АНТИТЕЛО ПРОТИВ LAG-3 Российский патент 2021 года по МПК C07K16/28 C07K16/46 A61K39/395 A61P31/00 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к антителу против LAG-3. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу против LAG-3, содержащему вариабельную область, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) крысиного антитела против бычьего LAG-3, и константную область антитела животного, отличного от крысы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген активации 3 лимфоцитов (LAG-3), иммуноингибирующий рецептор, был идентифицирован как молекула, тесно связанная с CD4 (непатентный документ №1: Triebel F, Jitsukawa S, Baixeras E, Roman-Roman S, Genevee C, Viegas -Pequignot E, Hercend TJ Exp. Med., 171(5):1393-1405; May 1, 1990). Недавно выяснилось, что эта молекула участвует в иммуносупрессии при хронических инфекциях и опухолях (непатентный документ №2: Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, Betts MR, Freeman GJ, Vignali DA, Wherry EJ. Nat. Immunol., 10(1):29-37; Nov. 30, 2008; Непатентный домент 3: Woo S-R, Turnis ME, Goldberg M V., Bankoti J, Selby M, Nirschl CJ, Bettini ML, Gravano DM, Vogel P, Liu CL, Tangsombatvisit S, Grosso JF, Netto G, Smeltzer MP, Chaux A, Utz PJ, Workman CJ, Pardoll DM, Korman AJ, Drake CG, Vignali DAA. Cancer Res., 72(4):917-927; Feb. 15, 2012). В области здравоохранения в качестве иммунотерапевтического лекарственного средства против опухолей был разработан препарат антител, который ингибирует активность LAG-3, и в настоящее время проводится фаза I его клинического испытания (название антитела: BMS-986016; Bristle-Myers Squibb and Ono Pharmaceutical Co., Ltd.)

На сегодняшний день авторы настоящего изобретения разработали иммунотерапию для лечения резистентных болезней животных, нацеленную на LAG-3, и было обнаружено, что эта новая иммунотерапия может использоваться в отношении многочисленных заболеваний и у множества животных. (Непатентный документ 4: Shirai T, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Suzuki S, Sunden Y, Onuma M, Murata S, Ohashi K. Vet. Immunol. Immunopathol., 144(3-4):462-467; Dec. 15, 2011; Непатентный документ №5: Konnai S, Suzuki S, Shirai T, Ikebuchi R, Okagawa T, Sunden Y, Mingala CN, Onuma M, Murata S, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 36(1):63-69; Jan. 2013; Непатентный документ №6: Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y, Ohashi K. Infect. Immun. 84(1):77-89; Oct. 19, 2015.

Однако антитела, которые были получены авторам настоящего изобретения до настоящего момента, являются антителами крысы, и поэтому их невозможно многократно вводить животным, отличным от крысы.

ЛИТЕРАТУРА УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Непатентные документы

Непатентный документ №1: Triebel F, Jitsukawa S, Baixeras E, Roman-Roman S, Genevee C, Viegas-Pequignot E, Hercend TJ Exp. Med., 171(5):1393-1405; May 1, 1990.

Непатентный документ №2: Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, Betts MR, Freeman GJ, Vignali DA, Wherry EJ. Nat. Immunol., 10(1):29-37; Nov. 30, 2008.

Непатентный домент №3: Woo S-R, Turnis ME, Goldberg M V., Bankoti J, Selby M, Nirschl CJ, Bettini ML, Gravano DM, Vogel P, Liu CL, Tangsombatvisit S, Grosso JF, Netto G, Smeltzer MP, Chaux A, Utz PJ, Workman CJ, Pardoll DM, Korman AJ, Drake CG, Vignali DAA. Cancer Res., 72(4):917-927; Feb. 15, 2012.

Непатентный документ №4: Shirai T, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Suzuki S, Sunden Y, Onuma M, Murata S, Ohashi K. Vet. Immunol. Immunopathol., 144(3-4):462-467; Dec. 15, 2011.

Непатентный документ №5: Konnai S, Suzuki S, Shirai T, Ikebuchi R, Okagawa T, Sunden Y, Mingala CN, Onuma M, Murata S, Ohashi K. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 36(1):63-69; Jan. 2013.

Непатентный документ №6: Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y, Ohashi K. Infect. Immun. 84(1):77-89; Oct. 19, 2015.

ЗАДАЧА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Задачей настоящего изобретения является создание антитела против LAG-3, способного к многократному введению животным, отличным от крысы.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

Авторы настоящего изобретения определили вариабельные области крысиного моноклонального антитела (2D8) против бычьего LAG-3, связывающегося с клетками Cos-7, экспрессирующими бычий LAG-3, и затем объединили гены, кодирующие полученные вариабельные области, с генами, кодирующими константные области бычьего иммуноглобулина (бычий IgG1 с мутациями, введенными в предполагаемые сайты связывания c рецепторам Fcγ в домене CH2 для ингибирования активности ADCC; см. фиг. 1 для аминокислотных положений и мутаций: 247 E→P, 248 L→V, 249 P→A, 250 G→делеция, 344 A→S, 345 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug; 142(4):551-561), таким образом, получив ген химерного антитела. Этот ген был введен в клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО). Посредством культивирования/пролиферации полученных клеток авторам настоящего изобретения удалось получить химерное "крысино-бычье" антитело против бычьего LAG-3. Кроме того, авторы настоящего изобретения определили CDR вариабельной области крысиного моноклонального антитела (2D8) против бычьего LAG-3. Настоящее изобретение было сделано на основе этих обнаружений.

Сущность настоящего изобретения описана ниже.

(1) Антитело против LAG-3, содержащее (а) легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 c аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

(2) Антитело по (1) выше, в котором вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи получены из крысы.

(3) Антитело по (2) выше, в котором вариабельная область легкой цепи представляет собой вариабельную область легкой цепи крысиного антитела против бычьего LAG-3, и вариабельная область тяжелой цепи представляет собой вариабельную область тяжелой цепи крысиного антитела против бычьего LAG-3.

(4) Антитело по (3) выше, в котором вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

(5) Антитело по любому из (1)-(4) выше, в котором константная область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи или каппа-цепи.

(6) Антитело по любому из (1)-(5) выше, в котором константная область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека или указанную аминокислотную последовательность с введенными мутациями, которые снижают активность ADCC и/или активность CDC.

(7) Антитело по (6) выше, в котором животное, отличное от крысы, является особью крупного рогатого скота; константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи; и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет введенные в нее мутации, которые уменьшают активность ADCC и/или активность CDC.

(8) Антитело по (7) выше, в котором константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

(9) Антитело по любому из (1)-(8) выше, которое имеет четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.

(10) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из (1)-(9) выше в качестве активного ингредиента.

(11) Композиция по (10) выше для профилактики и/или лечения злокачественных новообразований и/или воспаления.

(12) Композиция по (11) выше, причем злокачественное новообразование и/или воспаление выбраны из группы, состоящей из опухолевых заболеваний, лейкоза, болезни Джона, анаплазмоза, бактериального мастита, микотического мастита, микоплазменных инфекций (таких как микоплазменный мастит, микоплазменная пневмония или тому подобное), туберкулеза, инфекции Theileria orientalis, криптоспоридиоза, кокцидиоза, трипаносомоза и лейшманиоза.

(13) Искусственная генетическая ДНК, содержащая (а') ДНК, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b') ДНК, кодирующую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

(14) Вектор, содержащий искусственную генетическую ДНК по (13) выше.

(15) Клетка-хозяин, трансформированная вектором (14) выше.

(16) Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по (15) выше и сбор антитела против LAG-3 из полученной культуры.

(17) ДНК, кодирующая легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17), и константную области легкой цепи антитела животного, отличного от крысы.

(18) ДНК, кодирующая тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 c аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20), и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

Настоящее описание охватывает содержание описаний и/или чертежей Японских патентных заявок №2016-159091, на основании которых по настоящей патентной заявке испрашивается приоритет.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению было получено новое антитело против LAG-3. Это антитело можно использовать даже в отношении животных, которые не являются крысами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[Фиг. 1] Аминокислотная последовательность химерного "крысино-бычьего" антитела ch2DD8 против LAG-3. Показаны области CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3. Кроме того, также показаны аминокислоты, введенные как мутации, в бычий IgG1 (домен CH2) (аминокислотные положения и мутации: 247 E→P, 248 L→V, 249 P→A, 250 G→делеция, 344 A→S, 345 P→S).

[Фиг. 2] Схематическое изображение вектора pDC6 и химерного "крысино-бычьего" антитела ch2D8 против LAG-3.

[Фиг. 3] Чистота очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела ch2DD8 против LAG-3.

[Фиг. 4] Специфичность связывания химерного "крысино-бычьего" антитела ch2D8 против LAG-3.

[Фиг. 5] Ингибиторная активность химерного "крысино-бычьего" антитела ch2D8 против бычьего LAG-3 в отношении связывания бычьего LAG-3/MHC II

[Фиг. 6] Изменения в ответе IFN-γ под действием химерного "крысино-бычьего" антитела ch2D8 против бычьего LAG-3.

[Фиг. 7] Перекрестная реактивность крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 в отношении буйволиного LAG-3

[Фиг. 8] Перекрестная реактивность крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 в отношении овечьих Т-клеток

НАИЛУЧШИЕ СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже настоящее изобретение будет описано подробно.

Настоящее изобретение относится к антителу против LAG-3, содержащему (а) легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 c аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и (b) тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) крысиного антитела LAG-3 против бычьего PD-L3 представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), область, состоящую из аминокислотной последовательности SVS, и область, состоящую из аминокислотной последовательности MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17), соответственно (см. фиг. 1).

Кроме того, CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), область, состоящую из аминокислотной последовательности ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19), и область, состоящую из аминокислотной последовательности NREDFDY (SEQ ID NO: 20), соответственно (см. фиг. 1).

В аминокислотных последовательностях QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), SVS и MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17), а также в аминокислотных последовательностях GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и NREDFDY (SEQ ID NO: 20), одна, две, три, четыре или пять аминокислот могут быть удалены, замещены или добавлены. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию CDR VL или CDR VH антитела LAG-3.

Как используется в настоящем документе, термин «антитело» представляет собой концепцию, охватывающую не только полноразмерные антитела, но также и антитела меньшего молекулярного размера, такие как Fab, F(ab)'₂, ScFv, _{диатело}, _{VH, VL}, Sc(Fv)₂, биспецифичный sc(Fv)₂, минитело, мономер scFv-Fc и димер scFv-Fc.

В антителе против LAG-3 по настоящему изобретению, VL и VH могут быть крысиными. Например, VL может быть VL крысиного антитела против бычьего LAG-3, а VH может быть VH крысиного антитела против бычьего LAG-3.

Аминокислотные последовательности VL и аминокислотная последовательность VH крысиного антитела против бычьего LAG-3 показаны как SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2 могут иметь делецию(и), замену(и) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию VL или VH антитела LAG-3.

Существует два типа легкой цепи иммуноглобулина, которые называются каппа-цепью (κ) и лямбда-цепью (λ). В антителе против LAG-3 по настоящему изобретению константная область легкой цепи (CL) антитела животного, отличного от крысы, может иметь аминокислотную последовательность константной области либо каппа-цепи, либо лямбда-цепи. При этом, относительное содержание лямбда-цепи выше у крупного рогатого скота, овец, кошек, собак и лошадей, а каппа-цепи выше у мышей, крыс, людей и свиней. Поскольку цепь с более высоким относительным содержанием считается предпочтительной, то антитело крупного рогатого скота, овцы, кошки, собаки или лошади предпочтительно имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи, а антитело мыши, крысы, человека или свиньи предпочтительно имеет аминокислотную последовательность константной области каппа-цепи (κ).

Константная область тяжелой цепи (СН) антитела животного, отличного от крысы, может иметь аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека. Тяжелая цепь иммуноглобулина классифицируется на γ-цепь, μ-цепь, α-цепь, δ-цепь и ε-цепь в зависимости от разницы в константной области. В зависимости от типа присутствующей тяжелой цепи образуются пять классов (изотипов) иммуноглобулина; ими являются IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

Иммуноглобулин G (IgG) составляет 70-75% иммуноглобулинов человека и является наиболее распространенным мономерным антителом в плазме. IgG имеет четырехцепочечную структуру, состоящую из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. IgG1, IgG2 и IgG4 человека имеют молекулярную массу приблизительно 146000, тогда как IgG3 человека имеет длинную шарнирную область, которая соединяет Fab-область и Fc-область, и имеет большую молекулярную массу, равную 170000. IgG1 человека составляет около 65%, IgG2 человека - около 25%, IgG3 человека - около 7% и IgG4 человека - около 3% IgG человека. Они равномерно распределены внутри и снаружи кровеносных сосудов. Обладая сильным сродством к рецепторам Fc и факторам комплемента на поверхности эффекторных клеток, IgG1 человека индуцирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), а также активирует комплемент, индуцируя комплемент-зависимую клеточную цитотоксичность (CDC). IgG2 и IgG4 человека имеют низкую активность ADCC и CDC, поскольку их сродство к Fc-рецепторам и факторам комплемента низкое.

Иммуноглобулин М (IgM), который составляет приблизительно 10% иммуноглобулинов человека, представляет собой пентамерное антитело, состоящее из пяти основных четырехцепочечных структур, соединенных вместе. Он имеет молекулярный вес 970000. Обычно встречающийся только в крови, IgM продуцируется против инфекционных микроорганизмов и отвечает за иммунитет на ранней стадии.

Иммуноглобулин А (IgA) составляет 10-15% иммуноглобулинов человека. Он имеет молекулярный вес 160000. Секретируемый IgA представляет собой димерное антитело, состоящее из двух молекул IgA, соединенных вместе. IgA1 обнаружен в сыворотке, выделениях из носа, слюне и грудном молоке. В большом количестве IgA2 обнаружен в желудочном соке.

Иммуноглобулин D (IgD) представляет собой мономерное антитело, составляющее не более 1% иммуноглобулинов человека. IgD обнаружен на поверхности В-клеток и участвует в индукции продукции антител.

Иммуноглобулин E (IgE) представляет собой мономерное антитело, которое встречается в очень небольшом количестве, составляя лишь 0,001% или менее иммуноглобулинов человека. Считается, что иммуноглобулин Е вовлечен в иммунный ответ на паразитов, но в развитых странах, где паразиты встречаются редко, IgE, главным образом, вовлечен в бронхиальную астму и аллергию, среди прочего.

Что касается собак, то последовательности IgG-A (эквивалентен IgG2 человека), IgG-B (эквивалентен IgG1 человека), IgG-C (эквивалентен IgG3 человека) и IgG-D (эквивалентен IgG4 человека) были идентифицированы как тяжелая цепь IgG. В антителе по настоящему изобретению константная область тяжелой цепи IgG, не обладающая ни активностью ADCC, ни активностью CDC, является предпочтительной (IgG4 у человека). В случае, когда константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, можно использовать константную область, которая потеряла как активность ADCC, так и активность CDC в результате введения мутаций в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека.

Что касается крупного рогатого скота, то последовательности IgG1, IgG2 и IgG3 были идентифицированы как тяжелая цепь IgG. В антителе по настоящему изобретению константная область тяжелой цепи IgG, не обладающая ни активностью ADCC, ни активностью CDC, является предпочтительной (IgG4 у человека). Хотя константная область нативного IgG1 человека обладает активностью ADCC и активностью CDC, известно, что эти типы активности можно уменьшить путем введения аминокислотных замен или делеций в конкретные сайты. У крупного рогатого скота константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, поэтому в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентную IgG1 человека, можно ввести мутации, а затем использовать полученную константную область. В качестве примера, аминокислотная последовательность СН бычьего антитела (цепь IgG1, GenBank: X62916) с мутациями, введенными в домен СН2, и нуклеотидная последовательность для такой аминокислотной последовательности (после оптимизации кодонов) показаны как SEQ ID NO: 4 и 8, соответственно.

Если животным, отличным от крысы, является собака, то антитело против LAG-3 является более предпочтительным, причем (i) CL собачьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи и (ii) CH собачьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентную IgG4 человека.

Если животным, отличным от крысы, является представитель крупного рогатого скота, то антитело против LAG-3 является более предпочтительным, причем (i) CL бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи и (ii) CH бычьего антитело имеет мутации, которые снижают активность ADCC и/или активность CDC.

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению включает химерные "крысино-бычьи" антитела, бовинизированные антитела и полные антитела бычьего типа. Тем не менее, животные не ограничиваются особями крупного рогатого скота, и могут быть представлены людьми, собаками, свиньями, обезьянами, мышами, кошками, лошадьми, козами, овцами, буйволами, кроликами, хомячками, морскими свинками и тому подобное.

Например, антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может представлять собой антитело против LAG-3, в котором CL бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и СН бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 4 могут иметь делецию(и), замену(и) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию CL или CH антитела LAG-3.

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может иметь четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может быть получено, как описано ниже. Вкратце, синтезирован искусственный ген, который содержит (i) идентифицированные последовательности вариабельной области крысиного антитела против бычьего LAG-3 и (ii) последовательности константной области антитела животного, отличного от крысы (например, быка) (предпочтительно, иммуноглобулин, эквивалентный IgG1 человека, в котором в соответствующую область введены мутации для снижения активности ADCC и/или активности CDC). Полученный ген встраивают в вектор (например, плазмиду), который затем вводят в клетку-хозяин (например, клетку млекопитающего, такую как клетка CHO). Клетку-хозяин культивирует, и из полученной культуры собирают интересующее антитело.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VL крысиного антитела против бычьего LAG-3, идентифицированные авторами изобретения, показаны как SEQ ID NO: 1 и 5, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO: 11.

Аминокислотная последовательность VL и аминокислотная последовательность VH крысиного антитела против бычьего LAG-3, идентифицированные авторами изобретения, показаны как SEQ ID NO: 2 и 6, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO: 12.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность CL (лямбда-цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела показаны как SEQ ID NO: 3 и 7, соответственно. Кроме того, нуклеотидная последовательность после оптимизации кодонов показана как SEQ ID NO: 13.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) CH (цепь IgG1, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела показаны как SEQ ID NO: 4 и 8, соответственно.

Кроме того, SEQ ID NO: 9 показывает аминокислотную последовательность химерной легкой цепи, состоящей из VL крысиного антитела против бычьего LAG-3 и CL (лямбда цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела. Нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) химерной легкой цепи, состоящей из VL крысиного антитела против бычьего LAG-3 и CL (лямба цепь, GenBank: X62917) бычьего антитела, показана как SEQ ID NO: 14.

SEQ ID NO: 10 показывает аминокислотную последовательность химерной тяжелой цепи, состоящей из VH крысиного антитела против бычьего LAG-3 и CL (IgG1 цепь, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела. Нуклеотидная последовательность (после оптимизации кодонов) химерной тяжелой цепи, состоящей из VH крысиного антитела против бычьего LAG-3 и CH (IgG1 цепь, модифицированная из GenBank: X62916) бычьего антитела, показана как SEQ ID NO: 15.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH различных животных, отличных от крысы, могут быть получены из известных баз данных для использования в настоящем изобретении.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности бычьих CL и CH приведены в таблице ниже.

Таблица.

(Таблица)

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH овец, буйвола и человека приведены в таблице ниже.

(Таблица)

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3, 21-28, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59 могут иметь делецию(и), замену(ы) или добавление(я) в одной или нескольких (например, до пяти, максимально примерно 10) аминокислот. Даже если такие мутации были введены, то полученные аминокислотные последовательности способны выполнять функцию константной области тяжелой цепи или легкой цепи Ig.

Хотя константная область нативного IgG1 человека обладает активностью ADCC и активностью CDC, известно, что эти типы активности можно уменьшить путем введения аминокислотных замен и делеций в конкретные сайты. В случае животных, отличных от человека, где константная область иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, не была идентифицирована, мутации могут быть введены в соответствующую область иммуноглобулина, эквивалентного IgG1 человека, так что может быть использована полученная константная область с пониженной активностью ADCC и активностью CDC.

Настоящее изобретение относится к искусственной генетической ДНК, содержащей (а') ДНК, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17) и константную область легкой цепи (CL) антитела животного, отличного от крысы; и (b') ДНК, кодирующую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи (CH) антитела животного, отличного от крысы. Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей легкую цепь, содержащую VL, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17), и CL антитела животного, отличного от крысы. Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей тяжелую цепь, содержащую VH, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 c аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20), и CH антитела животного, отличного от крысы.

В случае (а) легкой цепи, содержащей вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO: 16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS, и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO: 17) и константную область легкой цепи антитела животного, отличной от крысы; и (b) тяжелой цепи, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO: 18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO: 19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO: 20) и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличной от крысы, следует обратиться к описанию выше. ДНК (а') представляет собой ДНК (ген), кодирующую легкую цепь (а); и ДНК (b') представляет собой ДНК (ген), кодирующую тяжелую цепь (b). Искусственная генетическая ДНК, содержащая ДНК (a') и ДНК (b'), может быть синтезирована на коммерческом синтезаторе. К искусственной генетической ДНК могут быть добавлены сайты распознавания ферментов рестрикции, последовательности KOZAK, последовательность сигнала присоединения поли-А, последовательности промоторов, последовательности интронов и тому подобное.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему вышеуказанную искусственную генетическую ДНК.

В качестве вектора можно использовать плазмиды на основе Escherichia coli (например, pBR322, pBR325, pUC12 или pUC13); плазмиды на основе Bacillus subtilis (например, pUB110, pTP5 или pC194), плазмиды на основе дрожжей (например, pSH19 или pSH15); бактериофаги, такие как фаг λ; вирусы животных, такие как ретровирус или вирус коровьей оспы; или вирусы патогенов насекомых, такие как бакуловирус. В описанных ниже примерах использовали pDC6 (патент Японии №5704753, патент США 9096878, патент ЕС 2385115, патент Гонконга (Китай) HK 1163739 и патент Австралии 2009331326).

Вектор также может содержать промоторы, энхансеры, сигналы сплайсинга, сигналы присоединения поли-А, последовательности интронов, маркеры селекции, точки начала репликации SV40 и так далее.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной указанным выше вектором. Можно получить антитело против LAG-3 по изобретению путем культивирования клетки-хозяина и сбора представляющего интерес антитела из полученной культуры. Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу получения антитела, включающему культивирование описанной выше клетки-хозяина и сбор антитела против LAG-3 по изобретению из культуры. В способе по настоящему изобретению для получения антитела вектор, содержащий искусственную генетическую ДНК, содержащую ДНК, кодирующую легкую цепь, и ДНК, кодирующую тяжелую цепь, может быть трансфицирован в клетку-хозяина. Альтернативно, вектор, в который введена ДНК, кодирующая легкую цепь, и вектор, в который введена ДНК, кодирующая тяжелую цепь, могут быть совместно трансфицированы в клетку-хозяина.

Примеры клеток-хозяев включают, но не ограничиваются, бактериальные клетки (такие как бактерии Escherichia, бактерии Bacillus или Bacillus subtilis), клетки грибов (такие как дрожжи или Aspergillus), клетки насекомых (такие как клетки S2 или клетки Sf), клетки животных (такие как клетки CHO, клетки COS, клетки HeLa, клетки C127, клетки 3T3, клетки BHK или клетки HEK 293) и клетки растений. Среди них предпочтительной является клетка CHO-DG44 (CHO-DG44 (dfhr^-/^-)), которая является клеткой с дефицитом дигидрофолатредуктазы.

Введение рекомбинантного вектора в клетку-хозяина может быть осуществлено способами, раскрытыми в Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 (например, метод на основе фосфата кальция, метод с DEAE-декстраном, трансфекция, микроинъекция, липофекция, электропорация, трансдукция, введение при соскабливании, метод дробовика и тому подобное) или путем инфекции.

Полученный трансформант может быть культивирован в среде с последующим сбором антитела против LAG-3 по настоящему изобретению из культуры. Если антитело секретируется в среду, то среда может быть восстановлена с последующим выделением и очисткой антитела из среды. Если антитело продуцируется внутри трансформированных клеток, то клетки можно лизировать с последующим выделением и очисткой антитела из клеточного лизата.

Примеры сред включают, но не ограничиваются, среду OptiCHO, среду Dynamis, среду CD CHO, среду ActiCHO, среду FortiCHO, среду Ex-Cell CD CHO, среду BalanCD CHO, среду ProCHO 5 и среду Cellvento CHO-100.

рН среды изменяется в зависимости от культивируемой клетки. Обычно используется диапазон рН от 6,8 до 7,6; в основном, подходит диапазон рН от 7,0 до 7,4.

Если культивируемая клетка представляет собой клетки СНО, то культивирование может быть выполнено способами, известными специалистам в данной области. Например, обычно можно проводить культивирование в газофазной атмосфере с концентрацией CO₂, равной 0-40%, предпочтительно 2-10%, при 30-39°C, предпочтительно при приблизительно 37°C.

Подходящий период культивирования обычно составляет от одного дня до трех месяцев, предпочтительно от одного дня до трех недель.

Выделение и очистка антитела могут быть выполнены известными способами. Известные способы выделения/очистки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, способы, использующие разницу в растворимости (такие как высаливание или осаждение растворителем); методы с использованием различий в молекулярной массе (такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация или электрофорез в SDS-полиакриламидном геле); методы, использующие разницу в электрическом заряде (такие как ионообменная хроматография); методы с использованием специфической аффинности (такие как аффинная хроматография); методы, использующие различия в гидрофобности (такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой); и методы, использующие различие в изоэлектрической точке (например, изоэлектрическое фокусирование).

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для животных или человека. Следовательно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеописанное антитело против LAG-3 в качестве активного ингредиента.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована для профилактики и/или лечения злокачественных новообразований и/или инфекций. Примеры злокачественных новообразований и/или воспаления включают, но ими не ограничены, опухолевые заболевания (например, меланому, рак легкого, рак желудка, рак почек, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак яичников и тому подобное), лейкоз, болезнь Джона, анаплазмоз, бактериальный мастит, микотический мастит, микоплазменные инфекции (такие как микоплазменный мастит, микоплазменная пневмония или тому подобное), туберкулез, инфекцию Theileria orientalis, криптоспоридиоз, кокцидиоз, трипаносомоз и лейшманиоз.

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению может быть растворено в буферах, таких как PBS, физиологический солевой раствор или стерильная вода, необязательно, фильтр-стерилизованная с помощью фильтра или тому подобного, а затем введено животным (включая человека) путем инъекции. К раствору антитела могут быть добавлены добавки (такие как красящие агенты, эмульгаторы, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества, солюбилизаторы, стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты, буферы, изотонизирующие агенты, регуляторы рН и тому подобное). В качестве путей введения могут быть выбраны внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подкожное или внутрикожное введение и тому подобное. Трансназальное или пероральное введение также может быть использовано.

Доза, количество и частота введения антитела против LAG-3 по настоящему изобретению могут изменяться в зависимости от симптомов, возраста и массы тела животного, способа введения, лекарственной формы и тому подобное. Например, 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 1-10 мг/кг массы тела, на взрослое животное обычно можно вводить по меньшей мере один раз с такой частотой, которая позволяет подтвердить желаемый эффект.

Хотя фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать самостоятельно, ее можно применять и в комбинации с хирургическими операциями, лучевой терапией, другими иммунотерапевтическими средствами, такими как противораковая вакцина, или лекарственными средствами с молекулярной мишенью. При таких комбинациях можно ожидать синергетический эффект.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[Пример 1] Получение химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3

1. Введение

Ген активации 3 лимфоцитов (LAG-3), иммуноингибирующий рецептор, был идентифицирован как молекула, тесно связанная с CD4. Недавно было обнаружено, что LAG-3 вовлечен в иммуносупрессию при хронических инфекциях и опухолях. В этом примере с целью создания нового средства для лечения инфекций у крупного рогатого скота, авторы изобретения получили ген химерного антитела путем связывания гена вариабельной области крысиного моноклонального антитела 2D8 против бычьего LAG-3, способного ингибировать связывание бычьего LAG-3 и MHC класса II с генами, кодирующими константные области бычьего иммуноглобулина (бычий IgG1 и Igλ; однако, были введены мутации в предполагаемые сайты связывания c рецепторам Fcγ в домене CH2 бычьего IgG1 для ингибирования активности ADCC; см. фиг. 1 для аминокислотных положений и мутаций: 247 E→P, 248 L→V, 249 P→A, 250 G→делеция, 344 A→S, 345 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4):551-561; Aug. 2014). Этот ген химерного антитела был введен в клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО). Посредством культивирования/пролиферации полученных клеток авторам настоящего изобретения удалось получить химерное "крысино-бычье" антитело против бычьего LAG-3 и подтвердить его ингибиторную активность и биологические активности.

2. Материалы, методы и экспериментальные результаты.

2.1 Конструирование клеток, экспрессирующих бычий LAG-3

Была определена нуклеотидная последовательность полноразмерной молекулы кДНК бычьего гена LAG-3 (номер доступа GenBank AB608099; Shirai T, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Sunden Y, Onuma M, Murata S, Ohashi K. Vet. Immunol. Immunopathol, 144(3-4):462-467; Dec. 15, 2011). На основании полученной генетической информации были получены клетки, экспрессирующие бычий LAG-3. Сначала для получения плазмиды, экспрессирующей бычий lAG-3, осуществляли ПЦР, используя синтезированную кДНК, полученную из клеток периферической крови (PBMC) крупного рогатого скота, в качестве матрицы и обработанные ферментами праймеры с сайтами распознавания BglII и EcoRI на 5'конце (boLAG-3-EGFP F и R). Продукты ПЦР расщепляли с помощью EcolRI (Takara) и SmaI (Takara), очищали набором FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pEGFP-N2 (Clontech), обработанный ферментами рестрикции аналогичным образом. Интересующую полученную плазмиду экспрессии экстрагировали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида обозначена как pEGFP-N2-boLAG-3.

Праймер (boLAG-3-EGFP F): GAAAGATCTATGCTGTGGGAGGCTTGGTT (SEQ ID NO: 61)

Праймер (boLAG-3-EGFP R): CCGGAATTCGGGTTGCTCTGGCTGCAGCT (SEQ ID NO: 62)

Клетки, экспрессирующие бычий LAG-3, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Сначала клетки COS-7 субкультивировали с плотностью 5×10⁴клеток/см² в 6-луночных планшетах, а затем культивировали в течение ночи в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированную фетальной бычьей сыворотки (Cell Culture Technologies), пенициллин 200 Ед/мл, стрептомицин 200 мкл/мл и 0,01% L-глютамин (Life Technologies) при 37°С в присутствии 5% СО₂. Затем, pEGFP-N2-boLAG-3 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль) вводили в клетки COS-7 при 0,4 мкг/см², используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Клетки культивировали в течение 48 часов (клетки, экспрессирующие бычий LAG-3-EGFP). Для подтверждения экспрессии бычьего LAG-3 в полученном, таким образом, экспрессирующих клеток, внутриклеточную локализацию EGFP визуализировали с помощью инвертированного конфокального лазерного микроскопа LSM700 (ZEISS).

2.2 Конструирование растворимого бычьего LAG-3

Плазмиду, экспрессирующую бычий LAG-3-Ig, конструировали в соответствии с методиками, описанными ниже. Для амплификации сигнального пептида и внеклеточной области бычьего LAG-3 (номер доступа GenBank AB608099) были сконструированы праймеры с сайтами распознавания NheI и NsiI на 5' конце (boLAG-3-Ig F и R). ПЦР проводили с использованием синтезированной кДНК, полученной из бычьих PBMC, в качестве матрицы. Продукты ПЦР расщепляли NheI (Takara) и NsiI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pCXN2.1-кроличий IgG1 Fc (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene, 108(2):193-199; Dec. 15, 1991; предоставлен доктором T. Yokomizo, Juntendo University Graduate School of Medicine и модифицирован в лаборатории изобретателей), обработанный ферментами рестрикции аналогичным образом. Плазмиды экспрессии очищали с использованием набора FastGene Xpress Plasmid PLUS (NIPPON Genetics) и хранили при -30°C перед применением в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pCXN2.1-boLAG-3-Ig.

Праймер (boLAG-3-Ig F): CTAGCTAGCCGCCCACCATGCTGTGGGAGGCTTGGTT (SEQ ID NO: 63)

Праймер (boLAG-3-Ig R): TGCATGCATCAGAACAGCTAGGTTGTACG (SEQ ID NO: 64)

Клетки, экспрессирующие растворимый бычий LAG-3-Ig, получали в соответствии с методиками, описанными ниже. Вкратце, 30 мкг pCXN2.1-boLAG-3-Ig вводили в 7,5×10⁷ клеток Expi293F (Life Technologies), используя Expifectamine (Life Technologies). После 7-и дневного культивирования при встряхивании культуральный супернатант собирали. Рекомбинантный Fc-слитый белок очищали от супернатанта с использованием Ab-Capcher Extra (ProteNova). После очистки буфер меняли на PBS (pH 7,4), используя обессоливающую колонку PD-10 (GE Healthcare). Полученный белок хранили при -30°С перед использованием в экспериментах (бычий LAG-3-Ig). Концентрацию очищенного бычьего LAG-3-Ig измеряли с использованием набора Rabbit IgG ELISA Quantitation (Bethyl). Для каждой операции промывки в ELISA использовали Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical). Поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric).

2.3 Получение клеток, продуцирующих крысиные моноклональные антитела против бычьих LAG-3

Синтезировали пептидную цепь из части внеклеточной области бычьего LAG-3 (аминокислоты с номерами от 71 до 99; аминокислотная последовательность: GSAAPTPRGPGPRRYTVLRLAPGGLRIGK (SEQ ID NO: 72)) путем добавления остатка цистеина к NH₂-концу, и связывали с белком гемоцианина молюска (белок-носитель). Получали эмульсию этой пептидной цепи и адъюванта TiterMax Gold (Sigma-Aldrich). Крысу иммунизировали в подушечку лапы полученной эмульсией. После этого, гибридомы получали из подвздошных лимфатических узлов, получая, таким образом, гибридому 2D8, продуцирующую крысиные моноклональные антитела против бычьих LAG-3. Что касается способа конструирования крысиного моноклонального антитела против бычьего LAG-3, то подробное описание приведено в следующем непатентном документе (Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y, Ohashi K. Infect. Immun., 84(1):77-89; Oct. 19, 2015).

2.4 Получение вектора, экспрессирующего химерное "крысино-бычьего" антитело против LAG-3

Химерное "крысино-бычьего" антитело ch2D8 против LAG-3 было получено путем слияния константных областей антитела бычьего IgG1 и Igλ с крысиным антителом против бычьего LAG-3 2D8, используемым в качестве вариабельной области антитела.

Сначала, гены вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи были идентифицированы с помощью RACE-способа в гибридоме, которая продуцирует крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3. Затем получали последовательность гена, в котором вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 связывали с известными константными областями бычьего IgG1 (тяжелая цепь; модифицирована; номер доступа в GenBank X62916) и бычьего Igλ (легкая цепь; номер доступа в GenBank X62917), соответственно, и была проведена оптимизация кодонов [SEQ ID NO: 9 и 10 (аминокислотные последовательности), SEQ ID NO: 14 и 15 (нуклеотидные последовательности после оптимизации кодонов)]. Следует отметить, что для ингибирования активности ADCC бычьего IgG1 были добавлены мутации в предполагаемые сайты связывания с рецептором Fcγ в домене CH2 (см. фиг. 1, где указаны аминокислотные положения и мутации: 247 E→P, 248 L→V, 249 P→A, 250 G→делеция, 344 A→S, 345 P→S; Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology, 142(4):551-561; Aug. 2014). Затем ген был искусственно синтезирован таким образом, что последовательность распознавания NotI, последовательность KOZAK, последовательность легкой цепи химерного антитела, последовательность сигнала присоединения поли-A (PABGH), последовательность промотора (PCMV), последовательность распознавания SacI, последовательность интрона (INRBG), последовательность KOZAK, последовательность тяжелой цепи химерного антитела и последовательность распознавания XbaI были расположены в указанном порядке. Синтезированную цепь гена расщепляли с помощью NotI (Takara) и XbaI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в сайт клонирования (последовательности распознавания ферментами NotI и XbaI ниже PCMV и между INRBG и PABGH) плазмиды экспрессии pDC6 (любезно предоставлен профессором S. Suzuki, Hokkaido University Research Center for Zoonosis Control), обработанной фрагментами рестрикции таким же образом (фиг. 2). Полученную плазмиду экстрагировали набором QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen) и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида обозначена как pDC6-boLAG-3ch2D8.

2.5 Экспрессия химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3

Полученную выше pDC6-boLAG-3ch2D8 трансфицировали в клетки CHO-DG44 (CHO-DG44 (dfhr^-/^-)), которые представляли собой клетки с дефицитом дигидрофолатредуктазы. Через сорок восемь часов среду заменяли средой CD OptiCHO (Life Technologies), содержащей 20 мМ добавки GlutaMAX (Life Technologies). После культивирования в течение 3 недель клетки подвергали селекции и клонированию с помощью лимитирующего разведения. Затем концентрации химерного антитела в культуральных супернатантах измеряли методом дот-блоттинга и ELISA с использованием кроличьего поликлонального антитела против бычьего IgG F(c) (Rockland), проводя таким образом селекцию клонов с высокой экспрессией. Полученный таким образом клон клеток, стабильно экспрессирующий химерное "крысино-бычьего" антитело против бычьего LAG-3, переносили в среду CD Opti-CHO и культивировали при встряхивании в течение 14 дней (125 об/мин, 37°C, 5% CO₂). Продукцию химерных антител в культуральном супернатанте измеряли с помощью ELISA с использованием поликлональных антител кролика против бычьего IgG F(c) (Rockland). Для каждой операции промывки в ELISA использовали Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical). Поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric). Культуральный супернатант на 14-й день центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут для удаления клеток, и супернатант пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм Steritop-GP (Millipore) для стерилизации и затем хранили при 4°С перед очисткой.

2.6 Очистка химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3

Из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, каждое химерное антитело очищали с использованием Ab Capcher Extra (ProteNova). Для связывания со смолой использовали способ с открытой колонкой; PBS pH 7,4 использовали в качестве уравновешивающего буфера и промывочного буфера. В качестве элюирующего буфера использовали 0,1 М глицин-HCl (рН 2,8). В качестве нейтрализующего буфера использовали 1М Трис (рН 9,0). В очищенном антителе заменяли буфер на PBS (pH 7,4), используя обессоливающую колонки PD-10 (GE Healthcare) и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 (50 кДа, Millipore). Очищенное таким образом химерное антитело пропускали через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм (Millipore) для стерилизации и хранили при 4°С перед применением в экспериментах.

2.7 Подтверждение чистоты очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3 (фиг. 3).

Чтобы подтвердить чистоту очищенного химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3, белки антител обнаруживали с помощью SDS-PAGE и окрашивания CBB. Очищенное химерное "крысино-бычье" антитело ch2D8 против бычьего LAG-3 суспендировали в буфере для образцов Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad) и денатурировали при 95°C в течение 5 минут в восстанавливающих условиях (восстановление 2-меркаптоэтанолом; Sigma-Aldrich) или в невосстанавливающих условиях. Используя 10% акриламидный гель, полученные образцы подвергали электрофорезу. В качестве маркеров молекулярной массы использовали Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad). После электрофореза гель окрашивали с помощью Quick-CBB (Wako) и обесцвечивали в дистиллированной воде.

Результаты показаны на фиг. 3. Полосы химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3 наблюдали в спрогнозированных положениях, то есть при 25 кДа (легкая цепь) и 50 кДа (тяжелая цепь) в восстанавливающих условиях и при 150-250 кДа в невосстанавливающих условиях.

2.8 Специфичность связывания химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3 (фиг. 4).

С помощью проточной цитометрии было подтверждено, что химерное "крысино-бычьего" антитело против бычьего LAG-3 специфически связывается с клетками, экспрессирующими бычье LAG-3 (описано выше). Сначала крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3 или химерное "крысино-бычьего" антитело ch2D8 против LAG-3 подвергали взаимодействию с клетками, экспрессирующими бычий LAG-3, при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки аллофикоцианин (APC)-меченное козлиное антитело против крысиного Ig (Southern Biotech) или Alexa Fluor 647-меченый козлиный F(ab')₂ против бычьего IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch) взаимодействовали при комнатной температуре в течение 30 мин. В качестве отрицательного контрольного антитела использовали контроль с изотипом IgG2a (κ) крысы (BD Bioscience) или бычьим антителом IgG1 (Bethyl). После промывки каждое крысиное антитело или химерное "крысино-бычье" антитело, связанное с клеточными поверхностями, детектировали с помощью FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich).

Экспериментальные результаты приведены на фиг. 4. Было обнаружено, что химерное "крысино-бычьего" ch2D8 антитело против бычьего LAG-3 связывается с клетками экспрессирующими бычьими LAG-3 так же как и крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3.

2.9 Ингибиторная активность химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3 в отношении связывания бычьего LAG-3/MHC класса II (фиг. 5)

Используя клеточный клон BL3.1 (клеточный клон, полученный из В-клеточной лимфомы крупного рогатого скота, который высоко экспрессирует MHC класса II) и бычий LAG-3-Ig (описанный выше), тестировали ингибирование связывания бычьего LAG-3/MHC класса II с помощью антител против LAG-3. Сначала, крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3 или химерное "крысино-бычье" ch2D8 против бычьего LAG-3 в конечной концентрации 0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5 или 25 мкг/мл и бычий LAG-3-Ig в конечной концентрации 3,3 мкг/мл смешивали в 96-луночных планшетах, где они взаимодействовали при 37°С в течение 30 мин. Затем клеточный клон BL3.1 (1×10⁵ клеток) блокировали PBS c добавлением 10% инактивированной козьей сывороткой (Life Technologies) при комнатной температуре в течение 15 минут и проводили реакцию с вышеуказанной реакционной смесью при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве отрицательного контрольного антитела использовали контроль с изотипом IgG1 (κ) крысы (BD Bioscience) или бычьим антителом IgG1 (Bethyl). После промывки Alexa Fluor 647-меченный козий F(ab')₂ против кроличьего IgG (H+L) (Life Technologies), который заранее подвергали абсорбционной обработки (37°C, 30 мин) IgG, полученным из крысиной сыворотки (Sigma-Aldrich) и IgG, полученный из крысиной сыворотки (Sigma-Aldrich) взаимодействовал при комнатной температуре в течение 30 минут, таким образом обнаруживая бычий LAG-3-Ig, связанный с клеточными поверхностями. Для анализа использовали FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich). Принимая долю клеток, связанных с LAG-3-Ig без добавления антител, за 100%, доля клеток, связанных с LAG-3-Ig, для каждой концентрации антител была показана как относительная величина.

Экспериментальные результаты приведены на фиг. 5. Было обнаружено, что химерное "крысино-бычье" антитела ch2D8 против бычьего LAG-3 ингибировало связывание LAG-3-Ig с клетками, экспрессирующими LAG-3, на том же уровне с крысиным антителом 2D8 против бычьего LAG-3.

2.10 Тест биологической активности с использованием химерного "крысино-бычьего" антитела против бычьего LAG-3 (фиг. 6)

Для подтверждения того факта, что ингибирование связывания бычьего LAG-3/MHC класса II химерным "крысино-бычьим" антителом против бычьего LAG-3 активирует лимфоциты, проводили тест биологической активности с использованием IFN-γ в качестве индикатора. Вкратце, РВМС, выделенные из бычьей периферической крови, суспендировали в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (Cell Culture Technologies), пенициллин 200 Ед/мл, стрептомицин 200 мкг/мл и 0,01% L-глютамин ( Life Technologies) до концентрации 2×10⁶ клеток/мл. К РВМС добавляли 10 мкг/мл крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 или химерного "крысино-бычьего" антитела ch2D8 против LAG-3. Затем проводили культивирование при 37°С и 5% СО₂ в течение 2 дней. В качестве контрольных антител использовали IgG, полученный из сыворотки крысы (Sigma-Aldrich) и IgG, полученный из бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich). Через два дня культивирования собирали культуральный супернатант и измеряли продукцию IFN-γ, используя набор Bovine IFN-γ ELISA (BETYL). Для каждой операции промывки в ELISA использовали Auto Plate Washer BIO WASHER 50 (DS Pharma Biomedical). Поглощение измеряли с помощью микропланшетного ридера MTP-650FA (Corona Electric).

Экспериментальные результаты приведены на фиг. 6. Было обнаружено, что химерное "крысино-бычьего" ch2D8 антитело против бычьего LAG-3 повышает ответ IFN-γ бычьих PBMC так же как и крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3.

2.11 Анализ CDR крысиного антитела против бычьего LAG-3

Определяющие комплементарность области (CDR) крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 определяли с использованием NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Результаты показаны на фиг. 1.

[Пример 2] Применение антитела против LAG-3 у других видов животных

1. Материалы, методы и экспериментальные результаты.

1.1 Идентификация генов овечьего и буйволиного LAG-3

Для определения полноразмерных кодирующих последовательностей (CDS) буйвола (Bubalus bubalis: азиатский буйвол) и кДНК овечье LAG-3, сначала обрабатывали праймеры для амплификации полноразмерных CDS из нуклеотидных последовательностей буйволиного и овечьего LAG-3 (номер доступа GenBank AB608099 и XM_012129455) (buLAG-3 CDS F и R, ovLAG-3 CDS F и R), а затем проводили ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК, полученную из буйволиного или овечьего PBMC. Для полученных амплифицированных продуктов определяли нуклеотидные последовательности с помощью капиллярного секвенатора согласно обычным методам.

Праймер (buLAG-3 CDS F): ATGCTGTGGGAGGCTTGGTTC (SEQ ID NO: 65)

Праймер (buLAG-3 CDS R): TCAGGGATGCTCTGGCTGCA (SEQ ID NO: 66)

Праймер (ovLAG-3 CDS F): ATGCTGTGGGAGGCTCAGTTCCAGG (SEQ ID NO: 67)

Праймер (ovLAG-3 CDS R): TCAGGGTTGCTCCGGCTGCA (SEQ ID NO: 68)

1.2. Конструирование клеток COS-7, экспрессирующих буйволиный LAG-3

Для получения плазмиды, экспрессирующей буйволиный LAG-3, проводили ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК, полученную буйволиного LAG-3, и праймеров, сконструированных путем добавления сайтов распознавания SacI и EcoRI на 5' конец (buLAG-3-EGFP F и R). Полученные продукты ПЦР расщепляли с помощью SacI (Takara) и EcoRI (Takara), очищали с помощью набора FastGene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pEGFP-N2 (Clontech), обработанный ферментами рестрикции аналогичным образом. Интересующую плазмиду экспрессии экстрагировали с использованием набора FastGene Xpress Plasmid PLUS (NIPPON Genetics) и хранили при -30°C перед применением в экспериментах. В настоящем документе полученная таким образом плазмида обозначена как pEGFP-N2-buLAG-3.

Праймер (buLAG-3-EGFP F): ATTGAGCTCATGCTGTGGGAGGCTTGGTT (SEQ ID NO: 69)

Праймер (buLAG-3-EGFP R): AATGAATTCGGGATGCTCTGGCTGCAGC (SEQ ID NO: 70)

Клетки COS-7 субкультивировали с плотностью ⁵ ×104 клеток/см2 в 6-луночных планшетах, а затем культивировали в течение ночи в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированную фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen) и 0,01% L-глютамин (Life Technologies) при 37°С в присутствии 5% СО₂. pEGFP-N2-buLAG-3 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль) вводили в клетки COS-7 при 0,4 мкг/см², используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Клетки культивировали в течение 48 часов (клетки, экспрессирующие бычий LAG-3-EGFP). Для подтверждения экспрессии буйволиного LAG-3 в полученных таким образом экспрессирующих клетках, внутриклеточную локализацию EGFP визуализировали с помощью универсального флуоресцентного микроскопа BZ-9000 (KEYENCE).

1.3. Реакционная способность крысиного антитела 2D8 против буйволиного LAG-3 в отношении буйволиного LAG-3 (фиг. 7)

Методом проточной цитометрии было подтверждено, что крысиное моноклональное антитело против LAG-3 перекрестно реагирует с буйволиным LAG-3. Клетки COS, экспрессирующие буйволиный LAG-3-EGFP, блокировали PBS с добавлением 10% инактивированной козьей сыворотки (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 15 минут и проводили реакцию с 10 мкг/мл крысиного антитела 2D8 против бычьего LAG-3 при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки клетки взаимодействовали с меченным APC козьим антителом против крысиного Ig (Beckman Coulter) при комнатной температуре в течение 30 мин. В качестве отрицательного контрольного антитела использовали контроль с изотипом IgG1 (κ) крысы (BD Bioscience). Для анализа использовали FACS Verse (BD Bioscience). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали 1% бычий сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich).

Экспериментальные результаты приведены на фиг. 7. Было подтверждено, что крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3 связывается с клетками, экспрессирующими буйволиный LAG-3.

1.4. Реакционная способность крысиного антитела 2D8 против LAG-3 с овечьими лимфоцитами (фиг. 8)

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из периферической крови овец центрифугированием в градиенте плотности с использованием Percoll (GE Healthcare). Выделенные PBMC буйвола суспендировали в среде RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), содержащей 10% инактивированную фетальную телячью сыворотку (Invitrogen), пенициллин 200 Ед/мл, стрептомицин 200 мкг/мл и 0,01% L-глютамин (Life Technologies). Плотность клеток доводили до 2×10⁶ клеток/мл. К этим PBMC добавляли 20 нг/мл форбол-12-миристат ацетата (PMA) и 1 мкг/мл йономицина (Sigma-Aldrich), а затем культивировали в течение ночи при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Культивированные РВМС собирали и блокировали с помощью PBS с добавление 10% инактивированной козьей сыворотки (Invitrogen) при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3 взаимодействовало при комнатной температуре в течение 30 минут. В качестве отрицательного контроля использовали IgG, полученный из крысиной сыворотки (Sigma-Aldrich). После промывки проводили мечение с помощью меченого АРС козьего антитела против крысиного Ig (Beckman Coulter) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем проводили реакцию с мышиным антителом против овечьего CD8 (38.65, AbD Serotec) при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки маркировку осуществляли с использованием меченного PerCP/Cy5.5 козьего антитела против мышиного IgG2a (SAnta Cruz) при комнатной температуре в течение 30 минут. После дополнительной промывки проводили реакцию с мышиным антителом против овечьего CD21, меченным Alexa Flour 488 (GB25A, VMRD), при комнатной температуре в течение 30 минут. Для мечения GB25A использовали набор Zenon Labeling Kit (Life Technologies). Для анализа использовали FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разбавления антител использовали 1% бычий сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich).

Экспериментальные результаты приведены на фиг. 8. Крысиное антитело 2D8 против бычьего LAG-3, прочно связывается с CD8⁺ овечьими T-клетками (CD21-CD8+ клетки) и CD8- T-клетками (CD21-CD8- клетки; т.е. клеточная популяция, содержащая CD4⁺ T-клетки и γ δ T-клетки), оба активированные стимуляцией PMA/иономицином.

Все публикации, патенты и заявки на патент, которые приводятся в данном документе, тем самым включены в своем полном объеме посредством ссылки.

Промышленная применимость

Антитело против LAG-3 по настоящему изобретению можно использовать для профилактики и/или лечения злокачественного новообразования и инфекций у животных.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ КОРПОРЕЙШН ХОККАЙДО ЮНИВЕРСИТИ

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ LAG-3

<130> FP-223PCT

<150> JP P2016-159091

<151> 2016-08-15

<160> 72

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 132

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 1

Met Met Ser Pro Val Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Leu

1 5 10 15

Gly Thr Asn Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser

20 25 30

Ala Thr Ile Gly Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln Ala Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 2

<211> 134

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 2

Met Val Leu Leu Glu Leu Val Ser Val Ile Ala Leu Phe Gln Gly Val

1 5 10 15

His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Lys Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp

35 40 45

Thr Tyr Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp

50 55 60

Trp Val Ala Ser Ile Thr Ile Lys Thr His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Glu Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Ser Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Leu Tyr Tyr Cys Asn Arg Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 3

<211> 105

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 3

Gln Pro Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu

1 5 10 15

Glu Leu Asn Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ser Val Thr Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile

35 40 45

Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Ser Asp Trp Lys Ser

65 70 75 80

Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr

85 90 95

Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

100 105

<210> 4

<211> 328

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 4

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp

145 150 155 160

Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp

180 185 190

Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro

195 200 205

Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser

225 230 235 240

Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr

260 265 270

Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr

275 280 285

Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr

290 295 300

Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

305 310 315 320

Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 5

<211> 396

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 5

atgatgagtc ctgtccaatc cctgtttttg ttattgcttt ggattctggg aaccaatggt 60

gatgttgtgc tgacccagac tccacccact ttatcggcta ccattggaca atcggtctcc 120

atctcttgca ggtcaagtca gagtctctta gatagtgatg gaaataccta tttaaattgg 180

ttgctacaga ggccaggcca atctccacag cttctaattt attcggtatc caacctggaa 240

tctggggtcc ccaacaggtt cagtggcagt gggtcagaaa cagatttcac actcaaaatc 300

agtggagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgca tgcaagctac ccatgttcca 360

ttcacgttcg gctcagggac gaagttggaa ataaaa 396

<210> 6

<211> 396

<212> ДНК

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

atgatgtctc ccgtccaaag cttgttcctg cttctcctct ggattctggg cacaaacgga 60

gatgtggttc tcacccagac cccccctact ctgtctgcca ccatcggcca gagcgtgtcc 120

atatcctgtc gcagctccca aagcctgctg gactccgatg ggaatactta cctgaattgg 180

ctgttgcagc ggcctggcca gtccccccag ctgttgatct acagcgttag caatctggaa 240

agcggggtcc ccaaccgatt ctccggaagc ggctccgaga ccgattttac cctcaagatc 300

tccggcgtgg aagccgagga cctgggagtg tattattgca tgcaggccac ccatgtgccc 360

ttcaccttcg gtagcggtac caagttggag atcaag 396

<210> 7

<211> 318

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 7

cagcccaagt ccccaccctc ggtcaccctg ttcccgccct ccacggagga gctcaacggc 60

aacaaggcca ccctggtgtg tctcatcagc gacttctacc cgggtagcgt gaccgtggtc 120

tggaaggcag acggcagcac catcacccgc aacgtggaga ccacccgggc ctccaaacag 180

agcaacagca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgagcagcga ctggaaatcg 240

aaaggcagtt acagctgcga ggtcacgcac gaggggagca ccgtgacgaa gacagtgaag 300

ccctcagagt gttcttag 318

<210> 8

<211> 987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 8

gctagcacca cagcacctaa agtttaccct ctgtcttcct gctgcggcga caagtcttca 60

tcaactgtta ctcttggatg cctggtctca agttacatgc ccgagcccgt gacagtgacc 120

tggaactcag gcgctctgaa gtctggagtg cacacatttc cagctgtgct tcagtctagc 180

ggcctgtatt ccctcagctc tatggttact gtacctggta gcaccagcgg acagactttc 240

acctgtaatg ttgcccatcc cgcatcttct accaaggtcg ataaagccgt tgaccccact 300

tgcaaaccat ccccttgtga ttgttgtcca ccccctccag tggctggccc ttccgtcttc 360

attttccctc ctaaacctaa ggatactctg accatctcag ggacacccga ggtcacctgt 420

gtcgtcgtgg acgtgggaca tgacgaccca gaagtcaagt tctcatggtt cgtggacgat 480

gtggaggtga acacagcaac aacaaagccc agagaagaac agtttaacag cacatatcgg 540

gtggtcagcg ccttgcgtat tcagcaccag gactggactg gtggcaagga gtttaagtgc 600

aaggtgcata acgaaggtct gccctcttct atagtgagaa ctatctcccg aactaagggc 660

cccgctcggg agccccaggt ttacgtcctt gctccccctc aggaggaact gagtaaatca 720

accgtgagtc tcacctgtat ggttacctca ttttacccag actacatcgc cgtagagtgg 780

cagaggaatg gacagccaga gtctgaggac aaatacggca ctactcctcc ccaactggat 840

gccgactctt cctacttcct ctactccaaa ttgcgagttg accggaactc atggcaggag 900

ggggacacat acacatgcgt cgttatgcac gaggccctgc acaaccatta cacccagaag 960

tccacatcta aaagtgcagg taagtaa 987

<210> 9

<211> 237

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> химерная L-цепь

<400> 9

Met Met Ser Pro Val Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Leu

1 5 10 15

Gly Thr Asn Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Pro Thr Leu Ser

20 25 30

Ala Thr Ile Gly Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Val Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln Ala Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Gln Pro Lys Ser Pro Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Thr Glu Glu Leu Asn Gly Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

145 150 155 160

Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Val Thr Val Val Trp Lys Ala Asp

165 170 175

Gly Ser Thr Ile Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys Gln

180 185 190

Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ser Ser

195 200 205

Asp Trp Lys Ser Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu Gly

210 215 220

Ser Thr Val Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 10

<211> 462

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> химерная Н-цепь

<400> 10

Met Val Leu Leu Glu Leu Val Ser Val Ile Ala Leu Phe Gln Gly Val

1 5 10 15

His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

20 25 30

Lys Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Asp

35 40 45

Thr Tyr Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp

50 55 60

Trp Val Ala Ser Ile Thr Ile Lys Thr His Asn Tyr Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Ala Ser Val Lys Glu Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln

85 90 95

Ser Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

100 105 110

Leu Tyr Tyr Cys Asn Arg Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val

115 120 125

Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro

130 135 140

Leu Ser Ser Cys Cys Gly Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Lys Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser

195 200 205

Thr Ser Gly Gln Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser

210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Ala Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys

225 230 235 240

Asp Cys Cys Pro Pro Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg

305 310 315 320

Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val

325 330 335

His Asn Glu Gly Leu Pro Ser Ser Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr

340 345 350

Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln

355 360 365

Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser

370 375 380

Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp

405 410 415

Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp

420 425 430

Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

450 455 460

<210> 11

<211> 396

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 11

atgatgtctc ccgtccaaag cttgttcctg cttctcctct ggattctggg cacaaacgga 60

gatgtggttc tcacccagac cccccctact ctgtctgcca ccatcggcca gagcgtgtcc 120

atatcctgtc gcagctccca aagcctgctg gactccgatg ggaatactta cctgaattgg 180

ctgttgcagc ggcctggcca gtccccccag ctgttgatct acagcgttag caatctggaa 240

agcggggtcc ccaaccgatt ctccggaagc ggctccgaga ccgattttac cctcaagatc 300

tccggcgtgg aagccgagga cctgggagtg tattattgca tgcaggccac ccatgtgccc 360

ttcaccttcg gtagcggtac caagttggag atcaag 396

<210> 12

<211> 402

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 12

atggtgcttc tcgagctggt cagcgtgatt gctctgtttc agggcgtgca ctgcgaagtg 60

cagctggtgg agagtggtgg tgggctcgtg caaccaaaag gcagtctcag gctgagttgt 120

gccgcctccg gattcgattt cgacacctac ccaatgagct gggtcaggca agccccaggg 180

aaaggactcg attgggtggc aagcattacc atcaagacac acaattatgc taccctgtat 240

gccgcaagcg taaaggaacg ctttaccatc tcccgcgatg atagccagtc catggtatat 300

ttgcaaatga ataatttgaa gacagaagat accgctttgt attattgcaa cagagaagat 360

tttgattatt gggggcaggg ggtgatggta accgtgtcca gc 402

<210> 13

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 13

cagcctaagt cccctccttc agtcaccctg tttccaccat ctaccgaaga actcaacggg 60

aataaagcaa cactggtgtg ccttatttct gatttttacc cagggtctgt gacagtggtt 120

tggaaagctg acggttcaac aattacaaga aacgtggaga caacaagggc ttctaagcag 180

tcaaactcta agtatgctgc aagttcttac ctttctctta caagtagtga ctggaaaagt 240

aagggcagtt attcatgcga ggtcactcac gagggaagta ctgtaactaa aactgtaaaa 300

ccatcagagt gttcatag 318

<210> 14

<211> 714

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 14

atgatgtctc ccgtccaaag cttgttcctg cttctcctct ggattctggg cacaaacgga 60

gatgtggttc tcacccagac cccccctact ctgtctgcca ccatcggcca gagcgtgtcc 120

atatcctgtc gcagctccca aagcctgctg gactccgatg ggaatactta cctgaattgg 180

ctgttgcagc ggcctggcca gtccccccag ctgttgatct acagcgttag caatctggaa 240

agcggggtcc ccaaccgatt ctccggaagc ggctccgaga ccgattttac cctcaagatc 300

tccggcgtgg aagccgagga cctgggagtg tattattgca tgcaggccac ccatgtgccc 360

ttcaccttcg gtagcggtac caagttggag atcaagcagc ctaagtcccc tccttcagtc 420

accctgtttc caccatctac cgaagaactc aacgggaata aagcaacact ggtgtgcctt 480

atttctgatt tttacccagg gtctgtgaca gtggtttgga aagctgacgg ttcaacaatt 540

acaagaaacg tggagacaac aagggcttct aagcagtcaa actctaagta tgctgcaagt 600

tcttaccttt ctcttacaag tagtgactgg aaaagtaagg gcagttattc atgcgaggtc 660

actcacgagg gaagtactgt aactaaaact gtaaaaccat cagagtgttc atag 714

<210> 15

<211> 1389

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная последовательность

<400> 15

atggtgcttc tcgagctggt cagcgtgatt gctctgtttc agggcgtgca ctgcgaagtg 60

cagctggtgg agagtggtgg tgggctcgtg caaccaaaag gcagtctcag gctgagttgt 120

gccgcctccg gattcgattt cgacacctac ccaatgagct gggtcaggca agccccaggg 180

aaaggactcg attgggtggc aagcattacc atcaagacac acaattatgc taccctgtat 240

gccgcaagcg taaaggaacg ctttaccatc tcccgcgatg atagccagtc catggtatat 300

ttgcaaatga ataatttgaa gacagaagat accgctttgt attattgcaa cagagaagat 360

tttgattatt gggggcaggg ggtgatggta accgtgtcca gcgctagcac cacagcacct 420

aaagtttacc ctctgtcttc ctgctgcggc gacaagtctt catcaactgt tactcttgga 480

tgcctggtct caagttacat gcccgagccc gtgacagtga cctggaactc aggcgctctg 540

aagtctggag tgcacacatt tccagctgtg cttcagtcta gcggcctgta ttccctcagc 600

tctatggtta ctgtacctgg tagcaccagc ggacagactt tcacctgtaa tgttgcccat 660

cccgcatctt ctaccaaggt cgataaagcc gttgacccca cttgcaaacc atccccttgt 720

gattgttgtc caccccctcc agtggctggc ccttccgtct tcattttccc tcctaaacct 780

aaggatactc tgaccatctc agggacaccc gaggtcacct gtgtcgtcgt ggacgtggga 840

catgacgacc cagaagtcaa gttctcatgg ttcgtggacg atgtggaggt gaacacagca 900

acaacaaagc ccagagaaga acagtttaac agcacatatc gggtggtcag cgccttgcgt 960

attcagcacc aggactggac tggtggcaag gagtttaagt gcaaggtgca taacgaaggt 1020

ctgccctctt ctatagtgag aactatctcc cgaactaagg gccccgctcg ggagccccag 1080

gtttacgtcc ttgctccccc tcaggaggaa ctgagtaaat caaccgtgag tctcacctgt 1140

atggttacct cattttaccc agactacatc gccgtagagt ggcagaggaa tggacagcca 1200

gagtctgagg acaaatacgg cactactcct ccccaactgg atgccgactc ttcctacttc 1260

ctctactcca aattgcgagt tgaccggaac tcatggcagg agggggacac atacacatgc 1320

gtcgttatgc acgaggccct gcacaaccat tacacccaga agtccacatc taaaagtgca 1380

ggtaagtaa 1389

<210> 16

<211> 11

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 16

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 17

Met Gln Ala Thr His Val Pro Phe Thr

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 18

Gly Phe Asp Phe Asp Thr Tyr Pro

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 19

Ile Thr Ile Lys Thr His Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 20

Asn Arg Glu Asp Phe Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 329

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 21

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro

100 105 110

Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp

145 150 155 160

Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp

180 185 190

Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu

195 200 205

Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys

225 230 235 240

Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys

260 265 270

Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr

290 295 300

Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 22

<211> 329

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 22

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro

100 105 110

Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp

145 150 155 160

Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp

180 185 190

Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu

195 200 205

Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys

225 230 235 240

Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys

260 265 270

Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr

290 295 300

Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 23

<211> 329

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 23

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Ala Val Asp Pro Arg Cys Lys Thr Thr Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro

100 105 110

Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp

145 150 155 160

Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp

180 185 190

Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu

195 200 205

Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys

225 230 235 240

Ser Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys

260 265 270

Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr

290 295 300

Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 24

<211> 326

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 24

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Ser Gly Gln Thr Phe

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Gly Val Ser Ile Asp Cys Ser Lys Cys His Asn Gln Pro Cys Val

100 105 110

Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

115 120 125

Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val Gly

130 135 140

His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Arg Ser Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Ser Ala Pro

195 200 205

Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu

225 230 235 240

Ser Val Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ala Val

245 250 255

Glu Trp Gln Arg Asn Arg Gln Thr Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Gln Leu Asp Thr Asp Arg Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Ala Tyr Thr Cys

290 295 300

Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Met Gln Lys Ser Thr

305 310 315 320

Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 25

<211> 326

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 25

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Gly Ser Thr Ser Gly Gln Thr Phe

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Gly Val Ser Ser Asp Cys Ser Lys Pro Asn Asn Gln His Cys Val

100 105 110

Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

115 120 125

Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val Gly

130 135 140

His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ile Lys Gly Leu Ser Ala Ser

195 200 205

Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val

225 230 235 240

Ser Val Thr Cys Met Val Ile Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Val Asp Val

245 250 255

Glu Trp Gln Arg Asp Arg Gln Thr Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Arg Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Thr Cys

290 295 300

Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Met Gln Lys Ser Thr

305 310 315 320

Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 26

<211> 327

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 26

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ser Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Lys Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Ser Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Ala Val Gly Val Ser Ser Asp Cys Ser Lys Pro Asn Asn Gln His Cys

100 105 110

Val Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

115 120 125

Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val

130 135 140

Gly His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val

145 150 155 160

Glu Val His Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

165 170 175

Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr

180 185 190

Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ile Lys Gly Leu Ser Ala

195 200 205

Ser Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro

210 215 220

Gln Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr

225 230 235 240

Val Ser Leu Thr Cys Met Val Ile Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Val Asp

245 250 255

Val Glu Trp Gln Arg Asp Arg Gln Thr Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Arg Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Thr

290 295 300

Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Met Gln Lys Ser

305 310 315 320

Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys

325

<210> 27

<211> 352

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 27

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Ser Ser Glu Thr Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Ala Val Thr Ala Arg Arg Pro Val Pro Thr Thr Pro Lys Thr Thr Ile

100 105 110

Pro Pro Gly Lys Pro Thr Thr Pro Lys Ser Glu Val Glu Lys Thr Pro

115 120 125

Cys Gln Cys Ser Lys Cys Pro Glu Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val

165 170 175

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Arg Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala

195 200 205

Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Gln Gly Lys Glu Phe Lys Cys

210 215 220

Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser

225 230 235 240

Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro

245 250 255

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile

260 265 270

Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp

290 295 300

Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Val Asn Lys Ser

305 310 315 320

Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala

325 330 335

Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 28

<211> 352

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 28

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Arg Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Glu Thr Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Ala Val Thr Ala Arg Arg Pro Val Pro Thr Thr Pro Lys Thr Thr Ile

100 105 110

Pro Pro Gly Lys Pro Thr Thr Gln Glu Ser Glu Val Glu Lys Thr Pro

115 120 125

Cys Gln Cys Ser Lys Cys Pro Glu Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val

165 170 175

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Arg Thr

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala

195 200 205

Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Gln Gly Lys Glu Phe Lys Cys

210 215 220

Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser

225 230 235 240

Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro

245 250 255

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile

260 265 270

Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp

290 295 300

Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Lys Ser

305 310 315 320

Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala

325 330 335

Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 29

<211> 990

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 29

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct tcagtcctcc 180

gggctgtact ctctcagcag catggtgacc gtgcccggca gcacctcagg acagaccttc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaaggctgt tgatcccaca 300

tgcaaaccat caccctgtga ctgttgccca ccccctgagc tccccggagg accctctgtc 360

ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc ctcacaatct cgggaacgcc cgaggtcacg 420

tgtgtggtgg tggacgtggg ccacgatgac cccgaggtga agttctcctg gttcgtggac 480

gacgtggagg taaacacagc cacgacgaag ccgagagagg agcagttcaa cagcacctac 540

cgcgtggtca gcgccctgcg catccagcac caggactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600

tgcaaggtcc acaacgaagg cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc caggaccaaa 660

gggccggccc gggagccgca ggtgtatgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720

agcacggtca gcctcacctg catggtcacc agcttctacc cagactacat cgccgtggag 780

tggcagagaa acgggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgacccc gccccagctg 840

gacgccgaca gctcctactt cctgtacagc aagctcaggg tggacaggaa cagctggcag 900

gaaggagaca cctacacgtg tgtggtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacgcag 960

aagtccacct ctaagtctgc gggtaaatga 990

<210> 30

<211> 990

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 30

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180

gggctgtact ctctcagcag catggtgacc gtgcccggca gcacctcagg acagaccttc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaaggctgt tgatcccaca 300

tgcaaaccat caccctgtga ctgttgccca ccccctgagc tccccggagg accctctgtc 360

ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc ctcacaatct cgggaacgcc cgaggtcacg 420

tgtgtggtgg tggacgtggg ccacgatgac cccgaggtga agttctcctg gttcgtggac 480

gacgtggagg taaacacagc cacgacgaag ccgagagagg agcagttcaa cagcacctac 540

cgcgtggtca gcgccctgcg catccagcac caggactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600

tgcaaggtcc acaacgaagg cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc caggaccaaa 660

gggccggccc gggagccgca ggtgtatgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720

agcacggtca gcctcacctg catggtcacc agcttctacc cagactacat cgccgtggag 780

tggcagagaa acgggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgacccc gccccagctg 840

gacgccgaca gctcctactt cctgtacagc aagctcaggg tggacaggaa cagctggcag 900

gaaggagaca cctacacgtg tgtggtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacgcag 960

aagtccacct ctaagtctgc gggtaaatga 990

<210> 31

<211> 990

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 31

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag catggtgacc gtgcccggca gcacctcagg aacccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttgatccc 300

agatgcaaaa caacctgtga ctgttgccca ccgcctgagc tccctggagg accctctgtc 360

ttcatcttcc caccgaaacc caaggacacc ctcacaatct cgggaacgcc cgaggtcacg 420

tgtgtggtgg tggacgtggg ccacgatgac cccgaggtga agttctcctg gttcgtggac 480

gacgtggagg taaacacagc cacgacgaag ccgagagagg agcagttcaa cagcacctac 540

cgcgtggtca gcgccctgcg catccagcac caggactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600

tgcaaggtcc acaacgaagg cctcccagcc cccatcgtga ggaccatctc caggaccaaa 660

gggccggccc gggagccgca ggtgtatgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720

agcacggtca gcctcacctg catggtcacc agcttctacc cagactacat cgccgtggag 780

tggcagagaa atgggcagcc tgagtcagag gacaagtacg gcacgacccc tccccagctg 840

gacgccgacg gctcctactt cctgtacagc aggctcaggg tggacaggaa cagctggcag 900

gaaggagaca cctacacgtg tgtggtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacgcag 960

aagtccacct ctaagtctgc gggtaaatga 990

<210> 32

<211> 981

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 32

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatcca gctgcggaga cacatccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtgtcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct tcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag catggtgacc gtgcccgcca gcagctcagg acagaccttc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaaggctgt tggggtctcc 300

attgactgct ccaagtgtca taaccagcct tgcgtgaggg aaccatctgt cttcatcttc 360

ccaccgaaac ccaaagacac cctgatgatc acaggaacgc ccgaggtcac gtgtgtggtg 420

gtgaacgtgg gccacgataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtgga tgacgtggag 480

gtgcacacgg ccaggtcgaa gccaagagag gagcagttca acagcacgta ccgcgtggtc 540

agcgccctgc ccatccagca ccaggactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600

aacaacaaag gcctctcggc ccccatcgtg aggatcatct ccaggagcaa agggccggcc 660

cgggagccgc aggtgtatgt cctggaccca cccaaggaag agctcagcaa aagcacgctc 720

agcgtcacct gcatggtcac cggcttctac ccagaagatg tagccgtgga gtggcagaga 780

aaccggcaga ctgagtcgga ggacaagtac cgcacgaccc cgccccagct ggacaccgac 840

cgctcctact tcctgtacag caagctcagg gtggacagga acagctggca ggaaggagac 900

gcctacacgt gtgtggtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacatgca gaagtccacc 960

tctaagtctg cgggtaaatg a 981

<210> 33

<211> 981

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 33

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtgtcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag catggtgacc gtgcccggca gcacctcagg acagaccttc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaaggctgt tggggtctcc 300

agtgactgct ccaagcctaa taaccagcat tgcgtgaggg aaccatctgt cttcatcttc 360

ccaccgaaac ccaaagacac cctgatgatc acaggaacgc ccgaggtcac gtgtgtggtg 420

gtgaacgtgg gccacgataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtgga cgacgtggag 480

gtgcacacgg ccaggacgaa gccgagagag gagcagttca acagcacgta ccgcgtggtc 540

agcgccctgc ccatccagca ccaggactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600

aacatcaaag gcctctcggc ctccatcgtg aggatcatct ccaggagcaa agggccggcc 660

cgggagccgc aggtgtatgt cctggaccca cccaaggaag agctcagcaa aagcacggtc 720

agcgtcacct gcatggtcat cggcttctac ccagaagatg tagacgtgga gtggcagaga 780

gaccggcaga ctgagtcgga ggacaagtac cgcacgaccc cgccccagct ggacgccgac 840

cgctcctact tcctgtacag caagctcagg gtggacagga acagctggca gagaggagac 900

acctacacgt gtgtggtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacatgca gaagtccacc 960

tctaagtctg cgggtaaatg a 981

<210> 34

<211> 984

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 34

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgagttctt gctgcgggga caagtccagc 60

tcgggggtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag catggtgacc gtgcccgcca gcagctcagg aacccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttggggtc 300

tccagtgact gctccaagcc taataaccag cattgcgtga gggaaccatc tgtcttcatc 360

ttcccaccga aacccaaaga caccctgatg atcacaggaa cgcccgaggt cacgtgtgtg 420

gtggtgaacg tgggccacga taaccccgag gtgcagttct cctggttcgt ggacgacgtg 480

gaggtgcaca cggccaggac gaagccgaga gaggagcagt tcaacagcac gtaccgcgtg 540

gtcagcgccc tgcccatcca gcaccaggac tggactggag gaaaggagtt caagtgcaag 600

gtcaacatca aaggcctctc ggcctccatc gtgaggatca tctccaggag caaagggccg 660

gcccgggagc cgcaggtgta tgtcctggac ccacccaagg aagagctcag caaaagcacg 720

gtcagcctca cctgcatggt catcggcttc tacccagaag atgtagacgt ggagtggcag 780

agagaccggc agactgagtc ggaggacaag taccgcacga ccccgcccca gctggacgcc 840

gaccgctcct acttcctgta cagcaagctc agggtggaca ggaacagctg gcagagagga 900

gacacctaca cgtgtgtggt gatgcacgag gccctgcaca atcactacat gcagaagtcc 960

acctctaagt ctgcgggtaa atga 984

<210> 35

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 35

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatcca gctgcggaga cacatccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtccg gcagtcctct 180

gggctgtact ctctcagcag catggtgact gtgcccgcca gcagctcaga aacccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgtcactgca 300

aggcgtccag tcccgacgac gccaaagaca actatccctc ctggaaaacc cacaacccca 360

aagtctgaag ttgaaaagac accctgccag tgttccaaat gcccagaacc tctgggagga 420

ctgtctgtct tcatcttccc accgaaaccc aaggacaccc tcacaatctc gggaacgccc 480

gaggtcacgt gtgtggtggt ggacgtgggc caggatgacc ccgaggtgca gttctcctgg 540

ttcgtggacg acgtggaggt gcacacggcc aggacgaagc cgagagagga gcagttcaac 600

agcacctacc gcgtggtcag cgccctgcgc atccagcacc aggactggct gcagggaaag 660

gagttcaagt gcaaggtcaa caacaaaggc ctcccggccc ccattgtgag gaccatctcc 720

aggaccaaag ggcaggcccg ggagccgcag gtgtatgtcc tggccccacc ccgggaagag 780

ctcagcaaaa gcacgctcag cctcacctgc ctgatcaccg gtttctaccc agaagagata 840

gacgtggagt ggcagagaaa tgggcagcct gagtcggagg acaagtacca cacgaccgca 900

ccccagctgg atgctgacgg ctcctacttc ctgtacagca agctcagggt gaacaagagc 960

agctggcagg aaggagacca ctacacgtgt gcagtgatgc acgaagcttt acggaatcac 1020

tacaaagaga agtccatctc gaggtctccg ggtaaatga 1059

<210> 36

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 36

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatccc gctgcggaga cacatccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagtggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc 180

gggctgtact ctctcagcag catggtgacc gtgcccgcca gcacctcaga aacccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgtcactgca 300

aggcgtccag tcccgacgac gccaaagaca accatccctc ctggaaaacc cacaacccag 360

gagtctgaag ttgaaaagac accctgccag tgttccaaat gcccagaacc tctgggagga 420

ctgtctgtct tcatcttccc accgaaaccc aaggacaccc tcacaatctc gggaacgccc 480

gaggtcacgt gtgtggtggt ggacgtgggc caggatgacc ccgaggtgca gttctcctgg 540

ttcgtggacg acgtggaggt gcacacggcc aggacgaagc cgagagagga gcagttcaac 600

agcacctacc gcgtggtcag cgccctgcgc atccagcacc aggactggct gcagggaaag 660

gagttcaagt gcaaggtcaa caacaaaggc ctcccggccc ccattgtgag gaccatctcc 720

aggaccaaag ggcaggcccg ggagccgcag gtgtatgtcc tggccccacc ccgggaagag 780

ctcagcaaaa gcacgctcag cctcacctgc ctgatcaccg gtttctaccc agaagagata 840

gacgtggagt ggcagagaaa tgggcagcct gagtcggagg acaagtacca cacgaccgca 900

ccccagctgg atgctgacgg ctcctacttc ctgtacagca ggctcagggt gaacaagagc 960

agctggcagg aaggagacca ctacacgtgt gcagtgatgc atgaagcttt acggaatcac 1020

tacaaagaga agtccatctc gaggtctccg ggtaaatga 1059

<210> 37

<211> 331

<212> Белок

<213> Ovis aries

<400> 37

Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr

65 70 75 80

Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro

100 105 110

Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

115 120 125

Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

130 135 140

Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

145 150 155 160

Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu

165 170 175

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

180 185 190

Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu

195 200 205

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln

210 215 220

Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro

245 250 255

Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu

260 265 270

Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr

275 280 285

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly

290 295 300

Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

305 310 315 320

Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

325 330

<210> 38

<211> 996

<212> ДНК

<213> Ovis aries

<400> 38

gcctcaacaa cacccccgaa agtctaccct ctgacttctt gctgcgggga cacgtccagc 60

tccatcgtga ccctgggctg cctggtctcc agctatatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactctg gtgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggccatcct gcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag cgtggtgacc gtgccggcca gcacctcagg agcccagacc 240

ttcatctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacaagcg tgttgagccc 300

ggatgcccgg acccatgcaa acattgccga tgcccacccc ctgagctccc cggaggaccg 360

tctgtcttca tcttcccacc gaaacccaag gacaccctta caatctctgg aacgcccgag 420

gtcacgtgtg tggtggtgga cgtgggccag gatgaccccg aggtgcagtt ctcctggttc 480

gtggacaacg tggaggtgcg cacggccagg acaaagccga gagaggagca gttcaacagc 540

accttccgcg tggtcagcgc cctgcccatc cagcaccaag actggactgg aggaaaggag 600

ttcaagtgca aggtccacaa cgaagccctc ccggccccca tcgtgaggac catctccagg 660

accaaagggc aggcccggga gccgcaggtg tacgtcctgg ccccacccca ggaagagctc 720

agcaaaagca cgctcagcgt cacctgcctg gtcaccggct tctacccaga ctacatcgcc 780

gtggagtggc agaaaaatgg gcagcctgag tcggaggaca agtacggcac gaccacatcc 840

cagctggacg ccgacggctc ctacttcctg tacagcaggc tcagggtgga caagaacagc 900

tggcaagaag gagacaccta cgcgtgtgtg gtgatgcacg aggctctgca caaccactac 960

acacagaagt cgatctctaa gcctccgggt aaatga 996

<210> 39

<211> 329

<212> Белок

<213> Ovis aries

<400> 39

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser

20 25 30

Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu

35 40 45

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Ala Lys Val

85 90 95

Asp Lys Arg Val Gly Ile Ser Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro

100 105 110

Pro Cys Val Ser Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Ser Leu Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Gly Gln Gly Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp

145 150 155 160

Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His

180 185 190

Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys

225 230 235 240

Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Gln Arg Ala Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys

260 265 270

Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu

275 280 285

Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr

290 295 300

Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

305 310 315 320

Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys

325

<210> 40

<211> 990

<212> ДНК

<213> Ovis aries

<400> 40

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctgacttctt gctgcgggga cacgtccagc 60

tccagctcca tcgtgaccct gggctgcctg gtctccagct atatgcccga gccggtgacc 120

gtgacctgga actctggtgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc catcctgcag 180

tcctccgggc tctactctct cagcagcgtg gtgaccgtgc cggccagcac ctcaggagcc 240

cagaccttca tctgcaacgt agcccacccg gccagcagcg ccaaggtgga caagcgtgtt 300

gggatctcca gtgactactc caagtgttct aaaccgcctt gcgtgagccg accgtctgtc 360

ttcatcttcc ccccgaaacc caaggacagc ctcatgatca caggaacgcc cgaggtcacg 420

tgtgtggtgg tggacgtggg ccagggtgac cccgaggtgc agttctcctg gttcgtggac 480

aacgtggagg tgcgcacggc caggacaaag ccgagagagg agcagttcaa cagcaccttc 540

cgcgtggtca gcgccctgcc catccagcac gaccactgga ctggaggaaa ggagttcaag 600

tgcaaggtcc acagcaaagg cctcccggcc cccatcgtga ggaccatctc cagggccaaa 660

gggcaggccc gggagccgca ggtgtacgtc ctggccccac cccaggaaga gctcagcaaa 720

agcacgctca gcgtcacctg cctggtcacc ggcttctacc cagactacat cgccgtggag 780

tggcagagag cgcggcagcc tgagtcggag gacaagtacg gcacgaccac atcccagctg 840

gacgccgacg gctcctactt cctgtacagc aggctcaggg tggacaagag cagctggcaa 900

agaggagaca cctacgcgtg tgtggtgatg cacgaggctc tgcacaacca ctacacacag 960

aagtcgatct ctaagcctcc gggtaaatga 990

<210> 41

<211> 102

<212> Белок

<213> Ovis aries

<400> 41

Pro Ser Val Phe Leu Phe Lys Pro Ser Glu Glu Gln Leu Arg Thr Gly

1 5 10 15

Thr Val Ser Val Val Cys Leu Val Asn Asp Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

20 25 30

Asn Val Lys Val Lys Val Asp Gly Val Thr Gln Asn Ser Asn Phe Gln

35 40 45

Asn Ser Phe Thr Asp Gln Asp Ser Lys Lys Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Ser Glu Tyr Gln Ser His Asn Ala Tyr

65 70 75 80

Ala Cys Glu Val Ser His Lys Ser Leu Pro Thr Ala Leu Val Lys Ser

85 90 95

Phe Asn Lys Asn Glu Cys

100

<210> 42

<211> 309

<212> ДНК

<213> Ovis aries

<400> 42

ccatccgtct tcctcttcaa accatctgag gaacagctga ggaccggaac tgtctctgtc 60

gtgtgcttgg tgaatgattt ctaccccaaa gatatcaatg tcaaggtgaa agtggatggg 120

gttacccaga acagcaactt ccagaacagc ttcacagacc aggacagcaa gaaaagcacc 180

tacagcctca gcagcaccct gacactgtcc agctcagagt accagagcca taacgcctat 240

gcgtgtgagg tcagccacaa gagcctgccc accgccctcg tcaagagctt caataagaat 300

gaatgttag 309

<210> 43

<211> 106

<212> Белок

<213> Ovis aries

<400> 43

Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr

1 5 10 15

Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr

35 40 45

Ile Asn Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys

65 70 75 80

Ser Lys Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Thr Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

100 105

<210> 44

<211> 321

<212> ДНК

<213> Ovis aries

<400> 44

ggtcagccca agtccgcacc ctcggtcacc ctgttcccgc cttccacgga ggagctcagt 60

accaacaagg ccaccgtggt gtgtctcatc aacgacttct acccgggtag cgtgaacgtg 120

gtctggaagg cagatggcag caccatcaat cagaacgtga agaccaccca ggcctccaaa 180

cagagcaaca gcaagtacgc ggccagcagc tacctgaccc tgacgggcag cgagtggaag 240

tctaagagca gttacacctg cgaggtcacg cacgagggga gcaccgtgac gaagacagtg 300

aagccctcag agtgttctta g 321

<210> 45

<211> 266

<212> Белок

<213> Bubalus bulalis

<400> 45

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln

20 25 30

Thr Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp

35 40 45

Lys Ala Val Val Pro Pro Cys Arg Pro Lys Pro Cys Asp Cys Cys Pro

50 55 60

Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

65 70 75 80

Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

85 90 95

Val Val Asp Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe

100 105 110

Val Asp Asp Val Glu Val Asn Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu

115 120 125

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His

130 135 140

Asn Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln

165 170 175

Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Asp Glu Leu

180 185 190

Ser Lys Ser Thr Val Ser Ile Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro

195 200 205

Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asp Gly Gln Pro Glu Ser Glu

210 215 220

Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly

245 250 255

Gly Ala Tyr Thr Cys Val Val Met His Glu

260 265

<210> 46

<211> 801

<212> ДНК

<213> Bubalus bubalis

<400> 46

gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctcc gggctctact ctctcagcag 60

cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc ttcacctgca acgtagccca 120

cccggccagc agcaccaagg tggacaaggc tgttgttccc ccatgcagac cgaaaccctg 180

tgattgctgc ccaccccctg agctccccgg aggaccctct gtcttcatct tcccaccaaa 240

acccaaggac accctcacaa tctctggaac tcctgaggtc acgtgtgtgg tggtggacgt 300

gggccacgat gaccccgagg tgaagttctc ctggttcgtg gacgatgtgg aggtaaacac 360

agccaggacg aagccaagag aggagcagtt caacagcacc taccgcgtgg tcagcgccct 420

gcccatccag cacaacgact ggactggagg aaaggagttc aagtgcaagg tctacaatga 480

aggcctccca gcccccatcg tgaggaccat ctccaggacc aaagggcagg cccgggagcc 540

gcaggtgtac gtcctggccc caccccagga cgagctcagc aaaagcacgg tcagcatcac 600

ttgcatggtc actggcttct acccagacta catcgccgta gagtggcaga aagatgggca 660

gcctgagtca gaggacaaat atggcacgac cccgccccag ctggacagcg atggctccta 720

cttcctgtac agcaggctca gggtgaacaa gaacagctgg caagaaggag gcgcctacac 780

gtgtgtagtg atgcatgagg c 801

<210> 47

<211> 309

<212> Белок

<213> Bubalus buballis

<400> 47

Ala Ser Ile Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Arg Gly

1 5 10 15

Glu Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Thr Val Thr Ala Pro Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr

85 90 95

Ala Val Gly Phe Ser Ser Asp Cys Cys Lys Phe Pro Lys Pro Cys Val

100 105 110

Arg Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

115 120 125

Met Ile Thr Gly Asn Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly

130 135 140

Arg Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Gly Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Gly Arg Ser Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Asn Asp Trp Thr Gly

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val

225 230 235 240

Ser Val Thr Cys Met Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val

245 250 255

Glu Trp His Arg Asp Arg Gln Ala Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg

275 280 285

Leu Lys Val Asn Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Gly Ala Tyr Thr Cys

290 295 300

Val Val Met His Glu

305

<210> 48

<211> 929

<212> ДНК

<213> Bubalus bubalis

<400> 48

gcctccatca cagccccgaa agtctaccct ctgacttctt gccgcgggga aacgtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gagcggcgtg cacaccttcc cggccgtcct tcagtcctct 180

gggctctact ctctcagcag cacggtgacc gcgcccgcca gcgccacaaa aagccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgttgggttc 300

tccagtgact gctgcaagtt tcctaagcct tgtgtgaggg gaccatctgt cttcatcttc 360

ccgccgaaac ccaaagacac cctgatgatc acaggaaatc ccgaggtcac atgtgtggtg 420

gtggacgtgg gccgggataa ccccgaggtg cagttctcct ggttcgtggg tgatgtggag 480

gtgcacacgg gcaggtcgaa gccgagagag gagcagttca acagcaccta ccgcgtggtc 540

agcaccctgc ccatccagca caatgactgg actggaggaa aggagttcaa gtgcaaggtc 600

aacaacaaag gcctcccagc ccccatcgtg aggaccatct ccaggaccaa agggcaggcc 660

cgggagccgc aggtgtacgt cctggcccca ccccaggaag agctcagcaa aagcacggtc 720

agcgtcactt gcatggtcac tggcttctac ccagactaca tcgccgtaga gtggcataga 780

gaccggcagg ctgagtcgga ggacaagtac cgcacgaccc cgccccagct ggacagcgat 840

ggctcctact tcctgtacag caggctcaag gtgaacaaga acagctggca agaaggaggc 900

gcctacacgt gtgtagtgat gcatgaggc 929

<210> 49

<211> 352

<212> Белок

<213> Bubalus bubalis

<400> 49

Ala Ser Thr Thr Ala Pro Lys Val Tyr Pro Leu Ala Ser Ser Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Lys Asn

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Met Val Thr Met Pro Thr Ser Thr Ala Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Phe Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Thr

85 90 95

Ala Val Thr Ala Arg His Pro Val Pro Lys Thr Pro Glu Thr Pro Ile

100 105 110

His Pro Val Lys Pro Pro Thr Gln Glu Pro Arg Asp Glu Lys Thr Pro

115 120 125

Cys Gln Cys Pro Lys Cys Pro Glu Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro

145 150 155 160

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val

165 170 175

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Arg Met

180 185 190

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala

195 200 205

Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Arg Glu Lys Glu Phe Lys Cys

210 215 220

Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser

225 230 235 240

Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro

245 250 255

Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile

260 265 270

Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Val Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly

275 280 285

Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr His Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp

290 295 300

Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asn Arg Ser

305 310 315 320

Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala

325 330 335

Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys Pro Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 50

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Bubalus bubalis

<400> 50

gcctccacca cagccccgaa agtctaccct ctggcatcca gctgcgggga cacgtccagc 60

tccaccgtga ccctgggctg cctggtctcc agctacatgc ccgagccggt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gtgccctgaa gaacggcgtg cacaccttcc cggccgtccg gcagtcctcc 180

gggctctact ctctcagcag catggtgacc atgcccacca gcaccgcagg aacccagacc 240

ttcacctgca acgtagccca cccggccagc agcaccaagg tggacacggc tgtcactgca 300

aggcatccgg tcccgaagac accagagaca cctatccatc ctgtaaaacc cccaacccag 360

gagcccagag atgaaaagac accctgccag tgtcccaaat gcccagaacc tctgggagga 420

ctgtctgtct tcatcttccc accgaaaccc aaggacaccc tcacaatctc tggaacgccc 480

gaggtcacgt gtgtggtggt ggacgtgggc caggatgacc ccgaagtgca gttctcctgg 540

ttcgtggatg acgtggaggt gcacacagcc aggatgaagc caagagagga gcagttcaac 600

agcacctacc gcgtggtcag cgccctgccc atccagcacc aggactggct gcgggaaaag 660

gagttcaagt gcaaggtcaa caacaaaggc ctcccggccc ccatcgtgag gaccatctcc 720

aggaccaaag ggcaggcccg ggagccacag gtgtatgtcc tggccccacc ccgggaagag 780

ctcagcaaaa gcacgctcag cctcacctgc ctaatcaccg gcttctaccc agaagaggta 840

gacgtggagt ggcagagaaa tgggcagcct gagtcagagg acaagtacca cacgacccca 900

ccccagctgg acgctgacgg ctcctacttc ctgtacagca ggctcagggt gaacaggagc 960

agctggcagg aaggagacca ctacacgtgt gcagtgatgc atgaagcttt acggaatcac 1020

tacaaagaga agcccatctc gaggtctccg ggtaaatga 1059

<210> 51

<211> 105

<212> Белок

<213> Bubalus bubalis

<400> 51

Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu

1 5 10 15

Glu Leu Ser Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ser Met Thr Val Ala Arg Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile

35 40 45

Thr Arg Asn Val Glu Thr Thr Arg Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser

65 70 75 80

Lys Gly Ser Tyr Ser Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr

85 90 95

Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser

100 105

<210> 52

<211> 318

<212> ДНК

<213> Bubalus bubalis

<400> 52

cagcccaagt ccgcaccctc agtcaccctg ttcccaccct ccacggagga gctcagcgcc 60

aacaaggcca ccctggtgtg tctcatcagc gacttctacc cgggtagcat gaccgtggcc 120

aggaaggcag acggcagcac catcacccgg aacgtggaga ccacccgggc ctccaaacag 180

agcaacagca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgggcagcga gtggaaatcg 240

aaaggcagtt acagctgcga ggtcacgcac gaggggagca ccgtgacaaa gacagtgaag 300

ccctcagagt gttcttag 318

<210> 53

<211> 229

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 53

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 54

<211> 690

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 54

gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360

gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690

<210> 55

<211> 229

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 55

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 56

<211> 690

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 56

gagtccaaat atggtccccc gtgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360

gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690

<210> 57

<211> 217

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 57

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 58

<211> 654

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 58

gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120

cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300

tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa atga 654

<210> 59

<211> 106

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 59

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 60

<211> 321

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 60

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgtta g 321

<210> 61

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 61

gaaagatcta tgctgtggga ggcttggtt 29

<210> 62

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 62

ccggaattcg ggttgctctg gctgcagct 29

<210> 63

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 63

ctagctagcc gcccaccatg ctgtgggagg cttggtt 37

<210> 64

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 64

tgcatgcatc agaacagcta ggttgtacg 29

<210> 65

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 65

atgctgtggg aggcttggtt c 21

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 66

tcagggatgc tctggctgca 20

<210> 67

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 67

atgctgtggg aggctcagtt ccagg 25

<210> 68

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 68

tcagggttgc tccggctgca 20

<210> 69

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 69

attgagctca tgctgtggga ggcttggtt 29

<210> 70

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 70

aatgaattcg ggatgctctg gctgcagc 28

<210> 71

<211> 516

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 71

Met Leu Trp Glu Ala Trp Phe Gln Val Trp Leu Phe Leu Gln Leu Leu

1 5 10 15

Trp Ala Ala Ala Val Glu Ala Pro Glu Pro Gly Ala Glu Val Pro Val

20 25 30

Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr

35 40 45

Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Pro Arg Thr Arg Gln Val Thr Trp

50 55 60

Gln His Val Pro Glu Ser Gly Ser Ala Ala Pro Thr Pro Arg Gly Pro

65 70 75 80

Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Arg Leu Ala Pro Gly Gly Leu Arg

85 90 95

Ile Gly Lys Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Glu Glu Met Gly

100 105 110

Leu Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala

115 120 125

Asp Ala Gly Glu Tyr His Ala Ala Val Arg Phe Gly Asn Arg Ala Leu

130 135 140

Ala Cys Arg Leu Arg Leu Arg Val Gly Gln Ala Ala Val Thr Ala Ser

145 150 155 160

Pro Pro Gly Pro Leu Trp Thr Ser Ser Trp Val Val Leu Asn Cys Ser

165 170 175

Phe Ser Arg Pro Asp Leu Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Gly Pro

180 185 190

Gly Arg Val Pro Val Gln Glu Ser Pro His His His Leu Val Gly Asn

195 200 205

Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Ser Leu Asp Ser Gly Thr Trp Gly

210 215 220

Cys Ser Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Thr Tyr Asn

225 230 235 240

Leu Ala Val Leu Gly Leu Glu Pro Arg Ala Thr Leu Thr Val Tyr Ala

245 250 255

Gly Ala Gly Ser Lys Val Glu Leu Pro Cys Arg Leu Pro Pro Gly Val

260 265 270

Gly Ile Gln Ser Ser Leu Thr Ala Met Trp Thr Pro Pro Gly Glu Gly

275 280 285

Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Asp Arg Asn Asn Phe Thr Leu Arg Leu

290 295 300

Glu Ala Val Gly Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Arg Val His

305 310 315 320

Leu Gln Gly Arg Gln Leu Ser Ala Thr Val Thr Leu Ala Val Ile Thr

325 330 335

Val Thr Pro Lys Pro Tyr Gly Ser Ser Gly Ser Leu Arg Lys Pro Phe

340 345 350

Cys Glu Val Thr Pro Ala Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Pro

355 360 365

Leu Asp Lys Arg Ser Gln Arg Arg Ser Pro Gly Pro Trp Leu Leu Thr

370 375 380

Pro Asp Ala Arg Pro Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys His Leu Tyr Gln

385 390 395 400

Gly Glu Arg Leu Leu Gly Thr Ala Val Tyr Leu Thr Glu Leu Ser His

405 410 415

Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Leu Gly Ala Gly Arg Thr Ala

420 425 430

His Leu Pro Leu Leu Ile Leu Gly Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Val

435 440 445

Thr Gly Ala Ser Ser Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro Arg

450 455 460

Arg Phe Ser Ala Leu Glu His Gly Thr His Pro Ser Gln Ala Ser Ser

465 470 475 480

Lys Thr Gly Glu Leu Glu Pro Glu Leu Glu Pro Glu Pro Asp Pro Glu

485 490 495

Val Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ser Gln Pro Gln Leu Gln

500 505 510

Pro Glu Gln Pro

515

<210> 72

<211> 29

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 72

Gly Ser Ala Ala Pro Thr Pro Arg Gly Pro Gly Pro Arg Arg Tyr Thr

1 5 10 15

Val Leu Arg Leu Ala Pro Gly Gly Leu Arg Ile Gly Lys

20 25

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу против LAG-3, а также к содержащей его фармацевтической композиции. Также раскрыта искусственная генетическая ДНК, кодирующая вышеуказанное антитело или его легкую или тяжелую цепь, а также вектор и клетка, ее содержащие. Изобретение также относится к способу получения антитела против LAG-3, предусматривающему культивирование вышеуказанной клетки-хозяина. Изобретение позволяет эффективно осуществлять профилактику и/или лечение инфекции или злокачественного новообразования. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 пр.

1. Антитело против LAG-3, содержащее

(а) легкую цепь, содержащую

вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 c аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO:17), и

константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и

(b) тяжелую цепь, содержащую

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO:20), и

константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

2. Антитело по п.1, где вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи получены из крысы.

3. Антитело по п.2, где вариабельная область легкой цепи представляет собой вариабельную область легкой цепи крысиного антитела против бычьего LAG-3, вариабельная область тяжелой цепи представляет собой вариабельную область тяжелой цепи крысиного антитела против бычьего LAG-3.

4. Антитело по п.3, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

5. Антитело по любому из пп.1-4, где константная область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи или каппа-цепи.

6. Антитело по любому из пп.1-5, где константная область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы, имеет аминокислотную последовательность константной области иммуноглобулина, эквивалентного IgG4 человека, или указанная аминокислотная последовательность имеет введенные мутации, которые снижают активность ADCC и/или активность CDC.

7. Антитело по п.5, где животное, отличное от крысы, является особью крупного рогатого скота; константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность константной области лямбда-цепи и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет введенные в нее мутации, которые уменьшают активность ADCC и/или активность CDC.

8. Антитело по п.7, где константная область легкой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 и константная область тяжелой цепи бычьего антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

9. Антитело по любому из пп.1-8, которое имеет четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.

10. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения злокачественного новообразования, где злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из опухолевых заболеваний и лейкоза, характеризующаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит антитело по любому из пп.1-9.

11. Композиция по п.10, где опухолевое заболевание выбрано из группы, состоящей из злокачественной меланомы, рака легких, рака желудка, рака почек, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака пищевода и рака яичников.

12. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения инфекции, где инфекция выбрана из группы, состоящей из болезни Джона, анаплазмоза, бактериального мастита, микотического мастита, микоплазменных инфекций, туберкулеза, инфекции Theileria orientalis, криптоспоридиоза, кокцидиоза, трипаносомоза и лейшманиоза, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного ингредиента антитело по любому из пп.1-9.

13. Композиция по п.12, где микоплазменная инфекция представляет собой микоплазменный мастит или микоплазменную пневмонию.

14. Искусственная генетическая ДНК, кодирующая антитело по любому из пп.1-9, где ДНК содержит

(а') ДНК, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO:17), и константную область легкой цепи антитела животного, отличного от крысы; и

(b') ДНК, кодирующую тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO:19) и CDR3 с аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO:20), и константную область тяжелой цепи антитела животного, отличного от крысы.

15. Вектор экспрессии, содержащий искусственную генетическую ДНК по п.14.

16. Клетка-хозяин для экспрессии антитела по любому из пп.1-9, где клетка трансформирована вектором по п.15.

17. Способ получения антитела против LAG-3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.15 и сбор анти-LAG-3 антитела из полученной культуры.

18. ДНК, кодирующая легкую цепь антитела по любому из пп.1-9, где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью QSLLDSDGNTY (SEQ ID NO:16), CDR2 с аминокислотной последовательностью SVS и CDR3 с аминокислотной последовательностью MQATHVPFT (SEQ ID NO:17).

19. ДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела по любому из пп.1-9, где тяжелая цепь антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GFDFDTYP (SEQ ID NO:18), CDR2 с аминокислотной последовательностью ITIKTHNYAT (SEQ ID NO:19) и CDR3 c аминокислотной последовательностью NREDFDY (SEQ ID NO:20).