, или ADC по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции, содержащие антитела или ADC по настоящему изобретению, предназначены без ограничения для применения в диагностике, обнаружении или наблюдении за нарушением, в предупреждении, лечении, контроле или облегчении тяжести нарушения или одного или нескольких его симптомов и/или в исследовании. В конкретном варианте осуществления композиция содержит одно или несколько антител по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько антител или ADC по настоящему изобретению и одно или несколько профилактических или терапевтических средств, отличных от антител или ADC по настоящему изобретению, для лечения нарушения, при котором активность B7-H3 оказывает негативное воздействие. Предпочтительно известно, что профилактические или терапевтические средства являются пригодными для или уже применялись или в настоящее время применяются в предупреждении, лечении, контроле или облегчении нарушения или одного или нескольких его симптомов. В соответствии с этими вариантами осуществления композиция может дополнительно содержать носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
Антитела и части антител или ADC по настоящему изобретению можно включать в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или часть антитела по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т. п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из воды, солевого раствора, фосфатно-солевого буферного раствора, декстрозы, глицерина, этанола и т. п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут также содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела, или части антитела, или ADC.
Известны различные системы доставки, и их можно применять для введения одного или нескольких антител или ADC по настоящему изобретению или комбинации из одного или нескольких антител по настоящему изобретению и профилактического средства или терапевтического средства, пригодного для предупреждения, контроля, лечения или облегчения тяжести нарушения или одного или нескольких его симптомов, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные к экспрессии антитела или фрагмента антитела, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструирования нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т. д. Способы введения профилактического или терапевтического средства по настоящему изобретению включают без ограничений парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и введение через слизистые оболочки (например, интраназальный и пероральный пути). Кроме того, можно использовать легочное введение, например, с помощью применения ингалятора или аэрозольного ингалятора и состава со средством для образования аэрозоля. См., например, патенты США №№ 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации согласно PCT №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению, комбинированную терапию или композицию по настоящему изобретению вводят с применением технологии для легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Кембридж, Массачусетс). В конкретном варианте осуществления профилактические или терапевтические средства по настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно, внутрь опухоли, перорально, интраназально, в легкие или подкожно. Профилактические или терапевтические средства можно вводить с помощью любого традиционного пути введения, например с помощью инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистую оболочку рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т. д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.
В конкретном варианте осуществления может быть желательно вводить профилактические или терапевтические средства по настоящему изобретению местно в участок, требующий лечения; этого можно достичь, к примеру и не для ограничения, путем местной инфузии, путем инъекции или с помощью имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый или непористый материал, включающий мембраны и матрицы, такие как мембраны Sialastic, полимеры, волокнистые матрицы (например, Tissuel®) или коллагеновые матрицы. В одном варианте осуществления эффективное количество одного или нескольких антител-антагонистов по настоящему изобретению вводят местно в пораженный участок субъекта для предотвращения, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или его симптома. В другом варианте осуществления эффективное количество одного или нескольких антител по настоящему изобретению вводят субъекту местно в пораженный участок в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких терапевтических средств (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств), отличных от антитела по настоящему изобретению для предупреждения, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или одного или нескольких его симптомов.
В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство по настоящему изобретению может доставляться в системе с контролируемым высвобождением или пролонгированным высвобождением. В одном варианте осуществления для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения можно применять насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения терапевтических средств по настоящему изобретению можно применять полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); патент США № 5679377; патент США № 5916597; патент США № 5912015; патент США № 5989463; патент США № 5128326; публикацию согласно PCT № WO 99/15154 и публикацию согласно PCT № WO 99/20253. Примеры полимеров, применяемых в составах с пролонгированным высвобождением, включают без ограничений поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимер(этилена и винилацетата), поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимер (лактида и гликолидов) (PLGA) и сложные полиортоэфиры. В предпочтительном варианте осуществления полимер, применяемый в составе с пролонгированным высвобождением, является инертным, не содержит вымываемых примесей, стабилен при хранении, стерильный и биоразлагаемый. В еще одном варианте осуществления систему для контролируемого или пролонгированного высвобождения можно поместить вблизи профилактической или терапевтической мишени, в связи с этим требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Системы для контролированного высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science 249:1527-1533). Любую методику, известную специалисту в данной области техники, можно применять для получения составов с пролонгированным высвобождением, содержащих одно или несколько терапевтический средств по настоящему изобретению. См., например, патент США № 4526938, публикацию согласно PCT WO 91/05548, публикацию согласно PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 и Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В конкретном варианте осуществления, где композиция по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую профилактическое или терапевтический средство, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для обеспечения экспрессии закодированного в ней профилактического или терапевтического средства, путем конструирования ее как части соответствующего вектора для экспрессии нуклеиновой кислоты и введения ее таким образом, что она попадает внутрь клетки, например с помощью применения ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или с помощью прямой инъекции, или с помощью применения бомбардировки микрочастицами (например, генная пушка; биолистика, Dupont) или покрытия липидами, или рецепторами клеточной поверхности, или трансфицирующими средствами, или с помощью введения ее в сочетании с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота может быть введена внутрь клетки и встроена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии с помощью гомологической рекомбинации.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению составляют, чтобы она была совместима с ее предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают без ограничений парентеральное, например внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное, интраназальное (например, ингаляционное), трансдермальное (например, местное), трансмукозальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию составляют согласно традиционным процедурам как фармацевтическую композицию, предназначенную для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В случае необходимости композиция может также содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции.
Если способ по настоящему изобретению предусматривает интраназальное введение композиции, композиция может быть составлена в аэрозольной форме, спрее, мелкодисперсной форме или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения в соответствии с настоящим изобретением в целях удобства могут доставляться в форме выпуска аэрозольного спрея из находящихся под давлением упаковок или аэрозольного ингалятора, с применением подходящего пропеллента (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, углекислого газа или другого подходящего газа). В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозирования может определяться путем обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи (например, составленные из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть составлены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Если способ по настоящему изобретению предусматривает пероральное введение, композиции можно составлять для перорального введения в форме таблеток, капсул, саше, желатиновых капсул, растворов, суспензий и т. п. Таблетки или капсулы можно получать с помощью традиционных способов с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); нааполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или натрия крахмалгликолят) или смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Жидкие препараты для перорального введения без ограничений могут быть в форме растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены как сухой продукт для разбавления водой или другой подходящей средой перед применением. Такие жидкие препараты могут быть получены с помощью традиционных способов с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизованные пищевые жиры); эмульгирующие средства (например, лецитин или аравийская камедь); неводные среды (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также содержать буферные соли, ароматизаторы, красящие и подслащивающие средства, в зависимости от обстоятельств. Препараты для перорального введения могут быть соответственно составлены для медленного высвобождения, контролируемого высвобождение или пролонгированного высвобождения профилактического(профилактических) или терапевтического(терапевтических) средства(средств).
Способ по настоящему изобретению может предусматривать легочное введение композиции, составленной со средством для образования аэрозоля, например, путем применения ингалятора или аэрозольного ингалятора. См., например, патенты США №№ 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078 и публикации согласно PCT №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению, комбинированное средство терапии и/или композицию по настоящему изобретению вводят с применением технологии для легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Кембридж, Массачусетс).
Способ по настоящему изобретению может предусматривать введение композиции, составленной для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или продолжительной инфузии). Составы для инъекции могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы (например, в ампулах или многодозных контейнерах) с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средах и могут содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В качестве альтернативы активный ингредиент может находиться в форме порошка для разбавления с помощью подходящей среды (например, стерильной воды, не содержащей пирогены) перед применением.
Способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать введение композиций, составленных как препараты-депо. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или с помощью внутримышечной инъекции. Таким образом, например, композиции могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, как эмульсия в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в качестве умеренно растворимых производных (например, в качестве умеренно растворимой соли).
Способы по настоящему изобретению охватывают введение композиций, составленных в качестве нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, которые образованы с анионами, такими как происходящие от соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т. д., и соли, которые образованы с катионами, такими как происходящие от натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т. д.
В целом, ингредиенты композиций поставляются либо отдельно, либо смешанными вместе в единичную лекарственную форму, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, показывающие количество активного средства. Если способом введения является инфузия, композицию можно распределить в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду фармацевтической степени чистоты или солевой раствор. Если способом введения является инъекция, может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекции или солевым раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.
В частности, в настоящем изобретении также предусмотрено, что одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению упакованы в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или саше, показывающие количество средства. В одном варианте осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере и могут быть разведены (например, с помощью воды или солевого раствора) до концентрации, подходящей для введения субъекту. Предпочтительно одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере в единичной дозе, составляющей по меньшей мере 5 мг, по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по настоящему изобретению следует хранить при от 2°C до 8°C в их оригинальном контейнере и профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по настоящему изобретению следует вводить в пределах 1 недели, в пределах 5 дней, в пределах 72 часов, в пределах 48 часов, в пределах 24 часов, в пределах 12 часов, в пределах 6 часов, в пределах 5 часов, в пределах 3 часов или в пределах 1 часа после разведения. В альтернативном варианте осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, показывающем количество и концентрацию средства. Предпочтительно жидкая форма вводимой композиции поставляется в герметично закрытом контейнере из расчета по меньшей мере 0,25 мг/мл, по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/кг, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл. Жидкую форму следует хранить при значениях температуры от 2°C до 8°C в ее оригинальном контейнере.
Антитела и части антител по настоящему изобретению можно включать в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Предпочтительно антитело или части антитела будут получены в виде инъекционного раствора, содержащего 0,1-250 мг/мл антитела. Инъекционный раствор может быть составлен в виде либо жидкой, либо лиофилизированной лекарственной формы в сосуде из флинтового или янтарного стекла, ампуле или заранее заполненного шприца. Буфер может представлять собой L-гистидин (1-50 мМ), оптимально 5-10 мМ, при pH 5,0-7,0 (оптимально pH 6,0). Другие подходящие буферы включают без ограничений сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия можно применять для модифицирования токсичности раствора при концентрации, составляющей 0-300 мМ (оптимально 150 мМ в случае жидкой лекарственной формы). В случае лиофилизированной лекарственной формы могут быть включены криопротекторы, преимущественно 0-10% сахарозы (оптимально 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. В случае лиофилизированной лекарственной формы могут быть включены объемообразующие средства, преимущественно 1-10% маннита (оптимально 2-4%). Стабилизаторы можно применять как в жидкой, так и в лиофилизированной лекарственных формах, преимущественно 1-50 мМ L-метионина (оптимально 5-10 мМ). Другие подходящие объемообразующие средства включают глицин, аргинин, можно включать 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают без ограничений полисорбат 20 и поверхностно-активные вещества BRIJ. Фармацевтическая композиция, содержащая антитела и части антител по настоящему изобретению, полученная в виде инъекционного раствора для парентерального введения, может дополнительно содержать средство, пригодное в качестве адъюванта, как например применяемые для повышения всасывания или распространения терапевтического белка (например, антитела). Особенно пригодным адъювантом является гиалуронидаза, такая как Hylenex® (рекомбинантная гиалуронидаза человека). Добавление гиалуронидазы в инъекционный раствор улучшает биодоступность для человека после парентерального введения, в частности подкожного введения. Оно также делает возможным увеличение объема в месте инъекции (т. е. больше 1 мл) с уменьшением боли и дискомфорта и сведением к минимуму случаев реакций в месте инъекции. (См. WO2004078140, US2006104968, включенные в данный документ посредством ссылки).
Композиции по настоящему изобретению могут быть в виде самых разных форм. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции находятся в форме инъекционных или инфузионных растворов, таких как композиции, аналогичные тем, которые применяются при пассивной иммунизации людей с помощью других антител. Предпочтительным способом введения является парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят с помощью внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводят с помощью внутримышечной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы можно получить путем включения активного соединения (т. е. антитела или части антитела) в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, после стерилизации фильтрованием. В целом, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и требуемые остальные ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных, лиофилизированных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сушка распылением, которая обеспечивает порошок активного ингредиента с любым дополнительным необходимым ингредиентом из их предварительно простерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, с помощью поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и с помощью применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированного всасывания инъекционных композиций можно достигать путем включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, солей моностеаратов и желатина.
Антитела и части антител или ADC по настоящему изобретению можно вводить с помощью различных способов, известных из уровня техники, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будут варьировать, в зависимости от необходимых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получать с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, как например составы с контролируемым высвобождением, в том числе импланты, трансдермальное пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Множество способов для получения таких составов запатентованы или в целом известны специалистам в данной области техники. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела или ADC по настоящему изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым пищевым носителем. Соединение (и другие ингредиенты, в случае необходимости) также могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессованы в таблетки или введены напрямую в пищевой рацион субъекта. В случае перорального введения терапевтического средства, соединения могут быть объединены с вспомогательными веществами и применяться в форме проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т. п. Чтобы ввести соединение по настоящему изобретению с помощью введения, отличного от парентерального, может быть необходимо покрыть соединение с помощью материала для предупреждения его инактивации или ввести соединение совместно с ним.
В других вариантах осуществления антитело, или часть антитела, или ADC по настоящему изобретению можно конъюгировать с молекулой на основе полимера, так что указанная молекула на основе полимера может придавать указанным антителу или части антитела по настоящему изобретению соответствующий размер, так что указанные антитело или часть антитела по настоящему изобретению имеют преимущества от улучшенного эффекта проницаемости и удержания (EPR-эффект) (см. также публикацию согласно PCT № WO2006/042146A2, и публикации заявок на патент США №№ 2004/0028687A1, 2009/0285757A1 и 2011/0217363A1, и патент США № 7695719 (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей).
В композиции также можно включать вспомогательные активные соединения. В определенных вариантах осуществления антитело, или часть антитела, или ADC по настоящему изобретению составляют и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, которые пригодны для лечения нарушений, при которых активность B7-H3 оказывает негативное воздействие. Например, антитело к hB7-H3, или часть антитела, или ADC по настоящему изобретению можно составлять и/или вводить совместно с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антителами, которые связывают цитокины или которые связывают молекулы клеточной поверхности). Кроме того, одно или несколько антител по настоящему изобретению можно применять в комбинации с двумя или более из вышеописанных терапевтических средств. В таких видах комбинированной терапии можно с успехом использовать более низкие дозы вводимых терапевтических средств, таким образом избегая возможных проявлений токсичности или осложнений, ассоциированных с различными видами монотерапии.
В определенных вариантах осуществления антитело или ADC с антителом к B7-H3, или его фрагмент связаны со средой, удлиняющей время полужизни, известной из уровня техники. Такие среды включают без ограничений Fc-домен, полиэтиленгликоль и декстран. Такие среды описаны, например, в заявке на патент США с порядковым № 09/428082 и опубликованной заявке согласно PCT № WO 99/25044, которые настоящим включены посредством ссылки для любой цели.
Специалисты в данной области легко поймут, что другие подходящие модификации и адаптации способов по настоящему изобретению, описанному в данном документе, являются очевидными, и их можно проводить с применением подходящих эквивалентов без отступления от объема настоящего изобретения или вариантов осуществления, раскрытых в данном документе. После приведенного подробного описания настоящее изобретение можно будет лучше понять с помощью ссылки на следующие примеры, которые включены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения.
Примеры
Пример 1. Синтез иллюстративных ингибиторов Bcl-xL
В данном примере предусмотрены способы синтеза иллюстративных соединений W2.01 - W2.91, ингибирующих Bcl-xL. Ингибиторы Bcl-xL (W2.01 - W2.91) и синтоны (примеры 2.1-2.176) были названы с использованием ACD/Name 2012 года выпуска (версия 56084, 5 апреля 2012 г., Advanced Chemistry Development Inc., Торонто, Онтарио), ACD/Name 2014 года выпуска (версия 66687, 25 октября 2013 г., Advanced Chemistry Development Inc., Торонто, Онтарио), ChemDraw®, версия 9.0.7 (CambridgeSoft, Кембридж, Массачусетс), ChemDraw® Ultra, версия 12.0 (CambridgeSoft, Кембридж, Массачусетс) или ChemDraw® Professional, версия 15.0.0.106. Ингибитор Bcl-xL и промежуточные соединения синтонов были названы с использованием ACD/Name 2012 года выпуска (версия 56084, 5 апреля 2012 г., Advanced Chemistry Development Inc., Торонто, Онтарио), ACD/Name 2014 года выпуска (версия 66687, 25 октября 2013 г., Advanced Chemistry Development Inc., Торонто, Онтарио), ChemDraw®, версия 9.0.7 (CambridgeSoft, Кембридж, Массачусетс), ChemDraw® Ultra, версия 12.0 (CambridgeSoft, Кембридж, Массачусетс) или ChemDraw® Professional, версия 15.0.0.106.
1.1 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({2-[2-(карбоксиметокси)этокси]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.01)
1.1.1 3-Бром-5,7-диметиладамантанкарбоновая кислота
В круглодонную колбу объемом 50 мл при 0°C добавляли бром (16 мл). Добавляли железный порошок (7 г) и реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут. Добавляли 3,5-диметиладамантан-1-карбоновую кислоту (12 г). Смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 дней. В реакционную смесь выливали смесь льда и концентрированной HCl. Полученную в результате суспензию дважды обрабатывали с помощью Na2SO3 (50 г в 200 мл воды) и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические вещества промывали 1 н. водным раствором HCl, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.1.2 3-Бром-5,7-диметиладамантанметанол
В раствор вещества из примера 1.1.1 (15,4 г) в тетрагидрофуране (200 мл) добавляли BH3 (1 М в тетрагидрофуране, 150 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем реакционную смесь осторожно гасили путем добавления по каплям метанола. Затем смесь концентрировали под вакуумом и остаток распределяли между этилацетатом (500 мл) и 2 н. водным раствором HCl (100 мл). Водный слой дополнительно дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. После выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение.
1.1.3 1-((3-Бром-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил)-1H-пиразол
В раствор вещества из примера 1.1.2 (8,0 г) в толуоле (60 мл) добавляли 1H-пиразол (1,55 г) и цианометилентрибутилфосфоран (2,0 г), и смесь перемешивали при 90°C в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (гептан:этилацетат, 10:1) с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 324,2 (M+H)+.
1.1.4 2-{[3,5-Диметил-7-(1H-пиразол-1-илметил)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]окси}этанол
В раствор вещества из примера 1.1.3 (4,0 г) в этан-1,2-диоле (12 мл) добавляли триэтиламин (3 мл). Смесь перемешивали при 150°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator) в течение 45 минут. Смесь выливали в воду (100 мл) и три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. После выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 305,2 (M+H)+.
1.1.5 2-({3,5-Диметил-7-[(5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этанол
В охлажденный (-78°C) раствор вещества из примера 1.1.4 (6,05 г) в тетрагидрофуране (100 мл) добавляли n-BuLi (40 мл, 2,5 М в гексане) и смесь перемешивали при -78°C в течение 1,5 часа. Добавляли йодметан (10 мл) с помощью шприца и смесь перемешивали при -78°C в течение 3 часов. Затем реакционную смесь гасили водным раствором NH4Cl и дважды экстрагировали этилацетатом и объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором. После высушивания над сульфатом натрия раствор фильтровали и концентрировали и остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 319,5 (M+H)+.
1.1.6 1-({3,5-Диметил-7-[2-(гидрокси)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-4-йод-5-метил-1H-пиразол
В раствор вещества из примера 1.1.5 (3,5 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли N-йодсукцинимид (3,2 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (600 мл) и промывали водным раствором NaHSO3, водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 445,3 (M+H)+.
1.1.7 1-((3-(2-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-4-йод-5-метил-1H-пиразол
Добавляли трет-бутилдиметилсилилтрифторметансульфонат (5,34 мл) в раствор вещества из примера 1.1.6 (8,6 г) и 2,6-лутидина (3,16 мл) в дихлорметане (125 мл) при -40°C, и обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 5-20% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 523,4 (M+H)+.
1.1.8 1-((3-(2-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол
Добавляли н-бутиллитий (8,42 мл, 2,5 М в гексанах) к веществу из примера 1.1.7 (9,8 г) в 120 мл тетрагидрофурана при -78°C и реакционную смесь перемешивали в течение 1 минуты. Добавляли триметилборат (3,92 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут. Добавляли пинакол (6,22 г) и обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры и ее перемешивали 2 часа. Реакцию гасили буфером с pH 7 и смесь выливали в простой эфир. Слои разделяли и органический слой концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 1 до 25% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.1.9 6-Фтор-3-бромпиколиновая кислота
Добавляли взвесь 6-амино-3-бромпиколиновой кислоты (25 г) в 400 мл дихлорметана/хлороформа, 1:1, к тетрафторборату нитрозония (18,2 г) в дихлорметане (100 мл) при 5°C в течение 1 часа. Полученную смесь перемешивали в течение еще 30 минут, затем нагревали до 35°C и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем регулировали pH до 4 с помощью водного раствора NaH2PO4. Полученный раствор три раза экстрагировали дихлорметаном и объединенные экстракты промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.1.10 трет-Бутил-3-бром-6-фторпиколинат
Добавляли пара-толуолсульфонилхлорид (27,6 г) в раствор вещества из примера 1.1.9 (14,5 г) и пиридина (26,7 мл) в дихлорметане (100 мл) и трет-бутаноле (80 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут и затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Раствор концентрировали и разделяли между этилацетатом и водным раствором Na2CO3. Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом. Органические слои объединяли, прополаскивали водным раствором Na2CO3 и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.1.11 Метил-2-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилата гидрохлорида (12,37 г) и вещества из примера 1.1.10 (15 г) в диметилсульфоксиде (100 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (12 мл) и смесь перемешивали при 50°C в течение 24 часов. Затем смесь разбавляли этилацетатом (500 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гексане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 448,4 (M+H)+.
1.1.12 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Нагревали смесь вещества из примера 1.1.11 (3,08 г), вещества из примера 1.1.8 (5 г), трис(дибензилиденацетон)дипалладия(0) (126 мг), 1,3,5,7-тетраметил-8-тетрадецил-2,4,6-триокса-8-фосфоадамантана (170 мг) и K3PO4 (3,65 г) в 1,4-диоксане (25 мл) и воде (25 мл) до 90°C в течение 2 часов. Смесь охлаждали и выливали в диэтиловый эфир:этилацетат, 1:1. Слои разделяли и органический слой промывали насыщенным водным раствором NaH2PO4, водой (2x) и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 1 до 25% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 799,6 (M+H)+.
1.1.13 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Перемешивали вещество из примера 1.1.12 (5 г) и моногидрат гидроксида лития (0,276 г) вместе в смеси растворителей из тетрагидрофурана (50 мл), метанола (5 мл) и воды (15 мл) при 70°C в течение 2 дней. Реакционную смесь охлаждали, подкисляли 1 М водным раствором HCl и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане (100 мл), охлаждали до -40°C и добавляли 2,6-лутидин (1,8 мл) и трет-бутилдиметилсилилтрифторметансульфонат (3,28 г). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры и ее перемешивали в течение 2 часов. Смесь разбавляли простым эфиром и слои разделяли. Органический слой концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране и обрабатывали насыщенным водным раствором K2CO3 в течение 1 часа. Данную смесь подкисляли концентрированной HCl и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 10 до 100% этилацетата в гептанах, затем 5% метанолом в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 785,6 (M+H)+.
1.1.14 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали вещество из примера 1.1.13 (970 мг), N,N-диизопропилэтиламин (208 мг) и 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфат (HATU) (970 мг) в 7 мл N,N-диметилформамида при 0°C в течение 10 минут. Добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (278 мг) и смесь перемешивали в течение 24 часов при 50°C. Смесь охлаждали и разбавляли этилацетатом. Органический слой промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (50 мл) и добавляли фторид тетрабутиламмония (10 мл, 1 М в тетрагидрофуране). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, выливали в этилацетат и промывали буфером с pH 7 и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 10 до 100% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 803,7 (M+H)+.
1.1.15 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-оксоэтокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.1.14 (100 мг) в дихлорметане (1,3 мл) при температуре окружающей среды добавляли перйодинан Десса-Мартина (58,1 мг) одной порцией. Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часа и добавляли дополнительное количество перйодинана Десса-Мартина (8 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и гасили путем добавления ~10% водного раствора NaOH и дихлорметана. Слои разделяли и органический слой промывали ~10% водным раствором NaOH. Органический слой высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении до получения твердого вещества, которое применяли в последующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 801,3 (M+H)+.
1.1.16 2-(2-(2-((2-((3-((4-(6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)этокси)этокси)уксусная кислота
В раствор 2-(2-(2-аминоэтокси)этокси)уксусной кислоты (22 мг) и вещества из примера 1.1.15 (100 мг) в метаноле (1,3 мл) при температуре окружающей среды добавляли MP-CNBH3 (65 мг, нагрузка 2,49 ммоль/г). Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение ночи и фильтровали через фильтр 0,4 микрона. Неочищенный материал очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 948,3 (M+H)+.
1.1.17 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-(2-(карбоксиметокси)этокси)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.1.16 (15 мг) в дихлорметане (1 мл) при температуре окружающей среды добавляли трифторуксусную кислоту (1 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,70 (bs, 2H), 8,29 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,53-7,42 (m, 3H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (bs, 2H), 4,03 (s, 2H), 3,90 (t, 2H), 3,84 (s, 2H), 3,68 (t, 2H), 3,63-3,54 (m, 6H), 3,17-3,04 (m, 4H), 3,00 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,45-1,40 (m, 2H), 1,36-1,20 (m, 4H), 1,21-0,96 (m, 7H), 0,91-0,81 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 892,3 (M+H)+.
1.2 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.02)
1.2.1 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.1.11 (2,25 г) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (205 мг) в ацетонитриле (30 мл) добавляли триэтиламин (3 мл) и пинаколборан (2 мл) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 3 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гексане, получали указанное в заголовке соединение.
1.2.2 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.2.1 (2,25 г) в тетрагидрофуране (30 мл) и воде (10 мл) добавляли вещество из примера 1.1.6 (2,0 г), 1,3,5,7-тетраметил-6-фенил-2,4,8-триокса-6-фосфоадамантан (329 мг), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (206 мг) и трехосновный фосфат калия (4,78 г). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи, охлаждали и разбавляли этилацетатом (500 мл). Полученную смесь промывали водой и солевым раствором и органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.3 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В холодный раствор вещества из примера 1.2.2 (3,32 г) в дихлорметане (100 мл) на ледяной бане последовательно добавляли триэтиламин (3 мл) и метансульфонилхлорид (1,1 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.4 Метил-2-(5-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.2.3 (16,5 г) в N,N-диметилформамиде (120 мл) добавляли азид натрия (4,22 г). Смесь нагревали при 80°C в течение 3 часов, охлаждали, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.5 2-(5-(1-((3-(2-Азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.4 (10 г) в смеси из тетрагидрофурана (60 мл), метанола (30 мл) и воды (30 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (1,2 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и нейтрализовали с помощью 2% водного раствора HCl. Полученную смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате (800 мл) и промывали солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.6 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Нагревали смесь вещества из примера 1.2.5 (10 г), бензо[d]тиазол-2-амина (3,24 г), фтор-N,N,N',N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфата (5,69 г) и N,N-диизопропилэтиламина (5,57 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) при 60°C в течение 3 часов, охлаждали и разбавляли этилацетатом. Полученную смесь промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.7 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.2.6 (2,0 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли Pd/C (10%, 200 мг). Смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи. Нерастворимый материал отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.8 трет-Бутил-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.2.7 (500 мг) в N,N-диметилформамиде (8 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (334 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и добавляли метиламин (0,3 мл) для гашения реакции. Полученную смесь перемешивали в течение 20 минут и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой с применением системы Analogix (колонка C18), с элюированием от 50 до 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
1.2.9 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.2.8 (200 мг) в дихлорметане (5 мл) трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,40-7,49 (s, 1H), 7,31-7,39 (m, 2 1H), (s, (s, 1H), (d, 1 2 1H), 2 ), 1H), 2 (s, 1H), 2 ),, 1H), ), ), 1H), ), 3,00 1H), ), (s, (t,H), ), (s, 1H), ), ), (s,H), ), 1,22-1,34 2 (s,H), 0,94-1,18 ), 1H), 0,85 (s, 6H). MS ),ESI) масса/электрон 854,1 (M+H)+.
1.3 Синтез 2-{[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}этил)сульфонил]амино}-2-дезокси-D-глюкопиранозы (соединения W2.03)
1.3.1 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.2.7 (200 мг) в дихлорметане (2,5 мл) трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 746,2 (M+H)+.
1.3.2 (3R,4R,5S,6R)-6-(Ацетоксиметил)-3-(винилсульфонамидо)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триилтриацетат
В суспензию (3R,4R,5S,6R)-6-(ацетоксиметил)-3-аминотетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триилтриацетата (7,7 г) в дихлорметане (100 мл) при 0°C добавляли 2-хлорэтансульфонилхлорид (4,34 г). Смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут и добавляли триэтиламин (12,1 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа, нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 дней. Смесь разбавляли дихлорметаном и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.3.3 N-((3R,4R,5S,6R)-2,4,5-Тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3-ил)этенсульфонамид
В раствор вещества из примера 1.3.2 (6,74 г) в метаноле (150 мл) добавляли триэтиламин (10 мл). Смесь перемешивали в течение 4 дней и концентрировали. Остаток растворяли в метаноле и обрабатывали с помощью Dowex HCR-5 до тех пор, пока раствор не становился нейтральным. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии с применением колонки Sephadex LH-20 (100 г), с элюированием метанолом, с получением указанного в заголовке соединения.
1.3.4 2-{[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}этил)сульфонил]амино}-2-дезокси-D-глюкопираноза
Перемешивали смесь вещества из примера 1.3.1 (23,5 мг), вещества из примера 1.3.3 (42,4 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (55 мкл) в N,N-диметилформамиде (1 мл) и воде (0,3 мл) в течение 5 дней. Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,55-7,66 (m, 1H), 7,46-7,54 (m, 1H), 7,42-7,47 (m, 1H), 7,33-7,40 (s, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 4,96 (s, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 2,97-3,14 (s, 1H), 2,10 (s, 1H), 1,44 (s,, 6H), (m, (s, 1H), (m, 6 ),H), (s, 6 ).HMS ESI(s, ) 1015,3 (M+H).
1.4 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
1.5 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(4-{[(3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил]метил}бензил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.05)
1.5.1 [4-((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-Трис-метоксиметокси-6-метоксиметоксиметилтетрагидропиран-2-илметил)фенил]метанол
Указанное в заголовке соединение получали согласно J. R. Walker et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3038-3048. MS (ESI) масса/электрон 478 (M+NH4)+.
1.5.2 4-((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-Трис-метоксиметокси-6-метоксиметоксиметилтетрагидропиран-2-илметил)бензальдегид
Растворяли вещество из примера 1.5.1 (1,000 г) в дихлорметане (25 мл) и добавляли перйодинан Десса-Мартина (1,013 г). Раствор перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Раствор разбавляли диэтиловым эфиром (25 мл) и добавляли 2 М водный раствор карбоната натрия (25 мл). Смесь три раза экстрагировали диэтиловым эфиром. Органические экстракты объединяли, промывали солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации раствор концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 50 до 70% этилацетата в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 476 (M+NH4)+.
1.5.3 (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-Триацетокси-6-(4-формилбензил)тетрагидропиран-2-илметиловый сложный эфир уксусной кислоты
Растворяли вещество из примера 1.5.2 (660 мг) в метаноле (145 мл). Добавляли 6 М хлористоводородную кислоту (8 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение двух дней. Растворители удаляли при пониженном давлении посредством азеотропной перегонки с этилацетатом три раза. Материал высушивали под вакуумом в течение четырех дней. Материал растворяли в N,N-диметилформамиде (50 мл). Добавляли последовательно уксусный ангидрид (12 мл), пиридин (6 мл) и N,N-диметилпиридин-4-амин (10 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Раствор разбавляли водой (150 мл) и три раза экстрагировали этилацетатом (50 мл). Органические вещества объединяли, промывали водой, промывали солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации раствор концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 40 до 50% этилацетата в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения.
1.5.4 (2R,3R,4R,5S)-2-(Ацетоксиметил)-6-(4-(((2-((3-((4-(6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)метил)бензил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 1.5.7 (40 мг) и вещество из примера 1.5.3 (22,5 мг) перемешивали в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавляли триацетоксиборогидрид натрия (14 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Материал очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 10% метанолом в дихлорметане. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1236 (M+H)+.
1.5.5 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(4-{[(3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил]метил}бензил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Растворяли вещество из примера 1.5.4 (68 мг) в метаноле (0,5 мл). Добавляли водный раствор гидроксида лития (2 М, 1 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 4,5 часа. Добавляли уксусную кислоту (0,1 мл) и растворители удаляли под вакуумом. Затем материал растворяли в трифторуксусной кислоте (2 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Раствор концентрировали под вакуумом. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением PLC 2020 от Gilson с колонкой C18, 150×30 мм, с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (bs, 1H), 8,68 (bs, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,51-7,43 (m, 3H), 7,39-7,24 (m, 6H), 6,96 (d, 1H), 5,23 (t, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,56 (d, 1H), 4,42 (dd, 1H), 4,11 (m, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H),3,22 (t, 1H), 3,15 (t, 1H), 3,09 (d, 1H), 3,01 (m, 6H), 2,89 (t, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,14 (m, 4H), 1,03 (q, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1012 (M+H)+.
1.6 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.06)
1.6.1 3-((2-((3-((4-(6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)пропан-1-сульфоновая кислота
Нагревали смесь вещества из примера 1.2.7 (100 мг), 1,2-оксатиолан-2,2-диоксида (13 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (19,07 мкл) в N,N-диметилформамиде (2 мл) до 50°C в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 924,1 (M+H)+.
1.6.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.6.1 (40 мг) в дихлорметане (2,5 мл) трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,52 (s, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,41-7,55 (s, 3H), 7,32-7,39 (m, 1H), 7,29 (s, 2H), 6,96 (s, 3H), 4,96 (s, 3H), 3,89 (s, 2H), 3,49-3,58 (s, 3H), 2,94-3,12 (s, 3H), 2,56-2,64 (s, 2H), 1,88-1,99 (s, 3H), 1,41 (s, 2H), 1,22-1,36 (s, 3H), 0,96-1,20 (s, 6H), 0,86 (s, 2H). MS (ESI) масса/электрон 868,3 (M+H)-.
1.7 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2,3-дигидроксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.07)
В раствор вещества из примера 1.2.7 (30 мг) в дихлорметане (3 мл) добавляли 2,3-дигидроксипропаналь (3,6 мг) и NaCNBH3 на смоле (200 мг). Смесь перемешивали в течение ночи, фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 3 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,27 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (t, 1H), 7,33-7,54 (m, 6H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 3H), 3,72-3,89 (m, 8H), 3,25-3,64 (m, 6H), 2,99-3,10 (m, 4H), 2,11 (s, 3H), 1,00-1,52 (m, 8H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 820,3 (M+H)+.
1.8 Синтез 2-({[4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил]сульфонил}амино)-2-дезокси-бета-D-глюкопиранозы (соединения W2.08)
1.8.1 (2R,3S,4S,5R,6S)-6-(Ацетоксиметил)-3-(4-формилфенилсульфонамидо)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триилтриацетат
Добавляли 4-формилбензол-1-сульфонилхлорид (100 мг) и (2S,3R,4R,5S,6R)-6-(ацетоксиметил)-3-аминотетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триилтриацетата гидрохлорид (563 мг) к 1,2-дихлорэтану (4 мл). Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,51 мл) и раствор нагревали при 55°C в течение трех дней. Раствор концентрировали при пониженном давлении и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием 70% этилацетатом в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и материал растворяли в ацетоне (4 мл). Добавляли хлористоводородную кислоту (1 М, 4 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем раствор экстрагировали 70% этилацетатом в гептанах (20 мл). Органический слой промывали солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 514 (M+H)+.
1.8.2 (2R,3S,4S,5R,6S)-6-(Ацетоксиметил)-3-(4-(((2-((3-((4-(6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)метил)фенилсульфонамидо)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триилтриацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.8.1 веществом из примера 1.5.3 в примере 1.5.4. MS (ESI) масса/электрон 1301 (M+H)+.
1.8.3 2-({[4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил]сульфонил}амино)-2-дезокси-бета-D-глюкопираноза
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.8.1 на вещество из примера 1.5.4 в примере 1.5.5. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (bs, 1H), 8,87 (bs, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,91 (d, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,70-7,55 (m, 3H), 7,52-7,42 (m, 3H), 7,39-7,33 (m, 2H), 7,29 (m, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (bs, 2H), 4,85 (dd, 1H), 4,62-4,52 (m, 2H), 4,32 (m, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,70-3,35 (m, 10H), 3,02 (m, 4H), 2,91 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,44 (bs, 2H), 1,37-1,22 (m, 4H), 1,18-0,98 (m, 6H), 0,93-0,82 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1075 (M+H)+.
1.9 Синтез 8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({2-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (соединения W2.09)
1.9.1 (2R,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-Гидроксиэтил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-азидо-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (720 мг) в трет-бутаноле (8 мл) и воде (4 мл) добавляли бут-3-ин-1-ол (140 мг), пентагидрат сульфата меди(II) (5,0 мг) и аскорбат натрия (40 мг). Смесь перемешивали 20 минут при 100°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 430,2 (M+H)+.
1.9.2 (2S,3S,4S,5R,6R)-2-(Метоксикарбонил)-6-(4-(2-оксоэтил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор диметилсульфоксида (0,5 мл) в дихлорметане (10 мл) при -78°C добавляли оксалилхлорид (0,2 мл). Смесь перемешивали 20 минут при -78°C и добавляли раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-гидроксиэтил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (233 мг) в дихлорметане (10 мл) с помощью шприца. Через 20 минут в смесь добавляли триэтиламин (1 мл) и смесь перемешивали в течение 30 минут, при этом обеспечивали повышение температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 429,2 (M+H)+.
1.9.3 8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({2-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]этил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин
В раствор вещества из примера 1.3.1 (150 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли вещество из примера 1.9.2 (86 мг) и NaBH3CN на смоле (2,49 ммоль/г, 200 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Затем реакционную смесь фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране/метаноле/H2O (2:1:1, 12 мл) и добавляли моногидрат гидроксида лития (50 мг). Смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,48 (s, 2H), 8,20 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,32-7,53 (m, 5H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 5,66 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,00 (d, 1H), 3,76-3,92 (m, 6H), 3,22-3,26 (m, 2H), 2,96-3,15 (m, 8H), 2,10 (s, 3H), 0,99-1,52 (m, 14H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1028,3 (M+H)+.
1.10 Синтез 3-[1-({3-[2-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.10)
1.10.1 2-(2-((3-((1H-Пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этокси)этанол
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.1.4, путем замещения этан-1,2-диола 2,2'-оксидиэтанолом. MS (ESI) масса/электрон 349,2 (M+H)+.
1.10.2 2-(2-((3,5-Диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)окси)этокси)этанол
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.1.5, путем замещения вещества из примера 1.1.4 веществом из примера 1.10.1. MS (ESI) масса/электрон 363,3 (M+H)+.
1.10.3 2-(2-((3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этокси)этанол
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.1.6, путем замещения вещества из примера 1.1.5 веществом из примера 1.10.2. MS (ESI) масса/электрон 489,2 (M+H)+.
1.10.4 2-(2-((3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этокси)этил метансульфонат
в охлажденный раствор вещества из примера 1.10.3 (6,16 г) в дихлорметане (100 мл) добавляли триэтиламин (4,21 г) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (1,6 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Затем реакционную смесь разбавляли этилацетатом (600 мл) и промывали водой и солевым раствором. После высушивания над сульфатом натрия раствор фильтровали и концентрировали и остаток применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 567,2 (M+H)+.
1.10.5 2-(2-((3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этокси)этанамин
Перемешивали раствор вещества из примера 1.10.4 (2,5 г) в 7 н. растворе аммиака в метаноле (15 мл) при 100°C в течение 20 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Реакционную смесь концентрировали под вакуумом и остаток разбавляли этилацетатом (400 мл) и промывали водным раствором NaHCO3, водой и солевым раствором. После высушивания над сульфатом натрия раствор фильтровали и концентрировали и остаток применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 488,2 (M+H)+.
1.10.6 трет-Бутил-(2-(2-((3-((4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этокси)этил)карбамат
В раствор вещества из примера 1.10.5 (2,2 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,26 г) и 4-диметиламинопиридин (100 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа и разбавляли этилацетатом (300 мл). Раствор промывали насыщенным водным раствором NaHCO3, водой (60 мл) и солевым раствором (60 мл). Органический слой высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 588,2 (M+H)+.
1.10.7 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.2.2, путем замещения вещества из примера 1.1.6 веществом из примера 1.10.6. MS (ESI) масса/электрон 828,5 (M+H)+.
1.10.8 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.2.5, путем замещения вещества из примера 1.2.4 веществом из примера 1.10.7. MS (ESI) масса/электрон 814,5 (M+H)+.
1.10.10 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.2.6, путем замещения вещества из примера 1.2.5 веществом из примера 1.10.8. MS (ESI) масса/электрон 946,2 (M+H)+.
1.10.11 3-(1-((3-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали как в примере 1.1.17, путем замещения вещества из примера 1.1.16 веществом из примера 1.10.9.
1.10.12 3-[1-({3-[2-(2-{[4-(бета-D-Аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.10.10 (88 мг) и триэтиламина (0,04 мл) в дихлорметане (1,5 мл) добавляли 4-(((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегид (27,7 мг), метанол (1 мл), MP-CNBH3 (2,49 ммоль/г, 117 мг) и уксусную кислоту (18 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 7,99 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,40-7,50 (m, 2H), 7,29-7,39 (m, 6H), 6,96 (d, 2H), 6,76 (d, 1H), 5,11 (d, 2H), 4,92 (s, 2H), 3,83-3,96 (m, 4H), 3,77 (s, 2H), 3,60-3,72 (m, 4H), 3,01 (d, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,09 (s, 3H), 0,98-1,32 (m, 14H), 0,82 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1058,3 (M+H)+.
1.11 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.11)
1.11.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-(2-аминоэтокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.10.9 (6,8 г) в 50% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане (10 мл) и перемешивали в течение 20 минут и растворители удаляли под вакуумом. Остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 790,2(M+H)+.
1.11.2 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(2-((2-(феноксисульфонил)этил)амино)этокси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.11.1 (200 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (146 мкл) в тетрагидрофуране (3 мл) при 0°C добавляли фенилэтенсульфонат (46 мг). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут, постепенно нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение ночи и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.11.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(2-((2-(феноксисульфонил)этил)амино)этокси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Раствор вещества из примера 1.11.2 (100 мг) в дихлорметане (5 мл) обрабатывали трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 974,9 (M+H)+.
1.11.4 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.11.3 (195 мг) в тетрагидрофуране (3 мл) и метаноле (2 мл) медленно добавляли 1 М водный раствор гидроксида натрия (2 мл). Смесь перемешивали в течение ночи и добавляли пеллеты NaOH (0,5 г). Полученную смесь нагревали при 40°C в течение 3 часов, охлаждали и концентрировали. Концентрат очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в 10 мМ водном растворе NH4OAc, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,41-7,51 (m, 3H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,88 (d, 1H), 4,93 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,60-3,66 (m, 4H), 3,13-3,19 (m, 2H), 3,05-3,10 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,79 (t, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,34 (s, 2H), 1,26 (s, 4H), 0,96-1,22 (m, 6H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 898,2 (M+H)+.
1.12 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.12)
1.12.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-(диэтоксифосфорил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.2.7 (307 мг) в тетрагидрофуране (5 мл) добавляли диэтилвинилфосфонат (176 мг) в воде (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 3 дней и добавляли несколько капель уксусной кислоты. Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием 10-70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 966,8 (M+H)+.
1.12.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.12.1 (170 мг) в дихлорметане (2,5 мл) добавляли бромтриметилсилан (82 мкл) и аллилтриметилсилан (50,4 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и добавляли воду (0,02 мл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,35 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,41-7,53 (m, 3H), 7,33-7,40 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,09 (s, 4H), 3,01 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,85-2,00 (m, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,19-1,37 (m, 4H), 1,14 (s, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (APCI) масса/электрон 854,4 (M+H)+.
1.13 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.13)
1.13.1 2-({3-[(4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этилметансульфонат
В охлажденный раствор вещества из примера 1.1.6 (6,16 г) в дихлорметане (100 мл) добавляли триэтиламин (4,21 г) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (1,6 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (600 мл) и промывали водой и солевым раствором. После высушивания над сульфатом натрия раствор фильтровали и концентрировали и остаток применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 523,4 (M+H)+.
1.13.2 1-({3,5-Диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-4-йод-5-метил-1H-пиразол
Перемешивали раствор вещества из примера 1.13.1 (2,5 г) в 2 М метиламине в метаноле (15 мл) при 100°C в течение 20 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Реакционную смесь концентрировали под вакуумом и остаток разбавляли этилацетатом (400 мл) и промывали водным раствором NaHCO3, водой и солевым раствором. После высушивания над сульфатом натрия раствор фильтровали и концентрировали и остаток применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 458,4 (M+H)+.
1.13.3 трет-Бутил-[2-({3-[(4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]метилкарбамат
В раствор вещества из примера 1.13.2 (2,2 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,26 г) и каталитическое количество 4-диметиламинопиридина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа и разбавляли этилацетатом (300 мл). Раствор промывали насыщенным водным раствором NaHCO3, водой (60 мл) и солевым раствором (60 мл). Органический слой высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 558,5 (M+H)+.
1.13.4 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.2.1 (4,94 г) в тетрагидрофуране (60 мл) и воде (20 мл) добавляли вещество из примера 1.13.3 (5,57 г), 1,3,5,7-тетраметил-8-тетрадецил-2,4,6-триокса-8-фосфоадамантан (412 мг), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (457 мг) и K3PO4 (11 г) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждали и разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 799,1 (M+H)+.
1.13.5 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.13.4 (10 г) в тетрагидрофуране (60 мл), метаноле (30 мл) и воде (30 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (1,2 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Реакционную смесь нейтрализовали 2% водным раствором HCl и концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли этилацетатом (800 мл), и промывали водой и солевым раствором, и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 785,1 (M+H)+.
1.13.6 трет-Бутил-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(трет-бутоксикарбонил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.13.5 (10 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (3,24 г), фтор-N,N,N',N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфат (5,69 г) и N,N-диизопропилэтиламин (5,57 г), и смесь перемешивали при 60°C в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (800 мл), и промывали водой и солевым раствором, и высушивали над сульфатом натрия. В результате фильтрации и выпаривания растворителя и очистки остатка на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 915,5 (M+H)+.
1.13.7 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.13.6 (5 г) в дихлорметане (20 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (10 мл) и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель выпаривали под вакуумом и остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 10 мл). Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой с применением системы Analogix и колонки C18 (300 г), и с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила и 0,1% раствора трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения.
1.13.8 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-сульфопропановой кислоты (0,020 г), N,N-диизопропилэтиламина (0,045 мл) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU, 0,020 г) вместе в N,N-диметилформамиде (0,75 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 30 минут добавляли вещество из примера 1.13.7 (0,039 г) и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительно 1 часа. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,027 мл) и перемешивание продолжали в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли водой (0,75 мл) и N,N-диметилформамидом (1 мл), нейтрализовали трифторуксусной кислотой (0,039 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,89 (s, 1H), 8,11-8,02 (m, 4H), 7,84 (d, 1H), 7,66 (d, 1H), 7,60-7,45 (m, 3H), 7,45-7,36 (m, 2H), 7,34 (d, 1H), 7,00 (dd, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,57-4,40 (m, 1H), 3,93 (t, 2H), 3,90-3,84 (m, 2H), 3,58-3,43 (m, 2H), 3,41-3,21 (m, 2H), 3,18-3,02 (m, 3H), 2,95-2,85 (m, 2H), 2,76 (td, 2H), 2,14 (d, 3H), 1,51-0,85 (m, 18H). MS (ESI) масса/электрон 911,2 (M+H)+.
1.14 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.14)
1.14.1 Ди-трет-бутил-(3-гидроксипропил)фосфонат
Добавляли NaH (60% в минеральном масле, 400 мг) к ди-трет-бутилфосфонату (1,93 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавляли (3-бромпропокси)(трет-бутил)диметилсилан (2,1 г) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли диэтиловым эфиром (300 мл) и раствор три раза промывали водой и солевым раствором, затем высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в 20 мл тетрагидрофурана и добавляли фторид тетрабутиламмония (TBAF, 1 М в тетрагидрофуране, 9 мл). Раствор перемешивали в течение 20 минут и затем добавляли буфер с pH 7 (50 мл). Смесь поглощали диэтиловый эфиром и разделяли, и органический слой промывали солевым раствором и затем концентрировали. Неочищенный продукт подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 10 до 100% этилацетата в гептанах, затем 5% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения.
1.14.2 Ди-трет-бутил-(3-оксопропил)фосфонат
Перемешивали вещество из примера 1.14.1 (200 мг) и перйодинан Десса-Мартина (370 мг) в дихлорметане (5 мл) в течение 2 часов. Смесь поглощали этилацетатом и дважды промывали 1 М водным раствором NaOH и солевым раствором и затем концентрировали. Неочищенный продукт подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 50 до 100% этилацетата в гептанах, затем 10% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения.
1.14.3 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((3-(диэтоксифосфорил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.10.11, путем замены вещества из примера 1.10.10 и 4-(((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегида веществом из примера 1.2.7 и веществом из примера 1.14.2 соответственно. MS (APCI) масса/электрон 980,9 (M+H)+.
1.14.5 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.12.2, путем замены вещества из примера 1.12.1 веществом из примера 1.14.3. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,37 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,42-7,53 (m, 3H), 7,33-7,40 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,86-3,93 (m, 2H), 3,52-3,59 (s, 2H), 2,93-3,06 (s, 6H), 2,10 (m, 2H), 1,71-1,89 (s, 3H), 1,53-1,65 (m, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,23-1,37 (m, 6H), 0,96-1,19 (s, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (APCI) масса/электрон 868,3 (M+H)+.
1.15 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.15)
Растворяли раствор (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-сульфопропановой кислоты (0,050 г) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,049 г) в N,N-диметилформамиде (1 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,102 мл). После перемешивания в течение 15 минут добавляли вещество из примера 1.3.1 (0,100 г) и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительно 3 часов. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,061 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь нейтрализовали 2,2,2-трифторуксусной кислотой (0,090 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,63 (t, 1H), 8,15-8,01 (m, 4H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,56-7,41 (m, 3H), 7,40-7,33 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,08-3,97 (m, 1H), 3,89 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,42-3,31 (m, 2H), 3,28-3,17 (m, 1H), 3,16-3,06 (m, 1H), 3,01 (t, 2H), 2,97 (dd, 1H), 2,76 (dd, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,39 (s, 2H), 1,32-1,20 (m, 4H), 1,19-1,07 (m, 4H), 1,07-0,95 (m, 2H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 897,2 (M+H)+.
1.16 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.16)
1.16.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-(2-((3-(ди-трет-бутоксифосфорил)пропил)амино)этокси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.10.10 (338 мг) и вещество из примера 1.14.2 (120 мг) в этаноле (20 мл) и раствор концентрировали. Остаток снова поглощали этанолом (20 мл) и концентрировали. Затем остаток растворяли в дихлорметане (10 мл) и к полученному добавляли триацетоксиборогидрид натрия (119 мг), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Неочищенную смесь подвергали хроматографии на силикагеле с применением 1% триэтиламина в этилацетате/метаноле, 95:5, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) 1080,3 (M+H)+.
1.16.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали вещество из примера 1.16.1 (22 мг) в дихлорметане (3 мл) и трифторуксусной кислоте (3 мл) в течение 2 дней. Смесь концентрировали и подвергали хроматографии с обращенной фазой на системе Isolera One от Biotage с применением колонки C18 на 40 г, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте/воде, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,62 (bs, 1H), 8,10 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 7,68 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,54 (dd, 1H), 7,50 (d, 1H), 7,42 (m, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,02 (d, 1H), 5,02 (s, 2H), 3,94 (m, 2H), 3,97 (m, 2H), 3,68 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,15 (m, 1H), 3,09 (m, 4H), 2,55 (m, 4H), 2,15 (s, 3H), 1,86 (m, 1H), 1,66 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,31 (m, 4H), 1,19 (m, 4H), 1,08 (m, 2H), 0,90 (s, 6H). MS (ESI) 912,2 (M+H)+.
1.17 Синтез 3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.17)
1.17.1 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{(2S)-4-трет-бутокси-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноил}(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.13.7 (0,060 г), (S)-4-трет-бутил-1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)сукцинат (0,034 г) и N,N-диизопропилэтиламин вместе в дихлорметане (1 мл). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь загружали на силикагель и применяли градиент элюирования метанол/дихлорметан, от 0,5 до 5%, с получением указанного в заголовке соединения.
1.17.2 3-{1-[(3-{2-[L-альфа-Аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.17.1 (0,049 г) в дихлорметане (1 мл) трифторуксусной кислотой (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и воде (0,5 мл), затем очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,15 (d, 3H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,55 (s, 1H), 3,92-3,86 (m, 2H), 3,60-3,47 (m, 2H), 3,47-3,37 (m, 2H), 3,32-3,21 (m, 1H), 3,09-2,97 (m, 4H), 2,92-2,72 (m, 3H), 2,67-2,53 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,46-0,94 (m, 12H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 875,2 (M+H)+.
1.18 Синтез 6-{4-[({2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино)метил]бензил}-2,6-ангидро-L-гулоновой кислоты (соединения W2.18)
1.18.1 Метиловый сложный эфир (2S,3S,4R,5S)-3,4,5-триацетокси-6-(4-бромметилбензил)тетрагидропиран-2-карбоновой кислоты
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в J. R. Walker et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3038-3048. MS (ESI) масса/электрон 518, 520 (M+NH4)+.
1.18.2 Метиловый сложный эфир (2S,3S,4R,5S)-3,4,5-триацетокси-6-(4-формилбензил)тетрагидропиран-2-карбоновой кислоты
Добавляли вещество из примера 1.18.1 (75 мг) и N-оксид пиридина (14 мг) в ацетонитрил (0,75 мл). В раствор добавляли оксид серебра(I) (24 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли безводный сульфат натрия (5 мг) и раствор перемешивали в течение пяти минут. Раствор фильтровали и концентрировали. Неочищенный материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием от 50 до 70% этилацетата в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения.
1.18.3 (3R,4S,5R,6R)-2-(4-(((2-((3-((4-(6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)метил)бензил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.18.2 веществом из примера 1.5.3 в примере 1.5.4. MS (ESI) масса/электрон 1222 (M+H)+.
1.18.4 трет-Бутиловый сложный эфир {2-[2-(2-оксоэтокси)этокси]этил}карбаминовой кислоты
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения трет-бутилового сложного эфира {2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этил}карбаминовой кислоты веществом из примера 1.5.1 в примере 1.5.2.
1.18.5 (3R,4S,5R,6R)-2-(4-(2-(2-((3-((4-(6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)-14,14-диметил-12-оксо-5,8,13-триокса-2,11-диазапентадецил)бензил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.18.3 веществом из примера 1.2.7 и вещества из примера 1.18.4 веществом из примера 1.5.3 в примере 1.5.4. MS (ESI) масса/электрон 1453 (M+H)+.
1.18.6 6-{4-[({2-[2-(2-Аминоэтокси)этокси]этил}-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино)метил]бензил}-2,6-ангидро-L-гулоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.18.5 на вещество из примера 1.5.4 в примере 1.5.5. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,38 (bs, 1H), 8,05 (dd, 1H), 7,90-7,68 (m, 6H), 7,62 (m, 2H), 7,53-7,27 (m, 8H), 6,94 (d, 1H), 4,96 (bs, 1H), 4,38 (bs, 4H), 3,91-3,57 (m, 11H), 3,37-3,11 (m, 14H), 2,98 (m, 6H), 2,61 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,44 (bs, 2H), 1,26 (m, 4H), 1,18-0,90 (m, 6H), 0,87 (bs, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1157 (M+H)+.
1.19 Синтез 4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенилгексопиранозидидуроновой кислоты (соединения W2.19)
1.19.1 (2R,3S,4R,5R,6R)-2-(4-Формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (2,42 г) в ацетонитриле (30 мл) добавляли оксид серебра(I) (1,4 г) и 4-гидроксибензальдегид (620 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 5 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 439,2 (M+H)+.
1.19.2 4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенилгексопиранозидидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.7 (36 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли вещество из примера 1.19.1 (21 мг) с последующим добавлением MgSO4 (60 мг). Смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли NaBH3CN на смоле (153 мг). Затем смесь перемешивали в течение 3 часов. Смесь фильтровали и к фильтрату добавляли моногидрат гидроксида лития (20 мг). Смесь перемешивали в течение 2 часов и подкисляли трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,57-8,72 (m, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,34-7,53 (m, 6H), 7,08 (t, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,10 (d,, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,06-4,15 (m, 4H), 3,83-3,97 (m, 6H), 3,26-3,42 (m, 8H), 2,93-3,10 (m, 6H), 2,10 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,24-1,38 (m, 6H), 0,97-1,16 (m, 4H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1028,3 (M+H)+.
1.20 Синтез 6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.20)
1.20.1 2-((3,5-Диметил-7-((5-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)окси)этанол
В раствор вещества из примера 1.1.6 (9 г) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) дихлорметана (827 мг) в ацетонитриле (60 мл) добавляли триэтиламин (10 мл) и пинаколборан (6 мл). Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи, охлаждали и применяли непосредственно на следующей стадии. MS (ESI) масса/электрон 445,4 (M+H)+.
1.20.2 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор трет-бутил-3-бром-6-хлорпиколината (5,92 г) в тетрагидрофуране (60 мл) и воде (30 мл) добавляли неочищенное вещество из примера 1.20.1 (4,44 г), 1,3,5,7-тетраметил-6-фенил-2,4,8-триокса-6-фосфоадамантан (1,5 г), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (927 мг) и K3PO4(22 г). Смесь перемешивали с обратным холодильником в течение ночи, охлаждали, разбавляли этилацетатом (800 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 531,1 (M+H)+.
1.20.3 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
В раствор вещества из примера 1.20.2 (3,2 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли имидазол (0,62 г) и хлор-трет-бутилдиметилсилан (1,37 г). Смесь перемешивали в течение ночи, разбавляли этилацетатом (300 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 645,4 (M+H)+.
1.20.4 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиколинат
В раствор 7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (507 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.20.3 (1,25 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (136 мг) и фторид цезия (884 мг). Смесь нагревали при 120°C в микроволновом синтезаторе (Biotage, Initiator) в течение 20 минут. Смесь разбавляли этилацетатом (500 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах и затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 741,5 (M+H)+.
1.20.5 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-(3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В суспензию бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (295 мг) в ацетонитриле (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (173 мг) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли раствор вещества из примера 1.20.4 (710 мг) в ацетонитриле (10 мл) и суспензию перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации органический слой концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 917,2 (M+H)+.
1.20.6 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.20.5 (1,4 г) в тетрагидрофуране (10 мл) добавляли фторид тетрабутиламмония (1,0 М в тетрагидрофуране, 6 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов, разбавляли этилацетатом (300 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 803,4 (M+H)+.
1.20.7 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В охлажденный(0°C) раствор вещества из примера 1.20.6 (1,2 г) в дихлорметане (20 мл) и триэтиламине (2 мл) добавляли метансульфонилхлорид (300 мг). Смесь перемешивали в течение 4 часов, разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 881,3 (M+H)+.
1.20.8 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.20.7 (1,5 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли азид натрия (331 мг). Смесь перемешивали в течение 48 часов, разбавляли этилацетатом (20,0 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 828,4 (M+H)+.
1.20.9 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.20.8 (1,5 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли Pd/C (10%, 200 мг). Смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 802,4 (M+H)+.
1.20.10 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((2-(диэтоксифосфорил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.12.1, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.20.9.
1.20.11 6-[1-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-фосфоноэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.12.2, путем замены вещества из примера 1.12.1 веществом из примера 1.20.10. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,40 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,74-7,89 (m, 3H), 7,47 (s, 2H), 7,38 (t, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,23 (t, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,53-3,64 (m, 2H), 3,03-3,18 (m, 2H), 2,84 (t, 2H), 2,23 (s, 3H), 1,87-2,02 (m, 4H), 1,46 (s, 2H), 1,26-1,38 (m, 4H), 1,12-1,23 (m, 4H), 0,99-1,11 (m, 2H), 0,89 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 854,1 (M+H)+.
1.21 Синтез 6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.21)
1.21.1 трет-Бутил-(2-((3,5-диметил-7-((5-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)окси)этил)(метил)карбамат
В раствор вещества из примера 1.13.3 (1,2 г) в 1,4-диоксане добавляли бис(бензонитрил)палладия(II) хлорид (0,04 г), 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (0,937 мл) и триэтиламин (0,9 мл). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи, разбавляли этилацетатом и промывали водой (60 мл) и солевым раствором (60 мл). Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.21.2 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.1.12, путем замены вещества из примера 1.1.11 и вещества из примера 1.1.8 трет-бутил-3-бром-6-хлорпиколинaтом и веществом из примера 1.21.1 соответственно. MS (APCI) масса/электрон 643,9 (M+H)+.
1.21.3 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиколинат
Нагревали смесь вещества из примера 1.21.2 (480 мг), 7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (387 мг), дихлорбис(трифенилфосфин)палладия(II) (78 мг) и фторида цезия (340 мг) в 1,4-диоксане (12 мл) и воде (5 мл) при 100°C в течение 5 часов. Реакционную смесь охлаждали и разбавляли этилацетатом. Полученную смесь промывали водой и солевым раствором и органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флеш-хроматографии, с элюированием 50% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 740,4 (M+H)+.
1.21.4 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор бензо[d]тиазол-2-амина (114 мг) в ацетонитриле (5 мл) добавляли бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбонат (194 мг). Смесь перемешивали в течение 1 часа и добавляли вещество из примера 1.21.3 (432 мг) в ацетонитриле (5 мл). Смесь перемешивали в течение ночи, разбавляли этилацетатом, промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 50% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.21.5 6-(1-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(метиламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.2.4 (200 мг) в дихлорметане (5 мл) трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи. Смесь концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,40 (s, 1H), 8,30 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,85 (d, 1H), 7,74-7,83 (m, 2H), 7,42-7,53 (m, 2H), 7,38 (t, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,23 (t, 1H), 3,93-4,05 (m, 2H), 3,52-3,62 (m, 2H), 2,97-3,10 (m, 2H), 2,84 (t, 2H), 2,56 (t, 2H), 2,23 (s, 3H), 1,88-2,00 (m, 2H), 1,45 (s, 2H), 1,25-1,39 (m, 4H), 1,12-1,22 (m, 4H), 1,00-1,09 (m, 2H), 0,89 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 760,1 (M+H)+.
1.21.6 6-(1-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-N-метил-3-сульфопропанамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Охлаждали (R)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-сульфопропановую кислоту (70,9 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (HATU, 65 мг) в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) на ледяной бане и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (68,9 мкл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут и при комнатной температуре в течение 8 часов. Добавляли вещество из примера 1.21.5 (100 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (60 мкл). Полученную смесь перемешивали в течение ночи, концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
1.21.7 6-[1-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(3-сульфо-L-аланил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.21.6 (80 мг) в дихлорметане (3 мл) трифторуксусной кислотой (1,5 мл) в течение 20 минут. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 0 до 50% ацетонитрила в 4 мМ водном растворе ацетата аммония, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,57 (s, 1H), 7,59-7,67 (m, 3H), 7,54 (d, 1H), 7,46-7,51 (m, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,08-7,17 (m, 2H), 6,90 (t, 1H), 3,91-4,10 (m, 3H), 3,84 (s, 2H), 3,04 (s, 2H), 2,75-2,83 (m, 4H), 2,59-2,70 (m, 2H), 2,27-2,39 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 1,81-1,93 (m, 2H), 1,74 (s, 9H), 1,42 (s, 2H), 0,96-1,33 (m, 10H), 0,86 (s, 3H). MS (ESI) масса/электрон 909,2 (M-H)-.
1.22 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.22)
1.22.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.2.5 (560 мг) и тиазоло[5,4-b]пиридин-2-амин (135 мг) в дихлорметане (12 мл). Добавляли N,N-диметилпиридин-4-амин (165 мг) и N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (260 мг) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и неочищенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном/этилацетатом, 65/35, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 829,1 (M+H)+.
1.22.2 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.22.1 веществом из примера 1.2.6 в примере 1.2.7. MS (ESI) масса/электрон 803,2 (M+H)+.
1.22.3 трет-Бутил-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.22.2 (70 мг) и 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфоната (48 мг) в дихлорметане (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,06 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и неочищенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 1 до 4% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1249,2 (M+H)+.
1.22.4 2-((2-((3-((4-(2-(трет-Бутоксикарбонил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)этансульфоновая кислота
К раствору вещества из примера 1.22.3 (70 мг) в тетрагидрофуране (0,25 мл) добавляли тетрабутиламмония фторид (60 мкл, 1,0 M раствор в тетрагидрофуране), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух дней. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. MS (ESI) масса/электрон 911,1 (M+H)+.
1.22.5 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.22.4 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,00 (s, 1H), 8,52 (dd, 2H), 8,33 (br s, 2H), 8,16 (dd, 1H), 7,62 (m, 1H), 7,53 (m, 2H), 7,45 (d, 1H), 7,38 (m, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,98 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,54 (m, 2H), 3,22 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 3,02 (t, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,41 (s, 2H), 1,28 (m, 4H), 1,14 (m, 4H), 1,02 (m, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 855,2 (M+H)+.
1.23 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.23)
1.23.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения тиазоло[4,5-b]пиридин-2-амина на тиазоло[5,4-b]пиридин-2-амин в примере 1.22.1. MS (ESI) масса/электрон 855,2 (M+H)+.
1.23.2 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.23.1 веществом из примера 1.2.6 в примере 1.2.7. MS (ESI) масса/электрон 803,2 (M+H)+.
1.23.3 трет-Бутил-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.23.2 веществом из примера 1.22.2 в примере 1.22.3. MS (ESI) масса/электрон 1249,2 (M+H)+.
1.23.4 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.23.3 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,20 (br s, 1H), 8,61 (dd, 1H), 8,56 (dd, 1H), 8,33 (br s, 2H), 7,56 (d, 1H) 7,52 (d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,39 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,98 (d, 1H), 4,98 (s, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,54 (m, 2H), 3,22 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 3,02 (t, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,41 (s, 2H), 1,30 (m, 4H), 1,12 (m, 4H), 1,02 (m, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 855,1 (M+H)+.
1.24 Синтез 6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.24)
1.24.1 трет-Бутил-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.8, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.20.9.
1.24.2 6-[1-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.9, путем замены вещества из примера 1.2.8 веществом из примера 1.24.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,26-8,46 (m, 3H), 8,02 (d, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,75-7,79 (m, 1H), 7,47 (s, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,22 (t, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,54-3,61 (m, 2H), 3,18-3,29 (m, 2H), 3,07-3,15 (m, 2H), 2,78-2,92 (m, 4H), 2,23 (s, 3H), 1,87-2,02 (m, 2H), 1,44 (s, 2H), 1,32 (q, 4H), 1,12-1,25 (m, 4H), 1,00-1,11 (m, 2H), 0,88 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 854,0 (M+H)+.
1.25 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.25)
1.25.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.12.1, путем замены диэтилвинилфосфоната трет-бутилакрилатом. MS (APCI) масса/электрон 930,6 (M+H)+.
1.25.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.25.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,03 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,39-7,50 (m, 2H), 7,32-7,38 (m, 3H), 7,23 (s, 1H), 6,73 (d, 1H), 4,88 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,79 (s, 2H), 2,99 (t, 2H), 2,86-2,93 (m, 2H), 2,50-2,58 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,35 (d, 2H), 1,01-1,30 (m, 10H), 0,86 (s, 6H). MS (APCI) масса/электрон 819,0 (M+H)+.
1.26 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.26)
1.26.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.7 (0,020 г), трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилата (4,79 мг) и триацетоксиборогидрида натрия (7 мг) в дихлорметане (0,5 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и очищали без обработки с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 0 до 10% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ELSD) масса/электрон 985,4 (M+H)+.
1.26.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.26.1 (0,108 г), вещества из примера 1.14.2 (0,030 г) и триацетоксиборогидрида натрия (0,035 г) в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре в течение 1 часа. В реакционную смесь добавляли трифторуксусную кислоту (1 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и воде (0,5 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,83 (s, 1H), 8,50 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,80 (d, 2H), 7,63 (d, 2H), 7,56-7,42 (m, 5H), 7,37 (tt, 3H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,44 (d, 6H), 3,31-3,16 (m, 6H), 3,09-2,98 (m, 2H), 2,98-2,85 (m, 1H), 2,18 (d, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,00-1,74 (m, 4H), 1,71-1,57 (m, 2H), 1,51-0,97 (m, 12H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 951,2 (M+H)+.
1.27 Синтез 3-{1-[(3-{2-[D-альфа-аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.27)
1.27.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(метиламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.11.1, путем замещения вещества из примера 1.10.9 веществом из примера 1.13.6.
1.27.2 3-{1-[(3-{2-[D-альфа-Аспартил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.27.1 (0,074 г), 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфата(V) (0,038 г), N,N-диизопропилэтиламина (0,048 мл) и (R)-4-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксобутановой кислоты (0,029 г) в дихлорметане (1 мл) в течение 2 часов. Добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) и воде (0,5 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,88 (s, 1H), 8,16 (s, 3H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,55-7,42 (m, 3H), 7,41-7,33 (m, 2H), 7,33-7,27 (m, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,63-4,49 (m, 1H), 3,89 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,61-3,37 (m, 4H), 3,10-2,97 (m, 4H), 2,89-2,73 (m, 2H), 2,67-2,52 (m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,45-0,95 (m, 12H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 875,3 (M+H)+.
1.28 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[1-(карбоксиметил)пиперидин-4-ил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.28)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.7 (0,055 г), трет-бутил-2-(4-оксопиперидин-1-ил)ацетата (0,014 г) и триацетоксиборогидрида натрия (0,019 г) в дихлорметане (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 2 часов в реакционную смесь добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) и воде (0,5 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,80 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,36 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,66-3,55 (m, 4H), 3,30 (s, 1H), 3,08 (s, 4H), 3,02 (t, 2H), 2,22 (d, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,97-1,78 (m, 2H), 1,44 (s, 2H), 1,31 (q, 4H), 1,20-0,96 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 887,3 (M+H)+.
1.29 Синтез N-[(5S)-5-амино-6-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-6-оксогексил]-N,N-диметилметанаминия (соединения W2.29)
Перемешивали раствор Fmoc-N-ε-(триметил)-L-лизина гидрохлорида (0,032 г), 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфата(V) (0,028 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,034 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) в течение 5 минут. Реакционную смесь добавляли к веществу из примера 1.13.7 (0,050 г) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение ночи. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,069 мл) и перемешивание продолжали в течение дополнительно 2 часов. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл), водой (0,5 мл) и трифторуксусной кислотой (0,101 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,13 (s, 3H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,54-7,42 (m, 3H), 7,42-7,34 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,42-4,24 (m, 1H), 3,89 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,29-3,16 (m, 2H), 3,08-3,00 (m, 15H), 2,87 (s, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,84-1,60 (m, 4H), 1,42-0,97 (m, 15H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 930,3 (M+H)+.
1.30 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[пиперидин-4-ил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.30)
1.30.1 трет-Бутил-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-({13-[1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил]-2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил}окси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоксилат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.8 (0,111 г), трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилат (0,021 г) и триацетоксиборогидрид натрия (0,028 г) в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли уксусную кислоту (7,63 мкл) и перемешивание продолжали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли дополнительное количество трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилата (0,021 г), триацетоксиборогидрид натрия (0,028 г) и уксусную кислоту (8 мкл) и перемешивание продолжали в течение дополнительно 4 часов. Реакционную смесь загружали непосредственно на силикагель и применяли градиент элюирования от 0,5 до 4% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения.
1.30.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[пиперидин-4-ил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.30.1 (0,078 г) в дихлорметане (1 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и растворяли в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) и воде (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,89 (s, 1H), 9,31 (s, 1H), 8,75 (d, 1H), 8,36-8,19 (m, 1H), 8,08 (d, 1H), 7,84 (d, 1H), 7,66 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 7,55-7,45 (m, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,34 (s, 1H), 6,99 (d, 1H), 5,00 (s, 2H), 3,93 (t, 2H), 3,87 (s, 2H), 3,49 (d, 6H), 3,39-3,31 (m, 2H), 3,01 (m, 6H), 2,15 (s, 6H), 1,94 (s, 2H), 1,58-0,99 (m, 12H), 0,91 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 937,3 (M+H)+.
1.31 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.31)
1.31.1 трет-Бутил-8-бром-5-гидрокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилат
В раствор трет-бутил-5-гидрокси-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилата (9 г) в N,N-диметилформамиде (150 мл) добавляли N-бромсукцинимид (6,43 г). Смесь перемешивали в течение ночи и гасили водой (200 мл). Смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. При выпаривании растворителя получали указанное в заголовке соединение, которое применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS(ESI) масса/электрон 329,2 (M+H)+.
1.31.2 трет-Бутил-5-(бензилокси)-8-бром-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.1 (11,8 г) в ацетоне (200 мл) добавляли бензилбромид (7,42 г) и K2CO3 (5 г) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток разделяли между этилацетатом (600 мл) и водой (200 мл). Органический слой промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 10% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 418,1 (M+H)+.
1.31.3 2-трет-Бутил-8-метил-5-(бензилокси)-3,4-дигидроизохинолин-2,8(1H)-дикарбоксилат
Добавляли метанол (100 мл) и триэтиламин (9,15 мл) к веществу из примера 1.31.2 (10,8 г) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладию(II) (0,48 г) в реактор высокого давления из нержавеющей стали объемом 500 мл. Сосуд несколько раз барботировали аргоном. В реакторе повышали давление с помощью монооксида углерода и его содержимое перемешивали в течение 2 часов при 100°C при давлении монооксида углерода 60 фунтов/кв. дюйм. После охлаждения неочищенную реакционную смесь концентрировали под вакуумом. Остаток добавляли в этилацетат (500 мл) и воду (200 мл). Органический слой дополнительно промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 10 до 20% этилацетата в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 398,1 (M+H)+.
1.31.4 Метил-5-(бензилокси)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилата гидрохлорид
В раствор вещества из примера 1.31.3 (3,78 г) в тетрагидрофуране (20 мл) добавляли 4 н. HCl в 1,4-диоксане (20 мл) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS(ESI) масса/электрон 298,1 (M+H)+.
1.31.5 Метил-5-(бензилокси)-2-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.4 (3,03 г) в диметилсульфоксиде (50 мл) добавляли вещество из примера 1.1.10 (2,52 г) и триэтиламин (3,8 мл) и смесь перемешивали при 60°C в течение ночи в атмосфере азота. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 553,1 (M+H)+.
1.31.6 трет-Бутил-(2-((3,5-диметил-7-((5-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)окси)этил)(метил)карбамат
В раствор вещества из примера 1.13.3 (2,6 г) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) дихлорметана (190 мг) в ацетонитриле (30 мл) добавляли триэтиламин (2,0 мл) и пинаколборан (1,4 мл) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь применяли непосредственно в следующей реакции без обработки. MS (ESI) масса/электрон 558,4 (M+H)+.
1.31.7 Метил-5-(бензилокси)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.5 (2,58 г) в тетрагидрофуране (40 мл) и воде (20 мл) добавляли вещество из примера 1.31.6 (2,66 г), 1,3,5,7-тетраметил-6-фенил-2,4,8-триокса-6-фосфоадамантан (341 мг), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (214 мг) и K3PO4 (4,95 г) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 4 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 904,5 (M+H)+.
1.31.8 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Добавляли вещество из примера 1.31.7 (3,0 г) в тетрагидрофуране (60 мл) к Pd(OH)2 (0,6 г, Degussa #E101NE/W, 20% на углероде, содержание воды 49%) в сосуд из нержавеющей стали для работы под давлением объемом 250 мл. Смесь встряхивали в течение 16 часов при давлении водорода 30 фунтов/кв. дюйм при 50°C. Смесь фильтровали через нейлоновую мембрану и растворитель выпаривали под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 815,1(M+H)+.
1.31.9 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(3-(ди-трет-бутоксифосфорил)пропокси)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.8 (163 мг) в тетрагидрофуране (10 мл) добавляли вещество из примера 1.14.1 (50,5 мг), трифенилфосфин (52,5 мг) и ди-трет-бутилазодикарбоксилат (46,2 мг) и смесь перемешивали в течение 3 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1049,2 (M+H)+.
1.31.10 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(3-(ди-трет-бутоксифосфорил)пропокси)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.31.9 (3 г) в тетрагидрофуране (20 мл), метаноле (10 мл) и воде (10 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (30 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Реакционную смесь нейтрализовали 2% водным раствором HCl и концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли этилацетатом (800 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 1034,5 (M+H)+.
1.31.11 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.31.10 (207 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (45,1 мг, 0,3 ммоль), фтор-N,N,N',N'- тетраметилформамидиния гексафторфосфат (79 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (150 мг) и смесь перемешивали при 60°C в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, затем 5% метанолом в дихлорметане. После концентрирования материал растворяли в смеси дихлорметана и трифторуксусной кислоты (1:1, 6 мл) и обеспечивали осаждение полученного при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривали и остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 9 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,27 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,76 (dd, 2H), 7,43-7,56 (m, 2H), 7,32-7,37 (m, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,00 (dd, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,15 (t, 2H), 3,88-3,93 (m, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,50-3,59 (m, 4H), 2,95-3,08 (m, 2H), 2,78-2,87 (m, 2H), 2,51-2,55 (m, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,90-2,01 (m, 2H), 1,65-1,75 (m, 2H), 1,41 (s, 2H), 1,22-1,36 (m, 6H), 0,98-1,18 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 898,2 (M+H)+.
1.32 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[N-(2-карбоксиэтил)-L-альфа-аспартил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.32)
1.32.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((S)-4-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксобутанамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В холодный (0°C) раствор (S)-4-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксобутановой кислоты (136 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU, 179 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (165 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут и добавляли вещество из примера 1.2.7 (252 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 50 до 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
1.32.2 3-(1-((3-(2-((S)-2-Амино-3-карбоксипропанамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.32.1 (100 мг) в дихлорметане (3 мл) трифторуксусной кислотой (2,5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.32.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((-2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)амино)-3-карбоксипропанамидо)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 1.32.2 (102 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,21 мл) в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляли трет-бутилакрилат (80 мг) и воду (1,5 мл). Смесь нагревали при 50°C в течение 24 часов и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием 20-60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 989,1 (M+H)+.
1.32.4 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[N-(2-карбоксиэтил)-L-альфа-аспартил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.32.3. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 3H), 8,62-9,21 (m, 2H), 8,52 (t, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,42-7,53 (m, 3H), 7,33-7,41 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,04-4,19 (m, 1H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,32-3,41 (m, 2H), 3,16-3,27 (m, 2H), 3,10 (t, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,83 (d, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,39 (s, 2H), 1,20-1,32 (m, 4H), 0,94-1,16 (m, 6H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 933,2 (M+H)+.
1.33 Синтез 3-{1-[(3-{2-[(2-аминоэтил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.33)
1.33.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.9 (188 мг), трет-бутил-(2-оксоэтил)карбамата (70,1 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (384 мкл) добавляли триацетоксиборогидрид натрия (140 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли NaCNBH3 (13,83 мг). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа и добавляли метанол (1 мл). Смесь перемешивали в течение 10 минут, разбавляли этилацетатом и промывали солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
1.33.2 3-{1-[(3-{2-[(2-Аминоэтил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.33.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,87 (s, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,41-7,56 (m, 3H), 7,33-7,40 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,50 (s, 2H), 3,29-3,40 (m, 4H), 3,19 (s, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,94 (t, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,25-1,37 (m, 4H), 0,98-1,19 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 897,2 (M+H)+.
1.34 Синтез 6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.34)
1.34.1 Метил-5-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)этокси)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В смесь вещества из примера 1.31.8 (500 мг), бензил-(2-гидроксиэтил)карбамата (180 мг) и трифенилфосфина (242 мг) в тетрагидрофуране (9 мл) добавляли (E)-ди-трет-бутилдиазен-1,2-дикарбоксилат (212 мг). Смесь перемешивали в течение 2 часов, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 50-100% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 991,1 (M+H)+.
1.34.2 5-(2-(((Бензилокси)карбонил)амино)этокси)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.34.1 (480 мг) в тетрагидрофуране (10 мл) и метаноле (5 мл) добавляли 1 М гидроксид лития (1,94 мл). Смесь нагревали при 50°C в течение ночи, охлаждали, подкисляли 10% водным раствором HCl до pH 3 и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 40 до 99% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 977,4 (M+H)+.
1.34.3 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)этокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В смесь вещества из примера 1.34.2 (245 мг), бензо[d]тиазол-2-амина (151 мг) и фтор-N,N,N',N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфата (TFFH) (132 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (876 мкл). Реакционную смесь нагревали при 65°C в течение 24 часов, охлаждали, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 0-80% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 1109,5 (M+H)+.
1.34.4 6-[5-(2-Аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.34.3 (100 мг) в дихлорметане (0,5 мл) трифторуксусной кислотой (10 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,75 (s, 2H), 8,27 (s, 2H), 7,89-8,09 (m, 4H), 7,77 (s, 2H), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,35 (t, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,02 (dd, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,27 (t, 2H), 3,87-3,97 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,50-3,58 (m, 2H), 3,00 (s, 2H), 2,88-2,96 (m, 2H), 2,52-2,60 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,42 (s, 2H), 1,23-1,36 (m, 4H), 0,98-1,19 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 819,3 (M+H)+.
1.35 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.35)
1.35.1 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-оксоэтокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор оксалилхлорида (8 мл, 2,0 М в дихлорметане) в дихлорметане (20 мл) при -78°C добавляли по каплям диметилсульфоксид (1 мл) в дихлорметане (10 мл) в течение 20 минут. Раствор перемешивали в течение 30 минут в атмосфере аргона и добавляли вещество из примера 1.20.2 (3,8 г) в виде раствора в дихлорметане (30 мл) в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение дополнительно 60 минут. Добавляли триэтиламин (2 мл) при -78°C и реакционную смесь перемешивали в течение 60 минут. Охлаждающую баню удаляли и обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры в течение ночи. Добавляли воду (60 мл). Водный слой подкисляли 1% водным раствором HCl и экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали 1% водным раствором HCl, водным раствором NaHCO3 и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 527,9 (M+H)+.
1.35.2 2,2,2-Трифтор-1-(п-толил)этил-3-йодпропан-1-сульфонат
Указанное в заголовке соединение получали согласно процедуре, изложенной в J. Org. Chem., 2013, 78, 711-716.
1.35.3 2,2,2-Трифтор-1-(п-толил)этил-3-аминопропан-1-сульфонат
Нагревали раствор вещества из примера 1.35.2 (2,0 г) в 7 н. растворе аммиака в метаноле (20 мл) до 80°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator) в течение 45 минут. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате (300 мл). Органический слой промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 312,23 (M+H)+.
1.35.4 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-(((3,5-диметил-7-(2-((3-((2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этокси)сульфонил)пропил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.35.3 (1,96 г) в дихлорэтане (30 мл) добавляли вещество из примера 1.35.1 (3,33 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и добавляли суспензию NaBH4 (1,2 г) в метаноле (8 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и разбавляли этилацетатом (300 мл). Органический слой промывали 2 н. водным раствором NaOH, водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (30 мл) и добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (2 г) с последующим добавлением каталитического количества 4-диметиламинопиридина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 924,42 (M+H)+.
1.35.5 7-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)-(3-((2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этокси)сульфонил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1-нафтойная кислота
В раствор метил-7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1-нафтоата (203 мг) в смеси 1,4-диоксана (10 мл) и воды (5 мл) добавляли вещество из примера 1.35.4 (600 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (45,6 мг) и фторид цезия (296 мг). Смесь нагревали при 120°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator) в течение 30 минут, разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением промежуточного соединения в виде сложного эфира. Остаток растворяли в смеси тетрагидрофурана (8 мл), метанола (4 мл) и воды (4 мл) и обрабатывали моногидратом гидроксида лития (200 мг) в течение 3 часов. Реакционную смесь подкисляли 1 н. водным раствором HCl до pH 4 и разбавляли этилацетатом (400 мл). Полученную смесь промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1060,24 (M+H)+.
1.35.6 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.35.5 (405 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (57,4 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорид (146 мг) и 4-(диметиламино)пиридин (93 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане (3 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (3 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,08 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,53 (s, 2H), 8,36 (dd, 1H), 8,26-8,13 (m, 3H), 8,06 (dd, 1H), 8,04-7,97 (m, 1H), 7,94 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,69 (dd, 1H), 7,51-7,43 (m, 2H), 7,40-7,31 (m, 1H), 7,19 (d, 0H), 3,88 (s, 2H), 3,54 (t, 2H), 3,16-2,91 (m, 4H), 2,68-2,55 (m, 2H), 2,29 (s, 0H), 2,22 (s, 3H), 1,93 (p, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,38-1,23 (m, 4H), 1,10 (dq, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 863,2 (M+H)+.
1.36 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.36)
1.36.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)-(1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.25.1 (0,086 г), трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилата (0,037 г), триацетоксиборогидрида натрия (0,039 г) и уксусной кислоты (11 мкл) в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи реакционную смесь загружали на силикагель и применяли градиент элюирования от 0,5 до 5% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ELSD) масса/электрон 1113,5 (M+H)+.
1.36.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.36.1 (0,050) в дихлорметане (0,5 мл) трифторуксусной кислотой (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и растворяли в диметилсульфоксиде и метаноле (1:1). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 9,38 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,55-7,42 (m, 3H), 7,41-7,33 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,73-3,54 (m, 3H), 3,53-3,34 (m, 4H), 3,34-3,25 (m, 2H), 3,02 (t, 2H), 2,99-2,85 (m, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,23-2,04 (m, 5H), 1,92-1,76 (m, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,39-1,23 (m, 4H), 1,23-0,96 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 901,3 (M+H)+.
1.37 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-сульфо-L-аланил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.37)
Перемешивали раствор (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-сульфопропановой кислоты (0,011 г) и 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфата(V) (10,80 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) в течение 5 минут. Данный раствор добавляли к веществу из примера 1.2.9 (0,025 г) и N,N-диизопропилэтиламину (0,014 мл). После перемешивания в течение 2 часов в реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,013 мл) и перемешивание продолжали в течение дополнительно 1 часа. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом и водой и гасили трифторуксусной кислотой. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,03 (dd, 4H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,54 (dd, 1H), 7,51-7,41 (m, 2H), 7,36 (td, 2H), 7,33 (s, 1H), 6,98 (dd, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,42 (dd, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,73 (ddd, 2H), 3,57-3,38 (m, 2H), 3,31 (dt, 1H), 3,08 (dd, 1H), 3,02 (t, 2H), 2,87 (tt, 1H), 2,81-2,54 (m, 2H), 2,10 (d, 3H), 1,51-0,91 (m, 12H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1005,2 (M+H)+.
1.38 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этил}-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.38)
1.38.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)амино)этил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.32.3, путем замены вещества из примера 1.32.2 веществом из примера 1.33.2.
1.38.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этил}-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.38.1. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,68 (s, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,42-7,50 (m, 2H), 7,33-7,40 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 3H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,66 (t, 2H), 3,31-3,53 (m, 8H), 3,18 (t, 2H), 3,02 (t, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,67 (t, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,22-1,37 (m, 6H), 0,98-1,19 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (APCI) масса/электрон 971,0 (M+H)+.
1.39 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.39)
1.39.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((3-(ди-трет-бутоксифосфорил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.23.2 (520 мг) и вещество из примера 1.14.2 (175 мг) в дихлорметане (6 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Добавляли суспензию борогидрида натрия (32 мг) в метаноле (1 мл) и смесь перемешивали в течение 30 минут. Реакционную смесь добавляли в насыщенный водный раствор NaHCO3 и экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и концентрирования при очистке с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0,5 до 5,0% метанола в дихлорметане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 1037,3 (M+H)+.
1.39.2 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.39.1 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,60 (dd, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,41 (br s, 2H), 7,65 (d, 1H) 7,48 (d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 4,97 (s, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,56 (m, 2H), 3,02 (m, 6H), 2,11 (s, 3H), 1,81 (m, 2H), 1,61 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (m, 4H), 1,14 (m, 4H), 1,04 (m, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 869,2 (M+H)+.
1.40 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.40)
1.40.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((3-(ди-трет-бутоксифосфорил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.22.2 веществом из примера 1.23.2 в примере 1.39.1. MS (ESI) масса/электрон 1037,3 (M+H)+.
1.40.2 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.40.1 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,52 (dd, 2H), 8,41 (br s, 2H), 8,17 (dd, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,53 (m, 2H), 7,46 (d, 1H), 7,38 (t, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,98 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,56 (t, 2H), 3,00 (m, 6H), 2,11 (s, 3H), 1,81 (m, 2H), 1,60 (m, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,31 (m, 4H), 1,14 (m, 4H), 1,04 (m, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 869,2 (M+H)+.
1.41 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.41)
1.41.1 Метил-5-(2-(трет-бутокси)-2-оксоэтокси)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.8 (163 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли трет-бутил-2-бромацетат (58,6 мг) и K2CO3 (83 мг) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 929,2 (M+H)+.
1.41.2 5-(2-(трет-Бутокси)-2-оксоэтокси)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.41.1 (3 г) в тетрагидрофуране (20 мл), метаноле (10 мл) и воде (10 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (300 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Реакционную смесь нейтрализовали 2% водным раствором HCl и концентрировали под вакуумом. Остаток разбавляли этилацетатом (800 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 914,5 (M+H)+.
1.41.3 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.41.2 (183 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (45,1 мг), фтор-N,N,N',N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфат (79 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (0,203 мл). Смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (1:1, 10 мл) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,73 (s, 1H), 8,30 (s, 2H), 7,99-8,07 (m, 1H), 7,75-7,79 (m, 1H), 7,70 (d, 1H), 7,44-7,56 (m, 2H), 7,30-7,39 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,03 (t, 1H), 6,87-6,93 (m, 1H), 4,98-5,18 (m, 4H), 4,84 (s, 3H), 3,78-4,01 (m, 4H), 3,55 (t, 2H). 2,77-3,07 (m, 4H), 2,53-2,61 (m, 3H), 2,04-2,16 (m, 3H), 1,41 (s, 2H), 1,02-1,34 (m, 6H), 0,83-0,91 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 834,2 (M+H)+.
1.42 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.42)
1.42.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)-(4-метокси-4-оксобутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.26.1 (0,169 г), метил-4-оксобутаноата (0,024 г) и триацетоксиборогидрида натрия (0,055 г) в дихлорметане (2 мл) при комнатной температуре. Через 2 часа реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (50 мл) и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (10 мл). Органический слой отделяли, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. При хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0,5 до 5% метанола/дихлорметана, содержащего аммиак, получали указанное в заголовке соединение. MS (ELSD) масса/электрон 1085,5 (M+H)+.
1.42.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.42.1 (0,161 г) в дихлорметане (0,5 мл) трифторуксусной кислотой (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в метаноле (0,6 мл) и обрабатывали моногидратом гидроксида лития (0,124 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). После перемешивания в течение 1,5 часа реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой (0,229 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,89-8,79 (m, 1H), 8,57-8,41 (m, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,41-7,32 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,44 (d, 2H), 3,26 (s, 2H), 3,22-3,11 (m, 2H), 3,09-2,85 (m, 6H), 2,34 (t, 2H), 2,19 (d, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,95-1,71 (m, 5H), 1,44 (s, 2H), 1,39-1,27 (m, 4H), 1,22-0,96 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 915,3 (M+H)+.
1.43 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.43)
1.43.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор метил-7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1-нафтоата (2,47 г) в 1,4-диоксане (40 мл) и воде (20 мл) добавляли вещество из примера 1.20.2 (4,2 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (556 мг) и фторид цезия (3,61 г) и реакционную смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 680,7 (M+H)+.
1.43.2 трет-Бутил-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В охлажденный (0°C) раствор вещества из примера 1.43.1 (725 мг) в дихлорметане (10 мл) и триэтиламине (0,5 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,249 мл) и смесь перемешивали в течение 4 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), и промывали водой и солевым раствором, и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 759,9 (M+H)+.
1.43.3 трет-Бутил-3-(1-(((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.43.2 (4,2 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли азид натрия (1,22 г) и смесь перемешивали в течение 96 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (600 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 705,8 (M+H)+.
1.43.4 7-(5-(1-((3-(2-Азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1-нафтойная кислота
В раствор вещества из примера 1.43.3 (3,5 г) в тетрагидрофуране/метаноле/воде (2:1:1, 30 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (1,2 г) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь подкисляли 1 н. водным раствором HCl и разбавляли этилацетатом (600 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 691,8 (M+H)+.
1.43.5 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.43.4 (870 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (284 мг), фтор-N,N,N',N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфат (499 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (488 мг). Смесь перемешивали при 60°C в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), и промывали водой и солевым раствором, и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 824,1 (M+H)+.
1.43.6 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.43.5 (890 мг) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли Pd/C (90 мг). Смесь перемешивали под давлением 1 атмосферы водорода в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и катализатор промывали этилацетатом. Растворитель выпаривали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 798,1 (M+H)+.
1.43.7 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.43.6 (189 мг) в N,N-диметилформамиде (6 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (106 мг). Смесь перемешивали в течение 4 дней. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), и промывали водой и солевым раствором, и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя остаток растворяли в трифторуксусной кислоте (10 мл) и отстаивали в течение ночи. Трифторуксусную кислоту выпаривали под вакуумом и остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 6 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,09 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,31-8,43 (m, 3H), 8,16-8,26 (m, 3H), 7,93-8,08 (m, 3H), 7,82 (d, 1H), 7,66-7,75 (m, 1H), 7,46-7,55 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,17-3,28 (m, 2H), 3,07-3,16 (m, 2H), 2,82 (t, 2H), 2,24 (s, 3H), 1,44 (s, 2H), 0,99-1,37 (m, 12H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 849,1 (M+H)+.
1.44 Синтез 3-{1-[(3-{2-[L-альфа-аспартил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.44)
1.44.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((S)-4-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксо-N-(2-сульфоэтил)бутанамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В холодный (0°C) раствор (S)-4-(трет-бутокси)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-4-оксобутановой кислоты (40,7 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU, 40,1 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (98 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и добавляли вещество из примера 1.2.9 (60 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1,5 часа и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1123,4 (M-H)-.
1.44.2 3-{1-[(3-{2-[L-альфа-Аспартил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.44.1 (100 мг) в дихлорметане (5 мл) трифторуксусной кислотой (1,5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 2H), 8,11-8,22 (m, 3H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,41-7,54 (m, 3H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,80 (s, 1H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,55-3,71 (m, 2H), 3,01 (t, 4H), 2,74-2,86 (m, 1H), 2,57-2,73 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 0,91-1,46 (m, 13H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 969,2 (M+H)+.
1.45 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.45)
1.45.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(оксетан-3-иламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.7 (0,095 г), оксетан-3-он (10 мг) и триацетоксиборогидрид натрия (0,038 г) в дихлорметане (1 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи реакционную смесь загружали непосредственно на силикагель и применяли градиент элюирования от 0,5 до 5% метанола в дихлорметане, содержащем аммиак, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ELSD) масса/электрон 858,4 (M+H)+.
1.45.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Растворяли вещество из примера 1.45.1 в дихлорметане (0,5 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,5 мл) и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,19 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53-7,40 (m, 3H), 7,40-7,31 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,87 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,67-3,62 (m, 4H), 3,22-3,14 (m, 1H), 3,14-3,06 (m, 2H), 3,00 (t, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,41 (s, 2H), 1,37-1,20 (m, 4H), 1,20-0,95 (m, 6H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 820,2 (M+H)+.
1.46 Синтез 6-[5-(2-аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.46)
1.46.1 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7,13-пентаметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.8, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.35.
1.46.2 6-[5-(2-Аминоэтокси)-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.34.4, путем замены вещества из примера 1.34.3 веществом из примера 1.46.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,74 (s, 2H), 8,96 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,94 (s, 3H), 7,72-7,81 (m, 2H), 7,53 (d, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,35 (t, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,02 (t, 2H), 5,03 (s, 2H), 4,26 (t, 2H), 3,92 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,23-3,38 (m, 4H), 3,13-3,25 (m, 1H), 2,82-3,00 (m, 4H), 2,78 (d, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,23-1,50 (m, 6H), 0,95-1,21 (m, 6H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 927,2 (M+H)+.
1.47 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.47)
1.47.1 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.8, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.46.2.
1.47.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.47.1 (100 мг) в дихлорметане (5 мл) трифторуксусной кислотой (5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm m 12,74 (s, 1H), 8,96 (d, 1H), 8,64 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,76 (dd, 2H), 7,41-7,57 (m, 2H), 7,24-7,40 (m, 2H), 7,02 (t, 2H), 5,03 (s, 2H), 4,23-4,42 (m, 2H), 3,90 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,25-3,40 (m, 6H), 3,12-3,24 (m, 2H), 2,81-3,01 (m, 6H), 2,78 (d, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,22-1,47 (m, 6H), 0,97-1,21 (m, 6H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) m 1035,3 (M+H)+.
1.48 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.48)
1.48.1 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{[2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-16-(2-сульфоэтил)-4,9-диокса-10λ6-тиа-13,16-диаза-3-силаоктадекан-18-ил]окси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.8, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.33.2.
1.48.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.47.2, путем замены вещества из примера 1.47.1 веществом из примера 1.48.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 3H), 8,55 (s, 4H), 8,04 (d, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,62 (d, 1H), 7,40-7,56 (m, 3H), 7,32-7,40 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 2H), 4,96 (s, 3H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,47 (d, 2H), 3,36 (s, 2H), 3,18-3,30 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,94 (t, 2H), 2,82 (t, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,26-1,49 (m, 6H), 0,96-1,20 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1005,2 (M+H)+.
1.49 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.49)
1.49.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)амино)этокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(метил-(2-сульфоэтил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.32.3, путем замены вещества из примера 1.32.2 веществом из примера 1.46.2.
1.49.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.49.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,75 (s, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,59 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,72-7,82 (m, 2H), 7,54 (d, 1H), 7,43-7,51 (m, 2H), 7,35 (t, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,02 (dd, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,34 (s, 2H), 3,93 (s, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,62 (s, 2H), 2,84-3,01 (m, 4H), 2,78 (d, 3H), 2,65-2,75 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,20-1,45 (m, 7H), 0,95-1,21 (m, 6H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 999,2 (M+H)+.
1.50 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.50)
1.50.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.23.2 (205 мг) в дихлорметане (2,4 мл) и добавляли трет-бутил-4-оксопиперидин-1-карбоксилат (51 мг) и триацетоксиборогидрид натрия (75 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Добавляли дополнительное количество дихлорметана и реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор NaHCO3. Органический слой промывали солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрования и концентрирования остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле на картридже Grace Reveleris® Amino, с градиентом элюирования 0,5-5,0% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 986,3(M+H)+.
1.50.2 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)(пиперидин-4-ил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Растворяли вещество из примера 1.50.1 (94 мг) в дихлорметане (1 мл), затем добавляли вещество из примера 1.14.2 (25 мг) и триацетоксиборогидрид натрия (30 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение четырех часов. Добавляли трифторуксусную кислоту (1,5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,82 (br s, 1H) 8,60 (dd, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,50 (br s, 1H), 7,66 (d, 1H), 7,50 (d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 4,98 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H) 3,69 (m, 2H), 3,61 (m, 1H), 3,44 (m, 2H) 3,23 (m, 4H), 3,02 (t, 2H), 2,93 (m, 2H), 2,18 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,92 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,64 (m, 2H), 1,44 (s, 2H), 1,31 (m, 4H), 1,14 (m, 4H), 1,04 (m, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 952,3 (M+H)+.
1.51 Синтез 6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.51)
1.51.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
В раствор вещества из примера 1.20.2 (3,2 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли имидазол (0,616 г) и хлор-трет-бутилдиметилсилан (1,37 г). Смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 645,4 (M+H)+.
1.51.2 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)пиколинат
В раствор 6-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазина (507 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.51.1 (1,25 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (136 мг) и фторид цезия (884 мг). Смесь перемешивали при 120°C при условиях микроволнового излучения (Biotage, Initiator) в течение 20 минут. Смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 744,1 (M+H)+.
1.51.3 трет-Бутил-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутилдиметилсилил)окси)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В суспензию бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (295 мг) в ацетонитриле (10 мл) при температуре окружающей среды добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (173 мг) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли раствор вещества из примера 1.51.2 (710 мг) в ацетонитриле (10 мл) и суспензию энергично перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 920,2 (M+H)+.
1.51.4 трет-Бутил-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.51.3 (1,4 г) в тетрагидрофуране (10 мл) добавляли фторид тетрабутиламмония (1,0 М в тетрагидрофуране, 6 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 806,0 (M+H)+.
1.51.5 трет-Бутил-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В охлажденный(0°C) раствор вещества из примера 1.51.4 (1,2 г) в дихлорметане (20 мл) и триэтиламине (2 мл) добавляли метансульфонилхлорид (300 мг). Смесь перемешивали в течение 4 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 884,1 (M+H)+.
1.51.6 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.51.5 (1,5 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) добавляли азид натрия (331 мг). Смесь перемешивали в течение 48 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрация и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 831,1 (M+H)+.
1.51.7 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-бензо[b][1,4]оксазин-6-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.51.6 (1,5 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли Pd/C (10%, 200 мг). Смесь перемешивали под давлением 1 атмосферы водорода в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали под вакуумом с получением неочищенного продукта. MS (ESI) масса/электрон 805,1 (M+H)+.
1.51.8 6-[4-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.51.7 (164 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) и N,N-диизопропилэтиламине (0,5 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (91 мг). Смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в тетрагидрофуране (2 мл). Добавляли фторид тетрабутиламмония (1 мл, 1 М в тетрагидрофуране) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали под вакуумом и остаток растворяли в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (1:1, 6 мл), при этом обеспечивали осаждение полученного в течение ночи. После выпаривания растворителя остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,74 (s, 1H), 8,35 (s, 2H), 7,94-8,00 (m, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,71-7,82 (m, 2H), 7,46 (s, 1H), 7,34-7,44 (m, 2H), 7,24 (t, 1H), 7,02 (d, 1H), 4,28-4,39 (m, 2H), 4,10-4,19 (m, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55-3,61 (m, 4H), 3,21-3,30 (m, 3H), 3,07-3,16 (m, 3H), 2,23 (s, 3H), 1,44 (s, 2H), 0,98-1,37 (m, 9H), 0,89 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 856,1 (M+H)+.
1.52 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.52)
1.52.1 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(3-((2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этокси)сульфонил)пропокси)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.31.8 (460 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли 2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этил-3-йодпропан-1-сульфонат (239 мг, получен согласно J. Org. Chem., 2013, 78, 711-716) и K2CO3 (234 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1018,5 (M+H)+.
1.52.2 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(3-((2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этокси)сульфонил)пропокси)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.52.1 (176 мг) в тетрагидрофуране (4 мл), метаноле (3 мл) и воде (3 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (60 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Затем смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали 1 н. водным раствором HCl, водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 1095,2 (M+H)+.
1.52.3 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-((2,2,2-трифтор-1-(п-толил)этокси)сульфонил)пропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-(((2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.52.2 (117 мг) в дихлорметане (6 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (19,27 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорид (37 мг) и 4-(диметиламино)пиридин (23,5 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт. MS (ESI) масса/электрон 1226,1 (M+H)+.
1.52.4 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Растворяли вещество из примера 1.52.3 (130 мг) в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (1:1, 6 мл) и перемешивали в течение ночи. После выпаривания растворителя остаток растворяли в N,N-диметилформамиде/воде (1:1, 12 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,68 (s, 1H), 8,13-8,32 (m, 2H), 8,01 (d, 1H), 7,75 (dd, 2H), 7,42-7,56 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,28-7,34 (m, 1H), 7,00 (dd, 2H), 5,03 (s, 2H), 4,19 (t, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,50-3,57 (m, 4H), 2,95-3,05 (m, 2H), 2,81 (t, 2H), 2,52-2,65 (m, 4H), 1,39 (s, 2H), 0,96-1,32 (m, 12H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 898,3 (M+H)+.
1.53 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.53)
1.53.1 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.51.4, путем замены вещества из примера 1.51.3 веществом из примера 1.51.1.
1.53.2 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
в охлажденный (0°C) раствор вещества из примера 1.53.1 (1,89 г) в дихлорметане (30 мл) и триэтиламине (3 мл) добавляли метансульфонилхлорид (1,03 г) и смесь перемешивали в течение 4 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки.
1.53.4 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
Растворяли вещество из примера 1.53.2 (2,2 г) в 7 н. растворе аммиака в метаноле (40 мл) и смесь перемешивали при 80°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator) в течение 2 часов. Смесь концентрировали под вакуумом и остаток растворяли в этилацетате, промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение.
1.53.5 трет-Бутил-6-хлор-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.53.3 (1,59 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (1,6 г) и N,N-диизопропилэтиламин (1 мл) и смесь перемешивали в течение 4 дней. Реакционную смесь растворяли в этилацетате (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 976,8 (M+H)+.
1.53.6 трет-Бутил-3-{1-[(3-{[13-(трет-бутоксикарбонил)-2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-хлорпиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.53.4 (2,93 г) в тетрагидрофуране (50 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (0,786 г) и 4-(диметиламино)пиридин (100 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали под вакуумом и остаток растворяли в этилацетате (300 мл), промывали 1 н. водным раствором HCl, водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1076,9 (M+H)+.
1.53.7 трет-Бутил-3-{1-[(3-{[13-(трет-бутоксикарбонил)-2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиридин-2-карбоксилат
В раствор 7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (65 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.53.5 (220 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (7 мг) и фторид цезия (45,6 мг). Смесь перемешивали при 120°C в течение 30 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1173,9 (M+H)+.
1.53.8 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В суспензию бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (48,2 мг) в ацетонитриле (10 мл) при температуре окружающей среды добавляли тиазоло[4,5-b]пиридин-2-амин (34 мг) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли раствор вещества из примера 1.53.6 (220 мг) в ацетонитриле (5 мл) и суспензию энергично перемешивали в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в трифторуксусной кислоте (10 мл) и перемешивали в течение ночи. После выпаривания растворителя остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,42-8,48 (m, 1H), 8,31-8,40 (m, 4H), 8,03 (d, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,26-7,37 (m, 2H), 3,93-4,02 (m, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,52-3,60 (m, 3H), 3,17-3,26 (m, 2H), 3,05-3,14 (m, 2H), 2,76-2,89 (m, 5H), 2,23 (s, 3H), 1,90-2,01 (m, 2H), 1,44 (s, 2H), 1,27-1,37 (m, 4H), 0,99-1,22 (m, 5H), 0,88 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 855,1 (M+H)+.
1.54 Синтез 3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.54)
1.54.1 трет-Бутил-3-{1-[(3-{[13-(трет-бутоксикарбонил)-2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил]пиридин-2-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замены метил-7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1-нафтоата 7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолином в примере 1.53.6. MS (ESI) масса/электрон 1226,6 (M+H)+.
1.54.2 7-[6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-{1-[(3-{[13-(трет-бутоксикарбонил)-2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10λ6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил]нафталин-1-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.54.1 (79 мг) в тетрагидрофуране (4 мл), метаноле (3 мл) и воде (3 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (60 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакцию разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали 1 н. водным раствором HCl, водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который применяли на следующий стадии без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 1211,6 (M+H)+.
1.54.3 3-{1-[(3,5-Диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.54.2 (60 мг) в дихлорметане (4 мл) добавляли тиазоло[4,5-b]пиридин-2-амин (7,56 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорид (19 мг) и 4-(диметиламино)пиридин (12,2 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанный в заголовке продукт, который растворяли в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (1:1, 6 мл) и перемешивали в течение ночи. После выпаривания растворителя остаток растворяли в N,N-диметилформамиде/воде (1:1, 12 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,42 (s, 1H), 9,05 (s, 1H), 8,51-8,69 (s, 1H), 8,31-8,41 (m, 2H), 8,18-8,26 (m, 2H), 8,06 (d, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,68-7,79 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,40 (m, 1H), 3,90 (s, 1H), 3,18-3,29 (d, 3H), 3,07-3,15 (d, 3H), 2,82 (d, 3H), 2,24 (s, 2H), 1,44 (d, 3H), 0,97-1,37 (d, 10H), 0,88 (d, 3H). MS (ESI) масса/электрон 850,1 (M+H)+.
1.55 Синтез (1ξ)-1-({2-[5-(1-{[3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-карбоксипиридин-2-ил]-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил}метил)-1,5-ангидро-D-глюцитола (соединения W2.55)
1.55.1 (2R,3R,4S,5R)-3,4,5-Трис(метоксиметокси)-2-((метоксиметокси)метил)-6-метилентетрагидро-2H-пиран
Указанное в заголовке соединение получали согласно J. R. Walker et al., Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 3038-3048. MS (ESI) масса/электрон 370 (M+NH4)+.
1.55.2 Метиловый сложный эфир 4-бром-3-цианометилбензойной кислоты
В раствор триметилсиланкарбонитрила (3,59 мл) в тетрагидрофуране (6 мл) добавляли по каплям 1 М фторид тетрабутиламмония (26,8 мл, 1 М в тетрагидрофуране) в течение 30 минут. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Растворяли метил-4-бром-3-(бромметил)бензоат (7,50 г) в ацетонитриле (30 мл) и добавляли по каплям в первый раствор в течение 30 минут. Раствор нагревали до 80°C в течение 30 минут и охлаждали. Раствор концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 20 до 30% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.55.3 Метиловый сложный эфир 3-(2-аминоэтил)-4-бромбензойной кислоты
Растворяли вещество из примера 1.55.2 (5,69 г) в тетрагидрофуране (135 мл) и добавляли 1 М боран (в тетрагидрофуране, 24,6 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и медленно гасили метанолом и 1 М водным раствором хлористоводородной кислоты. Добавляли 4 М водный раствор хлористоводородной кислоты (150 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и pH регулировали до 11-12 с применением твердого карбоната калия. Затем раствор экстрагировали дихлорметаном (3×100 мл). Органические экстракты объединяли и высушивали над безводным сульфатом натрия. Раствор фильтровали и концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 10 до 20% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 258, 260 (M+H)+.
1.55.4 Метиловый сложный эфир 4-бром-3-[2-(2,2,2-трифторацетиламино)этил]бензойной кислоты
Растворяли вещество из примера 1.55.2 (3,21 г) в дихлорметане (60 мл). Раствор охлаждали до 0°C и добавляли триэтиламин (2,1 мл). Добавляли по каплям трифторуксусный ангидрид (2,6 мл). Раствор перемешивали при 0°C в течение десяти минут и охлаждающую баню удаляли. Через 1 час добавляли воду (50 мл) и раствор разбавляли этилацетатом (100 мл). Добавляли 1 М водный раствор хлористоводородной кислоты (50 мл) и органический слой отделяли, промывали 1 М водным раствором хлористоводородной кислоты и промывали солевым раствором. Раствор высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 371, 373 (M+H)+.
1.55.5 Метиловый сложный эфир 5-бром-2-(2,2,2-трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновой кислоты
В колбу помещали вещество из примера 1.55.4 (4,40 г) и параформальдегид (1,865 г) и добавляли концентрированную серную кислоту (32 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Добавляли холодную воду (120 мл) и раствор экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Экстракты объединяли, промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (100 мл) и водой (100 мл) и высушивали над безводным сульфатом натрия. Смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 20 до 30% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 366, 368 (M+H)+.
1.55.6 Метил-2-(2,2,2-трифторацетил)-5-(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Растворяли вещество из примера 1.55.1 (242 мг) в тетрагидрофуране (7 мл) и добавляли по каплям 9-борабицикло[3.3.1]нонан (3,0 мл). Раствор нагревали с обратным холодильником в течение 4,5 часа и обеспечивали его охлаждение до комнатной температуры. Добавляли фосфат калия (3 М, 0,6 мл) и раствор перемешивали в течение 10 минут. Затем раствор дегазировали и три раза продували азотом. Отдельно растворяли вещество из примера 1.55.5 (239 мг) и аддукт дихлор[1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладия(II) и дихлорметана (39 мг) в N,N-диметилформамиде (7 мл) и раствор дегазировали и три раза продували азотом. Раствор N,N-диметилформамида добавляли по каплям в раствор тетрагидрофурана и смесь перемешивали в течение 18 часов. Добавляли раствор HCl (водный 0,1 М, 25 мл) и раствор три раза экстрагировали этилацетатом (30 мл). Органические экстракты объединяли, промывали солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 30 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 710 (M+NH4)+.
1.55.7 Метил-5-(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Растворяли вещество из примера 1.55.6 (247 мг) в метаноле (1 мл), тетрагидрофуране (1 мл) и воде (0,5 мл). Добавляли карбонат калия (59 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Раствор разбавляли этилацетатом (10 мл) и промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (1 мл). Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 600 (M+H)+.
1.55.8 Метил-2-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-5-(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.7 метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилатом в примере 1.1.11. MS (ESI) масса/электрон 799, 801 (M-трет-бутил)+.
1.55.9 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-5-(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.8 веществом из примера 1.1.11 в примере 1.2.1. MS (ESI) масса/электрон 903 (M+H)+, 933 (M+MeOH-H)-.
1.55.10 2-((3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этанамин
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.13.1 веществом из примера 1.10.4 в примере 1.10.5. MS (ESI) масса/электрон 444 (M+H)+.
1.55.11 трет-Бутил-(2-((3-((4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)карбамат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.10 веществом из примера 1.10.5 в примере 1.10.6. MS (ESI) масса/электрон 544 (M+H)+, 488 (M-трет-бутил)+, 542 (M-H)-.
1.55.12 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.9 веществом из примера 1.2.1 и вещества из примера 1.55.11 веществом из примера 1.13.3 в примере 1.13.4. MS (ESI) масса/электрон 1192 (M+H)+.
1.55.13 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5-(((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.12 веществом из примера 1.2.4 в примере 1.2.5. MS (ESI) масса/электрон 1178 (M+H)+, 1176 (M-H)-.
1.55.14 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(((3R,4S,5S,6S)-3,4,5-трис(метоксиметокси)-6-((метоксиметокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.13 веществом из примера 1.52.2 в примере 1.52.3. MS (ESI) масса/электрон 1310 (M+H)+, 1308 (M-H)-.
1.55.15 (1ξ)-1-({2-[5-(1-{[3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-карбоксипиридин-2-ил]-8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил}метил)-1,5-ангидро-D-глюцитол
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.55.14 веществом из примера 1.52.3 и 4 М водного раствора хлористоводородной кислоты трифторуксусной кислотой в примере 1.52.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 7,96 (d, 1H), 7,73 (d, 1H), 7,58 (bs, 3H), 7,46 (d, 1H), 7,43-7,39 (m, 2H), 7,30 (d, 1H), 7,27-7,25 (m, 2H), 6,88 (d, 1H), 4,90 (q, 2H), 3,76 (m, 4H), 3,51 (m, 1H), 3,21 (d, 2H), 3,18 (d, 1H), 3,12 (m, 2H), 3,02 (m, 4H), 2,93 (m, 4H), 2,83 (m, 2H), 2,59 (m,2H), 2,03 (s, 3H), 1,44 (s, 1H), 1,34 (s, 2H), 1,23 (q, 4H), 1,07 (m, 4H), 0,97 (q, 2 H), 0,80 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 922 (M+H)+, 920 (M-H)-.
1.56 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.56)
1.56.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((4-(трет-бутокси)-4-оксобутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.2.7 (0,103 г) и трет-бутил-4-бромбутаноата (0,032 г) в дихлорметане (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,034 мл) при 50°C в закрытом сосуде из темного стекла в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 2 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 5 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 944,6 (M+1).
1.56.1 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-карбоксипропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Растворяли раствор вещества из примера 1.56.1 (0,049 г) в дихлорметане (1 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (0,5 мл) и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в смеси (1:1) N,N-диметилформамид/вода (2 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 5 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,09- 12,32 (m, 2H), 8,31 (s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,54- 7,40 (m, 3H), 7,40- 7,32 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,55 (d, 2H), 3,02 (q, 4H), 2,92 (q, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), (p, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,21- 0,95 (m, 6H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 832,3 (M+H)+.
1.57 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.57)
1.57.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор метил-7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1-нафтоата (2,47 г) в 1,4-диоксане (40 мл) и воде (20 мл) добавляли вещество из примера 1.20.2 (4,2 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (556 мг) и фторид цезия (3,61 г). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи, разбавляли этилацетатом (400 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане и затем 5% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 680,84 (M+H)+.
1.57.2 трет-Бутил-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В охлажденный (0°C) раствор из примера 1.57.1 (725 мг) в дихлорметане (10 мл) и триэтиламине (0,5 мл) добавляли метансульфонилхлорид (0,249 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 758,93 (M+H)+.
1.57.3 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(метоксикарбонил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.57.2 (4,2 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли азид натрия (1,22 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 96 часов, разбавляли этилацетатом (600 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 704,86 (M+H)+.
1.57.4 7-(5-(1-((3-(2-Азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1-нафтойная кислота
В раствор вещества из примера 1.57.3 (3,5 г) в тетрагидрофуране/метаноле/H2O (2:1:1, 30 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (1,2 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь подкисляли 1 н. водным раствором HCl, разбавляли этилацетатом (600 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 691,82 (M+H)+.
1.57.5 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-азидоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.57.4 (870 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (284 мг), фтор-N,N,N'N'-тетраметилформамидиния гексафторфосфат (499 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (488 мг). Смесь перемешивали при 60°C в течение 3 часов, разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 824,02 (M+H)+.
1.57.6 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.57.5 (890 мг) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли Pd/C (90 мг, 5%). Смесь перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 798,2 (M+H)+.
1.57.7 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(3-фосфонопропил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.57.6 (137 мг) в дихлорметане (6 мл) добавляли вещество из примера 1.14.2 (43 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа и добавляли раствор NaBH4 (26 мг) в метаноле (2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали 2 н. водным раствором NaOH, водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане (5 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (5 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. раствора трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,03 (s, 1H), 8,48-8,35 (m, 3H), 8,29-8,16 (m, 3H), 8,08 (dd, 1H), 8,03 (dd, 1H), 7,94 (d, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,71 (dd, 1H), 7,53-7,47 (m, 2H), 7,38 (td, 1H), 4,81-0,53 (m, 89H). MS (ESI) масса/электрон 863,2 (M+H)+.
1.58 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-глюкопиранозилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.58)
В раствор вещества из примера 1.3.1 (44,5 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли 4-(((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегид (17 мг) и MgSO4 (300 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего добавляли цианоборогидрид натрия на смоле (300 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. раствора трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1015,20 (M+H)+.
1.59 Синтез 3-(1-{[3-(2-{[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.59)
В раствор вещества из примера 1.3.1 (44,5 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли 4-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегид (17 мг) и MgSO4 (300 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего добавляли цианоборогидрид натрия на смоле (300 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1015,20 (M+H)+.
1.60 Синтез 3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.60)
1.60.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((1-(трет-бутоксикарбонил)азетидин-3-ил)-(2-((4-(трет-бутилдифенилсилил)гидрокси-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.8 (0,075 г), трет-бутил-3-оксоазетидин-1-карбоксилат (0,021 г) и триацетоксиборогидрид натрия (0,025 г) в дихлорметане (0,5 мл) при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь загружали на силикагель и применяли элюирование от 0 до 10% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1403,9 (M+1).
1.60.2 3-{1-[(3-{2-[Азетидин-3-ил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.60.1 (0,029 г) в дихлорметане (1 мл) трифторуксусной кислотой (1 мл) и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле, 1:1 (2 мл), и смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,81 (s, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 7,50- 7,46 (m, 1H), 7,44 (d, 1H), 7,40- 7,33 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,37 (q, 1H), 4,27 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,58- 3,54 (m, 2H), 3,32 (t, 2H), 3,24 (s, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,85 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,48- 0,97 (m, 12H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 909,2 (M+H)+.
1.61 Синтез 3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.61)
1.61.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры для примера 1.33.1, путем замены трет-бутил-(2-оксоэтил)карбамата трет-бутил-(3-оксопропил)карбаматом. MS (ESI) масса/электрон 1011,5 (M+H).
1.61.2 3-{1-[(3-{2-[(3-Аминопропил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.6.2, путем замены вещества из примера 1.6.1 веществом из примера 1.61.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,88-7,67 (m, 4H), 7,62 (d, 1H), 7,57-7,40 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,05-3,78 (m, 4H), 3,41-3,08 (m, 3H), 2,94 (tt, 6H), 2,11 (s, 3H), 1,92 (t, 2H), 1,53-0,95 (m, 11H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 911,3 (M+H).
1.62 Синтез 6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (соединения W2.62)
1.62.1 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
В раствор вещества из примера 1.53.3 (521 мг) в этаноле (10 мл) при температуре окружающей среды добавляли триэтиламин (3 мл) с последующим добавлением трет-бутилакрилата (2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и затем концентрировали до сухого состояния. Остаток растворяли в этилацетате (200 мл) и раствор промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 657,21 (M+H)+.
1.62.2 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)(трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат
В раствор вещества из примера 1.62.1 (780 мг) в тетрагидрофуране (10 мл) добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (259 мг) с последующим добавлением каталитического количества 4-диметиламинопиридина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и затем концентрировали до сухого состояния. Остаток растворяли в этилацетате (200 мл) и раствор промывали насыщенным водным раствором NaHCO3, водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 757,13 (M+H)+.
1.62.3 трет-Бутил-3-(1-((3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)(трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)пиколинат
В раствор 7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолина (234 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.62.2 (685 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (63,2 мг) и фторид цезия (410 мг). Смесь нагревали до 120°C в течение 30 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Реакционную смесь гасили путем добавления этилацетата и воды. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 854,82 (M+H)+.
1.62.4 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)(трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В суспензию бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)карбоната (150 мг) в ацетонитриле (10 мл) при температуре окружающей среды добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (88 мг) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Добавляли раствор вещества из примера 1.62.3 (500 мг) в ацетонитриле (2 мл) и суспензию энергично перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь гасили путем добавления этилацетата и воды. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1030,5 (M+H)+.
1.62.5 6-[1-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.62.4 (110 мг) в дихлорметане (0,53 мл) при температуре окружающей среды добавляли трифторуксусную кислоту (0,53 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и концентрировали до состояния вязкого масла. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 2 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 55% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,10 (s, 3H), 8,37 (s, 1H), 8,26 (s, 2H), 7,98 (d, 1H), 7,86-7,71 (m, 3H), 7,44 (s, 1H), 7,39-7,31 (m, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,19 (t, 1H), 3,92 (d, 2H), 3,87 (s, 2H), 3,55 (t, 2H), 3,17-3,00 (m, 4H), 2,80 (t, 2H), 2,62 (t, 2H), 2,19 (s, 3H), 1,95-1,88 (m, 2H), 1,43 (s, 2H), 1,33-1,25 (m, 4H), 1,18-1,11 (m, 4H), 1,09-0,97 (m, 2H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 818,0 (M+H)+.
1.63 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(N6,N6-диметил-L-лизил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.63)
Перемешивали раствор (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-6-(диметиламино)гексановой кислоты (0,029 г) и 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфата (0,028 г) вместе в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) N,N-диизопропиламином (0,035 мл). После перемешивания в течение 5 минут раствор добавляли к веществу из примера 1.13.7 (0,051 г) и перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение ночи. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,070 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл), водой (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислотой (0,103 мл), затем очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением градиента ацетонитрил/вода, от 10% до 90%. Фракции, содержащие продукт, собирали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,59 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,12 (t, 3H), 8,01 (d, 1H), 7,85 (dd, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,77 (dd, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,38 (t, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,22 (t, 1H), 3,97 (t, 2H), 3,89 (s, 2H), 3,49 (dt, 4H), 3,06 (s, 2H), 2,99 (q, 2H), 2,88 (s, 2H), 2,84 (t, 2H), 2,75 (d, 6H), 2,22 (s, 3H), 2,00-1,90 (m, 2H), 1,84-1,52 (m, 4H), 1,48-0,95 (m, 14H), 0,87 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 916,2 (M+H)+.
1.64 Синтез 3-{1-[(3-{2-[(3-аминопропил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.64)
1.64.1 6-(1-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.21.5 (100 мг), N,N-диизопропилэтиламина (68,9 мкл) и трет-бутил-(3-оксопропил)карбамата (68,4 мг) в дихлорметане (3 мл) при температуре окружающей среды в течение 2 часов и добавляли NaCNBH4 (8,27 мг). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи. Добавляли метанол (1 мл) и воду (0,2 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 10 минут и концентрировали. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 30 до 80% ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. MS (ESI) масса/электрон 459,4 (M+2H)2+.
1.64.2 3-{1-[(3-{2-[(3-Аминопропил)(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.64.1 (100 мг) в дихлорметане (4 мл) при 0°C трифторуксусной кислотой (1 мл) в течение 1 часа и смесь концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (колонка C18), с градиентом элюирования от 10 до 60% ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,38 (s, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), ), 7,44 (s,H), ), 7,35 (td,H), ), 7,27 1H), ), 7,27 (s,H), 1 7,35 (s,H), 2 7,27 (td,H), 2 (d, 1H), 2 (d, 3,28H), (m, 7,35 1H), 2,70 7,44 1H), 2,19 7,27 6H), 1,90 7,44 1H), ), 1,43 (s,H), ), 7,27 6H), 4 (s, (s,H), 4 7,27 1,08H), (m, 7,27 ),H), (s, 7,27 ).HMS ESI) ) 817,6 (M+H).
1.65 Синтез 3-{1-[(3-{2-[азетидин-3-ил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.65)
1.65.1 6-(1-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил)-3-(1-((3-(2-((1-(трет-бутоксикарбонил)азетидин-3-ил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры, описанной в примере 1.64.1, путем замещения трет-бутил-(3-оксопропил)карбамата трет-бутил-3-оксоазетидин-1-карбоксилатом. MS (ESI) масса/электрон 915,3 (M+H)+.
1.65.2 3-{1-[(3-{2-[Азетидин-3-ил(метил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 1.64.2 путем замещения вещества из примера 1.64.1 веществом из примера 1.65.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,01 (s, 2 1 8,37 (s, 1 1 8,37 (d, 2 1 8,37 7,70 (m, 1 8,37 7,44 (s, 2 ), 8,37 (td, (m, 1 8,37 (d, 1 2 7,23 8,37 (m, 1 1 8,37 (s, 4 2 7,23 8,37 2 ), 2 1 8,37 ), 2 7,23 8,37 ), 1 1 8,37 ), 2,80, 7,23 8,37 2,68 2,80, 7,23 8,37 (s, 3 7,23 8,37 ( 2 2 8,37 1,42 2 7,23 8,37 1,30 (s, ), 8,37 1,15 (s, 2 ), 8,37 0,96 (s, 7,23 8,37 0,85 2 6 ). MS 2,80ESI) масса/электрон 815,5 (M+H)+.
1.66 Синтез N6-(37-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-L-лизил-N-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-L-аланинамида (W2.66)
1.66.1 (S)-6-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексановая кислота
В раствор (S)-6-амино-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексановой кислоты (8,5 г) в смеси 5% водного раствора NaHCO3 (300 мл) и диоксана (40 мл), охлажденной на ледяной бане, добавляли по каплям раствор (9H-флуорен-9-ил)метилпирролидин-1-илкарбоната (11,7 г) в диоксане (40 мл). Обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры и ее перемешивали в течение 24 часов. Устанавливали три дополнительных сосуда, как описано выше. После завершения реакции все четыре реакционные смеси объединяли и органический растворитель удаляли под вакуумом. Водный остаток подкисляли до pH 3 водным раствором хлористоводородной кислоты (1 н.) и затем экстрагировали этилацетатом (3 × 500 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением неочищенного соединения, которое перекристаллизовывали из метил-трет-бутилового эфира с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 11,05 (br. s., 1H), 7,76 (d, 2H), 7,59 (d, 2H), 7,45-7,27 (m, 4H), 6,52-6,17 (m, 1H), 5,16-4,87 (m, 1H), 4,54-4,17 (m, 4H), 3,26-2,98 (m, 2H), 1,76-1,64 (m, 1H), 1,62-1,31 (m, 14H).
1.66.2 трет-Бутил-17-гидрокси-3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1-оат
В раствор 3,6,9,12-тетраоксатетрадекан-1,14-диола (40 г) в толуоле (800 мл) добавляли по частям трет-бутоксид калия (20,7 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. В смесь добавляли по каплям трет-бутил-2-бромацетат (36 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Устанавливали два дополнительных сосуда, как описано выше. После завершения реакций все три реакционные смеси объединяли. В объединенную смесь добавляли воду (500 мл) и смесь концентрировали до 1 л. Смесь экстрагировали дихлорметаном и промывали 1 н. водным раствором трет-бутоксида калия (1 л). Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном: метанолом, 50:1, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 4,01 (s, 2H), 3,75-3,58 (m, 21H), 1,46 (s,9H).
1.66.3 трет-Бутил-17-(тозилокси)-3,6,9,12,15-пентаоксагептадекан-1-оат
В раствор вещества из примера 1.66.2 (30 г) в дихлорметане (500 мл) добавляли по каплям раствор 4-метилбензол-1-сульфонилхлорида (19,5 г) и триэтиламина (10,3 г) в дихлорметане (500 мл) при 0°C в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов и выливали в воду (100 мл). Раствор экстрагировали дихлорметаном (3 × 150 мл) и органический слой промывали хлористоводородной кислотой (6 н., 15 мл), затем с помощью NaHCO3 (5% водный раствор, 15 мл), затем водой (20 мл). Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением остатка, который очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием от петролейного эфира: этилацетата, 10:1, до дихлорметана:метанола, 5:1, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 7,79 (d, 2H), 7,34 (d, 2H), 4,18-4,13 (m, 2H), 4,01 (s, 2H), 3,72-3,56 (m, 18H), 2,44 (s, 3H), 1,47 (s, 9H).
1.66.4 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-Додекаоксагептатриаконтан-37-овая кислота
В раствор 2,5,8,11,14,17-гексаоксанонадекан-19-ола (32,8 г) в тетрагидрофуране (300 мл) добавляли гидрид натрия (1,6 г) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. В реакционную смесь добавляли по каплям раствор вещества из примера 1.66.3 (16 г) в тетрагидрофуране (300 мл) при комнатной температуре. Полученную в результате реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем добавляли воду (20 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение еще 3 часов до завершения гидролиза трет-бутилового сложного эфира. Конечную реакционную смесь концентрировали под вакуумом с удалением органического растворителя. Водный остаток экстрагировали дихлорметаном (2 × 150 мл). Водный слой подкисляли до pH 3 и затем экстрагировали этилацетатом (2 × 150 мл). Водный слой концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от петролейного эфира: этилацетата, 1:1, до дихлорметана:метанола, 5:1, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, хлороформ-d) δ 4,19 (s, 2H), 3,80-3,75 (m, 2H), 3,73-3,62 (m, 40H), 3,57 (dd, 2H), 3,40 (s, 3H).
1.66.5 (43S,46S)-43-((трет-Бутоксикарбонил)амино)-46-метил-37,44-диоксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса-38,45-диазагептатетраконтан-47-овая кислота
Синтезировали вещество из примера 1.66.5 с применением стандартных процедур пептидного синтеза Fmoc в твердой фазе и 2-хлортритиловой смолы. Встряхивали 2-хлортритиловую смолу (12 г, 100 ммоль), (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропановую кислоту (10 г, 32,1 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (44,9 мл, 257 ммоль) в безводном, высушенном просеиванием дихлорметане (100 мл) при 14°C в течение 24 часов. Смесь фильтровали и осадок промывали дихлорметаном (3 × 500 мл), диметилформамидом (2 × 250 мл) и метанолом (2 × 250 мл) (в течение 5 минут каждая стадия). К вышеуказанной смоле добавляли пиперидин/диметилформамид, 20% (100 мл), с удалением Fmoc-группы. Смесь барботировали азотом в течение 15 минут и затем фильтровали. Смолу промывали пиперидином/диметилформамидом, 20% (100 мл), еще пять раз (5 минут каждая стадия) и промывали диметилформамидом (5 × 100 мл) с получением незащищенной, нагруженной L-Ala смолой.
В раствор вещества из примера 1.66.1 (9,0 г) в N,N-диметилформамиде (50 мл) добавляли гидроксибензотриазол (3,5 г), 2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат (9,3 г) и N,N-диизопропилэтиламин (8,4 мл). Смесь перемешивали при 20°C в течение 30 минут. Вышеуказанную смесь добавляли к нагруженной D-Ala смоле и смешивали посредством барботирования азотом при комнатной температуре в течение 90 минут. Смесь фильтровали и смолу промывали диметилформамидом (5 минут каждая стадия). К вышеуказанной смоле добавляли пиперидин/ N,N-диметилформамид, примерно 20% (100 мл), с удалением Fmoc-группы. Смесь барботировали азотом в течение 15 минут и фильтровали. Смолу промывали пиперидином/диметилформамидом, 20% (100 мл), еще пять раз (5 минут каждая стадия), и наконец промывали диметилформамидом (5 × 100 мл).
В раствор вещества из примера 1.66.4 (11,0 г) в N,N-диметилформамиде (50 мл) добавляли гидроксибензотриазол (3,5 г), 2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат (9,3 г) и N,N-диизопропилэтиламин (8,4 мл), и смесь добавляли к смоле и смешивали посредством барботирования азотом при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь фильтровали и остаток промывали диметилформамидом (5 × 100 мл), дихлорметаном (8 × 100 мл) (5 минут каждая стадия).
К конечной смоле добавляли 1% трифторуксусную кислоту/дихлорметан (100 мл) и азот барботировали через полученное в течение 5 минут. Смесь фильтровали и фильтрат собирали. Операцию расщепления повторяли четыре раза. Объединенный фильтрат доводили до pH 7 с помощью NaHCO3 и промывали водой. Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, метанол-d4) δ 4,44-4,33 (m, 1H), 4,08-4,00 (m, 1H), 3,98 (s, 2H), 3,77-3,57 (m, 42H), 3,57-3,51 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 3,25 (t, 2H), 1,77 (br. s., 1H), 1,70-1,51 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,42-1,39 (m, 3H).
1.66.6 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(((43S,46S)-43-((трет-бутоксикарбонил)амино)-46-метил-37,44,47-триоксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса-38,45,48-триазапентаконтан-50-ил)окси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Смешивали вещество из примера 1.66.5 (123 мг, 0,141 ммоль) с 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфатом (58,9 мг) и N,N-диизопропилэтиламином (0,049 мл) в N-метил-2-пирролидоне (1 мл) в течение 10 минут и затем добавляли в раствор вещества из примера 1.2.7 (142 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,049 мл) в N-метил-2-пирролидоне (1,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Неочищенную реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, 25×100 мм, с элюированием от 5 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Фракции продукта лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC/MS) масса/электрон 1695,5 (M+H)+.
1.66.7 3-(1-((3-(((43S,46S)-43-Амино-46-метил-37,44,47-триоксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса-38,45,48-триазапентаконтан-50-ил)окси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 1.66.6 (82 мг) с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре в течение 30 минут. Растворитель выпаривали в слабом потоке азота и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, 25×100 мм, с элюированием от 5 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Фракции продукта лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,04 (dd, 4H), 7,64 (dt, 2H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,36 (q, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,40-4,27 (m, 1H), 3,93-3,72 (m, 7H), 3,59-3,47 (m, 42H), 3,33-3,27 (m, 3H), 3,23 (s, 5H), 3,05 (dt, 5H), 2,10 (s, 3H), 1,72-1,64 (m, 2H), 1,48-1,36 (m, 4H), 1,35-1,16 (m, 10H), 1,16-0,94 (m, 6H), 0,84 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 751,8 (2M+H)2+.
1.67 Синтез метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозида (W2.67)
1.67.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(пент-4-ин-1-иламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор трет-бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколината (85 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) добавляли пент-4-иналь (8,7 мг), уксусную кислоту (20 мг, 0,318) и безводный сульфат натрия (300 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. В реакционную смесь добавляли триацетоксиборогидрид натрия (45 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрация и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт, который растворяли в дихлорметане (5 мл) и трифторуксусной кислоте (3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После выпаривания растворителя остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 3 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием 20-80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 812,2 (M+H)+.
1.67.2 Метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозид
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-азидо-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (8,63 мг) в t-BuOH (2 мл) и воде (1 мл) добавляли вещество из примера 1.67.1 (20 мг), пентагидрат сульфата меди(II) (2,0 мг) и аскорбат натрия (5 мг). Смесь нагревали в течение 20 минут при 100°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Добавляли LiOH H2O (50 мг) в смесь, которую перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь нейтрализовали трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), c элюированием 20-80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 1032,2 (M+H)+.
1.68 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты
1.68.1 2-((3,5-Диметил-7-((5-метил-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)окси)этанол (W2.68)
В раствор 2-((3-((4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этанол (8,9 г) и аддукта PdCl2(dppf)-CH2Cl2 и (([1,1′-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (1:1), 818 мг) в ацетонитриле (120 мл) добавляли триметиламин (10 мл) и 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (12,8 мл). Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры и применяли в следующей реакции без дополнительной обработки. MS (ESI) масса/электрон 467,3 (M+Na)+.
1.68.2 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3-(2-гидроксиэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор трет-бутил-3-бром-6-хлорпиколината (6,52 г) в тетрагидрофуране (100 мл) и воде (20 мл) добавляли вещество из примера 1.68.1 (9,90 г), (1S,3R,5R,7S)-1,3,5,7-тетраметил-8-тетрадецил-2,4,6-триокса-8-фосфоадамантан (0,732 г), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (Pd2(dba)3, 1,02 г) и K3PO4 (23,64 г). Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь концентрировали при пониженном давлении, остаток растворяли в этилацетате (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 20 до 40% этилацетата в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 530,3 (M+H)+.
1.68.3 трет-Бутил-6-хлор-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((метилсульфонил)окси)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В охлажденный (0°C) раствор вещества из примера 1.68.2 (3,88 г) в дихлорметане (30 мл) и триэтиламине (6 мл) добавляли метансульфонилхлорид (2,52 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт (4,6 г), который применяли в следующей реакции без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 608,1 (M+H)+.
1.68.4 трет-Бутил-3-{1-[(3-{2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-хлорпиридин-2-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.68.3 (151 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли ди-трет-бутилиминодикарбоксилат (54 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 729,4 (M+H)+.
1.68.5 7-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1-нафтойная кислота
В раствор метил-7-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1-нафтоата (257 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.68.4 (600 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (57,8 мг) и CsF (375 мг). Смесь перемешивали при 120°C в течение 30 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали неочищенный продукт, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане, с получением промежуточного соединения в виде сложного диэфира. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (10 мл), метаноле (5 мл) и воде (5 мл) и добавляли LiOH H2O (500 мг), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь подкисляли 2 н. водным раствором HCl, растворяли в 400 мл этилацетата, промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (APCI) масса/электрон 765,3 (M+H)+.
1.68.6 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.68.5 (500 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (98 мг), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (251 мг) и 4-диметиламинопиридин (160 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1). После перемешивания в течение ночи раствор концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (12 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты) с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 741,2 (M+H)+.
1.68.7 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.68.6 (35 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли трет-бутилакрилат (120 мг) и H2O (138 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1). Через 16 часов смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (2 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,08 (s, 1H), 8,99 (d, 1H), 8,43-8,24 (m, 4H), 8,24-8,11 (m, 3H), 8,04 (d, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,74-7,62 (m, 1H), 7,53-7,43 (m, 2H), 7,35 (q, 1H), 3,87 (s, 2H), 3,08 (dp, 4H), 2,62 (t, 2H), 2,20 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,29 (q, 4H), 1,14 (s, 4H), 1,03 (q, 2H), 0,85 (s, 6H).
1.69 Синтез 6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты
1.69.1 Метил-3-бромхинолин-5-карбоксилат (W2.69)
В раствор 3-бромхинолин-5-карбоновой кислоты (2 г) в метаноле (30 мл) добавляли концентрированную H2SO4 (5 мл). Раствор перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в этилацетате (300 мл) и промывали водным раствором Na2CO3, водой и солевым раствором. После высушивания над безводным сульфатом натрия, фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 266 (M+H)+.
1.69.2 Метил-3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)хинолин-5-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.69.1 (356 мг) в N,N-диметилформамиде (5 мл) добавляли аддукт PdCl2(dppf)-CH2Cl2 и ([1,1′-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (1:1), 55 мг), ацетат калия (197 мг) и бис(пинаколато)дибор (510 мг). Смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры и применяли в следующей реакции без дополнительной обработки. MS (ESI) масса/электрон 339,2 (M+Na)+.
1.69.3 Метил-3-[5-{1-[(3-{2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]хинолин-5-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.69.2 (626 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.68.4 (1,46 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (140 мг) и CsF (911 мг). Смесь перемешивали при 120°C в течение 30 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане (1 л), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 880,3 (M+H)+.
1.69.4 3-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)хинолин-5-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.69.3 (1,34 г) в тетрагидрофуране (10 мл), метаноле (5 мл) и воде (5 мл) добавляли LiOH H2O (120 мг), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь подкисляли 2 н. водным раствором HCl, разбавляли этилацетатом (400 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (APCI) масса/электрон 766,3 (M+H)+.
1.69.5 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(5-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.69.4 (200 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (39,2 мг), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (50 мг) и 4-диметиламинопиридин (32 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (12 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 742,1 (M+H)+.
1.69.6 6-[5-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.69.5 (36 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (22 мг) и H2O (0,3 мл)). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и трифторуксусной кислотой (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,19 (s, 2H), 9,70 (d, 1H), 9,40 (s, 1H), 8,31 (d, 2H), 8,16 (d, 1H), 8,06 (d, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,98-7,88 (m, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,52-7,43 (m, 2H), 7,37 (q, 1H), 3,89 (s, 2H), 3,22 (p, 2H), 3,10 (q, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,23 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,23-1,10 (m, 4H), 1,04 (q, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 850,2 (M+H)+.
1.70 Синтез 6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.70)
1.70.1 Этил-6-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)хинолин-4-карбоксилат
В раствор этил-6-бромхинолин-4-карбоксилата (140 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли аддукт PdCl2(dppf)-CH2Cl2 и (([1,1′-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (1:1), 20,42 мг), ацетат калия (147 мг) и бис(пинаколато)дибор (190 мг). Смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры и применяли в следующей реакции без дополнительной обработки. MS (ESI) масса/электрон 328,1(M+H)+.
1.70.2 Этил-6-[5-{1-[(3-{2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]хинолин-4-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.70.1 (164 мг) в 1,4-диоксане (10 мл) и воде (5 мл) добавляли вещество из примера 1.68.4 (365 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (35 мг) и CsF (228 мг). Смесь перемешивали при 120°C в течение 30 минут при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане (1 л), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 894,3 (M+H)+.
1.70.3 6-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)хинолин-4-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.70.2 (3,1 г) в тетрагидрофуране (20 мл), метаноле (10 мл) и воде (10 мл) добавляли LiOH H2O (240 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь подкисляли 2 н. водным раствором HCl и разбавляли этилацетатом (400 мл). Органический слой промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 766,3 (M+H)+.
1.70.4 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.70.3 (4,2 г) в дихлорметане (30 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (728 мг), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (1,40 г) и 4-диметиламинопиридин (890 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 742,2 (M+H)+.
1.70.5 6-[4-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.70.4 (111 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (67 мг), N,N-диизопропилэтиламин (0,2 мл) и H2O (0,3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и трифторуксусной кислотой (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,31 (s, 1H), 9,10 (d, 1H), 8,91 (s, 1H), 8,58 (dd, 1H), 8,47-8,16 (m, 4H), 8,06 (dd, 1H), 7,99-7,89 (m, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,53-7,43 (m, 2H), 7,42-7,31 (m, 1H), 3,87 (s, 2H), 3,53 (d, 1H), 3,20 (p, 2H), 3,07 (p, 2H), 2,78 (t, 2H), 2,20 (s, 3H), 1,40 (s, 2H), 1,28 (q, 4H), 1,21-1,07 (m, 4H), 1,02 (q, 2H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 850,1 (M+H)+.
1.71 Синтез 6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.71)
В раствор вещества из примера 1.69.5 (140 мг) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли трет-бутилакрилат (242 мг) и H2O (0,3 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение выходных. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и трифторуксусной кислотой (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,17 (s, 2H), 9,69 (d, 1H), 9,37 (d, 1H), 8,30 (dd, 3H), 8,15 (dd, 1H), 8,04 (dd, 1H), 7,99-7,88 (m, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,53-7,40 (m, 2H), 7,34 (td, 1H), 3,88 (s, 2H), 3,55 (t, 2H), 3,08 (dt, 4H), 2,62 (t, 2H), 2,21 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,29 (q, 4H), 1,14 (s, 4H), 1,03 (q, 2H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 814,2 (M+H)+.
1.72 Синтез 6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.72)
1.72.1 Этил-7-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения этил-5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилата гидрохлорида 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилата гидрохлоридом в примере 1.1.11. MS (ESI) масса/электрон 451, 453 (M+H)+, 395, 397 (M-трет-бутил)+.
1.72.2 Этил-7-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.1 веществом из примера 1.1.11 в примере 1.2.1. MS (ESI) масса/электрон 499 (M+H)+, 443 (M- трет-бутил)+, 529 (M+CH3OH-H)-.
1.72.3 Этил-7-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.2 веществом из примера 1.2.1 и вещества из примера 1.55.11 веществом из примера 1.13.3 в примере 1.13.4. MS (ESI) масса/электрон 760 (M+H)+, 758 (M-H)-.
1.72.4 7-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-5,6,7,8-тетрагидроимидазо[1,5-a]пиразин-1-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.3 веществом из примера 1.1.12 в примере 1.1.13. MS (ESI) масса/электрон 760 (M+H)+, 758 (M-H)-.
1.72.5 трет-Бутил-6-(1-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.4 веществом из примера 1.52.2 в примере 1.52.3. MS (ESI) масса/электрон 892 (M+H)+, 890 (M-H)-.
1.72.6 3-(1-{[3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.5 веществом из примера 1.1.16 в примере 1.1.17. MS (ESI) масса/электрон 736 (M+H)+, 734 (M-H)-.
1.72.7 6-(1-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-(((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2-метилбутан-2-ил)окси)сульфонил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.6 веществом из примера 1.2.7 в примере 1.2.8.
1.72.8 6-[1-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.7 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,36 (bs, 2H), 8,03 (bs, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,64 (d, 1H), 7,46 (t, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,33 (t, 1H), 7,17 (d, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,28 (t, 2H), 4,11 (t, 2H), 3,86 (s, 2H), 3,56 (t, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 2,82 (t, 2H), 2,15 (s, 3H), 1,42 (s, 2H), 1,32 (q, 4H), 1,17 (q, 4, H), 1,03 (m, 2H), 0,88 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 844 (M+H)+, 842 (M-H)-.
1.73 Синтез 8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-{6-карбокси-5-[1-({3-[2-({3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-ил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина (W2.73)
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-азидо-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (8,63 мг) в t-CH3OH (2 мл) и воде (1 мл) добавляли вещество из примера 1.67.1 (20 мг), пентагидрат сульфата меди(II) (2,0 мг) и аскорбат натрия (5 мг). Смесь перемешивали в течение 20 минут при 100°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). В смесь добавляли LiOH H2O (50 мг) и перемешивание продолжали в течение ночи. Смесь нейтрализовали трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), c элюированием 20-80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 987,3 (M+H)+.
1.74 Синтез 6-[7-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.74)
1.74.1 Метил-2-[5-{1-[(3-{2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]-1H-индол-7-карбоксилат
Вещество из примера 1.74.1 получали путем замещения метил-2-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-индол-7-карбоксилата веществом из примера 1.2.1 и путем замещения вещества из примера 1.68.4 веществом из примера 1.1.6 в примере 1.1.12. MS (ESI) масса/электрон 866,3 (M-H)-.
1.74.2 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1H-индол-7-карбоновая кислота
Вещество из примера 1.74.2 получали путем замещения вещества из примера 1.74.1 веществом из примера 1.1.12 в примере 1.1.13. MS (ESI) масса/электрон 754,4 (M+H)+.
1.74.3 трет-Бутил-6-(7-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Вещество из примера 1.74.3 получали путем замещения вещества из примера 1.74.2 веществом из примера 1.1.13 в примере 1.1.14. MS (ESI) масса/электрон 886,5 (M+H)+.
1.74.4 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(7-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 1.74.4 получали путем замещения вещества из примера 1.74.3 веществом из примера 1.1.16 в примере 1.1.17. MS (ESI) масса/электрон 730,2 (M+H)+.
1.74.5 6-[7-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[(2,2,7,7-тетраметил-10,10-диоксидо-3,3-дифенил-4,9-диокса-10l6-тиа-13-аза-3-силапентадекан-15-ил)окси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Вещество из примера 1.74.5 получали путем замещения вещества из примера 1.74.4 веществом из примера 1.2.7 в примере 1.2.8. MS (ESI) масса/электрон 1176,7 (M+H)+.
1.74.6 6-[7-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Вещество из примера 1.74.6 получали путем замещения вещества из примера 1.74.5 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 11,32 (d, 1H), 8,23 (dd, 1H), 8,18 (d, 1H), 7,93-7,82 (m, 3H), 7,71 (d, 1H), 7,62 (s, 3H), 7,57-7,51 (m, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,40 (d, 1H), 7,35 (t, 1H), 7,22 (t, 1H), 4,86 (t, 2H), 3,85 (s, 2H), 3,47 (t, 2H), 3,08 (t, 2H), 2,88 (p, 2H), 2,21 (s, 3H), 1,37 (s, 2H), 1,32-1,20 (m, 4H), 1,14 (q, 4H), 1,07-0,94 (m, 2H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 838,2 (M+H)+.
1.75 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-6-[3-(метиламино)пропил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.75)
1.75.1 Метил-3-бром-5-(бромметил)бензоат
Добавляли азо-бис-изобутиронитрил (1,79 г) к метил-3-бром-5-метилбензоату (50 г) и N-бромсукцинимиду (44,7 г) в 350 мл ацетонитрила, и смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Добавляли дополнительно 11 г N-бромсукцинимида и 0,5 г азо-бис-изобутиронитрила и нагревание с обратным холодильником продолжали в течение 3 часов. Смесь концентрировали, поглощали в 500 мл диэтилового эфира и перемешивали в течение 30 минут. Смесь фильтровали и полученный раствор концентрировали. Неочищенный продукт подвергали хроматографии на силикагеле с применением 10% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.2 Метил-3-бром-5-(цианометил)бензоат
Добавляли цианид тетрабутиламмония (50 г) к веществу из примера 1.75.1 (67,1 г) в 300 мл ацетонитрила и смесь нагревали до 70°C в течение ночи. Смесь охлаждали, выливали в диэтиловый эфир и прополаскивали водой и солевым раствором. Затем смесь концентрировали и подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 2 до 20% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.3 Метил-3-(2-аминоэтил)-5-бромбензоат
Добавляли комплекс боран-THF (126 мл, 1 М раствор) в раствор вещества из примера 1.75.2 (16 г) в 200 мл тетрагидрофурана и смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь осторожно гасили метанолом (50 мл) и затем концентрировали до объема 50 мл. Смесь поглощали в 120 мл метанола/120 мл 4 М HCl/120 мл диоксана и перемешивали в течение ночи. Органические вещества удаляли при пониженном давлении и остаток дважды экстрагировали диэтиловым эфиром. Экстракты удаляли. Основность органического слоя повышали с помощью твердого K2CO3 и затем его экстрагировали этилацетатом и дихлорметаном (2x). Экстракты объединяли, высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.4 Метил-3-бром-5-(2-(2,2,2-трифторацетамидо)этил)бензоат
Добавляли по каплям трифторуксусный ангидрид (9,52 мл) в смесь вещества из примера 1.75.3 (14,5 г) и триметиламина (11,74 мл) в 200 мл дихлорметана при 0°C. После добавления обеспечивали нагревание смеси до комнатной температуры и ее перемешивали в течение трех дней. Смесь выливали в диэтиловый эфир и промывали раствором NaHCO3 и солевым раствором. Смесь концентрировали и подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 5 до 30% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.5 Метил-6-бром-2-(2,2,2-трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Добавляли серную кислоту к веществу из примера 1.75.4 (10 г) до его растворения (40 мл), и в это время добавляли параформальдегид (4,24 г) и смесь перемешивали в течение 2 часов. Затем раствор выливали на 400 мл льда и перемешивали 10 минут. Смесь экстрагировали этилацетатом (3x) и объединенные экстракты промывали раствором NaHCO3 и солевым раствором и затем концентрировали. Неочищенный продукт подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 2 до 15% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.6 Метил-6-(3-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)проп-1-ин-1-ил)-2-(2,2,2-трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Перемешивали раствор вещества из примера 1.75.5 (5,1 г), трет-бутилметил(проп-2-ин-1-ил)карбамат (2,71 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (PdCl2(PPh3)2, 0,49 г), CuI (0,106 г) и триэтиламин (5,82 мл) в 50 мл диоксана при 50°C в течение ночи. Смесь концентрировали и подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 10 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.7 Метил-6-(3-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-2-(2,2,2-трифторацетил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Добавляли вещество из примера 1.75.6 (4,2 г), тетрагидрофуран (20 мл) и метанол (20,00 мл) к влажному 20% Pd(OH)2/C (3 г) в сосуде для работы под давлением объемом 250 мл и встряхивали при давлении, составляющем 50 фунтов/кв. дюйм, и 50°C в течение 12 часов. Раствор фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
1.75.8 Метил-2-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-6-(3-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Перемешивали вещество из примера 1.75.7 (4,22 г) и карбонат калия (1,53 г) в 60 мл тетрагидрофурана, 25 мл метанола и 10 мл воды в течение ночи. Смесь концентрировали и добавляли 60 мл N,N-диметилформамида. Затем к полученному добавляли вещество из примера 1.1.9 (3,05 г) и триэтиламин (5 мл), и реакционную смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в этилацетат (600 мл), промывали водой (3x) и солевым раствором, высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 5 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 618,2 (M+H)+.
1.75.9 Метил-6-(3-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.75.8 (3,7 г), триэтиламина (2,50 мл) и PdCl2(dppf) (([1,1′-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (1:1), 0,29 г) в 25 мл ацетонитрила добавляли 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (1,74 мл) и реакционную смесь нагревали до 75°C в течение 5 часов, затем перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь концентрировали и подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 5 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 666,4 (M+H)+.
1.75.10 4-((трет-Бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутил-2-((2-((3-((4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)амино)этансульфонат
Вещество из примера 1.55.10 (2,39 г), 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (2,41 г) и триэтиламин (1,51 мл) перемешивали в 30 мл N,N-диметилформамида при 45°C в течение 3 часов. Смесь охлаждали и выливали в диэтиловый эфир (400 мл) и раствор диэтилового эфира промывали водой (3x) и солевым раствором и концентрировали. Неочищенный продукт хроматографировали на силикагеле с применением от 2 до 50% этилацетата в гептанах, с добавлением 1% триэтиламина, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 890,6 (M+H)+.
1.75.11 6-(6-(3-((трет-Бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-8-(метоксикарбонил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Добавляли вещество из примера 1.75.9 (1,777 г), вещество из примера 1.75.10 (1,98 г), трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0,102 г), 1,3,5,7-тетраметил-8-тетрадецил-2,4,6-триокса-8-фосфоадамантан (0,918 г) и фосфат калия (1,889 г) в 25 мл диоксана/10 мл воды, и раствор несколько раз вакуумировали/наполняли азотом. Реакционная смесь была прозрачной, и ее перемешивали при 70°C в течение ночи. Смесь охлаждали и выливали в этилацетат (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Смесь концентрировали и подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 5 до 50% этилацетата в гептанах, затем 10% метанола в этилацетате с 1% триэтиламина, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1301,4 (M+H)+.
1.75.12 6-(3-((трет-Бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-2-(5-(1-((3-(2-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-карбоксипиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Перемешивали вещество из примера 1.75.11 (1,5 г) и LiOH-H2O (0,096 г) в 15 мл тетрагидрофурана и 3 мл воды при 45°C в течение 10 дней. Смесь выливали в раствор 200 мл этилацетата/20 мл NaH2PO4 и добавляли концентрированный раствор HCl до достижения pH 3. Слои разделяли и водный слой дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором и концентрировали. Остаток подвергали хроматографии на силикагеле с применением от 0 до 5% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1287,3 (M+H)+.
1.75.13 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-6-(3-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)пропил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.6, путем замещения вещества из примера 1.2.5 веществом из примера 1.75.12. MS (ESI) масса/электрон 1419,5 (M+H)+.
1.75.14 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-6-[3-(метиламино)пропил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.9, путем замещения вещества из примера 1.2.8 веществом из примера 1.75.13. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,90 (bs, 1H), 8,33 (m, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,66 (m, 1H), 7,47 (m, 3H), 7,35 (m, 3H), 7,25 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,28 (t, 2H), 4,11 (t, 2H), 3,95 (m, 2H), 3,20 (m, 2H), 3,08 (m, 2H), 2,96 (m, 2H), 2,89 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,65 (m, 2H), 2,55 (t, 2H), 2,12 (s, 3H), 1,95 (m, 2H), 1,39 (s, 2H), 1,25 (m, 6H), 1,12 (m, 6H), 0,93 (s, 3H), 0,85 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 926,8 (M+H)+.
1.76 Синтез 5-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-5-дезокси-D-арабинитола (W2.76)
1.76.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((((4R,4'R,5R)-2,2,2',2'-тетраметил-[4,4'-би(1,3-диоксолан)]-5-ил)метил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.2.7 (75 мг) и (4R,4'R,5S)-2,2,2',2'-тетраметил-[4,4'-би(1,3-диоксолан)]-5-карбальдегид (22 мг) в дихлорметане (1 мл). Добавляли триацетоксиборогидрид натрия (40 мг) и раствор перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Раствор концентрировали при пониженном давлении и материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием от 5 до 10% метанола в дихлорметане. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1016 (M+H)+, 1014 (M-H)-.
1.76.2 5-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-5-дезокси-D-арабинитол
Растворяли вещество из примера 1.76.1 (45 мг) в трифторуксусной кислоте (1 мл) и воде (0,2 мл). Раствор смешивали при комнатной температуре в течение пяти дней. Растворители удаляли при пониженном давлении и материал поглощали метанолом (2 мл). Материал очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением от 25 до 75% ацетонитрила в воде (вес./0,1% TFA) в течение 30 минут на Grace Reveleris, оснащенной колонкой Luna: C18(2), 100 A, 250×30 мм. Фракции продукта объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли бис(трифторуксусной) кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (bs, 2H), 8,31 (m, 1H), 8,16 (m, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,51-7,43 (m, 3H), 7,37 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,69 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,04 (t, 2H), 3,89 (m, 2H), 3,59 (m, 3H), 3,49 (m, 4H), 3,42 (dd, 2H), 3,22 (dd, 2H), 3,06 (m, 2H), 3,02 (m, 4H), 2,10 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,14 (t, 4H), 1,04 (q, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 880 (M+H)+, 878 (M-H)-.
1.77 Синтез 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексита (W2.77)
1.77.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(((3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Растворяли (4R,5S,6R)-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триол (15 мг) в диметилсульфоксиде (0,5 мл). Добавляли вещество из примера 1.2.7 (88 мг) с последующим добавлением цианоборогидрида натрия (27 мг). Добавляли по каплям уксусную кислоту (82 мг) и раствор нагревали при 60°C в течение 16 часов. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли с помощью 1 мл метанола и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением от 20 до 75% ацетонитрила в воде (вес./0,1% TFA) в течение 60 минут на Grace Reveleris, оснащенной колонкой Luna: C18(2), 100 A, 150×30 мм. Фракции продукта объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли бис(трифторуксусной) кислоты. MS (ESI) масса/электрон 950 (M+H)+, 948 (M-H)-.
1.77.2 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит
Растворяли вещество из примера 1.77.1 (39 мг) в дихлорметане (0,5 мл). Добавляли трифторуксусную кислоту (740 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Растворители удаляли при пониженном давлении. Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) и добавляли 1 М водный раствор гидроксида натрия (0,5 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. Добавляли трифторуксусную кислоту (0,25 мл) и материал очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением от 20 до 75% ацетонитрила в воде (вес./0,1% TFA) в течение 60 минут на Grace Reveleris, оснащенной колонкой Luna: C18(2), 100 A, 150×30 мм. Фракции продукта объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли бис(трифторуксусной) кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 12,74 (bs, 1H), 8,28 (bs, 1H), 8,20 (bs, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,51-7,43 (m, 3H), 7,37 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,53 (bs, 3H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,77 (d, 1H), 3,60 (dd, 2H), 3,56 (t, 2H), 3,48 (m, 2H), 3,15 (d, 1H), 3,02 (m, 6H), 2,10 (s, 3H), 1,84 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,43 (s, 2H), 1,31 (q, 4H), 1,14 (t, 4H), 1,05 (q, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 894 (M+H)+, 892 (M-H)-.
1.78 Синтез 6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.78)
1.78.1 Метил-6-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)изохинолин-4-карбоксилат
В раствор метил-6-бромизохинолин-4-карбоксилата (1,33 г) в N,N-диметилформамиде (30 мл) добавляли аддукт PdCl2(dppf)-CH2Cl2 и (([1,1′-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (1:1), 204 мг), ацетат калия (1,48 г) и бис(пинаколато)дибор (1,92 г). Смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры и применяли в следующей реакции без дополнительной обработки. MS (APCI) масса/электрон 313,3 (M+H)+.
1.78.2 Метил-6-[5-{1-[(3-{2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]изохинолин-4-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.68.4 (1,2 г) в 1,4-диоксане (20 мл) и воде (10 мл) добавляли вещество из примера 1.78.1 (517 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (58 мг) и CsF (752 мг). Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. С помощью LC/MS установили ожидаемый продукт в виде основного пика. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 880,8 (M+H)+.
1.78.3 6-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)изохинолин-4-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.78.2 (3,1 г) в тетрагидрофуране (20 мл), метаноле (10 мл) и воде (10 мл) добавляли LiOH H2O (240 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь подкисляли 2 н. водным раствором HCl и разбавляли этилацетатом (400 мл). Органический слой промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 766,4 (M+H)+.
1.78.4 3-(1-((3-(2-Аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.78.3 (1,2 г) в дихлорметане (20 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (0,236 г), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (451 мг) и 4-диметиламинопиридин (288 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 742,1 (M+H)+.
1.78.5 6-[4-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.78.4 (55 мг) в N,N-диметилформамиде (6 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (34 мг), N,N-диизопропилэтиламин (0,6 мл) и H2O (0,6 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и трифторуксусной кислотой (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,25 (s, 2H), 9,58 (s, 1H), 9,06 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,42 (d, 1H), 8,35 (d, 2H), 8,26 (d, 1H), 8,11-8,03 (m, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,52-7,44 (m, 2H), 7,41-7,28 (m, 1H), 3,89 (s, 2H), 3,55 (t, 2H), 3,22 (t, 2H), 3,09 (s, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,23 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,23-1,11 (m, 4H), 1,04 (q, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI+) масса/электрон 850,1 (M+H)+.
1.79 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.79)
1.79.1 2,2-Диметил-1,3-диоксан-5-карбальдегид
В перемешиваемую суспензию хлорхромата пиридиния (1,1 г) и диатомовой земли (10 г) в дихлорметане (10 мл) добавляли по каплям (2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанол (0,5 г) в виде раствора в дихлорметане (3 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Суспензию фильтровали через диатомовую землю и промывали этилацетатом. Неочищенный продукт фильтровали через силикагель и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, хлороформ-d) δ 9,89 (s, 1H), 4,28-4,17 (m, 4H), 2,42-2,32 (m, 1H), 1,49 (s, 3H), 1,39 (s, 3H). MS (ESI) масса/электрон 305,9 (2M+NH4)+.
1.79.2 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-(((2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.2.7 (100 мг) и вещества из примера 1.79.1 (20 мг) в дихлорметане (1 мл) добавляли триацетоксиборогидрид натрия (40 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Водный слой обратно экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 20% до 100% этилацетата/этанола (3:1) в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ESI) масса/электрон 930,3 (M+H)+.
1.79.3 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Вещество из примера 1.79.3 получали путем замещения вещества из примера 1.79.2 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,82 (s, 1H), 8,13 (s, 2H), 8,00 (dd, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,49-7,38 (m, 3H), 7,37-7,29 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 6,92 (d, 1H), 4,92 (s, 4H), 3,85 (t, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,53 (t, 2H), 3,47 (dd, 2H), 3,00 (dt, 7H), 2,07 (s, 3H), 1,93 (p, 1H), 1,38 (s, 2H), 1,32-1,19 (m, 4H), 1,16-0,91 (m, 6H), 0,83 (s, 7H). MS (ESI) масса/электрон 834,3 (M+H)+.
1.80 Синтез 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентита (W2.80)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения (4S,5R)-тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триола (4R,5S,6R)-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триолом и вещества из примера 1.3.1 веществом из примера 1.2.7 в примере 1.77.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (bs, 1H), 12,72 (bs, 1H), 8,21 (bs, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,52-7,42 (m, 3H), 7,37 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,65 (m, 2H), 3,56 (m, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,24 (m, 2H), 3,03 (m, 5H), 2,10 (s, 3H), 1,89 (m, 1H), 1,67 (m, 1H), 1,44 (s, 2H), 1,31 (q, 4H), 1,14 (t, 4H), 1,05 (q, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 864 (M+H)+, 862 (M-H)-.
1.81 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{[(2S,3S)-2,3,4-тригидроксибутил]амино}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.81)
1.81.1 трет-Бутиловый-сложный эфир-(4S,5S)-5-гидроксиметил-2,2-диметил-[1,3]диоксолан-4-илметиловый сложный эфир угольной кислоты
Растворяли ((4S,5S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4,5-диил)диметанол (1000 мг) в N,N-диметилформамиде (50 мл). Добавляли гидрид натрия (60% в минеральном масле, 259 мг). Раствор смешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Медленно добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1413 мг). Раствор перемешивали в течение 30 минут и реакционную смесь гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония. Раствор разбавляли водой (150 мл) и дважды экстрагировали с применением 70% этилацетата в гептанах. Органические части объединяли и экстрагировали водой (100 мл), экстрагировали солевым раствором (50 мл) и высушивали на безводном сульфате натрия. Раствор концентрировали при пониженном давлении и материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием 30% этилацетатом в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 284 (M+Na)+.
1.81.2 трет-Бутиловый-сложный эфир-(4S,5R)-5-формил-2,2-диметил-[1,3]диоксолан-4-илметиловый сложный эфир угольной кислоты
Растворяли вещество из примера 1.81.1 (528 мг) в дихлорметане (20 мл). Добавляли перйодинан Десса-Мартина (896 мг) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение четырех часов. Раствор концентрировали при пониженном давлении и материал очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием от 20% до 50% этилацетата в гептанах. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения.
1.81.3 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-(((1S,3s,5R,7S)-3-(2-((((4S,5S)-5-(((трет-бутоксикарбонил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил)метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.81.2 (4R,4'R,5S)-2,2,2',2'-тетраметил-[4,4'-би(1,3-диоксолан)]-5-карбальдегидом в примере 1.76.1.
1.81.4 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-(2-{[(2S,3S)-2,3,4-тригидроксибутил]амино}этокси)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.81.3 веществом из примера 1.76.1 в примере 1.76.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (bs, 2H), 8,28 (bs, 1H), 8,18 (bs, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,63 (d, 1H), 7,51-7,43 (m, 3H), 7,36 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (m, 3H), 3,46 (m, 4H), 3,40 (m, 4H), 3,08-2,96 (m, 6H), 2,10 (s, 3H), 1,43 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,14 (t, 4H), 1,04 (q, 2H), 0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 850 (M+H)+, 848 (M-H)-.
1.82 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S,3S,4R,5R,6R)-2,3,4,5,6,7-гексагидроксигептил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.82)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения (2R,3R,4S,5R,6R)-2,3,4,5,6,7-гексагидроксигептаналя (4R,5S,6R)-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2,4,5-триолом и вещества из примера 1.3.1 веществом из примера 1.2.7 в примере 1.77.1. диметилсульфоксид 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 ( 1 ), 8,34-8,08 ( 1 ), (d, ( 1 ), 1 ), 1 (m, 3 ), 1 (m, 2 ), 1 (m, 1 ), 1 (m, 1 ), 4,96 (m, 2 ), 4,96 (m, 2 ), 3,90 ), ), ), 1 (m, ), ), 1 (m, ), ), (m, (m, ), ( (m, (m, ), ), (m, (m, ), ), (s, (m, ), ), (s, (m, ), ), 6 (m, ), ), 6 (m, ), ), (q, (m, ), ), 6 6 ). MS ) ) масса/электрон 940 )+.
1.83 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({3-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]пропил}сульфонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.83)
1.83.1 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-(3-((1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино)пропилсульфонамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В охлажденный (на ледяной бане) раствор вещества из примера 1.2.7 (31 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (60 мкл) в дихлорметане (1 мл) добавляли 3-хлорпропан-1-сульфонилхлорид (5 мкл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в N,N-диметилформамиде (1 мл), переносили в пробирку для микроволнового реактора объемом 2 мл и добавляли 2-аминопропан-1,3-диол (70 мг). Смесь нагревали при 130°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator) в течение 90 минут. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 997,2 (M+H)+.
1.83.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({3-[(1,3-дигидроксипропан-2-ил)амино]пропил}сульфонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Вещество из примера 1.83.2 получали путем замещения вещества из примера 1.83.1 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,40 (s, 2H), 8,05 7,98, 1H), 7,77 (d, 1 ),H), (d, 1 1H), 7,39 (m, 1H), 7,38 (s, 1H), ), 7,27 1 1H), 7,13 (t, 1 ),H), (d, 1 1 4,94H), 2 ), 1 ),H), 4 (s, 3,36H), 2 7,98, 3,36H), 10 (s, ),H), 3 ), 1 1H), 2 ), 1 2H), ), 1,25 1 4H), 1,25 0,92 1 6H), 0,84 (m, 6H). MS 7,98ESI) масса/электрон 941,2 (M+H)+.
1.84 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.84)
В раствор трет-бутил-3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколината (55 мг) в N,N-диметилформамиде (6 мл) добавляли N-(1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил)акриламид (73,4 мг), N,N-диизопропилэтиламин (0,2 мл) и H2O (0,2 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре 4 дня. С помощью LC/MS установили ожидаемый продукт в виде основного пика. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (500 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане и трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток растворяли в N,N-диметилформамиде (8 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием 20-80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,45 (s, 2H), 8,01 (d, 4H), 7,78 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,53-7,39 (m, 3H), 7,39-7,30 (m, 2H), 7,27 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,14 (s, 2H), 3,87 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,52 (d, 4H), 3,19 (s, 3H), 3,13-2,97 (m, 5H), 2,75 (t, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,42 (s, 2H), 1,29 (q, 4H), 1,12 (s, 4H), 1,09-0,99 (m, 2H), 0,85 (s, 7H). MS (ESI) масса/электрон 921,2 (M+H)+.
1.85 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(3S)-3,4-дигидроксибутил]амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.85)
В раствор вещества из примера 1.2.7 (213 мг) в дихлорметане (2 мл) добавляли (S)-2-(2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил)ацетальдегид (42 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут добавляли триацетоксиборогидрид натрия (144 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли трифторуксусную кислоту (2 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 5 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,22 (d, 2H), 8,05-8,01 (m, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53-7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,26-2,94 (m, 7H), 2,10 (s, 3H), 1,84-1,75 (m, 1H), 1,52-1,63 (m, 1H), 1,45-1,23 (m, 6H), 1,19-0,96 (m, 7H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 834,3 (M+H)+.
1.86 Синтез 4-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}метил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (W2.86)
В раствор 3-(1-((3-(2-аминоэтокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновой кислоты (36 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (21 мг)с последующим добавлением MgSO4 (60 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего добавляли MP-цианоборогидрид (Biotage, 153 мг, 2,49 ммоль/г). Затем смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь фильтровали и к фильтрату добавляли LiOH H2O (20 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и затем подкисляли трифторуксусной кислотой. Раствор очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1028,3 (M+H)+.
1.87 Синтез 3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (W2.87)
1.87.1 (2R,3R,5S,6S)-2-(3-Гидроксипропокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В перемешиваемый раствор (2R,3R,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (3,98 г) в толуоле (60 мл) добавляли пропан-1,3-диол (15,22 г). Смесь перемешивали при 75°C и добавляли Ag2CO3 (5,52 г) тремя порциями в течение периода, составляющего 3 часа. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, после чего суспензию фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 50% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 409,9 (M+NH4)+.
1.87.2 (2S,3S,5R,6R)-2-(Метоксикарбонил)-6-(3-оксопропокси)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор диметилсульфоксида (0,5 мл) в дихлорметане (10 мл) при -78°C добавляли оксалилхлорид (0,2 мл). Смесь перемешивали 20 минут при -78°C и добавляли раствор вещества из примера 1.87.1 (393 мг) в дихлорметане (10 мл) с помощью шприца. Через 20 минут добавляли триэтиламин (1 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут и обеспечивали повышение температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали указанное в заголовке соединение, которое применяли без дополнительной очистки. MS (DCI) масса/электрон 408,1 (M+NH4)+.
1.87.3 3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 1.68.6 (171 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли вещество из примера 1.87.2 (90 мг) и NaBH(OAc)3 (147 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали 2% водным раствором HCl, водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (6 мл), метаноле (3 мл) и воде (3 мл) и добавляли LiOH⋅H2O (100 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, подкисляли трифторуксусной кислотой и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в смеси диметилсульфоксид/метанол (1:1, 12 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием 20-80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,07 (s, 2H), 8,99 (s, 1H), 8,34 (dd, 1H), 8,29-8,11 (m, 5H), 8,06-8,02 (m, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,68 (dd, 1H), 7,55-7,40 (m, 2H), 7,34 (td, 1H), 4,23 (d, 1H), 3,87 (s, 2H), 3,76 (dt, 1H), 3,60 (d, 1H), 3,53 (dt, 3H), 3,29 (t, 1H), 3,15 (t, 1H), 3,06-2,91 (m, 6H), 2,20 (s, 3H), 1,83 (p, 2H), 1,44 (s, 2H), 1,30 (q, 4H), 1,14 (s, 4H), 1,03 (q, 2H), 0,85 (s, 7H). MS (ESI) масса/электрон 975,2(M+H)+.
1.88 Синтез 6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-оксидоизохинолин-6-ил]-3-[1-({3,5-диметил-7-[2-(метиламино)этокси]трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.88)
1.88.1 Метил-6-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)изохинолин-4-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.78.1 (0,73 г) в 1,4-диоксане (20 мл) и воде (10 мл) добавляли трет-бутил-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-хлорпиколинат (1,5 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (82 мг) и CsF (1,06 г) и реакционную смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептане (1 л), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 794,8 (M+H)+.
1.88.2 6-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)изохинолин-4-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.88.1 (300 мг) в тетрагидрофуране (6 мл), метаноле (3 мл) и воде (3 мл) добавляли LiOH⋅H2O (100 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь подкисляли 2 н. водным раствором HCl, разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 781,2 (M+H)+.
1.88.3 трет-Бутил-6-(4-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.88.2 (350 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли бензо[d]тиазол-2-амин (67,5 мг), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (129 мг) и 4-диметиламинопиридин (82 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. Фильтрация и выпаривание растворителя обеспечивали получение остатка, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 5% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (APCI) масса/электрон 912,3 (M+H)+.
1.88.4 4-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-6-(6-карбокси-5-(1-((3,5-диметил-7-(2-(метиламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)изохинолин-2-оксид
В раствор вещества из примера 1.88.3 (100 мг) в дихлорметане (6 мл) добавляли м-хлорпероксибензойную кислоту (19 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали насыщенным водным раствором NaHCO3, водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворители выпаривали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,32 (s, 2H), 9,21 (d, 1H), 8,71 (d, 1H), 8,49 (dd, 1H), 8,36-8,19 (m, 4H), 8,12 (dd, 1H), 8,07 (d, 1H), 7,96 (dd, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,56-7,46 (m, 3H), 7,42-7,35 (m, 1H), 3,90 (d, 3H), 3,56 (td, 3H), 3,02 (p, 3H), 2,55 (t, 4H), 2,29-2,19 (m, 4H), 1,45 (d, 3H), 1,37-1,26 (m, 5H), 1,16 (d, 6H), 1,10-1,01 (m, 3H), 0,88 (d, 8H). MS (ESI) масса/электрон 772,1 (M+H)+.
1.89 Синтез 6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.89)
1.89.1 1-((3-Бром-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол
В охлажденный (-30°C) раствор вещества из примера 1.1.3 (500 мг) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли н-бутиллитий (9,67 мл) и смесь перемешивали при -30°C в течение 2 часов. Добавляли по каплям метилйодид (1,934 мл) при -30°C. После завершения добавления смесь перемешивали при -30°C в течение дополнительно 2 часов. Медленно добавляли 1 н. водный раствор HCl в ледяной воде так, что температура поддерживалась ниже 0°C, до достижения pH 6. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут и разбавляли ледяной водой (10 мл) и этилацетатом (20 мл). Слои разделяли и водный слой дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 15/1 до 10/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 337, 339 (M+H)+.
1.89.2 1-(3,5-Диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)мочевина
Смешивали вещество из примера 1.89.1 (2,7 г) и мочевину (4,81 г) и перемешивали при 140°C в течение 16 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и суспендировали в метаноле (200 мл x 2). Нерастворимый материал удаляли путем фильтрации. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 317,3 (M+H) +.
1.89.3 3,5-Диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-амин
В раствор вещества из примера 1.40.2 (2,53 г) в 20% растворе этанола в воде (20 мл) добавляли гидроксид натрия (12,79 г). Смесь перемешивали при 120°C в течение 16 часов и при 140°C в течение еще 16 часов. Добавляли 6 н. водный раствор HCl до достижения pH 6. Смесь концентрировали и остаток суспендировали в метаноле (200 мл). Нерастворимый материал отфильтровывали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли HCl. MS (LC-MS) масса/электрон 273,9 (M+H)+.
1.89.4 трет-Бутил-(2-((3,5-диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)амино)-2-оксоэтил)карбамат
В раствор вещества из примера 1.89.3 (2,16 г) в N,N-диметилформамиде (100 мл) добавляли триэтиламин (3,30 мл), 2-((трет-бутоксикарбонил)амино)уксусную кислоту (1,799 г) и 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфат (3,90 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли воду (40 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (70 мл x 2). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 3/1 до 2/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 430,8 (M+H)+.
1.89.5 трет-Бутил-(2-((3-((4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)амино)-2-оксоэтил)карбамат
В раствор вещества из примера 1.89.4 (1,7 г) в N,N-диметилформамиде (20 мл) при температуре окружающей среды добавляли порциями NIS (N-йодсукцинимид, 1,066 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли ледяную воду (10 мл) и насыщенный водный раствор Na2S2O3 (10 мл). Смесь экстрагировали этилацетатом (30 мл x 2). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 3/1 до 2/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 556,6 (M+H)+.
1.89.6 Метил-2-(5-бром-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилата гидрохлорида (12,37 г) и вещества из примера 1.1.10 (15 г) в диметилсульфоксиде (100 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (12 мл) и смесь перемешивали при 50°C в течение 24 часов. Затем смесь разбавляли этилацетатом (500 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гексане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 448,4 (M+H)+.
1.89.7 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
В раствор вещества из примера 1.89.6 (2,25 г) и [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(II) (205 мг) в ацетонитриле (30 мл) добавляли триэтиламин (3 мл) и пинаколборан (2 мл) и смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 3 часов. Смесь разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. При очистке остатка с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 20% этилацетатом в гексане, получали указанное в заголовке соединение.
1.89.8 Метил-2-(6-(трет-бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)ацетамидо)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 1.2.2, путем замещения вещества из примера 1.1.6 веществом из примера 1.89.5. MS (ESI) масса/электрон 797,4 (M+H)+.
1.89.9 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)ацетамидо)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 1.2.5, путем замещения вещества из примера 1.2.4 веществом из примера 1.89.8. MS (ESI) масса/электрон 783,4 (M+H)+.
1.89.10 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)ацетамидо)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 1.2.6, путем замещения вещества из примера 1.2.5 веществом из примера 1.89.9. MS (ESI) масса/электрон 915,3 (M+H)+.
1.89.11 3-(1-{[3-(2-Аминоацетамидо)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 1.2.9 путем замещения вещества из примера 1.2.8 веществом из примера 1.89.10. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,82 (s, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,90-7,79 (m, 4H), 7,76 (d, 1H), 7,59 (dd, 1H), 7,49-7,38 (m, 3H), 7,37-7,29 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 6,92 (d, 1H), 4,92 (s, 2H), 3,85 (t, 2H), 3,77 (s, 2H), 3,40 (q, 2H), 2,98 (t, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,63 (s, 2H), 1,57-1,38 (m, 4H), 1,15-0,93 (m, 6H), 0,80 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 759,2 (M+H)+.
1.89.12 6-{8-[(1,3-Бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 1.89.11 (102 мг) в N,N-диметилформамиде (6 мл) добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (60 мг) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение выходных. Смесь разбавляли этилацетатом (300 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в дихлорметане/трифторуксусной кислоте (10 мл, 1:1) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворители выпаривали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 8,57 (s, 2H), 8,02 (d, 1H), 7,95 (s, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,52-7,37 (m, 3H), 7,39-7,29 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 4,94 (s, 2H), 3,87 (t, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,16 (q, 2H), 2,99 (t, 2H), 2,77 (t, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,64 (s, 2H), 1,55 (d, 2H), 1,45 (d, 2H), 1,21-0,95 (m, 6H), 0,82 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 867,2 (M+H)+.
1.90 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3,5-диметил-7-({2-[(2-сульфоэтил)амино]этил}сульфанил)трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.90)
1.90.1 3-((1H-Пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-тиол
Перемешивали смесь вещества из примера 1.1.3 (2,8 г) и тиомочевины (15,82 г) в 33% растворе (вес./вес.) HBr в уксусной кислоте (50 мл) при 110°C в течение 16 часов и концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. Остаток растворяли в 20% растворе этанола в воде (об./об.: 200 мл) и добавляли гидроксид натрия (19,06 г). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и концентрировали. Остаток растворяли в воде (60 мл) и подкисляли 6 н. водным раствором HCl до pH 5 - pH 6. Смесь экстрагировали этилацетатом (200 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 319,1 (M+H)+.
1.90.2 2-((3-((1H-Пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)тио)этанол
В раствор вещества из примера 1.90.1 (3,3 г) в этаноле (120 мл) добавляли этоксид натрия (2,437 г). Смесь перемешивали в течение 10 минут и добавляли по каплям 2-хлорэтанол (1,80 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов и нейтрализовали 1 н. водным раствором HCl до pH 7. Смесь концентрировали и остаток экстрагировали этилацетатом (200 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 6/1 до 2/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 321,2 (M+H)+.
1.90.3 2-((3,5-Диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)тио)этанол
В раствор вещества из примера 1.90.2 (2,3 г) в тетрагидрофуране (60 мл) добавляли по каплям н-бутиллитий (14,35 мл, 2 М в гексане) при -20°C в атмосфере азота. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 2 часов. В полученную смесь добавляли метилйодид (4,49 мл) при -20°C и смесь перемешивали при -20°C в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили путем добавления по каплям насыщенного водного раствора NH4Cl при -20°C. Полученную смесь перемешивали в течение 10 минут и подкисляли 1 н. водным раствором HCl до pH 5. Смесь дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 335,3 (M+H)+.
1.90.4 2-((3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)тио)этанол
В раствор вещества из примера 1.90.3 (3,65 г) в N,N-диметилформамиде (90 мл) добавляли N-йодсукцинимид (3,68 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь гасили путем добавления ледяной воды (8 мл) и насыщенного водного раствора NaS2O3 (8 мл). Смесь перемешивали в течение дополнительно 10 минут и экстрагировали этилацетатом (30 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (от 6/1 до 3/1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 461,2 (M+H)+.
1.90.5 Ди-трет-бутил-[2-({3-[(4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил}сульфанил)этил]-2-имидодикарбонат
В холодный раствор (баня с 0°C) вещества из примера 1.90.4 (3 г) в дихлорметане (100 мл) добавляли триэтиламин (1,181 мл) и мезилхлорид (0,559 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и реакционную смесь гасили путем добавления ледяной воды (30 мл). Смесь перемешивали в течение дополнительно 10 минут и экстрагировали дихлорметаном (50 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетонитриле (100 мл) и добавляли NH(Boc)2 (1,695 г) и Cs2CO3 (4,24 г). Смесь перемешивали при 85°C в течение 16 часов и реакционную смесь гасили путем добавления воды (20 мл). Смесь перемешивали в течение 10 минут и экстрагировали этилацетатом (40 мл x 2). Объединенные органические слои промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 10/1 до 6/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 660,1 (M+H)+.
1.90.6 Метил-2-[5-(1-{[3-({2-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}сульфанил)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.2, путем замены вещества из примера 1.1.6 веществом из примера 1.90.5. MS (ESI) масса/электрон 900,2 (M+H)+.
1.90.7A 2-(6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-(1-((3-((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этил)тио)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.5, путем замены вещества из примера 1.2.4 веществом из примера 1.90.6. MS (ESI) масса/электрон 786,2 (M+H)+.
1.90.7B трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этил)тио)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 1.2.6, путем замены вещества из примера 1.2.5 веществом из примера 1.90.7A. MS (ESI) масса/электрон 918,8 (M+H)+.
1.90.8 трет-Бутил-3-(1-((3-((2-аминоэтил)тио)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.90.7B (510 мг) в дихлорметане (5 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь гасили путем добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и трижды экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические вещества высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке продукта. MS (ESI) масса/электрон 818,1 (M+H)+.
1.90.9 3-(1-((3-((2-Аминоэтил)тио)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 1.90.9 выделяли во время получения вещества из примера 1.90.8. MS (ESI) 762,2 (M+H)+.
1.90.10 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-((2-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)этил)тио)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Растворяли вещество из примера 1.90.8 (235 мг) и 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (150 мг) в дихлорметане (1 мл), добавляли N,N-диизопропилэтиламин (140 мкл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение шести дней. Реакционную смесь непосредственно очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0,5 до 3,0% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения.
1.90.11 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-((2-((2-сульфоэтил)амино)этил)тио)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.90.10 веществом из примера 1.2.8 в примере 1.2.9. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,39 (br s, 2H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,51 (d, 1H),7,47 (ddd, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,35 (ddd, 1H), 7,30 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,22 (m, 2H), 3,06 (br m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,79 (t, 2H), 2,74 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,51 (s, 2H), 1,37 (m, 4H), 1,15 (m, 4H), 1,05 (m, 2H), 0,83 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 870,1 (M+H)+.
1.91 Синтез 6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{3-[(2-сульфоэтил)амино]пропил}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (W2.91)
1.91.1 1-((3-Аллил-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-1H-пиразол
В раствор вещества из примера 1.1.3 (0,825 г, 2,55 ммоль) в толуоле (5 мл) добавляли N, N'-азоизобутиронитрил (AIBN, 0,419 г, 2,55 ммоль) и аллилтрибутилстаннан (2,039 мл, 6,38 ммоль). Смесь продували потоком N2 в течение 15 минут, нагревали при 80°C в течение 8 часов и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием 5% этилацетатом в петролейном эфире, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 285,2 (M+H) +.
1.91.2 1-((3-Аллил-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол
В раствор вещества из примера 1.91.1 (200 мг, 0,703 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) при -78°C в атмосфере N2 добавляли н-бутиллитий (2,81 мл, 7,03 ммоль). Смесь перемешивали в течение 2 часов, пока температура не повышалась до -20°C, и затем ее перемешивали при -20°C в течение 1 часа. Добавляли йодметан (0,659 мл, 10,55 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 0,5 часа при -20°C. Реакционную смесь гасили насыщенным раствором NH4Cl и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенный органический слой промывали солевым раствором и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 299,2 (M+H) +.
1.91.3 3-(3,5-Диметил-7-((5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)адамантан-1-ил)пропан-1-ол
В атмосфере азота охлаждали раствор вещества из примера 1.91.2 (2,175 г, 7,29 ммоль) в безводном тетрагидрофуране (42,5 мл) до 0°C. Добавляли по каплям BH3⋅THF (15,30 мл, 15,30 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и охлаждали до 0°C. В реакционную смесь добавляли по каплям 10 н. водный раствор NaOH (5,03 мл, 50,3 ммоль) с последующим добавлением 30-процентного водного раствора H2O2 (16,52 мл, 146 ммоль). Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 90 минут. Реакционную смесь гасили 10-процентным раствором хлористоводородной кислоты (35 мл). Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (2×60 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (3×60 мл) и охлаждали на ледяной бане. Осторожно добавляли насыщенный водный раствор сульфита натрия (15 мл) и смесь перемешивали в течение нескольких минут. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (от 3:1 до 1:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 317,3 (M+H) +.
1.91.4 3-(3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)пропан-1-ол
Перемешивали смесь вещества из примера 1.91.3 (1,19 г, 3,76 ммоль) и 1-йодпирролидин-2,5-диона (1,015 г, 4,51 ммоль) в N,N-диметилформамиде (7,5 мл) в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили насыщенным раствором Na2SO3. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали насыщенным раствором Na2SO3, насыщенным раствором Na2CO3, водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над безводным Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (от 3:1 до 1:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 443,1 (M+H) +.
1.91.5 3-(3-((4-Йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)пропилметансульфонат
В раствор вещества из примера 1.91.4 (1,55 г, 3,50 ммоль) в CH2Cl2 (20 мл) при 0°C медленно добавляли (CH3CH2)3N (0,693 мл, 4,98 ммоль) и мезилхлорид (0,374 мл, 4,80 ммоль). Смесь перемешивали в течение 3,5 часа при 20°C и разбавляли с помощью CH2Cl2, промывали насыщенным раствором NH4Cl, NaHCO3 и солевым раствором. Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 521,1 (M+H) +.
1.91.6 Ди-трет-бутил-(3-{3-[(4-йод-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил}пропил)-2-имидодикарбонат
В раствор вещества из примера 1.91.5 (1,92 г, 3,69 ммоль) в CH3CN (40 мл) при 20°C добавляли ди-трет-бутилиминодикарбонат (0,962 г, 4,43 ммоль) и Cs2CO3 (2,404 г, 7,38 ммоль). Смесь перемешивали в течение 16 часов при 80°C, разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (10:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 642,3 (M+H) +.
1.91.7 Метил-2-[5-{1-[(3-{3-[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}-6-(трет-бутоксикарбонил)пиридин-2-ил]-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоксилат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.2, путем замены вещества из примера 1.1.6 веществом из примера 1.91.6. MS (ESI) масса/электрон 882,2 (M+H)+.
1.91.8 2-[6-(трет-Бутоксикарбонил)-5-{1-[(3-{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил]-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-8-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.5, путем замены вещества из примера 1.2.4 веществом из примера 1.91.7. MS (ESI) масса/электрон 768,4 (M+H)+.
1.91.9 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.6, путем замены вещества из примера 1.2.5 веществом из примера 1.91.8. MS (ESI) масса/электрон 901,1 (M+H)+.
1.91.10 трет-Бутил-3-(1-((3-(3-аминопропил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколинат
В раствор вещества из примера 1.91.9 (500 мг) в дихлорметане (5 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь гасили путем добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и трижды экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические вещества высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке продукта.
1.91.11 3-(1-((3-(3-Аминопропил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.91.9 (350 мг) в дихлорметане (5 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл). Смесь перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали и остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 4H), 7,47 (dt, 3H), 7,36 (q, 2H), 7,27 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,72 (q, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,45 (t, 2H), 1,18-1,05 (m, 9H), 1,00 (d, 6H), 0,80 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 744,2 ( M+H)+.
1.91.12 трет-Бутил-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(3-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этил)амино)пропил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколинат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.8, путем замены вещества из примера 1.2.7 веществом из примера 1.91.10.
1.91.13 6-{8-[(1,3-Бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3,5-диметил-7-{3-[(2-сульфоэтил)амино]пропил}трицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 1.2.9, путем замены вещества из примера 1.2.8 веществом из примера 1.91.12. 1H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ 12,85 (s, 1H), 8,02 (dd, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,54-7,39 (m, 3H), 7,38-7,31 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 4,94 (s, 2H), 3,87 (t, 2H), 3,15 (p, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,86 (dq, 2H), 2,76 (t, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,47 (td, 2H), 1,08 (d, 9H), 0,99 (d, 7H), 0,79 (s, 7H). MS (ESI) масса/электрон 852,2 (M+H)+.
Пример 2. Синтез иллюстративных синтонов
В данном примере предусмотрены способы синтеза иллюстративных синтонов, применимых в получении ADC.
2.1 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона CZ)
Охлаждали вещество из примера 1.2.9 (100 мг) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонат (приобретенный у Synchem, 114 мг) в N,N-диметилформамиде (7 мл) на бане с водой и льдом и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,15 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут и затем при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,75-7,82 (m, 2H), 7,40-7,63 (m, 6H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,24-7,29 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,01 (s, 1H), 4,83-5,08 (m, 4H), 4,29-4,48 (m, 1H), 4,19 (t, 1H), 3,84-3,94 (m, 2H), 3,80 (d, 2H), 3,14-3,29 (m, 2H), 2,87-3,06 (m, 4H), 2,57-2,69 (m, 2H), 2,03-2,24 (m, 5H), 1,89-2,02 (m, 1H), 1,53-1,78 (m, 2H), 1,26-1,53 (m, 8H), 0,89-1,27 (m, 12H), 0,75-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1452,2 (M+H)+.
2.2 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-сульфопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона DH)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.6.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,75-7,81 (m, 2H), 7,54-7,64 (m, 3H), 7,40-7,54 (m, 3H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,24-7,31 (m, 3H), 6,93-7,01 (m, 3H), 4,86-5,03 (m, 4H), 4,32-4,48 (m, 2H), 4,13-4,26 (m, 2H), 3,31-3,45 (m, 4H), 3,24 (d, 4H), 2,88-3,07 (m, 4H), 2,30-2,39 (m, 2H), 2,04-2,24 (m, 5H), 1,86-2,03 (m, 1H), 0,89-1,82 (m, 27H), 0,74-0,88 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1466,3 (M+H)+.
2.3 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.4 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона EP)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.11.4. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 8,01-8,10 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,55-7,65 (m, 3H), 7,41-7,53 (s, 1H), 7,32-7,38 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 6,97-7,02 (m, 3H), 6,96 (s, 3H), 6,03 (m, 3H), 4,90-5,03 (m, 3H), 4,31-4,46 (s, 3H), 4,20 (m, 3H), 3,88 (m, 3H), 3,82 (m, 2H), 2,97-3,06 (m, 1H), 2,88-2,98 (m, 1H), 2,58-2,68 (s, 3H), 2,05-2,22 (m, 3H), 1,92-2,02 (m, 2H), 0,89-1,75 (m, 23H), 0,77-0,87 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1496,3 (M+H)+.
2.5 Синтез метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитил}амино)бензил]окси}карбонил)амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозида (синтона EF)
2.5.1 Пент-4-иналь
В раствор оксалилхлорида (9,12 мл), растворенного в дихлорметане (200 мл), при -78°C добавляли диметилсульфоксид (14,8 мл), растворенный в дихлорметане (40 мл), в течение 20 минут. После перемешивания раствора в течение дополнительно 30 минут добавляли 4-пентинол (8,0 г), растворенный в дихлорметане (80 мл), в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение дополнительно 60 минут. Добавляли триэтиламин (66,2 мл) при -78°C и реакционную смесь перемешивали в течение 60 минут и затем обеспечивали ее нагревание до 10°C в течение дополнительно часа. Добавляли воду (200 мл) и два слоя разделяли. Водный слой подкисляли 1% водным раствором HCl и затем обратно экстрагировали дихлорметаном (3×100 мл). Объединенные органические слои промывали 1% водным раствором HCl и водным раствором NaHCO3. Водные экстракты обратно экстрагировали дихлорметаном (2×100 мл) и объединенные органические экстракты промывали солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации растворитель удаляли путем ротационного выпаривания (водяная баня, 30°C) с получением указанного в заголовке соединения.
2.5.2 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-(пент-4-ин-1-иламино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.7 (85 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) добавляли пент-4-иналь (8,7 мг), уксусную кислоту (20 мг) и сульфат натрия (300 мг). Смесь перемешивали в течение 1 часа и в реакционную смесь добавляли триацетоксиборогидрид натрия (45 мг). Смесь перемешивали в течение ночи, затем разбавляли этилацетатом (200 мл), промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и выпаривания растворителя получали остаток, который растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 3 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 812,1 (M+H)+.
2.5.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((3-(1-(((2S,3R,4R,5S,6S)-3,4,5-тригидрокси-6-метокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)метил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)пропил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(азидометил)-6-метокситетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (8,63 мг) в трет-бутаноле (2 мл) и воде (1 мл) добавляли вещество из примера 2.5.2 (20 мг), пентагидрат сульфата меди(II) (2,0 мг) и аскорбат натрия (5 мг). Смесь перемешивали 20 минут при 100°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). В смесь добавляли моногидрат гидроксида лития (50 мг) и ее перемешивали в течение ночи. Смесь нейтрализовали трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1032,2 (M+H)+.
2.5.4 Метил-6-[4-(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитил}амино)бензил]окси}карбонил)амино}пропил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил]-6-дезокси-бета-L-глюкопиранозид
В раствор 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-4-нитрофенилкарбоната (7,16 мг) и вещества из примера 2.5.3 (10 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,1 мл). Смесь перемешивали в течение ночи, затем подкисляли трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид -d6) δ ppm 9,65 (s, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,64-7,72 (m, 2H), 7,53-7,63 (m, 3H), 7,38-7,51 (m, 4H), 7,30-7,37 (m, 2H), 7,22-7,27 (m, 3H), 6,84-6,98 (m, 3H), 4,97 (d, 4H), 4,65 (dd, 1H), 4,50 (d, 1H), 4,36-4,46 (m, 1H), 4,25-4,32 (m, 1H), 4,10-4,20 (m, 1H), 3,85-3,95 (m, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,66-3,73 (m, 2H), 2,99-3,03 (m, 7H), 2,57 (t, 3H), 2,12-2,22 (m, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,99-2,05 (m, 2H), 1,70-1,88 (m, 4H), 1,39-1,67 (m, 8H), 1,35 (s, 3H), 0,92-1,28 (m, 14H), 0,80-0,88 (m, 16H). MS (ESI) масса/электрон 1629,5 (M+H)+.
2.6 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-(4-{[([2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-{3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}карбамоил)окси]метил}фенил)-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона EG)
2.6.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((3-(1-((2R,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-азидо-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (8,63 мг) в трет-бутаноле (2 мл) и воде (1 мл) добавляли вещество из примера 2.5.2 (20 мг), пентагидрат сульфата меди(II) (2,0 мг) и аскорбат натрия (5 мг). Смесь перемешивали 20 минут при 100°C при условиях микроволнового излучения (Biotage Initiator). В смесь добавляли моногидрат гидроксида лития (50 мг) и ее перемешивали в течение ночи. Смесь нейтрализовали трифторуксусной кислотой и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1032,1 (M+H)+.
2.6.2 N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-(4-{[([2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-{3-[1-(бета-D-глюкопирануронозил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропил}карбамоил)окси]метил}фенил)-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.6.1 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,64 (s, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,52-7,62 (m, 3H), 7,20-7,50 (m, 9H), 6,84-6,98 (m, 3H), 5,56 (d, 1H), 4,98 (d, 4H), 4,36-4,49 (m, 2H), 4,11-4,23 (m, 2H), 3,96 (d, 2H), 3,74-3,91 (m, 7H), 3,51-3,58 (m, 5H), 3,35-3,49 (m, 10H), 2,97-3,02 (m, 6H), 2,57-2,66 (m, 3H), 2,12-2,24 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,69-2,01 (m, 3H), 1,35-1,65 (m, 9H), 0,93-1,28 (m, 10H), 0,81-0,89 (m, 10H). MS (ESI) масса/электрон 1629,4 (M+H)+.
2.7 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона EH)
В раствор вещества из примера 1.13.8 (0,018 г) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,015 г, 0,023 ммоль) в N,N-диметилформамиде (0,75 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,015 мл). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (0,75 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 9,93 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,84-7,76 (m, 2H), 7,61 (d, 1H), 7,57 (d, 2H), 7,53 (dd, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,39-7,30 (m, 4H), 7,26 (d, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (dd, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,90 (t, 2H), 4,75-4,65 (m, 1H), 4,46-4,33 (m, 2H), 4,17 (dd, 2H), 3,66-3,47 (m, 4H), 3,36 (t, 4H), 3,12 (s, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,85-2,60 (m, 4H), 2,25-2,05 (m, 5H), 2,05-1,90 (m, 1H), 1,58-0,76 (m, 32H). MS (ESI) масса/электрон 1423,2 (M+H)+.
2.8 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[4-(бета-D-глюкопиранозилокси)бензил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ER)
2.8.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((4-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.7 (44,5 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли 4-(((2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегид (17 мг) и MgSO4 (300 мг). Смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли цианоборогидрид натрия на смоле (300 мг). Смесь перемешивали в течение ночи. Смесь фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1015,2 (M+H)+.
2.8.2 N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[4-(бета-D-глюкопиранозилокси)бензил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.8.1 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 7,96-8,14 (m, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,55-7,68 (m, 3H), 7,09-7,52 (m, 11H), 6,91-7,01 (m, 5H), 5,09 (d, 1H), 4,95 (dd, 4H), 4,35-4,47 (m, 4H), 4,14-4,23 (m, 3H), 3,86-3,94 (m, 6H), 3,31-3,46 (m, 8H), 3,16-3,25 (m, 3H), 2,90-3,04 (m, 4H), 2,59 (s, 1H), 1,88-2,24 (m, 6H), 0,88-1,75 (m, 24H), 0,76-0,90 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1613,7 (M+H)+.
2.9 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ES)
2.9.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3,5-диметил-7-(2-((4-(((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)амино)этокси)адамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.7 (44,5 мг) в тетрагидрофуране (2 мл) и уксусной кислоте (0,2 мл) добавляли 4-(((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензальдегид (17 мг) и MgSO4 (300 мг). Смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли цианоборогидрид натрия на смоле (300 мг). Смесь перемешивали в течение ночи. Смесь фильтровали и растворитель выпаривали. Остаток растворяли в диметилсульфоксиде/метаноле (1:1, 4 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1015,2 (M+H)+.
2.9.2 N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[4-(бета-D-аллопиранозилокси)бензил]-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.9.1 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 10,00 (s, 1H),, 7,96-8,11 1H), 7,79 (d, 1H), 7,53-7,65 (s, 1H), 7,08-7,52 (s, 1H),, (s, 1H), ), (d, 1H), ), (s, 1H), ), 4,35-4,48 1H), ), (s, (m,H), 3,82-3,96 (s, 8H), 3,32-3,50 (s, 1H), 3,12-3,25 4,35-4,48 1H), 2,90-3,06 (s, 8H), 1,89-2,19 (s, 1H), 0,88-1,75 (s, 22H), 0,76-0,88 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1612,5 (M+H)+.
2.10 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона EQ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.12.2. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,99 (s, 1H), 8,01-8,09 (m, 2H), 7,76-7,81 (m, 2H), 7,56-7,64 (m, 3H), 7,41-7,53 (m, 3H), 7,36 (q, 2H), 7,25-7,30 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 5,98 (s, 1H), 4,89-5,07 (m, 4H), 4,38 (s, 1H), 4,19 (t, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (d, 2H), 2,89-3,08 (m, 5H), 2,04-2,24 (m, 5H), 1,89-2,02 (m, 1H), 1,76-1,87 (m, 2H), 0,89-1,72 (m, 23H), 0,78-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1452,2 (M+H)+.
2.11 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона EU)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.12.2 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонатом соответственно. диметилсульфоксид 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,93 (s, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,72-7,83 (m, 2H), 7,54-7,65 (m, 3H), 7,41-7,54 (m, 3H), 7,31-7,40 (m, 2H), 7,24-7,30 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 4,87-5,11 (m, 3H), 4,11-4,45 (m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,79 (d, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,63-2,70 (m, 1H), 2,29-2,37 (m, 1H), 2,03-2,20 (m, 5H), 1,73-2,00 (m, 5H), 1,39-1,55 (m, 4H), 0,88-1,38 (m, 19H), 0,72-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1364,5 (M-H)-.
2.12 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона EV)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.14.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,78 (t, 2H), 7,61 (t, 3H), 7,39-7,54 (m, 3H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,25-7,30 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,01 (s, 1H), 4,97 (d, 4H), 4,29-4,47 (m, 2H), 4,14-4,23 (m, 2H), 3,85-3,93 (m, 2H), 3,32-3,42 (m, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,88-3,09 (m, 3H), 1,87-2,23 (m, 6H), 0,91-1,74 (m, 27H), 0,72-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1466,3 (M+H)+.
2.13 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона EW)
В раствор вещества из примера 1.15 (0,020 г) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,017 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,017 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,93 (s, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,86-7,76 (m, 3H), 7,63-7,41 (m, 7H), 7,39-7,32 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,30-7,21 (m, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,93 (s, 2H), 4,49-4,33 (m, 2H), 4,18 (dd, 2H), 4,15-4,08 (m, 2H), 3,90-3,86 (m, 2H), 3,36 (t, 2H), 3,34-3,27 (m, 1H), 3,18-3,04 (m, 2H), 3,04-2,96 (m, 2H), 2,89-2,61 (m, 2H), 2,27-2,05 (m, 5H), 2,03-1,87 (m, 1H), 1,59-1,42 (m, 4H), 1,42-0,91 (m, 18H), 0,91-0,76 (m, 11H). MS (-ESI) масса/электрон 1407,5 (M-H)-.
2.14 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}-(3-фосфонопропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона EX)
Перемешивали смесь вещества из примера 1.16.2 (59 мг), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (48 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,056 мл) в 2 мл N,N-диметилформамида в течение 24 часов. Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на системе Isolera One от Biotage с применением колонки C18 на 40 г, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте/воде. Необходимые фракции концентрировали и продукт лиофилизировали из воды и 1,4-диоксана с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,97 (bs, 1H), 8,04 (m, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,59 (m, 3H), 7,46 (m, 3H), 7,36 (m, 2H), 7,27 (m, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 4,97 (m, 4H), 4,40 (m, 2H), 4,17 (dd, 2H), 3,50-4,10 (m, 6H), 3,45 (m, 2H), 3,40 (m, 2H), 3,26 (m, 2H), 3,01 (m, 2H), 2,95 (s, 2H), 2,79 (s, 2H), 2,15 (m, 2H), 2,09 (s, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,60 (m, 1-2H), 1,35-1,50 (m, 6H), 1,25 (m, 4H), 1,17 (m, 2H), 1,10 (m, 2H), 0,97 (m, 1-2H), 0,84 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1510,4 (M+H)+.
2.15 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[{2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этокси]этил}-(3-фосфонопропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-аланинамида (синтона EY)
Смесь вещества из примера 1.16.2 (59 мг), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (42 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,042 мг) в 2 мл N,N-диметилформамида перемешивали в течение 24 часов. Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на системе Isolera One от Biotage с применением колонки C18 на 40 г, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте/воде. Фракции концентрировали и продукт лиофилизировали из воды и 1,4-диоксана с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. MS (ESI) масса/электрон 1422,6 (M-H)+.
2.16 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона EZ)
Перемешивали смесь вещества из примера 1.14.4 (50 мг), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (38 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,050 мл) в 2 мл N,N-диметилформамида в течение 24 часов. Смесь очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на системе Isolera One от Biotage с применением колонки C18 на 40 г, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте/воде. Необходимые фракции концентрировали и продукт лиофилизировали из воды и 1,4-диоксана с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,94 (bs, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 2H), 7,61 (m, 3H), 7,47 (m, 3H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (m, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,97 (m, 4H), 4,40 (m, 2H), 4,16 (dd, 2H), 3,50-4,10 (m, 6H), 3,68 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 3,25 (m, 4H), 3,02 (m, 2H), 2,94 (s, 2H), 2,79 (s, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,08 (s, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,40-1,50 (m, 6H), 1,20-1,30 (m, 6H), 1,08-1,19 (m, 4H), 0,97 (m, 1-2H), 0,76-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1380,3 (M+H)+.
2.17 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-3-карбокси-2-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)пропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FD)
В раствор вещества из примера 1.17 (0,040 г) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,034 г) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,035 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 9,92 (s, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 2H), 7,62 (d, 1H), 7,57 (d, 2H), 7,54-7,41 (m, 3H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,31-7,23 (m, 4H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (dd, 1H), 5,01-4,89 (m, 4H), 4,78 (dq, 1H), 4,45-4,30 (m, 1H), 4,23-4,11 (m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (s, 2H), 3,42-3,26 (m, 6H), 3,06 (s, 1H), 3,01 (t, 2H), 2,80 (s, 2H), 2,76-2,62 (m, 1H), 2,46-2,36 (m, 1H), 2,25-2,05 (m, 5H), 2,05-1,92 (m, 1H), 1,58-1,42 (m, 4H), 1,42-0,91 (m, 20H), 0,91-0,78 (m, 9H). MS (ESI) масса/электрон 1387,4 (M+H)+.
2.18 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[4-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона FS)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.19.2 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 7,97-8,14 (m, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,07-7,65 (m, 13H), 6,87-7,01 (m, 4H), 5,92-6,08 (m, 1H), 4,87-5,07 (m, 4H), 4,33-4,48 (m, 3H), 4,13-4,26 (m, 1H), 3,74-3,94 (m, 6H), 3,14-3,34 (m, 8H), 2,84-3,05 (m, 6H), 1,87-2,25 (m, 6H), 0,89-1,73 (m, 21H), 0,76-0,87 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1626,4 (M+H)+.
2.19 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-фосфоноэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона FI)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.20.11. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 10,00 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,84-7,90 (m, 1H), 7,79 (dd, 3H), 7,55-7,66 (m, 2H), 7,46 (s, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,29 (t, 3H), 7,18-7,25 (m, 1H), 6,99 (s, 2H), 5,99 (s, 1H), 5,00 (d, 1H), 4,38 (s, 1H), 4,13-4,24 (m, 1H), 3,96 (s, 2H), 3,87 (d, 2H), 2,88-3,08 (m, 4H), 2,84 (q, 2H), 2,04-2,26 (m, 5H), 1,89-2,01 (m, 3H), 1,75-1,88 (m, 2H), 1,63-1,74 (m, 1H), 0,91-1,63 (m, 21H), 0,76-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1450,5 (M-H)-.
2.20 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (синтона FV)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.22.5 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,00 (v br s, 1H), 10,00 (s, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,16 (dd, 1H), 8,06 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,59 (br m, 2H), 7,53 (m, 2H), 7,45 (d, 1H), 7,37 (t, 1H), 7,30 (s, 1H) 7,27 (d, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 4,98 (m, 4H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (br m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (br d, 2H), 3,44, 3,36 (br m, m, total 6H), 3,24 (m, 2H), 2,94-3,01 (m, 4H), 2,63 (br m, 2H), 2,14 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,97 (br m, 1H), 1,68 (br m, 1H), 1,58 (br m, 1H), 1,34-1,47 (m, 8H), 1,08-1,23 (m 10H), 0,95 (br m, 2H), 0,85-0,80 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1451,4 (M-H)-.
2.21 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона GC)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.21.7. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,40 (s, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,01 (dd, 1H), 7,89 (t, 1H), 7,74-7,84 (m, 3H), 7,58 (d, 2H), 7,47 (s, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,19-7,33 (m, 5H), 7,00 (s, 2H), 4,91 (q, 2H), 4,64-4,76 (m, 2H), 4,33-4,43 (m, 2H), 4,15-4,24 (m, 2H), 3,92-4,03 (m, 2H), 3,88 (s, 2H), 3,32-3,50 (m, 6H), 3,10-3,22 (m, 2H), 2,89-3,07 (m, 2H), 2,70-2,89 (m, 4H), 2,60-2,70 (m, 1H), 2,05-2,28 (m, 5H), 1,90-2,03 (m, 3H), 1,64-1,77 (m, 1H), 1,53-1,65 (m, 1H), 0,92-1,53 (m, 21H), 0,77-0,92 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1507,3 (M-H)-.
2.22 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[(2R)-1-{[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)амино}-1-оксо-3-сульфопропан-2-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона GB)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.21.7 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонатом соответственно. диметилсульфоксид 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,93 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,01 (dd, 1H), 7,88 (t, 1H), 7,74-7,84 (m, 3H), 7,57 (d, 2H), 7,46 (s, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,17-7,33 (m, 5H), 6,99 (s, 2H), 4,91 (d, 2H), 4,65-4,76 (m, 1H), 4,30-4,51 (m, 1H), 4,13-4,21 (m, 1H), 3,92-4,00 (m, 2H), 3,88 (s, 2H), 3,29-3,46 (m, 4H), 2,93-3,21 (m, 3H), 2,68-2,88 (m, 4H), 2,58-2,68 (m, 1H), 2,04-2,26 (m, 5H), 1,89-2,02 (m, 3H), 1,37-1,54 (m, 6H), 0,92-1,34 (m, 15H), 0,75-0,91 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон (M+H)+.
2.23 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (синтона FW)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.23.4 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,38 (v br s, 1H), 10,00 (s, 1H), 8,66 (m, 2H), 8,06 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,59 (br m, 2H), 7,53 (m, 1H), 7,47 (m 2H), 7,37 (t, 1H), 7,30 (s, 1H) 7,27 (d, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 4,98 (m, 4H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (br m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (br d, 2H), 3,40 (br m, 6H), 3,24 (m, 2H), 2,98 (m, 4H), 2,63 (m, 2H), 2,16 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,97 (br m, 1H), 1,68 (br m, 1H), 1,58 (br m, 1H), 1,34-1,47(m, 8H), 1,08-1,23 (m, 10H), 0,95 (br m, 2H), 0,85-0,80 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1451,5 (M-H)-.
2.24 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона GD)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.24.2. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 10,00 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,85-7,92 (m, 1H), 7,73-7,85 (m, 3H), 7,55-7,65 (m, 2H), 7,46 (s, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,28 (t, 3H), 7,22 (t, 1H), 6,99 (s, 2H), 6,00 (s, 1H), 4,99 (d, 1H), 4,28-4,50 (m, 1H), 4,19 (s, 1H), 3,77-4,03 (m, 4H), 3,31-3,41 (m, 2H), 3,20-3,29 (m, 2H), 2,87-3,08 (m, 3H), 2,83 (t, 2H), 2,63 (d, 2H), 2,05-2,25 (m, 5H), 1,88-2,01 (m, 3H), 1,69 (t, 1H), 1,53-1,63 (m, 1H), 1,31-1,53 (m, 8H), 1,04-1,29 (m, 11H), 0,89-1,02 (m, 2H), 0,77-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1450,4 (M-H)-.
2.25 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона GK)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.25.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,75-7,82 (m, 2H), 7,60 (t, 3H), 7,41-7,53 (m, 3H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,24-7,29 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,94 (d, 3H), 5,97 (s, 1H), 4,88-5,04 (m, 4H), 4,38 (d, 1H), 4,12-4,24 (m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,75-3,84 (m, 2H), 3,32-3,40 (m, 2H), 3,28 (d, 2H), 2,90-3,05 (m, 4H), 2,42-2,49 (m, 2H), 2,05-2,22 (m, 5H), 1,87-2,01 (m, 1H), 0,90-1,76 (m, 22H), 0,74-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1414,5 (M-H)-.
2.26 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона GJ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.25.2 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонатом соответственно. диметилсульфоксид 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,78 (s, 1H), 9,93 (s, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,75-7,83 (m, 2H), 7,54-7,65 (m, 3H), 7,41-7,52 (m, 3H), 7,32-7,40 (m, 2H), 7,24-7,29 (m, 3H), 6,98 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 4,90-5,04 (m, 4H), 4,32-4,45 (m, 2H), 4,12-4,21 (m, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,79 (d, 2H), 3,31-3,46 (m, 4H), 3,23-3,31 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,46 (t, 2H), 2,04-2,22 (m, 5H), 1,87-2,02 (m, 1H), 1,40-1,60 (m, 4H), 0,91-1,37 (m, 17H), 0,76-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1328,4 (M-H)-.
2.27 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2R)-3-карбокси-2-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)пропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона GW)
В раствор вещества из примера 1.27 (0,043 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонат (0,042 г) с последующим добавлением N,N-диизопропилэтиламина (0,038 мл), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. После перемешивания в течение 16 часов реакционную смесь разбавляли водой (0,5 мл) и N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,05 (s, 1H), 10,15 (s, 1H), 8,36 (d, 1H), 8,26 (d, 1H), 8,02 (d, 2H), 7,95-7,77 (m, 4H), 7,77-7,63 (m, 3H), 7,63-7,54 (m, 2H), 7,54-7,46 (m, 3H), 7,22 (s, 2H), 7,18 (dd, 1H), 5,17 (d, 4H), 5,01 (dq, 1H), 4,61 (p, 1H), 4,39 (t, 1H), 4,11 (t, 2H), 4,03 (s, 2H), 3,64-3,49 (m, 2H), 3,29 (s, 1H), 3,24 (t, 2H), 3,03 (s, 2H), 2,92 (dt, 1H), 2,73-2,61 (m, 4H), 2,35 (d, 4H), 2,18 (dt, 1H), 1,71 (h, 4H), 1,65-1,13 (m, 18H), 1,13-1,01 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1387,3 (M+H)+.
2.28 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[1-(карбоксиметил)пиперидин-4-ил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HF)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.28 (0,0449 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,049 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,044 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,78 (t, 2H), 7,65-7,58 (m, 3H), 7,54-7,41 (m, 3H), 7,38 (d, 1H), 7,34 (d, 1H), 7,32-7,24 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,97 (s, 1H), 5,01 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,38 (q, 1H), 4,23-4,14 (m, 1H), 4,05 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (s, 2H), 3,36 (t, 2H), 3,26-2,86 (m, 8H), 2,27-2,02 (m, 6H), 2,02-1,86 (m, 2H), 1,86-1,75 (m, 2H), 1,75-1,54 (m, 2H), 1,54-0,90 (m, 24H), 0,89-0,72 (m, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1485,2 (M+H)+.
2.29 Синтез соли (S)-6-((2-((3-((4-(6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил)-5,7-диметиладамантан-1-ил)окси)этил)(метил)амино)-5-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)-N,N,N-триметил-6-оксогексан-1-аминия (синтона HG)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.29 (8 мг), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (8,24 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (7,50 мкл, 0,043 ммоль) в N,N-диметилформамиде (0,250 мл) при комнатной температуре. Через 3 часа реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1,25 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,96 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,83-7,76 (m, 2H), 7,66-7,56 (m, 3H), 7,53-7,42 (m, 4H), 7,41-7,32 (m, 2H), 7,31-7,23 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,04-4,87 (m, 4H), 4,44-4,33 (m, 2H), 4,24-4,12 (m, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,50-3,13 (m, 9H), 3,11-2,92 (m, 14H), 2,80 (s, 1H), 2,25-2,04 (m, 5H), 2,03-1,89 (m, 1H), 1,75-0,91 (m, 28H), 0,91-0,77 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1528,5 (M+H)+.
2.30 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона HP)
The title compound was prepared as described in Example 2.1, replacing 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanamido)-3-methylbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzyl (4-nitrophenyl) carbonate with 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanamido)-3-methylbutanamido)propanamido)benzyl (4-nitrophenyl) carbonate. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,94 (s, 1H), 8,12 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 2H), 7,40-7,63 (m, 6H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,24-7,30 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,90-5,03 (m, 4H), 4,31-4,47 (m, 1H), 4,09-4,24 (m, 1H), 3,84-3,93 (m, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,30-3,39 (m, 2H), 3,20-3,28 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,57-2,65 (m, 2H), 2,05-2,22 (m, 5H), 1,87-2,02 (m, 2H), 1,41-1,58 (m, 4H), 1,22 (d, 18H), 0,74-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1364,5 (M-H)-.
2.31 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HR)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.30.2 (0,038 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,035 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,032 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1,25 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,10-8,00 (m, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,64-7,56 (m, 3H), 7,53 (d, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,39-7,32 (m, 2H), 7,29 (d, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,00 (s, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,48-4,32 (m, 2H), 4,27-4,15 (m, 2H), 4,11 (d, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,40-3,33 (m, 4H), 3,24-3,11 (m, 2H), 3,11-2,72 (m, 8H), 2,26-2,04 (m, 4H), 2,04-1,80 (m, 3H), 1,80-0,92 (m, 26H), 0,92-0,77 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1535,4 (M+H)+.
2.32 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HU)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.31.11 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,03 (dd, 2H), 7,70-7,84 (m, 3H), 7,59 (d, 2H), 7,48 (dd, 2H), 7,23-7,37 (m, 4H), 6,93-7,02 (m, 4H), 4,99 (d, 4H), 4,12-4,21 (m, 8H), 3,88-3,96 (m, 4H), 3,75-3,84 (m, 4H), 3,23-3,49 (m, 7H), 2,73-3,07 (m, 8H), 1,89-2,21 (m, 9H), 0,91-1,77 (m, 25H), 0,77-0,91 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1496,3 (M+H)+.
2.33 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HT)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.26.2 (0,040 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,030 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,020 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1,25 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 9,26 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 8,05-8,01 (m, 1H), 7,79 (d, 2H), 7,62 (d, 1H), 7,61-7,57 (m, 2H), 7,52-7,42 (m, 3H), 7,38 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,32-7,26 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,01 (s, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,96 (s, 3H), 4,44-4,33 (m, 2H), 4,18 (dd, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,71-3,61 (m, 2H), 3,53 (t, 2H), 3,36 (t, 2H), 3,07-2,66 (m, 8H), 2,28-2,06 (m, 6H), 2,05-1,92 (m, 2H), 1,92-1,80 (m, 2H), 1,78-0,95 (m, 32H), 0,92-0,77 (m, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1549,5 (M+H)+.
2.34 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HV)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.14.4 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,32-8,45 (m, 1H), 8,12-8,27 (m, 3H), 7,98-8,09 (m, 3H), 7,93 (d, 1H), 7,66-7,83 (m, 4H), 7,54-7,64 (m, 2H), 7,46-7,50 (m, 2H), 7,24-7,40 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 5,93-6,09 (m, 1H), 4,99 (s, 3H), 4,33-4,49 (m, 3H), 4,15-4,20 (m, 3H), 3,19-3,50 (m, 10H), 2,86-3,07 (m, 3H), 1,87-2,27 (m, 7H), 0,91-1,77 (m, 26H), 0,76-0,89 (m, 10H). MS (ESI) масса/электрон 1461,1 (M+H)+.
2.35 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона HZ)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.36.2 (0,031 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,025 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,016 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1,25 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,82 (s, 1H), 8,05 (dd, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,70-7,53 (m, 2H), 7,53-7,24 (m, 6H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,00 (s, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,37 (q, 2H), 4,25-4,15 (m, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,69-3,61 (m, 2H), 3,44-3,30 (m, 4H), 3,08-2,90 (m, 4H), 2,90-2,72 (m, 4H), 2,27-2,04 (m, 5H), 2,04-1,89 (m, 2H), 1,77-0,94 (m, 28H), 0,91-0,78 (m, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1499,5 (M+H)+.
2.36 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (синтона IA)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.39.2 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,60 (dd, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,06 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,59 (br m, 2H), 7,50 (m, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,27 (d, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 5,98 (br s, 1H), 4,98 (s, 4H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (br m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (br d, 2H), 3,36 (br m, 3H), 3,24 br (m, 4H), 2,98 (m, 4H), 2,16 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 1,95 (br m, 1H), 1,67 (br m, 3H), 1,34-1,47 (m, 9H), 1,08-1,23 (m, 11H), 0,95 (br m, 2H), 0,85-0,80 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1465,5 (M-H)-.
2.37 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N5-карбамоил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-орнитинамида (синтона IF)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.40.2 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,52 (dd, 1H), 8,16 (dd, 1H), 8,05 (br d, 1H), 7,78 (br d, 1H), 7,62 (m, 1H), 7,58 (br m, 2H), 7,52 (m, 2H), 7,44 (d, 1H), 7,38 (t, 1H), 7,29 (s, 1H) 7,27 (d, 2H), 6,99 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 4,98 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (br m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (br d, 2H), 3,36 (br m, 3H), 3,24 br (m, 4H), 2,98 (m, 4H), 2,16 (m, 2H), 2,12 (s, 3H), 1,95 (br m, 1H), 1,67 (br m, 3H), 1,47-1,34 (m, 9H), 1,08-1,23 (m, 11H), 0,95 (br m, 2H), 0,85-0,80 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1451,5 (M-H)-.
2.38 Синтез N-{6-[(хлорацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамида (синтона IG)
2.38.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.9 (0,050 г), (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (0,039 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,027 мл) в N,N-диметилформамиде (1 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи в реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,027 мл) и перемешивание продолжали в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой и смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 5 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1499,5 (M+H)+.
2.38.2 N-{6-[(Хлорацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-L-аланинамид
В раствор 6-(2-хлорацетамидо)гексановой кислоты (6 мг) и 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфата(V) (0,011 г) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,015 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут. Данный раствор добавляли к веществу из примера 2.38.1 (0,022 г) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,93 (s, 1H), 8,20-8,10 (m, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,83-7,76 (m, 2H), 7,64-7,55 (m, 3H), 7,55-7,50 (m, 1H), 7,50-7,41 (m, 2H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,32-7,24 (m, 3H), 6,96 (d, 1H), 5,07-4,92 (m, 3H), 4,39 (p, 1H), 4,18 (dd, 2H), 4,01 (s, 2H), 3,92-3,76 (m, 6H), 3,54-3,32 (m, 4H), 3,25 (t, 2H), 3,13-2,93 (m, 4H), 2,72-2,58 (m, 2H), 2,29-2,12 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,05-1,92 (m, 1H), 1,58-0,89 (m, 18H), 0,89-0,77 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1362,2 (M+H)+.
2.39 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IJ)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.41.3 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 10,03 (s, 1H), (s, 1H) ), 8,26-8,34 (m,H) ), 7,95-8,11 1H) ), 7,95-8,11 1H) ), 8,26-8,34 (m,H) ), 6,95-7,05H) 3 (s, 1H) 1 8,26-8,34 (m,H) 1 (s, 6,95-7,05H) 3 ), 6,95-7,05H) 1 (s, 6,95-7,05H) 1 7,95-8,11 4,11-4,23H) 1 8,26-8,34 (m,H) 3 8,26-8,34 3,22-3,39H) 10 8,26-8,34 4,11-4,23H) 12 (s, (m,H) 8 8,26-8,34 6,95-7,05H) (m, 8,26-8,34 ),H) (m, (s, 6HMS ESI) ) 1432,2 (M+H).
2.40 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)амино}этил)-(2-карбоксиэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IJ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.38.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,73-7,85 (m, 2H), 7,61 (t, 3H), 7,41-7,55 (m, 3H), 7,26-7,39 (m, 5H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,00 (s, 1H), 4,99 (d, 4H), 4,34-4,45 (m, 2H), 4,19 (dd, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,36 (t, 4H), 2,85-3,09 (m, 5H), 2,06-2,22 (m, 4H), 1,89-2,02 (m, 1H), 0,94-1,77 (m, 20H), 0,77-0,90 (m, 11H). MS (ESI) масса/электрон 1567,4 (M+H)+.
2.41 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({(2S)-2-[{[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентаноил]амино}бензил)окси]карбонил}-(2-карбоксиэтил)амино]-3-карбоксипропаноил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона IK)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.32.4. MS (ESI) масса/электрон 1592,4 (M-H)-.
2.42 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-2-({[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)-3-карбоксипропаноил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона IL)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.44.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,82 (s, 1H), 9,96 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 7,77 (d, 2H), 7,39-7,62 (m, 2H), 7,30-7,39 (m, 2H), 7,22-7,29 (m, 3H), 6,98 (m, 2H), 6,92-6,96 (s, 1H), 5,97 (m, 2H), 4,83-5,05 (m, 1H), 3,83-3,92 (m, 1H), 3,79 (m, 1H), 3,00 (m, 2H), 2,03-2,22 (m, 2H), 1,94 (m, 2H), 1,34 (m, 30H), 0,69-0,90 (m, 2H). MS (ESI) масса/электрон 1565,5 (M-H)-.
2.43 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IM)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.42.2 (0,045 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,035 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,038 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1,25 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,76 (s, 1H), 9,91 (s, 1H), 8,79 (s, 1H), 7,98 (dd, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,68-7,47 (m, 3H), 7,47-7,00 (m, 7H), 6,96-6,83 (m, 3H), 5,93 (s, 1H), 4,91 (d, 3H), 4,30 (q, 1H), 4,17-3,97 (m, 4H), 3,96-3,53 (m, 4H), 3,34-2,65 (m, 12H), 2,25 (t, 2H), 2,16-1,67 (m, 12H), 1,67-0,88 (m, 26H), 0,84-0,70 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1513,6 (M+H)+.
2.44 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона IO)
2.44.1 (E)-трет-Бутилдиметил-((3-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)аллил)окси)силан
В колбу, в которую загружали трет-бутилдиметил(проп-2-ин-1-илокси)силан (5 г) и дихлорметан (14,7 мл), в атмосфере азота добавляли по каплям 4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан (3,94 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одной минуты, затем переносили с помощью канюли в барботированную азотом колбу, содержащую Cp2ZrClH (хлоридобис(η5-циклопентадиенил)гидридоцирконий, реагент Шварца) (379 мг). Полученную в результате реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Смесь осторожно гасили водой (15 мл) и затем экстрагировали диэтиловым эфиром (3×30 мл). Объединенные органические фазы промывали водой (15 мл), высушивали над MgSO4, фильтровали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования этилацетатом/гептанами, от 0 до 8%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/заряд 316,0 (M+NH4)+.
2.44.2 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-Бром-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Растворяли (2R,3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (5 г) в ацетонитриле (100 мл). В раствор добавляли Ag2O (2,92 г) и реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавляли 4-бром-2-нитрофенол (2,74 г) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Остаток, который представлял собой соль серебра, фильтровали через диатомовую землю и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 10 до 70% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/заряд 550,9 (M+NH4)+.
2.44.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-((E)-3-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)проп-1-ен-1-ил)-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Объединяли вещество из примера 2.44.2 (1 г), карбонат натрия (0,595 г), трис(дибензилиденацетон)дипалладий (Pd2(dba)3) (0,086 г) и 1,3,5,7-тетраметил-6-фенил-2,4,8-триокса-6-фосфоадамантан (0,055 г) в 3-горлой круглодонной колбе объемом 50 мл, оснащенной обратным холодильником, и систему дегазировали азотом. Отдельно дегазировали раствор вещества из примера 2.44.1 (0,726 г) в тетрагидрофуране (15 мл) азотом в течение 30 минут. Последний полученный раствор переносили с помощью канюли в колбу, содержащую твердые реагенты, затем добавляли дегазированную воду (3 мл) с помощью шприца. Реакционную смесь нагревали до 60°C в течение двух часов. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом (3×30 мл) и водой (30 мл). Объединенные органические фазы высушивали (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0 до 35% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/заряд 643,1 (M+NH4)+.
2.44.4 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-Амино-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В трехгорлую, продутую азотом колбу объемом 500 мл, оснащенную выравнивающей давление капельной воронкой, загружали цинковую пыль (8,77 г). Добавляли дегазированный раствор вещества из примера 2.44.3 (8,39 г) в тетрагидрофуране (67 мл) с помощью канюли. Полученную в результате суспензию охлаждали на ледяной бане и добавляли по каплям 6 н. HCl (22,3 мл) с помощью капельной воронки с такой скоростью, что внутренняя температура реакционной смеси не превышала 35°C. После завершения добавления реакционную смесь перемешивали в течение двух часов при комнатной температуре и фильтровали через слой диатомовой земли, при этом прополаскивали водой и этилацетатом. Фильтрат обрабатывали насыщенным водным раствором NaHCO3 до тех пор, пока водный слой не перестал быть кислотным, и смесь фильтровали с удалением полученных твердых веществ. Фильтрат переносили в делительную воронку и слои разделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом (3×75 мл) и объединенные органические слои промывали водой (100 мл), высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и твердым веществом, собранным путем фильтрации, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/заряд 482,0 (M+H)+.
2.44.5 (9H-Флуорен-9-ил)метил-(3-хлор-3-оксопропил)карбамат
В раствор 3-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропановой кислоты (5,0 г) в дихлорметане (53,5 мл) добавляли тионилхлорид (0,703 мл). Смесь перемешивали при 60°C в течение одного часа. Смесь охлаждали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
2.44.6 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((E)-3-гидроксипроп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Растворяли вещество из примера 2.44.4 (6,78 г) в дихлорметане (50 мл) и раствор охлаждали до 0°C на ледяной бане. Добавляли N,N-диизопропилэтиламин (3,64 г), затем добавляли по каплям раствор вещества из примера 2.44.5 (4,88 г) в дихлорметане (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов, при этом обеспечивали нагревание ледяной бани до комнатной температуры. Добавляли насыщенный водный раствор NaHCO3 (100 мл) и слои разделяли. Водный слой дополнительно экстрагировали дихлорметаном (2×50 мл). Экстракты высушивали над Na2SO4, фильтровали, концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования этилацетатом/гептаном, от 5 до 95%, с получением неразделимой смеси анилина, который представляет собой исходный продукт, и необходимого продукта. Смесь разделяли между 1 н. водным раствором HCl (40 мл) и смесью диэтилового эфира и этилацетата, 1:1 (40 мл), и затем водную фазу дополнительно экстрагировали этилацетатом (2×25 мл). Органические фазы объединяли, промывали водой (2×25 мл), высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/заряд 774,9 (M+H)+.
2.44.7 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((E)-3-(((4-нитрофенокси)карбонил)окси)проп-1-ен-1-ил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Растворяли вещество из примера 2.44.6 (3,57 г) в дихлорметане (45 мл) и добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (2,80 г), затем добавляли по каплям N,N-диизопропилэтиламин (0,896 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. В раствор реакционной смеси добавляли силикагель (20 г) и смесь концентрировали до сухого состояния при пониженном давлении с поддержанием температуры бани на уровне 25°C или ниже. Остаток силикагеля загружали на поверхность колонки и продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования этилацетатом-гептаном, от 0 до 100%, с получением частично очищенного продукта, который был загрязнен нитрофенолом. Материал растирали с метил-трет-бутиловым простым эфиром (250 мл) и обеспечивали осаждение полученной взвеси в течение 1 часа. Продукт собирали путем фильтрации. Три последующие партии собирали подобным образом с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/заряд 939,8 (M+H)+.
2.44.8 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В холодный (0°C) раствор вещества из примера 2.44.7 (19,7 мг) и вещества из примера 1.41.3 (18,5 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,054 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли воду (2 мл) и моногидрат гидроксида лития (50 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь подкисляли трифторуксусной кислотой и фильтровали. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1273,2 (M+H)+.
2.44.9 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(карбоксиметокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 2.44.8 (10 мг) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (2,3 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,054 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли метанолом (2 мл) и подкисляли трифторуксусной кислотой. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (система Gilson), с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,70 (s, 1H), 9,03 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,87 (t, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,41-7,55 (m, 2H), 7,23-7,38 (m, 2H), 6,79-7,16 (m, 7H), 6,56 (d, 1H), 6,09-6,25 (m, 1H), 4,96-5,07 (m, 3H), 4,84 (s, 3H), 4,64 (d, 3H), 3,87-3,97 (m, 5H), 3,24-3,47 (m, 12H), 2,77-2,95 (m, 6H), 1,94-2,08 (m, 6H), 0,92-1,56 (m, 20H), 0,74-0,86 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1487,3 (M+Na)+.
2.45 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IP)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.43.7 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,09 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,30-8,40 (m, 3H), 7,93-8,25 (m, 6H), 7,23-7,86 (m, 10H), 6,92-7,05 (m, 2H), 4,99 (d, 2H), 4,36-4,44 (m, 2H), 4,14-4,23 (m, 2H), 2,87-3,35 (m, 12H), 2,81 (t, 2H), 2,59-2,70 (m, 2H), 1,84-2,28 (m, 8H), 0,97-1,77 (m, 20H), 0,77-0,88 (m,10H). MS (ESI) масса/электрон 1448,3 (M+Na)+.
2.46 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IS)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.46.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,69 (s, 1H), 9,97 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,04 (dd, 2H), 7,78 (d, 2H), 7,71 (d, 1H), 7,59 (d, 2H), 7,44-7,54 (m, 3H), 7,26-7,37 (m, 4H), 6,96-7,03 (m, 4H), 5,97 (s, 1H), 4,99 (d, 4H), 4,31-4,45 (m, 1H), 4,18 (dd, 1H), 4,09 (s, 2H), 3,85-3,93 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,39-3,47 (m, 2H), 3,24-3,39 (m, 4H), 3,12-3,24 (m, 2H), 2,75-3,07 (m, 9H), 2,06-2,23 (m, 5H), 1,90-2,01 (m, 1H), 1,54-1,75 (m, 2H), 1,24-1,52 (m, 12H), 0,91-1,24 (m, 8H), 0,77-0,88 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1525,4 (M+H)+.
2.47 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IU)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.47.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,70 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,04 (dd, 2H), 7,78 (d, 2H), 7,71 (d, 1H), 7,59 (d, 2H), 7,43-7,55 (m, 2H), 7,28-7,37 (m, 4H), 6,94-7,07 (m, 4H), 6,05 (s, 1H), 4,93-5,11 (m, 4H), 4,31-4,46 (m, 2H), 4,12-4,26 (m, 4H), 3,80-3,95 (m, 4H), 3,40-3,50 (m, 2H), 3,24-3,40 (m, 6H), 3,13-3,24 (m, 2H), 2,74-3,08 (m, 9H), 2,63-2,73 (m, 2H), 2,05-2,23 (m, 5H), 1,96 (s, 1H), 1,52-1,77 (m, 2H), 1,23-1,53 (m, 12H), 0,97-1,22 (m, 8H), 0,77-0,89 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1631,5 (M-H)-.
2.48 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)амино}этил)-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IV)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.48.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,82 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 9,29-9,57 (m, 1H), 8,05 (t, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,51-7,63 (m, 4H), 7,40-7,50 (m, 2H), 7,27-7,39 (m, 5H), 6,93-7,02 (m, 3H), 4,99 (d, 3H), 4,30-4,47 (m, 1H), 4,19 (t, 1H), 3,79-3,92 (m, 3H), 3,60-3,74 (m, 2H), 3,01 (s, 9H), 2,70 (d, 4H), 2,05-2,23 (m, 6H), 1,96 (d, 2H), 1,53-1,78 (m, 3H), 1,22-1,54 (m, 13H), 0,89-1,22 (m, 9H), 0,75-0,89 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1603,3 (M+H)+.
2.49 Синтез N-{6-[(хлорацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона IZ)
2.49.1 3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.2.9 (0,045 г), (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (0,043 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,041 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (1 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи в реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,024 мл) и перемешивание продолжали в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой, затем очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения.
2.49.2 N-{6-[(Хлорацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
В раствор 6-(2-хлорацетамидо)гексановой кислоты (6,43 мг) и 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфата(V) (0,012 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,019 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут. Данный раствор добавляли к веществу из примера 2.49.1 (0,026 г) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,18 (q, 1H), 8,08 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,84-7,76 (m, 2H), 7,64-7,56 (m, 3H), 7,56-7,50 (m, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,27 (d, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,05-4,91 (m, 4H), 4,48-4,33 (m, 1H), 4,26-4,14 (m, 1H), 4,02 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,81 (d, 2H), 3,25 (t, 2H), 3,14-2,98 (m, 6H), 2,98-2,87 (m, 2H), 2,74-2,59 (m, 2H), 2,27-2,05 (m, 6H), 2,04-1,92 (m, 1H), 1,78-1,65 (m, 1H), 1,65-1,53 (m, 1H), 1,53-0,90 (m, 22H), 0,90-0,73 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1448,2 (M+H)+.
2.50 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона JD)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.51.8 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,56 (s, 1H), 8,51-8,59 (m, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,82 (d, 1H), 7,69-7,77 (m, 2H), 7,34-7,62 (m, 7H), 7,16-7,34 (m, 4H), 6,95 (dd, 1H), 5,95-6,05 (m, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,06-4,44 (m, 6H), 3,85 (s, 3H), 3,39-3,59 (m, 7H), 2,61-2,74 (m, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,88-2,16 (m, 3H), 0,96-1,75 (m, 22H), 0,71-0,89 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1454,2 (M+Na)+.
2.51 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(2-{[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[метил-(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-ил]окси}этил)-(2-карбоксиэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона JF)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.49.2. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,71 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,08 (d, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,72 (d, 1H), 7,60 (d, 2H), 7,52 (d, 1H), 7,44-7,50 (m, 1H), 7,27-7,39 (m, 4H), 6,96-7,06 (m, 3H), 5,98 (s, 1H), 5,01 (d, 4H), 4,31-4,46 (m, 1H), 4,18 (s, 3H), 3,79-3,95 (m, 4H), 3,67-3,76 (m, 2H), 3,12-3,39 (m, 6H), 2,73-3,07 (m, 8H), 2,04-2,24 (m, 4H), 1,87-2,02 (m, 1H), 1,22-1,75 (m, 12H), 0,96-1,20 (m, 7H), 0,76-0,90 (m, 10H). MS (ESI) масса/электрон 1597,4 (M+H)+.
2.52 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-сульфопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона JK)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.52.4 веществом из примера 2.5.3 в примере 2.5.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,97 (s, 1H), 7,96-8,11 (m, 2H), 7,67-7,82 (m, 3H), 7,59 (d, 2H), 7,42-7,52 (m, 2H), 7,23-7,36 (m, 4H), 6,91-7,08 (m, 4H), 4,99 (d, 4H), 4,33-4,47 (m, 1H), 4,14-4,23 (m, 4H), 3,86-3,95 (m, 6H), 3,21-3,45 (m, 15H), 2,75-3,07 (m, 9H), 2,56-2,69 (m, 2H), 1,93-2,20 (m, 8H), 0,88-1,72 (m, 20H), 0,74-0,89 (m, 11H). MS (ESI) масса/электрон 1496,3 (M+Na)+.
2.53 Синтез N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона JJ)
Перемешивали раствор вещества из примера 2.49.1 (0,030 г), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (6,34 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,012 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. Через 1 час реакционную смесь гасили смесью N,N-диметилформамид:вода, 3:1 (1,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,18 (q, 1H), 8,12-8,00 (m, 2H), 7,86-7,75 (m, 2H), 7,65-7,55 (m, 3H), 7,53 (dd, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,36 (q, 2H), 7,33-7,23 (m, 3H), 6,95 (d, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,03-4,92 (m, 4H), 4,39 (q, 1H), 4,24-4,14 (m, 1H), 4,02 (s, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,81 (d, 2H), 3,39-3,16 (m, 2H), 3,14-2,86 (m, 10H), 2,68-2,60 (m, 2H), 2,25-2,04 (m, 6H), 2,03-1,90 (m, 1H), 1,78-1,65 (m, 1H), 1,64-1,54 (m, 1H), 1,54-0,90 (m, 20H), 0,89-0,75 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1410,1 (M+H)+.
2.54 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона JL)
Перемешивали раствор вещества из примера 2.49.1 (0,039 г), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетата (7,81 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,016 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре. Через 1 час реакционную смесь гасили смесью N,N-диметилформамид:вода, 3:1 (1,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 10,00 (d, 1H), 8,24 (d, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,59 (q, 3H), 7,53 (dd, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,36 (td, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,27 (d, 2H), 7,07 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 5,04-4,85 (m, 4H), 4,39 (q, 2H), 4,26 (dd, 2H), 4,13 (s, 2H), 3,86-3,17 (m, 8H), 3,07-2,81 (m, 4H), 2,63 (t, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,03-1,79 (m, 1H), 1,75-1,51 (m, 2H), 1,51-1,03 (m, 12H), 1,01-0,76 (m, 16H). MS (ESI) масса/электрон 1394,4 (M-H)-.
2.55 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-2-({[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]бензил)окси]карбонил}амино)-3-сульфопропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FE)
2.55.1 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-Формил-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (4 г) в ацетонитриле (100 мл)) добавляли оксид серебра(I) (10,04 г) и 4-гидрокси-3-нитробензальдегид (1,683 г). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 5 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон (M+18)+.
2.55.2 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(Гидроксиметил)-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.55.1 (6 г) в смеси хлороформа (75 мл) и изопропанола (18,75 мл) добавляли 0,87 г силикагеля. Полученную смесь охлаждали до 0°C, добавляли NaBH4 (0,470 г) и полученную суспензию перемешивали при 0°C в течение 45 минут. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (100 мл) и фильтровали через диатомовую землю. Фильтрат промывали водой и солевым раствором и концентрировали с получением неочищенного продукта, который применяли без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон (M+NH4)+:
2.55.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-Амино-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Гидрировали перемешиваемый раствор вещества из примера 2.55.2 (7 г) в этилацетате (81 мл) при 20°C под давлением 1 атмосферы H2, с применением 10% Pd/C (1,535 г) в качестве катализатора, в течение 12 часов. Реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном/метанолом, 95/5, с получением указанного в заголовке соединения.
2.55.4 3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропановая кислота
Растворяли 3-аминопропановую кислоту (4,99 г) в 10% водном растворе Na2CO3 (120 мл) в колбе объемом 500 мл и полученное охлаждали на ледяной бане. В полученный раствор постепенно добавляли (9H-флуорен-9-ил)метилхлорформиат (14,5 г) в 1,4-диоксане (100 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и затем добавляли воду (800 мл). Слой водной фазы отделяли от реакционной смеси и промывали диэтиловым эфиром (3×750 мл). Водный слой подкисляли 2 н. водным раствором HCl до значения pH 2 и экстрагировали этилацетатом (3×750 мл). Органические слои объединяли и концентрировали с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт перекристаллизовывали в смешанном растворителе этилацетат:гексан, 1:2 (300 мл), с получением указанного в заголовке соединения.
2.55.5 (9H-Флуорен-9-ил)метил-(3-хлор-3-оксопропил)карбамат
В раствор вещества из примера 2.55.4 в дихлорметане (160 мл) добавляли тионилхлорид (50 мл). Смесь перемешивали при 60°C в течение 1 часа. Смесь охлаждали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.55.6 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.55.3 (6 г) в дихлорметане (480 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (4,60 мл). Добавляли вещество из примера 2.55.5 (5,34 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь выливали в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Объединенные экстракты промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и концентрирования получали остаток, который очищали с помощью радиальной хроматографии с применением от 0 до 100% этилацетата в петролейном эфире в качестве подвижной фазы, с получением указанного в заголовке соединения.
2.55.7 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В смесь вещества из примера 2.55.6 (5,1 г) в N,N-диметилформамиде (200 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (4,14 г) и N,N-диизопропилэтиламин (1,784 мл). Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал растворяли в дихлорметане и аспирировали непосредственно на 1 мм планшет Chromatotron для радиальной хроматографии и применяли элюирование от 50 до 100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон (M+H)+.
2.55.8 3-(1-((3-(2-((R)-2-((((3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)амино)-N-метил-3-сульфопропанамидо)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.13.7 (0,055 г) и вещества из примера 2.55.7 (0,055 г) вместе в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,053 мл). После перемешивания в течение 3 часов реакционную смесь разбавляли этилацетатом (75 мл) и промывали водой (20 мл) и солевым раствором (25 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в метаноле (1 мл) и обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,025 г) в воде (0,6 мл). После перемешивания в течение 2 часов реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой (0,047 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты.
2.55.9 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[(2S)-2-({[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]бензил)окси]карбонил}амино)-3-сульфопропаноил](метил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 2.55.8 (0,013 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (3,07 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл) и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (7,90 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и разбавляли N,N-диметилформамидом и водой. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 9,07 (s, 1H), 8,15 (s, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,89 (t, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,61 (t, 1H), 7,56-7,50 (t, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (s, 1H), 7,39-7,32 (t, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,06 (s, 1H), 7,04-6,92 (s, 1H), 5,00-4,79 (t, 5H), 4,73-4,64 (m, 1H), 3,94-3,78 (m, 1H), 3,57-2,84 (s, 1H), 2,84-2,56 (s, 1H), 2,14-1,73 (m, 5H), 1,57-0,89 (t, 22H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1516,2 (M-H)-.
2.56 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона GG)
2.56.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Растворяли вещество из примера 1.22.5 (48 мг) в диметилформамиде (0,5 мл) и добавляли вещество из примера 2.44.7 (55 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (90 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (1 мл) и добавляли 1,94 н. водный раствор LiOH (0,27 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа. При очистке смеси с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 10 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, получали указанное в заголовке соединение в виде соли трифторуксусной кислоты. MS (ESI-) масса/электрон 1291,4 (M-H)-.
2.56.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-Карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.56.1 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,00 (v br s, 1H), 9,03 (s, 1H), 8,53 (dd, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,16 (dd, 1H), 7,90 (br s, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,54 (d, 1H) 7,52 (d, 1H), 7,44 (d, 1H), 7,37 (t, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,58 (m, 1H), 6,15 (m,1H), 4,96 (s, 2H), 4,88 (br m, 1 H), 4,64 (br m, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,48 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,67 (br m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,45 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1484,4 (M-H)-.
2.57 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона GM)
2.57.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.23.4 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1. MS (ESI) масса/электрон 1291,4 (M-H)-.
2.57.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-Карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.57.1 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,72 (d, 1H), 8,66 (d, 1H), 8,25 (s, 1H), 7,89 (br m, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,52 (br m, 2H), 7,46 (d, 1H), 7,39 (t, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,58 (m, 1H), 6,15 (m,1H), 4,96 (s, 2H), 4,88 (br m, 1 H), 4,64 (br m, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,48 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,67 (br m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,45 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1484,4 (M-H)-.
2.58 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона HD)
2.58.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1. MS (ESI-) масса/электрон 1290,2 (M-H)-.
2.58.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.58.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,89 (br m, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53 (br m, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,37 (m, 2H), 7,32 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,58 (m, 1H), 6,15 (m,1H), 4,96 (s, 2H), 4,88 (br m, 1 H), 4,64 (br m, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,48 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,67 (br m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,45 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI-) масса/электрон 1483,3 (M-H)-.
2.59 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона HS)
2.59.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(3-фосфонопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.40.2 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1. MS (ESI-) масса/электрон 1305,4 (M-H)-.
2.59.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-Карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[5,4-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.59.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,53 (dd, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,16 (dd, 1H), 7,90 (br s, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,54 (d, 1H) 7,52 (d, 1H), 7,44 (d, 1H), 7,37 (t, 1H), 7,28 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,56 (m, 1H), 6,16 (m,1H), 4,96 (s, 2H), 4,86 (br m, 1 H), 4,64 (br d, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,44 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,46 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1498,4 (M-H)-.
2.60 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона HW)
2.60.1 3-(1-(((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.31.11 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1. MS (ESI) масса/электрон 1336,2 (M+Na)+.
2.60.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-5-(3-фосфонопропокси)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.60.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H) 8,25 (s, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,83-7,91 (m, 1H), 7,75 (dd, 2H), 7,42-7,58 (m, 2H), 7,34 (t, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,93-7,15 (m, 6H), 6,56 (d, 1H), 6,09-6,24 (m, 1H), 5,01 (s, 3H), 4,80-4,92 (m, 2H), 4,57-4,69 (m, 3H), 4,12-4,21 (m, 6H), 3,86-3,94 (m, 7H), 3,28-3,47 (m, 12H), 2,77-2,96 (m, 6H), 2,52-2,58 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,90-2,05 (m, 4H), 1,65-1,78 (m, 2H), 0,90-1,53 (m, 16H), 0,80 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1529,5 (M+H)+.
2.61 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона HX)
2.61.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(3-фосфонопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.14.4 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1. MS (ESI) масса/электрон 1304,3 (M-H)-.
2.61.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.61.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,25 (br s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,89 (br m, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53 (br m, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,37 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,56 (m, 1H), 6,17 (m,1H), 4,96 (s, 2H), 4,86 (br m, 1 H), 4,64 (br d, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,44 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,46 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI-) масса/электрон 1497,4 (M-H)-.
2.62 Синтез 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона HY)
2.62.1 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-Формил-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Растворяли 2,4-дигидроксибензальдегид (15 г) и (2S,3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (10 г) в ацетонитриле, затем добавляли карбонат серебра (10 г) и реакционную смесь нагревали до 49°C. После перемешивания в течение 4 часов реакционную смесь охлаждали, фильтровали и концентрировали. Неочищенное указанное в заголовке соединение суспендировали в дихлорметане и фильтровали через диатомовую землю и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием этилацетатом/гептаном, от 1 до 100%, с получением указанного в заголовке соединения.
2.62.2 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-Гидрокси-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Охлаждали раствор вещества из примера 2.62.1 (16,12 г) в тетрагидрофуране (200 мл) и метаноле (200 мл) до 0°C и добавляли порциями борогидрид натрия (1,476 г). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 минут и гасили смесью вода:насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, 1:1 (400 мл). Полученные твердые вещества отфильтровывали и прополаскивали этилацетатом. Фазы разделяли и водный слой четыре раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенное указанное в заголовке соединение очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием этилацетатом/гептанами, от 1 до 100%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 473,9 (M+NH4)+.
2.62.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-гидроксифенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
К веществу из примера 2.62.2 (7,66 г) и трет-бутилдиметилсилилхлориду (2,78 г) в дихлорметане (168 мл) при -5°C добавляли имидазол (2,63 г) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи, при этом обеспечивали повышение внутренней температуры реакционной смеси до 12°C. Реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония и четыре раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические вещества промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенное указанное в заголовке соединение очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием этилацетатом/гептанами, от 1 до 50%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 593,0 (M+Na)+.
2.62.4 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
К веществу из примера 2.62.3 (5,03 г) и трифенилфосфину (4,62 г) в толуоле (88 мл) добавляли ди-трет-бутилазодикарбоксилат (4,06 г) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. Добавляли (9H-флуорен-9-ил)метил-(2-(2-гидроксиэтокси)этил)карбамат и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительно 1,5 часа. Реакционную смесь загружали непосредственно на силикагель и применяли элюирование этилацетат/гептаны, от 1 до 50%, с получением указанного в заголовке соединения.
2.62.5 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 2.62.4 (4,29 г) перемешивали в растворе уксусная кислота:вода:тетрагидрофуран, 3:1:1 (100 мл), в течение ночи. Реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Неочищенное указанное в заголовке соединение очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием этилацетатом/гептанами, от 1 до 50%, с получением указанного в заголовке соединения.
2.62.6 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(3-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.62.5 (0,595 г) и бис(4-нитрофенил)карбоната (0,492 г) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,212 мл). Через 1,5 часа реакционную смесь концентрировали под глубоким вакуумом. Реакционную смесь загружали непосредственно на силикагель и применяли элюирование этилацетат/гептаны, от 1 до 50%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 922,9 (M+Na)+.
2.62.7 3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.2.9 (0,073 г) и вещества из примера 2.62.6 (0,077 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,066 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в тетрагидрофуране (0,5 мл) и метаноле (0,5 мл) и обрабатывали моногидратом гидроксида лития (0,047 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). Через 1 час реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом и водой и гасили путем добавления трифторуксусной кислоты (0,116 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения.
2.62.8 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 2.62.7 (0,053 г), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (0,012 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,033 мл) в N,N-диметилформамиде (0,75 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом и водой. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,04 (d, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,54 (d, 1H), 7,51-7,40 (m, 2H), 7,40-7,31 (m, 3H), 7,20 (d, 1H), 7,00-6,94 (m, 3H), 6,73-6,57 (m, 2H), 5,06 (t, 1H), 5,01-4,91 (m, 4H), 3,96-3,85 (m, 2H), 3,85-3,78 (m, 2H), 3,78-3,69 (m, 2H), 3,59 (t, 2H), 3,53-3,34 (m, 6H), 3,34-3,21 (m, 4H), 3,17 (q, 2H), 3,02 (t, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,44-0,90 (m, 16H), 0,83 (d, 6H). MS (-ESI) масса/электрон 1432,4 (M-H)-.
2.63 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона IB)
2.63.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(3-фосфонопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.39.2 веществом из примера 1.22.5 в примере 2.56.1.
2.63.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{2-Карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.63.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,61 (d, 1H), 8,55 (d, 1H), 8,25 (br s, 1H), 7,89 (br m, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,50 (br d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,39 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,56 (m, 1H), 6,17 (m,1H), 4,97 (s, 2H), 4,86 (br m, 1 H), 4,64 (br d, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,27-3,44 (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,46 (m, 6H), 1,37 (br m, 2H), 1,28-0,90 (m, 10H), 0,77-0,82 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1498,3 (M-H)-.
2.64 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)({[(2E)-3-(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]фенил)проп-2-ен-1-ил]окси}карбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона IE)
2.64.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота, соль трифторуксусной кислоты
В раствор вещества из примера 1.25.2 (0,050 г) и вещества из примера 2.44.7 (0,061 г) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,047 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (0,5 мл) и тетрагидрофуране (0,5 мл) и обрабатывали раствором гидрата гидроксида лития (0,034 г) в воде (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой (0,083 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения
2.64.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)({[(2E)-3-(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-3-[(3-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}пропаноил)амино]фенил)проп-2-ен-1-ил]окси}карбонил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
В раствор вещества из примера 2.64.1 (0,042 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (10 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,027 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,04 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,87 (t, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,54-7,40 (m, 3H), 7,40-7,31 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,10 (d, 1H), 7,04 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,24-6,11 (m, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,86 (t, 1H), 4,65 (d, 2H), 3,95-3,84 (m, 2H), 3,84-3,75 (m, 4H), 3,44-3,24 (m, 10H), 3,01 (t, 2H), 2,62-2,52 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,46 (h, 4H), 1,40-1,31 (m, 2H), 1,30-0,88 (m, 14H), 0,87-0,75 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1447,5 (M-H)-.
2.65 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)-{[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-2-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона II)
2.65.1 3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.25.2 (0,055 г), вещества из примера 2.62.6 (0,060 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,052 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в тетрагидрофуране (0,5 мкл), в метаноле (0,5 мл), затем обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,037 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой (0,091 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты.
2.65.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)-{[(4-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-2-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Перемешивали раствор соли трифторуксусной кислоты из примера 2.65.1 (0,043), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (10 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,028 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (1 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (0,5 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 5 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,00 (t, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,54-7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,19 (d, 1H), 6,97 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,67 (d, 1H), 6,60 (dd, 1H), 5,14-5,03 (m, 1H), 4,96 (d, 4H), 4,08 (tt, 4H), 3,89 (q, 4H), 3,84-3,77 (m, 2H), 3,71 (t, 2H), 3,59 (t, 2H), 3,52-3,35 (m, 6H), 3,28 (dq, 4H), 3,17 (q, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,46 (d, 1H), 2,33 (t, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,45-0,90 (m, 12H), 0,82 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1396,4 (M-H)-.
2.66 Синтез N-[6-(этенилсульфонил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона KY)
2.66.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 1.2.9 (57 мг) и (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (54 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (103 мкл). Смесь перемешивали в течение ночи и добавляли диэтиламин (61,5 мкл). Полученную смесь перемешивали в течение 4 часов и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 10 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1257,4 (M-H).
2.66.2 N-[6-(Этенилсульфонил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.83, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата веществом из примера 2.66.1 и веществом из примера 2.82.5 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,88 (s, 0H), 9,99 (s, 1H), 8,05 (t, 2H), 7,80 (t, 2H), 7,60 (q, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,28 (d, 3H), 7,01-6,89 (m, 2H), 6,29-6,15 (m, 2H), 6,02 (s, 1H), 4,97 (d, 4H), 4,40 (td, 1H), 4,20 (t, 1H), 4,00-3,77 (m, 4H), 3,55-3,33 (m, 4H), 3,25 (d, 2H), 3,14-2,88 (m, 6H), 2,62 (t, 2H), 2,09 (s, 4H), 1,82-0,90 (m, 10H), 0,84 (dd, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1447,2 (M+H).
2.67 Синтез 4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона IW)
2.67.1 3-(1-((3-(2-((1-((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)пиперидин-4-ил)-(3-фосфонопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.26.2 (0,045 г) и вещества из примера 2.44.7 (0,053 г) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,041 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (0,5 мл) и тетрагидрофуране (0,5 мл) и обрабатывали раствором моногидрата гидроксида лития (0,030 г) в воде (0,5 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь гасили трифторуксусной кислотой (0,073 мл) и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения.
2.67.2 4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 2.67.1 (0,040 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (9,84 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,023 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,28 (s, 1H), 9,04 (s, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,87 (t, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (dd, 1H), 7,55-7,40 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,11 (dd, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,59 (d, 1H), 6,20 (t, 1H), 6,16 (t, 0H), 4,96 (s, 2H), 4,88 (d, 1H), 4,66 (d, 2H), 4,14 (d, 2H), 3,96-3,86 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,54 (t, 7H), 3,48-3,28 (m, 12H), 3,01 (t, 2H), 2,84 (s, 2H), 2,55 (t, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,07-1,95 (m, 4H), 1,88 (s, 2H), 1,73-1,54 (m, 4H), 1,54-1,38 (m, 6H), 1,39-1,26 (m, 4H), 1,26-0,93 (m, 8H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1582,4 (M+H)+.
2.68 Синтез 4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{2-карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона IY)
2.68.1 3-(1-((3-(2-((1-((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)пиперидин-4-ил)-(3-фосфонопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.50.2 веществом из примера 1.44.7 в примере 2.56.1. MS (ESI) масса/электрон 1388,5 (M-H)-.
2.68.2 4-[(1E)-3-{[(4-{[2-({3-[(4-{2-Карбокси-6-[8-([1,3]тиазоло[4,5-b]пиридин-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]пиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-фосфонопропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.68.1 веществом из примера 1.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,03 (s, 1H), 8,61 (d, 1H), 8,50 (d, 1H), 8,25 (br s, 1H), 7,89 (t, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,49 (d, 1H), 7,46 (d, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,11 (br d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,58 (m, 1H), 6,17 (m,1H), 4,97 (s, 2H), 4,88 (d, 1 H), 4,65 (br d, 2H), 3,88 (m, 3H), 3,79 (br m, 2H), 3,66 (br m, 2H), 3,27-3,44, (m, 14H), 3,01 (m, 2H), 2,85 (br m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,98 (br m, 2H), 1,89 (m, 1H), 1,62 (m, 4H), 1,46 (m, 6H), 1,31 (m, 4H), 1,15 (m, 6H), 1,04 (m, 2H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1581,4 (M-H)-.
2.69 Синтез 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона JA)
2.69.1 3-(1-((3-(2-(((((E)-3-(3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)фенил)аллил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.43.7 веществом из примера 2.44.7 в примере 2.56.1. MS (ESI) масса/электрон 1309,1 (M+Na)+.
2.69.2 4-[(1E)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)проп-1-ен-1-ил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.69.1 веществом из примера 2.56.1 в примере 2.56.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,09 (s, 1H), 9,02 (s, 2H), 8,35 (d, 1H), 8,13-8,29 (m, 4H), 7,86-8,09 (m, 5H), 7,81 (d, 1H), 7,66-7,75 (m, 1H), 7,44-7,55 (m, 1H), 7,37 (t, 1H), 7,09-7,18 (m, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,48-6,62 (m, 1H), 6,07-6,22 (m, 1H), 4,81-4,92 (m, 1H), 4,58-4,74 (m, 2H), 3,80-3,93 (m, 3H), 3,27-3,37 (m, 5H), 2,53-2,68 (m, 4H), 2,15-2,23 (m, 3H), 2,03 (t, 2H), 1,36-1,53 (m, 6H), 0,97-1,33 (m, 24H), 0,81 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1478,3(M-H)-.
2.70 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.71 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.72 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.73 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.74 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.75 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.76 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.77 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-3-сульфо-L-аланил}амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FA)
В раствор вещества из примера 1.15 (0,023 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (9,12 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,012 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и водой (0,5 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,65-7,57 (m, 2H), 7,54 (d, 1H), 7,51-7,41 (m, 2H), 7,40-7,31 (m, 3H), 7,01-6,96 (m, 3H), 4,96 (s, 2H), 4,34-4,28 (m, 3H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,37 (t, 2H), 3,29 (t, 2H), 3,16-2,95 (m, 4H), 2,80 (dd, 1H), 2,70 (dd, 1H), 2,11 (s, 3H), 2,06 (t, 2H), 1,47 (tt, 4H), 1,40-0,92 (m, 12H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1090,3 (M+H)+.
2.78 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FJ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.11.4 и перфторфенил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноатом соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,42-7,49 (m, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,46-3,56 (m, 4H), 3,31-3,46 (m, 10H), 3,01 (t, 2H), 2,61-2,68 (m, 1H), 2,55-2,60 (m, 1H), 2,21-2,32 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 1,40-1,51 (m, 4H), 1,37 (d, 2H), 0,91-1,30 (m, 12H), 0,83 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1091,2 (M+H)+.
2.79 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FK)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната перфторфенил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноатом. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,41-7,49 (m, 2H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,93-6,98 (m, 3H), 4,95 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,32-3,38 (m, 2H), 3,21-3,27 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,61-2,67 (m, 2H), 2,53-2,58 (m, 2H), 2,33-2,39 (m, 1H), 2,20-2,29 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,40-1,51 (m, 4H), 1,34 (s, 2H), 0,93-1,27 (m, 13H), 0,83 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1047,2 (M+H)+.
2.80 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-21-оксо-22-(2-сульфоэтил)-3,6,9,12,15,18-гексаокса-22-азатетракозан-24-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FQ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната перфторфенил-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,9,12,15,18-пентаоксагеникозан-21-оатом. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,42-7,54 (m, 3H), 7,33-7,38 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,95 (dd, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,07-3,53 (m, 24H), 3,01 (t, 2H), 2,61-2,69 (m, 1H), 2,54-2,60 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,96 (d, 2H), 0,92-1,39 (m, 13H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1269,4 (M+H)+.
2.81 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-21-оксо-22-(2-сульфоэтил)-3,6,9,12,15,18,25-гептаокса-22-азагептакозан-27-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона FR)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.11.4 и перфторфенил-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3,6,9,12,15,18-гексаоксагеникозан-21-оатом соответственно. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 7,41-7,50 (m, 2H), 7,33-7,39 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,01 (d, 2H), 6,97 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,31-3,60 (m, 30H), 3,01 (t, 2H), 2,64-2,71 (m, 1H), 2,53-2,61 (m, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,38 (s, 2H), 1,20-1,31 (m, 4H), 1,12-1,18 (m, 2H), 0,91-1,12 (m, 4H), 0,84 (s, 6H).
2.82 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[6-(этенилсульфонил)гексаноил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона JE)
2.82.1 Этил-6-((2-гидроксиэтил)тио)гексаноат
Перемешивали смесь этил-6-бромгексаноата (3 г), 2-меркаптоэтанола (0,947 мл) и K2CO3 (12 г) в этаноле (100 мл) в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане (100 мл) и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.82.2 6-((2-Гидроксиэтил)тио)гексановая кислота
Перемешивали смесь вещества из примера 2.82.1 (12 г) и 3 М водного раствора NaOH (30 мл) в этаноле (30 мл) в течение ночи. Органические вещества удаляли при пониженном давлении. Остаточную водную фазу промывали этилацетатом, подкисляли с помощью HCl до pH 5 и экстрагировали дихлорметаном. Экстракты объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.82.3 6-((2-Гидроксиэтил)сульфонил)гексановая кислота
В перемешиваемый раствор вещества из примера 2.82.2 (4 г) в смеси воды (40 мл) и 1,4-диоксана (160 мл) добавляли Oxone® (38,4 г) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаточный водный слой экстрагировали дихлорметаном. Экстракты объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.82.4 6-(Винилсульфонил)гексановая кислота
В холодный (0°C) раствор из примера 2.82.3 (1 г) в дихлорметане (10 мл) добавляли триэтиламин (2,8 мл) с последующим добавлением метансульфонилхлорида (1,1 мл) в атмосфере аргона. Смесь перемешивали в течение ночи и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.82.5 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-6-(винилсульфонил)гексаноат
В перемешиваемый раствор вещества из примера 2.82.4 (0,88 г) в дихлорметане (10 мл) добавляли 1-гидроксипирролидин-2,5-дион (0,54 г) и N,N'-метандиилидендициклогексанамин (0,92 г). Смесь перемешивали в течение ночи и фильтровали. Фильтрат концентрировали и очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием от 10 до 25% этилацетата в петролейном эфире, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 304,1 (M+1).
2.82.6 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[6-(этенилсульфонил)гексаноил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.83, путем замены 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата веществом из примера 2.82.5. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,53 (dd, 1H), 7,42-7,49 (m, 2H), 7,33-7,40 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,88-7,00 (m, 2H), 6,17-6,25 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,38 (dd, 2H), 3,25 (t, 2H), 3,04-3,12 (m, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,62-2,69 (m, 1H), 2,56 (dd, 1H), 2,27 (q, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,53-1,62 (m, 2H), 1,43-1,51 (m, 2H), 1,28-1,38 (m, 4H), 1,20-1,27 (m, 4H), 0,92-1,19 (m, 6H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1042,2 (M+H)+.
2.83 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[{6-[(хлорацетил)амино]гексаноил}-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона JM)
В смесь вещества из примера 1.2.9 (12,5 мг) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата (6,7 мг) в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (26 мкл). Смесь перемешивали в течение 10 дней и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 8,15-8,21 (m, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,41-7,49 (m, 2H), 7,32-7,39 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 6,96 (dd, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,01 (d, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,39 (d, 2H), 3,25 (t, 2H), 2,98-3,10 (m, 5H), 2,62-2,70 (m, 1H), 2,56-2,61 (m, 1H), 2,23-2,30 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,33-1,52 (m, 5H), 1,19-1,30 (m, 6H), 0,91-1,18 (m, 6H), 0,84 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1043,2 (M+H)+.
2.84 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона LE)
Перемешивали смесь вещества из примера 1.56 (0,020 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,022 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,018 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 5 часов реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамида и воды, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,82 (s, 1H), 9,97 (s, 1H), 8,10-7,98 (m, 2H), 7,84-7,72 (m, 2H), 7,67-7,54 (m, 3H), 7,54-7,41 (m, 3H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,30-7,23 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 5,99 (s, 1H), 4,98 (s, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,45-4,35 (m, 2H), 4,19 (dd, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,82-3,76 (m, 2H), 3,47-3,31 (m, 4H), 3,28-3,19 (m, 4H), 3,07-2,89 (m, 4H), 2,21-2,11 (m, 4H), 2,09 (s, 2H), 2,02-1,89 (m, 1H), 1,77-1,63 (m, 2H), 1,62-1,27 (m, 10H), 1,27-0,90 (m, 13H), 0,88-0,78 (m, 12H); MS (ESI) масса/электрон 1430,3 (M+1)+.
2.85 Синтез N-{6-[(бромацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона LH)
2.85.1 1H-Бензо[d][1,2,3]триазол-1-ил-6-(2-бромацетамидо)гексаноат
В раствор 6-(2-бромацетамидо)гексановой кислоты (105 мг) и бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония гексафторфосфата (PyBOP, 325 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли триэтиламин (87 мкл). Смесь перемешивали в течение 1 часа и очищали с помощью HPLC на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в 0,1% водном растворе TFA, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 368,7 (M+H).
2.85.2 N-{6-[(Бромацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
В смесь вещества из примера 2.66.1 (6,6 мг) и вещества из примера 2.85.2 (3,6 мг) в N,N-диметилформамиде (0,3 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (2,52 мкл). Смесь перемешивали в течение 5 минут, разбавляли диметилсульфоксидом и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,99 (s, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,08 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (dd, 2H), 7,60 (q, 3H), 7,56-7,50 (m, 1H), 7,50-7,41 (m, 2H), 7,36 (q, 2H), 7,32-7,25 (m, 3H), 6,96 (d, 1H), 4,98 (d, 4H), 4,39 (q, 1H), 4,20 (dd, 1H), 3,92-3,68 (m, 6H), 3,42 (dd, 1H), 3,25 (t, 2H), 3,09-2,87 (m, 6H), 2,64 (s, 2H), 2,25-1,87 (m, 5H), 1,79-0,89 (m, 17H), 0,88-0,67 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1492,5 (M-H).
2.86 Синтез 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона LJ)
2.86.1 3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(3-карбоксипропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.56 (0,024 г) и вещества из примера 2.62.6 (0,030 г) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,025 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в тетрагидрофуране (0,5 мл) и метаноле (0,5 мл) и обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,018 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). После перемешивания в течение 1 часа реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1262,7 (M+H)+.
2.86.2 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 2.86.1 (0,0173 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (4,38 мг) в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноат (4,38 мг) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамид:вода, 1:1 (1 мл), и смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,77 (s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,99 (t, 1H), 7,77 (d,1H), 7,62 (d, 1H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,40-7,32 (m, 2H), 8,28 (s, 1H), 7,23-7,17 (m, 1H), 6,97 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,60 (dd, 1H), 5,07 (m, 1H), 5,00-4,91 (m, 4H), 4,17-4,02 (m, 2H), 3,96-3,85 (m, 2H), 3,85-3,76 (m, 2H), 3,71 (t, 2H), 3,64-3,56 (m, 4H), 3,34-3,12 (m, 10H), 3,01 (, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,24-2,12 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,70 (p, 2H), 1,45-0,88 (m, 12H), 0,88-0,77 (m, 6H); MS (ESI) масса/электрон 1434,2 (M+Na)+.
2.87 Синтез 4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона MA)
2.87.1 3-(1-((3-(2-((1-(((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)пиперидин-4-ил)-(3-карбоксипропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.42 (0,050 г) и вещества из примера 2.62.6 (0,050 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) N,N-диизопропилэтиламином (0,042 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (0,5 мл) и тетрагидрофуране (0,5 мкл) и обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,031 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часа и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1345,7 (M+H)+.
2.87.2 4-({[(4-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-карбоксипропил)амино}пиперидин-1-ил)карбонил]окси}метил)-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 2.87.1 (0,047 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (0,011 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) N,N-диизопропилэтиламином (0,031 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамид:вода, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,15-8,07 (m, 2H), 7,88 (d, J=8,1 Гц, 1H), 7,71 (d, J=7,5 Гц, 1H), 7,62-7,50 (m, 3H), 7,50-7,45 (m, 1H), 7,45-7,42 (m, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,33-7,27 (m, 1H), 7,07 (s, 2H), 7,07-7,02 (m, 1H), 6,80-6,74 (m, 1H), 6,72-6,66 (m, 1H), 5,23-5,14 (m, 1H), 5,13-5,00 (m, 4H), 4,27-4,12 (m, 4H), 4,06-3,95 (m, 4H), 3,92 (s, 2H), 3,83-3,78 (m, 2H), 3,57-3,32 (m, 10H), 3,32-3,14 (m, 4H), 3,14-3,06 (m, 2H), 2,90 (s, 2H), 2,49-2,37 (m, 4H), 2,19 (s, 3H), 2,12-2,01 (m, 2H), 2,02-1,88 (m, 2H), 1,74-1,57 (m, 2H), 1,52 (s, 2H), 1,45-1,30 (m, 4H), 1,30-1,05 (m, 6H), 0,95 (s, 6H); MS (ESI) масса/электрон 1495,4 (M+H)+.
2.88 Синтез 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-сульфопропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона MD)
2.88.1 3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(3-сульфопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали раствор вещества из примера 1.6 (0,039 г) и вещества из примера 2.62.6 (0,041 г) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) N,N-диизопропилэтиламином (0,035 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток растворяли в метаноле (0,5 мл) и тетрагидрофуране (0,5 мкл) и обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,025 г) в виде раствора в воде (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часа и разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1297,8 (M+H)+.
2.88.2 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(3-сульфопропил)карбамоил}окси)метил]-3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В раствор вещества из примера 2.88.1 (0,024 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (6,40 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,016 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамид:вода, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,09-8,02 (m, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,50-7,42 (m, 2H), 7,40-7,33 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,20 (t, 1H), 6,98 (s, 3H), 6,66 (s, 1H), 6,60 (dd, 1H), 5,06 (t, 1H), 4,96 (s, 4H), 4,10 (dq, 4H), 3,81 (d, 4H), 3,71 (t, 2H), 3,59 (t, 2H), 3,51-3,35 (m, 4H), 3,26 (td, 6H), 3,17 (q, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,35 (dt, 4H), 2,10 (d, 3H), 1,75 (d, 2H), 1,44-0,88 (m, 12H), 0,82 (d, 6H); MS (ESI) масса/электрон 1446,4 (M-H)-.
2.89 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)амино}азетидин-1-ил)карбонил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона MG)
Перемешивали раствор вещества из примера 1.60 (0,026 г), 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (0,024 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,022 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамид:вода, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (dd, 2H), 7,60 (dd, 3H), 7,55-7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (t, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,04-4,92 (m, 4H), 4,37 (q, 1H), 4,34-4,24 (m, 1H), 4,24-4,10 (m, 4H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,40-3,29 (m, 4H), 3,01 (t, 2H), 2,99-2,91 (m, 1H), 2,87 (t, 2H), 2,25-2,06 (m, 5H), 1,95 (dt, 1H), 1,68 (s, 1H), 1,60 (s, 1H), 1,54-1,24 (m, 12H), 1,24-0,94 (m, 9H), 0,90-0,78 (m, 12H); MS (ESI) масса/электрон 1507,4 (M+H)+.
2.90 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[26-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-8,24-диоксо-3-(2-сульфоэтил)-11,14,17,20-тетраокса-3,7,23-триазагексакоз-1-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона MS)
В смесь вещества из примера 1.61.2 (15 мг) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадекан-19-оата (16,91 мг) в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (28,8 мкл) при 0°C. Смесь перемешивали в течение 3 часов и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой, с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,08-7,92 (m, 3H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,57-7,41 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,04-6,92 (m, 3H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,48 (d, 4H), 3,44-3,17 (m, 3H), 3,18-2,83 (m, 10H), 2,38-2,24 (m, 4H), 2,11 (s, 3H), 1,78 (m, 2H), 1,50-0,94 (m, 12H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1309,3 (M-H).
2.91 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)амино}пропил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона MR)
В смесь вещества из примера 1.61.2 (12,8 мг) и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната (10,4 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при 0°C добавляли N,N-диизопропилэтиламин (24,54 мкл). Смесь перемешивали в течение 3 часов и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,97 (s, 1H), 8,97 (s, 1H), 8,04 (t, 2H), 7,79 (dd, 2H), 7,65-7,40 (m, 7H), 7,36 (td, 3H), 7,28 (d, 3H), 6,99 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,98 (s, 1H), 4,95 (d, 4H), 4,49-4,30 (m, 1H), 4,24-4,11 (m, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,36 (t, 3H), 3,18-2,84 (m, 9H), 2,25-1,88 (m, 5H), 1,85-0,90 (m, 14H), 0,91-0,75 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон (M+H).
2.92 Синтез N-{6-[(йодацетил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона MQ)
В смесь вещества из примера 1.2.9 (8,2 мг) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-йодацетамидо)гексаноата (4,7 мг) в N,N-диметилформамиде (0,3 мл) на ледяной бане добавляли N,N-диизопропилэтиламин (3 мкл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 1,5 часа. Реакционную смесь разбавляли диметилсульфоксидом и смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson и колонки C18, с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 10,00 (s, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,06 (dd, 2H), 7,81 (dd, 2H), 7,60 (t, 3H), 7,48 (ddd, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,28 (d, 3H), 6,95 (d, 1H), 4,97 (d, 4H), 4,39 (q, 1H), 4,19 (t, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (d, 2H), 3,25 (d, 2H), 2,97 (dq, 6H), 2,63 (s, 2H), 2,25-1,88 (m, 5H), 1,78-0,70 (m, 29H). MS (ESI) масса/электрон 1538,4 (M-H).
2.93 Синтез N-{6-[(этенилсульфонил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона MZ)
2.93.1 Метил-6-(винилсульфонамидо)гексаноат
В раствор 6-метокси-6-оксогексан-1-аминия хлорида (0,3 г) и триэтиламина (1,15 мл) в дихлорметане при 0°C добавляли по каплям этенсульфонилхлорид (0,209 г). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Смесь разбавляли дихлорметаном и промывали солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 471,0 (2M+H)+.
2.93.2 6-(Винилсульфонамидо)гексановая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 2.93.1 (80 мг) и моногидрат гидроксида лития (81 мг) в смеси тетрагидрофурана (1 мл) и воды (1 мл) в течение 2 часов, затем разбавляли водой (20 мл) и промывали диэтиловым эфиром (10 мл). Водный слой подкисляли до pH 4 1 н. водным раствором HCl и экстрагировали дихлорметаном (3×10 мл). Органический слой промывали солевым раствором (5 мл), высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.93.3 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-6-(винилсульфонамидо)гексаноат
Перемешивали смесь вещества из примера 2.93.2 (25 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорида (43,3 мг) и 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (15,6 мг) в дихлорметане (8 мл) в течение ночи, промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония и солевым раствором и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.93.4 N-{6-[(Этенилсульфонил)амино]гексаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.83, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата веществом из примера 2.66.1 и веществом из примера 2.93.3 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,05 (dd, 2H), 7,79 (d, 2H), 7,60 (t, 3H), 7,55-7,40 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,27 (d, 3H), 7,19 (t, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,66 (dd, 1H), 6,09-5,90 (m, 2H), 4,97 (d, 4H), 4,39 (q, 1H), 4,20 (t, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (d, 2H), 3,25 (d, 2H), 2,97 (dt, 4H), 2,78 (q, 2H), 2,64 (q, 2H), 2,22-1,86 (m, 6H), 1,77-0,89 (m, 16H), 0,89-0,72 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1460,6 (M-H).
2.94 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-(1-{[3-(2-{[3-({6-[(йодацетил)амино]гексаноил}амино)пропил]-(2-сульфоэтил)амино}этокси)-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил]метил}-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона NA)
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.83, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата веществом из примера 2.61.2 и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-йодацетамидо)гексаноатом соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,20 (t, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,91 (t, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,50-7,41 (m, 2H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 6,96 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,06 (dt, 8H), 2,89 (t, 2H), 2,17-1,99 (m, 5H), 1,76 (s, 2H), 1,56-0,93 (m, 14H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1190,3 (M-H).
2.95 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(3-{[6-(этенилсульфонил)гексаноил]амино}пропил)-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона NB)
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.83, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2-хлорацетамидо)гексаноата веществом из примера 1.61.2 и веществом из примера 2.82.5 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,87 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,92 (t, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,51-7,41 (m, 2H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,01-6,90 (m, 2H), 6,29-6,16 (m, 2H), 4,96 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,83 (s, 2H), 3,45-3,19 (m, 2H), 3,19-2,95 (m, 8H), 2,89 (t, 2H), 2,16-1,98 (m, 5H), 1,84-1,66 (m, 2H), 1,64-1,21 (m, 13H), 1,08 (dq, 6H), 0,86 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1199,3 (M+H).
2.96 Синтез N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона NP)
2.96.1 (S)-(9H-Флуорен-9-ил)метил-(1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)карбамат
Растворяли (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-5-уреидопентановую кислоту (40 г) в дихлорметане (1,3 л). В раствор добавляли (4-аминофенил)метанол (13,01 г), 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфат(V) (42,1 г) и N,N-диизопропилэтиламин (0,035 л) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Продукт собирали посредством фильтрации и прополаскивали дихлорметаном. Объединенные твердые вещества высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 503,3 (M+H)+.
2.96.2 (S)-2-Амино-N-(4-(гидроксиметил)фенил)-5-уреидопентанамид
Растворяли вещество из примера 2.96.1 (44 г) в N,N-диметилформамиде (300 мл). Раствор обрабатывали диэтиламином (37,2 мл) и перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и растворитель концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на щелочном оксиде алюминия, с градиентом элюирования от 0 до 30% метанола в этилацетате, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 281,2 (M+H)+.
2.96.3 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Растворяли (S)-2-(трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутановую кислоту (9,69 г) в N,N-диметилформамиде (200 мл). В раствор добавляли 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфат(V) (18,65 г) и реакционную смесь перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре. Добавляли вещество из примера 2.96.2 (12,5 г) и N,N-диизопропилэтиламин (15,58 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре. Растворитель концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 10% метанолом в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 480,2 (M+H)+.
2.96.4 (S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-N-(4-(гидроксиметил)фенил)-5-уреидопентанамид
Растворяли вещество из примера 2.96.3 (31,8 г) в дихлорметане (650 мл) и в раствор добавляли трифторуксусную кислоту (4,85 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение трех часов при комнатной температуре. Растворитель концентрировали при пониженном давлении с получением смеси неочищенного указанного в заголовке соединения и 4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-2,2,2-трифторацетата. Неочищенный материал растворяли в растворе диоксан/вода, 1:1 (300 мл), и в раствор добавляли гидроксид натрия (5,55 г). Смесь перемешивали в течение трех часов при комнатной температуре. Растворитель концентрировали под вакуумом и неочищенный продукт очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы CombiFlash, с градиентом элюирования от 5 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,05% об./об. гидроксида аммония, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 380,2 (M+H)+.
2.96.5 (S)-2-((S)-2-(3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-(4-(гидроксиметил)фенил)-5-уреидопентанамид
В раствор вещества из примера 2.96.4 (38 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноат (26,7 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 531,06 (M+H)+.
2.96.6 4-((S)-2-((S)-2-(3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбонат
В раствор вещества из примера 2.96.5 (53,1 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (60,8 мг). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с градиентом элюирования от 10 до 85% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 696,2 (M+H)+.
2.96.7 N-[3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 и 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил-(4-нитрофенил)карбоната веществом из примера 1.24.2 и веществом из примера 2.96.6 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,91 (s, 1H), 9,80 (s, 2H), 8,33 (s, 2H), 7,96 (s, 2H), 7,81 (d, 4H), 7,61 (s, 2H), 7,43 (d, 10H), 7,34-7,02 (m, 14H), 5,92 (s, 8H), 4,94-4,70 (m, 6H), 4,18 (d, 11H), 3,85 (s, 8H), 3,05-2,66 (m, 8H), 2,30-2,13 (m, 14H), 2,03-1,49 (m, 2H), 0,92-0,63 (m, 40H). MS (ESI) масса/электрон 1408,3 (M-H)+.
2.97 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)-{[(2-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона NN)
2.97.1 4-(2-(2-Бромэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегид
Нагревали раствор 2,4-дигидроксибензальдегида (1,0 г), 1-бром-2-(2-бромэтокси)этана (3,4 г) и карбоната калия (1,0 г) в ацетонитриле (30 мл) до 75°C в течение 2 дней. Реакционную смесь охлаждали, разбавляли этилацетатом (100 мл), промывали водой (50 мл) и солевым раствором (50 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 30% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ELSD) масса/электрон 290,4 (M+H)+.
2.97.2 4-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-2-гидроксибензальдегид
В раствор вещества из примера 2.97.1 (1,26 г) в N,N-диметилформамиде (10 мл) добавляли азид натрия (0,43 г) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром (100 мл), промывали водой (50 мл) и солевым раствором (50 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 30% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ELSD) масса/электрон 251,4 (M+H)+.
2.97.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-2-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Перемешивали раствор вещества из примера 2.97.2 (0,84 г), (3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (1,99 г) и оксида серебра(I) (1,16 г) вместе в ацетонитриле (15 мл). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (20 мл). Добавляли диатомовую землю и реакционную смесь фильтровали и концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 75% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение.
2.97.4 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-Азидоэтокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Охлаждали раствор вещества из примера 2.97.3 (0,695 г) в метаноле (5 мл) и тетрагидрофуране (2 мл) до 0°C. Добавляли борогидрид натрия (0,023 г) и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры. После перемешивания в целом в течение 1 часа реакционную смесь выливали в смесь этилацетата (75 мл) и воды (25 мл) и добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (10 мл). Органический слой отделяли, промывали солевым раствором (50 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 85% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ELSD) масса/электрон 551,8 (M-H2O)-.
2.97.5 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
К веществу из примера 2.97.4 (0,465 г) в тетрагидрофуране (20 мл) добавляли 5% Pd/C (0,1 г) в сосуд для работы под давлением объемом 50 мл и смесь встряхивали в течение 16 часов при давлении водорода 30 фунтов/кв. дюйм. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли без дополнительной очистки. MS (ELSD) масса/электрон 544,1 (M+H)+.
2.97.6 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Охлаждали раствор вещества из примера 2.97.5 (0,443 г) в дихлорметане (8 мл) до 0°C, затем добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,214 мл) и (9H-флуорен-9-ил)метилхлорформиат (0,190 г). Через 1 час реакционную смесь концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 95% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение. MS (ELSD) масса/электрон 748,15 (M-OH)-.
2.97.7 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(2-(2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)этокси)этокси)-2-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.97.6 (0,444 г) в N,N-диметилформамиде (5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,152 мл) и бис(4-нитрофенил)карбонат (0,353 г) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 5 часов реакционную смесь концентрировали. При очистке остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 90% этилацетата в гептане, получали указанное в заголовке соединение.
2.97.8 3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота, соль трифторуксусной кислоты
В раствор вещества из примера 1.25 (0,070 г) и вещества из примера 2.97.7 (0,070 г) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,066 мл). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь концентрировали. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (0,75 мл) и метаноле (0,75 мл) и добавляли моногидрат гидроксида лития (0,047 г) в виде раствора в воде (0,75 мл). Через 3 часа реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (1 мл) и гасили трифторуксусной кислотой (0,116 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения.
2.97.9 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-4-(2-(2-(3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропанамидо)этокси)этокси)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 2.97.8 (0,027 г), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (7,92 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,017 мл) вместе в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 1 часа. Реакционную смесь гасили смесью воды и N,N-диметилформамида, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,81 (s, 1H), 8,03 (d, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,54-7,40 (m, 3H), 7,36 (td, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,69 (d, 1H), 6,60 (d, 1H), 5,03 (d, 3H), 4,96 (s, 2H), 4,05 (s, 2H), 3,93 (d, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,80 (d, 2H), 3,75-3,67 (m, 2H), 3,59 (t, 6H), 3,29 (q, 6H), 3,17 (q, 2H), 3,01 (t, 2H), 2,47 (d, 2H), 2,33 (t, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,44-0,88 (m, 12H), 0,82 (d, 6H); MS (ESI) масса/электрон 1396,5 (M-H)-.
2.98 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-3-сульфо-L-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона NO)
2.98.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 1.25.2 (0,059 г), (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамата (0,053 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,055 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при комнатной температуре в течение ночи. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,066 мл) и перемешивание продолжали в течение 30 минут. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамида и воды, 1:1 (2 мл), и гасили путем добавления трифторуксусной кислоты (0,073 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1223,8 (M+H)+.
2.98.2 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((R)-2-Амино-3-сульфопропанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота, соль трифторуксусной кислоты
Перемешивали раствор (R)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-сульфопропановой кислоты (0,021 г), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,020 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,031 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 3 минут. Раствор добавляли к веществу из примера 2.98.1 (0,043 г) в виде раствора в N,N-диметилформамиде (0,4 мл). После перемешивания в течение 30 минут добавляли раствор моногидрата гидроксида лития (0,022 г) в воде (0,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли смесью N,N-диметилформамида и воды, 1:1 (2 мл), и гасили путем добавления трифторуксусной кислоты (0,054 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1376,5 (M+1).
2.98.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((2-карбоксиэтил)-(((4-((S)-2-((S)-2-((R)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-сульфопропанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Перемешивали раствор вещества из примера 2.98.2 (0,025 г), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (7,77 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли смесью воды и N,N-диметилформамида, 1:1 (2 мл). Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 10 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 9,46 (s, 1H), 8,20 (d, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,69 (d, 2H), 7,61 (d, 1H), 7,51 (d, 1H), 7,49-7,45 (m, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,36 (td, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,25 (d, 2H), 6,97 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,98 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,73 (s, 2H), 4,16 (s, 2H), 4,03 (dd, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,81 (s, 2H), 3,51-3,32 (m, 6H), 3,28 (t, 2H), 3,09 (dd, 1H), 3,06-2,94 (m, 4H), 2,89 (dd, 1H), 2,46 (d, 2H), 2,16 (dd, 1H), 2,09 (d, 4H), 1,74 (s, 2H), 1,62-1,29 (m, 8H), 1,29-0,92 (m, 12H), 0,92-0,78 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1566,6 (M-H)-.
2.99 Синтез контрольного синтона, 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона H)
2.99.1 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-Формил-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор (2R,3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетата (4 г) в ацетонитриле (100 мл)) добавляли оксид серебра(I) (10,04 г) и 4-гидрокси-3-нитробензальдегид (1,683 г). Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием от 5 до 50% этилацетата в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон (M+18)+.
2.99.2 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(Гидроксиметил)-2-нитрофенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.99.1 (6 г) в смеси хлороформа (75 мл) и изопропанола (18,75 мл) добавляли 0,87 г силикагеля. Полученную смесь охлаждали до 0°C, добавляли NaBH4 (0,470 г) и полученную суспензию перемешивали при 0°C в течение 45 минут. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (100 мл) и фильтровали через диатомовую землю. Фильтрат промывали водой и солевым раствором и концентрировали с получением неочищенного продукта, который применяли без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон (M+NH4)+:
2.99.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-Амино-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Гидрировали перемешиваемый раствор вещества из примера 2.99.2 (7 г) в этилацетате (81 мл) при 20°C под давлением 1 атмосферы H2, с применением 10% Pd/C (1,535 г) в качестве катализатора, в течение 12 часов. Реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю и растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном/метанолом, 95/5, с получением указанного в заголовке соединения.
2.99.4 3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропановая кислота
Растворяли 3-аминопропановую кислоту (4,99 г) в 10% водном растворе Na2CO3 (120 мл) в колбе объемом 500 мл и полученное охлаждали на ледяной бане. В полученный раствор постепенно добавляли (9H-флуорен-9-ил)метилхлорформиат (14,5 г) в 1,4-диоксане (100 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов и затем добавляли воду (800 мл). Слой водной фазы отделяли от реакционной смеси и промывали диэтиловым эфиром (3×750 мл). Водный слой подкисляли 2 н. водным раствором HCl до значения pH 2 и экстрагировали этилацетатом (3×750 мл). Органические слои объединяли и концентрировали с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт перекристаллизовывали в смешанном растворителе этилацетат:гексан, 1:2 (300 мл), с получением указанного в заголовке соединения.
2.99.5 (9H-Флуорен-9-ил)метил-(3-хлор-3-оксопропил)карбамат
В раствор вещества из примера 2.99.4 в дихлорметане (160 мл) добавляли тионилхлорид (50 мл). Смесь перемешивали при 60°C в течение 1 часа. Смесь охлаждали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.99.6 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В раствор вещества из примера 2.99.3 (6 г) в дихлорметане (480 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (4,60 мл). Добавляли вещество из примера 2.99.5 (5,34 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смесь выливали в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Объединенные экстракты промывали водой и солевым раствором и высушивали над сульфатом натрия. После фильтрации и концентрирования получали остаток, который очищали с помощью радиальной хроматографии с применением от 0 до 100% этилацетата в петролейном эфире в качестве подвижной фазы, с получением указанного в заголовке соединения.
2.99.7 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропанамидо)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В смесь вещества из примера 2.99.6 (5,1 г) в N,N-диметилформамиде (200 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (4,14 г) и N,N-диизопропилэтиламин (1,784 мл). Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный материал растворяли в дихлорметане и аспирировали непосредственно на 1 мм планшет Chromatotron для радиальной хроматографии и применяли элюирование от 50 до 100% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон (M+H)+.
2.99.8 3-(1-((3-(2-((((3-(3-Аминопропанамидо)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В раствор вещества из примера 1.13.7 (325 мг) и вещества из примера 2.99.7 (382 мг) в N,N-диметилформамиде (9 мл) при 0°C добавляли N,N-диизопропиламин (49,1 мг). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 5 часов и добавляли уксусную кислоту (22,8 мг). Полученную смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в смеси тетрагидрофурана (10 мл) и метанола (5 мл). В данный раствор при 0°C добавляли 1 М водный раствор гидроксида лития (3,8 мл). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа, подкисляли уксусной кислотой и концентрировали. Концентрат лиофилизировали с получением порошка. Порошок растворяли в N,N-диметилформамиде (10 мл), охлаждали на ледяной бане и добавляли пиперидин (1 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут и добавляли 1,5 мл уксусной кислоты. Раствор очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson, с элюированием от 30 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусную кислоту, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1172,2 (M+H)+.
2.99.9 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]-2-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
К веществу из примера 2.99.8 (200 мг) в N,N-диметилформамиде (5 мл) при 0°C добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноат (105 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (0,12 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 15 минут, нагревали до комнатной температуры и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson с применением колонки C18 на 100 г, с элюированием от 30 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 2H) 9,07 (s, 1H) 8,18 (s, 1H) 8,03 (d, 1H) 7,87 (t, 1H) 7,79 (d, 1H) 7,61 (d, 1H) 7,41-7,53 (m, 3H) 7,36 (q, 2H) 7,28 (s, 1H) 7,03-7,09 (m, 1H) 6,96-7,03 (m, 3H) 6,94 (d, 1H) 4,95 (s, 4H) 4,82 (t, 1H) 3,88 (t, 3H) 3,80 (d, 2H) 3,01 (t, 2H) 2,86 (d, 3H) 2,54 (t, 2H) 2,08 (s, 3H) 2,03 (t, 2H) 1,40-1,53 (m, 4H) 1,34 (d, 2H) 0,90-1,28 (m, 12H) 0,82 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1365,3 (M+H)+.
2.100 Синтез контрольного синтона, 4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]-2-({N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-бета-аланил}амино)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона I)
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.99.9, путем замены 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата 2,5-диоксопирролидин-1-ил-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадекан-19-оатом. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,95 (s, 1H) 8,16 (s, 1H) 7,99 (d, 1H) 7,57-7,81 (m, 4H) 7,38-7,50 (m, 3H) 7,34 (q, 2H) 7,27 (s, 1H) 7,10 (d, 1H) 7,00 (d, 1H) 6,88-6,95 (m, 2H) 4,97 (d, 4H) 4,76 (d, 2H) 3,89 (t, 2H) 3,84 (d, 2H) 3,80 (s, 2H) 3,57-3,63 (m, 4H) 3,44-3,50 (m, 4H) 3,32-3,43 (m, 6H) 3,29 (t, 2H) 3,16 (q, 2H) 3,02 (t, 2H) 2,87 (s, 3H) 2,52-2,60 (m, 2H) 2,29-2,39 (m, 3H) 2,09 (s, 3H) 1,37 (s, 2H) 1,20-1,29 (m, 4H) 1,06-1,18 (m, 4H) 0,92-1,05 (m, 2H) 0,83 (s, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1568,6 (M-H)-.
2.101 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{[(43S,46S)-43-({[(4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}амино)-46-метил-37,44,47-триоксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса-38,45,48-триазапентаконтан-50-ил]окси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона OK)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.7, путем замены вещества из примера 1.13.8 веществом из примера 1.66.7. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (s, 1H), 8,21-7,97 (m, 4H), 7,79 (d, 4H), 7,71-7,32 (m, 15H), 7,28 (t, 4H), 7,02-6,91 (m, 3H), 4,95 (d, 5H), 4,33-4,12 (m, 3H), 3,98-3,76 (m, 11H), 3,41-3,21 (m, 22H), 3,21-2,90 (m, 12H), 2,24-2,05 (m, 7H), 1,81-0,90 (m, 46H), 0,90-0,78 (m, 17H). MS (ESI) масса/электрон 2014,0 (M+H)+, 1007,5 (M+2H)2+, 672,0 (M+3H)3+.
2.102 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-7-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона OW)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.62.5. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид -d6) δ ppm 9,95 (s, 1H), 8,36 (s, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,88-7,68 (m, 4H), 7,57 (d, 2H), 7,42 (s, 2H), 7,34 (t, 1H), 7,25 (dd, 3H), 7,19 (t, 1H), 6,95 (s, 2H), 5,96 (s, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,35 (q, 1H), 4,15 (dd, 1H), 3,93 (t, 2H), 3,83 (d, 2H), 3,32 (t, 2H), 3,27 (d, 1H), 2,93 (dtd, 1H), 2,80 (t, 2H), 2,47 (p, 19H), 2,24-2,02 (m, 5H), 1,91 (p, 3H), 1,74-1,25 (m, 8H), 1,27-0,89 (m, 10H), 0,79 (dd, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1414,4 (M+H)+.
2.103 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона PC)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.68.7. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,07 (s, 1H), 9,95 (s, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,33 (dd, 1H), 8,25-8,09 (m, 3H), 8,12-7,95 (m, 3H), 7,90 (d, 1H), 7,76 (dd, 2H), 7,73-7,63 (m, 1H), 7,56 (s, 3H), 7,41-7,29 (m, 1H), 6,95 (s, 2H), 5,97 (s, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,35 (d, 2H), 4,15 (dd, 1H), 3,50-3,22 (m, 10H), 2,92 (dtd, 3H), 2,29-2,00 (m, 6H), 1,92 (q, 1H), 1,75-0,88 (m, 24H), 0,79 (dd, 15H). MS (ESI) масса/электрон 1409,5 (M+H)+.
2.104 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)-{[(2-{[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона PI)
2.104.1 3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-2-(((2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-карбоксиэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
В холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.97.7 (26,9 мг) и вещества из примера 1.68.7 (23,5 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,043 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. С помощью LC/MS установили ожидаемый продукт в виде основного пика. В реакционную смесь добавляли воду (1 мл) и LiOH H2O (20 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь разбавляли N,N-диметилформамидом (2 мл), фильтровали и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1242,2 (M-H)-.
2.104.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-3-{1-[(3-{2-[(2-карбоксиэтил)-{[(2-{[(2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]бензил)окси]карбонил}амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.97.9, путем замены вещества из примера 2.97.8 веществом из примера 2.104.1 и замены 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанoатом. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,06 (s, 2H), 8,99 (s, 1H), 8,34 (dd, 1H), 8,25-8,10 (m, 3H), 8,04 (d, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,90 (d, 1H), 7,78 (d, 2H), 7,72-7,63 (m, 1H), 7,50-7,42 (m, 2H), 7,34 (t, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,94 (s, 2H), 6,65 (d, 1H), 6,56 (dd, 1H), 4,02 (t, 2H), 3,90 (d, 1H), 3,83 (s, 2H), 3,66 (t, 3H), 3,28 (q, 4H), 3,15 (q, 2H), 2,19 (s, 3H), 1,99 (t, 2H), 1,51-1,30 (m, 6H), 1,28-0,88 (m, 11H), 0,81 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1433,4 (M+H)+.
2.105 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона PJ)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.69.6. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,23 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 9,73 (d, 1H), 9,45 (s, 1H), 8,33 (t, 2H), 8,18 (d, 1H), 8,07 (dd, 2H), 8,02 (dd, 1H), 7,97 (dd, 1H), 7,80 (t, 2H), 7,65-7,55 (m, 2H), 7,53-7,44 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,27 (d, 2H), 6,98 (s, 2H), 4,98 (d, 2H), 4,38 (d, 1H), 4,18 (d, 1H), 3,56-3,31 (m, 3H), 3,26 (d, 2H), 3,08-2,89 (m, 2H), 2,64 (t, 2H), 2,23 (d, 3H), 2,12 (dp, 2H), 1,95 (s, 1H), 1,68 (s, 1H), 1,62-1,29 (m, 7H), 1,29-0,90 (m, 9H), 0,90-0,74 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1446,3 (M-H)-.
2.106 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона PU)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.70. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,97 (s, 1H), 9,12 (d, 1H), 8,93 (s, 1H), 8,60 (dd, 1H), 8,24 (dd, 2H), 8,05 (dd, 2H), 7,99-7,87 (m, 2H), 7,78 (dd, 2H), 7,67-7,51 (m, 3H), 7,43-7,31 (m, 1H), 7,26 (d, 2H), 6,97 (s, 2H), 5,98 (s, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,37 (d, 2H), 4,17 (dd, 1H), 3,49-3,22 (m, 11H), 2,95 (ddd, 3H), 2,20 (s, 4H), 2,19-1,86 (m, 3H), 1,74-0,89 (m, 22H), 0,81 (dd, 15H). MS (ESI) масса/электрон 1410,4 (M-H)-.
2.107 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона PV)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.70.5. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,96 (s, 1H), 9,11 (d, 1H), 8,92 (s, 1H), 8,60 (dd, 1H), 8,23 (dd, 2H), 8,12-7,97 (m, 2H), 7,98-7,92 (m, 2H), 7,77 (dd, 2H), 7,56 (t, 2H), 7,51-7,42 (m, 2H), 7,42-7,31 (m, 1H), 7,24 (d, 2H), 6,95 (s, 2H), 4,95 (d, 2H), 4,36 (q, 1H), 3,90-3,80 (m, 3H), 3,52-3,27 (m, 3H), 3,23 (t, 2H), 3,06-2,83 (m, 2H), 2,67-2,58 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 2,09 (dp, 2H), 1,93 (d, 1H), 1,72-1,25 (m, 7H), 1,27-0,88 (m, 10H), 0,88-0,70 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1446,3 (M-H)-.
2.108 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[5-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)хинолин-3-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-карбоксиэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона PW)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.71. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,97 (s, 1H), 9,70 (d, 1H), 9,40 (d, 1H), 8,31 (dd, 2H), 8,16 (d, 1H), 8,05 (t, 2H), 8,01-7,91 (m, 2H), 7,78 (dd, 2H), 7,59 (d, 3H), 7,52-7,44 (m, 2H), 7,36 (t, 1H), 7,26 (d, 2H), 6,96 (s, 2H), 5,99 (s, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,37 (d, 2H), 4,16 (dd, 1H), 3,53-3,20 (m, 9H), 2,94 (dtd, 2H), 2,21 (s, 3H), 2,17-1,85 (m, 3H), 1,71-0,89 (m, 22H), 0,81 (dd, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1410,4 (M-H)-.
2.109 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[1-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-5,6-дигидроимидазо[1,5-a]пиразин-7(8H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона QW)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.72.8 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид d6) δ ppm 11,07 (bs, 1H), 10,00 (bs, 1H), 8,27 (bs, 1H), 8,12 (m, 2H), 8,07 (d, 1H), 7,99 (d, 1H), 7,84-7,74 (m, 2H), 7,65 (d, 1H), 7,59 (m, 2H), 7,54-7,44 (m, 1H), 7,42-7,31 (m, 2H), 7,28 (m, 2H), 7,21 (q, 1H), 7,00 (m, 1H) 6,94-6,92 (m, 2H), 6,04 (bs, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,99 (m, 3H), 4,39 (m, 2H), 4,30 (bs, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,12 (bs, 2H), 3,70-3,64 (m, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,44-3,35 (m, 2H), 3,27 (m, 2H), 3,02 (m, 2H), 2,95 (m, 2H), 2,68 (t, 2H), 2,14 (m, 4H), 1,96 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,58 (m, 1H), 1,47 (m, 4H), 1,36 (m, 2H), 1,30-1,02 (m, 8H), 0,98 (m, 2H), 0,85-0,80 (m, 16 H).
2.110 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[7-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-1H-индол-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона RM)
Вещество из примера 2.110 получали путем замещения вещества из примера 1.74.6 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 11,30 (s, 1H), 9,93 (s, 1H), 8,26 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,92-7,84 (m, 3H), 7,76 (d, 1H), 7,69 (d, 1H), 7,54 (d, 3H), 7,47 (s, 1H), 7,35 (dd, 2H), 7,22 (t, 3H), 7,08 (t, 1H), 6,93 (s, 2H), 4,90 (s, 2H), 4,84 (t, 2H), 4,33 (q, 1H), 4,16-4,09 (m, 1H), 3,32 (t, 4H), 2,99 (m, 6H), 2,21 (s, 3H), 2,09 (m, 2H), 1,91 (m, 1H), 1,71-0,71 (m, 25H). MS (ESI) масса/электрон 1434,4 (M-H)-.
2.111 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[{3-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-(6-карбокси-5-{1-[(3,5-диметил-7-{2-[(2-сульфоэтил)амино]этокси}трицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-ил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-6-ил]пропил}(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона RR)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.75.14. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,60 (bs, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,33 (m, 2H), 8,02 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,55 (d, 2H), 7,49 (m, 3H), 7,29 (m, 1H), 7,25 (s, 4H), 6,99 (d, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,90 (m, 1H), 5,42 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,90 (m, 2H), 4,35 (t, 1H), 4,18 (t, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,55 (s, 3H), 3,52 (m, 2H), 3,35 (m, 4H), 3,22 (m, 4H), 3,08 (m, 2H), 2,99 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,85 (m, 2H), 2,79 (t, 2H), 2,52 (m, 1H), 2,15 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,94 (m, 1H), 1,88 (m, 1H), 1,68 (m, 1H), 1,54 (m, 1H), 1,42 (m, 4H), 1,38 (m, 4H), 1,27 (m, 4H), 1,13 (m, 4H), 1,02 (m, 2H), 0,85 (s, 6H), 0,78 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1523,3 (M+H)+, 1521,6 (M-H)-.
2.112 Синтез N-(6-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}гексаноил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SJ)
2.112.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Охлаждали вещество из примера 1.2.9, соль трифторуксусной кислоты (390 мг), трет-бутил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамат (286 мг) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (185 мг) в N,N-диметилформамиде (5 мл) на ледяной бане и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,35 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут и при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли диметилсульфоксидом до 10 мл и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 680,1 (M+2H)2+.
2.112.2 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 2.112.1 (300 мг) в 10 мл дихлорметана при 0°C трифторуксусной кислотой (4 мл) в течение 30 минут и смесь концентрировали. Остаток растворяли в смеси ацетонитрила и воды и лиофилизировали с получением необходимого продукта в виде соли TFA. MS (ESI) масса/электрон 1257,4 (M-H)-.
2.112.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((4-((13S,16S)-13-изопропил-2,2-диметил-4,11,14-триоксо-16-(3-уреидопропил)-3-окса-5,12,15-триазагептадеканамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Охлаждали вещество из примера 2.112.2 (соль трифторуксусной кислоты, 385 мг) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (140 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) на бане с ледяной водой. Добавляли по каплям N,N-диизопропилэтиламин (226 мкл)с последующим добавлением 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((трет-бутоксикарбонил)амино)гексаноата (127 мг) и смесь перемешивали в течение ночи. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1470,2 (M-H)-.
2.112.4 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-Аминогексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.112.2, путем замены вещества из примера 2.112.1 веществом из примера 2.112.3. MS (ESI) масса/электрон 1370,5 (M-H)-.
2.112.5 N-(6-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}гексаноил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Вещество из примера 2.112.4 (25 мг) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетат (9,19 мг) в N,N-диметилформамиде (0,3 мл) обрабатывали N,N-диизопропилэтиламином (25,4 мкл) в течение 30 минут при 0°C. Реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием 35-65% ацетонитрила в 4 мМ водном растворе ацетата аммония, с получением указанного в заголовке соединения в виде соли аммония. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,81 (s, 1H), 9,94 (s, 1H), 8,01 (dd, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,56 (s, 3H), 7,51-7,45 (m, 1H), 7,45-7,37 (m, 2H), 7,36-7,28 (m, 2H), 7,24 (t, 3H), 7,17 (s, 2H), 7,05 (s, 3H), 7,04 (s, 2H), 6,92 (s, 3H), 5,93 (s, 1H), 5,36 (s, 2H), 5,05-4,85 (m, 4H), 4,36 (q, 1H), 4,16 (dd, 1H), 3,95 (s, 2H), 3,85 (t, 2H), 3,76 (d, 2H), 3,22 (d, 1H), 3,05-2,81 (m, 6H), 2,68-2,53 (m, 2H), 2,09 (d, 4H), 1,76-0,86 (m, 14H), 0,86-0,71 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1507,5 (M-H)-.
2.113 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[3-(бета-L-глюкопирануронозилокси)пропил]карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SM)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.87.3. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,08 (s, 1H), 9,96 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,35 (dd, 1H), 8,24-8,13 (m, 3H), 8,09-8,02 (m, 2H), 8,00 (d, 1H), 7,91 (d, 1H), 7,77 (dd, 2H), 7,71-7,64 (m, 1H), 7,58 (t, 2H), 7,49-7,44 (m, 2H), 7,39-7,32 (m, 1H), 7,26 (d, 2H), 6,96 (s, 2H), 5,97 (s, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,37 (d, 1H), 4,22-4,12 (m, 2H), 3,84 (s, 1H), 3,37-3,20 (m, 6H), 3,15 (t, 1H), 3,04-2,81 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,11 (dp, 2H), 1,99-1,88 (m, 1H), 1,71 (q, 2H), 1,62-1,26 (m, 8H), 1,29-0,88 (m, 11H), 0,80 (dd, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1571,4 (M-H)-.
2.114 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)изохинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SN)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.78.5. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,95 (s, 1H), 9,61 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,54 (dd, 1H), 8,43 (d, 1H), 8,24 (d, 1H), 8,08-7,95 (m, 3H), 7,77 (dd, 2H), 7,63-7,51 (m, 2H), 7,50-7,42 (m, 2H), 7,40-7,31 (m, 1H), 7,24 (d, 2H), 6,95 (s, 2H), 6,00 (s, 1H), 4,95 (d, 2H), 4,36 (q, 1H), 4,15 (t, 1H), 3,27 (dt, 4H), 3,10-2,79 (m, 2H), 2,68-2,56 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 1,98-1,84 (m, 1H), 1,72-0,87 (m, 19H), 0,79 (dd, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1446,4 (M-H)-.
2.115 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-альфа-глутамил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SS)
2.115.1 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((4-((6S,9S,12S)-6-(3-(трет-бутокси)-3-оксопропил)-9-изопропил-2,2-диметил-4,7,10-триоксо-12-(3-уреидопропил)-3-окса-5,8,11-триазатридеканамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 2.112.2 (85 мг), гидрата 1-гидроксибензотриазола (41,3 мг) и (S)-5-трет-бутил-1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пентандиоата (54,0 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) при 0°C добавляли по каплям N,N-диизопропилэтиламин (118 мкл) и смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 35 до 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 773,4 (M+2H)2+.
2.115.2 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-Амино-4-карбоксибутанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали вещество из примера 2.115.1 (100 мг) в дихлорметане (11 мл) при 0°C трифторуксусной кислотой (4 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 3,5 часа и концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой, с элюированием от 5 до 60% ацетонитрила в смеси воды и 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
2.115.3 N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-альфа-глутамил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
В смесь гидрата 1-гидроксибензотриазола (2,87 мг), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (5,77 мг) и вещества из примера 2.115.2 (13 мг) при 0°C добавляли N,N-диизопропилэтиламин (13,08 мкл) и смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 9,99 (s, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,02 (dd, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,80-7,74 (m, 1H), 7,64 (t, 1H), 7,61-7,48 (m, 4H), 7,47-7,38 (m, 2H), 7,38-7,30 (m, 2H), 7,29-7,23 (m, 3H), 6,96 (s, 2H), 6,93 (d, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,06-4,88 (m, 5H), 4,37 (q, 1H), 4,28 (q, 1H), 4,18 (dd, 1H), 3,86 (t, 2H), 3,78 (d, 2H), 3,34 (t, 3H), 3,23 (d, 2H), 2,99 (t, 3H), 2,97-2,85 (m, 1H), 2,62 (dt, 1H), 2,26-2,15 (m, 2H), 2,16-2,00 (m, 5H), 2,01-1,79 (m, 1H), 1,75-1,50 (m, 3H), 1,50-0,87 (m, 17H), 0,81 (dd, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1579,6 (M-H)-.
2.116 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-альфа-глутамил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона TA)
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.115.3 путем замены 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетатом. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 10,02 (s, 1H), 8,38 (d, 1H), 8,14 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,82 (dd, 2H), 7,60 (t, 3H), 7,55-7,40 (m, 3H), 7,35 (td, 2H), 7,31-7,24 (m, 3H), 7,07 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 4,97 (d, 4H), 4,37 (ddd, 2H), 4,23-4,05 (m, 3H), 3,88 (t, 6H), 3,80 (d, 2H), 3,25 (d, 2H), 3,09-2,88 (m, 4H), 2,64 (s, 2H), 2,22 (dd, 2H), 2,09 (s, 3H), 2,02-1,49 (m, 5H), 1,47-0,89 (m, 12H), 0,83 (dd, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1523,5 (M-H)-.
2.117 Синтез 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-D-валил-N5-карбамоил-D-орнитил}амино)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексита (синтона TW)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.77.2 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,85 (bs, 1H), 9,98 (s, 1H), 8,06 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,78 (t, 2H), 7,60 (m, 3H), 7,52-7,42 (m, 4H), 7,36 (q, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,27 (d, 2H), 6,99 (s, 1H), 6,95 (d, 1H), 5,97 (bs, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,79 (m, 4H), 3,58 (m, 4H), 3,46-3,33 (m, 10H), 3,26 (m, 4H), 3,01 (m, 2H), 2,94 (m, 1H), 2,14 (m, 2H), 2,09 (s, 3H), 1,96 (m, 1H), 1,69 (m, 2H), 1,59 (m, 1H), 1,47 (m, 4H), 1,35 (m, 4H), 1,28-1,03 (m, 10H), 0,95 (m, 2H), 0,82 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1493 (M+H)+, 1491 (M-H)-.
2.118 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[4-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-2-оксидоизохинолин-6-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил](метил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ST)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.88.4. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,29 (s, 2H), 9,95 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,67 (s, 1H), 8,57-8,36 (m, 1H), 8,29-7,87 (m, 4H), 7,77 (dd, 2H), 7,56 (d, 2H), 7,53-7,41 (m, 2H), 7,24 (d, 2H), 6,95 (s, 2H), 5,95 (s, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,35 (q, 1H), 4,15 (dd, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,28 (dt, 4H), 3,06-2,77 (m, 3H), 2,19 (d, 3H), 2,17-1,80 (m, 3H), 1,74-0,88 (m, 22H), 0,79 (dd, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1368,4 (M-H)-.
2.119 Синтез N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ZL)
2.119.1 (3R,7aS)-3-Фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
Нагревали смесь (S)-5-(гидроксиметил)пирролидин-2-она (25 г), бензальдегида (25,5 г) и моногидрата пара-толуолсульфоновой кислоты (0,50 г) в толуоле (300 мл) с обратным холодильником с применением насадки Дина-Старка в осушительной трубке в течение 16 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и растворитель декантировали из нерастворимых материалов. Органический слой промывали насыщенной водной смесью на основе бикарбоната натрия (2x) и солевым раствором (1x). Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием гептаном/этилацетатом, 35/65, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 204,0 (M+H)+.
2.119.2 (3R,6R,7aS)-6-Бром-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
В холодную (-77°C) смесь вещества из примера 2.119.1 (44,6 г) в тетрагидрофуране (670 мл) добавляли по каплям бис(триметилсилил)амид лития (1,0 М в гексанах, 250 мл) в течение 40 минут с поддержанием температуры реакции < -73°C. Реакционную смесь перемешивали при -77°C в течение 2 часов и добавляли по каплям бром (12,5 мл) в течение 20 минут с поддержанием температуры реакции < -64°C. Реакционную смесь перемешивали при -77°C в течение 75 минут и гасили путем добавления 150 мл холодной 10% водной смеси на основе тиосульфата натрия в реакционную смесь при -77°C. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и разделяли между полунасыщенной водной смесью на основе хлорида аммония и этилацетатом. Слои разделяли и органический слой промывали водой и солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования гептаном/этилацетатом, 80/20, 75/25 и 70/30, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 299,0 и 301,0 (M+NH3+H)+.
2.119.3 (3R,6S,7aS)-6-Бром-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
Указанное в заголовке соединение выделяли в виде побочного продукта из примера 2.119.2. MS (DCI) масса/электрон 299,0 и 301,0 (M+NH3+H)+.
2.119.4 (3R,6S,7aS)-6-Азидо-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
В смесь вещества из примера 2.119.2 (19,3 г) в N,N-диметилформамиде (100 мл) добавляли азид натрия (13,5 г). Реакционную смесь нагревали до 60°C в течение 2,5 часов. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили путем добавления воды (500 мл) и этилацетата (200 мл). Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом (50 мл). Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием гептаном/этилацетатом, 78/22, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 262,0 (M+NH3+H)+.
2.119.5 (3R,6S,7aS)-6-Амино-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
В смесь вещества из примера 2.119.4 (13,5 г) в тетрагидрофуране (500 мл) и воде (50 мл) добавляли трифенилфосфин на полимерной подложке (55 г). Реакционную смесь механически перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю, с элюированием этилацетатом и толуолом. Смесь концентрировали при пониженном давлении, растворяли в дихлорметане (100 мл), высушивали с помощью сульфата натрия, затем фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. MS (DCI) масса/электрон 219,0 (M+H)+.
2.119.6 (3R,6S,7aS)-6-(Дибензиламино)-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
В смесь вещества из примера 2.119.5 (11,3 г) в N,N-диметилформамиде (100 мл) добавляли карбонат калия (7,0 г), йодид калия (4,2 г) и бензилбромид (14,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и гасили путем добавления воды и этилацетата. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 10 до 15% этилацетата в гептане, с получением твердого вещества, которое растирали с гептаном, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 399,1 (M+H)+.
2.119.7 (3S,5S)-3-(Дибензиламино)-5-(гидроксиметил)пирролидин-2-он
В смесь вещества из примера 2.119.6 (13 г) в тетрагидрофуране (130 мл) добавляли моногидрат пара-толуолсульфоновой кислоты (12,4 г) и воду (50 мл) и реакционную смесь нагревали до 65°C в течение 6 дней. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили путем добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и этилацетата. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Воскообразные твердые вещества растирали с гептаном (150 мл) с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 311,1 (M+H)+.
2.119.8 (3S,5S)-5-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-(дибензиламино)пирролидин-2-он
В смесь вещества из примера 2.119.7 (9,3 г) и 1H-имидазола (2,2 г) в N,N-диметилформамиде добавляли трет-бутилхлордиметилсилан (11,2 мл, 50 вес. % в толуоле) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь гасили путем добавления воды и этилового эфира. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 35% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 425,1 (M+H)+.
2.119.9 трет-Бутил-2-((3S,5S)-5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-(дибензиламино)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
В холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.119.8 (4,5 г) в тетрагидрофуране (45 мл) добавляли 95% гидрид натрия (320 мг) двумя порциями. Холодную смесь перемешивали в течение 40 минут и добавляли трет-бутил-2-бромацетат (3,2 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь гасили путем добавления воды и этилацетата. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5 до 12% этилацетата в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 539,2 (M+H)+.
2.119.10 трет-Бутил-2-((3S,5S)-3-(дибензиламино)-5-(гидроксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
В смесь вещества из примера 2.119.9 (5,3 г) в тетрагидрофуране (25 мл) добавляли фторид тетрабутиламмония (11 мл, 1,0 М в тетрагидрофуране/воде, 95/5). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа и затем гасили путем добавления насыщенной водной смеси хлорида аммония, воды и этилацетата. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 35% этилацетатом в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 425,1 (M+H)+.
2.119.11 трет-Бутил-2-((3S,5S)-5-((2-((4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-3-(дибензиламино)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
В смесь вещества из примера 2.119.10 (4,7 г) в диметилсульфоксиде (14 мл) добавляли смесь 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфоната (14,5 г) в диметилсульфоксиде (14 мл). Добавляли карбонат калия (2,6 г) и воду (28 мкл) и реакционную смесь нагревали при 60°C в атмосфере азота в течение одного дня. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем гасили путем добавления смеси солевого раствора, воды и диэтилового эфира. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 15 до 25% этилацетата в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI+) масса/электрон 871,2 (M+H)+.
2.119.12 трет-Бутил-2-((3S,5S)-3-амино-5-((2-((4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Растворяли вещество из примера 2.119.11 (873 мг) в этилацетате (5 мл) и метаноле (15 мл) и добавляли гидроксид палладия на угле, 20% по весу (180 мг). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода (30 фунтов/кв. дюйм) при комнатной температуре в течение 30 часов, затем при 50°C в течение одного часа. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и концентрировали с получением требуемого продукта. MS (ESI+) масса/электрон 691,0 (M+H)+.
2.119.13 4-(((3S,5S)-1-(2-(трет-Бутокси)-2-оксоэтил)-5-((2-((4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-2-оксопирролидин-3-ил)амино)-4-оксобут-2-еновая кислота
Малеиновый ангидрид (100 мг) растворяли в дихлорметане (0,90 мл) и по каплям добавляли смесь вещества из примера 2.119.12 (650 мг) в дихлорметане (0,90 мл), затем нагревали при 40°C в течение 2 часов. Реакционную смесь непосредственно очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 1,0 до 2,5% метанола в дихлорметане, содержащем 0,2% уксусной кислоты. После концентрирования фракций, содержащих продукт, добавляли толуол (10 мл) и смесь снова концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI-) масса/электрон 787,3 (M-H)-.
2.119.14 трет-Бутил-2-((3S,5S)-5-((2-((4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Суспендировали вещество из примера 2.119.13 (560 мг) в толуоле (7 мл) и добавляли триэтиламин (220 мкл) и сульфат натрия (525 мг). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 6 часов и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и твердые вещества прополаскивали этилацетатом. Элюент концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием гептаном/этилацетатом, 45/55, с получением указанного в заголовке соединения.
2.119.15 2-((3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)уксусная кислота
Растворяли вещество из примера 2.119.14 (1,2 г) в трифторуксусной кислоте (15 мл) и нагревали до 65-70°C в атмосфере азота в течение ночи. Удаляли трифторуксусную кислоту при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетонитриле (2,5 мл) и очищали с помощью препаративной жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке Luna C18(2) AXIA (250×50 мм, с размером частицы 10 мкм) с применением градиента 5-75% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты в воде, в течение 30 минут с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI-) масса/электрон 375,2 (M-H)-.
2.119.16 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.43.7 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI-) масса/электрон 1252,4 (M-H)-.
2.119.17 N-({(3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Вещество из примера 2.119.15 (7 мг) растворяли в N,N-диметилформамиде (0,15 мл) и добавляли O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (9 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (7 мкл). Смесь перемешивали в течение 3 минут при комнатной температуре и добавляли в смесь вещества из примера 2.119.16 (28 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (15 мкл) в N,N-диметилформамиде (0,15 мл). Через 1 час реакционную смесь разбавляли N,N-диметилформамидом/водой, 1/1 (1,0 мл), и очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой (колонка C18), с элюированием от 5 до 75% ацетонитрила в 0,1% водном растворе TFA, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,95 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,37 (d, 1H), 8,22 (m, 2H), 8,18 (m, 2H), 8,08 (m, 2H), 8,03 (m, 1H), 7,96 (br d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,70 (t, 1H), 7,61 (br m, 3H), 7,48 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,27 (br m, 2H), 7,08 (s, 2H), 4,99 (br d, 3H), 4,68 (t, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 4,04 (m, 1H), 3,87 (br d, 2H), 3,74 (br m, 1H) 3,65 (br t, 2H), 3,48 (br m, 4H), 3,43 (br m, 2H), 3,26 (br m, 2H), 3,00 (br m, 2H), 2,80 (m, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,66 (br m, 2H), 2,36 (br m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,87 (m, 1H), 1,69 (br m, 1H), 1,62 (br m, 1H), 1,40 (br m, 4H), 1,31-1,02 (m, 10 H), 0,96 (m, 2H), 0,85 (m, 12H). MS (ESI-) масса/электрон 1610,3 (M-H)-.
2.120 Синтез N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SX)
2.120.1 (S)-Метил-3-(4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат
В смесь 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил-4-метилбензолсульфоната (82,48 г) и карбоната калия (84,97 г) в ацетонитриле (1,5 л) добавляли (S)-метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-(4-гидроксифенил)пропаноат (72,63 г) и реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 12 часов. После того, как с помощью LC/MS установили, что исходный материал израсходовался, и основной продукт представлял собой требуемый продукт, реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали с помощью Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI): масса/электрон 811 (M+H2O)+.
2.120.2 3-(4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.120.1 (90,00 г) в тетрагидрофуране (1,5 л) и воде (500 мл) добавляли моногидрат гидроксида лития (14,27 г). Реакционную смесь перемешивали при 30°C в течение 12 часов, и с помощью LC/MS установили, что исходный материал израсходовался, и основной продукт представлял собой требуемый продукт. Реакционную смесь регулировали с применением водного раствора HCl до pH=6, и смесь концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке соединения. MS (ESI): масса/электрон 778,3 (M-H)-.
2.120.3 3-(4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-2-аминопропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.120.2 (88,41 г) в дихлорметане (1,5 л) добавляли трифторуксусную кислоту (100 мл) при 25°C в атмосфере N2 и реакционную смесь перемешивали при 40°C в течение 12 часов. С помощью LC/MS установили, что исходный материал израсходовался, и основной продукт представлял собой требуемый продукт. Смесь концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали с помощью Prep-HPLC с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 7,20 (d, J=8,6 Гц, 2H), 6,93 (d, J=8,2 Гц, 2H), 4,22 (dd, J=5,5, 7,4 Гц, 1H), 4,14-4,06 (m, 2H), 3,84-3,79 (m, 2H), 3,68-3,50 (m, 40H), 3,33 (s,3H), 3,21 (d, J=5,5 Гц, 1H), 3,12-3,05 (m,1H). MS (ESI) масса/электрон 680,1 (M+H)+.
2.120.4 4-((2-(4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-1-карбоксиэтил)амино)-4-оксобут-2-еновая кислота
В смесь вещества из примера 2.120.3 (80,00 г) в диоксане (1 л) добавляли фуран-2,5-дион (35 г) и реакционную смесь перемешивали при 120°C в течение 4 часов. С помощью LC/MS установили, что исходный материал израсходовался, и основной продукт представлял собой требуемый продукт. Смесь концентрировали с получением неочищенного указанного в заголовке соединения, которое применяли без очистки на следующей стадии. MS (ESI) масса/электрон 795,4 (M+H)+.
2.120.5 (S)-3-(4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.120.4 (96 г, неочищенное) в толуоле (1,5 л) добавляли триэтиламин (35,13 г) и реакционную смесь перемешивали при 120°C в течение 4 часов. С помощью LC/MS установили, что исходный материал израсходовался, и основной продукт представлял собой требуемый продукт. Реакционную смесь фильтровали с выделением органической фазы и органические вещества концентрировали с получением неочищенного продукта, который очищали с помощью Prep-HPLC (устройство: Shimadzu LC-20AP для препаративной HPLC, колонка: Phenomenex® Luna® (2) C18 250*50 мм, внутр. диам. 10 мкм, подвижная фаза: A означает H2O (0,09% раствор трифторуксусной кислоты), и B означает CH3CN, градиент: B от 15% до 43% за 20 минут, расход: 80 мл/минута, длина волны: 220 и 254 нм, вводимое количество: 1 грамм на введение), затем с помощью SFC-HPLC, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 6,98 (d, 2H), 6,74 (d, 2H), 6,56 (s, 2H), 4,85 (dd, 1H), 4,03 (t, 2H), 3,84-3,76 (m, 2H), 3,71-3,66 (m, 2H), 3,65-3,58 (m, 39H), 3,55-3,50 (m, 2H), 3,41-3,30 (m, 4H). MS (ESI) масса/электрон 760,3 (M+H)+.
2.120.6 N-{(2S)-2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.120.5 веществом из примера 2.119.15 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 10,03 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,37 (d, 1H), 8,22 (m, 3H), 8,16 (d, 1H), 8,12 (br m, 1H), 8,07 (d, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,96 (br d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,70 (t, 1H), 7,59 (br m, 2H), 7,48 (m, 2H), 7,37 (t, 1H), 7,28 (d, 2H), 7,02 (d, 2H), 6,89 (s, 2H), 6,77 (d, 2H), 4,98 (br d, 2H), 4,79 (dd, 1H), 4,39 (br m, 1H), 4,23 (br m, 2H), 3,99 (br m, 2H), 3,88 (br m, 2H), 3,69 (br m, 4H), 3,55 (m, 4H), 3,50 (s, 32H), 3,42 (m, 4H), 3,27 (m, 4H), 3,23 (s, 3H), 3,20 (m, 1H), 3,03 (br m, 1H), 2,98 (m, 1H), 2,65 (br t, 2H), 2,22 (s, 3H), 1,97 (br m, 1H), 1,69 (br m, 1H), 1,61 (br m, 1H), 1,39 (m, 4H), 1,31-0,91 (m, 12H), 0,85 (m, 9H), 0,77 (d, 3H). MS (ESI) масса/электрон 1993,7 (M-H)-.
2.121 Синтез N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SW)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.49.1 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,96 (s, 1H), 8,17 (br d, 1H), 8,03 (d, 2H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (m, 3H), 7,55 (d, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,37 (m, 3H), 7,27 (d, 2H), 7,08 (s, 2H), 6,98 (d, 1H), 4,97 (m, 4H), 4,68 (t, 1H), 4,37 (br m, 1H), 4,22 (br s, 1H), 4,17 (d, 1H), 4,03 (d, 1H), 3,89 (br t, 2H), 3,83 (br d, 2H), 3,74 (br m, 1H), 3,65 (t, 2H), 3,49 (m, 3H), 3,40 (br m, 4H), 3,25 (br m, 2H), 3,02 (br m, 4H), 2,80 (m, 2H), 2,67 (br m, 2H), 2,37 (br m, 1H), 2,10 (s, 3H), 1,99 (m, 1H), 1,86 (m, 1H), 1,69 (br m, 1H), 1,61 (br m, 1H), 1,52-0,91 (m, 16H), 0,85 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1615,4 (M-H)-.
2.122 Синтез N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона TV)
В смесь вещества из примера 2.120.5 (19,61 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (9,81 мг) в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (27,7 мкл). Смесь перемешивали в течение 5 минут и добавляли в холодную смесь вещества из примера 2.112.2 в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 40 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,99 (s, 1H), 8,19 (d, 1H), 8,14-8,04 (m, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,62-7,52 (m, 3H), 7,49 (d, 1H), 7,46-7,37 (m, 2H), 7,36-7,29 (m, 2H), 7,28-7,21 (m, 3H), 6,99 (d, 2H), 6,92 (d, 1H), 6,85 (s, 2H), 6,79-6,71 (m, 2H), 4,94 (d, 3H), 4,76 (dd, 1H), 4,35 (d, 1H), 4,20 (t, 1H), 3,96 (dd, 2H), 3,85 (t, 2H), 3,77 (d, 2H), 3,66 (dd, 2H), 3,52 (dd, 2H), 3,50-3,47 (m, 2H), 3,39 (dd, 2H), 3,20 (s, 4H), 2,97 (t, 3H), 2,60 (t, 2H), 2,13-2,01 (m, 3H), 1,93 (s, 1H), 1,61 (d, 2H), 1,49-0,88 (m, 10H), 0,87-0,59 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1998,7 (M-H)-.
2.123 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона SZ)
2.123.1 (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-Трис(бензилокси)-6-(бензилоксиметил)тетрагидропиран-2-он
В смесь (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-трис(бензилокси)-6-((бензилокси)метил)тетрагидро-2H-пиран-2-ола (75 г) в диметилсульфоксиде (400 мл) при 0°C добавляли уксусный ангидрид (225 мл). Смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре, после чего ее охлаждали до 0°C. Добавляли большое количество воды и останавливали перемешивание так, что обеспечивали осаждение реакционной смеси в течение 3 часов (неочищенный лактон перемещался на дно колбы). Надосадочную жидкость удаляли и неочищенную смесь разбавляли этилацетатом и 3 раза промывали водой, нейтрализовали насыщенной водной смесью на основе NaHCO3 и снова дважды промывали водой. Затем органический слой высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 561 (M+Na)+.
2.123.2 (3R,4S,5R,6R)-3,4,5-Трис(бензилокси)-6-(бензилоксиметил)-2-этинилтетрагидро-2H-пиран-2-ол
В смесь этинилтриметилсилана (18,23 г) в тетрагидрофуране (400 мл) в атмосфере азота, охлажденную на бане из сухого льда/ацетона (внутренняя темп.-65°C), добавляли по каплям 2,5 М BuLi в гексане (55,7 мл), с поддержанием температуры ниже -60°C. Смесь перемешивали на холодной бане в течение 40 минут, затем на бане с ледяной водой (внутренняя темп. повышалась до 0,4°C) в течение 40 минут, и наконец снова охлаждали до -75°C. Добавляли по каплям смесь вещества из примера 2.123.1 (50 г) в тетрагидрофуране (50 мл) с поддержанием внутренней температуры ниже -70°C. Смесь перемешивали на бане из сухого льда/ацетона в течение дополнительно 3 часов. Реакционную смесь гасили насыщенной водной смесью на основе NaHCO3 (250 мл). Обеспечивали нагревание смеси до комнатной температуры, ее экстрагировали этилацетатом (3×300 мл), высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 659 (M+Na)+.
2.123.3 Триметил-(((3S,4R,5R,6R)-3,4,5-трис(бензилокси)-6-(бензилоксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)этинил)силан
В перемешанную смесь вещества из примера 2.123.2 (60 г) в ацетонитриле (450 мл) и дихлорметане (150 мл) при -15°C на бане с льдом и солью добавляли по каплям триэтилсилан (81 мл) с последующим добавлением комплекса трифторида бора с диэтиловым эфиром (40,6 мл) со скоростью, при которой внутренняя температура не превышала -10°C. Затем смесь перемешивали при температуре от -15°C до -10°C в течение 2 часов. Реакционную смесь гасили насыщенной водной смесью на основе NaHCO3 (275 мл) и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем смесь экстрагировали этилацетатом (3×550 мл). Экстракты высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с градиентом элюирования этилацетатом/петролейным эфиром, от 0% до 7%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 643 (M+Na)+.
2.123.4 (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-Трис(бензилокси)-2-(бензилоксиметил)-6-этинилтетрагидро-2H-пиран
В перемешанную смесь вещества из примера 2.123.3 (80 г) в дихлорметане (200 мл) и метаноле (1000 мл) добавляли 1 н. водную смесь на основе NaOH (258 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли. Затем остаток разделяли между водой и дихлорметаном. Экстракты промывали солевым раствором, высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 571 (M+Na)+.
2.123.5 (2R,3R,4R,5S)-2-(Ацетоксиметил)-6-этинилтетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В смесь вещества из примера 2.123.4 (66 г) в уксусном ангидриде (500 мл), охлажденную с помощью бани со льдом/водой, добавляли по каплям комплекс трифторида бора с диэтиловым эфиром (152 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, охлаждали с помощью бани со льдом/водой и нейтрализовали насыщенной водной смесью на основе NaHCO3. Смесь экстрагировали этилацетатом (3×500 мл), высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали in vacuo. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с градиентом элюирования этилацетатом/петролейным эфиром, от 0% до 30%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 357 )+.
2.123.6 (3R,4R,5S,6R)-2-Этинил-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триол
В смесь вещества из примера 2.123.5 (25 г) в метаноле (440 мл) добавляли метанолат натрия (2,1 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем нейтрализовали 4 М HCl в диоксане. Растворитель удаляли и остаток адсорбировали на силикагеле и загружали на колонку из силикагеля. На колонке применяли градиент элюирования этилацетат/петролейный эфир, от 0 до 100%, затем метанол/этилацетат, от 0% до 12%, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 211 (M+Na)+.
2.123.7 (2S,3S,4R,5R)-6-Этинил-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоновая кислота
В трехгорлую круглодонную колбу загружали вещество из примера 2.123.6 (6,00 г), KBr (0,30 г), бромид тетрабутиламмония (0,41 г) и 60 мл насыщенной водной смеси на основе NaHCO3. Добавляли TEMPO ((2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил)оксил, 0,15 г) в 60 мл дихлорметана. Смесь энергично перемешивали и охлаждали на бане со льдом и солью до внутренней температуры, составляющей -2°C. Добавляли по каплям смесь солевого раствора (12 мл), водную смесь NaHCO3 (24 мл) и NaOCl (154 мл) так, что внутренняя температура поддерживалась ниже 2°C. Поддерживали pH реакционной смеси в диапазоне 8,2-8,4 путем добавления твердого Na2CO3. Через в целом 6 часов реакционную смесь охлаждали до внутренней температуры 3°C и добавляли по каплям этанол (~20 мл). Смесь перемешивали в течение ~30 минут. Смесь переносили в делительную воронку и слой на основе дихлорметана отбрасывали. Регулировали pH водного слоя до 2-3 с помощью 1 М водного раствора HCl. Затем водный слой концентрировали до сухого состояния с получением твердого вещества. К сухому твердому веществу добавляли метанол (100 мл) и взвесь перемешивали в течение ~30 минут. Смесь фильтровали через слой диатомовой земли и остаток в воронке промывали с помощью ~100 мл метанола. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения.
2.123.8 (2S,3S,4R,5R)-Метил-6-этинил-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоксилат
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 500 мл загружали суспензию из примера 2.123.7 (6,45 г) в метаноле (96 мл) и ее охлаждали на бане со льдом и солью при внутренней температуре, составляющей -1°C. Осторожно добавляли чистый тионилхлорид (2,79 мл). Внутренняя температура продолжала повышаться на протяжении добавления, но не превышала 10°C. Обеспечивали медленное нагревание реакционной смеси до 15-20°C в течение 2,5 часа. Через 2,5 часа реакционную смесь концентрировали с получением указанного в заголовке соединения.
2.123.9 (3S,4R,5S,6S)-2-Этинил-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
К веществу из примера 2.123.8 (6,9 г) в виде смеси в N,N-диметилформамиде (75 мл) добавляли 4-(диметиламино)пиридин (0,17 г) и уксусный ангидрид (36,1 мл). Суспензию охлаждали на ледяной бане и добавляли пиридин (18,04 мл) с помощью шприца в течение 15 минут. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры в течение ночи. Добавляли дополнительное количество уксусного ангидрида (12 мл) и пиридина (6 мл) и продолжали перемешивание в течение дополнительно 6 часов. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане и добавляли 250 мл насыщенной водной смеси на основе NaHCO3 и полученное перемешивали в течение 1 часа. Добавляли воду (100 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт дважды промывали насыщенной смесью на основе CuSO4, высушивали, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии, с элюированием этилацетатом/петролейным эфиром, 50%, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, метанол-d4) δ ppm 5,29 (t, 1H), 5,08 (td, 2H), 4,48 (dd, 1H), 4,23 (d, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,04 (d, 1H), 2,03 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,98 (s, 4H).
2.123.10 2-Йод-4-нитробензойная кислота
В колбу объемом 3 л с полной рубашкой, оснащенную механической мешалкой, температурным датчиком и капельной воронкой в атмосфере азота, загружали 2-амино-4-нитробензойную кислоту (69,1 г, Combi-Blocks) и серную кислоту, 1,5 М, водный раствор (696 мл). Полученную суспензию охлаждали до внутренней температуры, составляющей 0°C, и добавляли по каплям смесь нитрита натрия (28,8 г) в воде (250 мл) в течение 43 минут, при этом температуру поддерживали ниже 1°C. Реакционную смесь перемешивали при примерно 0°C в течение 1 часа. Добавляли по каплям смесь йодида калия (107 г) в воде (250 мл) в течение 44 минут, при этом температуру поддерживали ниже 1°C (изначально добавление было экзотермическим и наблюдалось выделение газа). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°C. Температуру повышали до 20°C и затем смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционная смесь становилась суспензией. Реакционную смесь фильтровали и собранное твердое вещество промывали водой. Перемешивали влажное твердое вещество (~108 г) в 10% сульфите натрия (350 мл, при этом ~200 мл воды применяли для промывания твердого вещества) в течение 30 минут. Суспензию подкисляли концентрированной хлористоводородной кислотой (35 мл) и твердое вещество собирали путем фильтрации и промывали водой. Твердое вещество суспендировали в воде (1 л) и повторно фильтровали и обеспечивали высыхание твердого вещества в воронке в течение ночи. Затем твердое вещество высушивали в вакуумной печи в течение 2 часов при 60°C. Полученное твердое вещество растирали с дихлорметаном (500 мл) и суспензию фильтровали и промывали с помощью дополнительного количества дихлорметана. Твердое вещество высушивали на воздухе с получением указанного в заголовке соединения.
2.123.11 (2-Йод-4-нитрофенил)метанол
В высушенную пламенем 3-горлую колбу объемом 3 л загружали вещество из примера 2.123.10 (51,9 г) и тетрагидрофуран (700 мл). Смесь охлаждали на ледяной бане до 0,5°C и добавляли по каплям боран-тетрагидрофурановый комплекс (443 мл, 1 М в THF) (присутствовало выделение газа) в течение 50 минут, с достижением конечной внутренней температуры, составляющей 1,3°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 15 минут и ледяную баню удаляли. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до температуры окружающей среды в течение 30 минут. Устанавливали колбонагреватель и реакционную смесь нагревали до внутренней температуры, составляющей 65,5°C, в течение 3 часов и затем обеспечивали ее охлаждение до комнатной температуры при перемешивании в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане до 0°C и гасили путем добавления по каплям метанола (400 мл). После короткого периода инкубации температура быстро повышалась до 2,5°C с выделением газа. После добавления первых 100 мл в течение ~30 минут добавление больше не было экзотермическим, и выделение газа прекратилось. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали при температуре окружающей среды в атмосфере азота в течение ночи. Смесь концентрировали до твердого вещества, растворяли в дихлорметане/метаноле и адсорбировали на силикагеле (~150 г). Остаток загружали на слой силикагеля (3000 мл) и применяли элюирование дихлорметаном, с получением указанного в заголовке соединения.
2.123.12 (4-Амино-2-йодфенил)метанол
В колбу объемом 5 л, оснащенную механической мешалкой, колбонагревателем, контролируемым температурным датчиком JKEM, и обратным холодильником, загружали вещество из примера 2.123.11 (98,83 г) и этанол (2 л). Реакционную смесь быстро перемешивали и добавляли железо (99 г) с последующим добавлением смеси хлорида аммония (20,84 г) в воде (500 мл). Реакционную смесь нагревали в течение 20 минут до внутренней температуры, составляющей 80,3°C, при которой смесь начинала бурно кипеть. Нагреватель удаляли до прекращения кипения. После этого смесь нагревали до 80°C в течение 1,5 часа. Реакционную смесь фильтровали в горячем состоянии через мембранный фильтр, и остаток железа промывали горячим этилацетатом/метанолом, 50% (800 мл). Элюент пропускали через слой диатомовой земли и фильтрат концентрировали. Остаток разделяли между 50% солевым раствором (1500 мл) и этилацетатом (1500 мл). Слои разделяли и водный слой экстрагировали этилацетатом (400 мл x 3). Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли без дополнительной очистки.
2.123.13 4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-йоданилин
В колбу объемом 5 л с механической мешалкой загружали вещество из примера 2.123.12 (88 г) и дихлорметан (2 л). Суспензию охлаждали на ледяной бане до внутренней температуры, составляющей 2,5°C, и добавляли порциями трет-бутилхлордиметилсилан (53,3 г) в течение 8 минут. Через 10 минут порциями добавляли 1H-имидазол (33,7 г) в холодную реакционную смесь. Реакционную смесь перемешивали в течение 90 минут, при этом внутренняя температура повышалась до 15°C. Реакционную смесь разбавляли водой (3 л) и дихлорметаном (1 л). Слои разделяли и органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением масла. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (1600 г, силикагель), с градиентом элюирования от 0 до 25% этилацетата в гептане, с получением указанного в заголовке соединения в виде масла.
2.123.14 (S)-2-((S)-2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропановая кислота
В смесь (S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутановой кислоты (6,5 г) в диметоксиэтане (40 мл) добавляли (S)-2-аминопропановую кислоту (1,393 г) и бикарбонат натрия (1,314 г) в воде (40 мл). Добавляли тетрагидрофуран (20 мл) для повышения растворимости. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли водный раствор лимонной кислоты (15%, 75 мл) и смесь экстрагировали 10% 2-пропанолом в этилацетате (2×100 мл). В органическом слое образовывался осадок. Объединенные органические слои промывали водой (2×150 мл). Органический слой концентрировали при пониженном давлении и затем растирали с диэтиловым эфиром (80 мл). После короткой обработки ультразвуком указанное в заголовке соединение собирали путем фильтрации. MS (ESI) масса/электрон 411 (M+H)+.
2.123.15 (9H-Флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.123.13 (5,44 г) и вещества из примера 2.123.14 (6,15 г) в смеси дихлорметана (70 мл) и метанола (35,0 мл) добавляли этил-2-этоксихинолин-1(2H)-карбоксилат (4,08 г) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и загружали на силикагель, с градиентом элюирования от 10% до 95% гептана в этилацетате, затем 5% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие продукт, концентрировали, растворяли в 0,2% растворе метанола в дихлорметане (50 мл), загружали на силикагель и применяли градиент элюирования от 0,2% до 2% метанола в дихлорметане. Фракции, содержащие продукт, собирали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 756,0 (M+H)+.
2.123.16 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-((5-((S)-2-((S)-2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенил)этинил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Объединяли смесь вещества из примера 2.123.9 (4,500 г), вещества из примера 2.123.15 (6,62 г), йодида меди(I) (0,083 г) и бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорида (0,308 г) во флаконе и дегазировали. Добавляли N,N-диметилформамид (45 мл) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (4,55 мл), и реакционный сосуд продували азотом и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разделяли между водой (100 мл) и этилацетатом (250 мл). Слои разделяли и органический слой высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5% до 95% этилацетата в гептане. Фракции, содержащие продукт, собирали, концентрировали и очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0,25% до 2,5% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 970,4 (M+H)+.
2.123.17 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)фенэтил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Добавляли вещество из примера 2.123.16 (4,7 г) и тетрагидрофуран (95 мл) к 5% Pt/C (2,42 г, влажный) в сосуд для работы под давлением объемом 50 мл и встряхивали в течение 90 минут при комнатной температуре при давлении водорода 50 фунтов/кв. дюйм. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 974,6 (M+H)+.
2.123.18 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)фенэтил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Перемешивали смесь вещества из примера 2.123.17 (5,4 г) в тетрагидрофуране (7 мл), воде (7 мл) и ледяной уксусной кислоте (21 мл) в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой (100 мл), насыщенной водной смесью на основе NaHCO3 (100 мл), солевым раствором (100 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 0,5% до 5% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 860,4 (M+H)+.
2.123.19 (2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенэтил)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В смесь вещества из примера 2.123.18 (4,00 г) и бис(4-нитрофенил)карбоната (2,83 г) в ацетонитриле (80 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (1,22 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи реакционную смесь концентрировали, растворяли в дихлорметане (250 мл) и промывали насыщенной водной смесью на основе NaHCO3 (4×150 мл). Органический слой высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Полученную пену очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с градиентом элюирования от 5% до 75% этилацетата в гексанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1025,5 (M+H)+.
2.123.20 3-(1-((3-(2-((((4-((R)-2-((R)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.123.19 (70 мг) и вещества из примера 1.2.9 (58,1 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,026 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли воду (1 мл) и LiOH H2O (20 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь подкисляли трифторуксусной кислотой, фильтровали и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1564,4 (M-H)-.
2.123.21 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.54, путем замены вещества из примера 2.49.1 веществом из примера 2.123.20. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,86 (s, 1H), 9,92 (d, 1H), 8,35-8,19 (m, 2H), 8,04 (d, 1H), 7,80 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,57-7,32 (m, 8H), 7,28 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,08 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,12-4,91 (m, 5H), 4,39 (t, 1H), 4,32-4,19 (m, 1H), 4,12 (s, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,80 (d, 2H), 3,14 (t, 1H), 3,06-2,87 (m, 4H), 2,69-2,58 (m, 4H), 2,37 (p, 1H), 2,09 (d, 4H), 2,04-1,91 (m, 4H), 1,54 (d, 1H), 1,40-0,99 (m, 20H), 0,99-0,74 (m, 16H). MS (ESI) масса/электрон 1513,5 (M-H)-.
2.124 Синтез 3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона ZM)
2.124.1A (9H-Флуорен-9-ил)метилбут-3-ин-1-илкарбамат
Перемешивали смесь бут-3-ин-1-амина гидрохлорида (9 г) и N,N-диизопропилэтиламина (44,7 мл) в дихлорметане (70 мл) и охлаждали до 0°C. Добавляли смесь (9H-флуорен-9-ил)метилхлорформиата (22,06 г) в дихлорметане (35 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром в этилацетате (от 10% до 25%), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 314 (M+Na)+.
2.124.1B (3R,4S,5S,6S)-2-(2-Формил-5-йодфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
В перемешиваемый раствор 2-гидрокси-4-йодбензальдегида (0,95 г) в ацетонитриле (10 мл) добавляли (3R,4S,5S,6S)-2-бром-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат (2,5 г) и оксид серебра (2 г). Смесь накрывали алюминиевой фольгой и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. После фильтрации через диатомовую землю фильтрат промывали этилацетатом, раствор концентрировали. Реакционную смесь очищали с помощью флэш-хроматографии с применением системы ISCO CombiFlash, колонки SF40-80g, с элюированием этилацетатом/гептаном, от 15 до 30% (расход: 60 мл/мин), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 586,9 (M+Na)+.
2.124.2 (2S,3S,4S,5R,6S)-Метил-6-(5-(4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)бут-1-инил)-2-формилфенокси)-3,4,5-триацетокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоксилат
Взвешивали вещество из примера 2.124.1B (2,7 г), вещество из примера 2.124.1A (2,091 г), бис(трифенилфосфин)палладия(II) хлорид (0,336 г) и йодид меди(I) (0,091 г) в сосуде и продували потоком азота. Добавляли триэтиламин (2,001 мл) и тетрагидрофуран (45 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. После перемешивания в течение 16 часов реакционную смесь разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали водой (100 мл) и солевым раствором (100 мл). Органический слой высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром в этилацетате (от 10% до 50%), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 750 (M+Na)+.
2.124.3 (2S,3S,4S,5R,6S)-Метил-6-(5-(4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)бутил)-2-формилфенокси)-3,4,5-триацетокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоксилат
Добавляли вещество из примера 2.124.2 (1,5 г) и тетрагидрофуран (45 мл) к 10% Pd-C (0,483 г) в сосуд для работы под давлением объемом 100 мл и перемешивали в течение 16 часов при давлении H2 1 атм. при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 754 (M+Na)+.
2.124.4 (2S,3S,4S,5R,6S)-Метил-6-(5-(4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)бутил)-2-(гидроксиметил)фенокси)-3,4,5-триацетокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоксилат
Охлаждали смесь вещества из примера 2.124.3 (2,0 г) в тетрагидрофуране (7,00 мл) и метаноле (7 мл) до 0°C и добавляли NaBH4 (0,052 г) одной порцией. Через 30 минут реакционную смесь разбавляли этилацетатом (150 мл) и водой (100 мл). Органический слой отделяли, промывали солевым раствором (100 мл), высушивали над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром в этилацетате (от 10% до 40%), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 756 (M+Na)+.
2.124.5 (2S,3S,4S,5R,6S)-Метил-6-(5-(4-(((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбониламино)бутил)-2-(((4-нитрофенокси)карбонилокси)метил)фенокси)-3,4,5-триацетокситетрагидро-2H-пиран-2-карбоксилат
В смесь вещества из примера 2.124.4 (3,0 г) и бис(4-нитрофенил)карбоната (2,488 г) в сухом ацетонитриле (70 мл) при 0°C добавляли N,N-диизопропилэтиламин (1,07 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 часов реакционную смесь концентрировали с получением остатка, который очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром в этилацетате (от 10% до 50%), с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 921 (M+Na)+.
2.124.6 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(3-(((2S,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
В холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.124.5 (44 мг) и вещества из примера 1.87.3 (47,4 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,026 мл). Реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. В реакционную смесь добавляли воду (1 мл) и LiOH H2O (20 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь подкисляли трифторуксусной кислотой, фильтровали и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1564,4 (M-H)-.
2.124.7 3-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}пропил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.5.4, путем замены вещества из примера 2.5.3 веществом из примера 2.124.6. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,06 (s, 2H), 8,99 (s, 1H), 8,34 (dd, 1H), 8,25-8,09 (m, 3H), 8,08-8,02 (m, 1H), 7,98 (d, 1H), 7,89 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,66 (q, 2H), 7,50-7,41 (m, 2H), 7,37-7,31 (m, 1H), 7,14 (t, 1H), 6,94 (s, 2H), 6,90 (s, 1H), 6,82 (d, 1H), 5,14-5,02 (m, 2H), 4,97 (d, 1H), 4,19 (d, 1H), 3,85 (dd, 3H), 3,37-3,23 (m, 9H), 3,14 (t, 1H), 3,04-2,92 (m, 4H), 2,19 (s, 3H), 1,96 (t, 2H), 1,73 (s, 2H), 1,55-0,87 (m, 21H), 0,81 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1564,4 (M-H)-.
2.125 Синтез N-{[(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона SV)
2.125.1 трет-Бутил-2-((3S,5S)-3-(дибензиламино)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
В смесь вещества из примера 2.119.10 (1,4 г) в N,N-диметилформамиде (5 мл) добавляли йодметан (0,8 мл). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли 95% гидрид натрия (80 мг). Через пять минут охлаждающую баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часа. Реакционную смесь гасили путем добавления воды (20 мл) и этилацетата (40 мл). Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали этилацетатом (10 мл). Объединенные органические слои высушивали с помощью сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием гептаном/этилацетатом, 80/20, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 439,2 (M+H)+.
2.125.2 трет-Бутил-2-((3S,5S)-3-амино-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
В смесь вещества из примера 2.125.1 (726 мг) в 2,2,2-трифторэтаноле (10 мл) добавляли гидроксид палладия на угле (20% по весу, 150 мг). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода (50 фунтов/кв. дюйм) при комнатной температуре в течение двух часов. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 259,0 (M+H)+.
2.125.3 4-(((3S,5S)-1-(2-(трет-Бутокси)-2-оксоэтил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-3-ил)амино)-4-оксобут-2-еновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.125.2 веществом из примера 2.119.12 в примере 2.119.13. MS (DCI) масса/электрон 374,0 (M+NH3+H)+.
2.125.4 трет-Бутил-2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.125.3 веществом из примера 2.119.13 в примере 2.119.14. MS (DCI) масса/электрон 356,0 (M+NH3+H)+.
2.125.5 2-((3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)уксусная кислота
В смесь вещества из примера 2.125.4 (120 мг) в дихлорметане (8 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в ацетонитриле (4 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой с помощью колонки Luna C18(2) AXIA, 250×50 мм, размер частиц 10 мкм, с применением градиента от 5 до 75% ацетонитрила в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты в воде, в течение 30 минут, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 300,0 (M+NH3+H)+.
2.125.6 N-{[(3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-5-(метоксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.125.5 веществом из примера 2.119.15 и вещества из примера 2.49.1 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,98 (s, 1H), 8,19 (br d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (m, 3H), 7,55 (d, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,37 (m, 2H), 7,32 (s, 1H), 7,27 (d, 2H), 7,08 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 5,00 (m, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,69 (t, 1H), 4,39 (br m, 1H), 4,28 (m, 1H), 4,20 (d, 1H), 3,88 (t, 3H), 3,81 (br m, 3H), 3,46 (m, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,26 (br m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,01 (m, 3H), 2,96 (m,1H), 2,65 (t, 2H), 2,36 (br m, 1H), 2,10 (s, 3H), 2,00 (m, 1H), 1,94 (m, 1H), 1,69 (br m, 1H), 1,59 (br m, 1H), 1,49-0,92 (m, 16H), 0,88 (d, 3H), 0,83 (m, 9H). MS (ESI) масса/электрон 1521,5 (M-H)-.
2.126 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона SY)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.123.21, путем замены 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетата 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноатом. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,87 (s, 1H), 8,09 (d, 1H), 8,05-7,95 (m, 1H), 7,77 (d, 2H), 7,59 (d, 1H), 7,55-7,31 (m, 7H), 7,28 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,97 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 5,08-4,84 (m, 5H), 4,36 (p, 1H), 3,78 (d, 2H), 3,54 (t, 1H), 3,48-3,28 (m, 9H), 3,21 (s, 2H), 3,12 (t, 2H), 3,02-2,84 (m, 4H), 2,81-2,54 (m, 6H), 2,19-1,84 (m, 9H), 1,63-1,39 (m, 6H), 1,35 (s, 1H), 1,29-0,86 (m, 18H), 0,80 (td, 15H). MS (ESI) масса/электрон 1568,4 (M-H)-.
2.127 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона TK)
2.127.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 1.2.9 (0,030 г), вещества из примера 2.124.5 (0,031 г) и 1H-бензо[d][1,2,3]триазол-1-ола гидрата (5 мг) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,017 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали, растворяли в тетрагидрофуране (0,4 мл) и метаноле (0,4 мл) и обрабатывали гидратом гидроксида лития (0,020 г) в виде смеси в воде (0,5 мл). Через 1 час реакционную смесь гасили 2,2,2-трифторуксусной кислотой (0,072 мл), разбавляли N,N-диметилформамидом:водой (1:1) (1 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой с применением системы Gilson PLC 2020, с градиентом элюирования ацетонитрилом/водой, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, объединяли и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1251,7 (M+H)+.
2.127.2 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В смесь вещества из примера 2.127.1 (0,027 г) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноата (6,32 мг) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,017 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили смесью 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,038 мл), воды (1,5 мл) и N,N-диметилформамида (0,5 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,84 (s, 1H), 8,03 (dd, 1H), 7,91-7,85 (m, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (dd, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,50-7,40 (m, 2H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,17 (dd, 1H), 6,99-6,90 (m, 4H), 6,83 (d, 1H), 5,15-5,04 (m, 2H), 5,05-4,96 (m, 1H), 4,95 (s, 2H), 3,91-3,83 (m, 4H), 3,81 (d, 3H), 3,58 (t, 2H), 3,42 (td, 3H), 3,33-3,24 (m, 5H), 3,00 (q, 4H), 2,68 (dt, 2H), 2,29 (t, 2H), 2,09 (d, 3H), 1,49 (d, 3H), 1,34 (td, 5H), 1,21 (dd, 5H), 1,15-1,07 (m, 2H), 1,07 (s, 4H), 0,95 (q, 1H), 0,82 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1402,1 (M+H)+.
2.128 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[4-({(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}амино)бутил]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота (синтона TR)
Перемешивали смесь вещества из примера 2.120.5 (0,035 г), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,015 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 5 минут. Смесь добавляли в смесь вещества из примера 2.127.1 (0,030 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,034 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 85%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 8,04-7,93 (m, 2H), 7,76 (d, 1H), 7,58 (dd, 1H), 7,53-7,36 (m, 3H), 7,37-7,25 (m, 3H), 7,15 (d, 1H), 6,97-6,88 (m, 4H), 6,87 (d, 2H), 6,85-6,77 (m, 1H), 6,76-6,69 (m, 2H), 5,13-4,96 (m, 3H), 4,92 (s, 2H), 3,95 (dd, 2H), 3,84 (d, 2H), 3,78 (s, 8H), 3,69-3,60 (m, 2H), 3,47 (d, 38H), 3,48-3,35 (m, 6H), 3,20 (s, 8H), 3,10 (dd, 2H), 2,98 (t, 2H), 2,69-2,60 (m, 2H), 2,50 (d, 1H), 2,06 (s, 3H), 1,49 (t, 2H), 1,35 (s, 4H), 1,21 (d, 4H), 1,05 (s, 6H), 0,79 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1991,6 (M-H)-.
2.129 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона TY)
Перемешивали смесь вещества из примера 2.120.5 (0,033 г), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,014 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 5 минут. Данную смесь добавляли в смесь вещества из примера 2.123.20 (0,032 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,033 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 85%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,90 (d, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,12 (m, 1), 8,01 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,53-7,40 (m, 4H), 7,43-7,30 (m, 4H), 7,27 (s, 1H), 7,18 (d, 2H), 7,06 (s, 1H), 7,00 (d, 2H), 6,97-6,91 (m, 2H), 6,87 (s, 2H), 6,76 (d, 2H), 5,02-4,92 (m, 4H), 4,77 (dd, 1H), 4,20 (t, 1H), 3,98 (dd, 2H), 3,86 (t, 2H), 3,78 (d, 2H), 3,70-3,65 (m, 2H), 3,54 (s, 2H), 3,55-3,45 (m, 38H), 3,45-3,37 (m, 2H), 3,35-3,25 (m, 2H), 3,21 (s, 4H), 3,17-3,06 (m, 2H), 2,99 (t, 2H), 2,73 (s, 2H), 2,61 (s, 4H), 2,07 (d, 4H), 2,01 (s, 2H), 1,94 (s, 2H), 1,54 (s, 2H), 1,27 (d, 4H), 1,22 (s, 2H), 1,11 (s, 6H), 1,08-0,99 (m, 2H), 0,90-0,79 (m, 6H), 0,76 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 705,6 (M-3H)3-.
2.130 Синтез 6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновой кислоты (синтона TX)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.123.20 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,85 (s, 1H), 8,17 (br d, 1H), 8,01 (d, 2H), 7,77 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,43 (m, 4H), 7,34 (m, 3H), 7,19 (d, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 4,99 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,63 (t, 1H), 4,36 (t, 1H), 4,19 (br m, 1H), 4,16 (d, 1H), 3,98 (d, 1H), 3,87 (br t, 2H), 3,81 (br d, 2H), 3,73 (brm, 1H), 3,63 (t, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,31 (t, 2H), 3,21 (br m, 2H), 3,17 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,92 (br m, 1H), 2,75 (m, 3H), 2,65 (br m, 3H), 2,35 (br m, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,98 (br m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,55 (br m, 1H), 1,34 (br m, 1H), 1,26 (br m, 6H), 1,09 (br m, 7H), 0,93 (br m, 1H), 0,87, 0,83, 0,79 (все d, всего 12H). MS (ESI) масса/электрон 1733,4 (M-H)-.
2.131 Синтез 6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-4-(4-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)бутил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновой кислоты (синтона TZ)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.127.1 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,02 (d, 1H), 7,82 (br t, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,53 (br d, 1H), 7,45 (ddd, 1H), 7,42 (d, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,33 (m, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,05 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,94 (s, 1H), 6,83 (d, 1H), 5,07 (br m, 2H), 5,00 (d, 1H), 4,95 (s, 2H), 4,69 (t, 1H), 4,04 (d, 2H), 3,87 (m, 3H), 3,82 (m, 3H), 3,73 (br m, 1H), 3,61 (m, 2H), 3,47 (br m, 3H), 3,40 (m, 4H), 3,29 (m, 4H), 3,06 (br m, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,73 (br m, 2H) 2,69 (br m, 2H), 2,52 (br t, 2H), 2,35 (br m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,81 (m, 1H), 1,53 (br m, 2H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (br m, 2H), 1,29-0,88 (br m, 10H), 0,82, 0,80 (оба s, в целом 6H). MS (ESI-) масса/электрон 1607,5 (M-H)-.
2.132 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона UA)
В смесь вещества из примера 2.127.1 (0,032 г) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,025 мл) и смесь охлаждали до 0°C. Добавляли одной порцией 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетат (8,86 мг) и перемешивали при 0°C в течение 45 минут. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,036 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,86 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 8,02 (dd, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,60 (dd, 1H), 7,51 (dd, 1H), 7,49-7,39 (m, 2H), 7,38-7,28 (m, 3H), 7,17 (dd, 1H), 7,06 (d, 2H), 6,98-6,89 (m, 2H), 6,83 (d, 1H), 5,13-5,03 (m, 2H), 5,04-4,96 (m, 1H), 4,94 (s, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,90-3,77 (m, 6H), 3,50 (s, 1H), 3,50-3,41 (m, 2H), 3,41 (dt, 3H), 3,28 (dt, 4H), 3,06-2,96 (m, 4H), 2,66 (dt, 2H), 2,51 (s, 2H), 2,08 (d, 3H), 1,52 (s, 2H), 1,42-1,32 (m, 4H), 1,23 (d, 4H), 1,11 (q, 2H), 1,06 (s, 4H), 0,81 (d, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1388,0 (M+H)+.
2.133 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона UZ)
2.133.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 2.124.5 (0,060 г), вещества из примера 1.43.7 (0,056 г) и 1H-бензо[d][1,2,3]триазол-1-ола (8 мг) в диметилсульфоксиде (0,5 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,056 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь обрабатывали смесью гидрата гидроксида лития (0,026 г) в воде (1 мл) и перемешивали в течение 30 минут. В реакционную смесь добавляли метанол (0,5 мл) и перемешивание продолжали в течение 30 минут. В реакционную смесь добавляли диэтиламин (0,033 мл) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь гасили 2,2,2-трифторуксусной кислотой (0,120 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1247,7 (M+H)+.
2.133.2 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
В смесь вещества из примера 2.133.1 (0,030 г) в N,N-диметилформамиде (0,400 мл) добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (0,023 мл) и смесь охлаждали до 0°C. Добавляли одной порцией 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетат (8,34 мг) и смесь перемешивали при 0°C в течение 30 минут. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,034 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 13,08 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,39-8,31 (m, 1H), 8,25-8,11 (m, 3H), 8,06 (d, 2H), 7,99 (d, 1H), 7,94 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,68 (t, 1H), 7,51-7,42 (m, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,35 (t, 1H), 7,22-7,13 (m, 1H), 7,06 (d, 2H), 6,93 (d, 1H), 6,83 (d, 1H), 5,15-5,00 (m, 2H), 4,99 (d, 1H), 3,97 (s, 2H), 3,86 (d, 3H), 3,42 (d, 4H), 3,29 (d, 5H), 3,03 (p, 2H), 2,72-2,62 (m, 2H), 2,51 (d, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,51 (q, 2H), 1,37 (q, 4H), 1,24 (d, 4H), 1,10 (s, 5H), 0,83 (d, 6H), 0,61 (s, 2H). MS (ESI) масса/электрон 1383,0 (M+H)+.
2.134 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[4-({(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[4-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]пропаноил}амино)бутил]фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона UK)
Перемешивали смесь вещества из примера 2.120.5 (0,028 г), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,013 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 5 минут. Смесь добавляли в смесь вещества из примера 2.133.1 (0,030 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,015 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,042 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 75%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,01 (s, 1H), 8,35 (dd, 1H), 8,27-8,13 (m, 3H), 8,06 (d, 1H), 8,00 (d, 1H), 7,94 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,73-7,64 (m, 1H), 7,53-7,43 (m, 2H), 7,42-7,32 (m, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,06 (s, 1H), 7,04-6,91 (m, 3H), 6,89 (d, 2H), 6,83 (d, 1H), 6,74 (d, 1H), 5,16-4,93 (m, 4H), 4,63 (dd, 2H), 3,96 (t, 2H), 3,86 (d, 4H), 3,66 (s, 4H), 3,55-3,46 (m, 36H), 3,45-3,35 (m, 8H), 3,35-3,24 (m, 6H), 3,21 (s, 2H), 3,11 (s, 2H), 2,99 (d, 2H), 2,83-2,59 (m, 3H), 2,52 (d, 2H), 2,21 (s, 3H), 1,57-0,86 (m, 14H), 0,83 (d, 4H). MS (ESI) масса/электрон 1986,6 (M-H)-.
2.135 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(4-карбоксибутил)фенил}-L-аланинамида (синтона UU)
2.135.1 Метил-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)-2-йодбензоат
Растворяли 3-йод-4-(метоксикарбонил)бензойную кислоту (9 г) в трет-бутаноле (100 мл) и добавляли дифенилфосфоразидат (7,6 мл) и триэтиламин (4,9 мл). Смесь нагревали до 83°C (внутренняя температура) в течение ночи. Смесь концентрировали до сухого состояния и очищали с помощью флэш-хроматографии, с градиентом элюирования от 0% до 20% этилацетата в гептане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 377,9 (M+H)+.
2.135.2 Метил-4-амино-2-йодбензоат
Перемешивали вещество из примера 2.135.1 (3 г) в дихлорметане (30 мл) и трифторуксусной кислоте (10 мл) при комнатной температуре в течение 1,5 часа. Реакционную смесь концентрировали до сухого состояния и разделяли между водой (регулировали pH до 1 с помощью хлористоводородной кислоты) и диэтиловым эфиром. Слои разделяли и водный слой промывали водной смесью на основе бикарбоната натрия, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали до сухого состояния. Полученное твердое вещество растирали с толуолом с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 278,0 (M+H)+.
2.135.3 Метил-4-((S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-йодбензоат
В колбу загружали вещество из примера 2.135.2 (337 мг) и вещество из примера 2.123.14 (500 мг). Добавляли этилацетат (18 мл) с последующим добавлением пиридина (0,296 мл). Полученную суспензию охлаждали на ледяной бане и добавляли по каплям 2,4,6-трипропил-1,3,5,2,4,6-триоксатрифосфинан-2,4,6-триоксид (50% смесь в этилацетате, 1,4 мл). Перемешивание продолжали при 0°C в течение 45 минут и реакционную смесь помещали в морозильную камеру при -20°C в течение ночи. Обеспечивали нагревание реакционной смеси до комнатной температуры и ее гасили водой. Слои разделяли и водный слой еще два раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные экстракты высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане и разбавляли диэтиловым эфиром с осаждением указанного в заголовке соединения, которое собирали путем фильтрации. MS (ESI) масса/электрон 669,7 (M+H)+.
2.135.4 (9H-Флуорен-9-ил)метил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Растворяли вещество из примера 2.54.3 (1 г) в тетрагидрофуране (15 мл) и смесь охлаждали до -15°C на бане со льдом и ацетоном. Затем добавляли по каплям алюмогидрид лития (1 н. в тетрагидрофуране, 3 мл), с поддержанием температуры ниже -10°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа и осторожно гасили 10% лимонной кислотой (25 мл). Слои разделяли и водный слой трижды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой и солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток адсорбировали на силикагеле и очищали с помощью флэш-хроматографии, с градиентом элюирования от 5% до 6% метанола в дихлорметане, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 664,1 (M+H)+.
2.135.5 Метил-5-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)фенил)пент-4-иноат
В перемешиваемую смесь метилпент-4-иноата (50 мг), вещества из примера 2.135.4 (180 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,15 мл) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (20 мг) и йодид меди (5 мг). Смесь три раза продували азотом и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой и солевым раствором. Водные слои обратно экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson, с элюированием от 20 до 90% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% об./об. трифторуксусной кислоты. Необходимые фракции объединяли и высушивали сублимацией с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 608,0 (M-H2O)+.
2.135.6 Метил-5-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(гидроксиметил)фенил)пентаноат
Перемешивали смесь вещества из примера 2.135.5 (0,084 г) и 10% Pd/C (0,02 г) в тетрагидрофуране (5 мл) при 20°C в атмосфере H2 с давлением 50 фунтов/кв. дюйм в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю и растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 612,0 (M-H2O)+.
2.135.7 Метил-5-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)пентаноат
Вещество из примера 2.135.7 получали путем замещения вещества из примера 2.135.7 веществом из примера 2.55.6 в примере 2.55.7. MS (ESI) масса/электрон 795,4 (M+H)+.
2.135.8 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(4-карбоксибутил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.135.8 получали путем замещения вещества из примера 2.135.7 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1271,4 (M-H)-.
2.135.9 N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(4-карбоксибутил)фенил}-L-аланинамид
Вещество из примера 2.135.9 получали путем замещения вещества из примера 2.135.8 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,88 (d, 1H), 8,3-8,2 (m, 2H), 8,01 (dd, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,59 (dd, 1H), 7,52 (dd, 1H), 7,47-7,29 (m, 8H), 7,23-7,18 (m, 1H), 7,05 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,00 (d, 2H), 4,94 (s, 2H), 4,37 (p, 1H), 3,51-3,28 (m, 5H), 3,26-3,14 (m, 2H), 2,99 (t, 2H), 2,65 (t, 2H), 2,57 (s, 2H), 2,26-2,17 (m, 3H), 2,07 (d, 3H), 1,94 (dd, 1H), 1,61-0,69 (m, 35H). MS (ESI) масса/электрон 1408,5 (M-H)+.
2.136 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона UV)
2.136.1 (3R,4S,5S,6S)-2-(5-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)проп-1-ин-1-ил)-2-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 2.136.1 получали путем замещения (9H-флуорен-9-ил)метилпроп-2-ин-1-илкарбамата веществом из примера 2.124.1A в примере 2.124.2. MS (ESI) масса/электрон 714,1 (M+H)+.
2.136.2 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропил)-2-формилфенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 2.136.2 получали путем замещения вещества из примера 2.136.1 веществом из примера 2.124.2 в примере 2.124.3. MS (ESI) масса/электрон 718,5 (M+H)+.
2.136.3 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропил)-2-(гидроксиметил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 2.136.3 получали путем замещения вещества из примера 2.136.2 веществом из примера 2.124.3 в примере 2.124.4. MS (ESI) масса/электрон 742,2 (M+Na)+.
2.136.4 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(5-(3-((((9H-Флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)пропил)-2-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенокси)-6-(метоксикарбонил)тетрагидро-2H-пиран-3,4,5-триилтриацетат
Вещество из примера 2.136.4 получали путем замещения вещества из примера 2.136.3 веществом из примера 2.124.4 в примере 2.124.5. MS (ESI) масса/электрон 885,2 (M+Na)+.
2.136.5 3-(1-((3-(2-((((4-(3-Аминопропил)-2-(((3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.136.5 получали путем замещения вещества из примера 2.136.4 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1237,7 (M+H)+.
2.136.6 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Вещество из примера 2.136.6 получали путем замещения вещества из примера 2.136.5 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,14 (d, 1H), 8,01 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,53-7,39 (m, 4H), 7,38-7,28 (m, 3H), 7,22-7,15 (m, 2H), 7,13-6,91 (m, 5H), 6,84 (d, 1H), 5,17-4,91 (m, 5H), 3,35-3,2 (m, 4H), 3,10-2,90 (m, 4H), 2,75-2,65 (m, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,65 (s, 2H), 1,39-0,71 (m, 21H). MS (ESI) масса/электрон 1372,3 (M-H)-.
2.137 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({[2-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)бензил]окси}карбонил)-(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона UZ)
2.137.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2R,3S,4R,5R,6R)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(3-((1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил)амино)-3-оксопропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.124.6, путем замены вещества из примера 1.87.3 веществом из примера 1.84. MS (ESI) масса/электрон 1319,4 (M-H)-.
2.137.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-{1-[(3-{2-[({[2-{[(2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]окси}-4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)бензил]окси}карбонил)-(3-{[1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-ил]амино}-3-оксопропил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.54, путем замены вещества из примера 2.49.1 веществом из примера 2.137.1. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 2H), 8,12 (s, 0H), 8,06 (s, 1H), 8,03-7,99 (m, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,72 (s, 0H), 7,60 (d, 1H), 7,52-7,39 (m, 3H), 7,34 (td, 2H), 7,26 (s, 1H), 7,21-7,11 (m, 2H), 7,05 (s, 2H), 6,93 (d, 2H), 6,83 (d, 1H), 5,09 (d, 2H), 5,00 (d, 1H), 4,94 (s, 2H), 4,12 (t, 1H), 3,97 (s, 2H), 3,87 (q, 4H), 3,79 (d, 2H), 3,29 (q, 2H), 3,12-2,93 (m, 5H), 2,47-2,23 (m, 1H), 2,07 (d, 3H), 1,50 (d, 3H), 1,36 (d, 5H), 1,31-0,85 (m, 9H), 0,81 (d, 7H). MS (ESI) масса/электрон 1568,4 (M-H)-.
2.138 Синтез 6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-4-(4-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)бутил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновой кислоты (синтона VB)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.133.1 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,99 (s, 1H), 8,34 (dd, 1H), 8,19 (d, 1H), 8,17 (d, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,93 (d, 1H), 7,80 (br t, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,67 (dd, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,45 (dd, 1H), 7,34 (dd, 1H), 7,14 (d, 1H), 7,03 (s, 2H), 6,93 (s, 1H), 6,82 (br d, 1H), 5,06 (br m, 2H), 4,98 (d, 1H), 4,67 (t, 1H), 4,02 (d, 2H), 3,85 (m, 3H), 3,71 (br m, 1H), 3,59 (t, 2H), 3,45 (br m, 3H), 3,41 (m, 4H), 3,27 (m, 4H), 3,03 (m, 2H), 2,70 (m, 2H) 2,65 (br m, 2H), 2,50 (br t, 2H), 2,31 (br m, 1H), 2,19 (s, 3H), 1,80 (m, 1H), 1,52 (br m, 2H), 1,38 (m, 2H), 1,35 (br m, 2H), 1,29-0,88 (br m, 10H), 0,82 (s, 3H), 0,80 (s, 3H). MS (ESI) масса/электрон 1602,4 (M-H)-.
2.139 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона VC)
2.139.1 3-(1-((3-(2-((((4-(3-Аминопропил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-(3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.139.1 получали путем замещения вещества из примера 2.136.4 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом и путем замещения вещества из примера 1.79.3 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1217,7 (M+H)+.
2.139.2 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Вещество из примера 2.139.1 получали путем замещения вещества из примера 2.139.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (s, 2H), 8,11 (t, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,62-7,56 (m, 1H), 7,50-7,37 (m, 3H), 7,37-7,29 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 7,04 (s, 2H), 6,96-6,88 (m, 2H), 6,82 (d, 1H), 5,06 (s, 2H), 4,98 (d, 1H), 4,92 (s, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,44-3,18 (m, 11H), 3,07-2,90 (m, 4H), 2,05 (s, 3H), 1,80 (s, 1H), 1,64 (p, 2H), 1,38-0,67 (m, 19H). (m, 21H). MS (ESI) масса/электрон 1352,5 (M-H)-.
2.140 Синтез N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)фенил}-L-аланинамида (синтона VS)
2.140.1 2-Йод-4-нитробензойная кислота
Добавляли 2-амино-4-нитробензойную кислоту (50 г) в смесь концентрированной H2SO4 (75 мл) и воды (750 мл) при 0°C и смесь перемешивали в течение 1 часа. В смесь добавляли по каплям смесь нитрита натрия (24,62 г) в воде (300 мл) при 0°C. Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 3 часов. В вышеуказанную смесь медленно добавляли смесь йодида натрия (65,8 г) в воде (300 мл). После завершения добавления полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов, затем при комнатной температуре в течение 16 часов и при 60°C в течение 2 часов. Полученную смесь охлаждали до комнатной температуры и разбавляли ледяной водой (300 мл). Твердое вещество собирали путем фильтрации, промывали водой (100 мл x 5) и высушивали на воздухе в течение 16 часов с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 291,9 (M-H)-.
2.140.2 Метил-2-йод-4-нитробензоат
Перемешивали смесь вещества из примера 2.140.1 (130 г) в смеси метанола (1000 мл) и серной кислоты (23,65 мл) при 85°C в течение 16 часов и концентрировали до сухого состояния. Остаток растирали с метанолом (100 мл) и суспензию перемешивали в течение 10 минут. Твердое вещество собирали путем фильтрации, промывали водой (200 мл x 3) и метанолом (20 мл) и высушивали на воздухе в течение 16 часов с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 308,0 (M+H)+.
2.140.3 Метил-4-амино-2-йодбензоат
В смесь хлорида аммония (122 г) и железа (38,2 г) в этаноле (1000 мл) и воде (100 мл) добавляли вещество из примера 2.140.2 (70 г) при комнатной температуре. Смесь перемешивали при 80°C в течение 4 часов и фильтровали с удалением нерастворимого материала. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в этилацетате (1000 мл) и промывали водой (500 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (1000 мл x 2). Объединенную органическую фазу промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 278,0 (M+H)+.
2.140.4 (4-Амино-2-йодфенил)метанол
В смесь вещества из примера 2.140.3 (40 г) в тетрагидрофуране (800 мл) добавляли по каплям 1 М гидрид диизобутилалюминия (505 мл) при -50°C. Смесь перемешивали при -50°C в течение 3 часов и охлаждали до -20°C. В смесь добавляли по каплям ледяную воду (180 мл) (с поддержанием температуры ниже 0°C). После добавления ледяной воды смесь перемешивали в течение 10 минут и фильтровали. Фильтрат концентрировали и остаток растворяли в этилацетате (800 мл) и воде (200 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (300 мл x 2). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 250,0 (M+H)+.
2.140.5 4-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-йоданилин
В смесь вещества из примера 2.140.4 (40 г) и имидазола (21,87 г) в дихлорметане (600 мл) и тетрагидрофуране (150 мл) добавляли трет-бутилдиметилхлорсилан (29,0 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и фильтровали с удалением твердого вещества. К фильтрату добавляли ледяную воду (50 мл). Смесь перемешивали в течение 10 минут и добавляли воду (100 мл). Смесь экстрагировали дихлорметаном (500 мл x 2). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 15/1 до 10/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон (LC-MS) (M+H)+.
2.140.6 (S)-трет-Бутил-(1-((4-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамат
В перемешанную смесь (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропановой кислоты (15,62 г) и вещества из примера 2.140.5 (30 г) в дихлорметане (600 мл) при 0°C добавляли по каплям POCl3 (15,39 мл). Смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов. В смесь осторожно добавляли по каплям ледяную воду (60 мл) (с поддержанием температуры ниже 5°C). Смесь перемешивали в течение 30 минут и концентрировали с удалением дихлорметана. Остаток суспендировали в этилацетате (500 мл) и воде (100 мл). Суспензию фильтровали. Органическую фазу промывали водой (200 мл x 2) и солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 533,0 (M-H) +.
2.140.7 (S)-трет-Бутил-(1-((4-(гидроксиметил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.140.6 (60 г) в тетрагидрофуране (600 мл) добавляли фторид тетрабутиламмония (28,2 г) в тетрагидрофуране (120 мл) при 0°C. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и фильтровали. К фильтрату добавляли воду (100 мл). Смесь перемешивали в течение 10 минут и затем концентрировали. Остаток разбавляли этилацетатом (800 мл) и водой (300 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (200 мл x 3). Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 3/1 до 1/1, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 443,0 (M+Na)+.
2.140.8 (S)-2-Амино-N-(4-(гидроксиметил)-3-йодфенил)пропанамид
Перемешивали смесь вещества из примера 2.140.7 (20 г) в смеси дихлорметана (80 мл) и трифторуксусной кислоты (40 мл) при комнатной температуре в течение 2 часов и концентрировали. Остаток растворяли в дихлорметане (80 мл) и добавляли триэтиламин (16,95 мл) для регулирования pH до 8. Указанное в заголовке соединение получали в виде свободного основания в дихлорметане, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. MS (LC-MS) масса/электрон 321,1 (M+H)+.
2.140.9 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Перемешивали смесь (S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутановой кислоты (6,79 г), триэтиламина (9,58 мл) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (5,26 г) в дихлорметане (250 мл) в течение 20 минут. Полученную смесь добавляли по каплям в смесь вещества из примера 2.140.8 (10 г) и 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорида (6,59 г) в дихлорметане (100 мл) при 0°C. После завершения добавления смесь перемешивали при 0°C в течение 2 часов. Добавляли ледяную воду (200 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 20 минут. Органическую фазу промывали насыщенной водной смесью на основе бикарбоната натрия (100 мл x 2), водой (100 мл x 2) и солевым раствором (100 мл), высушивали над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, от 3/1 до 1/1, с получением указанного в заголовке соединения. LC-MS масса/электрон 542,1 (M+Na)+.
2.140.10 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.140.9 (50 мг), 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ина (149 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорида (27,0 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (0,05 мл) в N,N-диметилформамиде (1 мл) добавляли йодид меди(I) (3,67 мг). Реакционную смесь продували потоком газообразного азота в течение 10 минут и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли диметилсульфоксидом, очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 1164,2 (M-H)-.
2.140.11 трет-Бутил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.140.10 (80 мг) и бис(4-нитрофенил)карбоната (31,3 мг) в N,N-диметилформамиде (0,2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,06 мл). Смесь перемешивали в течение 3 часов и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 35 до 75% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
2.140.12 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 1.2.9 (95 мг), вещества из примера 2.140.11 (148 мг) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (68,1 мг) в N,N-диметилформамиде (2,5 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (97 мкл). Смесь перемешивали в течение 3,5 часа и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 35 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения.
2.140.13 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Обрабатывали холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.140.12 (135 мг) в дихлорметане (4 мл) трифторуксусной кислотой (1 мл) в течение 5 часов. Смесь концентрировали и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 60% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 973,4 (M+2H)2+.
2.140.14 N-({(3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконт-52-ин-53-ил)фенил}-L-аланинамид
Обрабатывали смесь вещества из примера 2.119.15 (20,88 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (21,1 мг) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) N,N-диизопропилэтиламином (16,2 мкл) в течение 7 минут и медленно добавляли смесь вещества из примера 2.140.13 (60 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (32,3 мкл) в N,N-диметилформамиде (0,6 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 10,01 (d, 1H), 8,22 (d, 1H), 8,02 (t, 2H), 7,90-7,75 (m, 2H), 7,66-7,50 (m, 3H), 7,50-7,39 (m, 3H), 7,35 (q, 3H), 7,05 (s, 2H), 7,00 (d, 1H), 5,08 (d, 2H), 4,97 (s, 2H), 4,65 (t, 1H), 4,47-4,31 (m, 4H), 4,23-4,14 (m, 2H), 3,90-3,69 (m, 5H), 3,68-3,58 (m, 4H), 3,57-3,53 (m, 2H), 3,52-3,43 (m, 57H), 3,42-3,33 (m, 4H), 3,22 (s, 5H), 3,01 (t, 2H), 2,49 (p, 3H), 2,09 (d, 3H), 2,04-1,77 (m, 1H), 1,40-1,17 (m, 6H), 1,06 (dd, 6H), 0,97-0,63 (m, 11H). MS (ESI) масса/электрон 1153,3 (M+2H)2+.
2.141 Синтез N-({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамида (синтона VT)
2.141.1 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксадопентаконтан-52-ил)-4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Встряхивали смесь вещества из примера 2.140.10 (304 мг) и 10% Pd/C (90 мг, сухой) в тетрагидрофуране (20 мл) в сосуде для работы под давлением в течение 2 часов при давлении газообразного водорода 50 фунтов/кв. дюйм. Нерастворимый материал отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1168,3 (M-H)-.
2.141.2 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксадопентаконтан-52-ил)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.140.11, путем замены вещества из примера 2.140.10 веществом из примера 2.141.1.
2.141.3 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.140.12, путем замены вещества из примера 2.140.11 веществом из примера 2.141.2.
2.141.4 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.140.13, путем замены вещества из примера 2.140.12 веществом из примера 2.141.3. MS (ESI) масса/электрон 1948,8 (M-H)-.
2.141.5 N-({(3S,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамид
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.140.14 путем замены вещества из примера 2.140.13 веществом из примера 2.141.4. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,87 (s, 1H), 9,84 (s, 1H), 8,18 (d, 1H), 8,03 (dd, 2H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52 (d, 1H), 7,45 (ddd, 4H), 7,40-7,32 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 5,01 (d, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,64 (t, 1H), 4,38 (t, 1H), 4,24-4,12 (m, 2H), 4,00 (d, 1H), 3,88 (t, 2H), 3,78 (t, 3H), 3,64 (ddt, 2H), 3,49 (dd, 62H), 3,43-3,37 (m, 6H), 3,23 (s, 3H), 3,01 (t, 2H), 2,84-2,68 (m, 1,5H), 2,63 (dd, 4H), 2,36 (d, 0,5H), 2,08 (d, 3H), 1,74 (t, 2H), 1,25 (dt, 6H), 1,17-1,00 (m, 6H), 0,99-0,72 (m, 11H). MS (ESI) масса/электрон 1153,0 (M-2H)2-.
2.142 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона VY)
2.142.1 3-(1-((3-(2-((((4-(3-Аминопропил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.142.1 получали путем замещения вещества из примера 2.136.4 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом и путем замещения вещества из примера 1.85 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1217,3 (M+H)+.
2.142.2 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-(3-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}пропил)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Вещество из примера 2.142.2 получали путем замещения вещества из примера 2.142.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,14 (d, 1H), 8,03 (dt, 1H), 7,81-7,76 (m, 1H), 7,61 (dd, 1H), 7,53-7,41 (m, 3H), 7,38-7,32 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,06 (d, 2H), 6,97-6,92 (m, 2H), 6,85 (dd, 1H), 5,10 (q, 2H), 5,01 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,48-3,18 (m, 12H), 3,06 (q, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,77-0,66 (m, 16H). MS (ESI) масса/электрон 1352,5 (M-H)-.
2.143 Синтез 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексита (синтона WI)
2.143.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-((3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.77.2 веществом из примера 1.25 и вещества из примера 2.124.5 веществом из примера 2.97.7 в примере 2.97.8. MS (ESI) масса/электрон 1291 (M+H)+, 1289 (M-H)-.
2.143.2 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-арабиногексит
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.143.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,04 (d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,54-7,43 (m, 3H), 7,41-7,35 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,18 (m, 1H), 7,03 (s, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,86 (d, 1H), 5,18-5,05 (m, 3H), 5,03 (d, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,01 (s, 2H), 3,91 (d, 1H), 3,87 (t, 2H), 3,83 (m, 2H), 3,72 (s, 2H), 3,67 (m, 2H), 3,59 (dd, 2H), 3,50-3,27 (m, 16H), 3,14 (d, 2H), 3,04 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 1,68 (m, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,44-1,31 (m, 4H), 1,26-1,14 (m, 4H), 1,10 (m, 4H), 0,98 (q, 2H), 0,85 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1428 (M+H)+, 1426 (M-H)-.
2.144 Синтез 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентита (синтона WK)
2.144.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-((3S,4R)-3,4,5-тригидроксипентил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.80 веществом из примера 1.25 и вещества из примера 2.124.5 веществом из примера 2.97.7 в примере 2.97.8. MS (ESI) масса/электрон 1261 (M+H)+, 1259 (M-H)-.
2.144.2 1-{[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-({[4-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}бутил)-2-(бета-D-глюкопирануронозилокси)бензил]окси}карбонил)амино}-1,2-дидезокси-D-эритропентит
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.144.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,08 (t, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,62 (d, 1H), 7,53-7,42 (m, 3H), 7,38-7,33 (m, 2H), 7,20 (s, 1H), 7,17 (m, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,97-6,93 (m, 2H), 6,85 (d, 1H), 5,17-5,05 (m, 3H), 5,02 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 3,98 (s, 2H), 3,88 (m, 4H), 3,80 (m, 4H), 3,67 (m, 2H), 3,42 (m, 4H), 3,36-3,23 (m, 13H), 3,08-2,99 (m, 5H), 2,09 (s, 3H), 1,86 (m, 1H), 1,53 (m, 2H), 1,38 (m, 4H), 1,25 (m, 4H), 1,11 (m, 4H), 0,96 (m, 2H), 0,83 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1398 (M+H)+, 1396 (M-H)-.
2.145 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамид (синтона WP)
2.145.1 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(3-(((бензилокси)карбонил)амино)проп-1-ин-1-ил)-4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)-3-йодфенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата (0,5 г) в N,N-диметилформамиде (6 мл) добавляли бензилпроп-2-ин-1-илкарбамат (0,182 г), CuI (9,2 мг), бис(трифенилфосфин)палладия(II) дихлорид (35 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (1,0 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрировали под вакуумом. Остаток растворяли в этилацетате (300 мл), промывали водой, солевым раствором, высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. После выпаривания растворителя и очистки остатка с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 30% этилацетата в дихлорметане, получали указанное в заголовке соединение. MS (APCI) масса/электрон 581,2 (M-H)-.
2.145.2 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(3-аминопропил)-4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.145.1 (1,7 г) в этаноле (30 мл) добавляли 5% Pd/C (0,3 г) и циклогексен (в большом избытке). Реакционную смесь перемешивали при 100°C в течение 45 минут. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 451,1(M-H)-.
2.145.3 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил)-4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.145.2 (45 мг) в дихлорметане (4 мл) добавляли 2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-аль (79 мг)с последующим добавлением NaH(OAc)3 (63,5 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в N,N-диметилформамиде и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1212,1 (M-H)-.
2.145.4 трет-Бутил-((S)-1-(((S)-1-((3-(27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил)-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксопропан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
В смесь вещества из примера 2.145.3 (80 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (26 мг) с последующим добавлением N,N-диизопропиламина (0,012 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и очищали непосредственно с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1376,97 (M-H)-.
2.145.5 3-(1-((3-(2-((((2-(27-(2,5,8,11,14,17,20,23-Октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил)-4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил)пиколиновая кислота
В смесь вещества из примера 2.145.4 (30 мг) в N,N-диметилформамиде (4 мл) добавляли вещество из примера 1.43 (18,68 мг) с последующим добавлением гидрата 1-гидроксибензотриазола (3,4 мг) и N,N-диизопропиламина (3,84 мкл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. В смесь добавляли трифторуксусную кислоту (0,55 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1986,6 (M-H)-.
2.145.6 N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)нафталин-2-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамид
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.123.21, путем замены вещества из примера 2.123.20 веществом из примера 2.145.5. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 13,10 (s, 1H), 9,92 (s, 1H), 9,43 (s, 1H), 9,02 (s, 1H), 8,37 (dd, 1H), 8,30-8,14 (m, 5H), 8,07 (d, 1H), 8,02 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,74-7,68 (m, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,52-7,45 (m, 2H), 7,42-7,34 (m, 2H), 7,28 (d, 1H), 7,08 (s, 2H), 5,05 (d, 2H), 4,39 (t, 1H), 4,21 (dd, 1H), 4,12 (s, 2H), 3,88 (s, 2H), 3,49 (d, 55H), 3,34 (s, 200H), 3,23 (s, 5H), 3,13 (d, 4H), 2,79-2,65 (m, 5H), 2,23 (s, 3H), 1,94 (d, 8H), 1,47-0,94 (m, 15H), 0,92-0,76 (m, 12H).
2.146 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2S)-3-[3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона XD)
2.146.1 (S)-2-(((Бензилокси)карбонил)амино)-3-(3,4-дигидроксифенил)пропановая кислота
В смесь (S)-2-амино-3-(3,4-дигидроксифенил)пропановой кислоты (1,00 кг) и NaHCO3 (1,28 кг) в диоксане (5,00 л) и воде (5,00 л) добавляли по каплям бензилхлорформиат (1,04 к). Реакционную смесь перемешивали при 25°C в течение 12 часов. Реакционную смесь регулировали до pH=3,0~4,0 путем добавления 6 н. водного раствора HCl и экстрагировали этилацетатом (25 л). Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,73 (s, 1H), 7,54-7,26 (m, 8H), 6,64-6,45 (m, 3H), 4,98 (s, 2H), 4,49 (s, 1H), 2,87 (d, J=9,60 Гц, 1H), 2,68-2,62 (m, 1H).
2.146.2 (S)-Бензил-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-3-(3,4-дигидроксифенил)пропаноат
В смесь вещества из примера 2.146.1 (800,00 г) и Cs2CO3 (1,18 кг) добавляли бромметилбензол (259,67 г) при 20°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, и с помощью TLC установили завершение реакции. Остаток разбавляли с помощью H2O (5 л) и экстрагировали этилацетатом (три раза по 5 л). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (5 л), высушивали над Na2SO4 (150 г), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток дважды очищали с помощью колоночной хроматографии (SiO2, петролейный эфир/этилацетат=от 100:1 до 1:1) с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 2,77-3,02 (m, 2 H), 4,47 (br. s., 1 H), 4,61 (d, J=7,94 Гц, 1 H), 5,01-5,17 (m, 4 H), 5,35-5,47 (m, 1 H), 6,32 (br. s., 1 H), 6,38 (d, J=7,94 Гц, 1 H), 6,51 (s, 1 H), 6,65 (d, J=7,94 Гц, 1 H), 7,17-7,42 (m, 9 H).
2.146.3 (S)-Бензил-2-(((бензилокси)карбонил)амино)-3-(3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)пропаноат
В смесь K2CO3 (27,04 г) и KI (5,95 г) в N,N-диметилформамиде (150 мл) добавляли вещество из примера 2.146.2 (8,12 г) и 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил-4-метилбензолсульфонат (27,00 г) в диметилформамиде (150 мл). Смесь перемешивали при 75°C в течение 12 часов в атмосфере N2. Устанавливали два дополнительных сосуда, как описано выше. Все три реакционные смеси объединяли для очистки. Смесь выливали в водную смесь на основе NH4Cl (9 л) и экстрагировали этилацетатом (пять раз по 900 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (1500 мл), высушивали над Na2SO4 (150 г), фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного остатка. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии (SiO2, дихлорметан/метанол=от 100/1 до 20:1) с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 2,95-3,08 (m, 2 H), 3,38 (s, 6 H), 3,57-3,68 (m, 80 H), 3,78 (t, J=4,85 Гц, 2 H), 3,83 (t, J=5,29 Гц, 2 H), 4,01 (t, J=5,07 Гц, 2 H), 4,10 (t, J=5,07 Гц, 2 H), 4,58-4,70 (m, 1 H), 5,09 (s, 2 H), 5,14 (d, J=3,53 Гц, 2 H), 6,55 (d, J=8,38 Гц, 1 H), 6,62 (d, J=1,76 Гц, 1 H), 6,74 (d, J=7,94 Гц, 1 H), 7,27-7,49 (m, 10 H).
2.146.4 (S)-2-Амино-3-(3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.146.3 (16,50 г) в метаноле (200 мл) добавляли Pd/C (9,00 г) и смесь перемешивали при 50°C в атмосфере H2 (50 фунтов/кв. дюйм) в течение 16 часов. Подготавливали дополнительную реакционную смесь, как описано выше. С помощью LC/MS установили завершение реакции и обе реакционные смеси объединяли для очистки. Смесь фильтровали и концентрировали. Неочищенное указанное в заголовке соединение применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
2.146.5 (S)-3-(3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.146.4 (5,94 г) в H2O (60,00 мл) добавляли Na2CO3 (790,67 мг) и метил-2,5-диоксопиррол-1-карбоксилат (1,19 г). Смесь перемешивали при 25°C в течение 3 часов. Подготавливали четыре дополнительные реакционные смеси, как описано выше. Все пять реакционных смесей объединяли для очистки. Добавляли 4 М водный раствор HCl для регулирования pH до 2. Объединенную смесь очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой (среда трифторуксусной кислоты) с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ ppm 3,35-3,40 (m, 6 H), 3,51-3,58 (m, 4 H), 3,58-3,75 (m, 78 H), 3,81 (q, J=4,70 Гц, 4 H), 4,11 (dt, J=10,14, 5,07 Гц, 4 H), 4,91 (dd, J=11,47, 5,29 Гц, 1 H), 6,53-6,69 (m, 3 H), 6,71-6,89 (m, 2 H). MS (ESI) масса/электрон6 38,0 (M+H)+.
2.146.6 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2S)-3-[3,4-бис(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-илокси)фенил]-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота
Перемешивали смесь вещества из примера 2.146.5 (0,020 мл), O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (0,014 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,020 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) в течение 5 минут. Смесь добавляли в смесь вещества из примера 2.123.20 (0,042 г) и N-этил-N-изопропилпропан-2-амина (0,020 мл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл) и полученное перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционную смесь разбавляли смесью воды (1,5 мл), N,N-диметилформамида (0,5 мл) и 2,2,2-трифторуксусной кислоты (0,054 мл) и очищали с помощью препаративной HPLC с обращенной фазой на системе Gilson 2020 с применением градиента ацетонитрил/вода, от 5% до 85%. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,86 (s, 4H), 9,92 (s, 2H), 8,26 (d, 1H), 8,10 (s, 1H), 8,02 (dd, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,54-7,49 (m, 1H), 7,49-7,39 (m, 2H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,87 (s, 2H), 6,77 (d, 1H), 6,60-6,53 (m, 1H), 5,05-4,91 (m, 5H), 4,80 (dd, 2H), 4,37 (t, 2H), 4,21 (t, 2H), 3,97 (dt, 3H), 3,86 (t, 3H), 3,78 (d, 3H), 3,68 (dt, 4H), 3,65-3,28 (m, 102H), 3,20-3,08 (m, 2H), 2,99 (t, 2H), 2,92 (d, 2H), 2,68 (dd, 2H), 2,07 (d, 4H), 1,54 (s, 2H), 1,37-0,71 (m, 16H). MS (ESI) масса/электрон 2631,2 (M-H)-.
2.147 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамида (синтона XK)
2.147.1 Бензил-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаокса-35-азаоктатриаконтан-38-оат
В смесь 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-амина (1 г) в N,N-диметилформамиде (4 мл) и воде (3 мл) добавляли по каплям бензилакрилат (0,377 г). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи, очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 678,4 (M+H)+.
2.147.2 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-Ундекаокса-35-азаоктатриаконтан-38-овая кислота
Встряхивали вещество из примера 2.147.1 (220 мг) и 10% Pd/C (44 мг, сухой) в тетрагидрофуране (10 мл) в сосуде для работы под давлением в течение 1 часа при давлении газообразного водорода 50 фунтов/кв. дюйм. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток высушивали под глубоким вакуумом с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 588,3 (M+H)+.
2.147.3 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-35-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаокса-35-азаоктатриаконтан-38-оат
Обрабатывали холодную (0°C) смесь 2,5-диоксопирролидин-1-ил-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетата (566 мг), гидрата 1-гидроксибензотриазола (229 мг), 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (86 мг) и вещества из примера 2.147.2 (440 мг) в N,N-диметилформамиде (3 мл) N,N-диизопропилэтиламином (785 мкл) в течение 25 минут. Реакционную смесь разбавляли диметилсульфоксидом и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 5 до 55% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 822,3 (M+H)+.
2.147.4 N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-гептадекаоксатрипентаконтан-53-ил)фенил}-L-аланинамид
В холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.141.4 (28 мг), вещества из примера 2.147.3 (27,1 мг) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (6,6 мг) в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин-2 (20,1 мкл). Смесь перемешивали в течение 10 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 30 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,81 (s, 1H), 9,84 (s, 1H), 8,21-7,86 (m, 2H), 7,75 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,52-7,28 (m, 7H), 7,27-7,15 (m, 2H), 7,04 (d, 2H), 6,91 (d, 1H), 4,94 (d, 4H), 4,36 (dt, 3H), 4,19 (dt, 1H), 3,84 (t, 2H), 3,75 (d, 2H), 3,63 (d, 1H), 3,46 (dd, 104H), 3,36 (s, 2H), 3,19 (s, 5H), 2,97 (t, 2H), 2,57 (t, 5H), 2,42-2,26 (m, 1H), 2,03 (s, 7H), 2,00-1,83 (m, 1H), 1,70 (t, 2H), 1,38-0,96 (m, 13H), 0,96-0,69 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1327,7 (M-2H)2-.
2.148 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона XL)
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.147.4 путем замены вещества из примера 2.141.4 веществом из примера 2.112.2. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 9,96 (d, 1H), 8,18-7,85 (m, 3H), 7,75 (d, 1H), 7,64-7,37 (m, 7H), 7,32 (td, 2H), 7,28-7,20 (m, 3H), 7,04 (s, 2H), 6,92 (d, 1H), 5,17-4,79 (m, 4H), 4,59-4,31 (m, 3H), 4,21 (dt, 1H), 3,84 (t, 2H), 3,77 (d, 2H), 3,52 (s, 4H), 3,39 (d, 2H), 3,19 (s, 5H), 2,94 (dt, 4H), 2,60 (t, 3H), 2,43-2,27 (m, 1H), 2,05 (s, 4H), 1,60 (d, 2H), 1,44-0,57 (m, 22H). MS (ESI) масса/электрон 1964,8 (M-H)-.
2.149 Синтез N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамида (синтона YJ)
2.149.1 3-(1-((3-(2-((((2-(27-(2,5,8,11,14,17,20,23-Октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил)-4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.145.5, путем замены вещества из примера 1.43 веществом из примера 1.2.9. MS (ESI) масса/электрон 1991,4 (M-H)-.
2.149.2 N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-3-[27-(2,5,8,11,14,17,20,23-октаоксагексакозан-26-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23-октаокса-27-азатриаконтан-30-ил]фенил}-L-аланинамид
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.145, путем замены вещества из примера 2.145.5 веществом из примера 2.149.1. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,90 (s, 1H), 9,41 (s, 1H), 8,24 (d, 2H), 8,01 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,67-7,29 (m, 8H), 7,26 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 6,93 (d, 1H), 5,03 (d, 2H), 4,93 (s, 2H), 4,37 (t, 1H), 4,19 (dd, 1H), 4,11 (s, 2H), 3,86 (t, 2H), 3,79 (s, 2H), 3,70-3,26 (m, 226H), 3,21 (s, 6H), 3,11 (s, 5H), 2,99 (t, 2H), 2,66 (d, 4H), 2,08 (s, 3H), 1,89 (s, 8H), 1,44-0,90 (m, 14H), 0,89-0,68 (m, 11H).
2.150 Синтез N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона YQ)
2.150.1 3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пент-4-иноевая кислота
В смесь соли трифторуксусной кислоты и 3-аминопент-4-иноевой кислоты (1,9 г) в тетрагидрофуране (30 мл) добавляли метил-2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилат (1,946 г) с последующим быстрым добавлением N,N-диизопропилэтиламина (8,04 мл). Полученную смесь перемешивали при 60°C в течение 16 часов. Смесь концентрировали до сухого состояния. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 194 (M+H). 1H-ЯМР (диметилсульфоксид-d6, 400 МГц) δ 2,92-3,07 (m, 2H), 3,38 (d, 1H), 5,07-5,12 (m, 1H), 7,08 (s, 2H), 12,27 (bs, 0,6H).
2.150.2 3-(1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-Додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропановая кислота
К веществу из примера 2.150.1 (700 мг) в смеси трет-бутанол/H2O (2:1, 15 мл) добавляли 37-азидо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан (2123 мг). В смесь последовательно добавляли (R)-2-((S)-1,2-дигидроксиэтил)-4-гидрокси-5-оксо-2,5-дигидрофуран-3-олат натрия (71,8 мг) и сульфат меди(II) (28,9 мг). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 3,24 (s, 3H), 3,15-3,28 (m, 2H), 3,41-3,52 (m, 44H), 3,79 (t, 2H), 4,48 (t, 2H), 5,56-5,60 (m, 1H), 7,05 (s, 2H), 8,03 (s, 1H). MS (LC-MS) масса/электрон 779 (M+H)+.
2.150.3 N-{(3S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамид
В смесь O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (8,45 мг) и вещества из примера 2.150.2 (20 мг) в N,N-диметилформамиде (0,3 мл) при 0°C медленно добавляли N,N-диизопропилэтиламин (22,19 мкл) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 минуты. Добавляли холодную (0°C) смесь вещества из примера 2.112.2 (20 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (22 мкл) в N,N-диметилформамиде (0,4 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 10 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. (Абсолютная конфигурация в 3 положении задавалась произвольно). 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,95 (s, 1H), 8,07 (d, 3H), 8,04-7,96 (m, 2H), 7,77 (d, 1H), 7,64-7,53 (m, 3H), 7,50 (s, 1H), 7,48-7,39 (m, 2H), 7,34 (q, 2H), 7,30-7,23 (m, 3H), 6,98 (s, 2H), 6,93 (d, 1H), 5,61 (t, 1H), 4,96 (d, 4H), 4,54-4,27 (m, 3H), 4,14 (t, 1H), 3,86 (t, 2H), 3,77 (q, 4H), 3,43 (d, 71H), 3,21 (s, 6H), 3,00 (d, 5H), 2,61 (s, 2H), 2,07 (d, 3H), 1,92 (s, 1H), 1,60 (d, 2H), 1,47-0,86 (m, 10H), 0,85-0,67 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1010,6 (M-2H)2-.
2.151 Синтез N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона YR)
Вещество из примера 2.151 выделяли при получении вещества из примера 2.150.3. (Абсолютная конфигурация в 3 положении задавалась произвольно). 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,91 (s, 1H), 8,11 (dd, 2H), 8,04-7,99 (m, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,58 (t, 3H), 7,54-7,39 (m, 2H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,31-7,24 (m, 3H), 7,00 (s, 2H), 6,94 (d, 1H), 5,61 (dd, 1H), 5,08-4,79 (m, 4H), 4,40 (dt, 3H), 4,16 (s, 1H), 3,86 (t, 2H), 3,82-3,73 (m, 4H), 3,51-3,30 (m, 46H), 3,21 (s, 7H), 3,05-2,87 (m, 3H), 2,62 (t, 2H), 2,07 (d, 3H), 1,95 (s, 2H), 1,69 (s, 1H), 1,51-0,86 (m, 10H), 0,88-0,70 (m, 13H). MS (ESI) масса/электрон 1010,6 (M-2H)2-.
2.152 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона YS)
2.152.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)бензил)окси)карбонил)-((3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.77.2 веществом из примера 1.25 и вещества из примера 2.123.19 веществом из примера 2.97.7 в примере 2.97.8. MS (ESI) масса/электрон 1417 (M+H)+, 1415 (M-H)+.
2.152.2 6-[8-(1,3-Бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.152.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,85 (m, 1H), 8,18 (t, 2H), 7,96 (d, 1H), 7,73 (d, 1H), 7,55 (d, 1H), 7,46-7,25 (m, 8H), 7,21 (s, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 6,99 (d, 1H), 6,88 (d, 1H), 4,95 (bs, 2H), 4,88 (s, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,15 (t, 1H), 4,05 (s, 2H), 3,82 (t, 2H), 3,72 (m, 4H), 3,58-3,29 (m, 6H), 3,19 (m, 4H), 3,11-3,00 (m, 6H), 2,97 (t, 2H), 2,91 (t, 2H), 2,72 (m, 2H), 2,55 (m, 2H), 2,04 (s, 3H), 2,02-1,85 (m, 3H), 1,54 (m, 4H), 1,44 (s, 1H), 1,33 (bs, 1H), 1,22 (m, 6H), 1,04 (m, 6H), 0,86 (m, 2H), 0,77 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1554 (M+H)+, 1552 (M-H)-.
2.153 Синтез 6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)амино]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}бензил)окси]карбонил}-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона YY)
Растворяли вещество из примера 2.119.15 (11 мг) в N,N-диметилформамиде (0,1 мл). Добавляли 2-(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония гексафторфосфат(V) (11 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (7,4 мг). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем смесь добавляли в другую смесь вещества из примера 2.152.1 (34 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (16,3 мг) в N,N-диметилформамиде (0,2 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 60 минут при комнатной температуре и гасили трифторуксусной кислотой (36 мг). Смесь разбавляли водой (0,75 мл) и диметилсульфоксидом (0,75 мл) и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой с применением от 10 до 75% ацетонитрила в воде (вес./0,1% TFA) в течение 30 минут на Grace Reveleris, оснащенной колонкой Luna: C18(2), 100 A, 150×30 мм. Фракции продукта объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения в виде соли трифторуксусной кислоты. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,85 (m, 1H), 8,18 (d, 1H), 8,05 (d, 1H), 8,04 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,53-7,39 (m, 8H), 7,36 (q, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,07 (s, 1H), 6,96 (d, 1H),5,18 (bs, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,65 (t, 1H), 4,37 (t, 1H), 4,19 (t, 1H), 4,16 (s, 1H), 4,01 (d, 2H), 3,89 (t, 2H), 3,78 (m, 4H), 3,73 (m, 2H), 3,49-3,44 (m, 4H), 3,40-3,20 (m, 8H), 3,24 (m, 4H), 3,17-3,07 (m, 4H), 3,02 (t, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,76 (m, 4H), 2,62 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,99 (m, 2H), 1,86 (q, 1H), 1,62 (m, 4H), 1,38 (bs, 2H), 1,28 (m, 6H), 1,18-1,02 (m, 6H), 0,96 (m, 2H), 0,91-0,79 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1773 (M-H)-.
2.154 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона YT)
2.154.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)бензил)окси)карбонил)-(2-сульфоэтил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Охлаждали смесь вещества из примера 1.2.9 (200 мг), вещества из примера 2.123.19 (288 мг) и гидрата 1-гидроксибензотриазола (50,2 мг) в N,N-диметилформамиде (2 мл) на ледяной бане и добавляли N,N-диизопропилэтиламин (143 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часа и концентрировали. К остатку добавляли тетрагидрофуран (0,5 мл) и метанол (0,5 мл). Полученную смесь охлаждали на ледяной бане и медленно добавляли гидрат гидроксида лития (147 мг) в воде (2,5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа и охлаждали на ледяной бане. Добавляли по каплям трифторуксусную кислоту (361 мкл) до достижения pH 6. Смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 35 до 45% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 1375,5 (M-H)-.
2.154.2 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота
В смесь гидрата 1-гидроксибензотриазола (5,22 мг), вещества из примера 2.154.1 (23,5 мг) и вещества из примера 2.147.3 (24 мг) в N,N-диметилформамиде (1 мл) при 0°C медленно добавляли N,N-диизопропилэтиламин (23,84 мкл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 35 до 50% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 9,88 (s, 1H), 8,23-8,04 (m, 2H), 8,02 (dd, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,55-7,30 (m, 7H), 7,27 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,07 (d, 2H), 6,93 (d, 1H), 5,07-4,88 (m, 4H), 4,47-4,32 (m, 3H), 4,22 (dt, 1H), 3,97-3,73 (m, 4H), 3,62-3,45 (m, 35H), 3,31 (t, 3H), 3,21 (s, 3H), 3,06 (d, 2H), 2,83-2,54 (m, 5H), 2,47-2,29 (m, 1H), 2,13-1,84 (m, 5H), 1,52 (d, 1H), 1,43-0,69 (m, 26H). MS (ESI) масса/электрон 1043,0 (M-2H)2-.
2.155 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона YU)
2.155.1 3-(1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-Додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропановая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.150.2, путем замены вещества из примера 2.150.1 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пент-4-иноевой кислотой.
2.155.2 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.150.3, путем замены вещества из примера 2.150.2 и вещества из примера 2.112.2 веществом из примера 2.155.1 и веществом из примера 2.154.1 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,83 (s, 1H), 9,87 (d, 1H), 8,25-8,06 (m, 2H), 8,00 (d, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,54-7,28 (m, 6H), 7,25 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 6,98-6,85 (m, 3H), 5,09-4,89 (m, 4H), 4,76 (ddd, 1H), 4,36 (ddd, 3H), 4,17 (q, 1H), 3,84 (t, 2H), 3,76 (d, 2H), 3,72-3,66 (m, 2H), 3,49-3,44 (m, 37H), 3,20 (s, 5H), 3,01-2,82 (m, 3H), 2,13-1,81 (m, 5H), 1,52 (s, 1H), 1,39-0,50 (m, 23H). MS (ESI) масса/электрон 1069,7 (M+2H)2+.
2.156 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона YV)
Вещество из примера 2.156 выделяли в виде чистого диастереомера при получении вещества из примера 2.155.2. (Определение абсолютной конфигурации в 3 положении является произвольным). 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,82 (s, 1H), 9,85 (s, 1H), 8,08 (d, 2H), 8,03-7,95 (m, 2H), 7,75 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,51-7,29 (m, 6H), 7,24 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 6,95 (s, 2H), 6,91 (d, 1H), 5,59 (dd, 1H), 5,06-4,86 (m, 4H), 4,43 (dt, 2H), 4,32 (t, 1H), 4,11 (t, 1H), 3,84 (t, 2H), 3,75 (t, 3H), 3,55-3,41 (m, 43H), 3,41-3,36 (m, 2H), 3,19 (s, 5H), 3,10 (t, 1H), 3,03-2,86 (m, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,13-1,82 (m, 6H), 1,52 (s, 1H), 1,37-0,65 (m, 26H). MS (ESI) масса/электрон 1067,8 (M-2H)2-.
2.157 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона YW)
Вещество из примера 2.157 выделяли в виде чистого диастереомера при получении вещества из примера 2.155.2. (Определение абсолютной конфигурации в 3 положении является произвольным). 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,81 (s, 1H), 9,81 (s, 1H), 8,10 (d, 2H), 8,00 (d, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,75 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,51-7,28 (m, 6H), 7,24 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,91 (d, 1H), 5,59 (t, 1H), 5,06-4,87 (m, 4H), 4,46-4,26 (m, 2H), 4,12 (d, 1H), 3,84 (t, 2H), 3,75 (d, 3H), 3,46 (d, 27H), 3,40-3,36 (m, 2H), 3,19 (s, 5H), 3,01-2,85 (m, 3H), 2,60 (s, 3H), 1,99 (d, 4H), 1,52 (s, 1H), 1,35-0,65 (m, 23H). MS (ESI) масса/электрон 1067,8 (M-2H)2-.
2.158 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона ZB)
2.158.1 3-Азидопропан-1-сульфонат натрия
В смесь азида натрия (3,25 г) в воде (25 мл) добавляли 1,2-оксатиолан-2,2-диоксид (6,1 г) в ацетоне (25 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов и концентрировали до сухого состояния. Твердое вещество суспендировали в диэтиловом эфире (100 мл) и перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 1 часа. Суспензию охлаждали до комнатной температуры и твердое вещество собирали путем фильтрации, промывали ацетоном и диэтиловым эфиром и высушивали под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 164 (M-H)-.
2.158.2 Изопропил-3-азидопропан-1-сульфонат
Смесь вещества из примера 2.158.1 (6,8 г) в концентрированной HCl (90 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали до сухого состояния. Остаток растворяли в дихлорметане (350 мл) и в смесь добавляли триизопропоксиметан (42,0 мл) одной порцией. Полученную смесь перемешивали при 50°C в течение 2 часов и концентрировали до сухого состояния. Неочищенный остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом, 10/1, с получением указанного в заголовке соединения. 1H-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): 1,42 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 2,08-2,15 (m, 2H), 3,17 (t, 2H), 3,51 (t, 2H), 4,95-5,01 (m, 1H).
2.158.3 3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-(1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.150.1 (450 мг) в трет-бутаноле/H2O (2:1, 9 мл) добавляли вещество из примера 2.158.2 (483 мг) с последующим добавлением сульфата меди(II) (18,59 мг) и (R)-2-((S)-1,2-дигидроксиэтил)-4-гидрокси-5-оксо-2,5-дигидрофуран-3-олата натрия (46,2 мг). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и смесь концентрировали до сухого состояния. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H-ЯМР (диметилсульфоксид-d6, 400 МГц): 2,06-2,10 (m, 2H), 2,45-2,48 (m, 2H), 3,21-3,23 (m, 2H), 4,40-4,44 (m, 2H), 5,55-5,59 (m, 1H), 7,05 (s, 2H), 8,10 (s, 1H). MS (LCMS) масса/электрон 359 (M+H)+.
2.158.4 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.150.3, путем замены вещества из примера 2.150.2 и вещества из примера 2.112.2 веществом из примера 2.158.3 и веществом из примера 2.154.1 соответственно. Соединение выделяли в виде чистого диастереомера. (Абсолютная конфигурация в 3 положении задавалась произвольно). 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 10,14-9,66 (m, 1H), 8,07 (d, 2H), 8,04-7,96 (m, 2H), 7,75 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,52-7,29 (m, 7H), 7,26 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 6,92 (d, 3H), 5,58 (t, 1H), 5,09-4,84 (m, 4H), 4,35 (dt, 3H), 4,15-4,02 (m, 1H), 3,89-3,65 (m, 4H), 3,28 (d, 1H), 3,21 (dd, 2H), 3,14-3,02 (m, 2H), 3,01-2,86 (m, 4H), 2,62 (d, 3H), 2,37 (t, 2H), 2,29 (s, 0H), 2,02 (dt, 5H), 1,52 (s, 1H), 1,40-0,59 (m, 24H). MS (ESI) масса/электрон 1715,3 (M-H)-.
2.159 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-[(N-{(3R)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-[1-(3-сульфопропил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил]пропаноил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона ZC)
Вещество из примера 2.159 выделяли в виде чистого диастереомера при получении вещества из примера 2.158. (Абсолютная конфигурация в 3 положении задавалась произвольно). 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,97 (d, 1H), 8,21 (d, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,04-7,96 (m, 2H), 7,75 (d, 1H), 7,57 (d, 1H), 7,55-7,37 (m, 4H), 7,36-7,25 (m, 3H), 7,17 (d, 1H), 6,98 (s, 2H), 6,93 (d, 1H), 5,58 (t, 1H), 4,94 (d, 4H), 4,50-4,26 (m, 3H), 4,10 (s, 1H), 3,98-3,73 (m, 3H), 3,51 (d, 1H), 3,42 (s, 3H), 3,34-3,01 (m, 6H), 3,01-2,83 (m, 4H), 2,63 (d, 4H), 2,42 (d, 1H), 2,18-1,80 (m, 8H), 1,53 (s, 1H), 1,39-0,68 (m, 27H). MS (ESI) масса/электрон 1715,4 (M-H)-.
2.160 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-[2-(2-сульфоэтокси)этил]-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона ZJ)
2.160.1 4-((трет-Бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутил-2-(2-((трет-бутоксикарбонил)амино)этокси)этансульфонат
В смесь трет-бутил-(2-гидроксиэтил)карбамата (433 мг) в диметилсульфоксиде (0,9 мл) при 20°C добавляли 4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутилэтенсульфонат (500 мг) и K2CO3 (210 мг). Смесь нагревали до 60°C и перемешивали в течение 16 часов в закрытом сосуде. Смесь разбавляли этилацетатом, промывали водой и солевым раствором. Органический слой высушивали над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (от 10:1 до ~2:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 630,3 (M+Na) +.
2.160.2 4-((трет-Бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутил-2-(2-аминоэтокси)этансульфонат
В смесь вещества из примера 2.160.1 (1,5 г) в безводном дихлорметане (100 мл) при 20°C добавляли бромид цинка(II) (0,445 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. В вышеуказанную смесь добавляли дополнительное количество бромида цинка(II) (278 мг) и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительно 16 часов. Реакционную смесь гасили 1 М водной смесью на основе Na2CO3 (5 мл) и водный слой три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном/метанолом (10:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 508,2 (M+H)+.
2.160.3 трет-Бутил-3-((2-(2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)этил)амино)пропаноат
В смесь вещества из примера 2.160.2 (0,365 г) в N,N-диметилформамиде (5,5 мл) и воде (0,55 мл) добавляли трет-бутилакрилат (0,105 мл) и триэтиламин (10,02 мкл). Смесь перемешивали при 60°C в течение 30 часов. Смесь концентрировали. Остаток смешивали с 1 М водной смесью на основе Na2CO3 (5 мл). Водный слой три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием дихлорметаном/этилацетатом (3:1) и дихлорметаном/метанолом (10:1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 636,3 (M+H)+.
2.160.4 трет-Бутил-3-(N-(2-(2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)этил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо)пропаноат
В смесь вещества из примера 2.160.3 (557,5 мг), 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)уксусной кислоты (272 мг) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (667 мг) в N,N-диметилформамиде (1,75 мл) при 0°C добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,459 мл). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа. Реакционную смесь смешивали с насыщенной водной смесью на основе NH4Cl, экстрагировали этилацетатом и промывали солевым раствором. Органический слой высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, с элюированием петролейным эфиром/этилацетатом (2/1), с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 795,3 (M+Na) +.
2.160.5 3-(2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-(2-(2-сульфоэтокси)этил)ацетамидо)пропановая кислота
В смесь вещества из примера 2.160.4 (230 мг) в дихлорметане (4 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (3 мл). Смесь перемешивали при 20°C в течение 16 часов и концентрировали. Остаток очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 80% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (LC-MS) масса/электрон 379,0 (M+Na)+.
2.160.6 2-(2-(2-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-(3-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-3-оксопропил)ацетамидо)этокси)этан-1-сульфоновая кислота
Перемешивали смесь 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (16,43 мг), вещества из примера 2.160.5 (30 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорида (45,6 мг) в N,N-диметилформамиде в течение ночи. Реакционную смесь очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 2 до 30% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 475,9(M+H)+.
2.160.7 (6S)-2,6-Ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-[2-(2-сульфоэтокси)этил]-бета-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновая кислота
В смесь гидрата 1-гидроксибензотриазола (4,45 мг), вещества из примера 2.160.6 (8,97 мг) и вещества из примера 2.154.1 (20 мг) в N,N-диметилформамиде (0,8 мл) при 0°C добавляли N,N-диизопропилэтиламин (20 мкл, по каплям). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 30 до 55% ацетонитрила в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 12,87 (s, 1H), 9,88 (d, 1H), 8,28-8,10 (m, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,95 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,60 (d, 1H), 7,56-7,31 (m, 7H), 7,28 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,06 (d, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,06-4,90 (m, 4H), 4,38 (q, 3H), 4,28-4,11 (m, 1H), 3,87 (t, 2H), 3,79 (d, 2H), 3,71-3,49 (m, 5H), 3,21 (d, 2H), 3,12 (q, 2H), 2,97 (dt, 3H), 2,84-2,57 (m, 6H), 2,38 (dd, 1H), 2,13-1,86 (m, 5H), 1,55 (s, 1H), 1,39-0,64 (m, 25H). MS (ESI) масса/электрон 867,6 (M-2H)2-.
2.161 Синтез 6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-[1-({3-[2-({[(2-{2-[(2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидроксиоксан-2-ил]этил}-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[(2S)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-3-{4-[(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)окси]фенил}пропаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}фенил)метокси]карбонил}-[(3R,4S,5R)-3,4,5,6-тетрагидроксигексил]амино)этокси]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил}метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил]пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона ZE)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.120.5 веществом из примера 2.119.15 в примере 2.153. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 12,84 (bs, 2H), 9,92 (m, 1H), 8,26 (d, 1H), 8,13 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,52-7,41 (m, 4H), 7,36 (m, 3H), 7,27 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,02 (d, 2H), 6,95 (d, 1H), 6,89 (s, 2H), 6,78 (d, 2H), 5,02 (bs, 4H), 4,96 (s, 2H), 4,59 (dd, 1H), 4,38 (m, 2H), 4,21 (t, 1H), 3,99 (t, 2H), 3,88 (t, 2H), 3,79 (m, 2H), 3,69 (t, 2H), 3,64 (m, 1H), 3,57 (m, 4H), 3,53 (m, 4H), 3,50 (s, 40H), 3,42 (m, 2H), 3,38 (m, 1H), 3,30 (m, 2H), 3,23 (s, 6H), 3,20-3,08 (m, 6H), 3,01 (t, 2H), 2,94 (t, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,61 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 2,06-1,92 (m, 2H), 1,67-1,52 (m, 3H), 1,38 (m, 1H), 1,32-1,22 (m, 6H), 1,18-1,01 (m, 6H), 0,92 (m, 2H), 0,84 (m, 6H), 0,78 (m, 6H). MS (ESI) масса/электрон 1078 (M-2H)-.
2.162 Синтез 4-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]этокси}этокси)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона ZS)
2.162.1 3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-Аминоэтокси)этокси)-4-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.162.1 получали путем замещения вещества из примера 2.62.6 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом и путем замещения вещества из примера 1.85 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1261,4 (M-H)-.
2.162.2 4-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-Бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]этокси}этокси)фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Вещество из примера 2.162.2 получали путем замещения вещества из примера 2.162.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 8,18 (t, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,76 (d, 1H), 7,58 (dd, 1H), 7,50-7,29 (m, 6H), 7,26 (s, 1H), 7,17 (d, 1H), 7,03 (s, 2H), 6,92 (d, 1H), 6,64 (d, 1H), 6,57 (dd, 1H), 4,94 (d, 4H), 4,08 (hept, 2H), 4,00 (s, 2H), 3,92-3,68 (m, 8H), 3,51-3,13 (m, 12H), 2,98 (t, 2H), 2,06 (s, 3H), 1,65 (s, 1H), 1,43-0,66 (m, 18H). MS (ESI) масса/электрон 1398,5 (M-H)-.
2.163 Синтез 2,6-ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[(79S,82S)-74-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-82-метил-77,80,83-триоксо-79-(пропан-2-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-тетракозаокса-74,78,81-триазатриоктаконтан-83-ил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновой кислоты (синтона ZW)
2.163.1 Бензил-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-тетракозаокса-74-азагептагептаконтан-77-оат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.147.1, путем замены 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-амина 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-тетракозаоксатригептаконтан-73-амином. MS (ESI) масса/электрон 625,9 (M+2H)2+.
2.163.2 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-Тетракозаокса-74-азагептагептаконтан-77-овая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.147.2, путем замены вещества из примера 2.147.1 веществом из примера 2.163.1. MS (ESI) масса/электрон 1160,7 (M+H)+.
2.163.3 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-74-(2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44, 47,50,53, 56,59,62,65,68,71-тетракозаокса-74-азагептагептаконтан-77-оат
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.147.3, путем замены вещества из примера 2.147.2 веществом из примера 2.163.2. MS (ESI) масса/электрон 698,1(M+2H)2+.
2.163.4 2,6-Ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[(79S,82S)-74-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-82-метил-77,80,83-триоксо-79-(пропан-2-ил)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-тетракозаокса-74,78,81-триазатриоктаконтан-83-ил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали с применением процедуры в примере 2.147.4, путем замены вещества из примера 2.147.3 и вещества из примера 2.141.4 веществом из примера 2.163.3 и веществом из примера 2.154.1 соответственно. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,86 (s, 1H), 8,23-7,87 (m, 3H), 7,76 (d, 1H), 7,58 (dd, 1H), 7,53-7,25 (m, 7H), 7,19 (d, 1H), 7,05 (d, 2H), 6,92 (d, 1H), 5,07-4,85 (m, 4H), 4,49-4,30 (m, 3H), 4,20 (dt, 1H), 3,52 (d, 8H), 3,46-3,26 (m, 7H), 3,20 (s, 4H), 3,15-2,82 (m, 4H), 2,61 (s, 3H), 2,38 (dq, 1H), 2,11-1,82 (m, 5H), 1,53 (s, 1H), 1,39-0,66 (m, 24H). MS (ESI) масса/электрон 1326,9 (M-2H)2-.
2.164 Синтез 6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3-{2-[{[(4-{[(2S,5S)-2-[3-(карбамоиламино)пропил]-10-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-4,7-диоксо-5-(пропан-2-ил)-15-сульфо-13-окса-3,6,10-триазапентадеканан-1-оил]амино}фенил)метокси]карбонил}-(2-сульфоэтил)амино]этокси}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона ZX)
Перемешивали смесь 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (2,74 мг), 1-этил-3-[3-(диметиламино)пропил]карбодиимида гидрохлорида (4,26 мг) и вещества из примера 2.160.5 (9,01 мг) в N,N-диметилформамиде (0,3 мл) при комнатной температуре в течение ночи. Смесь охлаждали на ледяной бане. Добавляли гидрат 1-гидроксибензотриазола (3,65 мг) и смесь вещества из примера 2.112.2 (20 мг) и N,N-диизопропилэтиламина (22,19 мкл). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 10 минут и очищали с помощью HPLC с обращенной фазой, с элюированием от 30% до 55% ацетонитрила в 0,1% водном растворе трифторуксусной кислоты, с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,95 (d, 1H), 8,18-7,89 (m, 3H), 7,76 (d, 1H), 7,57 (d, 3H), 7,52-7,21 (m, 8H), 7,04 (d, 2H), 6,92 (d, 1H), 4,94 (d, 4H), 4,37 (d, 2H), 4,19 (d, 1H), 3,85 (t, 2H), 3,77 (d, 2H), 3,22 (d, 2H), 2,96 (dt, 4H), 2,73 (dt, 2H), 2,66-2,55 (m, 2H), 2,36 (s, 1H 2,06 (s, 3H), 1,91 (s, 1H), 1,61 (d, 3H), 1,47-0,86 (m, 11H), 0,80 (ddd, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1617,5 (M-H)-.
2.165 Данный абзац был намеренно оставлен незаполненным.
2.166 Синтез 6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновой кислоты (синтона AAA)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.167.1 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,86 (br d, 1H), 8,17 (br d, 1H), 8,04 (m, 2H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,51 (br d, 1H), 7,49-7,39 (m, 4H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,64 (t, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,16 (d, 1H), 4,01 (d, 1H), 3,88 (br t, 2H), 3,82 (br m, 3H), 3,75 (br m, 1H), 3,64 (t, 2H), 3,54 (d, 2H), 3,47 (m, 4H), 3,43 (br m, 4H), 3,23 (br m, 5H), 3,13 (t, 1H), 3,10 (br m, 1H), 3,01 (br m, 2H), 2,93 (t, 1H), 2,83-2,68 (m, 3H), 2,37 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,99 (br m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,55 (br m, 1H), 1,37 (br m, 1H), 1,28 (br m, 6H), 1,10 (br m, 7H), 0,93 (br m, 1H), 0,88-0,69 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1713,6 (M-H)-.
Альтернативный синтез 6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновой кислоты (синтона AAA)
2.166.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
В перемешиваемый раствор вещества из примера 1.85 (0,065 г), 1-гидроксибензотриазола (0,013 г) и N,N-диизопропилэтиламина (0,06 мл) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) добавляли вещество из примера 2.123.19 (0,085 г) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в смеси растворителей из метанола (0,5 мл) и тетрагидрофурана (0,5 мл) и добавляли моногидрат гидроксида лития (30 мг). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, после чего реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в метаноле/воде (1:1, 1 мл), содержащей 0,1 мл трифторуксусной кислоты. Образец очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (колонка Phenomenex® Luna® C18 250×50 мм, 100 мл/мин.), с элюированием от 20 до 100% ацетонитрила в воде, содержащей 0,01% трифторуксусной кислоты, в течение 40 минут. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/заряд 1357,5 (M+H)+.
2.166.2 6-(8-(Бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)-3-(1-((3-(2-((((2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)-4-((S)-2-((S)-2-(2-((3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)ацетамидо)-3-метилбутанамидо)пропанамидо)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)пиколиновая кислота (синтон AAA)
В раствор вещества из примера 2.119.15 (16 мг) в N,N-диметилформамиде (200 мкл) добавляли 1-[бис(диметиламино)метилен]-1H-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида гексафторфосфат (16 мг, HATU) и N,N-диизопропилэтиламин (17 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 минут и добавляли раствор вещества из примера 2.166.1 (48 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (20 мкл) в N,N-диметилформамиде (200 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение одного часа и разбавляли смесью N,N-диметилформамид/вода (1/1, 1,5 мл). Образец очищали с помощью HPLC с обращенной фазой (колонка Phenomenex® Luna® C18 250×50 мм, 100 мл/мин.), с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в воде, содержащей 0,01% трифторуксусной кислоты, в течение 40 минут. Фракции, содержащие продукт, лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,86 (br d, 1H), 8,17 (br d, 1H), 8,04 (m, 2H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,51 (br d, 1H), 7,49-7,39 (m, 4H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,21 (d, 1H), 7,07 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,00 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,64 (t, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,16 (d, 1H), 4,01 (d, 1H), 3,88 (br t, 2H), 3,82 (br m, 3H), 3,75 (br m, 1H), 3,64 (t, 2H), 3,54 (d, 2H), 3,47 (m, 4H), 3,43 (br m, 4H), 3,23 (br m, 5H), 3,13 (t, 1H), 3,10 (br m, 1H), 3,01 (br m, 2H), 2,93 (t, 1H), 2,83-2,68 (m, 3H), 2,37 (m, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,99 (br m, 2H), 1,85 (m, 1H), 1,55 (br m, 1H), 1,37 (br m, 1H), 1,28 (br m, 6H), 1,10 (br m, 7H), 0,93 (br m, 1H), 0,88-0,69 (m, 12H). MS (ESI) масса/заряд 1713,6 (M-H)-.
2.167 Синтез 2,6-ангидро-8-(2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}фенил)-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновой кислоты (синтона AAD)
2.167.1 3-(1-((3-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-Амино-3-метилбутанамидо)пропанамидо)-2-(2-((2S,3R,4R,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)этил)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.167.1 получали путем замещения вещества из примера 2.123.19 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом и путем замещения вещества из примера 1.85 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1355,5 (M-H)-.
2.167.2 2,6-Ангидро-8-(2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]-3-метилбутаноил}амино)пропаноил]амино}фенил)-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота
Вещество из примера 2.167.2 получали путем замещения вещества из примера 2.167.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 9,90 (d, 1H), 8,25 (m, 2H), 8,01 (d, 1H), 7,77 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,51-7,40 (m, 4H), 7,40-7,31 (m, 3H), 7,26 (s, 1H), 7,20 (d, 1H), 7,05 (s, 2H), 6,93 (d, 1H), 4,96 (d, 4H), 4,36 (t, 1H), 4,22-4,06 (m, 3H), 3,85 (t, 2H), 3,26-3,17 (m, 4H), 3,14-2,88 (m, 5H), 2,78-2,55 (m, 2H), 2,10-1,88 (m, 5H), 1,69-1,49 (m, 2H), 1,39-0,73 (m, 28H). MS (ESI) масса/электрон 1492,5 (M-H)-.
2.168 Синтез 2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{4-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]бутил}фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона AAE)
2.168.1 3-(1-((3-(2-((((4-(4-Аминобутил)-2-(((2S,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)бензил)окси)карбонил)-((S)-3,4-дигидроксибутил)амино)этокси)-5,7-диметиладамантан-1-ил)метил)-5-метил-1H-пиразол-4-ил)-6-(8-(бензо[d]тиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил)пиколиновая кислота
Вещество из примера 2.168.1 получали путем замещения вещества из примера 2.124.5 (9H-флуорен-9-ил)метил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбаматом и путем замещения вещества из примера 1.85 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.49.1. MS (ESI) масса/электрон 1229,5 (M-H)-.
2.168.2 2-{[({2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-Бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил)окси]метил}-5-{4-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетамидо]бутил}фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновая кислота
Вещество из примера 2.168.2 получали путем замещения вещества из примера 2.168.1 веществом из примера 2.49.1 в примере 2.54. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ 8,07 (s, 1H), 8,01 (dt, 1H), 7,77 (dt, 1H), 7,63-7,57 (m, 1H), 7,51-7,39 (m, 3H), 7,38-7,31 (m, 2H), 7,26 (s, 1H), 7,16 (d, 1H), 7,05 (s, 2H), 6,93 (d, 2H), 6,84-6,80 (m, 1H), 5,14-4,98 (m, 3H), 4,94 (s, 2H), 3,79 (d, 2H), 3,48-3,19 (m, 10H), 3,08-2,96 (m, 4H), 2,52 (s, 4H), 2,07 (s, 2H), 1,77-0,72 (m, 14H). MS (ESI) масса/электрон 1366,5 (M-H)-.
2.169 Синтез 6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-3-{1-[(3-{2-[{[(4-{[(2S)-5-(карбамоиламино)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пентаноил]амино}фенил)метокси]карбонил}-(2-сульфоэтил)амино]ацетамидо}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)метил]-5-метил-1H-пиразол-4-ил}пиридин-2-карбоновой кислоты (синтона ABG)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.54, путем замены вещества из примера 2.49.1 веществом из примера 1.89.12. 1H ЯМР (501 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,95 (d, 1H), 8,10-7,96 (m, 1H), 7,75 (t, 2H), 7,57 (dd, 3H), 7,51-7,18 (m, 8H), 6,95 (d, 3H), 6,92 (s, 0H), 5,03-4,86 (m, 4H), 4,36 (d, 1H), 3,85 (t, 2H), 3,78-3,67 (m, 4H), 3,42 (s, 2H), 3,33 (t, 2H), 3,04-2,86 (m, 4H), 2,63 (d, 2H), 2,13 (dd, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,98-1,87 (m, 0H), 1,71-1,23 (m, 10H), 1,24-0,85 (m, 6H), 0,78 (t, 11H). MS (ESI) масса/электрон 1463,5 (M-H)-.
2.170 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}сульфанил)этил]-(2-сульфоэтил)карбамоил}окси)метил]фенил}-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ABL)
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 1.90.11 веществом из примера 1.2.9 в примере 2.1. 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 10,0 (s, 1H), 8,08 (br s, 1H), 8,03 (d, 1H), 7,81 (br s, 1H) 7,78 (d, 1H), 7,60 (m, 3H) 7,52 (t, 1H), 7,47 (t, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,34 (d, 1H) 7,32 (s, 1H), 7,28 (d, 2H), 6,99 (s, 1H), 6,96 (d, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,96 (s, 2H), 4,39 (m, 1H), 4,18 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 3,82 (s, 1H), 3,77 (s, 1H), 3,46 (br m, 2H), 3,58 (t, 2H), 3,29 (v br m, 2H), 3,01 (br m, 3H), 2,95 (br m, 1H), 2,47 (m, 2H), 2,61 (br m, 2H) 2,16 (m, 1H), 2,10 (m, 4H), 1,96 (br m, 1H), 1,69 (v br m, 1H), 1,59 (v br m, 1H), 1,53-1,40 (m, 7H), 1,39-1,22 (m, 5H), 1,17 (m, 3H), 1,13-0,88 (m, 6H), 0,87-0,77 (m, 9H), 0,75 (s, 3H). MS (ESI) масса/электрон 1466,5 (M-H)-.
2.171 Синтез N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-[4-({[(3-{3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}пропил)-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)фенил]-N5-карбамоил-L-орнитинамида (синтона ABN)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.1, путем замены вещества из примера 1.2.9 веществом из примера 1.91.13. 1H ЯМР (501 МГц, DMSO-d6) δ ppm 12,83 (s, 1H), 9,96 (s, 1H), 8,03 (t, 2H), 7,77 (d, 2H), 7,64-7,52 (m, 3H), 7,45 (ddd, 3H), 7,34 (td, 2H), 7,29-7,21 (m, 3H), 7,03-6,91 (m, 3H), 4,95 (d, 4H), 4,37 (q, 1H), 4,17 (s, 1H), 3,86 (t, 2H), 3,45-3,29 (m, 4H), 3,10 (t, 2H), 2,95 (dt, 4H), 2,61 (q, 2H), 2,15 (td, 2H), 2,07 (s, 3H), 2,00-1,89 (m, 1H), 1,74-1,24 (m, 10H), 1,25-0,87 (m, 13H), 0,88-0,70 (m, 12H). MS (ESI) масса/электрон 1450,2 (M+H)+.
2.172 Синтез 2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-{4-[({(3S,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)амино]бутил}фенил-бета-D-глюкопиранозидуроновой кислоты (синтона AAF)
Указанное в заголовке соединение получали, как описано в примере 2.119.17, путем замены вещества из примера 2.168.1 веществом из примера 2.119.16. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 8,03 (d, 1H), 7,84 (br t, 1H), 7,78 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,50 (br d, 1H), 7,45 (dd, 1H), 7,43 (d, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,29 (s, 1H), 7,17 (br m, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,95 (m, 2H), 6,85 (d, 1H), 5,08 (s, 2H), 5,02 (d, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,70 (t, 1H), 4,06 (d, 2H), 3,88 (m, 4H), 3,81 (m, 2H), 3,73 (br m, 1H), 3,62 (m, 2H), 3,47 (br m, 4H), 3,40 (m, 4H), 3,35 (m, 2H), 3,29 (m, 4H), 3,07 (m, 2H), 3,00 (t, 2H), 2,73 (m, 2H), 2,54 (m, 2H), 2,36 (br m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,83 (m, 1H), 1,71 (br m, 1H), 1,55 (br m, 2H), 1,40 (br m, 5H), 1,24 (br m, 4H), 1,10 (br m, 5H), 0,94 (br m, 1H), 0,83, 0,81 (оба s, в целом 6H). MS (ESI) масса/электрон 1587,5 (M-H)-.
2.173 Синтез 2,6-ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[N-({(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-L-аланил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновой кислоты (синтона ABO)
2.173.1 (3R,6R,7aS)-6-Азидо-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.119.3 веществом из примера 2.119.2 в примере 2.119.4. MS (DCI) масса/электрон 262,0 (M+NH4)+.
2.173.2 (3R,6R,7aS)-6-Амино-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.1 веществом из примера 2.119.4 в примере 2.119.5. MS (DCI) масса/электрон 219,0 (M+H)+.
2.173.3 (3R,6R,7aS)-6-(Дибензиламино)-3-фенилтетрагидропирроло[1,2-c]оксазол-5(3H)-он
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.2 веществом из примера 2.119.5 в примере 2.119.6. MS (DCI) масса/электрон 399,1 (M+H)+.
2.173.4 (3R,5S)-3-(Дибензиламино)-5-(гидроксиметил)пирролидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.3 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.7, за исключением того, что реакционную смесь нагревали до 65°С в течение одного дня, а не 6 дней. MS (DCI) масса/электрон 311,1 (M+H)+.
2.173.5 (3R,5S)-5-(((трет-Бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-(дибензиламино)пирролидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.4 веществом из примера 2.119.7 в примере 2.119.8. Указанное в заголовке соединение переносили на следующую стадию без очистки. MS (DCI) масса/электрон 425,2 (M+H)+.
2.173.6 трет-Бутил-2-((3R,5S)-5-(((трет-бутилдиметилсилил)окси)метил)-3-(дибензиламино)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.5 веществом из примера 2.119.8 в примере 2.119.9. Указанное в заголовке соединение переносили на следующую стадию без очистки. MS (DCI) масса/электрон 539,3 (M+H)+.
2.173.7 трет-Бутил-2-((3R,5S)-3-(дибензиламино)-5-(гидроксиметил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.6 веществом из примера 2.119.9 в примере 2.119.10. MS (DCI) масса/электрон 425,2 (M+H)+.
2.173.8 трет-Бутил-2-((3R,5S)-5-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-3-(дибензиламино)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.7 веществом из примера 2.119.10 в примере 2.119.11.
2.173.9 трет-Бутил-(S)-2-(2-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-5-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.8 веществом из примера 2.119.11 в примере 2.119.12. MS (ESI) масса/электрон 691,1 (M+H)+.
2.173.10 4-(((3R,5S)-1-(2-(трет-Бутокси)-2-оксоэтил)-5-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-2-оксопирролидин-3-ил)амино)-4-оксобут-2-еновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.9 веществом из примера 2.119.12 в примере 2.119.13. MS (ESI) масса/электрон 789,0 (M+H)+.
2.173.11 трет-Бутил-2-((3R,5S)-5-((2-((4-((трет-бутилдифенилсилил)окси)-2,2-диметилбутокси)сульфонил)этокси)метил)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксопирролидин-1-ил)ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2173.10 веществом из примера 2.119.13 в примере 2.119.14.
2.173.12 2-((3R,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-((2-сульфоэтокси)метил)пирролидин-1-ил)уксусная кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.173.11 веществом из примера 2.119.14 в примере 2.119.15. MS (ESI) масса/электрон 377,0 (M+H)+.
2.173.13 2,6-Ангидро-8-[2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-{[N-({(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-[(2-сульфоэтокси)метил]пирролидин-1-ил}ацетил)-L-валил-L-аланил]амино}фенил]-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.123.20 веществом из примера 2.119.16 и вещества из примера 2.173.12 веществом из примера 2.119.15 в примере 2.119.17. 1H ЯМР (400 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,94 (d, 1H), 8,28 (br d, 1H), 8,01 (d, 2H), 7,77 (d, 1H), 7,59 (d, 1H), 7,53 (d, 1H), 7,43 (m, 4H), 7,34 (m, 3H), 7,19 (d, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,96 (d, 1H), 4,99 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,78 (t, 1H), 4,36 (t, 1H), 4,19 (br m, 1H), 4,16 (d, 1H), 3,98 (d, 1H), 3,87 (br t, 2H), 3,81 (br d, 2H), 3,73 (brm, 1H), 3,63 (t, 2H), 3,53 (m, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,31 (t, 2H), 3,21 (br m, 2H), 3,17 (m, 2H), 3,00 (m, 2H), 2,92 (br m, 1H), 2,75 (m, 3H), 2,65 (br m, 3H), 2,35 (br m, 1H), 2,16 (m, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,98 (br m, 2H), 1,55 (br m, 1H), 1,34 (br m, 1H), 1,26 (br m, 6H), 1,09 (br m, 7H), 0,93 (br m, 1H), 0,87, 0,83, 0,79 (все d, всего 12H). MS (ESI) масса/электрон 1733,3 (M-H)-.
2.174 Синтез 2,6-ангидро-8-{2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-[(N-{[(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-(41-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-тридекаокса-42-азатритетраконтан-43-ил)пирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновой кислоты (синтона ABM)
2.174.1 трет-Бутил-[(3R,5S)-5-{[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}-3-(дибензиламино)-2-оксопирролидин-1-ил]ацетат
В холодный (0°C) раствор вещества из примера 2.173.7 (1,6 г) в дихлорметане (15 мл) добавляли по каплям триэтиламин (0,70 мл) и метансульфонилхлорид (0,39 мл). Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Реакционную смесь гасили путем добавления насыщенного водного раствора бикарбоната натрия. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением промежуточного соединения, представляющего собой мезилат (1,9 г). Остаток растворяли в ацетонитриле (15 мл) и добавляли ди-трет-бутилиминодикарбоксилат (1,0 г) и карбонат цезия (2,4 г). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в атмосфере азота в течение одного дня. Реакционную смесь охлаждали и гасили путем добавления воды и диэтилового эфира. Слои разделяли и органический слой промывали солевым раствором. Объединенные водные слои обратно экстрагировали диэтиловым эфиром. Объединенные органические слои высушивали с помощью безводного сульфата натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле, с элюированием 20% этилацетатом в гептанах, с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 624,3 (M+H)+.
2.174.2 трет-Бутил-[(3R,5S)-3-амино-5-{[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}-2-оксопирролидин-1-ил]ацетат
В раствор вещества из примера 2.174.1 (1,0 г) в этилацетате (6 мл) и метаноле (18 мл) добавляли гидроксид палладия на угле (100 мг, 20% по весу). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода, подаваемого с помощью баллона, в течение одного дня. Реакционную смесь фильтровали через диатомовую землю, с элюированием этилацетатом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, растворяли в дихлорметане (10 мл) и фильтровали через фильтр канюли шприца Teflon, 40 микрон. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения. MS (DCI) масса/электрон 444,1 (M+H)+.
2.174.3 4-{[(3R,5S)-5-{[бис(трет-Бутоксикарбонил)амино]метил}-1-(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-2-оксопирролидин-3-ил]амино}-4-оксобут-2-еновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.174.2 веществом из примера 2.119.12 в примере 2.119.13. MS (ESI) масса/электрон 540,2 (M-H)-.
2.174.4 трет-Бутил-[(3R,5S)-5-{[бис(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксопирролидин-1-ил]ацетат
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.174.3 веществом из примера 2.119.13 в примере 2.119.14. MS (DCI) масса/электрон 541,1 (M+NH4)+.
2.174.5 2-((3R,5S)-5-(Аминометил)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксопирролидин-1-ил)уксусная кислота
В раствор вещества из примера 2.174.4 (284 мг) в дихлорметане (10 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в воде/ацетонитриле, 7/3 (5 мл), замораживали и лиофилизировали с получением указанного в заголовке соединения, которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. MS (ESI) масса/электрон 266,1 (M-H)-.
2.174.6 2-((3R,5S)-3-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-(41-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-тридекаокса-42-азатритетраконтан-43-ил)пирролидин-1-ил)уксусная кислота
В раствор 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-тридекаоксагентетраконтан-41-овой кислоты (160 мг) в N,N-диметилформамиде (1,0 мл) добавляли O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (85 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (130 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение трех минут при комнатной температуре и добавляли раствор вещества из примера 2.174.5 (70 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (130 мкл) в N,N-диметилформамиде (1,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа и разбавляли N,N-диметилформамидом/водой, 1/1 (3,5 мл). Раствор очищали с помощью HPLC с обращенной фазой на системе Gilson (колонка C18), с элюированием от 20 до 70% ацетонитрила в 0,1% водном растворе TFA, с получением указанного в заголовке соединения. MS (ESI) масса/электрон 880,4 (M-H)-.
2.174.7 2,6-Ангидро-8-{2-({[{2-[(3-{[4-(6-{8-[(1,3-бензотиазол-2-ил)карбамоил]-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил}-2-карбоксипиридин-3-ил)-5-метил-1H-пиразол-1-ил]метил}-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]декан-1-ил)окси]этил}-(2-сульфоэтил)карбамоил]окси}метил)-5-[(N-{[(3R,5S)-3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-2-оксо-5-(41-оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-тридекаокса-42-азатритетраконтан-43-ил)пирролидин-1-ил]ацетил}-L-валил-L-аланил)амино]фенил}-7,8-дидезокси-L-глицеро-L-гулооктоновая кислота
Указанное в заголовке соединение получали путем замещения вещества из примера 2.174.6 веществом из примера 2.119.15 и вещества из примера 2.123.20 веществом из примера 2.119.16 в примере 2.119.17 1H ЯМР (500 МГц, диметилсульфоксид-d6) δ ppm 9,93 (br d, 1H), 8,28 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,02 (br s, 1H), 7,91 (br d, 1H), 7,79 (d, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,51 (br d, 1H), 7,49-7,42 (m, 3H), 7,40 (br d, 1H), 7,36 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 5,00 (br d, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,70 (t, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,28 (m, 1H), 4,00 (dd, 2H), 3,88 (br m, 2H), 3,85 (br m, 1H), 3,80 (br m, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,50 (s, 44H), 3,48 (d, 4H), 3,43 (br m, 2H), 3,34 (br m, 2H), 3,23 (s, 3H), 3,21 (v br m, 2H), 3,14 (t, 2H), 3,10 (v br m, 1H), 3,00 (t, 2H), 2,94 (br m, 1H), 2,76 (v br m, 1H), 2,64 (v br m, 3H), 2,34 (br t, 2H), 2,32 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 2,09 (br d, 3H), 2,00 (br m, 1H), 1,56 (br m, 1H), 1,39-1,19 (br m, 8H), 1,19-0,92 (br m, 8H), 0,88 (br d, 3H), 0,87 (br m, 1H), 0,82 (br d, 6H), 0,79 (br s, 3H). MS (ESI) масса/электрон 1119,2 [(M-2H)/2]-.
2.175 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-ундекаоксатетратриаконтан-34-ил)-b-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона ABU)
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.147.4, путем замены вещества из примера 2.141.4 веществом из примера 2.167.1. MS (ESI) масса/электрон 1033,4 (M+2H)2+.
2.176 Синтез (6S)-2,6-ангидро-6-(2-{2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-бензотиазол-2-илкарбамоил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]-2-карбоксипиридин-3-ил}-5-метил-1H-пиразол-1-ил)метил]-5,7-диметилтрицикло[3.3.1.13,7]дец-1-ил}окси)этил]-[(3S)-3,4-дигидроксибутил]карбамоил}окси)метил]-5-({N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)ацетил]-N-[2-(2-сульфоэтокси)этил]-b-аланил-L-валил-L-аланил}амино)фенил}этил)-L-гулоновой кислоты (синтона ABV)
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры в примере 2.160.7, путем замены вещества из примера 2.154.1 веществом из примера 2.167.1. MS (ESI) масса/электрон 859,4 (M+2H)2+.
Пример 3. Получение моноклональных антител мыши к B7-H3 с помощью технологии мышиной гибридомы
Количество специфических к B7-H3 антител повышали с использованием технологии мышиных гибридом. В частности, в качестве иммуногенов использовали линию клеток фибробластов мыши (3T12), экспрессирующую полноразмерный B7-H3 человека, а также рекомбинантные слитые белки Fc человека или мыши B7-H3-ECD, последовательности которых приведены в таблице 1. Линии клеток человека, экспрессирующие B7-H3 человека, применяли для определения титров антисывороток и для скрининга антиген-специфических антител. Линии клеток до иммунизации подвергали воздействию приблизительно 3000 мбэр гамма-излучения. Два различных штамма мышей иммунизировали в область скакательного сустава дозами, содержащими 5×106 клеток/мышь/инъекция или 10 мкг белка/мышь/инъекция в присутствии адъюванта Gerbu MM (Cooper-Casey Corporation, Вэлли Сентер, Калифорния, США), в рамках как первичной, так и бустерной иммунизации. Для усиления иммунного ответа на B7-H3 мышам проводили дополнительную бустерную иммунизацию смесью белков B7-H3-ECD человека и мыши, меченных Fc человека, в рамках процедур заключительной бустерной иммунизации. Вкратце, антигены получали в PBS следующим образом: 200×106 клеток/мл или 400 мкг/мл белка. Рассчитанный объем антигена переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку и затем добавляли равный объем Gerbu MM. Раствор осторожно перемешивали вихревым способом в течение 1 минуты. Затем раствор адъювант-антиген набирали в надлежащий шприц для инъекции животного. Всего 25 мкл смеси инъецировали в область скакательного сустава каждой лапы мыши. Каждое животное подвергали бустерной иммунизации 3 раза до определения титра в сыворотке для групп. Всех животных подвергали 2 дополнительным бустерным иммунизациям равной смесью белка B7-H3-ECD мыши-Fc человека и белка B7-H3-ECD человека-Fc человека в адъюванте перед слиянием.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности рекомбинантных белков, применяемых для иммунизации или скрининга
Слияние с образованием гибридом и скрининг
Клетки из линии клеток миеломы мыши (NS-0, ECACC № 85110503) культивировали до достижения стадии лог-фазы непосредственно перед слиянием. У каждой мыши удаляли подколенные и паховые лимфатические узлы, и в стерильных условиях получали суспензии отдельных клеток. Лимфоциты сливали с клетками миеломы (E. Harlow, D. Lane, Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998); Kohler G. and Milstein C., "Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256:495-497 (1975); техническое руководство к прибору BTX Harvard ECM 2001 (Холлистон, Массачусетс, США). Слитые гибридные клетки распределяли в 96-луночные планшеты в среду DMEM/10% FBS/HAT. Образцы супернатанта культур выживших колоний гибридом подвергали клеточному скринингу с использованием линий клеток человека, экспрессирующих рекомбинантный B7-H3 человека. Вкратце, линию клеток человека, экспрессирующую B7-H3 человека, размораживали и непосредственно распределяли в 96-луночные планшеты (черные с прозрачным дном для получения изображения) при 50000 клеток/лунка в питательную среду и инкубировали в течение 2 дней при 37°C до достижения 50% конфлюентности. Супернатанты гибридомы (50 мкл/лунка) переносили в соответствующие планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Среду удаляли из каждой лунки и антитело козы к IgG-AF488 мыши (Invitrogen, № A11029, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США) использовали для выявления с использованием InCell Analyzer 2000 (GE). Хиты размножали, и связывание подтверждали посредством FACS с использованием другой линии клеток человека или линии клеток мыши, экспрессирующих B7-H3 человека, и антитела козы к IgG-PE мыши для выявления. Видовую специфичность определяли с использованием формата ELISA в соответствии со следующей процедурой. Планшеты для ELISA покрывали белками B7-H3-ECD человека-Fc человека, his-меченым белком B7-H3-ECD яванского макака, белками Bc-B-H3-ECD мыши-Fc человека в течение ночи при комнатной температуре. Планшеты промывали и в каждую лунку добавляли микропробу гибридомы (100 мкл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали, для выявления использовали антитело осла к IgG-HRP мыши (Jackson Immunochemicals, № 115-035-071, Вест Гроув, Пенсильвания, США), и OD связывания наблюдали при 650 нм.
Отобранные хиты субклонировали с помощью MoFlo (Beckman, Индианаполис, Индиана, США) путем помещения одной клетки на лунку в 96-луночные культуральные планшеты для обеспечения клональности линии клеток. Полученные в результате колонии подвергали скринингу на специфичность с использованием FACS с использованием линий клеток фибробластов 3Т12 мыши, экспрессирующих B7-H3 человека, B7-H3 яванского макака или B7-H3 мыши. Изотип каждого моноклонального антитела определяли с использованием набора для моноклонального изотипирования мыши (Roche, № 11-493-027-001, Индианаполис, Индиана, США). Клоны гибридомы, вырабатывающие антитела, которые проявляли высокую активность специфического связывания в отношении антигена B7-H3 человека и макака-крабоеда, субклонировали и очищали (таблица 2).
Таблица 2. Перечень антител к B7-H3, полученных с использованием технологии гибридомы мыши
яванского макака
Пример 4. Определение характеристик in vitro моноклональных антител к B7-H3 мыши.
Аффинность связывания очищенных моноклональных антител к B7-H3 определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса. В таблице 3 приведены константы скорости ассоциации (ka), константы скорости диссоциации (kd) и константы равновесной диссоциации (KD) для серии связывания моноклональных антител (mAb) к B7-H3, полученных из гибридомы мыши, с растворимыми ECD B7-H3 человека и B7-H3 макака-крабоеда. Кинетику связывания получали из измерений SPR с использованием прибора Biacore T200 и подхода захвата mAb (как описано в материалах и способах ниже).
Таблица 3. Кинетика Biacore связывания антител к B7-H3 из гибридомы мыши с B7-H3 человека и макака-крабоеда.
Название антитела
Mс)
Парные анализы связывания, выполненные на приборах Biacore T200 SPR, использовали для определения относительной группировки эпитопов для мышиных mAb к B7-H3, как описано в приведенных ниже способах. На фигуре 1 показано изображение группировки эпитопов, которое описывает относительное разнообразие эпитопов B7-H3 человека и перекрывание для ряда mAb к B7-H3, идентифицированных в данном документе. Эпитопные группы представлены в виде отдельных овалов, некоторые из которых перекрываются друг с другом. Антитела из различных эпитопных групп могут одновременно связываться с B7-H3 и, вероятно, связываться с различными эпитопами, в то время как антитела в пределах данной группы эпитопов не могут одновременно связываться с B7-H3 и, вероятно, связываться с перекрывающимися эпитопами. Информацию о группировке получали из анализа одновременного связывания, как описано в материалах и способах. Группировки Ab3, Ab4, Ab5, Ab11, Ab12 и Ab8 были неоднозначными.
Материалы и способы. Кинетика связывания
Прибор Biacore T200 SPR использовали для измерения кинетики связывания B7-H3 человека (аналита) с различными mAb (лигандами). Формат анализа представлял собой захват на основе Fc с помощью иммобилизованного антитела к (Fc) мыши (Pierce 31170) или иммобилизованного антитела к (Fc) человека (Pierce 31125). Стандартный протокол сочетания с амином использовали для иммобилизации реагентов захвата посредством первичных аминов на поверхности карбоксиметил (СМ)-декстрановых сенсорных чипов СМ5 (Biacore); захватывающие антитела связывали до уровня примерно 5000 RU. Для измерений кинетики связывания использовали буфер для анализа HBS-EP+ (Biacore): 10 мM Hepes, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% полисорбат 20. Во время анализа все измерения сверяли только с поверхностью захвата. Каждый цикл анализа состоял из следующих стадий: 1) Захват лиганда до примерно 50 RU; 2) Инъекция аналита как на эталонную, так и на и тестируемую поверхность, 240 мкл при 80 мкл/мин., после чего контролировали диссоциацию в течение 900 секунд при 80 мкл/мин.; 3) Восстановление поверхности захвата глицином с низким pH. Для определений кинетики инъекции аналита представляли собой 3-точечные, 9-кратные серии разведений 900 нМ, 100 нМ и 11,11 нМ, инъекции только буфера включали для вторичного сравнения с эталоном. Данные обрабатывали и подгоняли к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation для определения кинетических констант скорости связывания ka (скорость ассоциации) и kd (скорость диссоциации) и равновесной константы диссоциации (аффинность, KD).
Материалы и способы. Группировка эпитопов
Парные анализы связывания, выполненные на приборах Biacore T200 SPR, использовали для определения относительной группировки эпитопов для ряда mAb к B7-H3. Формат анализа представлял собой захват на основе Fc с помощью иммобилизованного антитела к (Fc) мыши (Pierce 31170) или иммобилизованного антитела к (Fc) человека (Pierce 31125). Стандартный протокол сочетания с амином использовали для иммобилизации реагентов захвата посредством первичных аминов на поверхности карбоксиметил (СМ)-декстрановых сенсорных чипов СМ5 (Biacore); захватывающие антитела связывали до уровня примерно 2000 RU. Измерения относительно группировки эпитопов проводили при 12°C (низкая температура обеспечивает информацию о группировке высокой скорости диссоциации mAb), буфером для анализа являлся HBS-EP+ (Biacore): 10 мM Hepes, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% полисорбат 20. Каждый цикл анализа состоял из следующих стадий в системе с четырьмя проточными ячейками: 1) отдельные тестовые mAb захватывали в проточные ячейки 2, 3 и 4 (проточная ячейка 1 была контрольной, тестовые mAb отсутствовали); 2) все 4 проточных ячейки затем блокировали посредством инъекции mAb изотипического контроля или коктейля изотипического mAb в концентрации 50 мкг/мл; 3) все 4 проточные ячейки затем инъецировали только с помощью антигена или только буфера (только буфер предназначен для двойного сравнения с эталоном, осуществляли для каждой пары mAb отдельно); 4) все 4 проточные ячейки затем инъецировали 2-ым тестируемым mAb при 10 мкг/мл; 5) все 4 проточные клетки затем восстанавливали глицином, рН 1,5. Анализ проводили для каждой тестируемой пары mAb в обратном направлении. Одновременное связывание оценивали, изучая соотношение ответа 2-го тестируемого mAb к ответу Ag (RUmAb2/RUAg); если это соотношение было равно 0,2 или больше, взаимодействие оценивали как одновременное связывание. Из этих данных анализа парного связывания вручную была построена диаграмма стиля "Венна" для отображения относительных группировок эпитопов.
Пример 5. Получение химерных антител к hB7-H3
После идентификации антител к B7-H3 из гибридомы мыши определяли вариабельные области тяжелой и легкой цепи (VH и VL), соответствующие секретируемым антителам, из клеток с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR). Вариабельные области мыши экспрессировались в клетках-хозяевах млекопитающих в контексте константной области человеческого иммуноглобулина для обеспечения химерных антител. В приведенной ниже таблице 4 представлены аминокислотные последовательности вариабельной области для химеризованных мышиных гибридом.
Таблица 4. Аминокислотные последовательности вариабельной области антител к B7-H3 из мышиных гибридом
из SEQ ID NO:1
из SEQ ID NO:1
из SEQ ID NO:1
из SEQ ID NO:5
из SEQ ID NO:5
из SEQ ID NO:5
из SEQ ID NO:9
из SEQ ID NO:9
из SEQ ID NO:9
из SEQ ID NO:13
из SEQ ID NO:13
из SEQ ID NO:13
из SEQ ID NO:16
из SEQ ID NO:16
из SEQ ID NO:16
из SEQ ID NO:20
из SEQ ID NO:20
из SEQ ID NO:20
из SEQ ID NO:24
из SEQ ID NO:24
из SEQ ID NO:24
из SEQ ID NO:28
из SEQ ID NO:28
из SEQ ID NO:28
из SEQ ID NO:32
из SEQ ID NO:32
из SEQ ID NO:32
из SEQ ID NO:36
из SEQ ID NO:36
из SEQ ID NO:36
из SEQ ID NO:40
из SEQ ID NO:40
из SEQ ID NO:40
из SEQ ID NO:44
из SEQ ID NO:44
из SEQ ID NO:44
из SEQ ID NO:48
из SEQ ID NO:48
из SEQ ID NO:48
из SEQ ID NO:52
из SEQ ID NO:52
из SEQ ID NO:52
из SEQ ID NO:56
из SEQ ID NO:56
из SEQ ID NO:56
из SEQ ID NO:60
из SEQ ID NO:60
из SEQ ID NO:60
из SEQ ID NO:64
из SEQ ID NO:64
из SEQ ID NO:64
из SEQ ID NO:68
из SEQ ID NO:68
из SEQ ID NO:68
из SEQ ID NO:72
из SEQ ID NO:72
из SEQ ID NO:72
из SEQ ID NO:76
из SEQ ID NO:76
из SEQ ID NO:76
из SEQ ID NO:80
из SEQ ID NO:80
из SEQ ID NO:80
из SEQ ID NO:84
из SEQ ID NO:84
из SEQ ID NO:84
из SEQ ID NO:87
из SEQ ID NO:87
из SEQ ID NO:87
из SEQ ID NO:91
из SEQ ID NO:91
из SEQ ID NO:91
из SEQ ID NO:95
из SEQ ID NO:95
из SEQ ID NO:95
из SEQ ID NO:98
из SEQ ID NO:98
из SEQ ID NO:98
из SEQ ID NO:101
из SEQ ID NO:101
из SEQ ID NO:101
из SEQ ID NO:105
из SEQ ID NO:105
из SEQ ID NO:105
из SEQ ID NO:108
из SEQ ID NO:108
из SEQ ID NO:108
из SEQ ID NO:112
из SEQ ID NO:112
из SEQ ID NO:112
Пример 6. Определение характеристик связывания химерных антител к B7-H3
Для получения очищенных химерных антител векторы экспрессии временно трансфицировали в суспензионные клеточные культуры HEK293 6E в соотношении от 60% до 40% от легкой до тяжелой цепи конструкции. Для трансфекции клеток использовали 1 мг/мл полиэтиленимина (PEI) или 2,6 мкл/мл экспифектамина. Супернатанты клеток собирали через пять дней во встряхиваемые колбы, центрифугировали до осаждения клеток и фильтровали с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм для отделения IgG от загрязняющих веществ в культуре. Содержащие антитела супернатанты очищали на Akta Pure с использованием белка A mAb SelectSure. Колонки уравновешивали в PBS, pH 7,4, затем через колонку пропускали супернатанты и проводили промывание с помощью PBS, pH 7,4. IgG элюировали 0,1 М уксусной кислотой рН 3,5 и собирали в несколько аликвот. Фракции, содержащие IgG, объединяли и подвергали диализу в PBS в течение ночи при 4°С. Химерные антитела к B7-H3, которые успешно экспрессировались, охарактеризовали по способности связываться со сверхэкспрессирующей B7-H3 линией клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI-H1650 (ATCC® № CRL-5883) с помощью FACS с использованием описанных ниже способов. В таблице 5 обобщены связывающие свойства химерных антител к B7-H3.
ТАБЛИЦА 5. Определение характеристик in vitro химерных антител к B7-H3
Способы FACS связывания
Клетки собирали из колб при конфлюентности примерно 80% с использованием буфера для диссоциации клеток Gibco®. Клетки промывали один раз в PBS/1% FBS (буфер FACS), затем ресуспендировали при 2,5×106 клеток/мл в буфере FACS. 100 мкл клеток/лунка добавляли в круглодонный 96-луночный планшет. 10 мкл 10-кратной концентрации mAb/ADC (конечные концентрации указаны на фигурах). Лунки дважды промывали буфером для FACS и ресуспендировали в 50 мкл вторичного Ab (AlexaFluor 488), разбавленного в буфере для FACS. Планшеты инкубировали при 4°C в течение одного часа, дважды промывали буфером для FACS. Клетки ресуспендировали в 100 мкл PBS/1% формальдегида и анализировали на проточном цитометре LSRII от Becton Dickinson. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа проточной цитометрии WinList.
Пример 7. Определение характеристик химерных антител к B7-H3 как конъюгатов лекарственного средства и антитела, ингибирующих Bcl-xL
Девять химерных антител к B7-H3 конъюгировали с синтоном CZ, ингибирующим Bcl-xL, (Bcl-xLi) (пример 2.1), с применением способа A конъюгации, описанного ниже. Полученные ADC (антитела к B7-H3, конъюгированные с синтоном CZ) исследовали в отношении связывания с B7-H3 человека на клеточной поверхности с помощью FACS (как описано в примере 6) и в отношении клеточной цитотоксичности в линиях клеток, экспрессирующих B7-H3. Из девяти антител три антитела (chAb2, chAb6 и chAb16) выпали в осадок после конъюгации с синтоном CZ и показали слабую цитотоксичность в клетках, экспрессирующих B7-H3 человека. В таблице 6 представлена активность связывания клеточной поверхности и цитотоксичность ADC с химерным антителом к B7-H3 в отношении раковых клеток молочной железы HCC38, экспрессирующих B7-H3 человека.
ТАБЛИЦА 6. Определение характеристик in vitro конъюгатов CZ с химерным антителом к B7-H3
B7-H3 человека EC50 нM
Материалы и способы. Конъюгация Bcl-xL-ингибиторных ADC
ADC синтезировали с использованием одного из способов, описанных ниже. Иллюстративные ADC синтезировали с применением одного из девяти иллюстративных способов, описанных ниже.
Способ A. Раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) Bond-Breaker ™ (10 мМ, 0,017 мл) добавляли к раствору антитела (10 мг/мл, 1 мл), предварительно нагретому до 37°С. Реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 1 часа. Раствор восстановленного антитела добавляли к раствору синтона (3,3 мМ, 0,160 мл в DMSO) и осторожно перемешивали в течение 30 минут. Реакционный раствор загружали в колонку для обессоливания (PD10, промытую 3х фосфатно-солевым буфером Дульбекко [DPBS] перед применением), а затем вносили DPBS (3 мл). Очищенный раствор ADC фильтровали через шприц-фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,2 микрона и диаметром 13 мм и хранили при 4°C.
Способ B. Раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) Bond-Breaker™ (10 мМ, 0,017 мл) добавляли к раствору антитела (10 мг/мл, 1 мл), предварительно нагретому до 37°С. Реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 1 часа. Раствор восстановленного антитела регулировали до рН=8 путем добавления борного буфера (0,05 мл, 0,5 М, рН 8), добавляли к раствору синтона (3,3 мМ, 0,160 мл в DMSO) и осторожно перемешивали в течение 4 часов. Реакционный раствор загружали в колонку для обессоливания (PD 10, промытую 3х PBS перед применением), затем DPBS (1,6 мл) и элюировали дополнительным количеством DPBS (3 мл). Очищенный раствор ADC фильтровали через шприц-фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,2 микрона и диаметром 13 мм и хранили при 4°C.
Способ C. Процедуры конъюгации проводили с использованием роботизированной системы для манипуляций с жидкостями PerkinElmer Janus (часть AJL8M01), оснащенной одноразовой головкой ModuLar Dispense Technology (MDT) I235 c 96 наконечниками (часть 70243540), содержащей захватную руку (часть 7400358), и пипетирующей рукой Varispan с 8 наконечниками (часть 7002357), на удлиненной платформе. Система PerkinElmer Janus находилась под управлением программного обеспечения WinPREP версии 4.8.3.315.
Фильтровальный планшет Pall Filter 5052 предварительно увлажняли 100 мкл 1x DPBS с использованием MDT. К фильтровальному планшету применяли вакуум в течение 10 секунд с последующей вентиляцией в течение 5 секунд для удаления DPBS с фильтровального планшета. 50% взвесь смолы на основе белка A (GE MabSelect Sure) в DPBS выливали в резервуар с 8 лунками, снабженный магнитным шариком, и смолу перемешивали путем пропускания движущегося магнита под пластиной резервуара. Руку Varispan на 8 наконечников, оснащенную проводящими наконечниками объемом 1 мл, использовали для аспирации смолы (250 мкл) и переноса на 96-луночный фильтровальный планшет. Вакуум применяли в течение 2 циклов для удаления большей части буфера. С использованием MDT аспирировали 150 мкл 1xPBS и распределяли в 96-луночный фильтровальный планшет, содержащий смолу. Применяли вакуум, удаляя буфер из смолы. Цикл прополаскивание/применение вакуума повторяли 3 раза. 96-луночный планшет для сбора материала с объемом лунки 2 мл устанавливали на платформу Janus, и с помощью MDT переносили 450 мкл 5x DPBS в планшет для сбора материала для дальнейшего применения. Восстановленное антитело (2 мг) в виде раствора в (200 мкл) DPBS получали, как описано выше для условий A, и предварительно загружали в 96-луночный планшет. Растворы восстановленного антитела переносили в лунки фильтровального планшета, содержащие смолу, и смесь смешивали с помощью MDT путем повторных операций аспирации/распределения объема 100 мкл в лунке в течение 45 секунд на цикл. Цикл аспирации/разливания повторяли в общей сложности 5 раз в течение 5 минут. Вакуум применяли к фильтровальному планшету в течение 2 циклов, удаляя таким образом избыток антитела. Наконечники MDT промывали водой в течение 5 циклов (200 мкл, общий объем 1 мл). С помощью MDT аспирировали и распределяли 150 мкл DPBS в лунки фильтровального планшета, содержащие связанное со смолой антитело, и в течение двух циклов применяли вакуум. Последовательность операций промывания и применения вакуума повторяли еще два раза. После последнего цикла применения вакуума 100 мкл 1x DPBS распределяли в лунки, содержащие связанное со смолой антитело. Затем с помощью MDT собирали 30 мкл каждого из 3,3 мМ растворов синтонов в диметилсульфоксиде, внесенных в планшет в 96-луночном формате, и распределяли в фильтровальный планшет, содержащий связанное со смолой антитело в DPBS. Конъюгационную смесь, содержащуюся в лунках, перемешивали с помощью MDT путем повторных операций аспирации/распределения объема 100 мкл в лунке в течение 45 секунд на цикл. Последовательность операций аспирации/разливания повторяли в общей сложности 5 раз в течение 5 минут. Вакуум применяли в течение 2 циклов для удаления избытка синтона в отходы. Наконечники MDT промывали водой в течение 5 циклов (200 мкл, общий объем 1 мл). С помощью MDT аспирировали и распределяли DPBS (150 мкл) в конъюгационную смесь, и в течение двух циклов применяли вакуум. Последовательность операций промывания и применения вакуума повторяли еще два раза. Затем захватное устройство MDT перемещало фильтровальный планшет и изолирующий воротник на станцию ожидания. С помощью MDT помещали планшет для сбора материала с объемом лунки 2 мл, содержащий 450 мкл 10x DPBS, внутрь вакуумной камеры. С помощью MDT повторно собирали вакуумную камеру, размещая там фильтровальный планшет и изолирующий воротник. Наконечники MDT промывали водой в течение 5 циклов (200 мкл, общий объем 1 мл). С помощью MDT аспирировали и распределяли 100 мкл элюирующего буфера IgG 3,75 (Pierce) в конъюгационную смесь. Через одну минуту в течение 2 циклов создавали вакуум, и элюент захватывали в принимающем планшете, содержащем 450 мкл 5х DPBS. Последовательность операций аспирации/разливания повторяли еще 3 раза для получения образцов ADC с концентрациями в диапазоне 1,5-2,5 мг/мл при рН 7,4 в DPBS.
Способ D. Процедуры конъюгации проводили с использованием роботизированной системы для манипуляций с жидкостями PerkinElmer Janus (часть AJL8M01), оснащенной одноразовой головкой ModuLar Dispense Technology (MDT) I235 c 96 наконечниками (часть 70243540), содержащей захватную руку (часть 7400358), и пипетирующей рукой Varispan с 8 наконечниками (часть 7002357), на удлиненной платформе. Система PerkinElmer Janus находилась под управлением программного обеспечения WinPREP версии 4.8.3.315.
Фильтровальный планшет Pall Filter 5052 предварительно увлажняли 100 мкл 1x DPBS с использованием MDT. К фильтровальному планшету применяли вакуум в течение 10 секунд с последующей вентиляцией в течение 5 секунд для удаления DPBS с фильтровального планшета. 50% взвесь смолы на основе белка A (GE MabSelect Sure) в DPBS выливали в резервуар с 8 лунками, снабженный магнитным шариком, и смолу перемешивали путем пропускания движущегося магнита под пластиной резервуара. Руку Varispan на 8 наконечников, оснащенную проводящими наконечниками объемом 1 мл, использовали для аспирации смолы (250 мкл) и переноса на 96-луночный фильтровальный планшет. К фильтровальному планшету применяли вакуум в течение 2 циклов для удаления большей части буфера. C помощью MDT аспирировали и разливали 150 мкл DPBS в лунки фильтровального планшета, содержащие смолу. Последовательность операций промывания и применения вакуума повторяли еще два раза. 96-луночный планшет для сбора материала с объемом лунки 2 мл устанавливали на платформу Janus, и с помощью MDT переносили 450 мкл 5x DPBS в планшет для сбора материала для дальнейшего применения. Восстановленное антитело (2 мг) в виде раствора в (200 мкл) DPBS получали, как описано выше для условий A, и распределяли в 96-луночный планшет. Затем с помощью MDT собирали 30 мкл каждого из 3,3 мМ растворов синтонов в диметилсульфоксиде, внесенных в планшет в 96-луночном формате, и распределяли в планшет, загруженный восстановленным антителом в DPBS. Смесь смешивали с помощью MDT путем двукратно повторяемых операций аспирации/распределения объема 100 мкл в лунке. Через пять минут конъюгационную реакционную смесь (230 мкл) переносили на 96-луночный фильтровальный планшет, содержащий смолу. Конъюгационную смесь и смолу, содержащиеся в лунках, перемешивали с помощью MDT путем повторных операций аспирации/разливания объема 100 мкл в лунке в течение 45 секунд на цикл. Последовательность операций аспирации/разливания повторяли в общей сложности 5 раз в течение 5 минут. Вакуум применяли в течение 2 циклов для удаления избытка синтона и белка в отходы. Наконечники MDT прополаскивали водой в течение 5 циклов (200 мкл, общий объем 1 мл). С помощью MDT аспирировали и распределяли DPBS (150 мкл) в конъюгационную смесь, и в течение двух циклов применяли вакуум. Последовательность операций промывания и применения вакуума повторяли еще два раза. Затем захватное устройство MDT перемещало фильтровальный планшет и изолирующий воротник на станцию ожидания. С помощью MDT помещали планшет для сбора материала с объемом лунки 2 мл, содержащий 450 мкл 10x DPBS, внутрь вакуумной камеры. С помощью MDT повторно собирали вакуумную камеру, размещая там фильтровальный планшет и изолирующий воротник. Наконечники MDT промывали водой в течение 5 циклов (200 мкл, общий объем 1 мл). С помощью MDT аспирировали и разливали 100 мкл элюирующего буфера для IgG 3,75 (P) в конъюгационную смесь. Через одну минуту применяли вакуум в течение 2 циклов, и элюент захватывали в принимающем планшете, содержащем 450 мкл 5x DPBS. Последовательность операций аспирации/разливания повторяли еще 3 раза для получения образцов ADC с концентрациями в диапазоне 1,5-2,5 мг/мл при рН 7,4 в DPBS.
Способ E. Раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) Bond-Breaker™ (10 мМ, 0,017 мл) добавляли к раствору антитела (10 мг/мл, 1 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 37°С в течение 75 минут. Раствор восстановленного антитела охлаждали до комнатной температуры и добавляли к раствору синтона (10 мМ, 0,040 мл в DMSO) с последующим добавлением борного буфера (0,1 мл, 1 М, рН 8). Реакционный раствор отстаивали в течение 3 дней при комнатной температуре, загружали в колонку для обессоливания (PD10, промытую 3×5 мл DPBS перед применением), затем вносили DPBS (1,6 мл) и элюировали дополнительным количеством DPBS (3 мл). Очищенный раствор ADC фильтровали через шприц-фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,2 микрона и диаметром 13 мм и хранили при 4°C.
Способ F. Конъюгацию проводили с использованием роботизированной системы для манипуляций с жидкостями Tecan Freedom Evo.
Раствор антитела (10 мг/мл) предварительно нагревали до 37°С и разделяли на аликвоты в нагретый 96-луночный планшет в количестве 3 мг на лунку (0,3 мл) и хранили при 37°С. К антителам добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) Bond-Breaker™ (1 мМ, 0,051 мл/лунка) и реакционную смесь выдерживали при 37°C в течение 75 минут. Раствор восстановленного антитела переносили в ненагретый 96-луночный планшет. Соответствующие растворы синтонов (5 мМ, 0,024 мл в DMSO) добавляли в лунки с восстановленными антителами и обрабатывали в течение 15 минут. Реакционные растворы загружали на платформу (8×12) колонок для обессоливания (NAP5, промытых 4x DPBS перед применением), затем вносили DPBS (0,3 мл) и элюировали дополнительным количеством DPBS (0,8 мл). Очищенные растворы ADC дополнительно разделяли на аликвоты для аналитических методов и хранили при 4°C.
Способ G. Конъюгацию проводили с использованием роботизированной системы для манипуляций с жидкостями Tecan Freedom Evo.
Раствор антитела (10 мг/мл) предварительно нагревали до 37°С и разделяли на аликвоты в нагретый 96-луночный планшет в количестве 3 мг на лунку (0,3 мл) и хранили при 37°С. К антителам добавляли раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) Bond-Breaker™ (1 мМ, 0,051 мл/лунка) и реакционную смесь выдерживали при 37°C в течение 75 минут. Растворы восстановленного антитела переносили в ненагретый 96-луночный планшет. Соответствующие растворы синтонов (5 мМ, 0,024 мл/лунка в DMSO) добавляли в лунки с восстановленными антителами с последующим добавлением борного буфера (рН=8, 0,03 мл/лунка) и обрабатывали в течение 3 дней. Реакционные растворы загружали на платформу (8×12) колонок для обессоливания (NAP5, промытых 4x DPBS перед применением), затем вносили DPBS (0,3 мл) и элюировали дополнительным количеством DPBS (0,8 мл). Очищенные растворы ADC дополнительно разделяли на аликвоты для аналитических методов и хранили при 4°C.
Способ H. Раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) Bond-Breaker™ (10 мМ, 0,17 мл) добавляли к раствору антитела (10 мг/мл, 10 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 37°С в течение 75 минут. Раствор синтона (10 мМ, 0,40 мл в DMSO) добавляли к раствору восстановленного антитела, охлажденному до комнатной температуры. Реакционный раствор отстаивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор ADC обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония (~ 2-2,5 мл) до образования слегка мутного раствора. Этот раствор загружали в колонку с бутилсефарозой (5 мл бутилсефарозы), уравновешенную 30% фазой B в фазе A (фаза A: 1,5 М сульфат аммония, 25 мМ фосфат; фаза B: 25 мМ фосфат, 25% изопропанол об./об.). Отдельные фракции с DAR2 (также называемым "E2") и DAR4 (также называемым "E4") элюировали при применении градиента A/B до 75% фазы B. Каждый раствор ADC концентрировали, и заменяли буфер с помощью центрифужных концентраторов или TFF для больших масштабов. Очищенные растворы ADC фильтровали через шприц-фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,2 микрона и диаметром 13 мм и хранили при 4°C.
Способ H.Раствор трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) Bond-Breaker™ (10 мМ, 0,17 мл) добавляли к раствору антитела (10 мг/мл, 10 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 37°С в течение 75 минут. Раствор синтона (10 мМ, 0,40 мл в DMSO) добавляли к раствору восстановленного антитела, охлажденному до комнатной температуры. Реакционный раствор отстаивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор ADC обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония (~ 2-2,5 мл) до образования слегка мутного раствора. Этот раствор загружали в колонку с бутилсефарозой (5 мл бутилсефарозы), уравновешенную 30% фазой B в фазе A (фаза A: 1,5 М сульфат аммония, 25 мМ фосфат; фаза B: 25 мМ фосфат, 25% изопропанол об./об.). Отдельные фракции с DAR2 (также называемым "E2") и DAR4 (также называемым "E4") элюировали при применении градиента A/B до 75% фазы B. Каждый раствор ADC концентрировали, и заменяли буфер с помощью центрифужных концентраторов или TFF для больших масштабов. Растворы ADC обрабатывали борным буфером (0,1 мл, 1 М, рН 8). Реакционный раствор отстаивали в течение 3 дней при комнатной температуре, затем загружали в колонку для обессоливания (PD10, промытую 3×5 мл DPBS перед применением), затем вносили DPBS (1,6 мл) и элюировали дополнительным количеством DPBS (3 мл). Очищенный раствор ADC фильтровали через шприц-фильтр с низким связыванием белков с размером пор 0,2 микрона и диаметром 13 мм и хранили при 4°C.
DAR и агрегация ADC
DAR и процентную величину агрегации иллюстративных синтезированных ADC определяли соответственно с помощью LC-MS и эксклюзионной хроматографии (SEC).
Общая методика LC-MS
Анализ LC-MS проводили с использованием системы для HPLC Agilent 1100, соединенной с масс-спектрометром Agilent LC/MSD TOF 6220 ESI. ADC восстанавливали с помощью 5 мМ (конечная концентрация) раствора Bond-Breaker® TCEP (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс), загружали в картридж для обессоливания с Protein Microtrap (Michrom Bioresorces, Оберн, Калифорния), и элюировали с градиентом от 10% B до 75% B в течение 0,2 минуты при температуре окружающей среды. Подвижная фаза A представляла собой H2О с 0,1% муравьиной кислотой (FA), подвижная фаза B представляла собой ацетонитрил с 0,1% FA, и скорость потока составляла 0,2 мл/мин. Масс-спектры совместно элюируемых легкой и тяжелой цепей получали времяпролетным методом в режиме электрораспылительной ионизации с использованием программного обеспечения для сбора данных Agilent MassHunterTM. Извлеченный спектр, представляющий собой зависимость интенсивности от соотношения масса/заряд, подвергали деконволюции с использованием функции максимальной энтропии программного обеспечения MassHunter для определения массы каждого восстановленного фрагмента антитела. DAR рассчитывали по подвергнутому деконволюции спектру путем суммирования значений интенсивности голых и модифицированных пиков для легкой цепи и тяжелой цепи, нормализованных путем умножения интенсивности на количество присоединенных молекул лекарственных средств. Суммарные нормализованные значения интенсивности делили на сумму значений интенсивности, а результаты суммирования для двух легких цепей и двух тяжелых цепей давали конечное среднее значение DAR для полного ADC.
Гидролиз тиосукцинимидов биоконъюгата можно отслеживать с помощью масс-спектрометрии с электрораспылением, так как добавление воды к конъюгату приводит к увеличению наблюдаемой молекулярной массы конъюгата на 18 дальтонов. В случаях, когда конъюгат получают путем полного восстановления межцепочечных дисульфидных связей антитела IgG1 человека и конъюгации производного малеимида с каждым из полученных цистеиновых остатков, каждая легкая цепь антитела будет содержать одну малеимидную модификацию, а каждая тяжелая цепь будет содержать три малеимидных модификации, как описано на фигуре 2. После полного гидролиза полученных тиосукцинимидов масса легкой цепи будет, таким образом, увеличиваться на 18 дальтонов, тогда как масса каждой тяжелой цепи будет увеличиваться на 54 дальтона. Это проиллюстрировано на фигуре 5, на которой показана конъюгация полностью восстановленного антитела huAb13v1 с иллюстративной структурой лекарственное средство-малеимидный линкер (синтон TX, молекулярная масса 1736 Да) и последующим ее гидролизом.
Общая методика эксклюзионной хроматографии
Эксклюзионную хроматографию проводили с использованием колонки Shodex KW802,5 в 0,2 М фосфате калия, рН 6,2, с 0,25 мМ хлорида калия и 15% IPA при скорости потока 0,75 мл/мин. Для каждого из высокомолекулярных и мономерных элюентов определяли площадь пика поглощения при 280 нм путем интегрирования площади под кривой. % долю агрегатов в образце конъюгата определяли путем деления площади пика поглощения при 280 нм для высокомолекулярного элюента на сумму площадей пиков поглощения при 280 нм для высокомолекулярных и мономерных элюентов и умножения на 100%.
Способы анализа жизнеспособности клеток in vitro
Линии опухолевых клеток HCC38 (рак молочной железы), NCI-H1650 (NSCLC) и NCI-H847 (линия клеток мелкоклеточного рака легкого) были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Клетки выращивали в 96-луночных культуральных планшетах с использованием рекомендуемой питательной среды в течение ночи при плотности 5×103 (HCC38) или 20×103 (NCI-H847) или 40×103 (NCI-H1650) на лунку. На следующий день средства для обработки добавляли в свежую среду в лунки в трех повторностях. Жизнеспособность клеток определяли через 5 дней с использованием набора для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega), как указано в протоколе производителя. Жизнеспособность клеток оценивали как процент от контрольных необработанных клеток.
Пример 8. Эффективность конъюгатов лекарственного средства и антитела к B7-H3 in vivo
Из девяти химерных антител, протестированных in vitro, конъюгированных с CZ-синтонами, четыре показали субнаномолярную цитотоксичность (таблица 6). chAb3-CZ, chAb18-CZ и chAb13-CZ достигли значений DAR в диапазоне от 2,6 до 4,2 (см. таблицу 7) и были оценены в отношении противоопухолевой активности в мышиной ксенотрансплантатной модели клеток мелкоклеточного рака легкого NCI-H146 человеческого происхождения, с применением способов, описанных ниже. Антитело MSL109 (антитело к IgG1, которое связывается с гликопротеином H цитомегаловируса (CMV)) использовали в качестве контроля как в виде голого антитела, так и в качестве ADC (конъюгированного с тем же синтоном (CZ), что и антитела chAb3, chAb18 и chAb13). MSL109 представляет собой изотипически сходный ненацеливающий контроль. Способы такого ксенотрансплантатного анализа описаны ниже. Результаты представлены в таблице 7. Результаты показывают, что каждый из ADC с антителом к B7-H3, ингибирующих Bcl-xL, способен значительно подавить рост опухоли относительно контроля с голым антителом (MSL109) или нецелевого специфического контроля Bcl-xL ADC (MSL109-CZ).
Таблица 7. Эффективность химерного антитела к B7-H3 в виде конъюгатов с лекарственным средством ингибитором Bcl-xL in vivo
[a] доза указана в мг/кг/день
Способы оценивания эффективности в ксенотрансплантатных моделях
Клетки NCI-H146, клетки NCI-1650 и клетки EBC-1 получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Виргиния). Клетки культивировали в виде монослоев в культуральных средах RPMI-1640 (NCI-H146, NCI-H1650) или MEM (EBC-1) (Invitrogen, Карсбад, Калифорния), которые были дополнены 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Hyclone, Логан, Юта). Для получения ксенотрансплантатов 5×106 жизнеспособных клеток соответственно инокулировали подкожно в правый бок самкам мышей SCID/bg с иммунодефицитом (Charles River Laboratories, Уилмингтон, Массачусетс). Объем инъекции составлял 0,2 мл и состоял из смеси S-MEM и матригеля в соотношении 1:1 (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси). Опухоли приводили в соответствие по размеру приблизительно 200 мм3. Антитела и конъюгаты составляли в 0,9% хлориде натрия для инъекций и инъецировали внутрибрюшинно. Объем инъекции не превышал 200 мкл. Терапию начинали в течение 24 часов после приведения опухолей в соответствие по размеру. В начале терапии мыши весили примерно 22 г. Объем опухоли оценивали два-три раза в неделю. С помощью электронного штангенциркуля получали измерения длины (L) и ширины (W) опухоли, и объем рассчитывали согласно следующему уравнению: V=L x W2/2. Мышей подвергали эвтаназии, когда объем опухоли достигал 3000 мм3 или появлялись язвенные поражения кожи. Мышей размещали по восемь на клетку. Пища и вода были доступны в неограниченном количестве. Проводили акклиматизацию мышей к вивариям в течение периода по меньшей мере одной недели до начала экспериментов. Животных тестировали в световой фазе в условиях режима 12 часов света: 12 часов темноты (освещение включали в 06:00 часов). Как описано выше, контрольное антитело к IgG человека (MSL109) использовали в качестве отрицательного контроля.
Для указания эффективности терапевтических средств использовали параметры амплитуды (TGImax), продолжительности (TGD) терапевтического ответа. TGImax означает максимальное ингибирование роста опухоли в ходе эксперимента. Подавление роста опухоли рассчитывали по формуле 100*(1-Tv/Cv), где Tv и Cv представляют собой средние объемы опухолей в группе обработки и контрольной группе. TGD или задержка роста опухоли представляет собой дополнительное время, необходимое обработанной опухоли для достижения объема 1 см3, по сравнению с контрольной группой. TGD рассчитывают как 100*(Tt/Ct-1), где Tt и Ct представляют собой соответственно медианные периоды времени для достижения 1 см3 в группе обработки и контрольной группе.
Пример 9. Гуманизация антитела к B7-H3 на основе chAb18
Химерное антитело к B7-H3 chAb18 выбирали для гуманизации исходя из его характеристик связывания и благоприятных свойств в качестве ADC, в том числе его свойства при конъюгировании с ингибитором Bcl-xL (описано выше как иллюстративный конъюгат CZ).
Гуманизированные антитела получали на основании последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) из chAb18. В частности, последовательности зародышевого типа человека отбирали для конструирования CDR-привитых гуманизированных антител на основе chAb18, в которых CDR-домены из VH- и VL-цепей прививали на различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человека. На основании выравниваний последовательностей VH- и VL-областей моноклонального антитела chAb18, следующие последовательности человека были отобраны как акцепторы:
IGHV1-69*06 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи;
IGKV1-9*01 и IGKJ2*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи;
IGKV6-21*01 и IGKJ2*01 в качестве альтернативного акцептора для конструирования легкой цепи.
Таким образом, CDR VH и VL chAb18 были привиты к указанным акцепторным последовательностям.
Для получения гуманизированных антител обратные мутации каркасной области идентифицировали и вводили в последовательности CDR-привитых антител с помощью синтеза вариабельного домена de novo или мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразных цепных реакций или обоих посредством способов, хорошо известных из уровня техники. Для каждого из CDR-привитых антител конструировали различные комбинации обратных мутаций и других мутаций, как описано ниже. Номера остатков для таких мутаций основаны на системе нумерации Kabat.
В случае тяжелых цепей huAb18VH.1 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL следующим образом: L46P, L47W, G64V, F71H. Дополнительные мутации включают следующие: Q1E, N60A, K64Q, D65G. В случае легких цепей huAb18VL.1 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL следующим образом: A43S, L46P, L47W, G64V, G66V, F71H. В случае легких цепей huAb18VL.2 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL следующим образом: L46P, L47W, K49Y, G64V, G66V, F71H.
Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR гуманизированных антител описаны в таблице 8 ниже.
ТАБЛИЦА 8. Аминокислотные последовательности VH и VL гуманизированных вариантов chAb18
Гуманизированные вариабельные области мышиных моноклональных антител к Ab18 (описанные выше) клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик.
Гуманизированное Ab18VH.1 (huAb18VH.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VH Ab18, содержащую последовательности каркасных областей IGHV1-69*06 и IGHJ6*01; Оно также содержит изменение Q1E для предупреждения образования пироглутамата. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VH.1 показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VH1.a (huAb18VH.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb18VH.1 и содержит 4 предложенных обратных мутаций каркасной области: M48I, V67T, L69I, K73R. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VH.1a показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VH1.b (huAb18VH.1b) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb18VH.1 и huAb18VH.1a и содержит 1 предложенную обратную мутацию каркасной области L69I и 3 приводящие к зародышевому типу изменения N60A, K64Q, D65G в HCDR2. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VH.1b показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VL.1 (huAb18VL.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VL Ab18, содержащую последовательности каркасных областей IGKV1-9*01 и IGKJ2*01. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VL.1 показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VL.1a (huAb18VL.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb18VL.1 и содержит 6 предложенных обратных мутаций каркасной области: A43S, L46P, L47W, G64V, G66V, F71H. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VL.11 показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VL.1b (huAb18VL.1b) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb18VL.1 и huAb18VL.1a и содержит 4 предложенные обратные мутации каркасной области: L46P, L47W, G64V, F71H. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VL.1b показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VL.2 (huAb18VL.2) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VL Ab18, содержащую последовательности каркасных областей IGKV6-21*01 и IGKJ2*01. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VL.2 показаны в таблице 8.
Гуманизированное Ab18VL.2a (huAb18VL.2a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb18VL.2 и содержит 6 предложенных обратных мутаций каркасной области: L46P, L47W, K49Y, G64V, G66V, F71H. Последовательности вариабельной области и CDR huAb18VL.2a показаны в таблице 8.
Таким образом, в результате гуманизации chAb18 получили 10 гуманизированных антител, в том числе huAb18v1, huAb18v2, huAb18v3, huAb18v4, huAb18v5, huAb18v6, huAb18v7, huAb18v8, huAb18v9 и huAb18v10. Вариабельные и тяжелые и легкие цепи для каждой из этих гуманизированных версий Ab18 представлены ниже:
Таблица 9. Гуманизированные антитела к B7-H3 на основе Ab18
Пример 10. Определение характеристик гуманизированных вариантов антител к B7-H3 на основе chAb18 in vitro
В результате гуманизации chAb18 было получено 10 вариантов (описанных выше в таблице 9), которые сохраняли связывание с B7-H3 человека и макака-крабоеда, что оценивали с помощью FACS (способ которого описан выше в примере 6). Эти варианты дополнительно характеризовали в отношении связывания с помощью SPR и успешно конъюгировали с ингибирующим Bcl-xL синтоном CZ с использованием способа A (описанного выше) и оценивали в отношении клеточной цитотоксичности, как описано в примере 7. В таблице 10 обобщены характеристики in vitro различных гуманизированных вариантов Ab18. Исходное chAb18, из которого были получены варианты, также исследовали в качестве сравнительного. Все гуманизированные варианты обладали схожими свойствами связывания, что было оценено с помощью Biacore, и сохраняли активность связывания с поверхностью клетки при экспрессии в виде конъюгатов с CZ-синтоном. Цитотоксичность всех вариантов в виде CZ-синтонов была сходной с таковой у chAb18, из которого они были получены.
ТАБЛИЦА 10. Определение характеристик in vitro гуманизированных вариантов антител к B7-H3 на основе Ab18
Гуманизированные варианты chAb18 конъюгировали с CZ-синтоном и исследовали в отношении цитотоксичности в линии клеток HCC38. Как описано в таблице 10, большинство гуманизированных антител показали сильную цитотоксичность, сходную с таковой, наблюдаемой у контрольного антитела chAb18.
Пример 11. Эффективность in Vivo гуманизированных вариантов Ab18 как ADC с ингибитором Bcl-xL
Шесть из гуманизированных вариантов chAb18 отбирали исходя из результатов цитотоксичности in vitro, описанных в примере 10. В частности, каждое из антител huAb18v1, huAb18v3, huAb18v4, huAb18v6, huAb18v7 и huAb18v9 конъюгировали с CZ-синтоном (с образованием ADC с антителом к B7-H3 и CZ) для оценки в ксенотрансплантатной модели in vivo мелкоклеточного рака легкого (с применением клеток NCI-H146), как описано в примере 8. Обработка однократной дозой мышей, несущих опухоли, приводила к подавлению роста опухоли и задержке роста опухоли, и результаты обобщены в таблице 11. Ab095 использовали в качестве отрицательного контроля эффекта введения IgG, так как он представляет собой изотипически сходное нецелевое специфическое антитело, созданное против столбнячного токсина. См. Larrick et al., 1992, Immunological Reviews 69-85. Мышам вводили 6 мг/кг ADC внутрибрюшинно QDx1.
Таблица 11. Эффективность in vivo ADC с антителом к B7-H3 (гуманизированные варианты chAb18-CZ)
путь/
схема
[a] доза указана в мг/кг/день
Как описано в таблице 11, каждое из исследуемых гуманизированных антител было способно подавить рост опухоли на мышиной ксенотрансплантатной модели.
Пример 12. Гуманизация антитела к B7-H3 на основе chAb3
Химерное антитело к B7-H3 на основе chAb3 отбирали для гуманизации исходя из его благоприятных свойств в качестве конъюгата, ингибирующего Bcl-xL (Bcl-xLi). Гуманизированные антитела получали на основании последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) из chAB3. В частности, последовательности зародышевого типа человека отбирали для конструирования CDR-привитых гуманизированных антител на основе chAb3, в которых CDR-домены из VH- и VL-цепей chAb3 прививали на различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человека. На основании выравниваний последовательностей VH- и VL-областей моноклонального антитела chAb3, следующие последовательности человека были отобраны как акцепторы:
IGHV1-69*06 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи;
IGKV2-28*01 и IGKJ4*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи;
IGHV1-69*06_IGHJ6 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASggtfssyaisWVRQAPGQGLEWMGgiipifgtanyaqkfqgRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARxxxxxxxxWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 174);
где xxxxxxxx представляет собой область CDR-H3.
IGKV2-28*01_IGKJ4
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCrssqsllhsngynyldWYLQKPGQSPQLLIYlgsnrasGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCxxxxxxxxxFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 175);
где xxxxxxxxx представляет собой область CDR-L3.
С помощью привития соответствующих CDR VH и VL chAb3 в указанные акцепторные последовательности получали CDR-привитые, гуманизированные и модифицированные последовательности VH и VL. Для получения гуманизированных антител с потенциальными обратными мутациями каркасной области мутации идентифицировали и вводили в последовательности CDR-привитых антител с помощью синтеза вариабельного домена de novo или мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразных цепных реакций или обоих способов. Для каждого из CDR-привитых антител конструировали различные комбинации обратных мутаций и других мутаций следующим образом. Номера остатков для таких мутаций основаны на системе нумерации Kabat.
Аминокислотные последовательности различных гуманизированных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей описаны ниже в таблице 12.
В случае тяжелых цепей huAb3VH.1 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL следующим образом: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, M80V, Y91F, R94G. В случае легких цепей huAb31VL.1 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL следующим образом: I2V, Y87F;
Следующие гуманизированные вариабельные области мышиного моноклонального антитела к chAb3 клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик.
Гуманизированное Ab3VH.1 (huAb3VH.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VH Ab3, содержащую последовательности каркасных областей IGHV1-69*06 и IGHJ6*01. Оно также содержит изменение Q1E для предупреждения образования пироглутамата.
Гуманизированное Ab3VH.1a (huAb3VH.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb3VH.1 и содержит 8 предложенных обратных мутаций каркасной области: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, M80V, Y91F, R94G.
Гуманизированное Ab3VH.1b (huAb3VH.1b) представляет собой гуманизированный формат между huAb3VH.1 и huAb3VH.1a и содержит 6 предложенных обратных мутаций каркасной области: M48I, V67A, I69L, A71V, K73R, R94G.
Гуманизированное Ab3VL.1 (huAb3VL.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VL Ab3, содержащую последовательности каркасных областей IGKV2-28*01 и IGKJ4*01.
Гуманизированное Ab3VL.1a (huAb3VL.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb3VL.1 и содержит 2 предложенные обратные мутации каркасной области: I2V, Y87F;
Гуманизированное Ab3VL.1b (huAb3VL.1b) представляет собой гуманизированный формат и содержит только 1 предложенную обратную мутацию каркасной области: I2V.
Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR вышеприведенных гуманизированных антител описаны в таблице 12 ниже.
Таблица 12. Последовательности VH- и VL-областей гуманизированных версий chAb3
В результате гуманизации chAb3 получили 6 гуманизированных антител, в том числе huAb3v1, huAb3v2, huAb3v3, huAb3v4, huAb18v5 и huAb3v6. Вариабельные и тяжелые легкие цепи для каждой из этих гуманизированных версий Ab18 представлены в таблице 13 ниже.
Таблица 13. Гуманизированные антитела Ab3
Пример 13. Определение характеристик гуманизированных вариантов антител chAb3 in vitro
В результате гуманизации chAb3 было получено 6 вариантов (описанных в таблице 13), которые сохраняли связывание с B7-H3 человека, что оценивали с помощью FACS (как описано в примере 6). Эти варианты были дополнительно характеризовали в отношении связывания с помощью SPR и в качестве ADC, конъюгированных с синтоном CZ, ингибирующим Bcl-xL (линкерное действующее средство). Гуманизированные антитела Ab3 также оценивали в отношении клеточной цитотоксичности (с использованием анализа, описанного выше в примере 7). В таблице 14 приведены характеристики in vitro гуманизированных вариантов chAb3. В качестве контроля использовали ADC, содержащий chAb3, конъюгированный с синтоном CZ.
ТАБЛИЦА 14. Определение характеристик in vitro гуманизированных вариантов chAb3
EC50 (нМ)
(нM)
Пример 14. Эффективность in vivo гуманизированных вариантов chAb3 как ADC с ингибитором Bcl-xL
Отбирали два гуманизированных варианта (huAb3v2 и huAb3v6) на основе сильной цитотоксичности in vitro в качестве CZ-конъюгатов и приемлемых свойств агрегации для оценки на мышиной ксенотрансплантатной модели in vivo клеток мелкоклеточного рака легких (клетки NCI-H146), как описано в материалах и способах в примере 8. Обработка однократной дозой у мышей, несущих опухоли, приводила к подавлению роста опухоли и задержке роста опухоли для обоих гуманизированных антител, конъюгированных с иллюстративным ингибитором Bcl-xL, и результаты обобщены в таблице 15.
Таблица 15. Эффективность in vivo гуманизированных вариантов chAb3-CZ
[a] доза указана в мг/кг/день
Пример 15. Модификации CDR гуманизированного варианта антитела huAb3v2
huAb3v2 продемонстрировало благоприятные свойства связывания и уничтожения клеток. Однако изучение аминокислотных последовательностей вариабельной области huAb3v2 выявило потенциальные сайты дезамидирования и/или изомеризации.
Аминокислотные последовательности вариабельных областей huAb3 описаны ниже, в том числе легкая цепь (huAb3VL1) и тяжелая цепь (huAb3VH1b). Потенциальные сайты дезамидирования и/или изомеризации в CDR VH (CDR2 у аминокислот "ds" и VL (CDR1 у аминокислот "ng") выделены курсивом и, таким образом, сконструированы для улучшения производства антител. CDR описаны строчными буквами в последовательностях ниже.
Чтобы получить варианты huAb3v2, в которых отсутствуют эти потенциальные сайты дезамидирования и/или изомеризации, каждую из аминокислот, указанных ниже (x и z; представляющих потенциальные сайты в CDR1 VL и CDR2 VH), подвергали мутагенезу. Полученные 30 вариантов VL спаривали с исходной VH huAb3v2 и исследовали в отношении связывания. Полученные 29 вариантов VH спаривали с исходной VL huAb3v2 и исследовали в отношении связывания. Удачные варианты VH объединяли и исследовали с продуктивными вариантами VL, несущими изменения в LCDR1, чтобы у окончательных гуманизированных вариантов отсутствовали потенциальные сайты дезамидирования и/или изомеризации в CDR. Аминокислотные последовательности вариантов представлены в таблице 16 ниже. Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи варианта huAb3v2, huAb3v2.5, представлены в SEQ ID NO: 170 и 171 соответственно. Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи варианта huAb3v2, huAb3v2.6, представлены в SEQ ID NO: 172 и 173 соответственно.
huAb3 VL1
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCrssqslvhsngdtylrWYLQKPGQSPQLLIYkvsnrfsGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCsqsthvpytFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 128)
xg (15 вариантов) (SEQ ID NO: 178)
nz (15 вариантов) (SEQ ID NO: 179)
huAb3 VH1b
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASgytfssywmhWVRQAPGQGLEWIGlihpdsgstnynemfknRATLTVDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGggrlyfdyWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 127)
(15 вариантов) xs (SEQ ID NO: 180)
(14 вариантов) dz (SEQ ID NO: 181)
где (для как VL, так и VH),
x=все аминокислоты, за исключением M, C, N, D или Q.
z=все аминокислоты, за исключением M, C, G, S, N или P.
Предложенные обратные мутации каркасной области подчеркнуты (см. пример 12).
Таблица 16. Последовательности вариабельных областей вариантов антител huAb3v2
Пример 16. Определение характеристик вариантов huAb3v2 in vitro
Удаление потенциальных сайтов дезамидирования и/или изомеризации (описанных в примере 15) дало только 6 вариантов, которые сохраняли связывание как с B7-H3 человека, так и B7-H3 макака-крабоеда, экзогенно экспрессируемыми на фибробластах 3T12 мыши, как оценивали с помощью FACS (как описано в способах примера 6).
Такие новые антитела к B7-H3 дополнительно характеризовали в отношении связывания с помощью SPR и конъюгировали с синтоном CZ Bcl-xLi и оценивали в отношении клеточной цитотоксичности (с использованием способов, описанных в примере 7). В таблице 17 приведены характеристики in vitro шести гуманизированных вариантов huAb3v2.
Таблица 17. Определение характеристик in vitro гуманизированных вариантов huAb3v2, в том числе голых антител и ADC
(нM)
Как описано в таблице 17, результаты показали, что все шесть вариантов huAb3v2 обладали сходными свойствами связывания с клетками, экспрессирующими B7-H3 человека или макака-крабоеда, по сравнению с исходным huAb3v2. Из шести вариантов huAb3v2 четыре антитела (huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.8, huAb3v2.9) показали сильную цитотоксичность в клетках H847 при конъюгировании с иллюстративным синтоном CZ Bcl-xLi.
Пример 17. Гуманизация антитела к B7-H3 chAb13
Химерное антитело к B7-H3 chAb13 выбрали для гуманизации на основе его характеристик связывания и благоприятных свойств в качестве ADC (при конъюгировании с ингибитором Bcl-xL).
До гуманизации chAb13 модифицировали с целью минимизации потенциального дезамидирования в CDR3 легкой цепи (QQYNSYPFT (SEQ ID NO:182); потенциальный сайт дезамидирования указан в виде остатков "NS" (выделено курсивом)). Вводили точечные мутации в аминокислотное положение, соответствующее "N" и/или "S" в CDR3 легкой цепи chAb13, в результате чего было получено 30 вариантов. Антитела, содержащие такие варианты легкой цепи CDR3, затем подвергали скринингу в отношении их способности сохранять характеристики связывания chAb13. Варианты, содержащие CDR3 с точечной мутацией триптофана (W) вместо серина "S" в мотиве "NS" (т. е. QQYNWYPFT (SEQ ID NO: 39)) сохраняли свойства связывания исходного антитела chAb13. Замена остатка S остатком W в CDR3 была неожиданной, учитывая структурные различия между серином и триптофаном, а также значительную роль, которую CDR3 играет в связывании антигена.
Гуманизированные антитела получали на основании последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) chAb13, в том числе CDR3 легкой цепи "NW". В частности, последовательности зародышевого типа человека отбирали для конструирования CDR-привитых гуманизированных антител на основе chAb13, в которых CDR-домены из VH- и VL-цепей прививали на различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человека. На основании выравниваний последовательностей VH- и VL-областей моноклонального антитела chAb13, следующие последовательности человека были отобраны как акцепторы:
IGHV4-b*01(0-1) и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи;
IGKV1-39*01 и IGKJ2*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи;
IGHV4-b_IGHJ6 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSgysissgyywgWIRQPPGKGLEWIGsiyhsgstyynpslksRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARxxxxxxxWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 176);
где xxxxxxx представляет область CDR-H3.
IGKV1-39_IGKJ2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCrasqsissylnWYQQKPGKAPKLLIYaasslqsGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCxxxxxxxxxFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 177);
где xxxxxxxxx представляет собой область CDR-L3.
С помощью привития "NW" легкой цепи CDR3 и остальных пяти соответствующих CDR VH и VL chAb13 в указанные акцепторные последовательности получали CDR-привитые, гуманизированные и модифицированные последовательности VH и VL. Для получения гуманизированных антител с потенциальными обратными мутациями каркасной области, мутации идентифицировали и вводили в последовательности CDR-привитых антител с помощью синтеза вариабельного домена de novo или мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразных цепных реакций или обоих посредством способов, хорошо известных из уровня техники. Для каждого из CDR-привитых антител конструировали различные комбинации обратных мутаций и других мутаций следующим образом. Номера остатков для таких мутаций основаны на системе нумерации Kabat.
Следующие гуманизированные вариабельные области мышиных моноклональных антител к chAb13 клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик.
Гуманизированное Ab13VH.1 (huAb13VH.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VH Ab13, содержащую последовательности каркасных областей IGHV4-b*01(0-1) и IGHJ6*01. Оно также содержит изменение Q1E для предупреждения образования пироглутамата.
Гуманизированное Ab13VH.1 (huAb13VH.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb13VH.1 и содержит 9 предложенных обратных мутаций каркасной области: S25T, P40F, K43N, I48M, V67I, T68S, V71R, S79F, R94G.
Гуманизированное Ab13VH.1b (huAb13VH.1b) представляет собой промежуточный формат между huAb13VH.1 и huAb13VH.1a и содержит 4 предложенные обратные мутации каркасной области: K43N, I48M, V67I, V71R.
Гуманизированное Ab13VL.1 (huAb13VL.1) представляет собой CDR-привитую гуманизированную VL Ab13, содержащую последовательности каркасных областей IGKV1-39*01 и IGHJ6*01.
Гуманизированное Ab13VL.1a (huAb13VL.1a) представляет собой гуманизированный формат на основе huAb13VL.1 и содержит 4 предложенные обратные мутации каркасной области: A43S, L46A, T85E, Y87F.
Гуманизированное Ab13VL.1b (huAb13VL.1b) представляет собой промежуточный формат между huAb13VL.1 и huAb13VL.1a и содержит 1 предложенную обратную мутацию каркасной области: Y87F.
Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR вышеприведенных описаны в таблице 18 ниже.
Таблица 18. Аминокислотные последовательности вариабельной области гуманизированного Ab13
Пример 18. Получение вариантов huAb13
Аминокислотные последовательности 3 VH и 3 VL области гуманизированных вариантов Ab13, описанные в таблице 18, спаривали вместе для получения 9 вариантов huAb13, описанных в таблице 19. Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи варианта huAb13v1, huAb13v1, представлены под SEQ ID NO: 168 и 169 соответственно.
Таблица 19. Последовательности вариабельных областей сконструированных вариантов huAb13
Пример 19. Определение характеристик гуманизированных вариантов huAb13VL.1a
Девять вариантов huAb13, описанных в примерах 17 и 18, получили и исследовали в отношении связывания с B7-H3 с помощью FACS (в соответствии со способами, описанными в примере 6). Шесть вариантов не связывались с B7-H3 человека. Остальные три варианта дополнительно характеризовали в отношении связывания с помощью SPR и конъюгировали (с помощью способа A) с ингибитором Bcl-xL (в частности, линкерным действующим средством (или синтоном) CZ) и оценивали клеточную цитотоксичность (в соответствии со способами, описанными в примере 7). В таблице 20 приведены характеристики in vitro таких вариантов.
Таблица 20. Определение характеристик in vitro вариантов huAb13VL.1a, конъюгированных с синтоном (или линкерной нагрузкой) CZ
hB7-H3
EC50 нM
Линия клеток H847 IC50) (нM)
HuAb13v1 отбирали для дальнейшего изучения, частично благодаря его сильной и чрезвычайной цитотоксичности в отношении клеток H847 и свойствам связывания, аналогичным chAb13, из которого оно было получено. Напротив, huAb13v5 и huAb13v6 показали плохие показатели кинетики в экспериментах Biacore, что дает возможность предположить, что их свойства связывания значительно отличаются от исходного chAb13, чем huAb13v1, и они обладают пониженной активностью в анализе уничтожения клеток.
Пример 20. Эффективность in vitro отобранных гуманизированных антител к B7-H3 с иллюстративными действующими средствами-линкерами-ингибиторами Bcl-xL (синтонами)
Гуманизированные антитела huAb13v1, huAb3v2.5 и huAb3v2.6 отбирали для конъюгации с несколькими полезными нагрузками ингибитора Bcl-xL (или синтонами) в объеме 3 мг с применением способов A, E или G, как описано в примере 7. Противоопухолевую активность таких ADC исследовали в анализах цитотоксичности с применением линии клеток NCI-H1650 немелкоклеточного рака легкого, как описано в примере 7. В качестве контроля также оценивали in vitro противоопухолевую активность ADC, содержащих ненацеливающее антитело MSL109 (моноклональное антитело, которое связывается с гликопротеином H CMV, конъюгированное с полезными нагрузками ингибитора Bcl-xL (или синтонами)). Результаты представлены в таблице 21.
Таблица 21. Цитотоксичность in vitro в отношении опухолевых клеток отобранных гуманизированных ADC с антителом к B7-H3 с иллюстративным действующим средством-линкером-ингибитором Bcl-xL (синтонами)
В отличие от низкой противоопухолевой активности, проявляемой ADC, содержащими ненацеливающее антитело MSL109, конъюгированное с полезной нагрузкой ингибитора Bcl-xL, ADC, нацеленные на B7-H3, демонстрировали большее уничтожение опухолевых клеток, что отражает антиген-зависимую доставку ADC, нацеленных на B7-H3, в опухолевые клетки, экспрессирующие B7-H3.
Противоопухолевую активность двух таких ADC исследовали в анализах цитотоксичности с применением линии клеток NCI-H146 мелкоклеточного рака легкого, как описано в примере 7. Результаты представлены в таблице 22.
Таблица 22. Цитотоксичность in vitro в отношении опухолевых клеток отобранных гуманизированных ADC с антителом к B7-H3 с иллюстративными синтонами, ингибирующими Bcl-xL.
huAb13v1-AAA E2 и huAb13v1-WD E2 исследовали в отношении цитотоксичности с применением клеток H146. Оба конъюгата проявляют сильную и сопоставимую цитотоксичность.
Пример 21. Анализ in vivo ADC с антителом к B7-H3
Гуманизированные антитела к B7-H3 huAb13v1, huAb3v2.5 и huAb3v2.6 отбирали для конъюгации с несколькими полезными нагрузками ингибитора Bcl-xL и оценивали с помощью ксенотрансплантатных моделей мелкоклеточного рака легкого (H146) в качестве конъюгатов с использованием ряда действующих средств с ингибитором Bcl-xL (синтоны) с использованием способов, описанных в примере 7 и примере 8. Результаты обобщены на таблице 23 и таблице 24.
Таблица 23. Эффективность in vivo ADC с гуманизированным антителом к B7-H3
схема
[a] доза указана в мг/кг/день
Таблица 24. Эффективность in vivo ADC с гуманизированным антителом к B7-H3
схема
[a] доза указана в мг/кг/день
Гуманизированное антитело к B7-H3 huAb13v1 конъюгировали с синтоном WD, ингибирующим Bcl-xL, и оценивали на ксенотрансплантатной модели B7-H3-положительного мелкоклеточного рака легкого (H1650) в качестве конъюгатов, с применением способов, описанных в примере 7 и примере 8. В качестве контроля также оценивали противоопухолевую активность in vivo ненацеливающего антитела, соответствующего изотипу IgG (AB095). Результаты обобщены в таблице 25.
Таблица 25. Эффективность in vivo ADC с гуманизированным антителом к B7-H3 huAb13v1-WD в H1650
способ конъюгации
мг/кг/день
схема
*=p < 0,05 по сравнению с контрольной обработкой (AB095)
¥=p < 0,05 по сравнению с наиболее активным партнером в комбинации лекарственного средства
Н. п.=не применяется
В противоположность отсутствию активности, наблюдаемому при использовании ненацеливающего IgG-антитела, соответствующего изотипу Ab095, ADC, нацеливающие B7-H3, с ингибитором Bcl-xL, демонстрировали подавление роста опухоли (TGI) и задержку роста опухоли (TGD), как показано в таблицах 24 и 25, отражая антиген-зависимую доставку ADC, нацеливающих B7-H3, которые доставляют ингибитор Bcl-xL к опухолевым клеткам, экспрессирующим B7-H3, в данной мышиной ксенотрансплантатной модели. Противоопухолевую активность ADC, содержащих ненацеливающее антитело MSL109, конъюгированное с синтонами, ингибирующими Bcl-xL, оценивали в качестве дополнительного контроля in vivo в ксенотрансплантатной модели B7-H3-положительного мелкоклеточного рака легкого (H1650). Активность таких ADC сравнивали с активностью ненацеливающего антитела, соответствующего изотипу IgG, AB095, в качестве контроля. Как показано в таблице 26, ADC, содержащие ненацеливающее антитело MSL109, конъюгированное с синтонами, ингибирующими Bcl-xL, демонстрируют очень умеренное подавление роста опухоли и низкую задержку роста опухоли или ее отсутствие. Напротив, нацеливающие B7-H3 ADC Bcl-xL (как показано в таблице 25) демонстрировали значительно большее подавление роста опухоли (TGI) и задержку роста опухоли (TGD), отражая антиген-зависимую доставку таких ADC в B7-H3-экспрессирующие клетки данной ксенотрансплантатной модели мыши.
Таблица 26. Эффективность ненацеливающихся (MSL109) ADC, ингибирующих BCL-xL, in vivo в модели NSCLC из NCI-H1650
[a] доза указана в мг/кг/день
*=p < 0,05 по сравнению с контрольной обработкой (AB095)
Q4Dx6 указывает на одну дозу каждые 4 дня, в общей сложности 6 доз
Пример 22. Комбинированная терапия с B7-H3
Оценивали противоопухолевую активность huAb13v1 конъюгатов CZ или TX в качестве очищенных конъюгатов DAR2 (E2) на ксенотрансплантатных моделях немелкоклеточного рака легкого (H1650, H1299, H1975 и EBC1) человеческого происхождения с использованием способов, описанных в примере 8. Противоопухолевую активность оценивали в виде монотерапии и в комбинации с доцетакселом (H1650, H1299, H1975 и EBC1). Результаты представлены в таблице 27.
Таблица 27. In vivo эффективность конъюгатов гуманизированных huAb13v1 антител к B7-H3 в виде монотерапии и в комбинации с доцетакселом
способ конъюгации
мг/кг/день
схема
+
DTX)
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
+
DTX)
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
+
DTX
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
+
DTX
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
+
DTX
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
+
DTX
+
Н. п.
+
7,5
+ IV/Q14Dx3
*=p < 0,05 по сравнению с контрольной обработкой (AB095)
¥=p < 0,05 по сравнению с наиболее активным партнером в комбинации лекарственного средства
Н. п.=не применяется
Результаты, представленные в таблице 27, показывают, что вышеуказанное huAb13v1 в виде CZ, TX, WD или AAA очищенных конъюгатов DAR2 (E2) подавляло рост всех четырех ксенотрансплантатных моделей NSCLC в виде монотерапии. Кроме того, huAb13v1 в виде CZ, TX, WD или AAA очищенных конъюгатов DAR2 (E2) эффективно комбинировали с доцетакселом для получения более устойчивого подавления роста опухоли. Это наиболее ярко проиллюстрировано на ксенотрансплантатной модели H1650, где комбинированная терапия приводила к TGD от 467% до >717%, тогда как индивидуальная монотерапия приводила к TGD в диапазоне 67%-158%. Эти результаты подтверждают клиническую применимость ADC с ингибитором Bcl-xL (Bcl-xLi), которые следует дозировать в комбинации с химиотерапией. Краткое изложение перечня последовательности
Примечание: Fc последовательность подчеркнута
Примечание: Fc последовательность подчеркнута
Примечание: последовательность мутантной константной области Ig гамма-1 подчеркнута
Примечание: последовательность константной области каппа-цепи Ig подчеркнута
Примечание: последовательность мутантной константной области Ig гамма-1 подчеркнута
Примечание: последовательность константной области каппа-цепи Ig подчеркнута
Примечание: последовательность мутантной константной области Ig гамма-1 подчеркнута
ELSSLRSEDTAVYYCAGGGRLYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Примечание: последовательность константной области каппа-цепи Ig подчеркнута
IGHV1-69*06_IGHJ6
IGKV2-28*01_IGKJ4
Примечание: X может представлять собой любую аминокислоту, за исключением M, C, N, D или Q
Примечание: X может представлять собой любую аминокислоту, за исключением M, C, G, S, N или P
Примечание: X может представлять собой любую аминокислоту, за исключением M, C, N, D или Q
Примечание: X может представлять собой любую аминокислоту, за исключением M, C, G, S, N или P
Включение посредством ссылки
Содержание всех ссылок, патентов, находящихся на рассмотрении заявок на патенты и опубликованных патентов, цитируемых в настоящей заявке, настоящим явно включены посредством ссылки.
Эквиваленты
Специалистам в данной области техники будет понятно или они способны определить с применением лишь обычного экспериментирования наличие многих эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены приведенной ниже формулой изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ABBVIE INC.
BRUNCKO, MILAN
<120> АНТИТЕЛА К B7-H3 И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА
<130> 117813-12620
<140>
<141>
<150> US 62/347,476
<151> 2016-06-08
<150> US 62/366,511
<151> 2016-07-25
<160> 182
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb2
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb2
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb2
<400> 3
Met Ile His Pro Asp Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Ser
<210> 4
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb2
<400> 4
Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 5
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb2
<400> 5
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Tyr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ile
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb2
<400> 6
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ile Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 7
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb2,
chAb3, chAb10, huAb3VL.1, huAb3VL.1a, huAb3VL.1b, huAb3v2.1,
huAb3v2.2, huAb3v2.3, huAb3v2.4, huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.7,
huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 7
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb2
<400> 8
Ser Gln Ser Thr His Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb3
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb3,
huAb3VH.1, huAb3VH.1a, huAb3VH.1b, huAb3v2.1, huAb3v2.2, huAb3v2.3,
huAb3v2.4, huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.7, huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb3,
huAb3VH.1, huAb3VH.1a и huAb3VH.1b
<400> 11
Leu Ile His Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 12
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb3,
huAb3VH.1, huAb3VH.1a, huAb3VH.1b, huAb3v2.1, huAb3v2.2, huAb3v2.3,
huAb3v2.4, huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.7, huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 12
Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 13
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb3
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb3,
huAb3VL.1, huAb3VL.1a и huAb3VL.1b
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 15
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb3,
huAb3VL.1, huAb3VL.1a, huAb3VL.1b, huAb3v2.1, huAb3v2.2, huAb3v2.3,
huAb3v2.4, huAb3v2.5, huAb3v2.6, huAb3v2.7, huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 15
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb4
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Leu Gly Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb4
<400> 17
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
<210> 18
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb4
<400> 18
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 19
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb4
<400> 19
Arg Leu Gly Leu His Phe Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb4
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Pro Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb4
<400> 21
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb4
<400> 22
Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb4
<400> 23
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb18
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Glu Thr Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb18,
huAb18VH.1, huAb18VH.1a и huAb18VH.1b
<400> 25
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Thr Ile His
1 5 10
<210> 26
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb18,
huAb18VH.1 и huAb18VH.1a
<400> 26
Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 27
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb18,
huAb18VH.1, huAb18VH.1a и huAb18VH.1b
<400> 27
Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 28
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb18
<400> 28
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Val Ser
50 55 60
Val Ser Gly Thr Ser His Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 29
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb18,
huAb18VL.1, huAb18VL.1a, huAb18VL.1b, huAb18VL.2 и huAb18VL.2a
<400> 29
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb18,
huAb18VL.1, huAb18VL.1a, huAb18VL.1b, huAb18VL.2 и huAb18VL.2a
<400> 30
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb18,
huAb18VL.1, huAb18VL.1a, huAb18VL.1b, huAb18VL.2 и huAb18VL.2a
<400> 31
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb13
<400> 32
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb13,
huAb13Vh.1, huAb13Vh.1a, huAb13Vh.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3,
huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 33
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp His
1 5 10
<210> 34
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb13,
huAb13Vh.1, huAb13Vh.1a, huAb13Vh.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3,
huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 34
Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb13,
huAb13Vh.1, huAb13Vh.1a, huAb13Vh.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3,
huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 35
Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr
1 5
<210> 36
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb13
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb13,
huAb13VL.1, huAb13VL.1a, huAb13VL.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3,
huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 37
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn Val Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb13,
huAb13VL.1, huAb13VL.1a, huAb13VL.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3,
huAb13v4, huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 38
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL huAb13VL.1,
huAb13VL.1a, huAb13VL.1b, huAb13v1, huAb13v2, huAb13v3, huAb13v4,
huAb13v5, huAb13v6, huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 39
Gln Gln Tyr Asn Trp Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 40
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb12
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Thr Asn Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Arg Tyr Ser Trp Ile Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 41
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb12
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb12
<400> 42
Thr Ile Ser Ser Gly Thr Asn Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb12
<400> 43
Gln Gly Arg Tyr Ser Trp Ile Ala Tyr
1 5
<210> 44
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb12
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Asp Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 45
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb12
<400> 45
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Asp Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 46
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb12 и
chAb17
<400> 46
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb12
<400> 47
Gln His Ser Arg Glu Leu Leu Thr
1 5
<210> 48
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb14
<400> 48
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Phe Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Tyr Gly Ser Gln Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb14
и chAb8
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb14
<400> 50
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 51
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb14
<400> 51
His Tyr Gly Ser Gln Thr Met Asp Tyr
1 5
<210> 52
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb14
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ile Met Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb14
<400> 53
Arg Thr Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb14
<400> 54
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb14
<400> 55
Gln His Phe Trp Ser Ile Met Trp Thr
1 5
<210> 56
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb6
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Tyr Val Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb6
<400> 57
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 58
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb6
<400> 58
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb6
<400> 59
Arg Gly Tyr Gly Tyr Val Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb6
<400> 60
Glu Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb6
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Ser Leu Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb6
<400> 62
Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb6
<400> 63
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb11
<400> 64
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Pro Gly Asn Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 65
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb11
<400> 65
Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 66
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb11
<400> 66
Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 67
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb11
<400> 67
Glu Ser Pro Gly Asn Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 68
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb11
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Thr Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 69
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb11
<400> 69
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 70
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb11
<400> 70
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb11
<400> 71
Gln Asn Asp Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb16
<400> 72
Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Phe Gly Asn Tyr Ile Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb16
<400> 73
Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb16
<400> 74
Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 75
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb16
<400> 75
Pro Gly Phe Gly Asn Tyr Ile Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb16
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb16
<400> 77
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
1 5 10
<210> 78
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb16
<400> 78
Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Leu
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb16
<400> 79
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 80
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb10
<400> 80
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly His Ile Asn Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Tyr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Met
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 81
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb10
<400> 81
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1 5 10
<210> 82
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb10
<400> 82
His Ile Asn Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 83
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb10
<400> 83
Arg Ser Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 84
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb10
<400> 84
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 85
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb10
<400> 85
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 86
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb10
<400> 86
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 87
<211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb7
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Glu Asn Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Thr Gly Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 88
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb7
<400> 88
Gly Phe Ser Phe Arg Gly Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 89
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb7
<400> 89
Ala Ile Ser Thr Gly Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 90
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb7
<400> 90
Arg Gly Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 91
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb7
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb7
<400> 92
Arg Pro Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb7
и chAb8
<400> 93
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 94
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb7
<400> 94
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Phe Thr
1 5
<210> 95
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb8
<400> 95
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Asn Tyr Thr Tyr Cys Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Arg Gly Tyr Asp Tyr His Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 96
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb8
<400> 96
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Asn Tyr Thr Tyr Cys Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb8
<400> 97
Gln Arg Gly Tyr Asp Tyr His Tyr Ala Met Asp Phe
1 5 10
<210> 98
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb8
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Asn Gly Ser Asp Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys Gln Asn Phe Trp Gly Thr Ser Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb8
<400> 99
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb8
<400> 100
Gln Asn Phe Trp Gly Thr Ser Trp Thr
1 5
<210> 101
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb17
<400> 101
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Val Ser Ser Asn Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Gly Thr Arg Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 102
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb17
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ile Met Ser
1 5 10
<210> 103
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb17
<400> 103
Ser Ile Val Ser Ser Asn Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys Gly
1 5 10 15
<210> 104
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb17
<400> 104
Ser Gly Thr Arg Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 105
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb17
<400> 105
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 106
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb17
<400> 106
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ala Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 107
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb17
<400> 107
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 108
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH chAb5
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Asp Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Asp
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Ala Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Cys
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Trp Lys Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 109
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VH chAb5
<400> 109
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Asp Trp Met His
1 5 10
<210> 110
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH chAb5
<400> 110
Met Ile His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 111
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VH chAb5
<400> 111
Ser Tyr Trp Lys Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 112
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL chAb5
<400> 112
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Thr Ser Tyr Met Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 113
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL chAb5
<400> 113
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 114
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VL chAb5
<400> 114
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb5
<400> 115
His Gln Trp Thr Ser Tyr Met Tyr Thr
1 5
<210> 116
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb18VH.1,
huAb18v1 и huAb18v5
<400> 116
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 117
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb18VH.1a,
huAb18v3, huAb18v8 и huAb18v9
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Thr Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb18VH.1b,
huAb18v2, huAb18v4, huAb18v6, huAb18v7 и huAb18v10
<400> 118
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Ser Gly Ser Thr Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2
VH huAb18VH.1b
<400> 119
Tyr Ile Asn Pro Asn Ser Arg Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb18VL.1,
huAb18v1 и huAb18v2
<400> 120
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 121
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb18VL.1a,
huAb18v3 и huAb18v4
<400> 121
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Val Ser
50 55 60
Val Ser Gly Thr Glu His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 122
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb18VL.1b,
huAb18v8 и huAb18v10
<400> 122
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Val Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 123
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb18VL.2,
huAb18v5 и huAb18v6
<400> 123
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 124
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb18VL.2a,
huAb18v7 и huAb18v9
<400> 124
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Val Ser
50 55 60
Val Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 125
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3VH.1,
huAb3v1 и huAb3v4
<400> 125
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 126
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3VH.1a,
huAb3v3 и huAb3v6
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 127
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3VH.1b,
huAb3v2 и huAb3v5
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 128
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3VL.1,
huAb3v1 и huAb3v2
<400> 128
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 129
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3VL.1a
и huAb3v3
<400> 129
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 130
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3VL.1b,
huAb3v4, huAb3v5 и huAb3v6
<400> 130
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 131
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3v2.1,
huAb3v2.2 и huAb3v2.3
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Trp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 132
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH
huAb3v2.1, huAb3v2.2 и huAb3v2.3
<400> 132
Leu Ile His Pro Trp Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 133
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3v2.1,
huAb3v2.4 и huAb3v2.7
<400> 133
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 134
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL
huAb3v2.1, huAb3v2.4 и huAb3v2.7
<400> 134
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Ser Gly Asp Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 135
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3v2.2,
huAb3v2.5 и huAb3v2.8
<400> 135
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 136
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL huAb3v2.2,
huAb3v2.5 и huAb3v2.8
<400> 136
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asp Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 137
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb3v2.3,
huAb3v2.6 и huAb3v2.9
<400> 137
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gln Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 138
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR1 VL huAb3v2.3,
huAb3v2.6 и huAb3v2.9
<400> 138
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gln Asp Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 139
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3v2.4,
huAb3v2.5 и huAb3v2.6
<400> 139
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Glu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 140
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH huAb3v2.4,
huAb3v2.5 и huAb3v2
<400> 140
Leu Ile His Pro Glu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 141
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb3v2.7,
huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 141
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Ile Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 142
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR2 VH huAb3v2.7,
huAb3v2.8 и huAb3v2.9
<400> 142
Leu Ile His Pro Ile Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe Lys
1 5 10 15
Asn
<210> 143
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb13VL.1,
huAb13v2, huAb13v5 и huAb13v7
<400> 143
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Trp Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 144
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAb13VL.1a,
huAb13v1, huAb13v3 и huAb13v8
<400> 144
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Trp Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 145
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VL huAB13VL.1b,
huAb13v4, huAb13v6 и huAb13v9
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Trp Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 146
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb13VH.1,
huAb13v2, huAb13v3 и huAb13v4
<400> 146
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 147
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb13VH.1a,
huAb13v1, huAb13v5 и huAb13v6
<400> 147
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 148
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность VH huAb13VH.1b,
huAb13v7, huAb13v8 и huAb13v9
<400> 148
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 534
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(534)
<223> Аминокислотная последовательность B7-H3 (человека)
<400> 149
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210> 150
<211> 692
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(692)
<223> B7-H3-ECD человека (fc слияние)
<400> 150
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Ala Ala
450 455 460
Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu
465 470 475 480
Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
485 490 495
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
500 505 510
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
515 520 525
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
530 535 540
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
545 550 555 560
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
565 570 575
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
580 585 590
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
595 600 605
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
610 615 620
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
625 630 635 640
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
660 665 670
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
675 680 685
Ser Pro Gly Lys
690
<210> 151
<211> 474
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(474)
<223> B7-H3-ECD мыши (fc слияние)
<400> 151
Met Leu Arg Gly Trp Gly Gly Pro Ser Val Gly Val Cys Val Arg Thr
1 5 10 15
Ala Leu Gly Val Leu Cys Leu Cys Leu Thr Gly Ala Val Glu Val Gln
20 25 30
Val Ser Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Asp Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Pro Asp Leu Leu Val Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Thr Asp Glu Gly Ser Tyr Thr Cys Phe Val Ser Ile Gln Asp
115 120 125
Phe Asp Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asn Met
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Lys Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Arg Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240
Pro Leu Thr Phe Ala Ala Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 152
<211> 460
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(460)
<223> B7-H3-ECD человека (His-метка)
<400> 152
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gly Ala Leu Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val Val
20 25 30
Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu
35 40 45
Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp
50 55 60
Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser
65 70 75 80
Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly
85 90 95
Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser
100 105 110
Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro
130 135 140
Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly
165 170 175
Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln
180 185 190
Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn
195 200 205
Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala
210 215 220
His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val
225 230 235 240
Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp
245 250 255
Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala
260 265 270
Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His
275 280 285
Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr
290 295 300
Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu
305 310 315 320
Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser
325 330 335
Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro
340 345 350
Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro
355 360 365
Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu
370 375 380
Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn
385 390 395 400
Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His
405 410 415
Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu
420 425 430
Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile
435 440 445
Thr Gly Gln Pro Met Thr His His His His His His
450 455 460
<210> 153
<211> 241
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(241)
<223> B7-H3-ECD мыши (His-метка)
<400> 153
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Val Glu Val Gln Val Ser Glu Asp Pro Val Val Ala Leu
20 25 30
Val Asp Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly
35 40 45
Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys
50 55 60
Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Ser Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Val Gln Gly Asn Ala
85 90 95
Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Thr Asp Glu Gly Ser Tyr Thr
100 105 110
Cys Phe Val Ser Ile Gln Asp Phe Asp Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln
115 120 125
Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys
130 135 140
Asp Leu Arg Pro Gly Asn Met Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln
145 150 155 160
Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Lys Asp Gly Gln Gly Val Pro
165 170 175
Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Arg Gly Leu
180 185 190
Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr
195 200 205
Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly
210 215 220
Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Leu Thr Phe His His His His His
225 230 235 240
His
<210> 154
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Macaca fascicularis
<220>
<221> другой_признак
<222> (1)..(473)
<223> B7-H3-ECD макака-крабоеда (His-метка)
<400> 154
Met Leu His Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45
Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95
Leu Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Ala Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu
195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Ile Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Leu Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Ala Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Ala Ala
450 455 460
Ala His His His His His His His His
465 470
<210> 155
<211> 98
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGHV1-69*06
<400> 155
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 156
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGHJ6*01
<400> 156
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 157
<211> 96
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKV1-9*01
<400> 157
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
<210> 158
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKJ2*01
<400> 158
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 159
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Константная область гамма-1-цепи Ig
<400> 159
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 160
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Мутантная константная область гамма-1-цепи Ig
<400> 160
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 161
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Константная область каппа-цепи Ig
<400> 161
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 162
<211> 105
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Константная область лямбда-цепи Ig
<400> 162
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 163
<211> 96
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKV6-21*01
<220>
<221> другой_признак
<222> (96)..(96)
<223> Xaa может представлять собой любую втречающуюся в природе
аминокислоту
<400> 163
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Xaa
85 90 95
<210> 164
<211> 101
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKV2-28*01
<400> 164
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Thr Pro Pro
100
<210> 165
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKJ4*01
<400> 165
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 166
<211> 98
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGHV-b*01(0-1)
<400> 166
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 167
<211> 96
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность IGKv1-39*01
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
<210> 168
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность тяжелой
цепи huAb13v1
<400> 168
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Tyr Asp Asp Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 169
<211> 214
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность легкой
цепи huAb13v1
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Phe Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Trp Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 170
<211> 447
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность тяжелой
цепи huAb3v2.5
<400> 170
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Glu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 171
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность легкой цепи
huAb3v2.5
<400> 171
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Arg Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 172
<211> 447
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность тяжелой цепи
huAb3v2.6
<400> 172
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Glu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 173
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность легкой цепи
huAb3v2.6
<400> 173
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gln Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 174
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: IGHV1-69*06_IGHJ6
<220>
<221> другой_признак
<222> (99)..(106)
<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту; данная часть представляет собой область CDR-H3
<400> 174
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 175
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: IGKV2-28*01_IGKJ4
<220>
<221> другой_признак
<222> (94)..(102)
<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту; данная часть представляет собой область CDR-L3
<400> 175
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 176
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: IGHV4-b_IGHJ6
<220>
<221> другой_признак
<222> (99)..(105)
<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту; данная часть представляет собой область CDR-H3
<400> 176
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 177
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: IGKV1-39_IGKJ2
<220>
<221> другой_признак
<222> (89)..(97)
<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту; данная часть представляет собой область CDR-L3
<400> 177
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
85 90 95
Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 178
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность вариантов
huAb3VL1
<220>
<221> другой_признак
<222> (33)..(33)
<223> X может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту, за исключением M, C, N, D или Q
<400> 178
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Xaa Gly Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 179
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность вариантов
huAb3VL1
<220>
<221> другой_признак
<222> (34)..(34)
<223> X может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту, за исключением M, C, G, S, N или P
<400> 179
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Xaa Asp Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 180
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность вариантов
huAb3VH1b
<220>
<221> другой_признак
<222> (54)..(54)
<223> X может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту, за исключением M, C, N, D или Q
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Xaa Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 181
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: Аминокислотная последовательность вариантов
huAb3VH1b
<220>
<221> другой_признак
<222> (55)..(55)
<223> X может представлять собой любую встречающуюся в природе
аминокислоту, за исключением M, C, G, S, N или P
<400> 181
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile His Pro Asp Xaa Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 182
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая: аминокислотная последовательность CDR3 VL chAb13
<400> 182
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ПРОМЕЖУТОЧНОЕ СОЕДИНЕНИЕ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2800137C1 |
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2013 |
|
RU2776489C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО-ПРОИЗВОДНОЕ ПИРРОЛОБЕНЗОДИАЗЕПИНА | 2018 |
|
RU2820928C2 |
| ПИРРОЛОБЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2736725C1 |
| АНТИТЕЛА К ТИКАГРЕЛОРУ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ | 2015 |
|
RU2754468C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО К B7H3-АНАЛОГ ЭКЗАТЕКАНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ | 2019 |
|
RU2785664C2 |
| КОНЬЮГАТ АНТИТЕЛА К КЛАУДИНУ И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2826119C1 |
| КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2781444C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ 3-(5-ГИДРОКСИ-1-ОКСОИЗОИНДОЛИН-2-ИЛ) ПИПЕРИДИН-2,6-ДИОНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С БЕЛКОМ С "ЦИНКОВЫМИ ПАЛЬЦАМИ" 2 (IKZF2) СЕМЕЙСТВА IKAROS | 2019 |
|
RU2797559C2 |
| N1/N2-ЛАКТАМНЫЕ ИНГИБИТОРЫ АЦЕТИЛ-КоА-КАРБОКСИЛАЗ | 2011 |
|
RU2540337C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат анти-hB7-H3 антитела и лекарственного средства для ингибирования Bcl-xL (варианты). В одном из вариантов реализации антитело представляет собой антитело IgG1 против hB7-H3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, и домен CDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, и домен CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37. Изобретение расширяет арсенал средств для ингибирования Bcl-xL. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 29 табл., 22 пр.
1. Конъюгат анти-hB7-H3 антитела и лекарственного средства для ингибирования Bcl-xL следующей структуры:
где Ab представляет собой антитело IgG1 против hB7-H3, содержащее
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:35, домен CDR2 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:34, и домен CDR1 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:33; и
вариабельную область легкой цепи, содержащую домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:39, домен CDR2 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:38, и домен CDR1 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37; и
где m равно 2.
2. Конъюгат анти-hB7-H3-антитела и лекарственного средства для ингибирования Bcl-xL со следующей структурой:
где Ab представляет собой антитело IgG1 против hB7-H3, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:147, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:144; и
где m равно 2.
3. Конъюгат анти-hB7-H3 антитела и лекарственного средства для ингибирования Bcl-xL следующей структуры:
где Ab представляет собой антитело IgG1 против hB7-H3, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:168, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:169; и
где m равно 2.
| US 8802091 B2, 12.08.2014 | |||
| WO 2016094505 A1, 16.06.2016 | |||
| Steven R Leong et al | |||
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| СПЕЦИФИЧЕСКИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ АГЕНТЫ ПРОТИВ В7-Н1 | 2010 |
|
RU2571204C2 |
