АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА-ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD123, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

Ссылка на список последовательностей

Эта заявка подана в электронной форме по EFS сети и включает представленный в электронной форме список последовательностей в формате.txt. Файл.txt содержит список последовательностей с именем "PC72333_SEQ_LIST_ST25.txt", созданный 27 октября 2017 года и имеющий размер 78 КБ. Список последовательностей, содержащийся в этом файле.txt, является частью описания и включен в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, например полноразмерным антителам, специфично связывающимся с CD123. Изобретение также относится к конъюгатам (например, конъюгатам антитела-лекарственного средства или "ADC"), включающим антитела к CD123, к композициям, включающим антитела к CD123 или их конъюгаты, и к способам применения антител к CD123 или их конъюгатов для лечения состояний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CD123 (например, рака).

Уровень техники

CD123 представляет собой альфа-цепь рецептора интерлейкина-3 (IL-3Rα или IL3RAa), которая образует гетеродимер с общей бета-цепью CD131, способствуя передаче сигнала IL-3. Биологическая роль IL-3 заключается в стимуляции выживания и пролиферации мультипотентных клеток. Считается, что CD123 участвует в стимуляции пролиферации клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и выполняет прямую функцию в биологии опухоли. CD123 часто экспрессируется на лейкозных стволовых клетках (ЛСК), популяции клеток, ассоциированной с рецидивом у пациентов. В нормальных тканях человека экспрессия CD123 в основном ограничена гемопоэтическими клетками, в частности, плазмоцитоидными дендритными клетками (пДК), которые составляют <0,4% мононуклеарных клеток периферической крови у человека. В качестве компонентов врожденного иммунитета, пДК продуцируют большое количество интерферонов 1 типа (IFN-α/β) в ответ на вирусные и бактериальные стимулы. Важно отметить то, что CD123 не экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках.

Ожидается, что новые случаи лейкоза, лимфомы и миеломы будут составлять 10,2 процента от 1688780 новых случаев рака, диагностированных в США в 2017 году. CD123 экспрессируется на раковых клетках при различных гемобластных неопластических заболеваниях, включая острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), при котором его экспрессия составляет >80%. Примеры гемобластных раковых клеток, которые экспрессируют CD123, включают бласты и лейкозные стволовые клетки. Заболевания, связанные с экспрессией CD123, включают ОМЛ, миелодиспластический синдром (МДС; низкого и высокого риска), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ, все подтипы), диффузную B-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) и неоплазию из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (БПДКН).

В настоящее время терапия таких заболеваний включает более 50 разных лекарственных средств, другие лекарственные средства находятся в стадии изучения и проходят клинические исследования. Лучевая терапия также обычно используется для лечения рака крови, а иногда ее назначают вместе с лекарственной терапией. Также используется иммунотерапия, генотерапия и индивидуальная медицина. Впрочем, эти терапии могут вызывать значительные побочные эффекты и нежелательные реакции. Таким образом, существует необходимость в новых и улучшенных способах лечения гемобластных неоплазий, экспрессирующих CD123 (IL-3Rα).

Сущность изобретения

Изобретение, раскрытое в настоящем документе, направлено на антитела, которые связываются с CD123, и конъюгаты, такие как конъюгаты антитела-лекарственного средства (ADC), содержащие антитела, которые связываются с CD123, а также способы получения и применения таких антител и ADC для лечения нарушений.

В настоящем документе предложены антитела, которые специфично связываются с CD123. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с CD123, где антитело содержит: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую три определяющих комплементарность области (CDR-области) VH, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6, 24, 32, 44, 51 или 64, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую три CDR-области VL, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:17, 28, 39, 48, 57 или 71. В некоторых вариантах осуществления VH может включать: (i) CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, 33, 52 или 65; (ii) CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, 25, 34, 45, 53 или 66; и (iii) CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, 35, 46 или 67. В некоторых вариантах осуществления VL область может включать: (i) CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18, 40, 58 или 72; (ii) CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19, 42, 60 или 74; и (iii) CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20, 42, 60 или 74. В некоторых вариантах осуществления VH может включать: (i) CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; (ii) CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:25; и (iii) CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9. В некоторых вариантах осуществления VL может включать: (i) CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18; (ii) CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:19; и (iii) CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20. В некоторых вариантах осуществления VH может включать последовательность, показанную в SEQ ID NO:24, или ее вариант с одной или более консервативными аминокислотными заменами остатков, которые не присутствуют в CDR, и/или VL может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:28, или ее вариант с одной или более аминокислотными заменами аминокислот, которые не присутствуют в CDR. В некоторых вариантах осуществления антитело может включать легкую цепь, содержащую последовательность, показанную в SEQ ID NO:30, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, показанную в SEQ ID NO:27.

Также предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с CD123 и включает вариабельную область тяжелой цепи, полученную с вектора экспрессии с рег. номером ATCC PTA-124283, и вариабельную область легкой цепи, полученную с вектора экспрессии с рег. номером ATCC PTA-124284.

Также предложены выделенные антитела, которые специфично связываются с CD123 и конкурирующие за связывание с CD123 с антителом, включающим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую три CDR-области VH, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 24, 32, 44, 51 или 64; и VL, содержащую три CDR-области VL, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, 28, 39, 48, 57 или 71.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 25 и 9, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:33, 34 и 35, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:40, 41 и 42.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:33, 45 и 46, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:40, 41 и 42.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:52, 53 и 54, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:58, 59 и 60.

Также предложены выделенные антитела к CD123, содержащие VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:65, 66 и 67, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:72, 73 и 74.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD123, как описано в настоящем документе, могут включать ацилдонорную глутаминсодержащую метку, рекомбинантно введенную на определенном сайте. В некоторых вариантах осуществления метка может включать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO:77), LLQG (SEQ ID NO:78), LSLSQG (SEQ ID NO:79), GGGLLQGG (SEQ ID NO:80), GLLQG (SEQ ID NO:81), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO:82), GLLQGGG (SEQ ID NO:83), GLLQGG (SEQ ID NO:84), GLLQ (SEQ ID NO:85), LLQLLQGA (SEQ ID NO:86), LLQGA (SEQ ID NO:87), LLQYQGA (SEQ ID NO:88), LLQGSG (SEQ ID NO:89), LLQYQG (SEQ ID NO:90), LLQLLQG (SEQ ID NO:91), SLLQG (SEQ ID NO:92), LLQLQ (SEQ ID NO:93), LLQLLQ (SEQ ID NO:94), LLQGR (SEQ ID NO:95), LLQGPP (SEQ ID NO:96), LLQGPA (SEQ ID NO:97), GGLLQGPP (SEQ ID NO:98), GGLLQGA (SEQ ID NO:99), LLQGPGK (SEQ ID NO:100), LLQGPG (SEQ ID NO:101), LLQGP (SEQ ID NO:102), LLQP (SEQ ID NO:103), LLQPGK (SEQ ID NO:104), LLQAPGK (SEQ ID NO:105), LLQGAPG (SEQ ID NO:106), LLQGAP (SEQ ID NO:107) и LLQLQG (SEQ ID NO:108). В некоторых вариантах осуществления глутаминсодержащей меткой является LLQG (SEQ ID NO:78).

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD123, как описано в настоящем документе, могут включать аминокислотную модификацию в положении 222, 340 или 370. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная модификация может быть заменой лизина на аргинин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотной модификацией может быть K222R.

В некоторых вариантах осуществления антитела к CD123, как описано в настоящем документе, могут включать линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть расщепляемым. В некоторых вариантах осуществления линкер может быть выбран из группы, состоящей из Ac-Lys-Gly (ацетил-лизин-глицина), аминокапроновой кислоты, Ac-Lys-β-Ala (ацетил-лизин-β-аланина), амино-ПЭГ2 (полиэтиленгликоль)-C2, амино-ПЭГ3-C2, амино-ПЭГ6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин п-аминобензилоксикарбонила), амино-ПЭГ6-C2-Val-Cit-PABC, аминокапроил-Val-Cit-PABC, [(3R,-5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)-этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, путресцина и Ac-Lys-путресцина. В некоторых вариантах осуществления линкером может быть Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил).

В некоторых вариантах осуществления антитело, как описано в настоящем документе, включает константную область. В некоторых вариантах осуществления антитело является гуманизированным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к субклассу IgG1, IgG2 или IgG2Δa, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело является IgG1 антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит мутацию N60G.

Также предложены конъюгаты, которые включают антитело к CD123, как описано в настоящем документе, конъюгированное со средством. В некоторых вариантах осуществления средство может быть выбрано из группы, состоящей из цитотоксического средства, иммуномодулирующего средства, визуализирующего средства, терапевтического белка, биополимера и олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления средство может быть цитотоксическим средством. В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство может быть выбрано из группы, состоящей из антрациклина, ауристатина, камптотецина, комбрестатина, CBI-димера, циклопропилпирролоиндолин (CPI)-димера, CTI-димера, доластатина, дуокармицина, ендиина, гелданамицина, димера индолинобензодиазепина, майтанзина, пуромицина, димера пирролобензодиазепина, таксана, алкалоида барвинка, тубулизина, гемиастерлина, сплайсеостатина, пладиенолида и их стереоизомеров, изостеров, аналогов или производных. В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство может быть CPI-димером. В некоторых вариантах осуществления CPI-димером является CPI-8314. В некоторых вариантах осуществления CPI-димер может иметь следующую структуру:

.

В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство может иметь название по ИЮПАК: (8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(1S)-1-(хлорметил)-5-гидрокси-8-метил-1,6-дигидропирроло-[3,2-e]индол-3(2H)-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)-карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ил-дигидрофосфат. В некоторых вариантах осуществления цитотоксическим средством может быть C31H31Cl2N4O7P или фармацевтически приемлемая соль или сольват. В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство может находиться в форме соли трифторуксусной кислоты (ТФУ): C31H31Cl2N4O7P⋅C2HF3O2.

В других вариантах осуществления цитотоксическим средством может быть MMAD (монометилауристатин D), 0101 (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]-пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), 3377 (N,2-диметилаланил-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-карбоксил-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-2-метокси-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил}-N-метил-L-валинамид), 0131 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид) или 0121 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид).

В некоторых вариантах осуществления конъюгат может включать формулу: антитело-(ацил-донорная глутамин-содержащая метка)-(линкер)-(цитотоксическое средство). В некоторых вариантах осуществления ацил-донорная глутамин-содержащая метка может включать аминокислотную последовательность LLQG (SEQ ID NO:78), а линкер может включать ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил. В некоторых вариантах осуществления ацил-донорная глутамин-содержащая метка может быть встроена в антитело в положении E294-N297. В некоторых вариантах осуществления конъюгат может дополнительно включать аминокислотную замену лизина на аргинин в положении 222 антитела согласно нумерации по EU-индексу Кэбата (K222R).

Также предложены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество антитела к CD123, описанного в настоящем документе, или ADC к CD123, описанного в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

Также предложены выделенные полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к CD123, описанное в настоящем документе. Также предложены векторы, которые включают такие полинуклеотиды.

Также предложены выделенные клетки-хозяева, которые рекомбинантно продуцируют любое из антител к CD123, описанных в настоящем документе. Также предложены способы получения антитела, содержащие культивирование таких клеток-хозяев при условиях, приводящих к продукции антитела, и выделения антитела из клеток-хозяев или культуры.

Также предложены способы лечения состояния, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD123, у индивида, содержащие введение больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей любое из антител к CD123, описанных в настоящем документе, или конъюгат любого из антител, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления состоянием является рак. В некоторых вариантах осуществления рак может быть раком, выбранным из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), неоплазии из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (БПДКН), волосатоклеточного лейкоза, B-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), множественной миеломы, злокачественной плазмоклеточной неоплазии, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, плазмоклеточного лейкоза, плазмоцитомы, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, B-лимфобластной лимфомы из клеток-предшественников, миелоидного лейкоза, макроглобулинемии Вальденстрема, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы лимфатической ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимической) В-крупноклеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной B-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой В-крупноклеточной лимфомы, первичной эффузионной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, B-крупноклеточной лимфомы с большим количеством Т-клеток/гистиоцитов, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной диффузной B-крупноклеточной лимфомы кожи (ножного типа), ВЭБ-положительной диффузной B-крупноклеточной лимфомы у пожилых, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, связанной с воспалением, внутрисосудистой B-крупноклеточной лимфомы, ALK-положительной B-крупноклеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, B-крупноклеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, неклассифицируемой B-клеточной лимфомы с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и лимфомы Беркитта, неклассифицируемой B-клеточной лимфомы с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и классической лимфомы Ходжкина и другой ассоциированной с B-клетками лимфомы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ОМЛ.

Также предложены способы ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, содержащие введение больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей любое из антител к CD123, предложенных в настоящем документе, или конъюгат любого из антител и фармацевтически приемлемый носитель.

Также предложены способы ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123 у индивида, включающий введение больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей любое из антител к CD123, предложенных в настоящем документе, или конъюгат любого из антител и фармацевтически приемлемый носитель.

Также предложены способы стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, включающий введение больному терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, включающей любое из антител к CD123, предложенных в настоящем документе, или конъюгат любого из антител и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте изобретения предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для лечения состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), ассоциированного с экспрессией CD123 у больного. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции) включает антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции) включает антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123.

В другом аспекте изобретения предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для применения в лечении состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), связанного с экспрессией CD123 у больного. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123.

В другом аспекте изобретения предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для лечения состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), ассоциированного с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для ингибирования роста или прогрессирования опухоли. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для ингибировани метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для стимулиряции регрессии опухоли.

Также в настоящем документе предложены способы конъюгирования антитела с AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 (AcLysPABC-CPI-8314). В некоторых вариантах осуществления способ включает получение композиции, включающей антитело и AcLysPABC-CPI-8314 в буфере, включающем 30-100 мМ KPO₄ и 150-200 мМ NaCl; добавление бактериальной трансглутаминазы к композиции; и инкубирование композиции для обеспечения конъюгирования антитела с AcLysPABC-CPI-8314. В некоторых вариантах осуществления pH композиции составляет 7. В некоторых вариантах осуществления композиция включает от 0,5 до 2 единиц (Ед) бактериальной трансглутаминазы на мг антитела. В некоторых вариантах осуществления композиция включает 1 Ед бактериальной трансглутаминазы на мг антитела. В некоторых вариантах осуществления AcLysPABC-CPI-8314 присутствует в 10-кратном молярном избытке по отношению к антителу. В некоторых вариантах осуществления композицию инкубируют при 25°C в течение ночи при постоянном перемешивании. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно включает 7,5% (об/об) диметилсульфоксида (ДМСО). В некоторых вариантах осуществления буфер включает 30 мМ KPO₄ и 150 мМ NaCl. В некоторых вариантах осуществления буфер включает 100 мМ KPO⁴ и 200 мМ NaCl. В некоторых вариантах осуществления антитело является противоопухолевым антителом. В некоторых вариантах осуществления противоопухолевое антитело является антителом к CD123.

Краткое описание фигур/чертежей

На ФИГ. 1 показаны результаты Вестерн-блот анализа клеток, обработанных IL-3 с антителом ("Ab"). 7G3 представляет собой исходное антитело, а 3D1, 18G3 и 16D6 являются антителами к CD123; 8.8 представляет собой антитело отрицательного контроля, которое не связывает CD123. Исследовали уровни STAT5, фосфорилированного STAT5 и актина.

На ФИГ. 2 показан репрезентативный анализ с помощью проточной цитометрии, демонстрирующий процент опухолевых клеток, остающихся в периферической крови (график слева) и костном мозге (график справа) в модели на животных после лечения растворителем или CD123-ADC (CD123-18G3-CPI).

На ФИГ. 3 показан график, на котором обобщенно представлена длительность выживания (в днях) животных, получавших растворитель или ADC к CD123 в указанных дозах.

Подробное описание

В изобретении, раскрытом в настоящем документе, предложены антитела и конъюгаты антитела-лекарственного средства (ADC), которые специфично связываются с CD123 (например, CD123 человека). В изобретении также предложены полинуклеотиды, кодирующие такие антитела, композиции, содержащие такие антитела, и способы получения и применения этих антител. В изобретении также предложены способы лечения нарушений, связанных с экспрессией CD123 у индивида, таких как рак или аутоиммунное заболевание.

Общие методики

При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии (включая рекомбинантные методы), микробиологии, цитологии, биохимии и иммунологии, которые известны в уровне техники. Такие методы полностью описаны в литературе, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Определения

"Антитело" является молекулой иммуноглобулина, способной к специфичному связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., по меньшей мере посредством одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. При использовании в настоящем документе термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их антигенсвязывающие фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела (содержащие, например, антитела акул и верблюдовых), и слитые белки, содержащие антитело и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена. Антитело содержит антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их субкласс), при этом антитело не должно обязательно относиться к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела иммуноглобулины могут подразделяться на различные классы. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, при этом некоторые из них могут также подразделяться на субклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" или "часть связывания антигена" антитела при использовании в настоящем документе относится к одному или более фрагментам интактного антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с данным антигеном (например, CD123). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, включают Fab; Fab'; F(ab')₂; Fd-фрагмент, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и CH1 доменов; Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного плеча антитела; однодоменный фрагмент антитела (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) и выделенную область, определяющую комплементарность (CDR).

Антитело, ADC или полипептид, которые "предпочтительно связываются" или "специфично связываются" (используемые попеременно в настоящем документе) с мишенью (например, белком CD123) является термином, хорошо известным в уровне техники, и способы определения такого специфичного или предпочтительного связывания также известны в уровне техники. Говорят, что молекула демонстрирует "специфичное связывание" или "предпочтительное связывание", если она реагирует или ассоциирует чаще, быстрее, с большей длительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело "специфично связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем с другими веществами. Например, антитело, которое специфично или предпочтительно связывается с эпитопом CD123, является антителом, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей длительностью, чем с другими эпитопами CD123 или эпитопами не CD123. Также следует понимать, что при прочтении этого определения, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое специфично или предпочтительно связывается с первой мишенью, может не связываться специфично или предпочтительно со второй мишенью. В таком качестве "специфичное связывание" или "предпочтительное связывание" не требует обязательно (хотя оно может включать) исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает предпочтительное связывание.

"Вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации. Как известно в уровне техники, вариабельные области тяжелой и легкой цепи состоят из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя определяющими комплементарность областями (CDR-областями), также известными как гипервариабельные области. CDR-области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости FR-областями, при этом CDR-области другой цепи способствуют формированию антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере два способа определения CDR-областей: (1) подход на основе межвидовой вариабельности последовательностей (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход на основе кристаллографических исследований комплексов антигена-антитела (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). При использовании в настоящем документе CDR может относиться к CDR-областям, определенным с помощью одного из двух способов или комбинации обоих способов.

"CDR" вариабельного домена представляет собой аминокислотные остатки в вариабельной области, которые идентифицированы в соответствии с определениями Кэбата, Чотиа, комбинации определений Кэбата и Чотиа, AbM, контактным и/или конформационным определениями или любым способом определения CDR, известным в уровне техники. CDR-области антител могут идентифицированы как гипервариабельные области, первоначально определенные Кэбатом с соавт. См., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Положения CDR-областей также можно идентифицировать как структурные петлевые структуры, первоначально описанные Чотиа с соавт. См., например, Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989. Другие методы определения CDR включают "определение AbM", которое представляет собой компромисс между определениями Кэбата и Чотиа и создано при использовании программы Oxford Molecular's AbM antibody modeling (в настоящее время Accelrys®), или "контактное определение" CDR-областей на основе наблюдаемых контактов с антигеном, изложенное в публикации MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. В другом подходе, называемом в настоящем документе "конформационным определением" CDR-областей, положения CDR-областей могут быть определены как остатки, которые определяют изменение энтальпии при связывании с антигеном. См., например, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Другие определения границ CDR могут не строго соответствовать одному из вышеуказанных методов, но, тем не менее, будут перекрываться, по меньшей мере частично, с CDR-областями по Кэбату, хотя они могут быть укорочены или удлинены с учетом данных прогнозирования или экспериментальных результатов, согласно которым конкретные остатки или группы остатков или даже целые CDR-области не оказывают значимого влияния на связывание с антигеном. При использовании в настоящем документе CDR может относиться к CDR-областям, определенным с помощью любого метода, известного в данной области техники, в том числе комбинации таких методов. Способы, используемые в настоящем документе, могут использовать CDR, определенные в соответствии с любым из этих методов. Для любого конкретного варианта осуществления, содержащего больше одной CDR, CDR могут быть определены в соответствии с любым из определений Кэбата, Чотиа, расширенного, AbM, контактного и/или конформационного.

Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем документе попеременно для обозначения цепей аминокислот любой длины, предпочтительно, относительно коротких (например, 10-100 аминокислот). Цепь может быть линейной или разветвленной, она может включать модифицированные аминокислоты и/или может быть прервана неаминокислотами. Данные термины также охватывают аминокислотную цепь, которая была модифицирована естественным путем или в результате вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидирование, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгирование с метящим компонентом. Также в рамках определения включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (в том числе, например, неприродных аминокислот и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Следует понимать, что полипептиды могут существовать в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей.

Антитела согласно изобретению могут быть получены с помощью способов, известных в уровне техники, например, рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, технологии синтеза или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных в уровне техники (см., например, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 и Fellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007).

Как известно в уровне техники, "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", попеременно используемые в настоящем документе, относятся к цепям нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в цепь ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды, и их аналоги. В случае присутствия, модификация структуры нуклеотида может быть сделана до или после сборки цепи. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть также изменен после полимеризации, например, при конъюгировании метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или более природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с созданием незаряженных связей (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и заряженных связей (например, фосфотиоаты, фосфодитиоаты и т.д.), модификации с введением боковых групп, таких как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации с включением интеркаляторов (например, акридина, псоралена и т.д.), модификации с включением хелатообразователей (например, металлов, радиоактивных металлов, бора, окислительных металлов и т.д.), модификации с включением алкилирующих соединений, модификации с созданием модифицированных связей (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5' и 3'-концевой OH может быть фосфорилирован или замещен аминами или остатками органических кэпирующих групп длиной от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть дериватизированы стандартными защитными группами. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы сахаров рибозы или деоксирибозы, которые общеизвестны в уровне техники, в том числе, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибоза, карбоциклические аналоги сахаров, альфа- или бета-аномерные сахарв, эпимерные сахарв, такой как арабиноза, ксилозы или ликсозы, производные пиранозы, производные фуранозы, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидаов, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными соединительными группами. Такие альтернативные соединительные группы включают, без ограничения, варианты осуществления, где фосфат заменен P(O)S ("тиоатом"), P(S)S ("дитиоатом"), (O)NR₂ ("амидатом"), P(O)R, P(O)OR', CO или CH₂ ("формацеталем"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть обязательно идентичными. Предыдущее описание относится ко всем полинуклеотидам, указанным в настоящем документе, включая РНК и ДНК.

Как известно в уровне техники "константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, отдельно или в комбинации.

При использовании в настоящем документе "по существу чистый" относится к материалу, который является по меньшей мере на 50% чистым (т.е. не содержит примеси), более предпочтительно, чистым по меньшей мере на 90%, более предпочтительно, чистым по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно чистым по меньшей мере на 98%, и наиболее предпочтительно чистым по меньшей мере на 99%.

"Клетка-хозяин" включает отдельную клетку или культуру клеток, которая может быть или была реципиентом вектора(ов) для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, причем потомство может не быть полностью идентичным (по морфологии или комплементу геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или искусственной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) настоящего изобретения.

Как известно в уровне техники термин "Fc-область" используется для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. "Fc-область" может быть Fc-областью с нативной последовательностью или вариантной Fc-областью. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут изменяться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека, как обычно определяют, простирается от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до ее C-конца. Нумерация остатков в Fc-области соответствует нумерации EU-индекса, как в публикации Кэбата, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc-область иммуноглобулина обычно включает две константных области, CH2 и CH3.

Термин "конкурирует" при использовании в настоящем документе в отношении антитела означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (или его часть) связывается с эпитопом в достаточной степени подобно связыванию второго антитела или его антигенсвязывающей части, при этом результат связывания первого антитела с его когнатным эпитопом заметно снижается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Может, но не должен обязательно, иметь место альтернативный случай, когда связывание второго антитела с его эпитопом также заметно снижается в присутствии первого антитела. То есть первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако в случаях, когда каждое антитело ингибирует с возможностью обнаружения связывание другого антитела с его когнатным эпитопом или лигандом, в одинаковой, большей или меньшей степени, антитела считаются "перекрестно конкурирующими" друг с другом за связывание с их соответствующим эпитопом(ами). Как конкурирующие, так и перекрестно конкурирующие антитела охвачены настоящим изобретением. Независимо от механизма, посредством которого осуществляется такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, стерическое затруднение, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его частью), специалист в данной области техники сумеет оценить на основе представленных в настоящем документе принципов, что такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела охвачены и могут быть полезными для способов, раскрытых в настоящем документе.

"Fc-область с нативной последовательностью" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, существующей в природе. "Вариантная Fc-область" включает аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности Fc-области с нативной последовательностью в результате присутствия по меньшей мере одной аминокислотной модификации, но при этом она сохраняет по меньшей мере одну эффекторную функцию Fc-области с нативной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариантная Fc-область имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с Fc-областью с нативной последовательностью или Fc-областью исходного полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области исходного полипептида. Вариантная Fc-область в настоящем документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности с Fc-областью с нативной последовательностью и/или с Fc-областью исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с ними, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с ними.

При использовании в настоящем документе термин "CD123" относится к любой форме CD123 и их вариантам, сохраняющим по меньшей мере часть активности CD123. Если не указано иное, например, при определенной ссылке на CD123 человека, CD123 включает CD123 всех видов млекопитающих с нативной последовательностью, например, человека, псовых, кошачих, лошадиных и бычьих. Примеры последовательностей CD123 показаны в Таблице 1.

Таблица 1

SEQ ID NO: ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 1 CD123 человека, длинная изоформа (сигнальный пептид подчеркнут) Metdtlllwvlllwvpgstg
tkedpnppitnlrmkakaqqltwdlnrnvtdiecvkdadysmpavnnsycqfgaislcevtnytvrvanppfstwilfpensgkpwagaenltcwihdvdflscswavgpgapadvqydlylnvanrrqqyeclhyktdaqgtrigcrfddisrlssgsqsshilvrgrsaafgipctdkfvvfsqieiltppnmtakcnkthsfmhwkmrshfnrkfryelqiqkrmqpviteqvrdrtsfqllnpgtytvqirarervyeflsawstpqrfecdqeegantrawrtsllialgtllalvcvfvicrrylvmqrlfpriphmkdpigdsfqndklvvweagkagleeclvtevqvvqkt 2 CD123 человека, длинная изоформа ECD с Flag и Avi метками (сигнальный пептид и метки подчеркнуты) Metdtlllwvlllwvpgstg
tkedpnppitnlrmkakaqqltwdlnrnvtdiecvkdadysmpavnnsycqfgaislcevtnytvrvanppfstwilfpensgkpwagaenltcwihdvdflscswavgpgapadvqydlylnvanrrqqyeclhyktdaqgtrigcrfddisrlssgsqsshilvrgrsaafgipctdkfvvfsqieiltppnmtakcnkthsfmhwkmrshfnrkfryelqiqkrmqpviteqvrdrtsfqllnpgtytvqirarervyeflsawstpqrfecdqeegantrawr
GGPPDYKDDDDKGGGLNDIFEAQKIEWHE 3 CD123 человека, короткая изоформа (сигнальный пептид подчеркнут) Metdtlllwvlllwvpgstg
tkegkpwagaenltcwihdvdflscswavgpgapadvqydlylnvanrrqqyeclhyktdaqgtrigcrfddisrlssgsqsshilvrgrsaafgipctdkfvvfsqieiltppnmtakcnkthsfmhwkmrshfnrkfryelqiqkrmqpviteqvrdrtsfqllnpgtytvqirarervyeflsawstpqrfecdqeegantrawrtsllialgtllalvcvfvicrrylvmqrlfpriphmkdpigdsfqndklvvweagkagleeclvtevqvvqkt 4 CD123 яванского макака, ECD с Flag и Avi метками (сигнальный пептид и метки подчеркнуты) metdtlllwvlllwvpgstgq
TKEDPNAPIRNLRMKEKAQQLMWDLNRNVTDVECIKGTDYSMPAMNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVASPPFSTWILFPENSGTPRAGAENLTCWVHDVDFLSCSWVVGPAAPADVQYDLYLNNPNSHEQYRCLHYKTDARGTQIGCRFDDIARLSRGSQSSHILVRGRSAAVSIPCTDKFVFFSQIERLTPPNMTGECNETHSFMHWKMKSHFNRKFRYELRIQKRMQPVRTEQVRDTTSFQLPNPGTYTVQIRARETVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGASSRAWRGGPPDYKDDDDKGGGLNDIFEAQKIEWHE

При использовании в настоящем документе "антитело к CD123" относится к антителу, которое специфично связывается с CD123 и модулирует биологическую активность и/или нижестоящее событие(я), опосредуемое CD123. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 является антагонистическим антителом. Антагонистические антитела к CD123 охватывают антитела, блокирующие, антагонистически воздействующие, подавляющие или уменьшающие (в любой степени, в том числе значимо) биологическую активность CD123, включая нижестоящие события, опосредуемые CD123, такие как, например, связывание IL-3 и/или нижестоящую сигнализацию, фосфорилирование STAT5 и выживание мультипотентных клеток. Примеры антител к CD123 и конъюгатов антитела-лекарственного средства к CD123 ("ADC к CD123") представлены в настоящем документе.

При использовании в настоящем документе "лечение" является методом получения полезных или требуемых клинических результатов. В рамках настоящего изобретения полезные или требуемые клинические результаты включают, без ограничения перечисленными, одно или более следующего: снижение пролиферации (или разрушение) неопластических или раковых клеток, ингибирование метастазирования неопластических клеток, ремиссию ассоциированного с CD123 заболевания (например, рака или аутоиммунного заболевания), уменьшение симптомов, возникших в результате ассоциированного с CD123 заболевания (например, рака или аутоиммунного заболевания), повышение качества жизни лиц, которые страдают ассоциированным с CD123 заболеванием (например, раком или аутоиммунным заболеванием), уменьшение дозы других лекарственных средств, требуемых для лечения ассоциированного с CD123 заболевания (например, рака или аутоиммунного заболевания), задержку развития ассоциированного с CD123 заболевания (например, рака или аутоиммунного заболевания), излечение ассоциированного с CD123 заболевания (например, рака или аутоиммунного заболевания) и/или увеличение выживаемости субъектов, имеющих ассоциированное с CD123 заболевание (например, рак или аутоиммунное заболевание).

"Уменьшение тяжести" означает облегчение или улучшение одного или более симптомов по сравнению с отсутствием введения антитела к CD123 или ADC к CD123. "Уменьшение тяжести" также включает уменьшение или сокращение длительности симптома.

При использовании в настоящем документе "эффективная доза" или "эффективное количество" лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции является количеством, достаточным, чтобы вызвать один или более полезных или требуемых результатов. В случае профилактического применения полезные или требуемые результаты включают устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или задержку возникновения заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, проявляющихся в процессе развития заболевания. В случае терапевтического применения полезные или требуемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение частоты или ослабление одного или более симптомов различных заболеваний или состояний, связанных с CD123 (таких как, например, без ограничения, рак), уменьшение дозы других лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания, усиление действия другого лекарственного средства и/или задержку прогрессирования ассоциированного с CD123 заболевания у субъектов. Эффективная доза может быть введена в одном или более введениях. В рамках настоящего изобретения эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции является количеством, достаточным для осуществления профилактического или терапевтического лечения, прямо или косвенно. Как понятно в клиническом контексте, эффективная доза лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнута или может не быть достигнута в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективная доза" может рассматриваться в контексте введения одного или более терапевтических средств, при этом можно считать, что одно средство вводят в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими средствами может быть достигнут или достигается требуемый результат.

"Индивид" или "субъект" являются млекопитающим, более предпочтительно человеком. Млекопитающие также включают, без ограничения перечисленными, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс.

При использовании в настоящем документе "вектор" означает конструкцию, которая способна обеспечивать доставку и, предпочтительно, экспрессию одного или более генов или последовательностей, представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, без ограничения перечисленными, вирусные векторы, голые ДНК или РНК-векторы экспрессии, плазмидные, космидные или фаговые векторы, ДНК или РНК-векторы экспрессии, ассоциированные с катионными конденсирующими веществами, ДНК или РНК-векторы экспрессии, инкапсулированные в липосомах, а также некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

При использовании в настоящем документе, "последовательность контроля экспрессии" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность контроля экспрессии может быть промотором, таким как конститутивный или индуцируемый промотор или энхансер. Последовательность контроля экспрессии функционально связана с транскрибируемой последовательностью нуклеиновой кислоты.

При использовании в настоящем документе "фармацевтически приемлемый носитель" или "фармацевтическое приемлемое вспомогательное вещество" включает любой материал, который при объединении с активным ингредиентом позволяет ему сохранять биологическую активность и не вызывает реакций с иммунной системой субъекта. Примеры включают, без ограничения перечисленными, любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буфер, воду, эмульсии, такие как эмульсию масло/вода и различные типы смачивающих веществ. Предпочтительными разбавителями для аэрозоля или парентерального введения являются фосфатно-солевой буфер (PBS) или физиологический (0,9%) раствор. Композиции, содержащие такие носители, изготавливают хорошо известными стандартными методами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; и Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005).

Термин "ацил-донорная глутамин-содержащая метка" или "глутаминовая метка" при использовании в настоящем документе относится к полипептиду или белку, содержащему один или более остатков Gln, которые действуют как акцептор амина для трансглутаминазы. См., например, публикацию PCT WO2012059882 и WO2015015448, которые настоящим включены посредством отсылки во всей своей полноте.

Термин "k_on" при использовании в настоящем документе относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном. В частности, константы скорости (k_on и k_off) и равновесные константы диссоциации измеряют с использованием IgG и белков CD123 (например, слитого белка CD123-Fc).

Термин "k_off" при использовании в настоящем документе относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитела/антигена.

Термин "K_D" при использовании в настоящем документе относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитела-антигена.

Ссылка на "приблизительно" при указании значения или параметра в настоящем документе включает (и описывает) варианты осуществления, направленные на такое значение или параметр как таковые. Например, описание в отношении "приблизительно X" включает описание "X". Числовые диапазоны включают в себя числа, определяющие диапазон.

При использовании в настоящем документе CPI относится к 1,2,8,8a-тетрагидроциклопропан[c]пирроло[3,2-e](5H)индол-4-ону или его замещенной или дериватизированной форме. CPI также может относиться к секо-форме CPI или секо-CPI, который также известен как 8-(хлорметил)-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ол, или его замещенной или дериватизированной форме (или формам).

Следует понимать, что во всех случаях, когда варианты осуществления описаны в настоящем документе с использованием формулировки "включающий", также представлены аналогичные в остальной части варианты осуществления, описанные в значениях "состоящий из" и/или "состоящий по существу из".

В тех случаях, когда аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в отношении группы Маркуша или другой группы альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но и каждого члена группы в отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также основную группу за отсутствием одного или более членов группы. В настоящем изобретении также предусматрено прямое исключение одного или более членов группы в заявленном изобретении.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое обычно известно специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. По всему тексту настоящего описания и формулы изобретения слово "включать" или его вариации, такие как "включает" или "включающий", будут подразумевать включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение какого-либо другого целого числа или группы целых чисел. Если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число.

В настоящем документе описаны примерные способы и материалы, хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут использоваться при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения. Материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Антитела к CD123 и конъюгаты антитела-лекарственного средства

В настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются с CD123 (например, CD123 человека (например, SEQ ID NO:1)), и конъюгаты (такие как конъюгаты антитела-лекарственного средства или ADC), содержащие антитело против CD123, отличающиеся любой одной или более следующими особенностями: (a) лечат, предотвращают, облегчают один или более симптомов состояния, связанного со злокачественными клетками, экспрессирующими CD123 у индивида (например, рака, такой как, без ограничения, ОМЛ, В-ОЛЛ, ВКЛ и т.д.); (b) ингибируют рост или прогрессирование опухоли у индивида (который имеет злокачественную опухоль, экспрессирующую CD123); (c) ингибируют метастазирование раковых (злокачественных) клеток, экспрессирующих CD123 у индивида (который имеет одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих CD123); (d) вызывают регрессию (например, долгосрочную регрессию) опухоли, экспрессирующей CD123; и (e) проявляют цитотоксическую активность в злокачественных клетках, экспрессирующих CD123.

Антитела, применимые в настоящем изобретении, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fc и т.д.), химерные антитела, биспецифичные антитела, гетероконъюгаты антител, одноцепочечные фрагменты (ScFv), их мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела (например, доменное антитело), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена, обладающий требуемой специфичностью, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или иметь любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123, как описано в настоящем документе, является моноклональным антителом. Например, антитело к CD123 может быть гуманизированным моноклональным антителом, человеческим антителом или химерным моноклональным антителом.

В некоторых вариантах осуществления антитело может включать модифицированную константную область, такую как, например, без ограничения, константная область, которая обладает повышенным потенциалом к стимуляции иммунного ответа. Например, константная область может быть модифицирована для увеличения аффинности к Fc-гамма-рецептору, такому как, например, FcγRI, FcγRIIA или FcγIII. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит, может включать константную область, которая иммунологически инертна, то есть, обладает сниженным потенциалом к стимуляции иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999; заявке PCT PCT/GB99/01441; и/или заявке на патент UK 98099518. Fc может быть человеческим IgG1, человеческим IgG2, человеческим IgG3 или человеческим IgG4. Fc может быть человеческим IgG2, содержащим мутацию A330P331→S330S331 (IgG2Δa), в котором аминокислотные остатки пронумерованы относительно последовательности IgG2 дикого типа (Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999). В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область IgG4, содержащую следующие мутации (Armour et al., Molecular Immunology 40 585-593, 2003): E233F234L235→P233V234A235 (IgG4Δc), в которой нумерация указана относительно IgG4 дикого типа. В еще одном варианте осуществления Fc является человеческим IgG4 E233F234L235→P233V234A235 с делецией G236 (IgG4Δb). В другом варианте осуществления Fc являются любым Fc человеческого IgG4 (IgG4, IgG4Δb или IgG4Δc), содержащим стабилизирующую мутацию шарнирной области S228→P228 (Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002). В другом варианте осуществления Fc может быть агликозилированным Fc.

В некоторых вариантах осуществления константная область может быть агликозилирована путем мутации остатка в положении присоединения олигосахарида (такого как Asn297) и/или фланкирующих остатков, которые являются частью последовательности распознавания гликозилирования в константной области. В некоторых вариантах осуществления константная область агликозилирована для N-связанного гликозилирования ферментативно. Константная область может быть агликозилирована для N-связанного гликозилирования ферментативно или при экспрессии в дефицитной по гликозилированию клетке-хозяине.

Одним из способов определения аффинности связывания антител к CD123 является измерение аффинности связывания монофункциональных Fab-фрагментов антитела. Для получения монофункциональных Fab-фрагментов антитело (например, IgG) может быть расщеплено папаином или экспрессировано рекомбинантно. Аффинность Fab-фрагмента к CD123 можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (системы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore™ 3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ), оснащенного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным стрептавидином (SA) или Fc против мышиных антител или Fc против человеческих антител с использованием рабочего буфера HBS-EP (0,01 М HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об/об поверхностно-активного вещества P20). Биотинилированный или Fc-слитый человеческий CD123 может быть разведен в буфере HBS-EP до концентрации меньше 0,5 мкг/мл и введен через отдельные каналы чипа с использованием переменного времени контакта с получением двух диапазонов плотности антигена, либо 50-200 единиц ответа (RU) для подробных кинетических исследований, либо 800-1000 RU для скрининговых анализов. Исследования с регенерацией показали, что 25 мМ NaOH в 25% об/об этаноле эффективно удаляет связанный Fab с сохранением активности CD123 на чипе в течение более 200 инъекций. Как правило, серийные разведения (охватывающие концентрации 0,1-10× расчетной K_D) очищенных образцов Fab вводят в течение 1 минуты со скоростью 100 мкл/минута, при этом допускается время диссоциации до 2 часов. Концентрации Fab белков определяют с помощью ИФА и/или электрофореза в ДСН-ПААГ при использовании Fab известной концентрации (определяемой с помощью анализа аминокислот) в качестве стандарта. Кинетические константы ассоциации (k_on) и константы диссоциации (k_off) получают одновременно путем глобальной аппроксимации данных в модели связывания Ленгмюра 1:1 (Ka Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) при использовании программы BIAevaluation. Значения равновесной константы диссоциации (K_D) вычисляют как k_off/k_on. Эта методика подходит для применения при определении аффинности связывания антитела с любым CD123, включая CD123 человека, CD123 другого млекопитающего (такого как CD123 мыши, CD123 крысы или CD123 примата), а также различных форм CD123 (например, гликозилированного CD123). Аффинность связывания антитела обычно измеряют при 25°C, но также ее могут измерять при 37°C. Аффинность связывания (K_D) антитела к CD123, как описано в настоящем документе, с CD123 (таким как CD123 человека (например, SEQ ID NO:1) может составлять от приблизительно 0,002 нМ до приблизительно 6500 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 6500 нМ, 6000 нМ, 5986 нМ, 5567 нМ, 5500 нМ, 4500 нМ, 4000 нМ, 3500 нМ, 3000 нМ, 2500 нМ, 2134 нМ, 2000 нМ, 1500 нМ, 1000 нМ, 750 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 193 нМ, 100 нМ, 90 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 18 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5,5 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,3 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или 0,002 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет меньше чем приблизительно 6500 нМ, 6000 нМ, 5500 нМ, 5000 нМ, 4000 нМ, 3000 нМ, 2000 нМ, 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4,5 нМ, 4 нМ, 3,5 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1 нМ или 0,5 нМ.

Антитела к CD123, как описано в настоящем документе, могут быть получены любым способом, известным в уровне техники. Для получения линий гибридомных клеток схема и график иммунизации животного-реципиента обычно определяют в соответствии с установленными и стандартными методиками стимуляции выработки и продукции антител, как далее описано в настоящем документе. Общие методы получения человеческих и мышиных антител известны в уровне техники и/или описаны в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую три CDR-области VH, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 24, 32, 44, 51 или 64. В некоторых аспектах изобретения антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую три CDR-области VL, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, 28, 39, 48, 57 или 71. В некоторых аспектах изобретения антитело содержит VH, содержащую три CDR-области VH, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 24, 32, 44, 51 или 64, и VL, содержащую три CDR-области VL, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17, 28, 39, 48, 57 или 71. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 25 и 9, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:18, 19 и 20. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:33, 34 и 35, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:40, 41 и 42. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:33, 45 и 46, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:40, 41 и 42. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:52, 53 и 54, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:58, 59 и 60. В других вариантах осуществления антитело к CD123 может включать VH, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:65, 66 и 67, и VL, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:72, 73 и 74.

Репрезентативные вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи антитела к CD123 могут включать аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6, 24, 32, 44, 51 и 64 и SEQ ID NO:17, 28, 39, 48, 57 и 71, соответственно. Репрезентативные тяжелые цепи и легкие цепи антитела к CD123 могут включать аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15, 27, 37, 47, 55 и 69 и SEQ ID NO:23, 30, 43, 49, 62 и 76, соответственно. Репрезентативные последовательности антител к CD123 показаны в Таблице 2.0.

Таблица 2.0 Репрезентативные последовательности антител к CD123

Последовательности тяжелой цепи Последовательности легкой цепи Антитело HC
CDR1 HC
CDR2 HC
CDR3 VH HC LC
CDR1 LC CDR2 LC
CDR3 VL LC 18G3 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:23 h18G3 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:30 16D6 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:43 h16D6 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:49 3D1 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:53 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:51 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:59 SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:62 20D7 SEQ ID NO:65 SEQ ID NO:66 SEQ ID NO:67 SEQ ID NO:64 SEQ ID NO:69 SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:73 SEQ ID NO:74 SEQ ID NO:71 SEQ ID NO:76

Примерные антитела к CD123, представленные в настоящем документе, включают 18G3, гуманизированное 18G3 (h18G3), 16D6, гуманизированное 16D6 (h16D6), 3D1 и 20D7, показанные в Таблице 2.1. Последовательности, показанные в Таблице 2.1, являются аминокислотными последовательностями, если не указано иное.

Таблица 2.1

SEQ ID NO: ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ 5 Нуклеотидная последовательность 18G3 VH CAGGTGAAACTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCGCACAGAGTCTGTCCATTACCTGCACTGTCTCTGGATTCTCATTAACCAGTGGTGACATAAGTTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTTGGAGTAATATGGTCTGGCGGAGGCACAAATTATAATTCTCGTCTCATGTCCAGACTGAGCATCACCAAGGACAACTCCAGGAGTCAAGTGTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACCGCCATATATTATTGTGTAAGAGATTGGGGTAACTTTTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA 6 18G3 VH с подчеркнутыми CDR-областями QVKLKESGPGLVAPAQSLSITCTVSGFSLTSGDISWIRQPPGKGLEWLGVIWSGGGTNYNSRLMSRLSITKDNSRSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRDWGNFYFDYWGQGTTLTVSS 7 18G3 CDRH1 GFSLTSGDIS 8 18G3 CDRH2 VIWSGGGTNYNSRLMS 9 18G3 CDRH3 DWGNFYFDY 10 18G3 JH WGQGTTLTVSS 11 CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 12 Шарнирная область EPKSCDRTHTCPPCP 13 CH2 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 14 CH3 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 15 18G3 HC QVKLKESGPGLVAPAQSLSITCTVSGFSLTSGDISWIRQPPGKGLEWLGVIWSGGGTNYNSRLMSRLSITKDNSRSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRDWGNFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16 Нуклеотидная последовательность 18G3 VL GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAGCAGTGGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACCTGGCAGTTTATTACTGCAGTCAATCTTATAATCTATACACATTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA 17 18G3 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGGGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCSQSYNLYTFGGGTKLEIK 18 18G3 CDRL1 KSSQSLLSSGTRKNYLA 19 18G3 CDRL2 WASTRQS 20 18G3 CDRL3 SQSYNLYT 21 18G3 JK FGGGTKLEIK 22 CL (R)TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 23 18G3 LC DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGGGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCSQSYNLYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 24 h18G3 VH с подчеркнутыми CDR-областями EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGGTNYGSRLMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGNFYFDYWGQGTLVTVSS 25 h18G3 CDRH2 VIWSGGGTNYGSRLMS 26 h18G3 JH WGQGTLVTVSS 27 h18G3 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGGTNYGSRLMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGNFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 28 h18G3 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTFGQGTKLEIK 29 h18G3 JK FGQGTKLEIK 30 h18G3 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 31 Нуклеотидная последовательность 16D6 VH CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATAACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCATTAACCAACTTTGATATAAGTTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTTGGAGTAATGTGGACTGGTGGAGGCACAAATTATAATTCAGCTTTCATGTCCAGACTGAGCATCAGCAGGGACATCTCCAAAAGCCAAGTTTCCTTAAAAATGAGCAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGGGGATACTTACTTCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCCGTCACCGTCTCATCAG 32 16D6 VH с подчеркнутыми CDR-областями QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNFDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSAFMSRLSISRDISKSQVSLKMSSLQTDDTAIYYCVRGDTYFFAMDYWGQGTSVTVSS 33 16D6 CDRH1 GFSLTNFDIS 34 16D6 CDRH2 VMWTGGGTNYNSAFMS 35 16D6 CDRH3 GDTYFFAMDY 36 16D6 JH WGQGTSVTVSS 37 16D6 HC QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNFDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSAFMSRLSISRDISKSQVSLKMSSLQTDDTAIYYCVRGDTYFFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 38 Нуклеотидная последовательность 16D6 VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAGCAGTGGAACCCGAAAGAACTTCTTGTCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGGATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTAAACAATCTTATAATCTATACACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 39 16D6 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKTGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQTEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIK 40 16D6 CDRL1 KSSQSLLSSGTRKNFLS 41 16D6 CDRL2 WASTRGS 42 16D6 CDRL3 KQSYNLYT 43 16D6 LC DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKTGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQTEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 44 h16D6 VH с подчеркнутыми CDR-областями EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNFDISWVRQAPGKGLEWVAVMWTGGGTNYQSAFMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDVYFFAMDYWGQGTLVTVSS 45 h16D6 CDRH2 VMWTGGGTNYQSAFMS 46 h16D6 CDRH3 GDVYFFAMDY 47 h16D6 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNFDISWVRQAPGKGLEWVAVMWTGGGTNYQSAFMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDVYFFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 48 h16D6 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKPGKAPKLLIYWASTRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLYTFGQGTKLEIK 49 h16D6 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKPGKAPKLLIYWASTRGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 50 Нуклеотидная последовательность 3D1 VH GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTGACTACTTCATGAAGTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGACTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGAAACTTTCTACAACCATCATTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACAATAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGACGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCCCGGCGGGGGAATGCTATGGACTTCTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 51 3D1 VH с подчеркнутыми CDR-областями EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSDYFMKWVKQSHGKRLEWIGDINPNNGETFYNHHFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSDDSAVYYCARPRRGNAMDFWGQGTSVTVSS 52 3D1 CDRH1 GYTFSDYFMK 53 3D1 CDRH2 DINPNNGETFYNHHFKG 54 3D1 CDRH3 PRRGNAMDF 55 3D1 HC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSDYFMKWVKQSHGKRLEWIGDINPNNGETFYNHHFKGKATLTIDKSSSTAYMQLNSLTSDDSAVYYCARPRRGNAMDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 56 Нуклеотидная последовательность 3D1 VL GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACCATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGAGGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAATTTCTGGTATATTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTATTTTTGTCAGCAACATTATAGTATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATACAA 57 3D1 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRGNQKNYLAWYQQKPGQSPKFLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIQ 58 3D1 CDRL1 KSSQSLLNRGNQKNYLA 59 3D1 CDRL2 FASTRES 60 3D1 CDRL3 QQHYSIPYT 61 3D1 JK FGGGTKLEIQ 62 3D1 LC DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRGNQKNYLAWYQQKPGQSPKFLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 63 Нуклеотидная последовательность 20D7 VH GAAGTACAGCTGCAGCAGTCTGGGCCCGAGCTTCGGAGACCTGGGACCTCAGTCAAGCTGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACAGTATTACAGATTTCCTTATGTACTGGGTAAAACATAGGCCAGAATACGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACAAAATATGCTCAGAAGTTCCAAAGCAAGGCCCGACTGACTGCAGATACGTCCTCCAAAACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACAGCAACCTATTTTTGTGCTAGATGGGGCTATATCACGGATTATTTCTATGGCGGGTTTACTTACTGGGGCCGAGGCACTCTGGTCACTGTCTCTTCA 64 20D7 VH с подчеркнутыми CDR-областями EVQLQQSGPELRRPGTSVKLSCKASGYSITDFLMYWVKHRPEYGLEWIGWIDPEDGETKYAQKFQSKARLTADTSSKTAYMELSSLTSEDTATYFCARWGYITDYFYGGFTYWGRGTLVTVSS 65 20D7 CDRH1 GYSITDFLMY 66 20D7 CDRH2 WIDPEDGETKYAQKFQS 67 20D7 CDRH3 WGYITDYFYGGFTY 68 20D7 JH WGRGTLVTVSS 69 20D7 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITDFLMYWVRQAPGKGLEWVAWIDPEDGETKYAQKFQSKARFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGYITDYFYGGFTYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 70 Нуклеотидная последовательность 20D7 VL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTCCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAGCTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAATAAGAACTTAGACTGGTATCAGCAAAAGCATGGAGAAGCTCCAAAACTCCTGATATATCATACAAACACTTTGCAAATGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTACGCACTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCCACATATTACTGCTATCAATATAACAGTGGGCCCACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAGA 71 20D7 VL с подчеркнутыми CDR-областями DIQMTQSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWYQQKHGEAPKLLIYHTNTLQMGIPSRFSGSGSGTDYALTITSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELR 72 20D7 CDRL1 KASQNINKNLD 73 20D7 CDRL2 HTNTLQM 74 20D7 CDRL3 YQYNSGPT 75 20D7 JL FGAGTKLELR 76 20D7 LC DIQMTQSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWYQQKHGEAPKLLIYHTNTLQMGIPSRFSGSGSGTDYALTITSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

В вариантах с заменами по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела удален, и другой остаток вставлен на его место. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также предусмотрены изменения в каркасной области. Консервативные замены показаны в Таблице 3 под заголовком "консервативные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены более существенные изменения, обозначенные как "примерные замены" в Таблице 3, или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, а продукты подвергнуты скринингу.

Таблица 3: Аминокислотные замены

Исходный остаток Консервативные замены Примерные замены Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин Leu (L) Ile Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин

Существенные изменения биологических свойств антитела достигаются при выборе замен, которые значительно отличаются по своему влиянию на сохранение: (a) структуры полипептидного скелета в области замены, например, в виде β-слоя или спиральной структуры, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (c) массы боковой цепи. Природные остатки подразделяются на группы на основе общих свойств боковой цепи:

(1) Неполярные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Полярные без заряда: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Кислотные (отрицательно заряженные): Asp, Glu;

(4) Основные (положительно заряженные): Lys, Arg;

(5) Остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и

(6) Ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.

Неконсервативные замены вводят путем замены члена одного из этих классов другим классом.

Например, один тип замещения, который может быть сделан, состоит в замене одного или более цистеинов в антителе, которые могут быть химически активными, другим остатком, таким как, без ограничения, аланин или серин. Например, может быть сделана замена неканонического цистеина. Замена может быть сделана в CDR или каркасной области вариабельного домена или в константной области антитела. В некоторых вариантах цистеин является каноническим. Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также может быть заменен, как правило, серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аберрантного сшивания. С другой стороны, цистеиновая связь(и) может быть добавлена в антитело для повышения его стабильности, особенно когда антитело является фрагментом антитела, таким как Fv-фрагмент.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату антитела к CD123, как описано в настоящем документе, или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело конъюгировано со средством (например, цитотоксическим средством) для направленной иммунотерапии (например, конъюгатам антитела-лекарственного средства или ADC), напрямую или не напрямую через линкер. Например, цитотоксическое средство может быть связано или конъюгировано с антителом к CD123, как описано в настоящем документе, для направленной локальной доставки молекулы цитотоксического средства в опухоли (например, опухоль, экспрессирующую CD123).

Способы конъюгирования цитотоксического средства или других терапевтических средств с антителами были описаны в различных публикациях. Например, химическая модификация может быть сделана в антителах либо через аминогруппы боковой цепи лизина, либо через сульфгидрильные группы цистеина, активированные путем восстановления межцепочечных дисульфидных связей для проведения реакции конъюгирования. См., например, Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005, и Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004. Также были описаны реакционноспособные остатки цистеина, введенные в определенные сайты антител для специфичного конъюгирования лекарственного средства с определенной стехиометрией. См., Например, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008. Конъюгирование с применением ацилдонорной глутаминсодержащей метки или эндогенного глутамина, сделанного реакционноспособным (т.е. способность образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила) с помощью полипептидной инженерии в присутствии трансглутаминазы и амина (например, цитотоксического средства, включающего или присоединенного к реакционноспособному амину), также описано в международных заявках WO2012/059882 и WO2015015448, которые полностью включены в настоящее описание посредством отсылки. Трансглутаминазы представляют собой протеин-глутамин-γ-глутамилтрансферазы (ЕС 2.3.2.13), которые обычно катализируют рН-зависимое трансамидирование остатков глутамина остатками лизина. Трансглутаминаза, используемая в изобретении, описанном в настоящем документе, может быть получена или создана из различных источников или сконструирована для катализа трансамидирования одного или более эндогенных остатков глутамина одним или более остатками лизина или аминдонорными агентами, содержащими один или более реакционноспособных аминов. Способы применения трансглутаминазы для получения ADC описаны, например, в публикации заявки на патент США 20170043033, полностью включенной в настоящий документ посредством отсылки.

ADC включают компонент антитела, конъюгированный с лекарственным средством, как правило, при использовании линкера. В некоторых вариантах осуществления ADC, раскрытые в настоящем документе, включают антитело, сайт-специфически конъюгированное с аминдонорным средством (например, малой молекулой, соединенной с линкером с аминдонорной единицей) через введенную глутаминсодержащую метку, эндогенный глутамин (т.е. нативные глутамины без инженерии, такие как глутамины в вариабельных доменах, CDR-областях и т.д.) и/или реакционноспособный эндогенный глутамин.

Эндогенный глутамин может быть сделан реакционноспособным (т.е. способность образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила в присутствии амина и трансглутаминазы) путем модификации одной или более аминокислот (например, делеции, вставки, замены или мутации аминокислоты) в антителе, путем ферментативного дегликозилирования или путем взаимодействия с рекомбинантной трансглутаминазой. Таким образом, в одном аспекте предложен конъюгат антитела-лекарственного средства (ADC), включающий формулу: антитело-(T-(X-Y-Z_a)_b)_c, где: T является: 1) глутаминсодержащей меткой, введенной в определенный сайт, 2) эндогенным глутамином, и/или 3) эндогенным глутамином, сделанным реакционноспособным путем инженерии антитела или рекомбинантной трансглутаминазой; X является аминдонорной единицей; Y является линкером; и Z является молекулой средства; X-Y-Z является аминдонорным средством, сайт-специфически конъюгированным с глутаминсодержащей меткой, эндогенным глутамином и/или реакционноспособным эндогенным глутамином; a является целым числом от 1 до 6; b является целым числом от 1 до 6; c является целым числом от 1 до 20; и где продукт (отношение лекарственного средства-антитела) a, b и c является по меньшей мере приблизительно 1. Как глутамин-содержащая метка, эндогенный глутамин, так и реакционноспособный глутамин на антителе, и аминдонорное средство (X-Y-Z), описанное в настоящем документе, являются субстратами для трансглутаминазы, при этом связь между глутаминсодержащей меткой и/или эндогенным/реакционноспособным глутамином и аминдонорным средством, имеет формулу CH₂-CH₂-CO-NH-, в которой NH-связан с линкером и половиной средства.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 или конъюгат, как описано в настоящем документе, включает ацилдонорную глутаминсодержащую метку, введенную в определенный сайт антитела (например, на C-конец, N-конец или в другой сайт в антителе к CD123). В некоторых вариантах осуществления метка включает аминокислоту глутамин (Q) или аминокислотную последовательность LQG, LLQGG (SEQ ID NO:77), LLQG (SEQ ID NO:78), LSLSQG (SEQ ID NO:79), GGGLLQGG (SEQ ID NO:80), GLLQG (SEQ ID NO:81), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO:82), GLLQGGG (SEQ ID NO:83), GLLQGG (SEQ ID NO:84), GLLQ (SEQ ID NO:85), LLQLLQGA (SEQ ID NO:86), LLQGA (SEQ ID NO:87), LLQYQGA (SEQ ID NO:88), LLQGSG (SEQ ID NO:89), LLQYQG (SEQ ID NO:90), LLQLLQG (SEQ ID NO:91), SLLQG (SEQ ID NO:92), LLQLQ (SEQ ID NO:93), LLQLLQ (SEQ ID NO:94), LLQGR (SEQ ID NO:95), LLQGPP (SEQ ID NO:96), LLQGPA (SEQ ID NO:97), GGLLQGPP (SEQ ID NO:98), GGLLQGA (SEQ ID NO:99), LLQGPGK (SEQ ID NO:100), LLQGPG (SEQ ID NO:101), LLQGP (SEQ ID NO:102), LLQP (SEQ ID NO:103), LLQPGK (SEQ ID NO:104), LLQAPGK (SEQ ID NO:105), LLQGAPG (SEQ ID NO:106), LLQGAP (SEQ ID NO:107) и LLQLQG (SEQ ID NO:108).

В некоторых вариантах осуществления ацил-донорная глутамин-содержащая метка включает, например, LLQG (SEQ ID NO:78), которая заменяет аминокислотные остатки E294-N297 в тяжелой цепи антитела.

Также предложено выделенное антитело, включающее ацилдонорную глутаминсодержащую метку и модификацию аминокислоты в положении 222, 340 или 370 антитела (схема нумерации EU), где модификация является делецией, вставкой, заменой, мутацией аминокислоты или их любой комбинацией. В некоторых вариантах осуществления модификация аминокислоты является заменой лизина на аргинин (например, K222R, K340R или K370R).

Средства, которые могут быть конъюгированы с антителами к CD123 или антигенсвязывающими фрагментами согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения перечисленными, цитотоксические средства, иммуномодулирующие средства, визуализирующие средства, терапевтические белки, биополимеры или олигонуклеотиды.

Примеры цитотоксического средства включают, без ограничения перечисленными, антрациклин, ауристатин, доластатин, комбрестатин, дуокармицин, димер пирролобензодиазепина, димер индолинобензодиазепина, ендиин, гелданамицин, майтанзин, пуромицин, таксан, алкалоид барвинка, камптотецин, тубулизин, гемиастерлин, сплайсеостатин, пладиенолид и их стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные.

В некоторых аспектах лекарственное средство/средство является димером циклопропилпирролоиндолина (CPI), димером CTI или димером CBI. Димеры CPI индуцируют межцепочечное сшивание ДНК и сильную цитотоксичность. В международной публикации PCT WO2015/110935, полностью включенной в настоящий документ посредством отсылки, раскрыты димеры CPI и CBI, которые могут применяться в ADC к CD123 согласно настоящему изобретению, и предложены способы получения димеров CPI и CBI. Например, средство (8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(1S)-1-(хлорметил)-5-гидрокси-8-метил-1,6-дигидропирроло[3,2-e]индол-3(2H)-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ил-дигидрофосфат, также известный как "димер CPI 8314", имеет следующую структуру:

.

соответствующую формуле C31H31Cl2N4O7P.

Антрациклины получают из бактерий Streptomyces и применяют для лечения широкого спектра онкологических опухолей, таких как лейкозы, лимфомы, злокачественные опухоли молочной железы, матки, яичника и легкого. Примеры антрациклинов включают, без ограничения перечисленными, даунорубицин, доксорубицин (т.е. адриамицин), эпирубицин, идарубицин, валрубицин и митоксантрон.

Доластатины и их петидные аналоги и производные, ауристатины, являются очень мощными антимитотическими средствами, которые, как было показано, обладали противоопухолевой и противогрибковой активностью. См., например, патент США 5,663,149 и Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998. Примеры доластатинов и ауристатинов включают, без ограничения перечисленными, доластатин 10, ауристатин E, ауристатин EB (AEB), ауристатин EFP (AEFP), MMAD (монометилауристатин D или монометилдоластатин 10), MMAF (монометилауристатин F или N-метилвалин-валин-долаизолейин-долапроин-фенилаланин), MMAE (монометилауристатин E или N-метил-валин-валин-долаизолейин-долапроин-норэфедрин), AE-эфир 5-бензоилвалериановой кислоты (AEVB) и другие новые ауристатины (такие как описанные в публикации US 2013/0129753). В некоторых вариантах осуществления ауристатином является 0101 (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

.

В некоторых вариантах осуществления ауристатином является 3377 (N,2-диметилаланил-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбоксил-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]-пирролидин-1-ил}-2-метокси-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил}-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

.

В некоторых вариантах осуществления ауристатином является 0131-OMe (N,2-диметилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

В других вариантах осуществления ауристатином является 0131 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]-пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

В других вариантах осуществления ауристатином является 0121 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

Камптотецин является цитотоксическим хинолиновым алкалоидом, ингибирующим фермент топоизомеразу I. Примеры камптотецина и его производных включают, без ограничения перечисленными, топотекан и иринотекан и их метаболиты, такие как SN-38.

Комбрестатины являются природными фенолами, обладающими способностью повреждать сосуды в опухолях. Примеры комбрестатинов и их производных включают, без ограничения перечисленными, комбрестатин A-4 (CA 4) и омбрабулин.

Дуокармицин и CC-1065 являются ДНК-алкилирующими средствами с цитотоксической активностью. См. Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995). Примеры дуокармицина и CC-1065 включают, без ограничения перечисленными, (+)-дуокармицин A и (+)-дуокармицин SA, (+)-CC-1065, а также соединения, раскрытые в международной заявке PCT/IB2015/050280, в том числе, без ограничения перечисленными, N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(хлорметил)-3-[(5-{[(1S)-1-(хлорметил)-5-(фосфоноокси)-1,2-дигидро-3H-бензо[e]индол-3-ил]-карбонил}тиофен-2-ил)карбонил]-2,3-дигидро-1H-бензо[e]индол-5-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)-фенил]-L-орнитинамид, имеющий структуру:

,

N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(1S)-1-(хлорметил)-8-метил-5-(фосфоноокси)-1,6-дигидропирроло[3,2-e]индол-3(2H)-ил]карбонил}-бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ил}окси)карбонил](метил)амино}-этил)(метил)карбамоил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамид, имеющий структуру:

,

N~2~-ацетил-L-лизил-L-валил-N~5~-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(4-{[(1S)-1-(хлорметил)-8-метил-5-(фосфоноокси)-1,6-дигидропирроло[3,2-e]индол-3(2H)-ил]карбонил}пентацикло[4.2.0.0~2,5~.0~3,8~.0~4,7~]окт-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)-фенил]-L-орнитинамид, имеющий структуру:

.

Ендиины являются классом противоопухолевых бактериальных продуктов, характеризуемых девяти- и десятичленными кольцами или наличием циклической системы конъюгированных тройных-двойных-тройных связей. Примеры ендиинов включают, без ограничения перечисленными, калихеамицин, эсперамицин, унциаламицин, динемицин и их производные.

Гелданамицины представляют собой бензохиноновые ансамициновые антибиотики, которые связываются с Hsp90 (белком теплового шока 90) и применялись в качестве противоопухолевых средств. Примеры гелданамицинов включают, без ограничения перечисленными, 17-AAG (17-N-аллиламино-17-деметоксигелданамицин) и 17-DMAG (17-диметиламиноэтиламино-17-деметоксигелданамицин).

Гемиастерлин и его аналоги (например, HTI-286) связываются с тубулином, нарушают нормальную динамику микротрубочек и, в стехиометрических количествах, деполимеризуют микротрубочки.

Майтанзины или их производные майтанзиноиды ингибируют пролиферацию клеток путем ингибирования формирования микротрубочек в ходе митоза посредством ингибирования полимеризации тубулина. См. Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975. Примеры майтанзинов и майтанзиноидов включают, без ограничения перечисленными, мертанзин (DM1) и его производные, а также ансамитоцин.

Димеры пирролобензодиазепина (PBD) и димеры индолинобензодиазепина (IGN) являются противоопухолевыми средствами, содержащими одну или более функциональных иминогрупп или их эквиваленты, которые связываются с двойной спиралью ДНК. Молекулы PBD и IGN основаны на природном продукте антрамицине и взаимодействуют с ДНК сиквенс-селективным образом с предпочтением в отношении пурин-гуанин-пуриновых последовательностей. Примеры PBD и их аналогов включают, без ограничения перечисленными, SJG-136.

Сплайсеостатины и пладиенолиды являются противоопухолевыми соединениями, которые ингибируют сплайсинг и взаимодействуют со сплайсосомой, SF3b. Примеры сплайсеостатинов включают, без ограничения перечисленными, сплайсеостатин A, FR901464 и (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-гидразинил-2-оксоэтил)-4-гидрокси-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]-3-метилпента-2,4-диен-1-ил}-2,5-диметилтетрагидро-2H-пиран-3-ил]амино}-5-оксопент-3-ен-2-илацетат, имеющий структуру:

.

Примеры пладиенолидов включают, без ограничения перечисленными, Пладиенолид B, Пладиенолид D или E7107.

Таксаны являются дитерпенами, которые действуют как антитубулиновые средства или ингибиторы митоза. Примеры таксанов включают, без ограничения перечисленными, паклитаксел (например, Таксол®) и доцетаксел (Таксотер®).

Тубулизины являются природными продуктами, выделенными из штамма миксобактерий, которые, как было показано, деполимеризовали микротрубочки и вызывали остановку митоза. Примеры тубулизинов включают, без ограничения перечисленными, тубулизин A, тубулизин B и тубулизин D.

Алкалоиды барвинка также являются антитубулиновыми средствами. Примеры алкалоидов барвинка включают, без ограничения перечисленными, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин.

В некоторых вариантах осуществления цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из MMAD (монометил-ауристатина D), 0101 (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида), 3377 (N,2-диметилаланил-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбоксил-2-фенилэтил]-амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-2-метокси-1-[(1S)-1-метилпропил]-4-оксобутил}-N-метил-L-валинамида), 0131 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида), 0131-OMe (N,2-диметилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метилL-валинамида), 0121 (2-метил-L-пролил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида) и (2S, 3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-гидразинил-2-оксоэтил)-4-гидрокси-1,6-диоксаспиро[2.5]окт-5-ил]-3-метилпента-2,4-диен-1-ил}-2,5-диметилтетрагидро-2H-пиран-3-ил]амино}-5-оксопент-3-ен-2-илацетата.

В некоторых вариантах осуществления средство является иммуномодулирующим средством. Примеры иммуномодулирующего средства включают, без ограничения перечисленными, ганцикловир, этанерцепт, такролимус, сиролимус, воклоспорин, циклоспорин, рапамицин, циклофосфамид, имуран, микофенолата мофетил, метотрексат, глюкокортикоид и его аналоги, цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, фактор некроза опухоли (ФНО), гемопоэтические факторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 и IL-21), колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)), интерфероны (например, интерфероны-α, -β и -γ), фактор роста стволовых клеток, обозначенный как "S 1 фактор", эритропоэтин и тромбопоэтин или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления молекула средства представляет собой визуализирующее средство (например, флуорофор или хелатообразователь), такое как флуоресцеин, родамин, лантаноидные люминофоры и их производные, или радиоизотоп, связанный с хелатообразователем. Примеры флуорофоров включают, без ограничения перечисленными, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) (например, 5-ФИТЦ), флуоресцеинамидит (ФАМ) (например, 5-ФАМ), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor^® (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5-TAMRA) тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101). Примеры хелатообразователей включают, без ограничения перечисленными, 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусную кислоту (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA), 1,4,7-триазациклононан, 1-глутаровую кислоту-4,7-уксусную кислоту (дефероксамин), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту) (BAPTA).

Примеры флуорофоров включают, без ограничения перечисленными, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) (например, 5-ФИТЦ), флуоресцеинамидит (ФАМ) (например, 5-ФАМ), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor^® (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5-TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101).

В некоторых вариантах осуществления терапевтические или диагностические радиоизотопы или другие метки (например, метки для ПЭТ или ОФЭКТ) могут быть включены в средство для конъюгирования с антителами к CD123 или антигенсвязывающими фрагментами, как описано в настоящем документе. Примеры радиоизотопа или других меток включают, без ограничения перечисленными, ³H, ¹¹C, ¹³N, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁵O, ³⁵S, ¹⁸F, ³²P, ³³P, ⁴⁷Sc, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁵Se, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁴Tc, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ⁹⁹Tc, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹Ag, ¹¹¹In, ¹¹³In, ¹²¹Te, ¹²²Te, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹²⁵Te, ¹²⁶I, ¹³¹I, ¹³¹In, ¹³³I, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁵³Pb, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶H, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹⁹⁷Pt, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²⁰¹Tl, ²⁰³Hg, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁴Ac или ²²⁵Ac.

В некоторых вариантах осуществления средство является терапевтическим белком, включающим, без ограничения, токсин, гормон, фермент и фактор роста.

Примеры белка (или полипептида) токсина включают, без ограничения перечисленными, дифтерийный токсин (например, цепь A дифтерийного токсина), экзотоксин и эндотоксин Pseudomonas, рицин (например, цепь A рицина), абрин (например, цепь A абрина), модецин (например, цепь A модецина), альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок фитолакки, гелонин, дифтеринный токсин, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трихотецены, пептиды с ингибиторным цистиновым узлом (ICK) (например, цератотоксины) и конотоксин (например, KIIIA или SmIII).

В некоторых вариантах осуществления средство является биосовместимым полимером. Антитела к CD123 или антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем документе, могут быть конъюгированы с биосовместимым полимером для увеличения периода полувыведения и биоактивности в сыворотке и/или для увеличения периода полувыведения in vivo. Примеры биосовместимых полимеров включают водорастворимый полимер, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или его производные, и цвиттер-ион-содержащие биосовместимые полимеры (например, фосфорилхолинсодержащий полимер).

В некоторых вариантах осуществления средство является олигонуклеотидом, таким как антисмысловые олигонуклеотиды.

В другом аспекте изобретения предложен конъюгат антитела, как описано в настоящем документе, где конъюгат включает формулу: антитело-(ацил-донорная глутамин-содержащая метка)-(линкер)-(цитотоксическое средство), где ацил-донорная глутамин-содержащая метка введена в определенный сайт антитела (например, на C-конец тяжелой или легкой цепи, после остатка T135 в тяжелой цепи антитела, или в другой сайт), где метка конъюгирована с линкером (например, линкером, содержащим один или более реакционноспособных аминов (например, первичный амин NH₂)), и где линкер конъюгирован с цитотоксическим средством (например, MMAD или другими ауристатинами, такими как 0101, 0131 или 3377).

Примеры линкера, содержащего один или более реакционноспособных аминов, включают, без ограничения перечисленными, Ac-Lys-Gly (ацетил-глицин-лизин), аминокапроновую кислоту, Ac-Lys-β-Ala (ацетил-лизин-β-аланин), амино-ПЭГ2 (полиэтиленгликоль)-C2, амино-ПЭГ3-C2, амино-ПЭГ6-C2 (или амино ПЭГ6-пропионил), Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил), амино-ПЭГ6-C2-Val-Cit-PABC, аминокапроил-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}-пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, путресцин или Ac-Lys-путресцин.

В некоторых вариантах осуществления (линкер)-(цитотоксическое средство) представляет собой N2-ацетил-L-лизил-L-валил-N5-карбамоил-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(хлорметил)-6-[(3-{[(1S)-1-(хлорметил)-8-метил-5-(фосфоноокси)-1,6-дигидропирроло[3,2-e]индол-3(2H)-ил]карбонил}бицикло[1.1.1]пент-1-ил)карбонил]-1-метил-3,6,7,8-тетрагидропирроло[3,2-e]индол-4-ил}окси)карбонил](метил)амино}этил)(метил)карбамоил]окси}метил)-фенил]-L-орнитинамид, молекулярная формула C63H82Cl2N13O15P, имеющий следующую структуру:

В некоторых вариантах осуществления (линкер)-(цитотоксическое средство) является формой соли трифторуксусной кислоты C63H82Cl2N13O15P, имеющей следующую структуру:

Формула формы соли трифторуксусной кислоты выше является C63H82Cl2N13O15P⋅C2HF3O2.

В некоторых вариантах осуществления ADC является: 1) антителом-LLQG (SEQ ID NO:78) - Ac-Lys-Val-Cit-PABC-CPI-8314. В некоторых вариантах осуществления ацил-донорная глутамин-содержащая метка включает, например, LLQG (SEQ ID NO:78), которая заменяет аминокислотные остатки E294-N297 в тяжелой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления ADC включает модификацию аминокислоты в положении K222 (в шарнирной области). В некоторых вариантах осуществления модификация является K222R. Примеры антитела включают, без ограничения перечисленными, h18G3, 18G3, h18G3, 16D6, h16D6, 3D1 и 20D7.

В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает композиции, в том числе фармацевтические композиции, содержащие антитела или ADC, описанные в настоящем документе или полученные способами и обладающие свойствами, описанными в настоящем документе. При использовании в настоящем документе композиции включают одно или более антител или ADC, которые связываются с CD123. Эти композиции могут дополнительно включать подходящие вспомогательные вещества, такие как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, включая буферы, которые известны в данной области.

Способы применения антител к CD123 и ADC на их основе

Антитела и ADC настоящего изобретения могут применяться в различных областях, включающих, без ограничения перечисленным, терапевтические способы лечения и диагностические способы лечения.

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения состояния, связанного с экспрессией CD123 у индивида. В некоторых вариантах осуществления способ лечения состояния, связанного с экспрессией CD123 у индивида, включает введение больному эффективного количества композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. Состояния, связанные с экспрессией CD123, включают, без ограничения перечисленными, нарушенную экспрессию CD123, измененную или аберрантную экспрессию CD123, злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, и пролиферативное нарушение (например, рак) или аутоиммунное нарушение.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения рака у индивида, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. При использовании в настоящем документе рак может быть, например, без ограничения, множественной миеломой, злокачественной плазмоклеточной неоплазией, лимфомой Ходжкина, нодулярной лимфомой Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезнью Калера и миеломатозом, плазмоклеточным лейкозом, плазмоцитомой, B-клеточным пролимфоцитарным лейкозом, волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ), B-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ), острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ), острым лимфоцитарным лейкозом (ОЛЛ, B-ОЛЛ), хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ), фолликулярной лимфомой, лимфомой Беркитта, лимфомой из клеток маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомой, крупноклеточной лимфомой, B-лимфобластной лимфомой из клеток-предшественников, бластной плазмоцитоидной дендритноклеточной неоплазией (БПДКН), миелоидным лейкозом, макроглобулинемией Вальденстрема, диффузной B-крупноклеточной лимфомой, фолликулярной лимфомой, лимфомой из клеток маргинальной зоны, лимфомой лимфатической ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой, мантийноклеточной лимфомой, лимфомой Беркитта, первичной медиастинальной (тимической) B-крупноклеточной лимфомой, лимфоплазмоцитарной лимфомой, макроглобулинемией Вальденстрема, нодулярной B-клеточной лимфомой из клеток маргинальной зоны, лимфомой из клеток маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой B-крупноклеточной лимфомой, первичной эффузионной лимфомой, лимфоматоидным гранулематозом, B-крупноклеточной лимфомой с большим количеством Т-клеток/гистиоцитов, первичной лимфомой центральной нервной системы, первичной диффузной B-крупноклеточной лимфомой кожи (ножного типа), ВЭБ-положительной диффузной B-крупноклеточной лимфомой у пожилых, диффузной B-крупноклеточной лимфомой, связанной с воспалением, внутрисосудистой B-крупноклеточной лимфомой, ALK-положительной B-крупноклеточной лимфомой, плазмобластной лимфомой, B-крупноклеточной лимфомой, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, B неклассифицируемой B-клеточной лимфомой с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и лимфомы Беркитта, неклассифицируемой B-клеточной лимфомой с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и классической лимфомы Ходжкина и другой ассоциированной с B-клетками лимфомой. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ОМЛ, B-ОЛЛ, БПДКН, НХЛ или ВКЛ.

В некоторых вариантах осуществления предложен способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. В других вариантах осуществления предложен способ ингибирования метастазирования клеток, экспрессирующих CD123 у индивида, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. В других вариантах осуществления предложен способ стимуляции регрессии опухоли в злокачественных клетках у индивида, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения аутоиммунного нарушения у индивида, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе.

При использовании в настоящем документе аутоиммунные нарушения включают, без ограничения перечисленными, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, диабет (I типа), рассеянный склероз, болезнь Аддисона, целиакию, дерматомиозит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, энцефалопатию Хашимото, миастению гравис, пернициозную анемию, реактивный артрит, синдром Шегрена, острый диссеминированный энцефаломиелит, агаммаглобулинемию, амиотрофический боковой склероз, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, антисинтетазный синдром, атопическую аллергию, атопический дерматит, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную периферическую нейропатию, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунную крапивницу, аутоиммунный увеит, болезнь Бехчета, болезнь Кастлемана, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дерматомиозит, эозинофильный фасциит, желудочно-кишечный пемфигоид, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, гнойный гидраденит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, нарколепсию, вульгарную пузырчатку, пернициозную анемию, полимиозит, первичный билиарный цирроз, рецидивирующий полихондрит, ревматическую лихорадку, темпоральный артериит, поперечный миелит, неспецифический язвенный колит, недифференцированный коллагеноз, васкулит и гранулематоз Вегенера.

В другом аспекте изобретения предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для лечения состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), ассоциированного с экспрессией CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления предложено эффективное количество композиции (например, фармацевтической композиции), включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123.

В другом аспекте изобретения предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для применения при лечении состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), ассоциированного с экспрессией CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123, у больного. В некоторых вариантах осуществления предложены антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, для стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123.

В другом аспекте изобретения предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для лечения состояния (например, рака или аутоиммунного нарушения), ассоциированного с экспрессией CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для ингибирования роста или прогрессирования опухоли. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123. В некоторых вариантах осуществления предложено применение антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для стимуляции регрессии опухоли.

В другом аспекте предложен способ обнаружения, диагностики и/или мониторирования состояния, ассоциированного с экспрессией CD123. Например, антитела к CD123, как описано в настоящем документе, могут быть помечены поддающейся обнаружению молекулой, такой как визуализирующее средство и фермент-субстратная метка. Антитела, как описано в настоящем документе, также могут применяться для диагностических исследований in vivo, таких как визуализация in vivo (например, ПЭТ или ОФЭКТ), или окрашивающий реагент.

В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают этап лечения субъекта с применением дополнительной формы терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная форма терапии является дополнительной противоопухолевой терапией, включающей, без ограничения перечисленным, химиотерапию, радиацию, хирургию, гормональную терапию и/или дополнительную иммунотерапию.

В некоторых вариантах осуществления дополнительная форма терапии включает введение одного или более терапевтических средств в дополнение к антителам к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. Одним или более терапевтическими средствами могут быть, например, без ограничения перечисленными, второе антитело (например, антитело против VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) (например, Авастин^®), антитело против HER2 (например, Герцептин^®), антитело против CD25, антитело против CD33, антитело против CD20 (например, Ритуксан^®), антитело против муцинподобного гликопротеина, антитело против ФНО, антитело против PD-1 или PD-L1 и/или антитело к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) (например, Эрбитукс^®)), ингибитор ангиогенеза, цитотоксическое средство (например, антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, валрубицин и митоксантрон), таксан (например, паклитаксел и доцетаксел), доластатин, дуокармицин, ендиин, гелданамицин, майтанзин, пуромицин, алкалоид барвинка (например, винкристин), ингибитор топоизомеразы (например, этопозид), тубулизин, аналог пиримидина (например, фтороурацил), платиносодержащие средства (например, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин), алкилирующие средства (например, мелфалан, циклофосфамид или кармустин) и гемиастерлин), иммуномодулирующее средство (например, преднизон), противовоспалительное средство (например, дексаметазон), ингибитор ароматазы (например, анастрозол, эксеместан, летрозол, ворозол, форместан или тестолактон), ингибитор протеасом (например, бортезомиб, такой как Велкейд^® ([(1R)-3-метил-1-[[(2S)-1-оксо-3-фенил-2-[(пиразинилкарбонил)-амино]пропил]амино]бутил]бороновая кислота), а также другие средства, такие как тамоксифен.

Например, в некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения ОМЛ, включающий введение больному эффективного количества композиции, включающей антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, и одного другого терапевтического средства, такого как химиотерапевтическое средство или талидомид или его производное (например, леналидомид). В некоторых вариантах осуществления одно другое терапевтический средство выбрано из группы, состоящей из бортезомиба (например, Велкейда^®), мелфалана, преднизона, доксорубицина, леналидомида, талидомида, преднизона, кармустина, этопозида, цисплатина, циклофосфамида и винкристина. В некоторых вариантах осуществления другим терапевтическим веществом является бортезомиб (например, Велкейд^®), мелфалан или преднизон. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рецидив или является рефрактерным к предыдущей терапии ОМЛ.

Антитело к CD123 или ADC к CD123 могут быть введены пациенту любым подходящим путем. Специалистам в данной области должно быть известно, что примеры, описанные в настоящем документе, не предназначены для ограничения, но служат в качестве иллюстрации доступных методик. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 или ADC к CD123 вводят пациенту в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например, путем болюсного введения или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, внутричерепным, трансдермальным, подкожным, внутрисуставным, подъязычным, интрасиновиальным, путем инсуффляции, интратекальным, пероральным, ингаляционным или наружным путями. Введение может быть системным, например, внутривенным введением, или локализованным. Для введения могут применять доступные в продаже небулайзеры для жидких композиций, включая струйные небулайзеры и ультразвуковые небулайзеры. Жидкие композиции могут распылять с помощью небулайзера непосредственно, а лиофилизированный порошок могут распылять с помощью небулайзера после восстановления. Также антитело к CD123 или ADC к CD123 можно распылять в форме аэрозоля при использовании фторуглеродных составов и дозирующего ингалятора, или вдыхать в виде лиофилизированного и измельченного порошка.

В одном варианте осуществления антитело к CD123 или ADC к CD123 вводят посредством методов сайт-специфической или адресной локальной доставки. Примеры методов сайт-специфической или адресной локальной доставки включают различные имплантируемые депо-источники антитела к Trop или ADC к CD123 или катетеры для локальной доставки, такие как инфузионные катетеры, постоянные катетеры или игольные катетеры, синтетические трансплантаты, адвентициальные манжеты, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямую инъекцию или непосредственное применение. См., например, публикацию PCT WO 00/53211 и патент США 5,981,568.

Для введения могут применяться различные композиции антитела к CD123 или ADC к CD123. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 или ADC к CD123 могут вводить в чистой форме. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD123 (или ADC к CD123) и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество могут присутствовать в разных композициях. Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества известны в уровне техники и являются относительно инертными веществами, которые облегчают введение фармакологически эффективной субстанции. Например, вспомогательное вещество может придавать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие вспомогательные вещества включают, без ограничения перечисленными, стабилизаторы, смачивающие вещества и эмульгаторы, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие вещества, буферы и вещества, усиливающие проникновение через кожу. Вспомогательные вещества, а также композиции для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственных средств описаны в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

В некоторых вариантах осуществления эти средства включают в композиции для введения путем инъекции (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Таким образом, эти средства могут быть объединены с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как раствор хлорида натрия, раствор Рингера, раствор декстрозы и тому подобное Конкретная схема применения, т.е. доза, время введения и повторное введение, будет зависеть от конкретного пациента и его истории болезни.

Антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, могут вводить с применением любого подходящего способа, в том числе путем инъекции (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Антитело к CD123 или ADC к CD123 также могут вводить путем ингаляции, как описано в настоящем документе. Как правило, для введения антитела к CD123 и ADC к CD123 начальная кандидатная доза может составлять приблизительно 2 мг/кг. В рамках настоящего изобретения типичная ежедневная доза может изменяться в пределах от приблизительно 3 мкг/кг до 30 мкг/кг до 300 мкг/кг до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или больше, в зависимости от указанных выше факторов. Например, может использоваться доза приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг и приблизительно 25 мг/кг. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают, пока не будет наблюдаться требуемая супрессия симптомов или пока не будут достигнуты достаточные терапевтические уровни, например, для ингибирования или задержки роста/прогрессирования опухоли или метастазирования раковых клеток. Один из примерных схем применения включает введение начальной дозы приблизительно 2 мг/кг с последующим введением еженедельной поддерживающей дозы приблизительно 1 мг/кг антитела к CD123 или ADC к CD123, или с последующим введением поддерживающей дозы приблизительно 1 мг/кг раз в две недели. Другая примерная схема применения включает введение начальной дозы приблизительно 0,21, приблизительно 0,5 или приблизительно 0,8 мг/кг раз в неделю или раз в три недели. Другая примерная схема применения включает введение повышаемых доз (например, начальной дозы 1 мг/кг с постепенным повышением до одной или больше более высоких доз раз в неделю или в течение более длительного периода времени). Другие схемы применения также могут быть полезными, в зависимости от структуры фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист. Например, в некоторых вариантах осуществления предумотрено введение от одного до четырех раз в неделю. В других вариантах осуществления предумотрено введение один раз в месяц или один раз в два месяца или в три месяца. Ход этой терапии легко мониторировать с помощью стандартных методов и анализов. Схему применения (содержащую используемое антитело к CD123 или ADC к CD123) могут изменять с течением времени.

В рамках настоящего изобретения подходящая доза антитела к CD123 или ADC к CD123 будет зависеть от применяемого антитела к CD123 или ADC к CD123 (или их композиций), типа и тяжести симптомов, подлежащих лечению, независимо от введения средства для терапевтических целей, от предыдущей терапии, истории болезни субъекта и ответа на применение средства, скорости клиренса введенного средства у индивида и от решения лечащего врача. Обычно врач вводит антитело к CD123 или ADC к CD123 до тех пор, пока не будет достигнута доза, которая обеспечивает получение нужного результата. Доза и/или частота введения могут изменяться в течение курса лечения. Эмпирические показатели, такие как полупериод существования, как правило, будут способствовать определению дозы. Например, антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела, могут применяться для увеличения полупериода существования антитела и предотвращения атаки на антитело иммунной системы реципиента. Частоту введения могут определять и корректировать в течение курса терапии, и обычно, но не обязательно, она основана на лечении и/или подавлении, и/или ослаблении, и/или задержке появления симптомов, например, ингибировании или задержке роста опухоли и т.д. В альтернативе могут быть подходящими композиции с замедленным непрерывным высвобождением антител к CD123 или ADC к CD123. Различные композиции и устройства для обеспечения замедленного высвобождения известны в уровне техники.

В одном варианте осуществления дозы антитела к CD123 или ADC к CD123 могут быть эмпирически определены у пациентов, которые получали одно или более введений антитела к CD123 или соответствующего ADC к CD123. Пациенты получают повышаемые дозы антитела к CD123 или антагониста CD123. Для оценки эффективности могут отслеживать изменение показателя заболевания.

Введение антитела к CD123 или ADC к CD123 в соответствии со способом в настоящем изобретении может быть непрерывным или периодическим в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, от того, является ли цель введения терапевтической или профилактической, а также от других факторов, известных практикующим специалистам. Введение антитела к CD123 или ADC к CD123 может быть по существу непрерывным в течение предварительно выбранного периода времени или может осуществляться в виде серии разделенных интервалами доз.

В некоторых вариантах осуществления может присутствовать больше одного антитела к CD123 или ADC к CD123. Может присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или больше разных антител к CD123 или ADC к CD123. Обычно такие антитела к CD123 или ADC к CD123 могут обладать дополняющими активностями, не оказывающими негативного влияния друг на друга. Например, может применяться одно или более следующих антител к CD123: первое антитело к CD123, направленное на один эпитоп на CD123, и второе антитело CD123, направленное на другой эпитоп на CD123.

Терапевтические композиции антитела к CD123 или ADC к CD123, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, подготавливают к хранению путем смешивания антитела, обладающего требуемой степенью чистоты, с дополнительными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый спирт или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (меньше чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие соединения, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, манит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Липосомы, содержащие антитело к CD123 или ADC к CD123, получают способами, известными в уровне техники, такими, как описано в Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; и патенты США 4,485,045 и 4,544,545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты в патенте США 5,013,556. Особенно полезные липосомы могут быть получены способом обращено-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ). Липосомы экструдируют через фильтры с порами определенного размера, получая липосомы требуемого диаметра.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, изготовленные, например, способами коацервации или межфазной полимеризацией, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие способы раскрыты в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом такие матрицы имеют форму профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), изобутират ацетат сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Композиции, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это с легкостью достигается, например, при фильтровании через стерильные фильтрующие мембраны. Композиции терапевтического антитела к CD123 или ADC к CD123 обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, пакет или флакон с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции.

Композиции согласно настоящему изобретению могут быть в единичных лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии, или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения или введения путем ингаляции или инсуффляции.

Для изготовления твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например, стандартными таблеточными компонентами, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, фосфат дикальция или камеди, а также другими фармацевтическими разбавителями, например, водой, с получением твердой композиции для изготовления лекарственной формы, содержащей гомогенную смесь соединения данного изобретения или его нетоксичную фармацевтически приемлемую соль. Когда эти композиции для изготовления лекарственной формы называют гомогенными, это означает, что активный ингредиент равномерно распределен по всему объему композиции, при этом композицию можно легко разделить на одинаково эффективные единичные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Затем эту твердую композицию для изготовления лекарственной формы делят на единичные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента согласно настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты оболочкой или составлены иным образом для получения лекарственной формы, обеспечивающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля могут включать внутренний и внешний компонент дозы, причем последний находится в форме оболочки на первом. Два компонента могут быть разделены кишечнорастворимым слоем, который служит для противодействия распаду в желудке и позволяет внутреннему компоненту в неизмененном виде проходить в двенадцатиперстную кишку или задерживает его высвобождение. Для изготовления таких кишечнорастворимых слоев или покрытий могут использоваться различные материалы, такие материалы включают ряд полимерных кислот и смеси полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящие поверхностно-активные вещества включают, в частности, неионогенные вещества, такие как полиоксиэтиенсорбитаны (например, Tween™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Span™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным веществом предпочтительно будут включать от 0,05 до 5% поверхностно-активного вещества, и могут включать от 0,1 до 2,5%. Следует понимать, что могут быть добавлены другие компоненты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые носители, при необходимости.

Подходящие эмульсии могут быть изготовлены при использовании доступных в продаже жирных эмульсий, таких как Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ и Lipiphysan™. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, либо, в альтернативе, он может быть растворен в масле (например, соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле) и в эмульсии, образованной при смешивании с фосфолипидом (например, фосфолипидами яйца, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Следует понимать, что могут быть добавлены другие компоненты, например глицерин или глюкоза, для регуляции тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии, как правило, будут содержать до 20% масла, например, 5-20%. Жирная эмульсия может включать капли жира от 0,1 до 1,0 мкм, в особенности от 0,1 до 0,5 мкм, и иметь pH в диапазоне 5,5-8,0.

Эмульсионные композиции могут быть изготовлены путем смешивания антитела к CD123 или ADC к CD123 с Intralipid™ или его компонентами (соевое масло, фосфолипиды яйца, глицерин и вода).

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях или их смеси, а также порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, как указано выше. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят пероральным или назальным респираторным путем для местного или системного действия. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях могут распылять с использованием газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства или распыляющее устройство может быть подсоединено к лицевой маске, тенту или аппарату вентиляции легких с перемежающимся положительным давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка могут быть введены предпочтительно перорально или назально из устройств, которые доставляют композицию соответствующим образом.

Композиции

Композиции, применяемые в способах изобретения, включают эффективное количество антитела к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе. Примеры таких композиций, а также способов их изготовления, также описаны в предыдущем разделе и ниже. В некоторых вариантах осуществления композиция включает одно или более антител к CD123 или ADC к CD123. Например, антитело к CD123 распознает CD123 человека. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 является человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 включает константную область, которая способна индуцировать требуемый иммунный ответ, такой как антителоопосредованный лизис или ADCC. В других вариантах осуществления антитело к CD123 включает константную область, которая не вызывает ненужного или нежелательного иммунного ответа, такого как антителоопосредованный лизис или ADCC. В других вариантах осуществления антитело к CD123 включает одну или более CDR-областей антитела (например, одну, две, три, четыре, пять или, в некоторых вариантах осуществления, все шесть CDR-областей).

Следует понимать, что композиции могут содержать больше одного антитела к CD123 или ADC к CD123 (например, смесь антител к CD123, которые распознают разные эпитопы CD123). Другие примерные композиции содержат больше одного антитела к CD123 или ADC к CD123, которые распознают один и тот же эпитоп(ы), или разные типы антител к CD123 или ADC к CD123, которые связываются с разными эпитопами CD123 (например, CD123 человека).

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 можно вводить в комбинации с введением одного или более дополнительных терапевтических средств. Они включают, без ограничения перечисленными, применение химиотерапевтического средства, вакцины, терапии на основе CAR-T-клеток, лучевой терапии, терапии цитокинами, вакцины, биспецифичного антитела к CD123, ингибитора других иммуносупрессивных путей, ингибиторов ангиогенеза, активатора Т-клеток, ингибитора метаболического пути, ингибитора mTOR, ингибитора пути аденозина, ингибитора тирозинкиназы, в том числе, без ограничения перечисленным, ингибиторов ALK и сунитиниба, ингибитора BRAF, эпигенетического модификатора, ингибитора IDO1, ингибитора или деплетора Treg клеток и/или миелоидных клеток-супрессоров, ингибитора JAK, ингибитора STAT, ингибитора циклин-зависимой киназы, биотерапевтического средства (в том числе, без ограничения перечисленным, антител против VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, других рецепторов факторов роста, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, CD123, PD-L1, TIGIT и ICOS), иммуногенного средства (например, аттенуированных злокачественных клеток, опухолевых антигенов, антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, сенсибилизированные опухолевым антигеном или нуклеиновыми кислотами, иммуностимулирующими цитокинами (например, IL-2, IFNα2, ГМ-КСФ), и клеток, трансфицированных генами, кодирующими иммуностимулирующие цитокины, такие как, без ограничения, ГМ-КСФ). Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклосфосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в особенности булатацин и булатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в особенности калихеамицин гамма-1 и калихеамицин phiI1, см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеин ендииновых антибиотиков), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), пэгилированный липосомальный доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функцию коры надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средства, восполняющие дефицит фолиевой кислоты, такие как фолиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефосфамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2" -трихлортриэтиламин; трихотецены (в особенности Т-2 токсин, верракурин A, риридин A и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел и доксетаксел; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платины; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; Кселоду; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДФМО); ретиноиды, такие как ретиноевую кислоту; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше. Также включены антигормональные средства, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), содержащие, например, тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Фарестон); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует синтез эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат, эксеместан, форместан, фадрозол, ворозол, летрозол и анастрозол; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с одним или более другими терапевтическими средствами, направленно воздействующими на модулятор иммунной контрольной точки, такими как, например, без ограничения, средство, направленно воздействующее на CD123, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL , CD70, CD27 , 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1(CD66a ), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-аденозин (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, путь VEGF, CSF-1 или модулятор врожденного иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании, например, с антагонистическим антителом против PD-L1, таким как, например, BMS-936559 (MDX-1105); антителом к CD123 таким как, например, ниволумаб, пембролизумаб и пидилизумаб; антагонистическим антителом против CTLA-4, таким как, например, ипилимумаб; антагонистическим антителом против LAG-3, таким как BMS-986016 и IMP701; антагонистическим антителом против TIM-3; антагонистическим антителом против B7-H3, таким как, например, MGA271; антагонистическим антителом против VISTA; антагонистическим антителом против TIGIT; антагонистическим антителом против CD28; антителом против CD80; антителом против CD86; антагонистическим антителом против B7-H4; агонистическим антителом против ICOS; агонистическим антителом против CD28; модулятором врожденного иммунного ответа (например, TLR, KIR, NKG2A) и ингибитором IDO. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с агонистом 4-1BB (CD137), таким как, например, PF-05082566 или BMS-663513. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с агонистом OX40, таким как, например, агонистическое антитело против OX-40. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с агонистом GITR, таким как, например, агонистическое антитело против GITR, такое как, например, без ограничения, TRX518. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с ингибитором IDO. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с терапией цитокинами, такими как, например, без ограничения, IL-15, CSF-1, MCSF-1, и т.д.

В некоторых вариантах осуществления антитело к CD123 применяется в сочетании с одним или более другими терапевтическими антителами, такими как, например без ограничения, антитело, направленно взаимодействующее с CD19, CD22, CD40, CD52 или CCR4.

В некоторых вариантах осуществления терапия антителом к CD123 может предшествовать или осуществляться после лечения другим средством с интервалами в пределах от несколких минут до недель. В вариантах осуществления, когда другие средства и/или белки или полинуклеотиды вводят отдельно, можно в целом гарантировать, что значительный период времени не истек между каждой доставкой, в результате чего средство и композиция настоящего изобретения все еще будут способны оказывать предпочтительно комбинированное воздействие на субъекта. В таких случаях предусмотрено, что можно применять оба метода лечения в течение приблизительно 12-24 ч друг после друга и, более предпочтительно, в течение приблизительно 6-12 ч друг после друга. В некоторых ситуациях может быть предпочтительным значительно продлить период времени для введения, однако, когда между соответствующими введениями проходит от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).

В некоторых вариантах осуществления композиция антитела к CD123 включает второе средство, выбранное из кризотиниба, палбоциклиба, гемцитабина, циклофосфамида, фтороурацила, FOLFOX, фолиновой кислоты, оксалиплатина, акситиниба, сунитиниба малата, тофацитиниба, бевацизумаба, ритуксимаба и трастузумаба.

В некоторых вариантах осуществления композицию антитела к CD123 комбинируют со схемой лечения, дополнительно включающей традиционную терапию, выбранную из группы, состоящей из: хирургии, лучевой терапии, химиотерапии, направленной терапии, иммунотерапии, гормональной терапии, ингибирования ангиогенеза и паллиативной терапии.

Композиция, применяемая в настоящем изобретении, может дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. KE Hoover), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (меньше чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатообразующие соединения, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества дополнительно описаны в настоящем документе.

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева

В изобретении также предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитела согласно изобретению, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид. В другом аспекте изобретения предложены композиции (такие как фармацевтические композиции), содержащие любой из полинуклеотидов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция включает вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, кодирующий любое из антител, описанных в настоящем документе. В другом аспекте изобретения предложен способ получения любого из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе.

Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также охвачены настоящим изобретением. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, и могут быть молекулами ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают молекулы гяРНК, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК однозначным образом, и молекулы мРНК, не содержащие интроны. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но должны обязательно, присутствовать в полинуклеотиде настоящего изобретения, и полинуклеотид может быть, но должен быть обязательно, связан с другими молекулами и/или материалами-носителями.

Полинуклеотиды могут включать нативную последовательность (то есть эндогенную последовательность, которая кодирует антитело или его часть) или могут включать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или вставок, в результате чего иммунореактивность кодируемого полипептида не уменьшается по сравнению с нативной иммунореактивной молекулой. Влияние на иммунореактивность кодируемого полипептида в целом можно оценить, как описано в настоящем документе. Варианты предпочтительно демонстрируют по меньшей мере приблизительно 70% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% идентичность, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичность и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% идентичность с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативное антитело или его часть.

Говорят, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются "идентичными", если последовательность нуклеотидов или аминокислот в этих двух последовательностях совпадает при выравнивании с максимальным соответствием, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят путем сравнения последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей подобия последовательностей. "Окно сравнения" при использовании в настоящем документе относится к сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, обычно от 30 до приблизительно 75 или от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с референсной последовательностью, содержащей такое же число смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено при использовании программы Megalign в пакете программ для биоинформатики Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих публикациях: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Предпочтительно "процент идентичности последовательностей" определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения протяженностью по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать вставки или делеции (то есть пропуски) 20 процентов или меньше, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с референсными последовательностями (которые не содержат вставок или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотный остаток присутствуют в обеих последовательностях, с получением числа совпадавших положений, деления количества совпадавших положений на общее количество положений в референсной последовательности ( т.е. размер окна) и умножения результатов на 100, получая процент идентичности последовательности.

Варианты могут также или альтернативно быть по существу гомологичными нативному гену или его части или комплементу. Такие варианты полинуклеотида способны к гибридизации в условиях умеренной строгости с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарной последовательностью).

Подходящие "условия умеренной строгости" включают предварительную промывку в растворе 5× SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (pH 8,0); гибридизацию при 50°C-65°C, 5× SSC, в течение ночи; с последующей промывкой два раза при 65°C в течение 20 минут с каждым из 2×, 0,5× и 0,2× SSC, содержащими 0,1% SDS.

При использовании в настоящем документе "очень строгие условия" или "условия высокой строгости" являются условиями, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру при промывке, например, 0,015 М хлорида натрия/0,0015 M цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об/об) формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ мМ натрийфосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамида, 5× SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5× раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфат при 42°C, с промывкой при 42°C в 0,2× SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамида при 55°C, с последуюшей промывкой высокой строгости, состоящей из 0,1× SSC содержащим ЭДТА при 55°C. Специалисту будет известно, как при необходимости скорректировать температуру, ионную силу и т.д., чтобы отрегулировать такие факторы, как длину зонда и тому подобное

Специалистам в данной области должно быть известно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, описанный в настоящем документе. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее, полинуклеотиды, которые отличаются из-за различий в использовании кодонов, конкретно предусмотрены в настоящем изобретении. Кроме того, аллели генов, включащих полинуклеотидные последовательности, предложенные в настоящем документе, входят в объем настоящего изобретения. Аллели являются эндогенными генами, которые изменены в результате одной или более мутаций, таких как делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не должны обязательно, иметь измененную структуру или функцию. Аллели могут быть идентифицированы при использовании стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей в базе данных).

Полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть получены при использовании химического синтеза, рекомбинантных методов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в данной области и не требуют подробного описания в настоящем документе. Специалист в данной области сумеет использовать представленные в настоящем документе последовательности и коммерческий синтезатор ДНК для получения нужной последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с применением рекомбинантных методов полинуклеотид, содержащий требуемую последовательность, может быть встроен в подходящий вектор, а вектор, в свою очередь, может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как дополнительно обсуждается в настоящем документе. Полинуклеотиды могут быть встроены в клетки-хозяева любым способом, известным в данной области. Клетки трансформируют посредством введения экзогенного полинуклеотида путем прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-спаривания или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться в клетке в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрироваться в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким способом полинуклеотид может быть выделен из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., Например, Sambrook et al., 1989.

В альтернативе воспроизводить последовательности ДНК позволяет ПЦР. Технология ПЦР известна в уровне техники и описана в патентах США 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 и 4,683,202, а также PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК может быть получена при использовании выделенной ДНК в подходящем векторе и его вставки в подходящую клетку-хозяина. При репликации клетки и транскрипции ДНК в РНК, РНК может быть выделена с помощью методов, известных специалистам в данной области, как, например, описано в Sambrook et al., 1989, выше.

Подходящие клонирующие векторы могут быть сконструированы в соответствии со стандартными методиками или могут быть выбраны из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области. Хотя выбранный клонирующий вектор может изменяться в зависимости от предполагаемой клетки-хозяина, полезные клонирующие векторы, как правило, будут обладать способностью к саморепликации, могут обладать одной мишенью для конкретной эндонуклеазы рестрикции и/или могут нести гены маркера, который может использоваться при отборе клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и его производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

Векторы экспрессии обычно представляют собой реплицирующиеся полинуклеотидные конструкции, которые содержат полинуклеотид согласно изобретению. Подразумевается, что вектор экспрессии должен реплицироваться в клетках-хозяевах либо в качестве эписом, либо как неотъемлемая часть хромосомной ДНК. Подходящие векторы экспрессии включают, без ограничения перечисленными, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и вектор(ы) экспрессии, раскрытый в публикации PCT WO 87/04462. Компоненты вектора обычно могут включать, без ограничения перечисленным, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; начало репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции) также обычно требуются один или более элементов контроля трансляции, такие как сайты связывания рибосомы, сайты инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор является инфекционным агентом, таким как вирус осповакцины). Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.

В изобретении также предложены клетки-хозяева, содержащие любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем документе. Любые клетки-хозяева, способные к оверэкспрессии гетерологичных ДНК, могут использоваться с целью выделения генов, кодирующих антитело, полипептид или белок, представляющие интерес. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают, без ограничения перечисленными, клетки COS, HeLa и CHO. См. также публикацию PCT WO 87/04462. Подходящие клетки-хозяева не млекопитающих включают прокариотов (таких как E. coli или B. subtillis) и дрожжей (таких как S. cerevisae, S. pombe или K. lactis). Предпочтительно клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне примерно в 5 раз выше, более предпочтительно в 10 раз выше, еще более предпочтительно в 20 раз выше, чем у соответствующего эндогенного антитела или представляющего интерес белка, если таковой присутствует, в клетках-хозяевах. Скрининг клеток-хозяев на специфичное связывание с CD123 осуществляют с помощью иммуноанализа или FACS. Может быть идентифицирована клетка с оверэкспрессией представляющего интерес антитела или белка.

Наборы

В изобретении также предложены наборы для применения в настоящих способах. Наборы согасно изобретению включают один или более контейнеров, включающих антитело к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, и инструкции по применению в соответствии с любым из способов изобретения, описанного в настоящем документе. Обычно эти инструкции содержат описание применения антитела к CD123 или ADC к CD123 для вышеописанного терапевтического лечения.

Инструкции, касающиеся применения антител к CD123 или ADC к CD123, как описано в настоящем документе, обычно содержат информацию в отношении дозировки, схемы применения и пути введения для намеченного лечения. Контейнеры могут быть единичными дозами, упаковками недозированного препарата (например, многодозовыми упаковками) или субъединичными дозами. Инструкции, поставляемые в наборах согласно изобретению, представляют собой, как правило, письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажный лист, включенный в набор), однако также допускаются машиночитаемые инструкции (например, инструкции, содержащиеся на магнитном или оптическом дисковом запоминающем устройстве).

Наборы настоящего изобретения находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, без ограничения, флаконы, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, запаянные ПЭТФ или полиэтиленовые пакеты) и тому подобное Также предусмотрены пакеты для применения в сочетании с определенным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с раствором для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может быть пакетом с раствором для внутривенного введения или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно активное вещество в композиции является антителом к CD123. Контейнер может дополнительно включать второе фармацевтически активное вещество.

В наборах могут быть необязательно предоставлены дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретивная информация. Обычно набор включает контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или связанные с ним.

Биологическое депонирование

Репрезентативные материалы согласно настоящему изобретению были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 29 июня 2017 года. Вектор, имеющий регистрационный номер ATCC PTA-124283, представляет собой полинуклеотид, кодирующий последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела к CD123, и вектор, имеющий регистрационный номер ATCC PTA-124284 представляет собой полинуклеотид, кодирующий последовательность легкой цепи гуманизированного антитела к CD123. Депозиты были сделаны в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов в рамках патентной процедуры и правилами к нему (Будапештский договор). Это обеспечивает сохранение жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет с даты депонирования. Депозит будет предоставлен ATCC в соответствии с условиями Будапештского договора и при условии соглашения между Pfizer Inc. и ATCC, которое гарантирует постоянную и неограниченную доступность потомства депонированной культуры для общего доступа после выдачи соответствующего патента США или после публикации в общем доступе любой заявки на патент США или другой страны, в зависимости от того, что произойдет раньше, и гарантирует доступность потомства для стороны, определенной Комиссаром США по патентам и товарным знакам, и которая обладает на него правами согласно Разделу 122 35 U.S.C. и правилам Комиссара в соответствии с этим (включая Раздел 1.14 37 C.F.R. с конкретной ссылкой на 886 OG 638).

Правообладатель настоящей заявки согласен, что в том случае, если культура материалов депозита погибнет или будет потеряна или разрушена при выращивании в подходящих условиях, материалы будут быстро заменены по уведомлению другими такими же материалами. Доступность депонированного материала не следует рассматривать как лицензию на практическое применение изобретения в нарушение прав, предоставленных с разрешения какого-либо органа государственного управления в соответствии с действующим патентным правом.

Примеры

Следующие примеры предлагаются только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Фактически, различные модификации изобретения, в дополнение к показанным и описанным в настоящем документе, станут очевидными для специалистов в данной области из предшествующего описания и попадут в объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Цитотоксичность конъюгатов антитела к CD123-лекарственного средства in vitro

В данном Примере проиллюстрирована цитотоксичность различных ADC к CD123.

В этом исследовании цитотоксичность различных ADC к CD123 исследовали при использовании 2D анализа цитотоксичности in vitro в следующих линиях клеток ОМЛ: MOLM13, MV411, JVM3, Granata519, OCI-AML3, NB4 и HL60. В Таблице 4 показан уровень экспрессии CD123 для каждой из соответствующих используемых клеток.

Таблица 4. Уровень экспрессии CD123 в различных линиях клеток ОМЛ.

Линия клеток MOLM13 MV411 JVM3 Granta519 OCI-AML3 NB4 HL60 Уровень экспрессии CD123 +++ +++ ++ ++ + + -

Первой группой тестируемых ADC являлся ADC к CD123, конъюгированный с CPI с линкером AcLysValCitPABC. Этими ADC являлись: 18G3-CPI, 16D6-CPI, 3D1-CPI и 20D7-CPI, каждый из которых имеет отношение лекарственного средства:антитела (DAR) ~2. Препарат ADC к CD123 подробно описана в Примере 5, ниже. Контрольный IgG (IgG, не связывающийся с CD123) с CPI средством и DAR ~2 ("Neg.8.8") использовали в качестве отрицательного контроля.

Для 2D анализа цитотоксичности in vitro, клетки ОМЛ инкубировали с ADC или контролем в следующих дозах: 100 нг/мл, 25 нг/мл, 6,25 нг/мл, 1,56 нг/мл, 0,39 нг/мл, 0,09 нг/мл, 0,024 нг/мл, 0,006 нг/мл, 0,002 нг/мл и 0,0004 нг/мл в течение 96 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием CelltiterGlo (Promega, Madison, WI) и люминесценцию определяли с помощью анализатора планшетов Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA). Вычисления значений 50% ингибирования (IC50) производили с помощью 4-параметрической аппроксимации кривой XLfit (IDBS, Boston, MA). Результаты представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Значения IC50 ADC CD123-CPI в клетках ОМЛ.

ADC IC50 (нг/мл) в клетках ОМЛ MOLM13 MV411 JVM3 Granta519 OCI-AML3 NB4 HL60 18G3-CPI 0,25±
0,04 0,41±
0,07 0,69±
0,22 0,38±
0,01 2,65±
0,12 63,92±
36,08 >84,4±
33,30 16D6-CPI 0,22±
0,05 0,4±
0,15 0,59±
0,24 - - - >105,34±
94,66 3D1-CPI 0,33±
0,06 - - - - - >104,68±
95,32 20D7-CPI 0,32±
0,14 - - - - - - Neg.8.8-CPI >88,43±
18,66 >90,82±
8,64 >77±
14,3 >87,85±
12,14 >100±0 >100±0 >113,43±
19,09

Результаты показывают, что CD123-CPI являются цитотоксическими для клеток, которые экспрессируют CD123, причем они являются более цитотоксическими, чем неспецифичный CP1 (NEG8.8-CPI). Например, в клетках MOLM13, IC50 ADC к CD123 18G3-CPI, 16D6-CPI и 3D1-CPI составляют 0,25±0,04 нг/мл, 0,22±0,05 нг/мл, 0,33±0,06 нг/мл и 0,32±0,14 нг/мл, соответственно. В отличие от этого, IC50 NEG.8.8-CPI составило >88,43±18,66 (Таблица 5, последняя строка). NEG.8.8-CPI с DAR ~2 был существенно менее активным при максимальных тестируемых дозах (Таблица 5, последняя строка). Значения IC50 указанных ADC к CD123 хорошо коррелируют с уровнем экспрессии CD123 на клетках (Таблицы 4 и 5). Например, IC50 18G3-CPI в клетках MV411, экспрессирующих высокие уровни CD123, составляет 0,41±0,07. В то же время, IC50 18G3-CPI в клетках NB4, экспрессирующих низкие уровни CD123, составляет 63,92±36,08, а IC50 18G3-CPI в клетках HL60, не экспрессирующих CD123, составляет >84,4±33,30.

CD123-18G3 ADC был конъюгирован с другим средством, либо iPr-калихеамицин, либо CTI (глюкуронид) имеет подобный цитотоксический эффект. Результаты анализа цитотоксичности для 18G3, конъюгированного с iPr-калихеамицином ("iPr"), приведены в Таблице 6. Результаты анализа цитотоксичности для 18G3, конъюгированного с CTI (глюкуронид), приведены в Таблице 7.

Таблица 6: значения IC50 CD123-iPr ADC в клетках ОМЛ.

IC50 (нг/мл) в клетках ОМЛ Линия клеток MOLM13 MV4-11 Уровень экспрессии CD123 +++ +++ 18G 3-iPr 0,05075±0.01 0,125±0,06 Neg 8.8-iPr 96,23 >100

Таблица 7: значения IC50 CD123-CTI ADC в клетках ОМЛ.

IC50 (нг/мл) в клетках ОМЛ Линия клеток MOLM13 MV411 Granta519 JVM3 OCI-AML3 NB4 HL60 Уровень экспрессии CD123 +++ +++ ++ ++ + + - 18G3-CTI 0,33±
0,05 0,51±
0,06 0,26±0,04 1,3±0,36 2,58±0,6 38,60±
9,18 >100±0 Neg.8.8-CTI >100±0 84,96±
15,04 >100±0 >100±0 >100±0 >100±0 >100±0

Эти данные демонстрируют, что CD123-ADC с DAR ~2 активны и вызывают гибель клеток в CD123-экспрессирующих линиях раковых клеток, но неактивны в клетках, не экспрессирующих CD123. Это демонстрирует активность и специфичность этих ADC.

Пример 2: Сигнальный путь интерлейкина-3 (IL-3) и цитотоксичность антител и ADC к CD123

Данный Пример иллюстрирует способность блокировать сигнализацию IL-3 антител к CD123, а также цитотоксичность ADC к CD123.

Это исследование проводили с целью определить, связывается ли какой-либо из клонов антитела к CD123 конкурентно с IL-3-связывающими участками в CD123/IL-3Rα-экспрессирующих клетках TF-1. CD123/IL-3Rα-экспрессирующие клетки TF-1 совместно инкубировали с 20 нг/мл IL-3 и следующими антителами к CD123: 3D1, 18G3 и 16D6 в дозах 100 нг/мл, 25 нг/мл, 6,25 нг/мл, 1,56 нг/мл, 0,39 нг/мл, 0,09 нг/мл, 0,024 нг/мл, 0,006 нг/мл, 0,002 нг/мл и 0,0004 нг/мл. Антитело к CD123 7G3 использовали в качестве эталонного антитела, которое, как было показано, блокирует сигнальный путь IL-3, и антитело Neg 8,8 использовали в качестве отрицательного контроля. Для теста CTG, измеряющего выживание клеток, клетки обрабатывали в течение четырех дней при 37°C. После периода обработки клетки собирали и получали белок. Уровни STAT5, фосфорилированного STAT5 и актина определяли с помощью Вестерн-блот-анализа. Результаты Вестерн-блоттинга показаны на ФИГ. 1.

Присутствие нижестоящего сигнального белка, фосфорилированного ("Фосфо-Stat5") STAT5, указывает на активацию сигнального пути IL-3. Обработка клеток TF-1 только одним IL-3 или IL-3 и контрольным антителом Neg 8.8 ("8.8") активировало сигнализацию IL-3, на которую указывало присутствие фосфо-Stat5 (ФИГ. 1). Обработка антителом к CD123 7G3 блокирует сигнализацию IL-3. Антитело к CD123 3D1 также блокировало этот путь. В отличие от этого, антитела к CD123 18G3 и 16D6 не блокировали фосфорилирование IL-3-опосредованного STAT5.

Цитотоксичность CD123-18G3-CPI и CD123-16D6-CPI сохранялась в присутствии IL-3 (Таблица 8).

Таблица 8

Линия клеток IL-3 (нг/мл) IC50 (нг/мл) в клетках ОМЛ Neg.8.8-CPI CD123-18G3-CPI CD123-16D6-CPI MOLM13 0 44,24±0,0 0,14±0,0 0,23±0,0 MOLM13 0,3 42,93±0,0 0,12±0,0 0,23±0,0 MOLM13 1 28,38±0,0 0,14±0,0 0,19±0,0 MV4-11 0 >200 1,07±0,0 1,25±0,0 MV4-11 0,3 >200 1,05±0,0 1,13±0,0 MV4-11 1 >200 0,21±0,0 1,13±0,0

Пример 3: Эффективность CD123-ADC in vivo

Данный Пример иллюстрирует эффективность ADC к CD123 in vivo.

Противоопухолевую активность ADC к CD123 исследовали in vivo при использовании моделей на ксенотрансплантатах линии клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). В каждой модели, описанной ниже, первую дозу вводили в День 0. Опухоли измеряли по меньшей мере один раз в неделю, и их объем вычисляли согласно формуле: объем опухоли (мм³)=0,5×(ширина опухоли²)(длина опухоли). Средние объемы опухоли (±S.E.M.) для каждой группы лечения вычисляли при включении 10 животных. Все эксперименты на животных проводили в учреждении, аккредитованном Ассоциацией по оценке лабораторного ухода за животными в соответствии с руководством Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и соответствующим разрешением на проведение исследований на животных. ADC к CD123 продемонстрировали высокую эффективность в линиях клеток с различными мутациями генов или оверэкспрессией генов и/или белков дозозависимым образом.

A. Ксенотрансплантаты ОМЛ H.1 MOLM13

Противоопухолевую активность ADC к CD123 исследовали в отношении роста человеческих опухолей in vivo у мышей NOD/SCID с иммунодефицитом. Для подкожных (sc) моделей ОМЛ, 5×10⁶ клеток MOLM13 подкожно имплантировали в бок самок мышей. Когда опухоли достигали среднего объема 200 мм³, у животных определяли стадию, чтобы гарантировать однородность размера опухоли в разных группах лечения. В модели на ксенотрансплантатах MOLM13 ОМЛ sc внутривенно вводили дозу четыре раза каждые четыре дня (Q4d×4) растворителя PBS, CD123-CPI (18G3, 16D6 или 3D1) в дозе 0,3 мг/кг или 1 мг/кг, или контроль Neg-8.8-CPI в дозе 0,3 мг/кг или 1 мг/кг. Данные приведены в Таблице 9.

Таблица 9

Ксенотрансплантаты ОМЛ MOLM-13, средний объем опухоли (мм³ +/- SEM) Q4d×4 PBS CD123-CPI Neg 8.8-CPI 18G3-CPI 16D6-CPI 3D1-CPI ДОЗА (мг/кг) 0 0,3 1 0,3 1 0,3 1 0,3 1 День 0 248±10 251±7 250±13 241±17 248±6 249±5 247±12 252±14 246±14 День 2 660±38 407±25 386±35 391±43 319±24 337±18 405±43 553±49 448±52 День 5 1313±51 322±27 239±36 293±37 173±19 261±15 261±30 651±60 388±43 День 9 2802±90 123±14 95±8 136±17 64±7 127±7 96±13 486±64 193±38 День 12 - 16±11 0±0 28±14 0±0 20±11 0±0 374±72 83±15 День 17 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 169±67 0±0 День 20 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 354±115 0±0 День 25 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 1148±307 0±0 День 27 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 1010±324 0±0 День 33 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 2015±487 0±0 День 40 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 2703±590 0±0 День 48 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 День 54 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 День 54 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 День 60 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0

CD123-CPI значимо ингибировал опухоль по сравнению с NEG.8.8-CPI (Таблица 9). В дозе 0,3 мг/кг все три ADC к CD123: 18G3-CPI, 16D6-CPI и 3D1-CPI, были цитотоксическими. На день 17, десять из десяти животных в каждой группе показали регрессию опухоли. Все эти мыши не имели опухоли по меньшей мере до дня 60, когда исследование было завершено. При дозе 1 мг/кг ADC к CD123 регрессию опухоли наблюдали раньше, в день 12.

Эти данные демонстрируют, что CD123-CPI ингибирует рост ксенотрансплантатных опухолей ОМЛ MOLM13.

Для проверки эффективности CD123-ADC в более низких дозах, исследование эффективности in vivo проводили при использовании той же модели MOLM13. Животные получали лечение, как описано выше. Как показано ниже в Таблице 10, CD123-CPI в дозе 0,1 мг/кг с высокой эффективностью и дозозависимо ингибируют рост опухоли у всех мышей (Таблица 10, центральные столбцы "18G3-CPI" и "16D6-CPI"). В то же время, опухоли у мышей, получавших Neg. 8,8-CPI, продолжали расти (Таблица 10, правый столбец " Neg. 8,8-CPI").

Таблица 10

Ксенотрансплантаты ОМЛ MOLM-13, средний объем опухоли (мм³ +/-SEM) Q4d×4 PBS CD123-CPI Neg 8.8-CPI 18G3-CPI 16D6-CPI Контроль Доза→
(мг/кг) 0 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 День 0 177±
10 187±
14 183±
15 181±
11 184±
13 181±
12 182±
9 181±
15 183±
14 188±
24 День 4 551±
47 199±
21 147±
21 112±
14 226±
22 178±
20 87±
9 494±
43 324±
56 209±
50 День 9 1614±
125 120±
19 40±
13 4±4 169±
27 51±
13 0±0 1530±
123 1060±
159 157±
38 День 11 2216±
149 110±
29 13±
10 0±0 217±
52 10±
10 0±0 2075±
79 1253±
170 78±
25 День 14 - 112±
45 0±0 0±0 371±
94 0±0 0±0 - 2217±
219 77±
31 День 16 - 106±
49 0±0 0±0 411±
104 0±0 0±0 - 1749±
280 38±
23 День 22 - 385±
143 0±0 0±0 1319±
275 0±0 0±0 - - 147±
67 День 25 - 859±
308 0±0 0±0 1470±
344 0±0 0±0 - - 356±
136 День 29 - 720±
273 0±0 0±0 1948±
653 0±0 0±0 - - 865±
298 День 31 - 805±
349 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - 577±
251 День 37 - 927±
653 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - 1154±
352 День 42 - 747±
747 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - 2363±
158 День 47 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - День 53 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - День 57 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - День 65 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - -

Для проверки эффективности CD123-18G3-CTI, исследование эффективности in vivo проводили при использовании той же модели MOLM13. Животные получали лечение, как описано выше. Как показано в Таблице 11, лечение CD123-18G3-CTI ингибировало рост опухоли у мышей дозозависимым образом. В то же время, опухоли у мышей, получавших Neg. 8.8-CTI, продолжали расти.

Таблица 11

Ксенотрансплантаты ОМЛ MOLM-13, средний объем опухоли (мм³ +/-SEM) Q4d×4 Neg.8.8-CTI CD123-18G3-CTI (Глюкуронид) CD123-18G3-CTI (Галактозид) ДОЗА (мг/кг) 0,1 (Glu) 0,3 (Gal) 0,01 0,03 0,1 0,01 0,03 0,1 0,3 День -1 207±12 213±12 205±11 211±9 213±11 208±8 202±7 209±14 213±15 День 5 698±46 805±67 702±41 640±48 358±32 808±88 688±46 391±30 320±34 День 8 1264±
80 1304±
106 1215±
71 834±77 307±27 1500±113 1191±
85 354±33 248±31 День 12 2551±
117 2062±
142 2338±
118 1196±
133 147±17 - 2165±
160 278±27 127±17 День 15 - - - 1214±
128 61±6 - - 175±21 59±14 День 19 - - - 1583±
192 38±12 - - 142±28 13±8 День 22 - - - - 0±0 - - 115±36 18±12 День 26 - - - - 0±0 - - 194±58 0±0 День 29 - - - - 0±0 - - 266±93 0±0 День 36 - - - - 0±0 - - 635±
194 0±0 День 39 - - - - 0±0 - - 906±254 0±0 День 42 - - - - 0±0 - - - 0±0 День 49 - - - - 0±0 - - - 0±0 День 54 - - - - 0±0 - - - 0±0 День 60 - - - - 0±0 - - - 0±0

B. Ксенотрансплантаты ОМЛ H.2 MV4-11

Влияние ADC к CD123 на рост человеческих опухолей оценивали при использовании иммунодефицитных мышей. Для подкожных (sc) моделей ОМЛ, 5×10⁶ клеток MV4-11 подкожно имплантировали в бок самок мышей NOD-SCID. Когда опухоли достигли среднего объема 200 мм³, у животных определяли стадию, чтобы гарантировать однородность размера опухоли в разных группах лечения. Животным с ксенотрансплантатами ОМЛ MV4-11 sc внутривенно вводили дозы четыре раза каждые четыре дня (Q4dx4) растворителя PBS, CD123-CPI или 8,8-CPI в следующих дозах: 0,1, 0,3 и 0,6 мг/кг. Данные приведены в Таблице 12. CD123-18G3-H16-CPI сравнивали с Neg. 8.8-CPI и растворителем PBS.

Доза 0,6 мг/кг CD123-CPI являлась самым активным ADC, протестированным в данном исследовании, и на день 65 десять из десяти животных, оставшихся в исследовании, не имели опухоли. Даже при дозе 0,3 мг/кг девять из десяти мышей показали регрессию опухоли около дня 25 и оставались без опухоли, пока исследование не было завершено в день 65. Данные демонстрируют, что CD123-CPI ингибирует рост ксенотрансплантатных опухолей MV4-11.

Таблица 12

Ксенотрансплантаты ОМЛ MV4-11, средний объем опухоли (мм³ +/-SEM) q4d×4 PBS CD123-18G3-H16-CPI Neg 8.8-H16-CPI ДОЗА (мг/кг) 0 0,1 0,3 0,6 0,1 0,3 0,6 День 0 235±14 236±17 232±13 232±15 236±9 233±11 228±12 День 3 373±19 225±19 183±11 174±16 310±20 289±13 204±16 День 8 579±62 142±15 114±9 101±7 509±41 230±39 118±11 День 11 961±112 161±24 98±9 79±7 767±72 289±55 107±16 День 15 1876±200 189±63 70±18 57±12 1428±157 395±77 60±20 День 18 1781±467 226±84 60±17 57±12 1773±136 615±123 77±23 День 21 - 392±144 96±23 67±14 2560±220 954±186 112±32 День 25 - 729±271 111±56 49±20 - 1632±230 168±87 День 28 - 626±337 125±101 67±30 - 1684±688 301±150 День 32 - 215±197 208±183 113±79 - 1645±677 431±197 День 36 - 385±367 40±16 198±177 - 1541 494±129 День 39 - 0±0 21±11 265±249 - 1901 603±153 День 44 - 15±15 29±12 31±15 - - 1346±348 День 51 - 0±0 20±10 32±18 - - 711±411 День 58 - 40±23 20±10 27±13 - - 1450±818 День 65 - 0±0 9±6 19±10 - - День 73 0±0 0±0 0±0

Для проверки эффективности CD123-CTI, исследование эффективности in vivo проводили с помощью такой же модели MV4-11. Животные получали лечение, как описано выше. Как показано в Таблице 13, CD123-CTI также ингибирует рост опухоли у мышей дозозависимым образом, тогда как опухоли у мышей, получавших Neg. 8.8-CTI, продолжали расти.

Таблица 13

Ксенотрансплантаты ОМЛ MV4-11, средний объем опухоли (мм³ +/-SEM) Q4d×4 Neg.8.8-CTI CD123-18G3-CTI (Глюкуронид) CD123-18G3-CTI (Галактозид) ДОЗА (мг/кг) 0,3
(Glu) 0,3
(Gal) 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 День -1 229±14 232±10 235±21 232±11 235±14 233±11 232±14 229±13 День 4 307±18 301±18 299±28 221±15 189±9 270±23 260±14 216±18 День 7 361±37 408±49 468±37 193±10 122±9 333±19 214±23 163±12 День 12 458±58 759±74 804±85 215±30 96±12 625±52 325±52 121±25 День 15 513±57 868±78 1165±128 214±35 83±14 873±86 425±68 114±25 День 18 640±85 1367±179 1551±107 229±43 75±11 1348±104 519±88 96±19 День 21 867±108 1970±227 2263±90 311±60 94±19 2140±162 716±124 86±20 День 25 1264±179 - - 391±85 50±14 - 900±170 70±16 День 28 1497±159 - - 484±99 73±16 - 1192±251 64±16 День 32 - - - 627±121 107±19 - - 82±21 День 35 - - - 771±144 89±17 - - 92±21 День 40 - - - 1056±205 65±16 - - 74±24 День 43 - - - - 46±11 - - 113±44 День 47 - - - - 58±10 - - 135±72 День 50 - - - - 67±12 - - 198±107 День 54 - - - - 49±9 - - 339±210 День 61 - - - - 61±8 - - 337±273 День 70 - - - - 41±7 - - - День 78 - - - - 23±7 - - - День 84 - - - - 35±8 - - - День 92 - - - - 16±6 - - - День 99 - - - - 11±5 - - -

Эти результаты демонстрируют, что ADC к CD123 очень эффективен при лечении опухолей.

Пример 4: Эффективность CD123-ADC in vivo

Данный Пример иллюстрирует эффективность ADC к CD123 in vivo при использовании диссеминированных ксенотрансплантатов, полученных у пациентов с ОМЛ (AML PDX).

Активность CD123-CPI в отношении роста in vivo в диссеминированной модели исследовали у иммунодефицитных мышей с клетками костного мозга, полученных у пациентов в соответствии с надлежащими процедурами получения согласия. В Таблице 14 предоставлено краткое описание образцов пациентов, используемых в данном исследовании.

Таблица 14

Модель Риск Подтип Нарушение Цитогенетика PDX2407 Высокий, рецидивы M2 FLT3-ITD 46, XY PDX0407 Средний M2 NPM-1
FLT3-ITD 46, XY CTG 2226 Высокий, рефрактерный M4 FLT3-ITD
Цитогенетика 46,XY, add(6)(p21),del(8)(p21),
add(12)(q24.1)[13]/46,XY, del(1)
(q32),del(7)(q22q32),der(6;12)
(q10;p10),add(22)(q?11.2),
+mar[3]/45,XY, t(1;2)(p?22;q11.2),-21[1]/46,XY[3] CTG 2229 Высокий, рефрактерный M1 Цитогенетика 46,XY, del(2)(p13p?23),t(4;13)(q31;q34),add(4)(q?25),del(6)(q13q25),t(9;22)(q34;q11.2),del(10)(q24),add(16)(q24)[20] CTG 2235 Средний, de novo AML-MLD Цитогенетика 46,XY, del(20)(q11.2q13.1)[20] CTG 2238 Высокий
de novo Не выбран FLT3-ITD Нет данных CTG2240 Средний, de novo AML-MLD Цитогенетика 46,XY, t(9;11)(p22;q23),?add(10)
(q?24)[5]/46,XY[5] 50170 Высокий, с рецидивами M1 FLT3-ITD 46, XY 50102 Благоприятный Неопреде-ленный Не определяли Не определяли

Для исследований 1,0×10⁶ клеток костного мозга пациента внутривенно вводили в латеральную хвостовую вену облученных мышей NSG. Исследование включало определение стадии и рандомизацию на основе приживления человеческих CD45+/CD123+/CD33+ клеток (12-55% в периферической крови при измерении с помощью проточно-цитометрического окрашивания). Мышам AML PDX внутривенно 2 раза каждые семь дней вводили дозы (Q7d×2) растворителя PBS или 18G3-CPI. Приблизительно через 3-5 дней после введения второй/последней дозы периферическую кровь и костный мозг забирали у умерщвленных мышей. Опухолевые клетки, оставшиеся в костном мозге и крови умерщвленных животных, исследовали с помощью проточной цитометрии. Результаты приведены на графике на ФИГ. 2 и в Таблице 15. В Таблице 15 числа представляют собой процент опухолевых клеток, оставшихся в периферической крови и костном мозге.

Каждое исследование включало приблизительно 6-10 мышей на группу. Данные демонстрируют, что ADC к CD123 являлся эффективным при снижении количества опухолевых клеток как в периферической крови, так и в костном мозге дозозависимым образом (ФИГ. 2 и Таблица 15).

Таблица 15

Модель Доза
CD123-CPI Периферическая кровь Костный мозг мг/кг % лечение/% растворитель
(%±SEM) % лечение/% растворитель
(%±SEM) PDX2407 0,1 0,56±0,1/88±1,1 3,04±0,7/90±2 0,5 0,3±0,05/88±1,1 0,14±0,03/90±2 PDX0407 0,03 1,1±0,2/29±4,8 1,3±0,4/30±14 0,1 0,16±0,04/29±4,8 0,8±0,3/30±14 CTG 2226 0,03 1,5±0,4/21±2 18±1,9/77±7,4 0,1 0,9±0,3/22±2 8±1,6/77±7,4 CTG 2229 0,03 54±9/65±3,2 83±6,9/84±6 0,1 16±2,5/65±3,2 50±9,7/84±6 CTG 2235 0,03 1,8±0,6/31±6 73±6,1/83±4,5 0,1 0,7±0,23/31±6 59±6,3/83±4,5 CTG 2238 0,03 5,8±0,7/32±2 45±9,7/95±0,6 0,1 1,7±0,5/32±2 12±1,6/95±0,6 CTG2240 0,03 1±0,4/52±2,9 60±12/99±0,1 0,1 0,2±0,07/52±2,9 16±6,7/99±0,1 PDX 50170 0,03 0,4±0,1/14±1,4 24±7,3/46±9,6 PDX 50120 0,03 53±0,8/58±0,8 83±1,9/77±2,6 0,1 40±4,2/58±0,8 83±4,7/77±2,6 0,3 31±2,4/58±0,8 78±1,9/77±2,6

Для определения, может ли CD123-18G3-CPI увеличивать общую выживаемость мышей-опухоленосителей, проводили исследование выживаемости с использованием PDX2407, если периферическая кровь показывала высокую приживаемость, т.е. ~32% в среднем. Мышам внутривенно вводили дозу 2 раза каждые семь дней (Q7dx2) раствортеля PBS или CD123-CPI и вели ежедневное наблюдение. Если мышь демонстрировала клинические признаки, такие как летаргию и потерю веса (в соответствии с утвержденным Ассоциацией по оценке лабораторного ухода за животными руководством Институционального комитета по уходу за животными и их использованию), мышь усыпляли.

Результаты приведены на графике на ФИГ. 3. Лечение CD123-18G3-CPI дозозависимо увеличивает общую выживаемость животных, имеющих опухоли. В частности, лечение CD123-18G3-CPI в дозе 0,1 мг/кг увеличивало выживаемость приблизительно на 25%, а лечение CD123-18G3-CPI в дозе 0,3 мг/кг увеличивало выживаемость приблизительно в два раза (ФИГ. 3).

Эти результаты демонстрируют, что лечение CD123-ADC вызывает регрессию и ингибирует прогрессирование ОМЛ и увеличивает выживаемость.

Пример 5: Получение конъюгата антитела-лекарственного средства (ADC) против CD123

Данный Пример иллюстрирует конъюгирование и получение h18G3 AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314, ADC к CD123, также указанного в настоящем документе как "18G3-CPI" или "CD123-18G3-CPI".

18G3-CPI представляет собой ADC, состоящий из гуманизированного мАт 18G3 против CD123 (см. Таблицы 2.0 и 2.1, выше, "h18G3"), линкера AcLysValCitPABC и циклопропилпирролоиндолинового (CPI) средства. Мутации K222R, E295L, Q295L, Y296Q, N297G были введены в верхнюю шарнирную область и Fc для обеспечения сайт-специфического конъюгирования CPI средства, катализируемого трансглутаминазой. Аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи гуманизированного IgG1 антитела CD123-18G3-H16-N60G-K222R (именуемого в настоящем документе как "h18G3") являются следующими:

Легкая цепь:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:30)

Тяжелая цепь:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGGTNYGSRLMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGNFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:27)

Последовательность сайт-специфической мутации H16 выделена полужирным курсивом выше и включает пять H16 сайт-специфических мутаций для трансглутаминазы K222R (в шарнирной области), E294L, Q295L, Y296Q и N297G. Последовательность LLQG является меткой, распознаваемой трансглутаминазой, и линкер-средство конъюгировано по Q296. G в CDR-H2 (подчеркнут) является мутацией N60G.

Линкер-средство, AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI, сайт-специфически конъюгировано по аминокислоте Q296. Структура линкера-средства AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 показана ниже.

h18G3 конъюгировали с линкер-средством AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 с помощью бактериальной трансглутаминазы (Sigma, 45 Ед/мг белка). В частности, антитело подвергали замене буфера в буфере, содержащем 100 мМ KPO₄, 200 мМ NaCl, pH 7. Линкер-средство добавляли в 10-кратном молярном избытке к антителу в присутствии 7,5% (об/об) диметилсульфоксида (ДМСО). Ферментативную реакцию инициировали добавлением 1 Ед бактериальной трансглутаминазы на мг антитела и инкубировали при 25°C в течение ночи с непрерывным перемешиванием.

Реакционную смесь инкубировали с 15% изопропиловым спиртом в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь разбавляли в 4 объемах 1М KPO₄ буфера и очищали с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) при использовании колонки с бутилсефарозой HP (GE Lifesciences). В методе использовали 1М KPO₄, 50 мМ Трис, pH 7 для связывания и ADC элюировали 50 мМ Трис, pH 7 в 10 CV. Очищенное с помощью HIC соединение диализировали в конечном буфере, содержащем 20 мМ гистидина, 85 мг/мл сахарозы, pH 5,8. Затем ADC дополнительно исследовали с помощью SEC на чистоту и обращенно-фазовой хроматографии для вычисления отношения лекарственного средства-антитела. Концентрацию белка определяли с помощью УФ-спектрофотометра.

Основное антитело показало очень хорошую экспрессию до 700 мг/л при оценке в пулах CHO, 88% выход при очистке и 99% чистоту после трех стадий очистки. 18G3 показало очень хорошую эффективность конъюгирования при оценке достигаемого DAR 1,9-2,0 и 55-60% выхода конъюгирования после очистки. Полученный ADC, CD123-18G3-H16-N60G-K222R-hG1-(Q)AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI, показал хорошую термостабильность и молекулярную целостность.

Пример 6: Способы конъюгирования антитела с AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 при использовании трансглутаминазы

Данный Пример иллюстрирует конъюгирование антитела с линкер-средством AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314, также указанным в настоящем документе как AcLysPABC-CPI-8314.

Конъюгирование CPI-линкер-цитотоксического средства. Конъюгирование AcLysPABC-CPI-8314 (структура показана выше в Примере 5) по сайту H16 антитела оптимизировали путем изменения множества различных параметров, таких как молярная концентрация и солевой состав, pH, концентрация фермента, время и температура (Таблица 16). Вкратце, антитело подвергали замене буфера в подходящем буфере и при рН, в каждых из условий, показанных в Таблице 16. 10-кратный молярный избыток линкер-средства AcLysPABC-CPI-8314 добавляли к антителу и 5-10% диметилсульфоксида добавляли для солюбилизации линкер-средства в реакционной смеси. После добавления бактериальной трансглутаминазы (0,5-5 Ед/мг антитела) реакционную смесь непрерывно перемешивали в течение указанного времени и температуры. Непрореагировавшее линкер-средство и фермент трансглутаминазу удаляли с помощью эксклюзионной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия. Отношение лекарственного средства-антитела вычисляли с помощью ЖХМС или ОФ-ВЭЖХ.

Эффективность конъюгирования при измерении по отношению лекарственного средства-антитела (DAR) для различных условий показана в Таблице 16. Например, при замене буфера антитела в буфере, содержащем 30 мМ KPO₄, 150 мМ NaCl при pH 7, было достигнуто DAR 1,6.

Антитела, направленно взаимодействующие с CD33, CD123, Her2, PRLR, CD22 и другими антигенами, включая антигены, конъюгировали с линкер-средством AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 при использовании этих оптимизированных условий.

Таблица 16

Ионная сила буфера Концентрация NaCl, мМ pH Единицы ТГ/мг Ат Отношение ЛС-антитело (DAR) 20 мМ NaAc 75 5,8 1 0,3 30 мМ KPO4 150 6,5 1 1,3 30 мМ KPO4 150 7,0 0,5 1,6 30 мМ KPO4 150 7,0 2 1,6 30 мМ KPO4 150 7,0 5 1,4 30 мМ KPO4 150 7,5 1 1,5 30 мМ KPO4 150 8,0 1 0,6 25 мМ Трис 150 8,0 1 0,6

Хотя раскрытые идеи были описаны со ссылкой на различные применения, способы, наборы и композиции, следует понимать, что различные изменения и модификации могут быть внесены без отступления от идей, изложенных в настоящем документе и заявленном изобретении ниже. Вышеприведенные примеры представлены для лучшей иллюстрации раскрытых идей и не предназначены для ограничения объема идей, представленных в настоящем документе. Хотя настоящие идеи были описаны в отношении этих примеров осуществления, специалист в данной области легко сумеет понять, что многочисленные вариации и модификации этих примеров осуществления возможны без излишних экспериментов. Все подобные вариации и модификации включены в рамки настоящего описания.

Все источники, цитируемые в настоящем документе, включая патенты, заявки на патент, статьи, справочники и тому подобное, а также источники, цитируемые в них, в той же степени, в какой они еще не включены, настоящим включены посредством отсылки во всей своей полноте. В случае, если один или более из включенных источников и аналогичных материалов отличаются от настоящей заявки или противоречат ей, включая, без ограничения перечисленным, определенные термины, употребление терминов, описанные методики и тому подобное, настоящая заявка имеет преимущественную силу.

Вышеизложенное описание и примеры подробно описывают некоторые определенные варианты осуществления изобретения и описывают наилучший способ осуществления, предусмотренный авторами изобретатения. Однако следует учитывать, что независимо от того, насколько подробно вышеизложенное может быть представлено в тексте, изобретение может быть практически осуществлено многими способами, и поэтому изобретение следует рассматривать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПФАЙЗЕР ИНК.

ЧАРАТИ, Манодж Бабурао

ХАН, Йоон-Чи

КАТРАГАДДА, Мадан

ПИШЕ-НИКОЛЯ, Николь Мелисса

ТЬЮМИ, Лоуренс Натан

<120> АНТИТЕЛА И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА-ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА,

СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD123, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> PC72333

<160> 108

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Arg Met Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn

35 40 45

Val Thr Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala

50 55 60

Val Asn Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val

65 70 75 80

Thr Asn Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile

85 90 95

Leu Phe Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu

100 105 110

Thr Cys Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val

115 120 125

Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val

130 135 140

Ala Asn Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala

145 150 155 160

Gln Gly Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala

180 185 190

Phe Gly Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu

195 200 205

Ile Leu Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser

210 215 220

Phe Met His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr

225 230 235 240

Glu Leu Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val

245 250 255

Arg Asp Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val

260 265 270

Gln Ile Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser

275 280 285

Thr Pro Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg

290 295 300

Ala Trp Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu

305 310 315 320

Val Cys Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu

325 330 335

Phe Pro Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln

340 345 350

Asn Asp Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu

355 360 365

Cys Leu Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

370 375 380

<210> 2

<211> 336

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Arg Met Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn

35 40 45

Val Thr Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala

50 55 60

Val Asn Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val

65 70 75 80

Thr Asn Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile

85 90 95

Leu Phe Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu

100 105 110

Thr Cys Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val

115 120 125

Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val

130 135 140

Ala Asn Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala

145 150 155 160

Gln Gly Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser

165 170 175

Ser Gly Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala

180 185 190

Phe Gly Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu

195 200 205

Ile Leu Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser

210 215 220

Phe Met His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr

225 230 235 240

Glu Leu Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val

245 250 255

Arg Asp Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val

260 265 270

Gln Ile Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser

275 280 285

Thr Pro Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg

290 295 300

Ala Trp Arg Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

305 310 315 320

Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

325 330 335

<210> 3

<211> 301

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Thr Lys Glu Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn

20 25 30

Leu Thr Cys Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala

35 40 45

Val Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn

50 55 60

Val Ala Asn Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp

65 70 75 80

Ala Gln Gly Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala

100 105 110

Ala Phe Gly Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile

115 120 125

Glu Ile Leu Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His

130 135 140

Ser Phe Met His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg

145 150 155 160

Tyr Glu Leu Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln

165 170 175

Val Arg Asp Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr

180 185 190

Val Gln Ile Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp

195 200 205

Ser Thr Pro Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr

210 215 220

Arg Ala Trp Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala

225 230 235 240

Leu Val Cys Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg

245 250 255

Leu Phe Pro Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe

260 265 270

Gln Asn Asp Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu

275 280 285

Glu Cys Leu Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

290 295 300

<210> 4

<211> 337

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Ala Pro Ile Arg Asn

20 25 30

Leu Arg Met Lys Glu Lys Ala Gln Gln Leu Met Trp Asp Leu Asn Arg

35 40 45

Asn Val Thr Asp Val Glu Cys Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Ser Met Pro

50 55 60

Ala Met Asn Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu

65 70 75 80

Val Thr Asn Tyr Thr Val Arg Val Ala Ser Pro Pro Phe Ser Thr Trp

85 90 95

Ile Leu Phe Pro Glu Asn Ser Gly Thr Pro Arg Ala Gly Ala Glu Asn

100 105 110

Leu Thr Cys Trp Val His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Val

115 120 125

Val Gly Pro Ala Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn

130 135 140

Asn Pro Asn Ser His Glu Gln Tyr Arg Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp

145 150 155 160

Ala Arg Gly Thr Gln Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ala Arg Leu

165 170 175

Ser Arg Gly Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala

180 185 190

Ala Val Ser Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Phe Phe Ser Gln Ile

195 200 205

Glu Arg Leu Thr Pro Pro Asn Met Thr Gly Glu Cys Asn Glu Thr His

210 215 220

Ser Phe Met His Trp Lys Met Lys Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg

225 230 235 240

Tyr Glu Leu Arg Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Arg Thr Glu Gln

245 250 255

Val Arg Asp Thr Thr Ser Phe Gln Leu Pro Asn Pro Gly Thr Tyr Thr

260 265 270

Val Gln Ile Arg Ala Arg Glu Thr Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp

275 280 285

Ser Thr Pro Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Ser Ser

290 295 300

Arg Ala Trp Arg Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

305 310 315 320

Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His

325 330 335

Glu

<210> 5

<211> 351

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 5

caggtgaaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc ccgcacagag tctgtccatt 60

acctgcactg tctctggatt ctcattaacc agtggtgaca taagttggat tcgccagcca 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatggtctg gcggaggcac aaattataat 180

tctcgtctca tgtccagact gagcatcacc aaggacaact ccaggagtca agtgttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacacc gccatatatt attgtgtaag agattggggt 300

aacttttact ttgactattg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 6

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ala Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gly

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Arg Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Trp Gly Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 7

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 8

Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Arg Leu Met Ser

1 5 10 15

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 9

Asp Trp Gly Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 10

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 98

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 12

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 13

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu

50 55 60

Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

100 105

<210> 15

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 15

Gln Val Lys Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ala Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gly

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Arg Leu Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Trp Gly Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 16

<211> 336

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 16

gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagtaggaga gaaggtcact 60

atgagctgca aatccagtca gagtctgctc agcagtggaa cccgaaagaa ctacttggct 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180

caatctgggg tccctgatcg cttcacaggc ggtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgcaggctga ggacctggca gtttattact gcagtcaatc ttataatcta 300

tacacattcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336

<210> 17

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 17

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 18

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 19

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 19

Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 20

Ser Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 21

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 22

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 23

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 23

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 24

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gly

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Arg Leu Met

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Trp Gly Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 25

Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Arg Leu Met Ser

1 5 10 15

<210> 26

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 26

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Gly

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Ser Arg Leu Met

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Trp Gly Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 28

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 29

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 30

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 31

<211> 355

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 31

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccata 60

acctgcactg tctctgggtt ctcattaacc aactttgata taagttggat tcgccagcca 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atgtggactg gtggaggcac aaattataat 180

tcagctttca tgtccagact gagcatcagc agggacatct ccaaaagcca agtttcctta 240

aaaatgagca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag aggggatact 300

tacttctttg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctccg tcaccgtctc atcag 355

<210> 32

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 32

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Asp Thr Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 33

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Phe Asp Ile Ser

1 5 10

<210> 34

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 34

Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 35

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 35

Gly Asp Thr Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 36

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 37

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 37

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Gly Asp Thr Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 38

<211> 336

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 38

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca aatccagtca gagtctgctc agcagtggaa cccgaaagaa cttcttgtct 120

tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctattgggc atccactagg 180

ggatctgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtc tgcaacctga agattttgca acttactact gtaaacaatc ttataatcta 300

tacacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaa 336

<210> 39

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 39

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 40

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 40

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser Gly Thr Arg Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ser

<210> 41

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 41

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 42

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 42

Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr

1 5

<210> 43

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 43

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 44

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gln Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Val Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 45

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 45

Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gln Ser Ala Phe Met Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Gly Asp Val Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 47

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Met Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gln Ser Ala Phe Met

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Val Tyr Phe Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 48

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 49

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 50

<211> 354

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 50

gaggtccagc tacaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata caccttcagt gactacttca tgaagtgggt gaaacagagc 120

catggaaaga gacttgagtg gattggagat attaatccta acaatggtga aactttctac 180

aaccatcatt tcaagggcaa ggccacattg acaatagaca aatcctccag tacagcctac 240

atgcagctca acagcctgac atctgacgac tctgcagtct attactgtgc aagaccccgg 300

cgggggaatg ctatggactt ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354

<210> 51

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 51

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Phe Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Phe Tyr Asn His His Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Arg Arg Gly Asn Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 52

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 52

Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Met Lys

1 5 10

<210> 53

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 53

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Phe Tyr Asn His His Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 54

Pro Arg Arg Gly Asn Ala Met Asp Phe

1 5

<210> 55

<211> 447

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 55

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Phe Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Phe Tyr Asn His His Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Arg Arg Gly Asn Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 56

<211> 339

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 56

gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcacc 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagaggca atcaaaagaa ctatttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaatttctgg tatattttgc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattattttt gtcagcaaca ttatagtatt 300

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaatacaa 339

<210> 57

<211> 113

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 57

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Phe Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Gln

<210> 58

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 58

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 59

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 59

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 60

Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr

1 5

<210> 61

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 61

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Gln

1 5 10

<210> 62

<211> 220

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Phe Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Gln Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 63

<211> 369

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 63

gaagtacagc tgcagcagtc tgggcccgag cttcggagac ctgggacctc agtcaagctg 60

tcttgtaagg cttctggcta cagtattaca gatttcctta tgtactgggt aaaacatagg 120

ccagaatacg gcctggaatg gattggatgg attgatcctg aggatggtga aacaaaatat 180

gctcagaagt tccaaagcaa ggcccgactg actgcagata cgtcctccaa aacagcctac 240

atggaactca gcagcctgac gtctgaggac acagcaacct atttttgtgc tagatggggc 300

tatatcacgg attatttcta tggcgggttt acttactggg gccgaggcac tctggtcact 360

gtctcttca 369

<210> 64

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 64

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Phe

20 25 30

Leu Met Tyr Trp Val Lys His Arg Pro Glu Tyr Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Ser Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Lys Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Tyr Ile Thr Asp Tyr Phe Tyr Gly Gly Phe Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 65

Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Phe Leu Met Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 66

Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Ser

<210> 67

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 67

Trp Gly Tyr Ile Thr Asp Tyr Phe Tyr Gly Gly Phe Thr Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 68

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 69

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Phe

20 25 30

Leu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Ser Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Ile Thr Asp Tyr Phe Tyr Gly Gly Phe

100 105 110

Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

195 200 205

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

210 215 220

Pro Lys Ser Cys Asp Arg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Leu Leu Gln

290 295 300

Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

325 330 335

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 70

<211> 318

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 70

gacatccaga tgacccagtc tcctccagtc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60

ctcagctgca aagcaagtca gaatattaat aagaacttag actggtatca gcaaaagcat 120

ggagaagctc caaaactcct gatatatcat acaaacactt tgcaaatggg catcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat tacgcactca ccatcaccag cctgcagcct 240

gaagatgttg ccacatatta ctgctatcaa tataacagtg ggcccacgtt tggagctggg 300

accaagctgg aactgaga 318

<210> 71

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 71

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Asn Thr Leu Gln Met Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ala Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Ser Gly Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

100 105

<210> 72

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 72

Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn Leu Asp

1 5 10

<210> 73

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 73

His Thr Asn Thr Leu Gln Met

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 74

Tyr Gln Tyr Asn Ser Gly Pro Thr

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 75

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 76

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Val Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asn Lys Asn

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys His Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Asn Thr Leu Gln Met Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ala Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Ser Gly Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 77

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 77

Gln Leu Gln Gly Leu Leu Gln Gly Gly

1 5

<210> 78

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 78

Leu Leu Gln Gly

1

<210> 79

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 79

Leu Ser Leu Ser Gln Gly

1 5

<210> 80

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 80

Gly Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 81

Gly Leu Leu Gln Gly

1 5

<210> 82

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 82

Leu Leu Gln Gly Ser Pro Leu Ala Gln Ser His Gly Gly

1 5 10

<210> 83

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 83

Gly Leu Leu Gln Gly Gly Gly

1 5

<210> 84

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 84

Gly Leu Leu Gln Gly Gly

1 5

<210> 85

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 85

Gly Leu Leu Gln

1

<210> 86

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 86

Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly Ala

1 5

<210> 87

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 87

Leu Leu Gln Gly Ala

1 5

<210> 88

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 88

Leu Leu Gln Tyr Gln Gly Ala

1 5

<210> 89

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 89

Leu Leu Gln Gly Ser Gly

1 5

<210> 90

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 90

Leu Leu Gln Tyr Gln Gly

1 5

<210> 91

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 91

Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly

1 5

<210> 92

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 92

Ser Leu Leu Gln Gly

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 93

Leu Leu Gln Leu Gln

1 5

<210> 94

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 94

Leu Leu Gln Leu Leu Gln

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 95

Leu Leu Gln Gly Arg

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 96

Leu Leu Gln Gly Pro Pro

1 5

<210> 97

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 97

Leu Leu Gln Gly Pro Ala

1 5

<210> 98

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 98

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro

1 5

<210> 99

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 99

Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala

1 5

<210> 100

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 100

Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys

1 5

<210> 101

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 101

Leu Leu Gln Gly Pro Gly

1 5

<210> 102

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 102

Leu Leu Gln Gly Pro

1 5

<210> 103

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 103

Leu Leu Gln Pro

1

<210> 104

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 104

Leu Leu Gln Pro Gly Lys

1 5

<210> 105

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 105

Leu Leu Gln Ala Pro Gly Lys

1 5

<210> 106

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 106

Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly

1 5

<210> 107

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 107

Leu Leu Gln Gly Ala Pro

1 5

<210> 108

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> СИНТЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ

<400> 108

Leu Leu Gln Leu Gln Gly

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к выделенному антителу, которое специфично связывается с CD123, а также к содержащему его конъюгату и композиции. Также раскрыты выделенный полинуклеотид, кодирующий вышеуказанное антитело, а также клетка и вектор, его содержащие. Изобретение также относится к способу получения антитела, предусматривающему культивирование вышеуказанной клетки. Изобретение эффективно для лечения состояния, связанного с клетками, экспрессирующими CD123. 16 н. и 23 з.п. ф-лы, 3 ил., 16 табл., 6 пр.

1. Выделенное антитело, которое специфично связывается с CD123, где антитело содержит тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:27, и легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:30.

2. Выделенное антитело, которое специфично связывается с CD123, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) с SEQ ID NO:24 и вариабельную область легкой цепи (VL) с SEQ ID NO:28.

3. Антитело по п.1 или 2, где антитело содержит ацил-донорную глутамин-содержащую метку.

4. Антитело по п.3, где ацил-донорная глутамин-содержащая метка представляет собой LLQG (SEQ ID NO:78).

5. Конъюгат для направленной доставки средства, где конъюгат содержит антитело по любому из пп.1-4 и линкер.

6. Конъюгат по п.5, где линкер является расщепляемым линкером.

7. Конъюгат по п.5, где линкер выбран из группы, состоящей из Ac-Lys-Gly (ацетил-лизин-глицина), аминокапроновой кислоты, Ac-Lys-β-Ala (ацетил-лизин-β-аланина), амино-ПЭГ2 (полиэтиленгликоль)-C2, амино-ПЭГ3-C2, амино-ПЭГ6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонила), амино-ПЭГ6-C2-Val-Cit-PABC, аминокапроил-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)-этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноил}пиперидин-3,5-диил]бис-Val-Cit-PABC, путресцина и Ac-Lys-путресцина.

8. Конъюгат по п.7, где линкером является Ac-Lys-Val-Cit-PABC (ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил).

9. Конъюгат по любому из пп.5-8, где антитело конъюгировано с цитотоксическим средством, или терапевтическим средством, или визуализирующим средством.

10. Конъюгат по п.9, где цитотоксическое средство или терапевтическое средство выбрано из цитотоксического средства, иммуномодулирующего средства, терапевтического белка, биополимера и олигонуклеотида.

11. Конъюгат по п.9, где цитотоксическое средство выбрано из группы, состоящей из антрациклина, ауристатина, камптотецина, комбрестатина, димера CBI, димера циклопропилпирролоиндолина (CPI), димера CTI, доластатина, дуокармицина, ендиина, гелданамицина, димера индолино-бензодиазепина, майтанзина, пуромицина, димера пирролобензодиазепина, таксана, алкалоида барвинка, тубулизина, гемиастерлина, сплайсеостатина, пладиенолида и их стереоизомеров, изостеров, аналогов или производных.

12. Конъюгат по любому из пп.9-11, где цитотоксическое средство является димером CPI.

13. Конъюгат по п.12, где димер CPI представляет собой C₃₁H₃₁Cl₂N₄O₇P или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, включая C₃₁H₃₁Cl₂N₄O₇P^.C₂HF₃O₂.

14. Конъюгат по любому из пп.10-13, где конъюгат включает формулу: антитело-(ацил-донорная глутамин-содержащая метка)-(линкер)-(цитотоксическое средство).

15. Конъюгат по п.14, где ацил-донорная глутамин-содержащая метка включает аминокислотную последовательность LLQG (SEQ ID NO:78) и где линкер включает ацетил-лизин-валин-цитруллин-п-аминобензилоксикарбонил.

16. Конъюгат антитела-лекарственного средства для направленной иммунотерапии, содержащий тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:27, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:30, линкер, присоединенный к тяжелой цепи или легкой цепи, и цитотоксическое средство или терапевтическое средство, присоединенное к линкеру.

17. Конъюгат антитела-лекарственного средства для направленной иммунотерапии, содержащий тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:27, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:30, линкер ацетил-лизин-валин-цитруллин-p-аминобензил-оксикарбонил (Ac-Lys-Val-Cit-PABC), присоединенный к тяжелой цепи или легкой цепи, и цитотоксическое средство или терапевтическое средство, присоединенное к линкеру.

18. Конъюгат антитела-лекарственного средства для направленной иммунотерапии, содержащий тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:27, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:30, линкер ацетил-лизин-валин-цитруллин-p-аминобензил-оксикарбонил (Ac-Lys-Val-Cit-PABC), присоединенный к тяжелой цепи или легкой цепи, и димер циклопропилпирролоиндолин (CPI), присоединенный к линкеру.

19. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с клетками, экспрессирующими CD123, включающая терапевтически эффективное количество антитела по любому из пп.1-4 или конъюгата по любому из пп.5-18 и фармацевтически приемлемый носитель.

20. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп.1, 3 или 4.

21. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.20.

22. Выделенная клетка-хозяин, которая рекомбинантно продуцирует антитело по любому из пп.1, 3 или 4, содержащая вектор экспрессии по п.21.

23. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.22 в условиях, которые приводят к продукции антитела, и выделение антитела из клетки-хозяина или культуры.

24. Способ лечения состояния, ассоциированного с клетками, экспрессирующими CD123, у индивида, включающий введение больному эффективного количества фармацевтической композиции по п.19.

25. Способ по п.24, где состоянием является рак.

26. Способ по п.25, где рак является раком, выбранным из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), неоплазии из бластных плазмоцитоидных дендритных клеток (БПДКН), волосатоклеточного лейкоза, B-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ), множественной миеломы, злокачественной плазмоклеточной неоплазии, лимфомы Ходжкина, нодулярной лимфомы Ходжкина с лимфоидным преобладанием, болезни Калера и миеломатоза, плазмоклеточного лейкоза, плазмоцитомы, B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ), фолликулярной лимфомы, лимфомы Беркитта, лимфомы из клеток маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, крупноклеточной лимфомы, B-лимфобластной лимфомы из клеток-предшественников, миелоидного лейкоза, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, лимфомы лимфатической ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками, мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, лимфомы Беркитта, первичной медиастинальной (тимической) В-крупноклеточной лимфомы, лимфоплазмоцитарной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема, нодулярной B-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, внутрисосудистой В-крупноклеточной лимфомы, первичной эффузионной лимфомы, лимфоматоидного гранулематоза, B-крупноклеточной лимфомы с большим количеством Т-клеток/гистиоцитов, первичной лимфомы центральной нервной системы, первичной диффузной B-крупноклеточной лимфомы кожи (ножного типа), ВЭБ-положительной диффузной B-крупноклеточной лимфомы у пожилых, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, связанной с воспалением, ALK-положительной B-крупноклеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, B-крупноклеточной лимфомы, возникающей при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, неклассифицируемой B-клеточной лимфомы с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и лимфомы Беркитта, неклассифицируемой B-клеточной лимфомы с промежуточными признаками диффузной B-крупноклеточной лимфомы и классической лимфомы Ходжкина и другой ассоциированной с B-клетками лимфомы.

27. Способ по п.26, где рак представляет собой ОМЛ.

28. Способ ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, где способ включает введение индивиду эффективного количества фармацевтической композиции по п.19.

29. Способ ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих CD123, у индивида, включающий введение больному эффективного количества фармацевтической композиции по п.19.

30. Способ стимуляции регрессии опухоли у индивида, который имеет злокачественные клетки, экспрессирующие CD123, включающий введение больному эффективного количества фармацевтической композиции по п.19.

31. Способ конъюгирования антитела по любому из пп.1 или 2 с AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 (известен как AcLysPABC-CPI-8314), который имеет следующую структуру:

где способ включает:

получение композиции, включающей указанное антитело и AcLysPABC-CPI-8314, в буфере, содержащем 30-100 мМ KPO4 и 150-200 мМ NaCl;

добавление бактериальной трансглутаминазы к композиции; и

инкубирование композиции для обеспечения конъюгирования указанного антитела с AcLysPABC-CPI-8314.

32. Способ по п.31, где pH композиции составляет 7.

33. Способ по п.31 или 32, где композиция включает 0,5-2 единицы (Ед) бактериальной трансглутаминазы на мг антитела.

34. Способ по любому из пп.31-33, где композиция включает 1 Ед бактериальной трансглутаминазы на мг антитела.

35. Способ по любому из пп.31-34, где AcLysPABC-CPI-8314 присутствует в 10-кратном молярном избытке по отношению к антителу.

36. Способ по любому из пп.31-35, где композицию инкубируют при 25°C в течение ночи с непрерывным перемешиванием.

37. Способ по любому из пп.31-36, где композиция дополнительно включает 7,5% (об./об.) диметилсульфоксида (ДМСО).

38. Способ по любому из пп.31-37, где буфер включает 30 мМ KPO4 и 150 мМ NaCl.

39. Способ по любому из пп.31-37, где буфер включает 100 мМ KPO4 и 200 мМ NaCl.