Средство для определения неспецифической реактивности овец Советский патент 1992 года по МПК A61K39/00 G01N33/555 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для определения физиологического состояния организма.

Гемолизин - инактивированная сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, известен в качестве средства, которое широко используется в лабораторной практике как диагностикум. Специфическая гемолитическая сыворотка, лизирующая эритроциты барана в высоком титре, применяется в реакции связывания комплемента (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. /Под ред. М.О.Биргера.- М.: Медицина. 1982, с. 464).

Известно также применение гемолизина при титровании комплемента. Его активность определяют в той же гемолитической системе, которую используют для реакции связывания комплемента (стандартные эритроциты барана и антисыворотка). Об активности комплемента судят по наименьшему количеству исследуемой сыворотки, которое способствует полному или 50% гемолизу сенсибилизированных эритооци- .

Известен способ определения иммунологической реактивности особей, включающий инкубирование проб крови с тестирующей биологической жидкостью, причем в качестве тестирующей биологической жидкости используют видоспецифиче- скую антисыворотку, которую в соотношении 1:2 смешивают с периферической кровью исследуемого, инкубируют 18ч при 20-24°С в капиллярах, а результаты реакции учитывают по скорости оседания эритроцитов и степени цитолиза в опытной и контрольной пробах.

Недостатком этого способа является то. что для его осуществления в условиях лаборатории необходимо приготовление видос- пецифической сыворотки, что сопряжено с

ч

Ј

VJ -ч| СО О

ч

большими трудностями (наличием лабораторных животных, затратой средств и времени). Кроме того, сыворотки, полученные в условиях различных лабораторий и в разное время, не отличаются стабильностью. Качество полученных антисывороток зависит от многих факторов, связанных с технологией их получения, в том числе: от степени очистки антигена, уровня иммунного ответа лабораторных животных и других.

Целью изобретения является расширение арсенала средств для определения неспецифической реактивности организма и повышение возможности их практического применения.

Эта цель достигается применением гемолизина в качестве средства для определения неспецифической реактивности у овец. Определение реактивности поголовья овец осуществляется in vitro путем смешивания гемолитической сыворотки с периферической кровью исследуемого животного, инкубирования смеси в капиллярах с последующим учетом результатов реакции через 18 ч по степени цитолиза в опытной и контрольной пробах.

Существо технического решения заключается в следующем.

Гемолитическую сыворотку в соотноше- нии 1:2 смешивают с периферической кровью исследуемого животного, инкубируют 18ч при в капиллярах, а результаты реакции учитывают по скорости оседания эритроцитов и степени гемолиза в опытной и контрольной пробах.

Видоспецифические антитела гемолитической сыворотки под влиянием комплемента исследуемого животного вступают в реакцию с эритроцитарными антигенами, что приводит к их агглютинации и гемолизу. Цитотоксические действие гемолизина зависит от содержания комплемента в крови исследуемого животного, а также от функциональной активности клеток крови и гено- типических особенностей организма.

Предлагаемое средство испытано на овцематках, новорожденных ягнятах и поясняется примерами.

П р и м е р 1. Готовили различные разведения гемолизина на физиологическом растворе и ставили реакцию капельной ге- магглютинации с кровью исследуемого животного. Гемолитическую сыворотку для реакции связывания комплемента использовали в разведении 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128.

Одну каплю крови исследуемого животного наносили на предметное стекло, затем добавляли одну каплю гемолизина, быстро перемешивали стеклянной палочкой и через 3-5 мин учитывали результаты реакции в крестах.

Как видно из приведенных данных в табл. 1, наибольшее разведение гемолизина, с которым наблюдается агглютинация эритроцитов исследуемых проб крови, составило 1/128, Однако у некоторых животных (№ 35; 9586; 4570 и др.) реакция была отрицательной. Наиболее выраженная ре0 акция, интенсивностью не менее двух крестов, отмечалась в разведении гемолитической сыворотки, равном 1/16. В связи с этим для определения иммунологической реактивности животных была взята

5 гемолитическая сыворотка 1:16.

П р и м е р 2. В капиллярную пипетку аппарата Памченкова 1/2 объема 50 мм набирали гемолизина и выливали в лунку предметного стекла. Затем этой же пипет0 кой набирали кровь (100 мм) и тоже выливали в лунку. Кровь исследуемого животного тщательно перемешивали с зптисыворот- кой и полученную смесь набирали в пипетку и ставили в штатив. В связи с тем, что гемо5 лизин смешивался с кровью исследуемого животного в разведении 1:2 его рабочее разведение было 1:8.

Ставили также контрольную пробу для каждого животного отдельно. В контроль0 ном капилляре вместо гемолитической сыворотки использовали физиологический раствор.

Учет реакции (контроль и опыт) проводили через 18 ч по скорости оседания эрит5 роцитов (высота столба осевших эритроцитов), а также степени цитолиза.

Индекс неспецифической реактивности определяли по формуле

ИНР (А-В):А + (С-0):С,

0 где ИНР - индекс нёспецифической реактивности;

А-высота столба осевших эритроцитов в опытном капилляре;

В - высота столба осевших эритроцитов

5 в контрольном капилляре;

С - степень гемолиза в крестах в опытном капилляре;

D - степень гемолиза в крестах в контрольном капилляре.

0 Результаты-учета реакции по отдельным животным представлены в табл. 2,

Как видно из приведенных данных в табл. 2, высота столба осевших эритроцитов в опытном и контрольном капиллярах у жи5 вотных была различной. Наиболее существенная разница отмечена у животного № 4027 (7 мм в контроле и 67 мм в опыте), что соответствовало самому высокому индексу реактивности. У животного № ЮГ. 4 разница была менее существенной т.е, 1 мм, а имдеке неспецифической реактивности составил 0,07.

П р и м е р 3. По изложенной методике была проведена оценка неспецифической реактивности 92 овцематок и рожденных ими 97 ягнятах. В результате исследований (табл. 3) установлено, что средние значения индекса неспецифичес кой реактивности у овцематок были значительно выше, чем у ягнят.

Как видно, различия между группами животных не только по средним величинам, но и характеру распределения величин статистически достоверны. Дисперсия показателя реактивности у ягнят была более выраженной, чем у маток. Коэффициент вариации индекса неспецифической реактив- поста у ягнят составил 93,6%, а у маток 65,1%.

При сопоставлении результатов реакции у овцематок и рожденных от них ягнят установлено, что у ягнят случаев гемолиза эритроцитов при добавлении гемолитиче- ской сыворотки не наблюдалось. У овцематок наоборот такие случаи регистрировались более чаще. Видимо это следует объяснить отсутствием комплемен- та в крови у новорожденных ягнят.

Поскольку система комплемента играет важную роль в поддержании гомеостаза показатели этой реакции отражают особенности реактивности организма.

Таким образом, предлагаемое средство при использовании его с целью определения неспецифической реактивности позволяет значительно расширить возможности практического применения, особенно при массовом обследовании поголовья.

Использование известного диагности- кума в качестве средства для определения неспецифической реактивности имеет преимущества, так как он выпускается биологическойпромышленностью, стандартизирован и имеется в любой районной лаборатории.

Поскольку гемолитическая сыворотка проявляетсвоедействие в присутствии комплемента, стало быть от реактивности комплемента, содержащегося в крови исследуемого животного, зависит проявление агглютинации и гемолиза, обусловленного действием антител. С другой стороны результаты реакции зависят также от специфики антигенов, адсорбированных на поверхности эритроцитов.

Формула изобретения Применение гемолизина в качестве средства длл определения неспецифической реактивности овец.

Использование: экспериментальная и ветеринарная иммунология. Сущность определение неспецифической реактивности овец с помощью гемолизина, который используют в разведении 1:8-1:16. Гемолизин смешивают с периферической кровью исследуемого животного, инкубируют 18ч при 20-24°С в капиллярах и учитывают результаты реакции по скорости оседания эритроцитов и степени гемолиза в опытной и контрольной пробах. По результатам реакции определяют индекс неспецифической реактивности животных. 3 табл.

Таблица 1

Критерий различий Достоверность

Таблица 2

Таблица 3

td 6,70 Р 0,001

Р 0,05