НЕВИРУСНЫЙ ИММУНОТАРГЕТИНГ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/18 A61K47/68 A61K48/00 A61P21/00 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет. по предварительной заявке США № 62/872425, поданной 10 июля 2019 года, которая включена в настоящий документ путем ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О СПИСКЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Список последовательностей, связанный с этой заявкой, предоставляется в текстовом формате вместо бумажной копии и таким образом включен в данное описание посредством ссылки. Названием текстового файла, содержащего список последовательностей, является 72245_SEQ_Final_2020-07-08.txt. Текстовый файл имеет размер 145 килобайт, был создан 8 июля 2020 года и подан через EFS-Web вместе с подачей спецификации изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Мышечные заболевания человека включают как относительно редкие состояния, таких как мышечные дистрофии, так и распространенные сопутствующие состоянии, такие как связанная с диабетом и возрастная мышечная слабость (саркопения). В настоящее время не существует эффективного лечения для многих заболеваний мышц, включая наиболее распространенную и тяжелую форму мышечной дистрофии, известную как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD). Краткий обзор основных признаков DMD показан схематически на фиг. 1. Так как дистрофин, ген, ответственный за DMD, был открыт в 1987 году, исследователи пытались разработать методики доставки гена дистрофина в мышцы и за счет этого ослабить или даже вылечить заболевание. Однако основным недостатком этого подхода в случае DMD является огромный размер гена дистрофина дикого типа, составляющий приблизительно 14 т.п.о. у зрелого транскрипта, который является слишком большим для вставки в вирусные векторы, доступные для доставки генов в ткани. Для иллюстрации, наиболее широко используемый в генной терапии вирусный вектор представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV), общая вместимость которого составляет всего 5 т.п.о. Следовательно, чтобы обеспечить возможность доставки терапевтического дистрофинового трансгена, ген дистрофина должен быть усечен до «микродистрофинов», которые составляют приблизительно одну треть от полноразмерного дистрофина и обеспечивают только частичное улучшение функции мышц in vivo у мышей mdx (DMD). Другие основные проблемы, связанные с вирусными векторами, включают отсутствие специфичности в таргетинге вектора к желаемому типу клеток и потенциальный иммунный ответ, связанный с доставкой вируса. Возможность активации иммунного ответа является существенным ограничением в случае подходов с использованием AAV, так как она функционально ограничивает терапевтическую доставку всего одним введением. Весьма вероятно, что этого будет недостаточно для лечения дегенеративных заболеваний мышц, таких как DMD, которые могут требовать вмешательства в течение нескольких лет или даже десятилетий. Кроме того, многие люди уже встречались с некоторыми серотипами AAV, что исключает у них применение генной терапии с использованием АAV.

[0004] Соответственно, несмотря на успехи в области понимания патологии мышечных заболеваний и создания терапевтических вирусных векторов, сохраняется потребность в неиммуногенных векторных платформах, которые могут специфично доставлять терапевтическую полезную нагрузку в мышечные клетки без ограничений по размеру или типу полезной нагрузки. Данное изобретение решает эти и связанные потребности.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Это краткое изложение сущности изобретения приведено для представления подборки концепций в сокращенном виде, которые дополнительно описаны ниже в подробном описании. Это краткое изложение не предназначено для определения ключевых признаков заявленного объекта изобретения, а также не предназначено для использования в качестве помощи при определении объема заявленного изобретения.

[0006] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композиции, содержащей связывающий домен, например, антитело, или его фрагмент или производное, которое специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 («GLUT4»), и терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную со связывающим доменом.

[0007] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу таргетинга терапевтической полезной нагрузки для доставки в клетку, которая экспрессирует GLUT4, причем способ включает контактирование клетки с композицией по изобретению. Способ может быть осуществлен in vitro. В альтернативном варианте способ может представлять собой способ in vivo лечения заболевания или состояния, связанного с клетками, экспрессирующими GLUT4.

[0008] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин, включающему введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции по изобретению. Композиция в этом аспекте способа содержит связывающий домен, например, антитело, или его фрагмент или производное, которое специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 («GLUT4»), и терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную с антителом, или его фрагментом или производным. Терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанную с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0009] Фигура 1 представляет собой схематичный обзор мышечной дистрофии Дюшенна (DMD).

[0010] Фигура 2 представляет собой схематичный обзор аспектов невирусной, мышечно-таргетированной платформы доставки генов, раскрытой в данном документе.

[0011] Фигура 3 представляет собой схематическое изображение общей структуры репрезентативной платформы композиций по изобретению, которые использовались в клеточных экспериментах in vitro, более подробно описанных ниже.

[0012] Фигура 4 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 1, описанного ниже, показывающего экспрессию nNOS и НА-тэга. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. Показано, что инкубация платформы с мышечными клетками в течение всего 15 мин приводит к экспрессии nNOS.

[0013] Фигура 5 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 2, описанного ниже, показывая экспрессию nNOS. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. В этом эксперименте проверяли влияние различных концентраций плазмидной ДНК (pDNA) и различных соотношений DC-chol:pDNA.

[0014] Фигура 6 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 3, описанного ниже, показывая экспрессию полноразмерного дистрофина с использованием антитела 331 (антитела к С-концевой области белка) при возрастающих концентрациях вводимого инсулина. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. Результаты показали, что добавление инсулина до 5 нМ повышает экспрессию дистрофина.

[0015] Фигура 7 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 4, описанного ниже, показывая экспрессию полноразмерного дистрофина с использованием антитела 331 (антитела к С-концевой области белка). GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. Как показано, экспрессия дистрофина выше в клетках, сверхэкспрессирующих (+) GLUT4 (mdx GLUT4), и при увеличении количества альбумина, добавленного при экспрессии.

[0016] Фигура 8 представляет собой схематическое изображение общей структуры и компонентов другого аспекта композиции по изобретению, которая была предназначена для экспериментов in vivo, более подробно описанных ниже.

[0017] Фигура 9A-B иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 5, описанного ниже, показывающего экспрессию nNOS и НА-тэга после введения in vivo платформы без добавления анти-GLUT4 антитела. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. Повышение экспрессии как nNOS, так и НА-тэга наблюдалось в икроножной (9A) и передней большеберцовой (9В) мышцах у получавшей инъекцию мыши по сравнению с не получавшей инъекцию мышью mdx Con. Экспрессия nNOS наблюдалась как в получивших инъекцию (+) мышцах, так и в не получивших инъекцию (-) мышцах, что указывает на то, что композиция способна выходить из получивших инъекцию мышц и поступать в системное кровообращение, чтобы в конечном итоге трансфецировать мышцы в противоположной (не получавшей инъекцию) конечности.

[0018] Фигура 10A-B. (10A) Окрашивание Кумасси, демонстрирующее успешную очистку двух клонов анти-GLUT4 моноклональных антител (mAb) с использованием колонок с A/G-белком. Окрашивание кумасси каждого клона показано в невосстановительных (NR) или восстановительных (R) условиях; (10В) графическая иллюстрация связывания клонов mAb с нативным белком GLUT4 с инсулином и без инсулина. Mdx-миобласты, сверхэкспрессирующие GLUT4, инкубировали с клонами мышиных mAb 1 и 2 (при различных разведениях исходного раствора 1 мг/мл), в присутствии или без 100 нМ инсулина, в течение 20 мин при 37°С с последующей инкубацией с конъюгированным с HRP вторичным антителом в течение того же времени. Связывание с антителами (поглощение) измеряли с помощью колориметрического анализа. Повышенная абсорбционная способность показывает, что оба клона связываются с нативным белком GLUT4 in vitro, при этом Клон 2 обладает большей аффинностью связывания, чем Клон 1. Для обоих клонов инсулин увеличивает поглощение за счет переноса большего количества GLUT4 в плазматическую мембрану. В качестве контроля показано поглощение для только вторичного антитела (пунктирная линия).

[0019] Фигура 11 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга из эксперимента 6, описанного ниже, показывающего экспрессию НА-тэга после введения in vivo (внутримышечной инъекции в переднюю большеберцовую и икроножную мышцы) композиции платформы без добавления («без mAb») или с добавлением («mAb») анти-GLUT4 антитела. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. Многократное увеличение экспрессии HA-тэга наблюдалось в обеих мышцах мышей, обработанных композицией платформы, конъюгированной с mAb.

[0020] Фигура 12A-B иллюстрирует результаты эксперимента 7, показывающие экспрессию α-синтрофина у мышей mdx4CV после введения in vivo (внутримышечной (в/м) инъекции в переднюю большеберцовую и икроножную мышцы или внутривенной (в/в) инъекции через ретроорбитальный синус) композиции платформы, содержащей анти-GLUT4 антитело (см. фиг. 8). ДНК-конструкция α-синтрофина содержала последовательность пальмитоилирования RAS для таргетинга белка на поверхностную мембрану мышечной клетки (сарколемму). (12А) Результаты Вестерн-блоттинга показывают значительно более высокую экспрессию α-синтрофина в мышцах мышей как с в/м, так и с в/в инъекций, по сравнению с не получавшей инъекции контрольной мышью mdx4CV. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. (12B) Иммуноокрашивание поперечных срезов мышц, показывающее множество мышечных волокон с локализованным на поверхности мембраны окрашенным α-синтрофином у получавших в/м или в/в инъкцию мышей, что неочевидно у не получавших инъекцию контрольных мышей. Следует обратить внимание, что очень яркие области окрашивания в некоторых мышечных волокнах у мыши с в/м инъекцией, скорее всего, представляют собой нервно-мышечные соединения, которые имеют большую площадь поверхности мембраны для экспрессии α-синтрофина.

[0021] Фигура 13A-B иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга в эксперименте 8, показывающие экспрессию nNOS у мышей mdx4CV после введения in vivo платформы, содержащей конструкцию nNOS, описанную на фиг. 11. (13A) В этом эксперименте двум мышам в/м вводили композицию в икроножную мышцу одной задней конечности, и двум мышам вводили в/в через ретроорбитальный синус. Вестерн-блот показывает, что как в/м, так и в/м инъекции привели к значительному увеличению экспрессии nNOS в икроножной мышце по сравнению с двумя икроножными мышцами контрольной мыши mdx4CV, не получавшей инъекции. В соответствии с предыдущими экспериментами, в/м инъекция приводила к увеличению экспрессии nNOS в мышцах как получавшей инъекцию (в/м+), так и противоположной (в/м-) конечности, что указывает на системное распространение платформы после в/м введения. Кроме того, уровень гомолога дистрофина, атрофина, также был значительно увеличен в мышцах мышей, которым платформу вводили с помощью инъекции. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка. (13B) Трем мышам mdx внутривенно вводили различное количество плазмиды nNOS (20, 60 или 120 мкг). Как показал Вестерн-блоттинг, уровни экспрессии как nNOS, так и HA-тэга постепенно повышаются по мере увеличения дозы плазмиды. GAPDH использовали в качестве контроля нанесения белка.

[0022] Фигура 14 иллюстрирует результаты из эксперимента 9, где экспрессию полноразмерного дистрофина в мышцах измеряли после системной доставки композиции невирусной платформы (см. фиг. 8). Двум мышам mdx4CV в/в вводили различные дозы платформы, содержащей 50 или 100 мкг конструкции CK8-дистрофина. Как показал Вестерн-блоттинг, обе дозы демонстрируют экспрессию полноразмерного дистрофина в трех мышцах задних конечностей (четырехглавой, икроножной и передней большеберцовой) с уровнем, составляющим приблизительно от 0,2 до 0,25% от показателей для мыши дикого типа. Общий белок, вносимый в лунку WT (мышь дикого типа), был такой же, как и во всех других лунках, но состоял из 0,25% белка мыши дикого типа (WT), смешанного с 99,75% белка мыши mdx4CV Con. Слабые полосы у контрольной мыши mdx4CV без инъекций указывают на очень небольшое количество ревертантных волокон, которые экспрессируют низкий уровень дистрофина у мышей mdx.

[0023] Фигура 15 представляет собой результаты эксперимента 9, показывающие экспрессию полноразмерного дистрофина в сердечной мышце после системной доставки состава платформы (см. фиг.8). Двум мышам mdx4CV в/в вводили платформу, содержащей конструкцию либо CK8-дистрофина, либо CMV-дистрофина. Как показано с помощью Вестерн-блоттинга, обе конструкции обеспечивали экспрессию полноразмерного дистрофина в сердце, причем плазмида CMV-дистрофина давала более высокий уровень, чем конструкция с CK8. При этом уровень экспрессии в сердечной мышце также составлял приблизительно 0,1-0,2% от экспрессии у мыши дикого типа (WT). Общий белок, вносимый в лунку WT, был такой же, как и во всех других лунках, но состоял из 0,25% белка мыши дикого типа (WT), смешанного с 99,75% белка мыши mdx4CV Con. В качестве мембранно-специфичного контроля нанесения использовали кавеолин-3.

[0024] На фигуре 16A-B продемонстрированы результаты эксперимента 10, показывающего анализ отслеживания частиц композиции невирусной платформы (см. фиг. 8), содержащей плазмиду СК8-полноразмерного дистрофина. (16A) Изображение частиц платформы, идентифицированных и отслеженных программным обеспечением Nanosight ns300 для анализа размера. (16B) График распределения частиц, показывающий размер частиц в зависимости от концентрации частиц. Значения представляют собой среднее значение ±SEM для 4 отдельных входных данных из одного образца.

[0025] Фигура 17 иллюстрирует результаты эксперимента 11, в котором анализ ELISA был разработан для измерения аффинности связывания 6 моноклональных антител, полученных против пептидной последовательности мышиного GLUT4 (GRQGPGGPDSI; SEQ ID NO:4). Как показано, все антитела демонстрировали дозозависимое увеличение поглощения, указывающее на повышенное связывание с пептидом мышиного GLUT4.

[0026] На фигуре 18 продемонстрированы результаты эксперимента 11 анализа ELISA, в котором проверяли аффинность связывания 7 моноклональных антител, полученных против пептидной последовательности GLUT4 человека (GRQGPEGPSSI; SEQ ID NO:2). Как показано, все антитела демонстрировали дозозависимое увеличение поглощения, указывающее на повышенное связывание с рекомбинантным человеческим белком GLUT4.

[0027] На фигуре 19 показаны результаты эксперимента 11, в котором анализ ELISA был разработан для проверки того, могут ли антитела, полученные к последовательности GLUT4 человека (GRQGPEGPSSI; SEQ ID NO:2), связываться с последовательностью пептида GLUT4 мыши (GRQGPGGPDSI; SEQ ID №:4). Как показано, клоны антител, полученные к последовательности белка человека (5E3, 8G2, 12E11, 1A7), связывали мышиный пептид намного слабее, чем антитела, полученные к последовательности мышиного белка (22F6 и 21E5), которые достигли насыщения связывания при относительно низкой концентрации (приблизительно 2 нг/мл).

[0028] На фигуре 20 продемонстрированы результаты анализа ELISA из эксперимента 11, в котором проверяли, могут ли антитела, полученные к последовательности мышиного GLUT4 (GRQGPGGPDSI; SEQ ID NO:4), связываться с последовательностью GLUT4 человека (GRQGPEGPSSI; SEQ ID NO:2). Как показано, антитела, полученные к последовательности мышиного белка (22F6 и 21E5), очень слабо связывались с антигеном, в то время как антитела к последовательности белка человека связывались сильно (5E3, 8G2).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0029] Это изобретение основано на разработке авторами невирусных векторных платформ для специфичного таргетинга терапевтических полезных нагрузок, как генетических, так и фармакологических, в ткани скелетных и сердечных мышц. Вкратце, конструкция платформы, показанная на фиг. 2, была ориентирована на доставку большего количества полезной нагрузки, например, полноразмерного транскрипта гена дистрофина, для лечения заболеваний, связанных с нарушением экспрессии дистрофина или дисфункцией продукта гена.

[0030] Платформа использует специфичную и инсулинозависимую экспрессию белка-переносчика глюкозы 4 (GLUT4) в мышцах и другом ограниченном наборе тканей. GLUT4 кодируется геном SLC2A4, который преимущественно экспрессируется в поперечнополосатых мышцах (скелетных и сердечных) и жировой ткани, но также экспрессируется в определенных областях головного мозга, включая гиппокамп и мозжечок. GLUT4 является членом семейства белков, переносящих глюкозу. Переносчики глюкозы представляют собой интегральные мембранные белки, содержащие 12 трансмембранных спиральных доменов. GLUT4 на высоком уровне экспрессируется в мышечной и жировой ткани, в то время как другие члены семейства переносчиков глюкозы специфичны для других тканей. Например, GLUT3, высокоаффинный переносчик глюкозы, является основным переносчиком глюкозы в нейронах. Без активации, GLUT4 в основном находится во внутриклеточных везикулах, но перемещается к плазматической мембране и сливается с ней при введении инсулина, тем самым опосредуя инсулинозависимое поглощение глюкозы. После связывания инсулина с рецептором инсулина активируется сигнальный путь, ведущий к транслокации GLUT4 в плазматическую мембрану. Этот процесс происходит в течение 15 минут после связывания инсулина. Как только концентрация инсулина снижается, со временем GLUT4 интернализуется в везикулах и либо проходит через эндосомальную систему, либо возвращается обратно в плазматическую мембрану.

[0031] Описанная векторная платформа использует это двунаправленное опосредованное везикулами перемещение GLUT4 к плазматической мембране, а затем обратно внутрь клетки, чтобы обеспечить стратегию доставки терапевтических средств в клетки и ткани, экспрессирующие GLUT4. Как более подробно описано ниже, впервые были разработаны новые антитела, как кроличьи поликлональные, так и мышиные моноклональные, которые связываются с внеклеточным доменом мышиного белка GLUT4. С использованием различных методов конъюгации антител было получено несколько структур полезной нагрузки/вектора. Был проведен ряд экспериментов in vitro и in vivo для оценки специфичности, пропускной способности и других полезных аспектов этих репрезентативных вариантов осуществления векторной платформы. Например, было продемонстрировано, что эффективно нацеленный терапевтический трансген, в том числе плазмидная ДНК размером до 19 т.п.о., содержащая полноразмерный ген дистрофина, может поглощаться и экспрессироваться мышечными клетками. Плазмидная ДНК была успешно транспортирована в клетку после интернализации GLUT4, и была инициирована экспрессия гена дистрофина. Анализы в конечном итоге демонстрируют полезность платформы для лечения мышечных заболеваний, которые до сих пор трудно поддавались лечению. Платформа является не только гибкой, что позволяет использовать различные типы терапевтической полезной нагрузки, но и не требует вирусных компонентов. Соответственно, платформа допускает многократное введение в течение длительного времени, в том числе в течение нескольких лет, для лечения хронических и дегенеративных заболеваний мышц без риска иммуногенности.

[0032] В соответствии с вышеизложенным в описании предложена композиция, содержащая связывающий домен, который специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 («GLUT4»). Композиция дополнительно содержит терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную со связывающим доменом.

Связывающий домен

[0033] В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой или содержит антитело, его фрагмент или производное. В таких вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка может быть прямо или непрямо конъюгирована с антителом, его фрагментом или производным.

[0034] Термин «антитело» используется в настоящем документе в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, полученные из любого млекопитающего, продуцирующего антитела (например, мыши, крысы, кролика и примата, включая человека), и которые специфично связываются с целевым антигеном. Фрагмент антитела конкретно относится к интактной части или субдомену исходного антитела, который все еще сохраняет антигенсвязывающую способность. Производное антитела относится к молекуле, которая включает одно или несколько антител или фрагментов антител. Как правило, имеется по меньшей мере некоторая дополнительная модификация в структуре антитела или его фрагмента или в представлении или конфигурации антитела или его фрагмента. Примеры антител по настоящему изобретению включают поликлональные, моноклональные и рекомбинантные антитела. Примеры антител или производных антител по настоящему изобретению также включают полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела); гуманизированные антитела; мышиные антитела; химерные, мышь-человек, мышь-примат, примат-

[0035] Как указано, фрагмент антитела представляет собой часть или субдомен, полученный из полноразмерного антитела или относящийся к нему, предпочтительно включающий его определяющие комплементарность области (CDR), антигенсвязывающие области или вариабельные области, а производные антитела относятся к дальнейшей структурной модификации или комбинациям в полученной молекуле. Иллюстративные примеры фрагментов или производных антител, охватываемых настоящим изобретением, включают Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2 и Fv-фрагменты, диантитела, молекулы одноцепочечных антител, V_HH-фрагменты, V_NAR-фрагменты, полиспецифичные антитела, образованные фрагментами антител, нанотела и т.п. Например, типовое производное одноцепочечного антитела, охватываемое настоящим описанием, представляет собой «одноцепочечный Fv» или «scFv» фрагмент антитела, который содержит домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Еще одно иллюстративное одноцепочечное антитело, охватываемое настоящим изобретением, представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab).

[0036] Как указано, антитела могут быть дополнительно модифицированы для создания производных, подходящих для различных целей. Например, «химерное антитело» представляет собой рекомбинантный белок, который содержит домены из разных источников. Например, вариабельные домены и определяющие комплементарность области (CDR) могут быть получены из антител животных (например, грызунов), в то время как остальная часть молекулы антитела получена из человеческого антитела. «Гуманизированное антитело» представляет собой химерное антитело, содержащее минимальную последовательность, соответствующую специфичным определяющим комплементарность областям, полученным из иммуноглобулина животного, перенесенного в каркас антитела человека. Гуманизированные антитела обычно представляют собой рекомбинантные белки, в которых только определяющие комплементарность области (CDR) антитела получены из антитела животного. Любое из этих антител или их фрагментов или производных охвачено настоящим изобретением.

[0037] Фрагменты и производные антител, распознающие специфичное эпитопы, могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области. Например, Fab- и F(ab’)₂-фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием таких ферментов, как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab’)₂-фрагментов). F(ab’)₂-фрагменты содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен CHI тяжелой цепи. Кроме того, антитела, или их фрагменты или производные по настоящему изобретению также могут быть получены с использованием различных методов фагового дисплея, известных в данной области. Наконец, антитела, или их фрагменты или производные могут быть получены рекомбинантно в соответствии с известными методами.

[0038] Специалисту-практику будет очевидно, что связывающий домен может содержать антигенсвязывающие молекулы, отличные от домена на основе антител, такие как пептидные антитела, антигенсвязывающие каркасы (например, DARPin, белки с повторами HEAT, белки с повторами ARM, белки с тетратрикопептидными повторами и другие каркасы на основе природных белков с повторами и т. д. [см., например, Boersma and Pluckthun, Curr. Opin. Biotechnol. 22:849-857, 2011, и цитируемые в них ссылки, включенные в настоящий документ путем ссылки]), которые включают функциональный связывающий домен или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0039] В некоторых вариантах осуществления связывающий домен (например, антитело, или его фрагмент или производное) является биотинилированным. Как более подробно описано ниже, биотинилирование облегчает некоторые варианты сборки/конъюгации композиции.

[0040] Используемый в настоящем документе термин «специфично связываться» или его варианты относятся к способности связывающего домена (например, антитела или его фрагмента или производного) связываться с представляющим интерес антигеном (например, GLUT4), без значительного связывания с другими молекулами в стандартных условиях, известных в данной области. Связывающий домен может связываться с другими пептидами, полипептидами или белками, но с более низкой аффинностью, определяемой, например, с помощью иммунологических анализов, BIAcore или других методов анализа, известных в данной области. Однако предпочтительно, чтобы связывающий домен практически не реагировал перекрестно с другими антигенами.

[0041] В некоторых вариантах осуществления GLUT4-связывающий домен композиции имеет аффинность связывания в диапазоне, характеризуемом константой диссоциации (Kd) от примерно 50 нМ (более низкая аффинность связывания) до примерно 0,001 нМ (более высокая аффинность связывания). Например, связывающий домен имеет аффинность связывания с белком GLUT, характеризующуюся (Kd) примерно 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 1 нМ, 0,75 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,01 нМ, 0,005 нМ и 0,001 нМ или даже меньше. Типичные диапазоны (Kd), характеризующие аффинность связывания домена для таргетинга в клетки с антигеном, характерным для интересующего типа клеток, включают от примерно 30 нМ до примерно 10 нМ, от примерно 20 нМ до примерно 1 нМ, от примерно 10 нМ до примерно 0,1 нМ, от примерно 0,5 нМ до примерно 0,05 нМ и от примерно 0,1 нМ до примерно 0,001 нМ или даже ниже, или любой субдиапазон в них.

Мишень для связывания

[0042] Как указано выше, связывающий домен (например, антитело или его фрагмент или производное) специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 (GLUT4). GLUT4 кодируется геном SLC2A4 (или его гомологами), который преимущественно экспрессируется в поперечнополосатых мышцах (скелетных и сердечных) и жировой ткани, но также экспрессируется в определенных областях головного мозга, включая гиппокамп и мозжечок. Это изобретение охватывает GLUT4 любого млекопитающего, такого как человек, мышь, крыса, кошка, собака, лошадь и т. д. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфично связывается с внеклеточным доменом белка GLUT4.

[0043] В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфично связывается с доменом первой внеклеточной петли GLUT4. В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, которая является субдоменом домена первой внеклеточной петли GLUT4 человека. Например, иллюстративный домен GLUT4, рассматриваемый в настоящем описании, включает домены, представленные в последовательностях с номером доступа Genbank M91463.1 (человек), номером доступа Genbank AB008453.1 (мышь), номером доступа Genbank NM_001159327.1 (собака) и номером доступа Genbank L36125.1 (крыса), каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, которая представляет собой репрезентативный домен первой внеклеточной петли GLUT4 человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфично связывается с субдоменом домена первой внеклеточной петли GLUT4, который содержит последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2.

[0044] В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4, которая является субдоменом домена первой внеклеточной петли мышиного GLUT4. В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, которая представляет собой репрезентативный домен первой внеклеточной петли мышиного GLUT4. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфично связывается с субдоменом домена первой внеклеточной петли GLUT4, который содержит последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4.

Полезная нагрузка

[0045] Терапевтическая полезная нагрузка может представлять собой любую полезную нагрузку, способную индуцировать изменение в клетке-мишени, которая, по крайней мере временно, экспрессирует GLUT4 на своей поверхности. Изменение может иметь терапевтический эффект, если оно происходит in vivo. Типичные, неограничивающие терапевтические полезные нагрузки могут содержать нуклеиновую кислоту, белок или пептид, липид, низкомолекулярный фармацевтический препарат и/или радиоизотоп.

[0046] Например, в некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, такую как ДНК (включая кДНК), мРНК, киРНК, кшРНК и нРНК (направляющая РНК). Молекулы нРНК можно использовать в методах для редактирования ДНК (например, методах CRISPR/Cas9) и редактирования РНК.

[0047] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность (например, открытую рамку считывания), кодирующую белок, который оказывает терапевтическое действие на клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит открытую рамку считывания, функционально связанную с промоторной последовательностью для обеспечения экспрессии открытой рамки считывания в клетке-мишени. Эту открытую рамку считывания можно назвать трансгеном. Термин «промотор» относится к регуляторной нуклеотидной последовательности, которая может активировать транскрипцию (экспрессию) трансгена и/или его сплайсированные варианты. Промотор обычно расположен выше гена, но может быть расположен и в других областях, прилегающих к гену, или даже внутри гена. Промотор обычно содержит сайты связывания РНК-полимеразы и одного или нескольких факторов транскрипции, которые участвуют в сборке транскрипционного комплекса. Используемый в настоящем документе термин «функционально связанный» означает, что промотор и кодирующая нуклеиновая кислота сконфигурированы и расположены относительно друг друга таким образом, что промотор может активировать транскрипцию кодирующей нуклеиновой кислоты с помощью транскрипционного аппарата клетки. Промотор может быть конститутивным или индуцибельным. Конститутивные промоторы можно определить на основании характеристик клетки-мишени и конкретных факторов транскрипции, доступных в цитозоле. Специалист в данной области может выбрать подходящий промотор в зависимости от предполагаемого хозяина, поскольку различные промоторы известны и широко используются в данной области. Примеры неограничивающих промоторов включают промотор мышечной креатинкиназы (CK) (номер доступа Genbank AF188002.1) и промотор скелетного актина человека (номер доступа Genbank NG_006672.1), каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки. В то время как усовершенствования, предусмотренные в настоящем документе, позволяют использовать полноразмерные промоторы, укороченные промоторы, которые сохраняют некоторую активность, по-прежнему охватываются настоящим изобретением. Типичные, не ограничивающие примеры укороченных промоторов СК, которые сохраняют активность, описаны в Hauser MA, et al., Analysis of muscle creatine kinase regulatory elements in recombinant adenoviral vectors, Mol Ther. 2000l 2(1):16-25, и в Brennan KJ and Hardeman EC, Quantitative analysis of the human alpha-skeletal actin gene in transgenic mice, J Biol Chem. 1993 268(1):719-725, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[0048] Терапевтическая полезная нагрузка нуклеиновой кислоты может иметь любой размер и любую конфигурацию, такую как линейная форма, плазмидная форма (например, кольцевая форма) или миникольцевая форма. Как показано ниже, было продемонстрировано, что композиции по настоящему изобретению способны доставлять очень большие трансгены для успешной экспрессии в клетках-мишенях. Таким образом, полезная нагрузка нуклеиновой кислоты не ограничена в отношении размера, что практически запрещает использование типичных вирусных векторов. Таким образом, линейные формы нуклеиновых кислот могут включать короткие олигонуклеотиды или более длинные трансгены, без ограничений. Как понятно специалистам-практикам, миникольца представляют собой производные кольцевых плазмид меньшего размера, в которых отсутствует большинство или все компоненты прокариотического вектора. Миникольца могут функционировать как носители трансгена с тем преимуществом, что они менее подвержены деградации из-за меньшего размера и/или отсутствия прокариотической последовательности.

[0049] Как указано выше, нуклеиновая кислота может представлять собой трансген, сконфигурированный таким образом, чтобы он содержал последовательность, кодирующую любой желаемый белок или фрагмент белка, экспрессируемый в клетке-мишени. Трансген может кодировать любой белок, который желательно экспрессировать в клетке. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует белок, который оказывает благотворное влияние на клетку по сравнению с мутантной эндогенной версией, присутствующей в клетке-мишени. Например, как описано выше, мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) представляет собой тяжелое сцепленное с полом заболевание, возникающее из-за аберрантного белка дистрофина (или аберрантной экспрессии белка дистрофина). Ген, кодирующий дистрофин, называемый геном «DMD», является одним из самых длинных генов человека, охватывающим около 2,3 миллионов пар оснований (0,08% генома человека) в локусе Xp21 с примерно 79 экзонами. Первичный транскрипт белка дикого типа составляет около 21 тысяч пар оснований, а зрелая мРНК - около 14 тысяч пар оснований. Как описано ниже, авторы изобретения установили, что векторная платформа по изобретению может доставлять такие длинные трансгены в клетки GLUT4+ (например, мышечные клетки) для успешного получения экспрессии. Соответственно, типичный и не ограничивающий пример полезной нагрузки нуклеиновой кислоты включает кодирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок дистрофин, или его функциональный фрагмент, функционально связанную с промоторной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления кодируемый белок дистрофин представляет собой полноразмерный белок дистрофин человека или по существу полноразмерный белок дистрофин человека. Типичная полноразмерная белковая последовательность дистрофина человека представлена в SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка нуклеиновой кислоты кодирует дистрофин с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно а 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5.

[0050] Термин «практически полноразмерный» охватывает варианты осуществления, в которых кодируется значительная, но неполная версия дистрофина, как, например, кодируется по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% или по меньшей мере примерно 99% полноразмерного белка дистрофина (например, с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с SEQ ID NO:5, описанной выше), обеспечивая видимое фенотипическое улучшение в клетке-мишени.

[0051] Также было показано, что белки «микродистрофины», вводимые или экспрессируемые в клетке с аберрантным или мутантным геном DMD, могут обеспечивать по меньшей мере некоторый эффект улучшения, компенсирующий эндогенную мутацию в гене DMD. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что многие укороченные версии дистрофина обладают улучшенной функциональностью по сравнению с мутированной или аберрантной экспрессией дистрофина у субъектов с DMD и другими заболеваниями, связанными с дистрофином. Соответственно, доставка или индукция экспрессии этих укороченных или микродистрофиновых белков в мышечной клетке может начать восстановление относительно здорового или улучшенного фенотипа. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка нуклеиновой кислоты может кодировать функциональный фрагмент белка дистрофина, такой как любой микродистрофин, известный в данной области. Например, в статье Ramos et al., 2019 Molecular Therapies 27: 623-635, включенной в настоящий документ путем ссылки, описаны несколько миниатюрных конструкций микродистрофина, которые оптимизированы для повышения эффективности. Иллюстративные и не ограничивающие области и домены белка дистрофина, которые, как было показано, обладают характеристиками, способствующими функциональности конструкций микродистрофина, включают: палочковидный домен с по меньшей мере 4 SR-доменами, α-синтрофин-связывающий домен в SR16-17, актин-связывающий домен и богатый цистеином домен для связывания β-дистрогликана.

[0052] В некоторых вариантах осуществления полноразмерный белок дистрофин имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5, которая представляет собой предсказанную последовательность полноразмерного белка дистрофина человека. Последовательность имеет номер доступа Genbank AAA53189.1 и полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления полноразмерный белок дистрофин имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:6, которая представляет собой предсказанную последовательность полноразмерного белка дистрофина мыши. Последовательность имеет номер доступа Genbank NP_031894.1 и полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления полноразмерный белок дистрофин человека имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7, которая представляет собой предсказанную последовательность полноразмерного белка дистрофина крысы. Последовательность имеет номер доступа Genbank XP_017457396.1 и полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления полноразмерный белок дистрофин человека имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 8, которая представляет собой предсказанную последовательность полноразмерного белка дистрофина кролика. Последовательность имеет номер доступа Genbank XP_017205220.1 и полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Как указано выше, терапевтическая полезная нагрузка нуклеиновой кислоты в этих вариантах осуществления может содержать полноразмерную последовательность белка дистрофина, по существу полноразмерную последовательность дистрофина или быть ее функциональным фрагментом, который сохраняет способность обеспечивать по меньшей мере некоторый терапевтический эффект в отношении восстановления улучшенного фенотипа.

[0053] Как указано выше, полезная нагрузка нуклеиновой кислоты может включать линейные нуклеиновые кислоты, такие как короткие олигомеры. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота не является трансгеном, кодирующим белок, а скорее изменяет эндогенную экспрессию и трансляцию белков в клетке-мишени. Например, в некоторых терапевтических подходах к лечению геномных заболеваний, таких как DMD, вводят олигонуклеотиды для пропуска экзонов в пре-мРНК, которые содержат мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания. Вводимые олигонуклеотиды (например, фосфодиамидат-морфолино олигомеры) сконфигурированы для последовательность-специфичной гибридизации с мутированной пре-мРНК и стерически препятствуют связыванию сплайсосомы в местах соединения мутантного экзона в кодирующей молекуле пре-мРНК. В результате сплайсосома вырезает не только интроны, но и экзон, содержащий мутацию сдвига рамки считывания. Полученная зрелая мРНК кодирует слегка укороченный белок, лишенный мутантного экзона и сохраняющий рамку считывания по всем оставшимся интронов. Укороченный белок сохраняет по меньшей мере некоторые характеристики белка дикого типа по сравнению с версией, содержащей сдвиг рамки считывания. Этот подход был реализован для DMD. Однако такие подходы требуют очень большого количества олигонуклеотидов из-за высокой скорости деградации после введения. См., например, Verhaart IEC and Aartsma-Rus A, Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy, Nat Rev Neurol. 2019 Jul;15(7):373-386, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки. Полезная нагрузка нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включает такие терапевтические олигомеры. Описанная платформа обеспечивает преимущество специфичного таргетинга олигомеров в клетку-мишень, что приводит к эффективному поглощению клеткой. Таким образом, раскрытая платформа для таргетинга не требует таких высоких доз олигонуклеотидов и обеспечивает более высокую вероятность доставки и поглощения клетками-мишенями.

[0054] В других вариантах осуществления полезная нагрузка нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть сконфигурирована так, чтобы стимулировать РНК-интерференцию. Например, в некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит молекулы короткой интерферирующей РНК (киРНК) или короткой шпилечной РНК (кшРНК) или нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулы киРНК или кшРНК. Последовательности таких молекул нуклеиновых кислот могут быть легко сконфигурированы в соответствии с навыками и знаниями в данной области, чтобы привести к связыванию и последующей деградации транскриптов мРНК, что приведет к нокдауну любого желаемого белка-мишени в клетке.

[0055] В любом варианте полезной нагрузки нуклеиновой кислоты, но особенно когда полезная нагрузка нуклеиновой кислоты довольно велика (например, для длинных нуклеиновых кислот, кодирующих дистрофин или его большие участки), композиция может также содержать дополнительные компоненты для облегчения эффективного свертывания или упаковки (например, конденсации) нуклеиновой кислоты. Дополнительная упаковка может быть полезна для линейных (например, олиго или длинных последовательностей), плазмидных и миникольцевых вариантов полезной нагрузки нуклеиновой кислоты, описанных выше, без ограничений. Например, в одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой. Гистоновый белок (белки) может способствовать свертыванию полезной нагрузки нуклеиновой кислоты для эффективной упаковки и переноса. В некоторых вариантах осуществления гистоновый белок или по меньшей мере часть множества гистоновых белков биотинилируют для облегчения конъюгации, как более подробно описано ниже.

[0056] В других вариантах осуществления композиция дополнительно содержит множество катионных фрагментов, связанных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что катионные молекулы потенциально могут конденсировать ДНК, которая представляет собой полимерную анионную молекулу. Таким образом, пептиды, содержащие множество положительно заряженных аминокислот, пригодны для конденсации полезной нагрузки полимерной нуклеиновой кислоты. Примеры катионных аминокислот включают лизин (Lys, K), гистидин (His, H) и аргинин (Arg, R). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит один или несколько катионных пептидов, где катионные пептиды содержат множество катионных аминокислот, например, выбранных из His, Arg и Lys, возможно, в комбинации. Пептид обычно имеет общий положительный заряд. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит одну или несколько пептидных фрагментов поли-L-Lys («PLL»). Дополнительные не ограничивающие катионные молекулы или фрагменты, которые могут быть включены в композицию для конденсации полезной нагрузки нуклеиновой кислоты, включают линейный полиэтиленимин («LPEI»), разветвленный полиэтиленимин («BPEI»), хитозан, спермидин и спермин, полиамидоамин («РАМАМ»), поли(2-диметиламиноэтилметакрилат) («PDMAEMA»), поли(бета-аминоэфиры) («PBAE»), поли{N-[N-(2-аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид («PAsp(DET)»), поли(2-аминоэтилэтиленфосфат («PPEEA») и т.п.

[0057] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть катионных фрагментов, таких как PLL или другие катионные молекулы, указанные выше, биотинилируют для облегчения конъюгации, как более подробно описано ниже.

Конъюгация

[0058] Связывающий домен, например, антитело или его фрагменты или производные, можно конъюгировать с терапевтической полезной нагрузкой любым известным способом. Конъюгация может быть ковалентной или ионной.

[0059] В некоторых иллюстративных неограничивающих вариантах осуществления конъюгация основана на взаимодействии между биотином и связывающимся партнером, таким как авидин, нейтравидин и стрептавидин, для обеспечения очень высокой аффинности и специфичной конъюгации составляющих частей композиции.

[0060] Например, в одном варианте осуществления связывающий домен (например, антитело или его фрагмент, или производное) и сворачивающий или конденсирующий ДНК элемент (например, гистон или катионный пептид) являются биотинилированными. Полезная нагрузка нуклеиновой кислоты связана со сворачивающим или конденсирующим ДНК элементом (например, сворачивается вокруг сворачивающего элемента или конденсируется с его помощью). Благодаря взаимодействию нескольких биотинилированных компонентов с одной и той же молекулой нейтравидина, связывающий домен и сворачивающий или конденсирующий элемент и ассоциированная полезная нагрузка нуклеиновой кислоты конъюгируются вместе с высокой аффинностью.

[0061] В некоторых дополнительных вариантах осуществления может быть агрегировано множество связывающих доменов и полезной нагрузки нуклеиновой кислоты (с ассоциированным сворачивающими или конденсирующими ДНК элементами). Этого можно достичь, просто в результате связывания нескольких биотинилированных элементов с одним и тем же связывающим партнером на основе авидина. В качестве альтернативы может быть несколько биотинилированных сворачивающих или конденсирующих ДНК элементов, связанных с одной и той же полезной нагрузкой нуклеиновой кислоты, каждый из которых связан с другим связывающим партнером на основе авидина, который, в свою очередь, связан с другим связывающим доменом. Этой агрегации можно дополнительно способствовать путем включения в состав одной или нескольких частиц, таких как липосомы, которые могут связываться с несколькими нуклеотидными полезными нагрузками. Например, как показано на фиг. 3, несколько полезных нагрузок в виде плазмид связаны с катионной структурой липосомы. Каждая плазмида, в свою очередь, связана с множеством гистоновых белков, часть которых биотинилирована. Биотинилированные гистоны связываются с биотинилированными связывающими доменами (например, антителами против GLUT4) в результате связывания с нейтравидином. Получение такой иллюстративной композиции более подробно описано ниже.

[0062] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления раскрытая композиция может дополнительно содержать катионную частицу, такую как липосома, которая может дополнительно ассоциироваться и/или агрегировать с полезной нагрузкой нуклеиновой кислоты. Катионные липосомы известны и могут быть легко сконструированы специалистами в данной области для облегчения надлежащей агрегации и/или ассоциации с полезной нагрузкой нуклеиновой кислоты. В некоторых иллюстративных неограничивающих вариантах осуществления липосома может содержать один или несколько липидов, выбранных из DC-холестерин HCl,3b-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карамоил]холестерин гидрохлорида («DC-Chol»), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина («DOPE»), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмония («DOTMA»), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N, N,N-триметиламмонийпропана («DOTAP»), диметилдиоктадециламмоний бромида («DDAB»), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана («DMTAP»), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана («DODAP»), гемисукцинатхолестерина («CHEMS») и холестерина («CHOL»), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N, N-диметил-1-пропанаминия («DOSPA»), диоктадециламидоглицилспермина («DOGS»), диолеоилфосфатидилхолина («DOPC») и т.п. В некоторых вариантах осуществления липосома дополнительно содержит полиэтиленгликоль («PEG»).

[0063] В другом иллюстративном варианте осуществления, показанном на фиг. 8, полезная нагрузка плазмидной ДНК связана с множеством катионных фрагментов PLL, которые являются биотинилированными. Биотинилированные фрагменты PLL связываются со связывающими доменами (например, антителами против GLUT4) путем взаимной ассоциации с одним и тем же связывающим партнером нейтравидином.

[0064] В дополнительных вариантах осуществления композиция дополнительно содержит альбумин, который может способствовать усиленной экспрессии полезной нагрузки нуклеиновой кислоты. Как более подробно описано ниже, недавние данные показали, что альбумин может усиливать экспрессию белка с доставляемых ДНК/липосомных векторов. Среди других причин считается, что альбумин усиливает доставку композиции к клеткам-мишеням, включая усиление исключения из эндосомальной утилизации и проникновения в ядро полезной нагрузки нуклеиновой кислоты. Отрицательно заряженный альбумин может связываться с положительно заряженными липосомами, связанными с полезной нагрузкой нуклеиновыми кислотами. В других вариантах осуществления, где для конъюгации используются связывающие партнеры на основе биотина и авидина, альбумин может быть биотинилирован. Таким образом, положительно заряженная липосома не является обязательным условием эффективности альбумина. Это показано на фиг. 8.

[0065] В одном аспекте изобретение относится к композициям, описанным в настоящем документе, для применения при лечении заболевания, при этом заболевание поддается лечению путем доставки полезной нагрузки в клетку, которая экспрессирует GLUT4. Подходящие заболевания, охватываемые данным аспектом, в дополнение к другим элементам термина «лечение», используемого в данном документе, более подробно описаны ниже. В некоторых вариантах осуществления применение предполагается для лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин. В некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, предназначены для лечения мышечной дистрофии Дюшенна («DMD») или мышечной дистрофии Беккера («BMD»), которые более подробно описаны выше и ниже. В этих вариантах осуществления полезная нагрузка композиций по изобретению может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую полноразмерный белок дистрофин (например, дикого типа), или его функциональный фрагмент (например, около 80%, 85%, 90%, 95%, 98%), или его вариант, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере примерно на 90%, 95% или 98% идентична последовательности белка дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изменение идентичности последовательностей по сравнению с последовательностью дикого типа является результатом консервативных замен, которые существенно не влияют на функцию белка. В некоторых вариантах осуществления применение может дополнительно включать введение субъекту инсулина для увеличения доступной мишени GLUT4 и таргетинга полезной нагрузки.

Способы

[0066] Настоящее изобретение также охватывает способы использования и изготовления раскрытых композиций.

[0067] В одном аспекте относится к способу таргетинга полезной нагрузки (например, терапевтической полезной нагрузки) для доставки в клетку, которая экспрессирует GLUT4. Способ включает контакт клетки с любым вариантом раскрытой композиции, например, как указано выше.

[0068] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает контакт клетки с инсулином до контакта клетки с композицией. Как описано выше, GLUT4 в высокой степени экспрессируется в поперечнополосатых мышцах и жировой ткани, а также в клетках определенных областей мозга, включая гиппокамп и мозжечок. GLUT4 в основном находится во внутриклеточных везикулах хранения GLUT4 (GSV). Однако после связывания инсулина с рецептором инсулина (в чувствительных к инсулину клетках, включая скелетные мышцы, сердце, жировые клетки и некоторые нейроны) активируется сигнальный путь, ведущий к транслокации GLUT4 к плазматической мембране. См., например, Klip, A, et al., 30 sweet years of GLUT4. 2019, REV119.008351, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления инсулин контактирует с клеткой по меньшей мере около 10 минут (например, около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 80, 90, 120 минут или больше) до контакта клетки с композицией.

[0069] В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы, клетку гладкой мышцы, клетку жировой ткани, клетку гиппокампа или клетку мозжечка.

[0070] Как указано выше, полезная нагрузка (например, терапевтическая полезная нагрузка) может представлять собой любую композицию, которая улучшает или изменяет фенотип клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как трансген, которая обеспечивает экспрессию желаемого белка в клетке. Иллюстративный вариант осуществления представляет собой трансген, кодирующий дистрофин или его функциональный фрагмент для обеспечения экспрессии белка дистрофина в клетке. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ характеризуется как способ экспрессии или увеличения экспрессии функционального белка дистрофина в клетке или увеличения экспрессии функционального фрагмента белка дистрофина в клетке. Увеличение может быть любым уровнем экспрессии от начальной точки отсутствия экспрессии до осуществления способа. В некоторых вариантах осуществления клетка может иметь остаточную (то есть обнаруживаемую) экспрессию белка дистрофина или его функционального фрагмента. В некоторых вариантах осуществления клетка может экспрессировать белок дистрофин или его функциональный фрагмент на уровне, который составляет по меньшей мере примерно 0,01%, 0,025%, 0,05%, 0,1%, 1%, 2,5%, 5%, 10%, 25%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более по сравнению с аналогичной клеткой (например, из того же источника ткани), которая имеет интактный ген дикого типа, кодирующий дистрофин. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой мышечную клетку.

[0071] В других вариантах осуществления клетка представляет собой раковую клетку, экспрессирующую GLUT4 на поверхности. Неограничивающие примеры таких раковых клеток включают клетки меланомы, клетки рака предстательной железы, раковые клетки мышечной ткани, такие как клетки рабдомиосаркомы, и клетки рака молочной железы. В таких вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка может представлять собой любую противораковую терапевтическую нагрузку, такую как радиоизотоп или другой токсин.

[0072] Способ можно осуществлять in vitro. В качестве альтернативы способ может представлять собой метод in vivo, направленный на лечение заболевания, связанного с дисфункцией клеток, экспрессирующих GLUT4, конститутивно или временно, на поверхности. Способ in vivo включает введение эффективного количества раскрытой композиции нуждающемуся в этом субъекту.

[0073] Используемый в настоящем документе термин «лечить» относится к медикаментозному контролю заболевания, нарушения или состояния (например, мышечной дистрофии, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) или мышечная дистрофия Беккера (BMD) или рак) у субъекта (например, человека или другого млекопитающего, такое как примат, лошадь, собака, мышь, крыса, морская свинка, кролик и т.п.). Лечение может включать любые признаки успеха в лечении или облегчение заболевания или состояния (например, DMD, BMD или рака), включая любой параметр, такой как ослабление, ремиссия, ослабление симптомов или улучшение переносимости заболевания или состояния пациентом, замедление скорости дегенерации или ухудшения, или менее тяжелая дегенерация. В неограничивающих примерах термин «лечить» в контексте DMD может включать замедление или ингибирование прогрессирования потери мышечной массы или слабости; стабилизацию или увеличение мышечной силы, мышечного контроля или двигательных навыков; снижение мышечной усталости; стабилизацию или улучшение функции диафрагмы; стабилизацию или улучшение сердечного выброса и т.д. В неограничивающих примерах термин «лечить» в контексте рака может включать замедление или ингибирование скорости роста опухоли или снижение вероятности рецидива по сравнению с отсутствием лечения. В некоторых вариантах осуществления лечение включает достижение некоторой поддающейся обнаружению степени гибели раковых клеток у пациента. Лечение или облегчение симптомов может основываться на объективных или субъективных параметрах, включая результаты осмотра врачом. Соответственно, термин «лечение» включает введение композиций по настоящему изобретению для облегчения или остановки или ингибирования развития симптомов или состояний, связанных с заболеванием или состоянием (например, DMD, BMD или рака). Термин «терапевтический эффект» относится к облегчению, уменьшению или устранению заболевания или состояния, симптомов заболевания или состояния или побочных эффектов заболевания или состояния у субъекта. Термин «терапевтически эффективный» относится к количеству композиции, которое приводит к терапевтическому эффекту и может быть легко определено.

[0074] Как указано выше, способ может включать введение субъекту терапевтически эффективного количества раскрытой композиции. Как указано, полезная нагрузка нуклеиновой кислоты обычно сконфигурирована для экспрессии в клетке-мишени, например, функционально связана с соответствующим промотором. Эффективное количество представляет собой количество, которое дает результаты в благоприятном изменении фенотипа. Преимущество наличия промотора, специфичного для клетки, например, промотора, специфичного для мышц, заключается в том, что он будет придавать дополнительную специфичность по сравнению с уже обеспечиваемым таргетингом связывающего домена на GLUT4.

[0075] В некоторых вариантах осуществления способ лечения сочетается или координируется с другими терапевтическими стратегиями. В этом комбинаторном аспекте предусмотрена любая другая терапевтическая стратегия для лечения состояний, связанных с мутированной или аберрантной экспрессией дистрофина. В контексте рака, экспрессирующего GLUT4, другой стратегией противораковой терапии может быть противораковая иммунотерапия, в которой используются иммуномодулирующие композиции (например, антитела, иммунные клетки, цитокины и т.д.), которые могут усиливать собственный иммунный ответ субъекта против раковой мишени. Такая иммунная терапия включает адоптивную терапию иммунными клетками, включая Т-клетки CAR, терапию ингибиторами иммунных контрольных точек, противораковые вакцины и т.п.

[0076] Способы лечения могут включать композицию по изобретению для устранения ряда состояний, связанных с клетками, экспрессирующими GLUT4. Например, к заболеваниям, которые можно лечить введением композиции по изобретению, относятся заболевания скелетных мышц, такие как: мышечные дистрофии (миотоническая дистрофия (болезнь Штейнерта), мышечная дистрофия Дюшенна, мышечная дистрофия Беккера, поясно-конечностные мышечные дистрофии, плечелопаточно-лицевая мышечная дистрофия врожденная мышечная дистрофия, окулофарингеальная мышечная дистрофия, дистальная мышечная дистрофия и мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса), другие миопатии, такие как воспалительные миопатии (например, полимиозит, дерматомиозит и миозит с включениями), миопатии, обусловленные эндокринными нарушениями (гипертиреоидные и гипотиреоидные миопатии), заболевания, вызывающие мышечную атрофию, такие как раковая кахексия и саркопения, врожденная миотония, врожденная парамиотония, центроядерная миопатия, немалиновая миопатия, миотубулярная миопатия, периодический паралич, миопатии RYR-1 и воспалительные миопатии (например, полимиозит, дерматомиозит и миозит с включенными тельцами). Предлагаемый способ может быть также применен для лечения заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза (ALS), инфантильной прогрессирующей спинальной мышечной атрофии (1-го типа - болезни Верднига-Гоффмана), промежуточной спинальной мышечной атрофии (2-го тип), ювенильной спинальной мышечной атрофии (3-го типа - болезни Кугельберга-Веландера), спинальной мышечной атрофии взрослых (4-го типа) и спинально-бульбарной мышечной атрофии (болезни Кеннеди)), заболеваний нервно-мышечного синапса, таких как миастения, синдрома Ламберта-Итона (миастенического) и врожденных миастенических синдромов, заболеваний периферических нервов, таких как болезнь Шарко-Мари-Тута, атаксия Фридрейха и болезнь Держерина-Сотта, кардиомиопатий, метаболических заболеваний, поражающих мышцы, например, дефицита фосфорилазы (болезни Мак-Ардла), дефицита кислой мальтазы (болезни Помпе), дефицита фосфофруктокиназы (болезни Таруи), дефицита фермента амило-1,6-глюкозидазы (болезни Кори или Форбса), митохондриальной миопатии, дефицита карнитина, дефицита карнитин-пальмитил-трансферазы, дефицита фосфоглицераткиназы, дефицита фосфоглицератмутазы, дефицита лактатдегидрогеназы и дефицита миоаденилатдезаминазы), а также заболеваний, поражающих жировую ткань, таких как диабет, болезненное ожирение, врожденная генерализованная липодистрофия (врожденная липодистрофия Берардинелли-Сейпа), семейная парциальная липодистрофия, семейный дефицит липопротеинлипазы, болезнь накопления нейтральных липидов и синдром Чанарина-Дорфмана. Поскольку GLUT4 экспрессируется в гиппокампе и мозжечке, заболевания головного мозга, включая болезнь Альцгеймера, атаксию, телеангиэктазию, NBIA (нейродегенерация с накоплением железа в головном мозге), синдром Фара, синдром Барта и болезнь Паркинсона, можно лечить с использованием композиций по изобретению. Наконец, поскольку GLUT4 сверхэкспрессируется при некоторых видах рака, раскрытые композиции можно использовать для таргетинга и лечения злокачественной меланомы и рака предстательной железы, а также рака, поражающего мышцы, такого как рабдомиосаркома.

[0077] В конкретном аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей:

связывающий домен, который специфично связывает белок-транспортер глюкозы 4 («GLUT4»), и

терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную со связывающим доменом, при этом терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанной с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент.

[0078] В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или является генетическим носителем мышечной дистрофии Дюшенна («DMD»). Как описано выше, мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) представляет собой тяжелое сцепленное с полом заболевание, возникающее из-за аберрантного белка дистрофина (или аберрантной экспрессии белка дистрофина). Будучи сцепленным с полом заболеванием, DMD в основном поражает мужчин и обычно проявляется сначала потерей мышечной ткани ног и таза, а затем рук. Случаи могут прогрессировать до того, что субъект испытывает затруднения в дыхании и плохой сердечный выброс. У пострадавших субъектов в конечном итоге значительно сокращается продолжительность жизни из-за обширных потерь и деградации мышечной ткани. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или является генетическим носителем мышечной дистрофии Беккера («BMD»). Мышечная дистрофия Беккера («BMD») связана с DMD тем, что она также возникает в результате мутаций в гене дистрофина. Мышечная дистрофия Беккера («BMD»), однако, имеет более мягкое течение симптомов по сравнению с DMD, вероятно, потому, что уровень остаточной функции дистрофина у субъектов с BMD относительно более высокий по сравнению с субъектами с DMD из-за локализации мутации в гене дистрофина.

[0079] Примеры элементов композиции более подробно описаны выше и применимы к данному аспекту. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой антитело, его фрагмент или производное, которое специфично связывается с GLUT4. Такие антитела или их фрагменты, или производные более подробно описаны выше. В некоторых вариантах осуществления антитело, его фрагмент или производное специфично связывается с первым внеклеточным доменом GLUT4. Домен и конкретные эпитопы в нем более подробно описаны выше. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфичо связывается с доменом первой внеклеточной петли GLUT4. В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, которая является субдоменом домена первой внеклеточной петли GLUT4 человека. В некоторых вариантах осуществления домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере примерно 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% и 100%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1, которая представляет собой репрезентативный домен первой внеклеточной петли GLUT4 человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфично связывается с субдоменом домена первой внеклеточной петли GLUT4, который содержит последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98%) с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2.

[0080] В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с GLUT4, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления связывающий домен представляет собой фрагмент антитела или производное антитела. Фрагмент антитела или производное антитела может представлять собой или содержать одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело. Одноцепочечное антитело может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab).

[0081] В некоторых вариантах осуществления антитело, его фрагмент или производное является биотинилированным.

[0082] Нуклеиновая кислота в этом аспекте способа может представлять собой любую полезную нагрузку нуклеиновой кислоты, как описано выше. Например, нуклеиновая кислота имеет линейную форму, форму плазмиды или форму миникольца.

[0083] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления гистоновый белок или по меньшей мере часть множества гистоновых белков биотинилированы.

[0084] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит липосому, связанную с нуклеиновой кислотой. Элементы липосом более подробно описаны выше и применимы к этому аспекту изобретения. В некоторых вариантах осуществления липосома содержит один или несколько липидов, выбранных из DC-холестерин HCl,3b-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карамоил]холестерин гидрохлорида («DC-Chol»), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина («DOPE»), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмония («DOTMA»), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмонийпропана («DOTAP»), диметилдиоктадециламмоний бромида («DDAB»), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана («DMTAP»), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана («DODAP»), гемисукцинатхолестерина («CHEMS») и холестерина («CHOL»), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия («DOSPA»), диоктадециламидоглицилспермина («DOGS»), диолеоилфосфатидилхолина («DOPC») и т.п. В некоторых вариантах осуществления липосома дополнительно содержит полиэтиленгликоль («PEG»).

[0085] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит множество катионных пептидных фрагментов, связанных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления катионные фрагменты представляют собой или включают поли-L-лизин («PLL»), линейный полиэтиленимин («LPEI»), разветвленный полиэтиленимин («BPEI»), хитозан, спермидин и спермин, полиамидоамин («PAMAM»), поли(2-диметиламиноэтилметакрилат) («PDMAEMA»), поли(бета-аминоэфир)ы («PBAE»), поли{N-[N-(2-аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид («PAsp(DET)»), поли(2-аминоэтилэтиленфосфат («PPEEA») и т.п. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть множества катионных пептидных фрагментов является биотинилированной.

[0086] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит альбумин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть альбумина является биотинилированной.

[0087] В некоторых вариантах осуществления антитело, его фрагмент или производное биотинилировано, и композиция дополнительно содержит нейтравидин.

[0088] В некоторых вариантах осуществления кодируемый белок дистрофин представляет собой по существу полноразмерный белок дистрофин человека. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный белок дистрофин человека имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:5.

[0089] Субъектом может быть млекопитающее, такое как человек, другой примат, крыса, мышь, кролик, кошка, собака и т.п. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.

Состав и введение

[0090] Настоящее изобретение также охватывает составы, подходящие для способов введения для применения в терапевтических целях in vivo у субъектов (например, млекопитающих с DMD, BMD, раком или состояниями, описанными выше). Согласно навыкам и знаниям, общепринятым в данной области, композиции по изобретению могут быть изготовлены с соответствующими носителями и неактивными связующими веществами и т.п. для введения в конкретные клетки-мишени. Поскольку композиции содержат связывающие домены, которые придают специфичность к клеткам-мишеням, композиции могут быть составлены для прямого или системного введения в соответствии с навыками и знаниями в данной области.

Иллюстративные анти-GLUT4 антитела.

[0091] Известны анти-GLUT4 антитела, которые связываются с внеклеточным доменом GLUT4 человека (см., например, Tucker et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 115:E4990-E4999, опубликовано онлайн 16 мая 2018 г.). В другом аспекте изобретение относится к моноклональным антителам, которые связывают пептид GLUT4 человека GRQGPEGPSSI (SEQ ID NO:2). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-GLUT4 антителу, или его фрагменту или производному, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L). В некоторых аспектах V_H содержит CDR1, содержащую последовательность (D/E)Y(S/T)(I/M)H, CDR2, содержащую последовательность WINTE(S/T)G(D/E)X₁(T/S)YADDFKG, и CDR3, содержащую последовательность RX₂X₃Y; и V_L содержит CDR1, содержащую последовательность (R/K)(A/S)SQS(L/V)X₄X₅(N/S), CDR2, содержащую последовательность (V/A)SNR(F/Y)(S/T), и CDR3, содержащую последовательность QDX₆X₇X₈PT. В некоторых вариантах осуществления X₁ представляет собой P или T; X₂ представляет собой A, F, S или G; X₃ представляет собой A, D, E или G; X₄ представляет собой S, V, N или Т; X₅ представляет собой N, H, R, K или T; X₆ представляет собой R, Y, S, T или K; X₇ представляет собой H, N, E, T, Y или S; или X₈ представляет собой V, S, L или I.

[0092] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления анти-GLUT4 антитело, или его фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) VH-CDR1, содержащей последовательность (D/E)Y(S/T)(I/M)H; (b) VH-CDR2, содержащей последовательность WINTE(S/T)G(D/E)X₁(T/S)YADDFKG; (c) VH-CDR3, содержащей последовательность RX₂X₃Y; (d) VL-CDR1, содержащей последовательность (R/K)(A/S)SQS(L/V)X₄X₅(N/S); (e) VL-CDR2, содержащей последовательность (V/A)SNR(F/Y)(S/T); и (f) VL-CDR3, содержащей последовательность QDX₆X₇X₈PT. В некоторых вариантах осуществления X₁ представляет собой P или T; X₂ представляет собой A, F, S или G; X₃ представляет собой A, D, E или G; X₄ представляет собой S, V, N или Т; X₅ представляет собой N, H, R, K или T; X₆ представляет собой R, Y, S, T или K; X₇ представляет собой H, N, E, T, Y или S; или X₈ представляет собой V, S, L или I.

[0093] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-GLUT4 антитело, или его фрагмент или производное содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) VH-CDR1, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO:10-17; (b) VH-CDR2, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO:18-25; (c) VH-CDR3, имеющей последовательность, выбранную из LDF и SEQ ID NO:27-33; (d) VL-CDR1, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO:34-41; (e) VL-CDR2, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO:42-49; и (f) VL-CDR3, имеющей последовательность, выбранную из SEQ ID NO:50-57.

[0094] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к анти-GLUT4 антителу, или его фрагменту или производному, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L). В некоторых вариантах осуществления V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:10-17, VH-CDR2, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:18-25, и VH-CDR3, имеющую последовательность, выбранную из LDF и SEQ ID NO:27-33; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:34-41, VL-CDR2, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:42-49, и VL-CDR3, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:50-57.

[0095] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:18, и VH-CDR3, имеющую последовательность LDF; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:34, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:42, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:50.

[0096] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:19, и VH-CDR3, имеющую последовательность приведенную в SEQ ID NO:27; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:35, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:43, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:51.

[0097] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:12, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20, и VH-CDR3, имеющую последовательность приведенную в SEQ ID NO:28; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:36, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:44, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:52.

[0098] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:13, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:21, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:29; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:37, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:45, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:53.

[0099] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:14, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:22, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:30; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:38, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:46, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:54.

[0100] В некоторых вариантах осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:15, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:23, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:31; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:39, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:47, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:55.

[0101] В другом варианте осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:16, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:24, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:32; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:40, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:48, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:56.

[0102] В еще одном варианте осуществления изобретения V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:17, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:25, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:33; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:41, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:49, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:57.

[0103] В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут присутствовать в одной или нескольких CDR без существенного снижения способности антитела связывать антиген. Например, в CDR могут быть внесены консервативные изменения (например, консервативные замены, предусмотренные в настоящем документе), которые существенно не снижают аффинность связывания. В некоторых вариантах осуществления каждая представленная выше CDR либо не изменена, либо содержит одну, две, три или четыре аминокислотные замены.

[0104] В некоторых вариантах осуществления анти-GLUT4 антитело, или его фрагмент или производное дополнительно содержит CDR по предшествующим абзацам в этом разделе, и последовательность каркасных областей, имеющую идентичность по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% с каркасной последовательностью иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления каждая из каркасной области 1 (FR1), каркасной области 2 (FR2), каркасной области 3 (FR3) и каркасной области 4 (FR4) имеет по меньшей мере 90% идентичности или по меньшей мере 95% идентичности соответствующей последовательности FR1, FR2, FR3 или FR4 человека.

[0105] Антитело, описанное выше, которое связывает пептид GLUT4 человека с аминокислотной последовательностью GRQGPEGPSSI (SEQ ID NO:2), можно использовать для доставки полезной нагрузки, как описано в любом из вариантов осуществления, подробно описанных в настоящем документе.

Иллюстративные варианты осуществления

[0106] Иллюстративные варианты осуществления включают, но не ограничиваются, следующее:

[0107] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело, или его фрагмент или производное, которое специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 («GLUT4»), и терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную с антителом, или его фрагментом или производным. В одном варианте осуществления антитело, или его фрагмент или производное, специфично связывается с доменом первой внеклеточной петли GLUT4. В некоторых аспектах домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью INAPQKVIEQSYNETWLGRQGPEGPSSIPPGTLTTL (SEQ ID NO:1). В одном аспекте домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью GRQGPEGPSSI (SEQ ID NO:2). В некоторых аспектах антитело, или его фрагмент или производное, специфично связывается с субдоменом первого внеклеточного домена GLUT4, который содержит аминокислотную последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью GRQGPGGPDSI (SEQ ID NO:4). В одном аспекте, антитело, или его фрагмент или производное, специфично связывается с субдоменом первого внеклеточного домена GLUT4, который содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью GRQGPEGPSSI (SEQ ID NO:2).

[0108] В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте фрагмент антитела или производное антитела представляет собой или содержит одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело. В некоторых аспектах одноцепочечное антитело может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab).

[0109] В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент или производное биотинилировано.

[0110] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, белок или пептид, липид, низкомолекулярный фармацевтический препарат или радиоизотоп. В одном варианте осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота выбрана из ДНК, мРНК, киРНК и кшРНК. В одном варианте осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота содержит открытую рамку считывания, функционально связанную с промоторной последовательностью. В одном варианте осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту в линейной форме, нуклеиновую кислоту в плазмидной форме или нуклеиновую кислоту в форме миникольца.

[0111] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой. В одном аспекте гистоновый белок или по меньшей мере часть множества гистоновых белков биотинилирована.

[0112] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит липосому, связанную с нуклеиновой кислотой. В одном аспекте липосома содержит один или несколько липидов, выбранных из DC-холестерин HCl,3b-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карамоил]холестерин гидрохлорида («DC-Chol»), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина («DOPE»), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмония («DOTMA»), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмонийпропана («DOTAP»), диметилдиоктадециламмоний бромида («DDAB»), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана («DMTAP»), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана («DODAP»), гемисукцинатхолестерина («CHEMS») и холестерина («CHOL»), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия («DOSPA»), диоктадециламидоглицилспермина («DOGS»), диолеоилфосфатидилхолина («DOPC») и т.п. В одном аспекте осуществления липосома дополнительно содержит полиэтиленгликоль («PEG»).

[0113] В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит множество катионных пептидных фрагментов, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота. В одном варианте осуществления катионные пептидные фрагменты представляют собой или содержат поли-L-лизин («PLL»), линейный полиэтиленимин («LPEI»), разветвленный полиэтиленимин («BPEI»), хитозан, спермидин и спермин, полиамидоамин («PAMAM»), поли(2-диметиламиноэтилметакрилат) («PDMAEMA»), поли(бета-аминоэфир)ы («PBAE»), поли{N-[N-(2-аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид («PAsp(DET)»), поли(2-аминоэтилэтиленфосфат («PPEEA») и т.п. В одном аспекте по меньшей мере часть множества катионных пептидных фрагментов является биотинилированной.

[0114] В некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит альбумин. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть альбумина биотинилирована.

[0115] В некоторых вариантах осуществления антитело, или его фрагмент или производное биотинилировано, и композиция дополнительно содержит нейтравидин.

[0116] В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанную с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент. В одном варианте осуществления белок дистрофин представляет собой по существу полноразмерный белок дистрофин человека. В одном аспекте полноразмерный белок дистрофин человека имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5.

[0117] Изобретение дополнительно относится к способу таргетинга терапевтической полезной нагрузки для доставки в клетку, которая экспрессирует GLUT4, причем способ включает контакт клетки с композицией. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает контакт клетки с инсулином перед контактом клетки с композицией. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы, клетку гладкой мускулатуры, клетку жировой ткани, клетку гиппокампа или клетку мозжечка. В одном аспекте клетка представляет собой клетку меланомы, клетку рака предстательной железы, раковую клетку мышечной ткани, такую как клетка рабдомиосаркомы, или клетку рака молочной железы.

[0118] В другом аспекте настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей: антитело, или его фрагмент или производное, которое специфично связывается с белком-переносчиком глюкозы 4 («GLUT4»), и терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную с антителом, или его фрагментом или производным, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанной с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или представляет собой генетического носителя мышечной дистрофии Дюшенна («DMD») или мышечную дистрофию Беккера («BMD»).

[0119] В некоторых вариантах осуществления антитело, или его фрагмент или производное, используемое в способе лечения заболевания или состояния, описанного в предыдущих двух абзацах, специфично связывается с доменом первой внеклеточной петли GLUT4. В одном из вариантов осуществления изобретения домен первой внеклеточной петли GLUT4 содержит аминокислотную последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью INAPQKVIEQSYNETWLGRQGPEGPSSIPPGTLTTL (SEQ ID NO:1). В некоторых аспектах антитело, или его фрагмент или производное, специфично связывается с субдоменом первого внеклеточного домена GLUT4, который содержит последовательность с идентичностью по меньшей мере 80% с последовательностью GRQGPEGPSSI (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте осуществления изобретения фрагмент антитела или производное антитела представляет собой или содержит одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело. В некоторых аспектах одноцепочечное антитело может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab). В некоторых вариантах осуществления антитело, или его фрагмент или производное, биотинилировано. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота находится в линейной форме, плазмидной форме или миникольцевой форме. В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой. В одном аспекте гистоновый белок или по меньшей мере часть множества гистоновых белков биотинилированы. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит липосому, связанную с нуклеиновой кислотой. В одном варианте осуществления липосома содержит один или несколько липидов, выбранных из DC-холестерин HCl,3b-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карамоил]холестерин гидрохлорида («DC-Chol»), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина («DOPE»), 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмония («DOTMA»), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмонийпропана («DOTAP»), диметилдиоктадециламмоний бромида («DDAB»), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана («DMTAP»), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана («DODAP»), гемисукцинатхолестерина («CHEMS») и холестерина («CHOL»), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия («DOSPA»), диоктадециламидоглицилспермина («DOGS»), диолеоилфосфатидилхолина («DOPC») и т.п. В одном аспекте осуществления липосома дополнительно содержит полиэтиленгликоль («PEG»). В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит множество катионных пептидных фрагментов, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота. В одном варианте осуществления катионные пептидные фрагменты представляют собой или содержат поли-L-лизин («PLL»), линейный полиэтиленимин («LPEI»), разветвленный полиэтиленимин («BPEI»), хитозан, спермидин и спермин, полиамидоамин («PAMAM»), поли(2-диметиламиноэтилметакрилат) («PDMAEMA»), поли(бета-аминоэфир)ы («PBAE»), поли{N-[N-(2-аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид («PAsp(DET)»), поли(2-аминоэтилэтиленфосфат («PPEEA») и т.п. В одном аспекте по меньшей мере часть множества катионных пептидных фрагментов является биотинилированной. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит альбумин. В одном варианте осуществления по меньшей мере часть альбумина биотинилирована. В некоторых вариантах осуществления антитело, или его фрагмент или производное, биотинилировано, и композиция дополнительно содержит нейтравидин. В некоторых вариантах осуществления кодируемый белок дистрофин представляет собой по существу полноразмерный белок дистрофин человека. В одном варианте осуществления полноразмерный белок дистрофин человека имеет аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с последовательностью (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

[0120] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к анти-GLUT4 антителу, или его фрагменту или производному, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L), где: (а) V_H содержит CDR1, содержащую последовательность (D/E)Y(S/T)(I/M)H, CDR2, содержащую последовательность WINTE(S/T)G(D/E)X₁(T/S)YADDFKG, и CDR3, содержащую последовательность RX₂X₃Y; и (b) V_L содержит CDR1, содержащую последовательность (R/K)(A/S)SQS(L/V)X₄X₅(N/S), CDR2, содержащую последовательность (V/A)SNR(F/Y)(S/T), и CDR3, содержащую последовательность QDX₆X₇X₈PT. В некоторых вариантах осуществления X₁ представляет собой P или T; X₂ представляет собой A, F, S или G; X₃ представляет собой A, D, E или G; X₄ представляет собой S, V, N или Т; X₅ представляет собой N, H, R, K или T; X₆ представляет собой R, Y, S, T или K; X₇ представляет собой H, N, E, T, Y или S; или X₈ представляет собой V, S, L или I.

[0121] В еще одном аспекте настоящее изобретение включает анти-GLUT4 антитело, или его фрагмент или производное, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L), где: (а) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:10-17, VH-CDR2, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:18-25, и VH-CDR3, имеющую последовательность, выбранную из LDF и SEQ ID NO:27-33; и (b) V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:34-41, VL-CDR2, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:42-49, и VL-CDR3, имеющую последовательность, выбранную из SEQ ID NO:50-57.

[0122] В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-GLUT4 антитело или его фрагмент или производное, содержит вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L), где: (а) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:18, и VH-CDR3, имеющую последовательность LDF; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:34, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:42, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:50; (b) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:19, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:27, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:35, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:43, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 51; (c) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:12, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:28, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:36, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:44, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:52; (d) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:13, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:21, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:29, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:37, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:45, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:53; (e) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:14, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:22, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:30, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:38, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:46, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:54; (f) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:15, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:23, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:31; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:39, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:47, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:55; (g) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:16, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:24, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:32, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:40, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:48, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:56; или (h) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:17, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:25, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:33, и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:41, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:49, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:57.

[0123] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к композиции, содержащей антитело, или его фрагмент или производное по любому из вариантов осуществления, описанных выше в трех предыдущих абзацах, и терапевтическую полезную нагрузку, конъюгированную с антителом, или его фрагментом или производным. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела или производное антитела представляет собой или содержит одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело. В некоторых аспектах одноцепочечное антитело может представлять собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab). В одном аспекте одноцепочечное антитело представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, белок или пептид, липид, низкомолекулярный фармацевтический препарат или радиоизотоп. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота выбрана из ДНК, мРНК, киРНК и кшРНК. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, где нуклеиновая кислота содержит открытую рамку считывания, функционально связанную с промоторной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту в линейной форме, нуклеиновую кислоту в плазмидной форме или нуклеиновую кислоту в миникольцевой форме. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит липосому, связанную с нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит множество катионных пептидных фрагментов, ассоциированных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанную с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент. В одном варианте осуществления белок дистрофин представляет собой по существу полноразмерный белок дистрофин человека, имеющий аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности по меньшей мере 80% с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:5.

[0124] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу таргетинга терапевтической полезной нагрузки для доставки в клетку, которая экспрессирует GLUT44, причем способ включает контакт клетки с композицией, содержащей анти-GLUT4 антитело, или его фрагмент или производное, описанные в предыдущем абзаце. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает контакт клетки с инсулином перед контактом клетки с композицией. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы, клетку гладкой мускулатуры, клетку жировой ткани, клетку гиппокампа или клетку мозжечка. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку меланомы, клетку рака предстательной железы, раковую клетку мышечной ткани, такую как клетка рабдомиосаркомы, или клетку рака молочной железы. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

[0125] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин, включающему в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело по любому из вышеуказанных вариантов осуществления. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или представляет собой генетического носителя мышечной дистрофии Дюшенна («DMD») или мышечной дистрофии Беккера(«BMD»). В некоторых вариантах осуществления кодируемый белок дистрофин имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80% с SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

Общие определения

[0126] Если специально не указано в данном документе, все термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, что и для специалистов в данной области. Для определений и терминов в данной области практикующие специалисты могут обратиться к Ausubel, F.M., et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (2010), Coligan, J.E., et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York (2010), Mirzaei, H. and Carrasco, M. (eds.), Modern Proteomics - Sample Preparation, Analysis and Practical Applications in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer International Publishing, 2016, и Comai, L, et al., (eds.), Proteomic: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology, Springer International Publishing, 2017.

[0127] Для удобства, некоторые термины, используемые в этом описании и/или формуле изобретения, представлены в данном документе. Определения приведены для помощи в описании конкретных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения заявленного изобретения, поскольку объем изобретения ограничен только формулой изобретения.

[0128] Использование термина «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если явно не указано, что он относится к только альтернативам, или альтернативные варианты являются взаимоисключающими, хотя изобретение поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или».

[0129] Слова в единственном числе при использовании в сочетании со словом «содержащий» в формуле изобретения или в описании означают один или несколько, если специально не указано иное.

[0130] Если контекст явно не требует иного, во всем описании и формуле изобретения, слова «содержать», «содержащий» и т.п. должны быть истолкованы во включительном смысле, в отличие от исключающего или исчерпывающего смысла, что должно означать «включающий, но не ограниченный этим». Слова, используемые в единственном или множественном числе, также включают множественное и единственное число, соответственно. Слово «примерно» указывает число в диапазоне минорного изменения выше или ниже установленного эталонного числа. Например, в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% выше или ниже указанного эталонного числа.

[0131] В настоящем документе термин «полипептид» или «белок» относится к полимеру, в котором мономеры представляют собой аминокислотные остатки, которые соединены вместе амидные связи. Когда аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, можно использовать либо L-оптический изомер, либо D-оптический изомер, причем L-изомеры являются предпочтительными. Термин полипептид или белок, используемый в настоящем документе, охватывает любую аминокислотную последовательность и включает модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Термин «полипептид» конкретно предназначен для охвата встречающихся в природе белков, а также тех, которые получены рекомбинантно или синтетически.

[0132] Специалисту понятно, что отдельные замены, делеции или добавления в пептиде, полипептиде или белковой последовательности, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или часть аминокислот в последовательности, являются «консервативно модифицированным вариантом», где изменение приводит к замене аминокислоты химически подобной аминокислотой. Консервативные аминокислотные замены, обеспечивающие функционально аналогичные аминокислоты, хорошо известны специалисту в данной области. Следующие шесть групп являются примерами аминокислот, которые считаются консервативными заменами друг для друга:

(1) аланин (А), серин (S), треонин (Т),

(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (Е),

(3) аспарагин (N), глутамин (Q),

(4) аргинин (R), лизин (K),

(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V), и

(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).

[0133] Ссылка на идентичность последовательностей указывает степень схожести двух полимерных последовательностей, таких как белковые последовательности. Определение идентичности последовательностей может быть легко осуществлено специалистами в данной области с использованием принятых алгоритмов и/или методик. Идентичность последовательностей обычно определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть последовательности пептида или полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (например, разрывы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичный аминокислотный остаток или нуклеотидное основание встречаются в обеих последовательностях, получая количество совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Для осуществления таких сравнений легко доступны различные выполняемые в программах алгоритмы, такие как BLAST N или BLAST P.

[0134] Раскрыты материалы, композиции и компоненты, которые могут быть использованы для, могут быть использованы в сочетании с, могут быть использованы в приготовлении для, или представляют собой продукты раскрытых способов и композиций. Понятно, что, когда комбинации, подмножества, взаимодействия, группы и т.д. из этих материалов раскрыты, то специально предполагается каждая из различных индивидуальных и сборных комбинаций, даже несмотря на то, что конкретные ссылки на каждую и все одиночную комбинацию и перестановку этих соединений могут быть явно не раскрыты. Эта концепция применяется ко всем аспектам этого изобретения, включая, но не ограничиваясь этим, стадии в описанных способах. Таким образом, конкретные элементы любых вышеуказанных вариантов осуществления могут быть объединены или замещенны на элементы в других вариантах осуществления. Например, если существует множество дополнительных стадий, которые могут быть выполнены, следует понимать, что каждая из этих дополнительных стадий может быть выполнена с помощью любых конкретных стадий способа или комбинации стадий способа раскрытых способов, и что каждая такая комбинация или выборка комбинаций конкретно предусмотрена и должна рассматриваться как раскрытая. Кроме того, понятно, что варианты осуществления, описанные в данном документе, могут быть реализованы с использованием любого подходящего материала, такого как те, которые описаны в другом месте в данном документе или известные в данной области техники.

[0135] Публикации, цитируемые в данном документе, и предмет изобретения, из-за которого они указаны, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.

ПРИМЕРЫ

[0136] Ниже приведено описание ряда иллюстративных анализов, проводимых на репрезентативных вариантах осуществления композиций мышечно-специфичной векторной платформы для определения полезности конструкции платформы в отношении эффективной доставки терапевтических полезных нагрузок в мышечные и другие ткани.

Введение

[0137] В невирусной векторной платформе по изобретению используется анти-GLUT4 антитело (или другие связывающие агенты (например, фрагмент антитела, пептиды, рецепторы и т.д.)), способное специфично связывать внеклеточный домен GLUT4. Первая внеклеточная петля является наиболее крупной, наиболее доступной и, вероятно, иммуногенной областью для внеклеточного таргетинга GLUT4. Этот домен содержит аминокислоты 45-80 в последовательности GLUT4 мыши: inapqkvieqsynatwlgrqgpggpdsipqgtlttl (SEQ ID NO: 3). Антитела получали против пептида с аминокислотами 61-72 в данной последовательности: grqgpggpdsi (SEQ ID NO: 4). Аналогичная область в последовательности белка человека, grqgpegpssi (SEQ ID NO: 2) имеет 83,3% гомологии с последовательностью мышиного белка. Предсказано, что эта последовательность не имеет какой-либо вторичной структуры и гипотетически была предложена для получения антител, которые могли связываться с этим доменом нативного белка GLUT4.

[0138] С использованием этой платформы, анти-GLUT4 антитело (или его фрагмент) может быть затем конъюгировано с терапевтическим геном или другим лекарственным средством с использованием широкого спектра материалов, таких как белки, пептиды, липиды, липосомы и т.д., для инкапсулирования терапевтического агента, оптимизации его стабильности и биодоступности in vivo, и усиления исключения из эндосомальной утилизации и доставки в ядро (для нуклеиновых кислот) после проникновения в клетку-мишень. Как продемонстрировано в нижеследующих экспериментах, размер ДНК не является ограничивающим фактором, предоставляя возможность доставки больших генов, таких как полноразмерный дистрофин (приблизительно 14 т.п.о.), и также использования сильных мышечноспецифичных промоторов для активации экспрессии гена.

Эксперименты на культуре клеток in vitro

[0139] Для начальных экспериментов по культивированию клеток in vitro использовали систему биотин-нейтравидин для конъюгации нацеливающего антитела с катионной липосомой, содержащей терапевтическую плазмиду. Этот вариант осуществления векторной платформы для экспериментов in vitro показан схематически на фиг. 3. Сначала, плазмиду смешивают с гистоном H1 (H-H1), часть которого биотинилирована. H-H1 представляет собой положительно заряженный ядерный белок, который связывается с отрицательно заряженной ДНК и частично конденсирует ее. Далее, добавляют биотинилированное анти-GLUT4 антитело, которое также биотинилировано. После чего, негликозилированный авидидин (дегликозилированный авидидин), высокоспецифичный биотинсвязывающий белок с минимальным неспецифичным связыванием по сравнению с авидином, добавляют для связывания биотинилированных белков. Далее, белки и ДНК смешивают с катионными липосомами, содержащими два липида, DC-Chol(DC-холестерин HCl,3b-[N-(N’,N’-диметиламиноэтан)-карамоил] холестерина гидрохлорид) и DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин). Молярное соотношение DC-Chol:DOPE составляет 30:70. Каждая из четырех стадий инкубации, описанных выше, проводится при комнатной температуре в течение 30 минут.

[0140] В первоначальных экспериментах для доказательства концепции, эту конъюгированную структуру оценивали по тому, может ли она проникать в мышечные клетки in vitro, и экспрессируется ли в клетках белок, кодируемый плазмидой ДНК. В этих экспериментах использовали коммерчески доступную клеточную линию крысиных миобластов (L6-GLUT4myc), которая сверхэкспрессирует GLUT4, содержащий myc-тэг (аминокислотную последовательность AEEQKLISEEDLLK; SEQ ID NO: 9), вставленную в первую внеклеточную петлю между аминокислотами 66 и 67. Для начальных экспериментов с использованием этой клеточной линии биотинилировали коммерческое антитело, которое специфично связывается с myc-тэгом.

Эксперимент 1

[0141] Клетки L6-GLUT4myc в 6-луночных планшетах трансфицировали структурой, показанной на фиг. 3. В этом эксперименте использовали плазмиду, содержащую модифицированную конструкцию нейронной синтазы оксида азота (NOS-M), которая включает С-концевой НА-тэг для обнаружения и последовательность пальмитоилирования RAS для таргетинга на плазматическую мембрану (Rebolledo DL, et al. (2016). Sarcolemmal targeting of nNOSmu improves contractile function of mdx muscle. Hum Mol Genet 25, 158-166). Эта плазмида управляется промотором скелетного актина человека (HSA) и имеет длину приблизительно 11 т.п.о. В этом эксперименте для каждой лунки использовали 10 мкг плазмиды NOS-М. Основные задачи этого эксперимента заключались в проверке того, достаточной для связывания антитела с GLUT4myc, и определения того, может ли степень связывания усиливаться инсулином. После инкубации клетки промывали и затем собирали через 3 дня для анализа экспрессии nNOS и НА-тэга методом Вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 4, как минимум 15-минутная инкубация была достаточной для получения экспрессии nNOS и HA, а уровни белка после инкубации в течение 30 и 40 мин были одинаковыми. Важно отметить, что для каждого временного интервала 100 нМ инсулин заметно увеличивал экспрессию белка, что указывает на то, что связывание и проникновение структуры в клетку зависело от перемещения GLUT4 из цитозоля на мембрану.

Эксперимент 2

[0142] Для второго эксперимента были поставлены две основные задачи. Первая задача заключалась в исследовании влияния различного количества плазмидной ДНК на поглощение клеткой и экспрессию. Второй задачей являлось определение оптимального количества ДНК относительно липосом, определяемого соотношением DC-Chol к ДНК (мас./мас.). Как показано на фиг. 5, из всех концентраций ДНК, соотношение DC-Chol и ДНК, равное 2,0, давало самую высокую экспрессию nNOS в соответствии с предшествующими исследованиями. В пересчете на ДНК, 5 мкг было достаточным для получения высокой экспрессии nNOS, тогда как уровень экспрессии снижался при 20 мкг, в частности, из-за более высокого соотношения DC-Chol и ДНК. Таким образом, в будущих экспериментах на клеточных культурах использовали от 5 до 10 мкг ДНК при соотношении DC-Chol и ДНК 2,0.

Эксперимент 3

[0143] В этом эксперименте миобласты L6-GLUT4myc инкубировали с той же структурой, показанной на фиг. 3, за исключением того, что плазмида NOS-M была заменена полноразмерной плазмидой, кодирующей дистрофин. Эта конструкция находится под контролем широко известного промотора CAG и имеет приблизительно 20 т.п.о. в длину (Farruggio AP, et al. (2017), Biotechnol J 12(4), 1600477). Двумя основными задачами этого эксперимента были: (1) проверка того, может ли очень большой ген дистрофина проникать в целевую мышечную клетку и экспрессироваться с использованием этой нацеливающей платформы, и (2) проверка эффекта широкого диапазона концентраций инсулина на таргетинг и инициацию экспрессии в мышечных клетках. Диапазон инсулина начинался с низкого уровня, соответствующего уровню в крови человека. В этом эксперименте клетки инкубировали с вектором в течение 15 мин, промывали и затем собирали через 3 дня. Как показано на фиг. 6, полноразмерный дистрофин экспрессировался на высоком уровне, и уровень дистрофина был выше в клетках, обработанных инсулином. Важно отметить, что при низких концентрациях инсулина, обычно присутствующих в крови человека (0,5 и 1,0 нМ), происходит увеличение экспрессии дистрофина по сравнению с клетками без инсулина. Эти результаты поддерживают гипотезу от том, что усиление или индукция транслокации GLUT4 к плазматической мембране инсулином приводит к большему связыванию и поглощению платформы и последующей экспрессии дистрофина.

Эксперимент 4

[0144] Были получены как поликлональные, так и мышиные моноклональные антитела против пептидной последовательности (GRQGPGGPDSI; SEQ ID NO:4), взятой из первого внеклеточной петли мышиного GLUT4. Эти антитела хорошо связываются с пептидом в анализе ELISA. См. например, таблицу 1, в которой приведены результаты тестов ELISA для 20 отобранных мышиных моноклональных антител.

[0145] Таблица 1. Данные анализа ELISA, показывающие уровни поглощения при различных разведениях для 20 мышиных моноклональных антител против пептидной последовательности GRQGPGGPDSI (SEQ ID NO:4). Все клеточные линии, продуцирующие антитела, хорошо связываются с пептидом.

Клеточные линии mAb Разведение клеточных супернатантов Отрицательный контроль Титр 1:10 1:30 1:90 1:270 1:810 1,2,430 1B12-1 2,807 2,792 2,417 2,115 1,504 0,746 0,065 >1:2,430 1B12-2 2,761 2,568 2,129 1,604 0,846 0,389 0,065 1:2,430 18B2-1 2,778 2,682 2,338 2,053 1,520 0,864 0,065 >1:2,430 18B2-2 2,829 2,718 2,380 2,187 1,665 0,986 0,065 >1:2,430 21E5-1 2,618 2,344 1,778 1,194 0,678 0,314 0,065 1:2,430 21E5-2 2,706 2,472 2,050 1,632 1,018 0,474 0,065 1:2,430 22F6-1 2,628 2,279 1,736 1,071 0,561 0,246 0,065 1:2,430 22F6-2 2,650 2,462 2,101 1,620 1,079 0,485 0,065 1:2,430 24B4-1 2,473 2,349 2,034 1,474 0,846 0,409 0,065 1:2,430 24B4-2 2,512 2,403 2,171 1,701 1,050 0,531 0,065 >1:2,430 25D4-1 2,754 2,613 2,279 1,794 1,081 0,568 0,065 >1:2,430 25D4-2 2,704 2,661 2,435 1,876 1,193 0,661 0,065 >1:2,430 25H4-1 2,710 2,680 2,469 1,933 1,353 0,758 0,065 >1:2,430 25H4-2 2,669 2,653 2,412 1,891 1,220 0,701 0,065 >1:2,430 26A7-1 2,425 2,378 2,051 1,489 0,887 0,412 0,065 1:2,430 26A7-2 2,611 2,464 2,131 1 536 0,879 0,438 0,065 1:2,430 29C10-1 2,660 2,453 2,089 1,661 0,991 0,468 0,065 1:2,430 29C10-2 2,716 2,482 2,030 1,530 0,876 0,417 0,065 1:2,430 30F8-1 2,776 2,708 2,491 1,967 1,266 0,699 0,065 >1:2,430 30F8-2 2,777 2,696 2,356 1,802 1,139 0,590 0,065 >1:2,430

[0146] В этом эксперименте поликлональные кроличьи антитела сначала очищали с помощью аффинной очистки на пептиде. Далее проверяли способность антител связываться с нативным GLUT4 и опосредовать поглощение полноразмерного дистрофина мышечными клетками, отрицательными по дистрофину (mdx-H2N) (Morgan et al., 1994). Несмотря на то, что эти клетки экспрессируют некоторое количество эндогенного GLUT4, было желательно определить, будет ли увеличение экспрессии GLUT4 дополнительно улучшать поглощение и экспрессию вектора по изобретению. Поэтому, клетки mdx-H2K трансфицировали плазмидой, содержащей ген GLUT4 мыши (mdx-H2K-GLUT4), и с помощью антибактериального отбора была получена поликлональная клеточная линия, которая имеет уровень экспрессии GLUT4 выше примерно в два-три раза. С использованием этих дистрофин-отрицательных клеток было желательно оценить, приводит ли повышенная экспрессия GLUT4 к большему связыванию и поглощению невирусной векторной платформы, и, следовательно, к усилению экспрессии дистрофина.

[0147] Другая основная задача этого эксперимента заключалась в проверке того, может ли альбумин повышать экспрессию гена. Основой для этой гипотезы послужили недавние данные о том, что покрытие ДНК/липосомальных векторов сывороточным альбумином человека может усиливать экспрессию репортерного белка люциферазы в клетках легких и селезенки мышей. Поскольку альбумин отрицательно заряжен при нейтральном рН, он может связываться с положительно заряженными липосомами, вместе с плазмидной ДНК. Результаты этого эксперимента выявляют ряд важных фактов (фиг. 7). Во-первых, экспрессия полноразмерного дистрофина была определена и измерена, указывая на то, что поликлональные антитела кролика были способны эффективно связываться с GLUT4 и доставлять плазмиду внутрь мышечных клеток в ядро. Во-вторых, экспрессия дистрофина была значительно выше в клетках mdx-H2K-GLUT4 по сравнению с обычными клетками mdx-H2K. В-третьих, увеличение концентраций альбумина повышает экспрессию дистрофина в обеих мышечных клеточных линиях.

Эксперименты in vivo

[0148] ДНК/липосомные векторы для введения in vivo могут иметь потенциальные проблемы вследствие относительно больших размеров этих структур (обычно≥200 нм). Таким образом, была разработана нелипосомальная альтернативная структура (фиг. 8) для улучшения применения in vivo. При этом плазмидная ДНК в высокой степени конденсируется положительно заряженным поли-L-лизином (PLL) в структуры, которые могут иметь диаметр от 30 до 60 нм для плазмиды 20 т.п.о. (Fink TL, et al. (2006)). Размер плазмиды до 20 т.п.о. не ограничивает эффективный перенос генов в клетках легких in vivo с использованием упакованных наночастиц ДНК. Gene Ther 13, 1048-1051). PLL является биотинилированным, что дает возможность последующего связывания с нейтравидином. Затем добавляют биотинилированное мышиное моноклональное анти-GLUT4 антитело.

[0149] Наконец, добавляют биотинилированный рекомбинантный сывороточный альбумин человека. Утверждается, что альбумин способствует in vivo введению этой структуры по ряду причин. (1) Альбумин пересекает плотный эндотелиальный барьер мышечных капилляров за счет трансцитоза. Это обеспечивает механизм для перемещения альбумина и, следовательно, невирусной векторной платформы по изобретению из кровотока в мышечное внеклеточное пространство. (2) Известно, что альбумин предпочтительно накапливается во внеклеточном пространстве скелетных и сердечных мышц. (3) Альбумин может входить в мышечные клетки за счет эндоцитоза. Это может иметь особое значение в дистрофических мышцах, которые имеют повышенную проницаемость мембраны и накапливают альбумин внутриклеточно. (4) Было показано, что альбумин способствует усилению исключения из эндосомальной утилизации и доставке в ядро плазмидной ДНК. (5) Альбумин является очень стабильным и имеет длительный период полужизни in vivo 19 дней. (6) Альбумин с очень низкой вероятностью будет вызывать любые побочные эффекты или иммунные ответы, учитывая, что он является распространенным сывороточным белком. Это позволит осуществлять многократное введение терапевтической полезной нагрузки через невирусную векторную платформу.

Эксперимент 5

[0150] В этом первом эксперименте in vivo внутримышечные (в/м) инъекции сначала выполняли с использованием структуры, показанной на фиг. 8, без анти-GLUT4 антитела для определения фонового эффекта невирусной векторной платформы без нацеливающего антитела. Инъекции проводили в две мышцы (переднюю большеберцовую и икроножную мышцы) одной конечности 8-недельных мышей mdx, общепринятой животной модели DMD. Структура содержала плазмиду NOS-M, описанную в эксперименте 1. Интересно, что через три дня, как передняя большеберцовая, так и икроножная мышцы экспрессировали NOS-M, как было показано как с помощью антител к nNOS, так и с помощью антител к НА-тэгу (фиг. 9А-В). Предположительно, более проницаемые мышечные волокна у mdx-мышей позволяют некоторое поглощение альбумин-содержащей структуры. По сравнению с получившими инъекции mdx-мышами, не получившие инъекций mdx-мыши, имели эндогенную экспрессию nNOS, но не имели экспрессии НА-тэга. Не получавшая инъекций мышь дикого типа (WT) имела более высокую эндогенную экспрессию nNOS, чем mdx-мышь, но также не имела экспрессию НА-тэга. Другое очень интересное открытие состоит в том, что для обеих мышц, но, в особенности, для передней большеберцовой мышцы, наблюдалась экспрессия NOS-M (НА-тэг) как в получившей инъекцию, так и в не получившей инъекцию конечности (см. фиг. 9A-B). Это указывает на то, что структура способна выйти в системный кровоток из получивших инъекцию мышц, а затем проникнуть в не получавшие инъекцию мышцы другой конечности.

Эксперимент 6

[0151] В следующем эксперименте была проверена гипотеза о том, что конъюгация моноклональных мышиных анти-GLUT4 антител со структурой будет значительно усиливать проникновение платформы по изобретению в мышцы mdx-мышей. Сначала были получены и очищены два мышиных моноклональных антитела. Корректную молекулярную массу и чистоту антител проверяли в восстановительных и невосстановительных условиях с помощью окрашивания Кумасси полиакриламидного геля (фиг. 10А). Затем проверяли аффинность связывания каждого антитела in vitro с использованием линии мышечных клеток mdx-H2K-GLUT4. Конкретно, клетки инкубировали с каждым антителом при различных разведениях (от исходной концентрации1 мг/мл) в течение 20 мин при 37°С с или без 100 нМ инсулина. Клетки промывали, инкубировали с вторичным меченным HRP антителом и снова промывали. Колориметрический анализ использовали для количественного определения относительного количества связанного антитела с нативным белком GLUT4 путем измерения поглощения с помощью спектрофотометра. Как показано на фиг. 10В, оба антитела, Клон 1 и Клон 2, связывались с нативным белком GLUT4 дозозависимым образом. Во всех разведениях Клон 2 имел более высокое поглощение, чем Клон 1. Важно, что для обоих антител инсулин (100 нМ) увеличивал поглощение (см. фиг. 10В), что указывает на большее связывание, когда большее количество GLUT4 переносится в плазматическую мембрану посредством инсулинового сигнального пути.

[0152] Далее антитело Клона 2 биотинилировали и встраивали в невирусную векторную платформу путем связывания с нейтравидином. В качестве контроля использовали также невирусную векторную платформу без антитела (описанную в эксперименте 5). Двум mdx-мышей вводили с помощью в/м инъекции невирусную векторную платформу с или без конъюгированного антитела. Аналогично, инъекции проводили в переднюю большеберцовую и икроножную мышцы одной конечности. Через шесть дней после инъекций мышцы собирали и использовали для Вестерн-блот-анализа. Как показано на фиг. 11, уровень экспрессии nNOS, измеренный по НА-тэгу, был значительно (в несколько раз) выше как в передней большеберцовой, так и в икроножной мышцах мыши, получившей инъекцию платформы, содержащей mAb Клона 1. Эти данные свидетельствуют о том, что анти-GLUT4 антитело сильно повышает таргетинг и проникновению невирусной векторной платформы в скелетные мышцы.

Эксперимент 7

[0153] Затем проверяли, может ли внутривенное (в/в) введение нацеливающей невирусной платформы привести к системной доставке и экспрессии в мышцах белков, кодирующих гены различных размеров. Для проверки этой гипотезы использовали три гена различного размера (эксперименты 7-9). В этом эксперименте использовали наименьший из этих генов. Этот ген представляет собой α-синтрофин, с размером плазмиды приблизительно 5,5 т.п.о. В этом эксперименте мышам mdx4CV вводили с помощью в/м или в/в инъекции невирусную платформу, описанную на фиг. 11, содержащую ген α-синтрофина, который имеет последовательность пальмитоилирования RAS на С-конце для таргетинга в сарколемму. Таргетинг α-синтропина в сарколемму в нормальной мышце происходит путем взаимодействия с дистрофином, отсутствующим в мышцах мышей mdx4CV. Как показано на фиг. 12, как в/м, так и в/в доставка приводит к значительному увеличению экспрессии α-синтропина в мышце через 12 дней после инъекции по сравнению с не получавший инъекцию контрольной мышцей, как подтверждено Вестерн-блоттингом (фиг. 12A) и иммуноокрашиванием (фиг.12В) поперечных срезов мышц.

Эксперимент 8

[0154] Вторым геном был выбран nNOS, как описано на фиг. 11, с размером плазмиды приблизительно 10,5 т.п.о. Вновь мышам mdx4CV снова проводили либо в/м, либо в/в инъекции. Конкретно, двум мышам вводили с помощью в/м инъекции в икроножную мышцу одной задней конечности, а двум мышам вводили с помощью в/в инъекции в ретроорбитальный синус. Как показано на фиг. 13А, экспрессия nNOS была значительно выше (приблизительно на 50%) в мышцах мышей после в/м и в/в инъекций по сравнению с не получавшей инъекции контрольной мышцей. В данном эксперименте также измеряли экспрессию утрофина (гомолога дистрофина) с помощью Вестерн-блоттинга, где было показано значительное увеличение у мышей, которым вводили с помощью инъекции конструкцию nNOS (см. фиг. 13A). В другом эксперименте исследовали влияние дозы плазмиды nNOS. Для этого mdx-мышам вводили в/в платформу, содержащую различные дозы плазмиды nNOS (20, 60 или 120 мкг). Как показано на фиг. 13, наблюдалось прогрессирующее увеличение экспрессии nNOS в передней большеберцовой мышце по мере увеличения дозы плазмиды nNOS, что было измерено как по экспрессии nNOS, так и НА-тэга.

Эксперимент 9

[0155] Используемый для проверки третий и наибольший исследуемый ген представлял собой полноразмерный мышиный дистрофин. При этом использовали две плазмидные конструкции, каждая из которых содержала полноразмерный дистрофин, но с различными промоторами и плазмидными каркасами. Первая конструкция содержала укороченный мышечноспецифичный промотор креатин-киназы 8 (CK8) (PMID: 21266958, PMID: 19298131). Эта конструкция имела размер 15,5 т.п.о. Вторая конструкция содержала повсеместно распространенный промотор цитомегаловируса (CMV). Эта конструкция имела размер 17,5 т.п.о. Как показано на фиг. 14, мыши mdx4CV, получившие в/в инъекцию CK8-конструкции, демонстировала экспрессию полноразмерного дистрофина в ряде мышц задних конечностей. Уровни экспрессии были намного выше, чем у не получавших инъекции мышей mdx4CV, образцы от которых имели слабые полосы на Вестерн-блоте из-за присутствия очень малого количества ревертантных волокон, которые экспрессируют дистрофин (PMID: 1635838). Кроме того, в этом эксперименте для Вестерн-блоттинга использовали обогащенный мембранами лизат мышц, который, вероятно, позволяет обнаружение даже очень низкого уровня дистрофина скелетных мышц из ревертантных волокон. Сравнение с мышью WT показало уровни дистрофина у получивших инъекции мышей в пределах от -0,2 до 0,5% для различных мышц. Далее мышам mdx4CV вводили с помощью в/в инъекции платформу, содержащую либо CK8-, либо CMV-конструкцию для измерения экспрессии дистрофина в сердце. Важно, что, как показано на фиг. 15, сердечные мышцы у получивших инъекцию мышей показали четкую экспрессию полноразмерного дистрофина по сравнению с не получавшим инъекции контролем. Уровень экспрессии дистрофина был выше с использованием CMV-конструкции по сравнению с CK8-конструкцией, при значениях от 0,1 до 0,2% от уровня белка у мыши WT. Взятые вместе, данные из экспериментов 8 и 9 показывают, что композиция невирусной платформы (см. фиг. 8), содержащая большой ген, такой как полноразмерный дистрофин, эффективно поглощается и экспрессируется как скелетными, так и сердечными мышцами.

Эксперимент 10

[0156] В этом эксперименте проводили анализ отслеживания частиц для определения распределения размеров частиц, полученных с использованием невирусной платформы по изобретению. В этом эксперименте композиция платформы (см. фиг. 8) содержала плазмиду для экспрессии полноразмерного дистрофина под контролем CK8-промотора. Анализ отслеживания частиц проводили с использованием стандартных процедур для NanoSight ns300 (Malvern Panalytical), что позволяет достоверно и быстро измерять распределение частиц по размеру в диапазоне от 0,01 до 1,0 мкм. Образец платформы разводили 1:100 деионизированной водой, и затем проводили 4 отдельных измерения распределения частиц по размерам. Как показано на фиг. 20, график распределения размера частиц указывает, что модальный (пиковый) размер частиц составлял 171 нм. В целом, средний размер частиц составлял 236 нм ±4,4 и. Анализ данных показал, что 50% частиц имели размер менее 213 нм, а 90% частиц имели размер менее 344 нм. Средний размер частиц по изобретению является очень сходным со средним размером частиц, содержащих нейтравидин и киРНК (237 нм), которые были эффективными для подавления экспрессии генов in vivo у мышей (PMID: 28026957). Таким образом, данные, представленные в этом эксперименте, показывают, что даже с крупной плазмидной ДНК, такой как плазмида, кодирующая полноразмерный дистрофин (15,5 т.п.о.), невирусная платформа образует мелкие частицы, которые могут эффективно поглощаться и экспрессироваться мышцами in vivo (см. фиг. 14 и 15).

Эксперимент 11

[0157] В этом эксперименте получали ряд моноклональных антител против GLUT4 и оценивали аффинность связывания каждого антитела. Мышиные моноклональные антитела против как пептида GLUT4 мыши (GRQGPGGPDSI; SEQ ID NO:4), так и пептида GLUT4 человека (GRQGPPGPSSI; SEQ ID NO: 2) были изготовлены в компании Genscript (NJ, USA). Было получено всего 14 уникальных клонов; 6 против последовательности GLUT4 мыши и 8 против последовательности GLUT4 человека. Каждую линию клеток гибридомы выращивали в культуре в течение нескольких недель, и моноклональные антитела очищали с использованием A/G-латексных шариков. Аффинность связывания каждого моноклонального антитела измеряли с помощью ELISA. Для антител против последовательности GLUT4 мыши ELISA-планшет покрывали пептидом (SEQ ID NO: 4). Для антител против последовательностей GLUT4 человека, рекомбинантный белок GLUT4 человека использовали для покрытия планшета для ELISA. В обоих случаях каждую лунку планшета для ELISA покрывали 100 нг антигена в течение ночи при 4°С после блокирования, моноклональные антитела добавляли на 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли вторичное конъюгированное с HRP анти-мышиное антитело на 1 ч при комнатной температуре. После дальнейшей промывки добавляли хромогенный субстрат для HRP (1-STEP™ Ultra TMB-ELISA substrate solution; Thermo Fisher Scientific) на 10-20 минут. Наконец, реакцию останавливали добавлением 2М серной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм на планшетном ридере. Как показано на фиг. 16, все 6 моноклональных антител демонстрировали зависимое от концентрации увеличение поглощения. Наилучшими связывающими клонами были 25D4, а затем 22F6 и 21Е5. Остальные три клона продемонстрировали аналогичные, более низкие кривые связывания (см. фиг. 16). Для моноклональных антител, специфичных к последовательности GLUT человека, использовали такой же способ, за исключением того, что планшет покрывали рекомбинантным белком GLUT4 человека. Как показано на фиг. 17, 7 моноклональных антител демонстрировали дозозависимое увеличение поглощения, причем клоны 5E3 и 8G2 имели наилучшую аффинность связывания, и клоны 2В9 и 4G2 показывали наиболее слабую аффинность связывания. Один клон, 15G2, невозможно было проанализировать из-за недостаточной продукции антител этой линией гибридомных клеток.

[0158] Для проверки того, могут ли антитела против мышиной последовательности связываться с белком GLUT4 человека, или наоборот, могут ли антитела против последовательности из белка человека связываться с последовательностью пептида GLUT4 мыши, были проведены два дополнительных анализа ELISA. Как показано на фиг. 18, два антитела, которые прочно связываются с последовательностью мыши (22F6 и 21Е5), не связываются эффективно с белком GLUT4 человека, в то время как антитела, полученные против последовательности пептида GLUT4 человека (5E3 и 8G2), показали сильное связывание. Как показано на фиг. 19, в обратном эксперименте антитела, полученные против последовательности GLUT4 человека, связывались с различной степенью аффинности с пептидом GLUT4 мыши (8G2 являлись наилучшими, тогда как 12Е11 не связывались), но все четверо этих антител связывались намного хуже, чем антитела, полученные против мышиной последовательности (22F6 и 21E5). Таким образом, несмотря на 83,3% гомологии между последовательностями мышиного и человеческого пептида, полученные антитела связываются значительно сильнее с видоспецифичной последовательностью GLUT4, против которой они были получены.

Эксперимент 12

[0159] Для каждого из полученных 14 уникальных моноклональных антител, 6 против последовательности GLUT4 мыши и 8 против последовательности GLUT4 человека, в компании GenScript (NJ, USA) были отсеквенированы вариабельные области тяжелой и легкой цепей следующим способом. Общую РНК выделяли из клеток гибридомы (с использованием реагента TRIzol®). Затем тотальную РНК обратно транскрибировали в кДНК, используя либо изотип-специфичные антисмысловые праймеры, либо универсальные праймеры (с помощью набора PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit). Фрагменты тяжелой цепи и легкой цепи антител амплифицировали по стандартной рабочей процедуре (SOP) быстрой амплификации концов кДНК (RACE) от GenScript. Амплифицированные фрагменты антител клонировали в стандартный вектор для клонирования по отдельности. ПЦР на колониях проводили для скрининга клонов со вставками правильного размера, и были получены последовательности для каждого антитела. В таблице 2 приведены определяющие комплементарность области (CDR) для тяжелой и легкой цепей для 6 моноклональных антител, полученных против пептида GLUT4 мыши (GRQGPGGPDSI; SEQ ID NO:4). Также показаны предсказанные консенсусные последовательности для каждой CDR. В таблице 3 приведены определяющие комплементарность области (CDR) для тяжелой и легкой цепей для 8 моноклональных антител, полученных против пептида GLUT4 человека (GRQGPPGPSSI; SEQ ID NO:2). Также показаны прогнозируемые консенсусные последовательности для каждой CDR. Интересно, что два клона (2В9 и 4G7), которые наиболее слабо связываются с белком GLUT4 человека в анализе ELISA (см. фиг. 17), не содержат аргинина (R), найденного в консенсусной последовательности CDR3_VH у других 6 клонов, что позволяет предположить, что этот остаток может иметь важную роль в активности связывания антигена. Следует также отметить, что клон 15G2 не был представлен в анализе ELISA (см. фиг. 17), поскольку это антитело не росло хорошо при культивировании в лаборатории авторов изобретения.

[0160] В таблице 2 приведены результаты эксперимента 12, в котором получены аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR) для тяжелой цепи (V_H) и легкой цепи (V_L) 6 клонов моноклональных мышиных антител против последовательности пептида GRQGPGGPDSI мышиного GLUT4 (SEQ ID NO: 4). Также ниже таблицы 2 приведены иллюстративные консенсусные последовательности для каждой CDR.

Клоны CDR1 (V_H) CDR2 (V_H) CDR3 (V_H) 25D4 TYGMS (SEQ ID NO:58) WINTSSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO:60) PIHMVVAEDY (SEQ ID NO:66) 24H4 TYGMT (SEQ ID NO:59) WINTYSGVPTYANDFKG (SEQ ID NO:61) PIHKVVAEDY (SEQ ID NO:67) 22F6 TYGMS (SEQ ID NO:58) WINTYSGLPTYTNDFKG (SEQ ID NO:62) PITTVVPFDY (SEQ ID NO:68) 21E5 TYGMS (SEQ ID NO:58) WINTYSGLPTYADDFKG (SEQ ID NO:63) PITTVVPFDY (SEQ ID NO:69) 18B2 TYGMS (SEQ ID NO:58) WINTYSGVPTYADDFKG (SEQ ID NO:64) PITKVVAGDF (SEQ ID NO:70) 30F8 TYGMS (SEQ ID NO:58) WINTFSGVPTYTDDFKG (SEQ ID NO:65) PITTVVPFDY (SEQ ID NO:71) Клоны CDR1 (V_L) CDR2 (V_L) CDR3 (V_L) 25D4 KSSQILLYGRNQKNYLA (SEQ ID NO:72) WASTRES (SEQ ID NO:78) QQYYSKPYT (SEQ ID NO:84) 24H4 RSSQSLLYSGNQKNYLA (SEQ ID NO:73) WASTWES (SEQ ID NO:79) QQYYTFPYT (SEQ ID NO:85) 22F6 RSSQSLVYTYGNTYLH (SEQ ID NO:74) KVSNRFS (SEQ ID NO:80) SQSRHSPWT (SEQ ID NO:86) 21E5 RSSQSLVYNYGNTYLH (SEQ ID NO:75) KVSNRFS (SEQ ID NO:81) SQSRHSPWT (SEQ ID NO:87) 18B2 KSSQSLLYRSNQKNYLA (SEQ ID NO:76) WASTRES (SEQ ID NO:82) QQYFSSPYT (SEQ ID NO:88) 30F8 RSSQSLVYSTGNTYLH (SEQ ID NO:77) KVSNRFS (SEQ ID NO:83) SQSRHGPWT (SEQ ID NO:89)

Консенсусные последовательности CDR

CDR1 (V_H): T Y G M S/T

CDR2 (V_H): W I N T Y/F/S S G L/V P T Y X X D F K G

CDR3 (V_H): P I H/T X V V A/P X D Y

CDR1 (V_L): K/R S S Q S L L/V Y X_5-6 Y L A/H

CDR2 (V_L): K/W A/V S N/T R E/F S

CDR3 (V_L): Q Q S/Y F/R/Y H/S/T X P Y/W T

[0161] В таблице 3 приведены результаты эксперимента 12, в котором получены аминокислотные последовательности, определяющих комплементарность областей (CDR), для тяжелой цепи (V_H) и легкой цепи (V_L) 8 клонов моноклональных антител против последовательности пептида GRQGPEGPSSI GLUT4 человека (SEQ ID NO:2). Также ниже таблица 3 приведены иллюстративные консенсусные последовательности для каждой CDR.

Клон CDR1(V_H) CDR2(V_H) CDR3(V_H) 2B9 DDAMH (SEQ ID NO:10) WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:18) LDF (содержится в SEQ ID NO:26) 4G7 DYSMH (SEQ ID NO:11) WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:19) GASGY (SEQ ID NO:27) 5E3 EYTIH (SEQ ID NO:12) GINCNSGGTSYTQKFKD (SEQ ID NO:20) RFFYGSSQFAY (SEQ ID NO:28) 15G2 DYSMH (SEQ ID NO:13) WINTETGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:21) RGEF (SEQ ID NO:29) 8G2 DFSMH (SEQ ID NO:14) WINTETGDPTYADDFKG (SEQ ID NO:22) RGDY (SEQ ID NO:30) 1A7 AYSMH (SEQ ID NO:15) WINTETGEATYADDFKG (SEQ ID NO:23) RGDY (SEQ ID NO:31) 6D1 DYSMH (SEQ ID NO:16) WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:24) RGDY (SEQ ID NO:32) 12E11 DYSMH (SEQ ID NO:17) WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:25) GRSAY (SEQ ID NO:33) Клон CDR1(V_L) CDR2(V_L) CDR3(V_L) 2B9 RSSQSLVHSNGKTYLH (SEQ ID NO:34) KVSNRFS (SEQ ID NO:42) SQSTHVPWT (SEQ ID NO:50) 4G7 KASQSVSKNVA (SEQ ID NO:35) SSSKRYS (SEQ ID NO:43) HQDYNSPWT (SEQ ID NO:51) 5E3 RASKSVTTSGYSYMH (SEQ ID NO:36) LASNLES (SEQ ID NO:44) QHSRELPLT (SEQ ID NO:52) 15G2 KASQSVNKNVA (SEQ ID NO:37) SASKRYT (SEQ ID NO:45) LQDYTSPWT (SEQ ID NO:53) 8G2 RSSQSLVHSNRNIYLH (SEQ ID NO:38) KVSNRFS (SEQ ID NO:46) SQDKYIPWT (SEQ ID NO:54) 1A7 RSSQSLVRSNRNIYLH (SEQ ID NO:39) KVSNRFS (SEQ ID NO:47) SQDSHIPWT (SEQ ID NO:55) 6D1 RSSQSLVHNNRNIYLH (SEQ ID NO:40) KVSNRFS (SEQ ID NO:48) SQDRYIPWT (SEQ ID NO:56) 12E11 KASQTVSNNVA (SEQ ID NO:41) SASNRYT (SEQ ID NO:49) QQDYSSPWT (SEQ ID NO:57)

Консенсусные последовательности CDR

CDR1 (V_H): D/E Y S/T I/M H

CDR2 (V_H): W I N T E S/T G D/E X T/S Y A D D F K G

CDR3 (V_H): R X X Y

CDR1 (V_L): R/K A/S S Q S L/V X X N/S

CDR2 (V_L): V/A S N R F/Y S/T

CDR3 (V_L): Q D X X X P W T

Заключение

[0162] Показано, что невирусная векторная платформа по изобретению может эффективно и специфично доставлять терапевтические полезные нагрузки в ткани, которые экспрессируют GLUT4, включая, но не ограничиваясь ими, скелетные мышцы, сердечные мышцы, жировую ткань, гладкие мышцы, определенные области головного мозга (например, гиппокамп и мозжечок) и определенные раковые клетки (например, меланоциты). Терапевтические средства, которые могут быть доставлены в эти ткани с помощью платформы по изобретению, включают нуклеиновые кислоты (например, плазмидную ДНК, миникольцевую ДНК, мРНК, киРНК, кшРНК, олигонуклеотиды, конструкции CRISPR/Cas9), пептиды, липиды и лекарственные средства. Платформа не ограничена конкретными размерами полезной нагрузки, а скорее может успешно доставлять различные крупные нуклеотидные конструкции, обеспечивая поглощение и экспрессию кодируемых больших трансгенов. Эффекты и эффективность таргетинга и поглощения дополнительно усиливаются индуцируемой инсулином транслокацией GLUT4 в плазматическую мембрану клетки и введением альбумина в состав векторной платформы. Терапевтические композиции, включающие невирусную векторную платформу по изобретению, могут быть доставлены в качестве монотерапии или как часть комбинированной терапии.

[0163] Хотя были проиллюстрированы и описаны иллюстративные варианты осуществления, следует понимать, что в них могут быть внесены различные изменения, не выходящие за рамки сущности и объема изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> University of Washington

Whitehead, Nicholas P.

Froehner, Stanley C.

<120> НЕВИРУСНЫЙ ИММУНОТАРГЕТИНГ

<130> UWOTL-1-72245

<150> US 62/872,425

<151> 2019-07-10

<160> 89

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Gln Ser Tyr Asn Glu Thr Trp

1 5 10 15

Leu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Gly Pro Ser Ser Ile Pro Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Thr Thr Leu

35

<210> 2

<211> 11

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Arg Gln Gly Pro Glu Gly Pro Ser Ser Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 36

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 3

Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Gln Ser Tyr Asn Ala Thr Trp

1 5 10 15

Leu Gly Arg Gln Gly Pro Gly Gly Pro Asp Ser Ile Pro Gln Gly Thr

20 25 30

Leu Thr Thr Leu

35

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 4

Gly Arg Gln Gly Pro Gly Gly Pro Asp Ser Ile

1 5 10

<210> 5

<211> 3685

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg

35 40 45

Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met

260 265 270

His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg

275 280 285

Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala

290 295 300

Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln

305 310 315 320

His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu

325 330 335

Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu

340 345 350

Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile

355 360 365

Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly

370 375 380

Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu

405 410 415

Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu

420 425 430

Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val

435 440 445

Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu

450 455 460

Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly

465 470 475 480

Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu

485 490 495

Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His

500 505 510

Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys

530 535 540

Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys

545 550 555 560

Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser

565 570 575

Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp

580 585 590

Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala

595 600 605

Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys

610 615 620

Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr

625 630 635 640

Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln

645 650 655

Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr

660 665 670

Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val

675 680 685

Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro

690 695 700

Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile

705 710 715 720

Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr

725 730 735

Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Phe Arg Lys

740 745 750

Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg

755 760 765

Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala

770 775 780

Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser

785 790 795 800

Ile Lys Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys

805 810 815

Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile

820 825 830

Ile Ala Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr

835 840 845

Ala Glu Asn Trp Leu Lys Ile Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Pro Thr

850 855 860

Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu

865 870 875 880

Ser Gly Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Ile Ala

885 890 895

Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val

900 905 910

Ala Phe Thr Asn His Phe Lys Gln Val Phe Ser Asp Val Gln Ala Arg

915 920 925

Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr

930 935 940

Gln Glu Thr Met Ser Ala Ile Arg Thr Trp Val Gln Gln Ser Glu Thr

945 950 955 960

Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Asp Tyr Glu Ile Met Glu

965 970 975

Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln

980 985 990

Gln Ser Gly Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ser Lys

995 1000 1005

Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu

1010 1015 1020

Glu Ile Glu Gly Arg Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu Val Glu

1025 1030 1035

His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile

1040 1045 1050

Gln Asn His Ile Gln Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp

1055 1060 1065

Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile

1070 1075 1080

Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Ser Asp Ile

1085 1090 1095

Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln

1100 1105 1110

Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu

1115 1120 1125

Thr Glu Leu Lys Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Met Cys Gln

1130 1135 1140

Gln Val Tyr Ala Arg Lys Glu Ala Leu Lys Gly Gly Leu Glu Lys

1145 1150 1155

Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met

1160 1165 1170

Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys

1175 1180 1185

Thr Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala

1190 1195 1200

Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr

1205 1210 1215

Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln

1220 1225 1230

Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln

1235 1240 1245

Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu

1250 1255 1260

Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala

1265 1270 1275

Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu

1280 1285 1290

Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser

1295 1300 1305

Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile

1310 1315 1320

Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu

1325 1330 1335

Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu

1340 1345 1350

Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser

1355 1360 1365

Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln

1370 1375 1380

Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala

1385 1390 1395

Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile

1400 1405 1410

Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys

1415 1420 1425

Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln

1430 1435 1440

Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe

1445 1450 1455

Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Leu Arg Leu Gln Glu

1460 1465 1470

Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu

1475 1480 1485

Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn

1490 1495 1500

His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu

1505 1510 1515

Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys

1520 1525 1530

Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu

1535 1540 1545

Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys

1550 1555 1560

Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys

1565 1570 1575

Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu

1580 1585 1590

Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp

1595 1600 1605

Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys

1610 1615 1620

Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu

1625 1630 1635

Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu

1640 1645 1650

Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu

1655 1660 1665

Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr

1670 1675 1680

Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala

1685 1690 1695

Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys

1700 1705 1710

Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile Arg

1715 1720 1725

Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala

1730 1735 1740

Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser

1745 1750 1755

Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr

1760 1765 1770

Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser

1775 1780 1785

Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln

1790 1795 1800

Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu

1805 1810 1815

Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn

1820 1825 1830

Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys

1835 1840 1845

Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp

1850 1855 1860

Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln

1865 1870 1875

Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu

1880 1885 1890

Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp

1895 1900 1905

Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys

1910 1915 1920

Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu

1925 1930 1935

Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser

1940 1945 1950

Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg

1955 1960 1965

Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met

1970 1975 1980

Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser

1985 1990 1995

Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu

2000 2005 2010

Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe

2015 2020 2025

Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp

2030 2035 2040

Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys

2045 2050 2055

Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys

2060 2065 2070

Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val

2075 2080 2085

Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val

2090 2095 2100

Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln

2105 2110 2115

Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro

2120 2125 2130

Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu

2135 2140 2145

Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn

2150 2155 2160

Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala

2165 2170 2175

Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln

2180 2185 2190

Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu

2195 2200 2205

Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe

2210 2215 2220

Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu

2225 2230 2235

Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val

2240 2245 2250

Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys

2255 2260 2265

Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile

2270 2275 2280

Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr

2285 2290 2295

Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln

2300 2305 2310

Gly Glu Ile Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys

2315 2320 2325

Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp

2330 2335 2340

Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn

2345 2350 2355

Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln

2360 2365 2370

Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His

2375 2380 2385

Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu

2390 2395 2400

Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln

2405 2410 2415

Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr

2420 2425 2430

Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Pro

2435 2440 2445

Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser

2450 2455 2460

Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala

2465 2470 2475

Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile

2480 2485 2490

Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu

2495 2500 2505

Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg

2510 2515 2520

Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys

2525 2530 2535

Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg

2540 2545 2550

Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu

2555 2560 2565

Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr

2570 2575 2580

Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln

2585 2590 2595

Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val

2600 2605 2610

Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys

2615 2620 2625

Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu

2630 2635 2640

Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys

2645 2650 2655

Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile

2660 2665 2670

His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His

2675 2680 2685

Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala

2690 2695 2700

Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala

2705 2710 2715

Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu

2720 2725 2730

Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His

2735 2740 2745

Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu

2750 2755 2760

Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg

2765 2770 2775

Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser

2780 2785 2790

Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys

2795 2800 2805

Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu

2810 2815 2820

Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe

2825 2830 2835

Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg

2840 2845 2850

Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr

2855 2860 2865

Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys

2870 2875 2880

Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln

2885 2890 2895

Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr

2900 2905 2910

Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys

2915 2920 2925

Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr

2930 2935 2940

Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly

2945 2950 2955

Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp

2960 2965 2970

His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu

2975 2980 2985

Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr

2990 2995 3000

Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu

3005 3010 3015

Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp

3020 3025 3030

Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala

3035 3040 3045

Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg

3050 3055 3060

Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr

3065 3070 3075

Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln

3080 3085 3090

Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr

3095 3100 3105

Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu

3110 3115 3120

Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu

3125 3130 3135

Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys

3140 3145 3150

Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu

3155 3160 3165

Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu

3170 3175 3180

Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser

3185 3190 3195

Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp

3200 3205 3210

Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe

3215 3220 3225

Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln

3230 3235 3240

Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn

3245 3250 3255

Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys

3260 3265 3270

Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu

3275 3280 3285

Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala

3290 3295 3300

Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu

3305 3310 3315

Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn

3320 3325 3330

Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys

3335 3340 3345

Gly His Lys Met His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr

3350 3355 3360

Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn

3365 3370 3375

Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly

3380 3385 3390

Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr

3395 3400 3405

Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala

3410 3415 3420

Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu

3425 3430 3435

His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser

3440 3445 3450

Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu

3455 3460 3465

His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser

3470 3475 3480

Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu

3485 3490 3495

Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu

3500 3505 3510

Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys

3515 3520 3525

Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro

3530 3535 3540

Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu

3545 3550 3555

Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu

3560 3565 3570

Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser

3575 3580 3585

Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu

3590 3595 3600

Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu

3605 3610 3615

Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly

3620 3625 3630

Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro

3635 3640 3645

Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu

3650 3655 3660

Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys

3665 3670 3675

Pro Met Arg Glu Asp Thr Met

3680 3685

<210> 6

<211> 3678

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 6

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Ile Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Asp Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Lys

35 40 45

Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Lys Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Thr Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Ser Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Ser Gln His Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Lys Cys Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg

245 250 255

Thr Ser Ser Lys Val Thr Arg Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln

260 265 270

Met His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu

275 280 285

Gln Thr Ser Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Phe Thr

290 295 300

Gln Ala Ala Tyr Val Ala Thr Ser Asp Ser Thr Gln Ser Pro Tyr Pro

305 310 315 320

Ser Gln His Leu Glu Ala Pro Arg Asp Lys Ser Leu Asp Ser Ser Leu

325 330 335

Met Glu Thr Glu Val Asn Leu Asp Ser Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu

340 345 350

Val Leu Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Arg Ala Gln Gly

355 360 365

Glu Ile Ser Asn Asp Val Glu Glu Val Lys Glu Gln Phe His Ala His

370 375 380

Glu Gly Phe Met Met Asp Leu Thr Ser His Gln Gly Leu Val Gly Asn

385 390 395 400

Val Leu Gln Leu Gly Ser Gln Leu Val Gly Lys Gly Lys Leu Ser Glu

405 410 415

Asp Glu Glu Ala Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg

420 425 430

Trp Glu Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Lys Leu His

435 440 445

Lys Val Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asp Asp

450 455 460

Trp Leu Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Lys Lys Met Glu Glu Glu Pro

465 470 475 480

Phe Gly Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Cys Gln Val Gln Gln His Lys

485 490 495

Val Leu Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu

500 505 510

Thr His Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr

515 520 525

Ala Ala Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn

530 535 540

Ile Cys Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Ile Val Leu Gln Asp Ile Leu

545 550 555 560

Leu Lys Trp Gln His Phe Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Thr Trp

565 570 575

Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ala Met Lys Asn Ile Gln Thr Ser Gly Phe

580 585 590

Lys Asp Gln Asn Glu Met Met Ser Ser Leu His Lys Ile Ser Thr Leu

595 600 605

Lys Ile Asp Leu Glu Lys Lys Lys Pro Thr Met Glu Lys Leu Ser Ser

610 615 620

Leu Asn Gln Asp Leu Leu Ser Ala Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln

625 630 635 640

Lys Met Glu Ile Trp Met Glu Asn Phe Ala Gln Arg Trp Asp Asn Leu

645 650 655

Thr Gln Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr

660 665 670

Thr Thr Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr

675 680 685

Met Val Thr Thr Arg Glu Gln Ile Met Val Lys His Ala Gln Glu Glu

690 695 700

Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser

705 710 715 720

Glu Leu Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp

725 730 735

Ile Thr Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Ser Glu Phe Ala Val Tyr

740 745 750

Arg Lys Glu Gly Asn Ile Ser Asp Leu Gln Glu Lys Val Asn Ala Ile

755 760 765

Ala Arg Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg

770 775 780

Ser Ala Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Ala Asn Glu Gly Val Asn Ala

785 790 795 800

Glu Ser Ile Arg Gln Ala Ser Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Thr Glu

805 810 815

Phe Cys Gln Leu Leu Ser Glu Arg Val Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Thr

820 825 830

Asn Ile Ile Thr Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr

835 840 845

Thr Thr Ala Glu Asn Leu Leu Lys Thr Gln Ser Thr Thr Leu Ser Glu

850 855 860

Pro Thr Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn

865 870 875 880

Arg Leu Ser Ala Leu Gln Pro Gln Ile Glu Gln Leu Lys Ile Gln Ser

885 890 895

Leu Gln Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp

900 905 910

Phe Val Ala Phe Thr Asn His Phe Asn His Ile Phe Asp Gly Val Arg

915 920 925

Ala Lys Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met

930 935 940

Arg Tyr Gln Glu Thr Met Ser Ser Ile Arg Thr Trp Ile Gln Gln Ser

945 950 955 960

Glu Ser Lys Leu Ser Val Pro Tyr Leu Ser Val Thr Glu Tyr Glu Ile

965 970 975

Met Glu Glu Arg Leu Gly Lys Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Lys

980 985 990

Glu Gln Gln Asn Gly Phe Asn Tyr Leu Ser Asp Thr Val Lys Glu Met

995 1000 1005

Ala Lys Lys Ala Pro Ser Glu Ile Cys Gln Lys Tyr Leu Ser Glu

1010 1015 1020

Phe Glu Glu Ile Glu Gly His Trp Lys Lys Leu Ser Ser Gln Leu

1025 1030 1035

Val Glu Ser Cys Gln Lys Leu Glu Glu His Met Asn Lys Leu Arg

1040 1045 1050

Lys Phe Gln Asn His Ile Lys Thr Leu Gln Lys Trp Met Ala Glu

1055 1060 1065

Val Asp Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ala

1070 1075 1080

Glu Ile Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Gly

1085 1090 1095

Asp Ile Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Gly

1100 1105 1110

Gly Gln Lys Ile Lys Ser Glu Ala Glu Leu Glu Phe Ala Ser Arg

1115 1120 1125

Leu Glu Thr Glu Leu Arg Glu Leu Asn Thr Gln Trp Asp His Ile

1130 1135 1140

Cys Arg Gln Val Tyr Thr Arg Lys Glu Ala Leu Lys Ala Gly Leu

1145 1150 1155

Asp Lys Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu

1160 1165 1170

Trp Met Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu

1175 1180 1185

Tyr Lys Thr Pro Asp Glu Leu Gln Thr Ala Val Glu Glu Met Lys

1190 1195 1200

Arg Ala Lys Glu Glu Ala Leu Gln Lys Glu Thr Lys Val Lys Leu

1205 1210 1215

Leu Thr Glu Thr Val Asn Ser Val Ile Ala His Ala Pro Pro Ser

1220 1225 1230

Ala Gln Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn

1235 1240 1245

Tyr Gln Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu

1250 1255 1260

Glu Glu Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu

1265 1270 1275

Lys Ala Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Leu Lys Leu Lys Thr

1280 1285 1290

Met Glu Asn Val Pro Ala Gly Pro Glu Glu Ile Thr Glu Val Leu

1295 1300 1305

Glu Ser Leu Glu Asn Leu Met His His Ser Glu Glu Asn Pro Asn

1310 1315 1320

Gln Ile Arg Leu Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met

1325 1330 1335

Asp Glu Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp

1340 1345 1350

Arg Glu Leu His Glu Glu Ala Val Arg Lys Gln Lys Leu Leu Glu

1355 1360 1365

Gln Ser Ile Gln Ser Ala Gln Glu Ile Glu Lys Ser Leu His Leu

1370 1375 1380

Ile Gln Glu Ser Leu Glu Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr

1385 1390 1395

Ile Thr Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln

1400 1405 1410

Lys Ile Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu

1415 1420 1425

Met Lys Lys His Asn Gln Gly Lys Asp Ala Asn Gln Arg Val Leu

1430 1435 1440

Ser Gln Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met

1445 1450 1455

Lys Phe Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu

1460 1465 1470

Glu Glu Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro

1475 1480 1485

Ala Leu Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Ile Gln Ser Gln

1490 1495 1500

Leu Ser His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys

1505 1510 1515

Ser Glu Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln

1520 1525 1530

Lys Lys Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr

1535 1540 1545

Ala Leu Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu

1550 1555 1560

Arg Lys Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met

1565 1570 1575

Arg Lys Glu Met Asn Val Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp

1580 1585 1590

Thr Glu Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn

1595 1600 1605

Leu Asp Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Ile

1610 1615 1620

Glu Lys Gln Lys Ala His Leu Lys Ser Val Thr Glu Leu Gly Glu

1625 1630 1635

Ser Leu Lys Met Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp

1640 1645 1650

Lys Leu Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val Thr Ser Arg

1655 1660 1665

Val Glu Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met

1670 1675 1680

Glu Thr Phe Asp Gln Asn Ile Glu Gln Ile Thr Lys Trp Ile Ile

1685 1690 1695

His Ala Asp Glu Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln

1700 1705 1710

Gln Lys Glu Asp Ile Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Met Asn Asp

1715 1720 1725

Met Arg Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Lys Leu

1730 1735 1740

Met Ala Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Val Val Glu Pro Gln

1745 1750 1755

Ile Ser Glu Leu Asn Arg Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile

1760 1765 1770

Lys Thr Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe

1775 1780 1785

Asn Ser Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile

1790 1795 1800

Gln Gln Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met

1805 1810 1815

Ser Glu Asp Asn Glu Gly Thr Val Asn Glu Leu Leu Gln Arg Gly

1820 1825 1830

Asp Asn Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu

1835 1840 1845

Ile Lys Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu

1850 1855 1860

Lys Asp Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser

1865 1870 1875

His Gln Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys

1880 1885 1890

Cys Leu Asp Glu Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Glu Pro

1895 1900 1905

Arg Asp Glu Arg Lys Leu Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys

1910 1915 1920

Lys Lys Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly Leu

1925 1930 1935

Ser Glu Asn Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln

1940 1945 1950

Leu Ser Lys Arg Trp Arg Gln Ile Glu Ser Asn Phe Ala Gln Phe

1955 1960 1965

Arg Arg Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Leu His Glu Glu Thr

1970 1975 1980

Met Val Val Thr Thr Glu Asp Met Pro Leu Asp Val Ser Tyr Val

1985 1990 1995

Pro Ser Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Ser His Ile Leu Gln Ala Leu

2000 2005 2010

Ser Glu Val Asp His Leu Leu Asn Thr Pro Glu Leu Cys Ala Lys

2015 2020 2025

Asp Phe Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile

2030 2035 2040

Lys Asp Asn Leu Gln Gln Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His

2045 2050 2055

Lys Lys Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Ser Met Glu Lys

2060 2065 2070

Val Lys Val Gln Glu Ala Val Ala Gln Met Asp Phe Gln Gly Glu

2075 2080 2085

Lys Leu His Arg Met Tyr Lys Glu Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg

2090 2095 2100

Ser Val Glu Lys Trp Arg His Phe His Tyr Asp Met Lys Val Phe

2105 2110 2115

Asn Gln Trp Leu Asn Glu Val Glu Gln Phe Phe Lys Lys Thr Gln

2120 2125 2130

Asn Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys

2135 2140 2145

Glu Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Ala Val Val Arg Thr

2150 2155 2160

Leu Asn Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr

2165 2170 2175

Asp Val Asn Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Ser Leu Arg

2180 2185 2190

Trp His Asp Ile Cys Lys Glu Leu Ala Glu Arg Arg Lys Arg Ile

2195 2200 2205

Glu Glu Gln Lys Asn Val Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn

2210 2215 2220

Glu Phe Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ile Thr

2225 2230 2235

Pro Leu Gly Asp Glu Gln Gln Leu Lys Glu Gln Leu Glu Gln Val

2240 2245 2250

Lys Leu Leu Ala Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys

2255 2260 2265

Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Ala Val Leu Val Ser Ala Pro Ile

2270 2275 2280

Arg Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Lys Lys Leu Lys Gln Thr

2285 2290 2295

Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln

2300 2305 2310

Gly Glu Leu Glu Val His Leu Lys Asp Phe Arg Gln Leu Glu Glu

2315 2320 2325

Gln Leu Asp His Leu Leu Leu Trp Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln

2330 2335 2340

Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Ser Gln Ala Gly Pro Phe Asp Ile

2345 2350 2355

Lys Glu Ile Glu Val Thr Val His Gly Lys Gln Ala Asp Val Glu

2360 2365 2370

Arg Leu Leu Ser Lys Gly Gln His Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ser

2375 2380 2385

Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu Asp Leu Arg Ser Glu Trp

2390 2395 2400

Glu Ala Val Asn His Leu Leu Arg Glu Leu Arg Thr Lys Gln Pro

2405 2410 2415

Asp Arg Ala Pro Gly Leu Ser Thr Thr Gly Ala Ser Ala Ser Gln

2420 2425 2430

Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Ser Val Val Thr Lys Glu Thr Val

2435 2440 2445

Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Leu Leu Glu Val Pro

2450 2455 2460

Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp

2465 2470 2475

Leu Ser Leu Leu Asp Arg Val Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val

2480 2485 2490

Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala

2495 2500 2505

Thr Leu Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu

2510 2515 2520

Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu

2525 2530 2535

Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile Gln Ile Gln

2540 2545 2550

Trp Asp Glu Val Gln Glu Gln Leu Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu

2555 2560 2565

Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu

2570 2575 2580

Glu Ala Glu Gln Val Ile Gly Gln Val Arg Gly Lys Leu Asp Ser

2585 2590 2595

Trp Lys Glu Gly Pro His Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile

2600 2605 2610

Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Arg Gln Ile

2615 2620 2625

Ser Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp

2630 2635 2640

Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn

2645 2650 2655

Ile Asn Thr Ser Trp Gly Asn Ile His Lys Arg Val Ser Glu Gln

2660 2665 2670

Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro

2675 2680 2685

Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ser Trp Ile Thr Glu Ala Glu Thr

2690 2695 2700

Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Ser Arg Lys Glu Lys Leu Leu

2705 2710 2715

Glu Asp Ser Arg Gly Val Arg Glu Leu Met Lys Pro Trp Gln Asp

2720 2725 2730

Leu Gln Gly Glu Ile Glu Thr His Thr Asp Ile Tyr His Asn Leu

2735 2740 2745

Asp Glu Asn Gly Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp

2750 2755 2760

Glu Ala Pro Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys

2765 2770 2775

Trp Ser Glu Leu Gln Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu

2780 2785 2790

Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln

2795 2800 2805

Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg

2810 2815 2820

Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn

2825 2830 2835

Asp Ile His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro

2840 2845 2850

Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu

2855 2860 2865

Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu

2870 2875 2880

Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg

2885 2890 2895

Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Ala Glu Trp Asp Lys Leu Asn Leu

2900 2905 2910

Arg Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Ala Leu Glu Arg

2915 2920 2925

Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Ala Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu

2930 2935 2940

Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp

2945 2950 2955

Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala

2960 2965 2970

Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Asn Arg Val

2975 2980 2985

Asn Asp Leu Ala His Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser

2990 2995 3000

Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Arg

3005 3010 3015

Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu

3020 3025 3030

Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr

3035 3040 3045

Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val

3050 3055 3060

Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His

3065 3070 3075

Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn

3080 3085 3090

Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu

3095 3100 3105

Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys

3110 3115 3120

Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met

3125 3130 3135

Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg

3140 3145 3150

Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val

3155 3160 3165

Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg

3170 3175 3180

Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser

3185 3190 3195

Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys

3200 3205 3210

Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly

3215 3220 3225

Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu

3230 3235 3240

Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser

3245 3250 3255

Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu

3260 3265 3270

Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu

3275 3280 3285

Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln

3290 3295 3300

Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg

3305 3310 3315

Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys

3320 3325 3330

Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro

3335 3340 3345

Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg

3350 3355 3360

Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr

3365 3370 3375

Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val

3380 3385 3390

Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe

3395 3400 3405

Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Gln Leu Ser His

3410 3415 3420

Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala

3425 3430 3435

Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser

3440 3445 3450

Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His Tyr

3455 3460 3465

Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser

3470 3475 3480

Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu

3485 3490 3495

Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu

3500 3505 3510

Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys Gly

3515 3520 3525

Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser Pro

3530 3535 3540

Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu

3545 3550 3555

Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu

3560 3565 3570

Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg Gln

3575 3580 3585

Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr

3590 3595 3600

Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln

3605 3610 3615

Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Glu Ser Met

3620 3625 3630

Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly

3635 3640 3645

Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser

3650 3655 3660

Arg Gly Arg Asn Ala Pro Gly Lys Pro Met Arg Glu Asp Thr Met

3665 3670 3675

<210> 7

<211> 3699

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 7

Met Glu Asp Glu Arg Glu Asp Val Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp

1 5 10 15

Ile Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe Gly Lys Gln His Ile Asp Asn Leu

20 25 30

Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Lys Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly

35 40 45

Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His

50 55 60

Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala Leu Gln Val Leu Gln Lys Asn Asn

65 70 75 80

Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His

85 90 95

Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val

100 105 110

Lys Asn Val Met Lys Thr Ile Met Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser

115 120 125

Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val Arg Glu Ser Thr Arg Asn Tyr Pro

130 135 140

Gln Val Asn Val Leu Asn Phe Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala

145 150 155 160

Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn

165 170 175

Ser Val Val Ser Gln Gln Ser Ala Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe

180 185 190

Asn Ile Ala Lys Cys Gln Leu Gly Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu

195 200 205

Asp Val Ala Thr Thr Tyr Pro Asp Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile

210 215 220

Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile

225 230 235 240

Arg Glu Val Glu Met Leu Pro Arg Pro Ser Lys Val Thr Arg Glu Glu

245 250 255

His Phe Gln Leu His His Gln Met His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val

260 265 270

Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Gln Thr Ser Ser Ser Pro Lys Pro Arg

275 280 285

Phe Lys Ser Tyr Ala Phe Thr Gln Ala Ala Tyr Val Ala Thr Ser Asp

290 295 300

Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Pro Ser Gln His Leu Glu Ala Pro Gly Ser

305 310 315 320

Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Ile Glu Thr Glu Val Asn Leu Asp Ser

325 330 335

Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu

340 345 350

Asp Thr Leu Arg Ala Gln Gly Glu Ile Ser Lys Asp Val Glu Glu Val

355 360 365

Lys Glu Gln Phe His Ala His Glu Gly Phe Met Met Asp Leu Thr Ser

370 375 380

His Gln Gly Leu Val Gly Asn Val Leu Gln Leu Gly Ser Arg Leu Val

385 390 395 400

Gly Lys Gly Lys Leu Thr Glu Asp Glu Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln

405 410 415

Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu Cys Leu Arg Val Ala Ser Met

420 425 430

Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Lys Val Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln

435 440 445

Lys Leu Lys Glu Leu Asp Asp Trp Leu Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr

450 455 460

Lys Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys

465 470 475 480

Cys Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu

485 490 495

Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His Met Val Val Val Val Asp Glu

500 505 510

Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val

515 520 525

Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys Lys Trp Thr Glu Asp Arg Trp

530 535 540

Ile Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys Trp Gln Arg Phe Thr Glu Glu

545 550 555 560

Gln Cys Leu Phe Ser Lys Trp Leu Ser Glu Lys Glu Asp Ala Met Lys

565 570 575

Asn Ile Gln Thr Ser Gly Phe Glu Asp Gln Asn Glu Met Val Ser Ser

580 585 590

Leu Gln Asn Ile Ser Ala Leu Lys Ile Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln

595 600 605

Ser Met Glu Lys Leu Ser Ser Leu Asn Gln Asp Leu Leu Ser Ala Leu

610 615 620

Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Met Glu Met Trp Met Glu Asn Phe

625 630 635 640

Ala Gln Arg Trp Asp Asn Leu Thr Gln Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ala

645 650 655

Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr

660 665 670

Thr Val Met Glu Thr Val Thr Met Val Thr Thr Arg Glu Gln Ile Met

675 680 685

Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys

690 695 700

Arg Gln Ile Thr Val Asp Ser Glu Ile Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp

705 710 715 720

Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln

725 730 735

Ser Ser Glu Phe Ala Val Tyr Arg Lys Glu Gly Asn Ile Ser Asp Leu

740 745 750

Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Ala Arg Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg

755 760 765

Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala Gln Ala Leu Val Glu Gln Met

770 775 780

Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Glu Ser Ile Arg Gln Ala Ser Glu Gln

785 790 795 800

Leu Asn Ser Arg Trp Thr Glu Phe Cys Gln Leu Leu Ser Glu Arg Val

805 810 815

Asn Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Asn Ile Ile Thr Phe Tyr Asn Gln Leu

820 825 830

Gln Gln Leu Glu Gln Met Thr Thr Thr Ala Glu Asn Leu Leu Lys Thr

835 840 845

Gln Pro Thr Thr Leu Ser Glu Pro Thr Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys

850 855 860

Ile Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu Ser Ala Leu Gln Pro Gln Ile

865 870 875 880

Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Leu Thr Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly

885 890 895

Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val Ala Phe Thr Asn His Phe Asn

900 905 910

Tyr Val Phe Asp Gly Val Arg Ala Arg Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile

915 920 925

Phe Asp Thr Leu Pro Pro Met Arg Tyr Gln Glu Thr Met Ser Ser Ile

930 935 940

Arg Thr Trp Ile Gln Gln Ser Glu Asn Lys Leu Ser Ile Pro His Leu

945 950 955 960

Ser Val Thr Glu Tyr Glu Ile Met Glu Glu Arg Leu Gly Lys Leu Gln

965 970 975

Ala Leu Gln Ser Ser Leu Lys Glu Gln Gln Asn Gly Phe Asn Tyr Leu

980 985 990

Asn Ala Thr Val Lys Glu Ile Ala Lys Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser

995 1000 1005

Gln Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu Glu Val Glu Gly Arg Trp Lys

1010 1015 1020

Lys Leu Ser Thr Gln Leu Val Glu His Cys Gln Lys Leu Glu Glu

1025 1030 1035

His Met Asn Lys Leu Arg Lys Phe Gln Asn His Lys Lys Thr Leu

1040 1045 1050

Gln Lys Trp Met Ala Glu Val Asp Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp

1055 1060 1065

Pro Ala Leu Gly Asp Ala Glu Ile Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln

1070 1075 1080

Cys Arg Leu Leu Val Gly Asp Ile Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu

1085 1090 1095

Asn Ser Val Asn Glu Gly Gly Gln Lys Ile Lys Ser Glu Ala Glu

1100 1105 1110

Phe Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu Lys Glu Leu Lys Glu Leu Asn

1115 1120 1125

Thr Gln Trp Asp His Ile Cys Arg Gln Val Tyr Thr Arg Lys Glu

1130 1135 1140

Ala Leu Lys Ala Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp

1145 1150 1155

Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr

1160 1165 1170

Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys Thr Pro Asp Glu Leu Gln Thr

1175 1180 1185

Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala Lys Glu Glu Ala Leu Gln Lys

1190 1195 1200

Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr Glu Thr Val Asn Ser Val Ile

1205 1210 1215

Ser Gln Ala Pro Pro Ala Ala Gln Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu

1220 1225 1230

Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn

1235 1240 1245

Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu Val Trp Ala Cys Trp His Glu

1250 1255 1260

Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val

1265 1270 1275

Glu Leu Lys Leu Lys Ala Thr Glu Asn Val Pro Ala Gly Ala Glu

1280 1285 1290

Glu Ile Thr Glu Val Leu Glu Ser Leu Glu Asn Leu Met His His

1295 1300 1305

Ser Glu Glu Asn Pro Asn Gln Ile Arg Leu Leu Ala Gln Thr Leu

1310 1315 1320

Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu

1325 1330 1335

Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu Leu His Glu Glu Ala Val Arg

1340 1345 1350

Lys Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser Ile Gln Ser Ala Gln Glu Ile

1355 1360 1365

Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln Glu Ser Leu Glu Phe Ile Asp

1370 1375 1380

Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln

1385 1390 1395

Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile Gln Ser Asp Leu Thr Ser His

1400 1405 1410

Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys Lys His Asn Gln Gly Lys Asp

1415 1420 1425

Ala Asn Gln Arg Val Leu Ser Gln Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys

1430 1435 1440

Leu Gln Asp Val Ser Ile Lys Phe Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala

1445 1450 1455

Asn Phe Glu Gln Arg Leu Glu Glu Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu

1460 1465 1470

Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln

1475 1480 1485

Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Ser His Cys Val Asn Leu Tyr Lys

1490 1495 1500

Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu Val Glu Met Val Ile Lys Thr

1505 1510 1515

Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu

1520 1525 1530

Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu

1535 1540 1545

Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu

1550 1555 1560

Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys Glu Met Asn Val Leu Thr Glu

1565 1570 1575

Trp Leu Ala Ala Thr Asp Thr Glu Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val

1580 1585 1590

Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys

1595 1600 1605

Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys Gln Lys Ala His Leu Lys Ser

1610 1615 1620

Val Thr Glu Leu Gly Asp Ser Leu Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys

1625 1630 1635

Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu Thr Leu Leu Asn Ser Asn Trp

1640 1645 1650

Ile Ala Val Thr Ser Arg Val Glu Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu

1655 1660 1665

Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Ser Phe Asp Gln Asn Val Glu His

1670 1675 1680

Ile Thr Lys Trp Ile Ile His Thr Asp Glu Leu Leu Asp Glu Ser

1685 1690 1695

Glu Lys Arg Lys Pro Gln Gln Lys Glu Asp Ile Leu Lys Arg Leu

1700 1705 1710

Lys Ala Glu Met Asn Asp Ile Arg Pro Lys Val Asp Ala Thr Arg

1715 1720 1725

Asp Gln Ala Ala Lys Leu Met Ala Asn Arg Gly Asp Tyr Cys Arg

1730 1735 1740

Lys Ile Val Glu Pro Gln Ile Ser Glu Leu Asn Arg Arg Phe Ala

1745 1750 1755

Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu

1760 1765 1770

Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu

1775 1780 1785

Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu

1790 1795 1800

Asp Phe Asn Lys Asp Met Ser Glu Asp Asn Glu Gly Thr Val Asn

1805 1810 1815

Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn Leu Gln Gln Arg Ile Thr Asp

1820 1825 1830

Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys Leu Lys Gln Gln Leu Leu Gln

1835 1840 1845

Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys

1850 1855 1860

Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln Trp Tyr Gln Tyr Lys Ser Gln

1865 1870 1875

Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu Asp Glu Ile Glu Lys Lys Leu

1880 1885 1890

Ala Ser Leu Pro Glu Pro Arg Asp Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile

1895 1900 1905

Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg

1910 1915 1920

Arg Gln Ala Glu Ser Leu Ser Glu Asn Gly Ala Ala Met Ala Val

1925 1930 1935

Glu Pro Thr Gln Ile Gln Leu Ser Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu

1940 1945 1950

Ser Asn Phe Ala Gln Phe Arg Arg Leu Asn Phe Ala Gln Ile His

1955 1960 1965

Thr Leu His Glu Glu Thr Met Val Val Thr Thr Glu Asp Met Pro

1970 1975 1980

Leu Asp Val Ser Tyr Val Pro Ser Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Ser

1985 1990 1995

His Ile Leu Gln Ala Leu Ser Glu Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala

2000 2005 2010

Pro Glu Leu Asn Ala Lys Asp Phe Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu

2015 2020 2025

Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Glu Asn Leu Gln Gln Ile Ser Gly

2030 2035 2040

Arg Ile Asp Val Ile His Lys Lys Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser

2045 2050 2055

Ala Thr Pro Met Glu Arg Val Lys Leu Gln Glu Ala Val Ser Gln

2060 2065 2070

Met Asp Phe His Trp Glu Lys Leu Asn Arg Met Tyr Lys Glu Arg

2075 2080 2085

Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val Glu Lys Trp Arg His Phe His

2090 2095 2100

Tyr Asp Met Lys Val Phe Asn Gln Trp Leu Asn Asp Val Glu Gln

2105 2110 2115

Phe Phe Lys Lys Thr Gln Asn Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys

2120 2125 2130

Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg

2135 2140 2145

Gln Ala Val Val Arg Thr Leu Asn Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile

2150 2155 2160

Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala Asn Ile Leu Gln Glu Lys Leu

2165 2170 2175

Gly Ser Leu Ser Leu Arg Trp His Glu Val Cys Lys Glu Leu Ala

2180 2185 2190

Glu Arg Arg Lys Arg Val Glu Glu Gln Lys Asn Val Phe Ser Glu

2195 2200 2205

Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe Val Ser Trp Leu Glu Glu Ala

2210 2215 2220

Asp Asn Ile Ala Thr Thr Pro Pro Gly Asp Glu Glu Gln Leu Lys

2225 2230 2235

Glu Lys Leu Glu Gln Val Lys Leu Leu Thr Glu Glu Leu Pro Leu

2240 2245 2250

Arg Gln Gly Ile Leu Lys Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Ala Val

2255 2260 2265

Leu Val Ser Ala Pro Ile Arg Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu

2270 2275 2280

Lys Lys Leu Lys Gln Thr Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg

2285 2290 2295

Ala Leu Pro Glu Lys Gln Gly Glu Leu Glu Val His Ile Lys Asp

2300 2305 2310

Phe Arg Gln Phe Glu Glu Gln Leu Asp His Leu Leu Leu Trp Leu

2315 2320 2325

Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Ser Gln

2330 2335 2340

Pro Gly Pro Phe Asp Leu Lys Glu Thr Glu Val Thr Val Gln Ala

2345 2350 2355

Lys Gln Pro Asp Val Glu Arg Leu Leu Ser Lys Gly Gln His Leu

2360 2365 2370

Tyr Lys Glu Lys Pro Ser Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu

2375 2380 2385

Asp Leu Arg Ser Glu Trp Glu Ala Val Asn His Leu Leu Trp Glu

2390 2395 2400

Leu Arg Thr Lys Gln Pro Asp Arg Ala Pro Gly Leu Ser Thr Thr

2405 2410 2415

Gly Ala Ser Ala Ser Gln Thr Val Thr Val Val Thr Gln Pro Val

2420 2425 2430

Asp Thr Lys Glu Thr Val Ile Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser

2435 2440 2445

Leu Leu Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp

2450 2455 2460

Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Arg Val Ile Lys

2465 2470 2475

Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met

2480 2485 2490

Ile Ile Lys Gln Lys Leu Val Glu Ser Met Met Asn Ser His Leu

2495 2500 2505

Gln Gly Ala Thr Leu Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu

2510 2515 2520

Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser

2525 2530 2535

Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile

2540 2545 2550

Gln Ile Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu Gln Leu Gln Asn Arg Arg

2555 2560 2565

Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu

2570 2575 2580

Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Ile Gly Gln Ala Arg Gly Lys

2585 2590 2595

Leu Asp Ser Trp Lys Glu Gly Pro His Thr Met Asp Ala Ile Gln

2600 2605 2610

Lys Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln

2615 2620 2625

Arg Gln Ile Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu

2630 2635 2640

Leu Arg Asp Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile

2645 2650 2655

Thr Glu Asn Ile Asn Thr Ser Trp Gly Asn Ile Leu Lys Arg Val

2660 2665 2670

Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu Glu Glu Thr Gln Arg Leu Leu Gln

2675 2680 2685

Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Ile Thr Glu

2690 2695 2700

Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Ser Arg Lys Glu

2705 2710 2715

Lys Leu Leu Glu Asp Ser Arg Gly Val Arg Glu Leu Met Lys Pro

2720 2725 2730

Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Ile Tyr

2735 2740 2745

His Asn Leu Asp Glu Asn Gly Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu

2750 2755 2760

Gly Ser Asp Glu Ala Pro Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met

2765 2770 2775

Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg

2780 2785 2790

Ser His Leu Glu Val Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu

2795 2800 2805

Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu

2810 2815 2820

Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln

2825 2830 2835

Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr

2840 2845 2850

Lys Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe

2855 2860 2865

Leu Thr Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu

2870 2875 2880

Pro Arg Glu Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg

2885 2890 2895

Leu Leu Arg Lys Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Asp Lys

2900 2905 2910

Leu Asn Leu His Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Ala

2915 2920 2925

Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln Glu Ala Ala Asp Glu Leu Asp

2930 2935 2940

Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro

2945 2950 2955

Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys

2960 2965 2970

Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val

2975 2980 2985

Asn His Val Asn Asp Leu Ala His His Leu Thr Thr Leu Gly Ile

2990 2995 3000

Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Asn Thr

3005 3010 3015

Arg Trp Arg Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln

3020 3025 3030

Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe

3035 3040 3045

Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro

3050 3055 3060

Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys

3065 3070 3075

Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp

3080 3085 3090

Leu Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu

3095 3100 3105

Arg Arg Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser

3110 3115 3120

Ala Ala Cys Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp

3125 3130 3135

Gln Pro Met Asp Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile

3140 3145 3150

Tyr Asp Arg Leu Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro

3155 3160 3165

Leu Cys Val Asp Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp

3170 3175 3180

Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly

3185 3190 3195

Ile Ile Ser Leu Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr

3200 3205 3210

Leu Phe Lys Gln Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg

3215 3220 3225

Arg Leu Gly Leu Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln

3230 3235 3240

Leu Gly Glu Val Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser

3245 3250 3255

Val Arg Ser Cys Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu

3260 3265 3270

Ala Ala Leu Phe Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gln Ser Met

3275 3280 3285

Val Trp Leu Pro Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala

3290 3295 3300

Lys His Gln Ala Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile

3305 3310 3315

Gly Phe Arg Tyr Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys

3320 3325 3330

Gln Ser Cys Phe Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met

3335 3340 3345

His Tyr Pro Met Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu

3350 3355 3360

Asp Val Arg Asp Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr

3365 3370 3375

Lys Arg Tyr Phe Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val

3380 3385 3390

Gln Thr Val Leu Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Val Thr Leu

3395 3400 3405

Ile Asn Phe Trp Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Gln

3410 3415 3420

Leu Ser His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser

3425 3430 3435

Arg Leu Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp

3440 3445 3450

Ser Ile Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile

3455 3460 3465

Gln His Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln

3470 3475 3480

Pro Arg Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu

3485 3490 3495

Arg Gly Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn

3500 3505 3510

Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu

3515 3520 3525

His Lys Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro

3530 3535 3540

Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala

3545 3550 3555

Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln

3560 3565 3570

Ile Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg

3575 3580 3585

Leu Arg Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn

3590 3595 3600

Gly Thr Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp

3605 3610 3615

Ser Ser Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser

3620 3625 3630

Glu Ser Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Pro Gln Asp Thr

3635 3640 3645

Ser Thr Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe

3650 3655 3660

Pro Ser Ser Arg Gly His Asn Val Gly Ser Leu Phe His Met Ala

3665 3670 3675

Asp Asp Leu Gly Arg Ala Met Glu Ser Leu Val Ser Val Met Ile

3680 3685 3690

Asp Glu Glu Gly Ala Glu

3695

<210> 8

<211> 3677

<212> Белок

<213> Oryctolagus cuniculus

<220>

<221> прочие признаки

<222> (2570)..(2570)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<220>

<221> прочие признаки

<222> (2597)..(2597)

<223> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту

<400> 8

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Ile Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg

35 40 45

Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Gln Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Lys Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Ser Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Lys Cys Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Ala Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Leu Leu Pro Arg

245 250 255

Pro Ser Lys Val Thr Arg Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met

260 265 270

His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg

275 280 285

Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala

290 295 300

Ala Tyr Val Ser Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln

305 310 315 320

His Leu Glu Ala Pro Gly Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu

325 330 335

Thr Glu Val Ser Leu Asp Ser Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu

340 345 350

Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Lys Glu Ile

355 360 365

Ser Ser Asp Val Glu Glu Val Lys Glu Gln Phe His Thr His Glu Gly

370 375 380

Tyr Met Met Asp Leu Thr Ser His Gln Gly Arg Val Gly Asn Val Leu

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ser Gln Leu Ile Arg Thr Gly Lys Leu Ser Glu Glu Glu

405 410 415

Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu

420 425 430

Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Lys Val

435 440 445

Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu

450 455 460

Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly

465 470 475 480

Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu

485 490 495

Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His

500 505 510

Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Glu His Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys

530 535 540

Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys

545 550 555 560

Trp Gln Arg Phe Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Thr Trp Leu Ser

565 570 575

Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp

580 585 590

Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu His Lys Leu Thr Val Leu Lys Thr

595 600 605

Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Asp Lys Leu Ser Ser Leu Asn

610 615 620

Gln Ala Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Met

625 630 635 640

Glu Ala Trp Leu Glu Asn Phe Ala Leu Arg Trp Asp Asn Leu Val Gln

645 650 655

Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr

660 665 670

Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Met Val

675 680 685

Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro

690 695 700

Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Ile Val Asp Ser Glu Ile

705 710 715 720

Arg Lys Arg Leu Asp Val Asp Ile Thr Glu Leu His Ser Trp Ile Thr

725 730 735

Arg Ser Glu Ala Val Leu Gln Ser Pro Glu Phe Ala Ile Tyr Arg Lys

740 745 750

Glu Gly Asn Phe Ser Asp Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Ile Glu Arg

755 760 765

Glu Lys Ala Glu Lys Phe Arg Lys Leu Gln Asp Ala Ser Arg Ser Ala

770 775 780

Gln Ala Leu Val Glu Gln Met Val Asn Glu Gly Val Asn Ala Asp Ser

785 790 795 800

Ile Lys Gln Ala Leu Glu Gln Leu Asn Ser Arg Trp Ile Glu Phe Cys

805 810 815

Gln Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Trp Leu Glu Tyr Gln Asn Ser Ile

820 825 830

Ile Thr Phe Tyr Asn Gln Leu Gln Gln Leu Glu Gln Met Ile Thr Thr

835 840 845

Ala Glu Asn Trp Leu Lys Thr Gln Pro Thr Thr Ala Ser Glu Pro Thr

850 855 860

Ala Ile Lys Ser Gln Leu Lys Met Cys Lys Asp Glu Val Asn Arg Leu

865 870 875 880

Ser Ala Leu Gln Pro Gln Ile Glu Arg Leu Lys Ile Gln Ser Thr Ala

885 890 895

Leu Lys Glu Lys Gly Gln Gly Pro Met Phe Leu Asp Ala Asp Phe Val

900 905 910

Ala Phe Thr Asn His Phe Asn Gln Val Phe Ala Asp Ala Gln Ala Arg

915 920 925

Glu Lys Glu Leu Gln Thr Ile Phe Asp Thr Leu Pro Pro Thr Arg Tyr

930 935 940

Gln Glu Thr Ile Ser Thr Ile Arg Thr Trp Ile Gln Gln Ser Glu Pro

945 950 955 960

Lys Leu Ser Ile Pro Gln Leu Ser Val Thr Glu Tyr Glu Ile Met Glu

965 970 975

Gln Arg Leu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Gln Ser Ser Leu Gln Glu Gln

980 985 990

Gln Ser Gly Leu Thr Tyr Leu Ser Thr Thr Val Lys Glu Met Ala Lys

995 1000 1005

Lys Ala Pro Ser Glu Ile Ser Arg Lys Tyr Gln Ser Glu Phe Glu

1010 1015 1020

Glu Ile Glu Gly His Trp Lys Lys Leu Ser Tyr Gln Leu Val Asp

1025 1030 1035

His Cys Gln Lys Leu Glu Glu Gln Met Asn Lys Leu Arg Lys Ile

1040 1045 1050

Gln Asn His Ile Lys Thr Leu Lys Lys Trp Met Ala Glu Val Asp

1055 1060 1065

Val Phe Leu Lys Glu Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp Ser Glu Ile

1070 1075 1080

Leu Lys Lys Gln Leu Lys Gln Cys Arg Leu Leu Val Asn Asp Ile

1085 1090 1095

Gln Thr Ile Gln Pro Ser Leu Asn Ser Val Asn Glu Ser Gly Gln

1100 1105 1110

Lys Ile Lys Asn Glu Ala Glu Pro Glu Phe Ala Ser Arg Leu Glu

1115 1120 1125

Thr Glu Leu Arg Glu Leu Asn Ser Gln Trp Asp His Met Cys Arg

1130 1135 1140

Gln Val Tyr Thr Arg Lys Asp Ala Leu Lys Ala Gly Leu Asp Lys

1145 1150 1155

Thr Leu Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met

1160 1165 1170

Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Phe Glu Tyr Lys

1175 1180 1185

Thr Pro Asp Glu Leu Gln Thr Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala

1190 1195 1200

Lys Glu Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ser Lys Val Lys Leu Leu Thr

1205 1210 1215

Glu Ser Val Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Ala Ala Gln

1220 1225 1230

Glu Ala Leu Lys Lys Glu Leu Asp Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln

1235 1240 1245

Trp Leu Cys Thr Arg Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu

1250 1255 1260

Val Trp Ala Cys Trp His Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala

1265 1270 1275

Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val Glu Val Lys Leu Lys Thr Thr Glu

1280 1285 1290

Thr Leu Pro Gly Gly Ala Glu Glu Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser

1295 1300 1305

Leu Glu Asn Leu Met Gln His Ser Glu Asp Asn Pro Asn Gln Ile

1310 1315 1320

Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly Gly Val Met Asp Glu

1325 1330 1335

Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser Arg Trp Arg Glu

1340 1345 1350

Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser

1355 1360 1365

Ile Gln Ser Ala Gln Glu Ile Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln

1370 1375 1380

Glu Ser Leu Ala Phe Ile Asp Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala

1385 1390 1395

Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro Gln Glu Ala Gln Lys Ile

1400 1405 1410

Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser Leu Glu Glu Met Lys

1415 1420 1425

Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg Val Leu Ser Gln

1430 1435 1440

Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser Met Lys Phe

1445 1450 1455

Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu Glu Glu

1460 1465 1470

Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala Leu

1475 1480 1485

Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn

1490 1495 1500

His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu

1505 1510 1515

Val Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys

1520 1525 1530

Gln Thr Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu

1535 1540 1545

Lys Leu His Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys

1550 1555 1560

Gln Gln Leu Glu Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys

1565 1570 1575

Glu Met Asn Ala Leu Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu

1580 1585 1590

Leu Thr Lys Arg Ser Ala Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp

1595 1600 1605

Ala Glu Ile Ala Trp Gly Lys Ala Thr Gln Lys Glu Val Glu Lys

1610 1615 1620

Gln Lys Ala His Leu Lys Ser Val Ile Glu Leu Gly Glu Ala Leu

1625 1630 1635

Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr Leu Val Glu Asp Lys Leu

1640 1645 1650

Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Val Ala Val Thr Ser Arg Ala Glu

1655 1660 1665

Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys His Met Glu Thr

1670 1675 1680

Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile Ile Gln Ala

1685 1690 1695

Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln Gln Lys

1700 1705 1710

Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Met Asn Asp Ile Arg

1715 1720 1725

Pro Lys Val Asp Ser Ile Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala

1730 1735 1740

Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Val Val Glu Pro Lys Ile Ser

1745 1750 1755

Glu Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr

1760 1765 1770

Gly Lys Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser

1775 1780 1785

Asp Ile Gln Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln

1790 1795 1800

Gly Val Asn Leu Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Ser Glu

1805 1810 1815

Asp Asn Glu Gly Thr Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn

1820 1825 1830

Leu His Glu Arg Ile Thr Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys

1835 1840 1845

Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp

1850 1855 1860

Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys Ala Leu Glu Ile Ser His Gln

1865 1870 1875

Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp Asp Leu Leu Lys Cys Leu

1880 1885 1890

Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu Pro Asp Pro Lys Asp

1895 1900 1905

Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu Gln Lys Lys Lys

1910 1915 1920

Glu Glu Leu Asn Ala Val His Arg Gln Ala Glu Gly Leu Ser Glu

1925 1930 1935

Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Ile Gln Ile Gln Leu Ser

1940 1945 1950

Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg Arg

1955 1960 1965

Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Val

1970 1975 1980

Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser

1985 1990 1995

Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Ser Glu

2000 2005 2010

Val Asp Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Ser Ala Lys Asp Phe

2015 2020 2025

Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Glu

2030 2035 2040

Cys Met Gln Gln Ile Ser Gly Arg Ile Asp Val Ile His Asn Lys

2045 2050 2055

Lys Ala Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Ala Ala Glu Arg Val Lys

2060 2065 2070

Leu Gln Glu Ala Leu Ala Gln Leu Asp Ser Gln Trp Glu Lys Val

2075 2080 2085

Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val

2090 2095 2100

Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Met Lys Ile Phe Asn Gln

2105 2110 2115

Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Lys Lys Thr Gln Ile Pro

2120 2125 2130

Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu

2135 2140 2145

Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn

2150 2155 2160

Thr Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala

2165 2170 2175

Asn Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Asn Leu Asn Leu Arg Trp Gln

2180 2185 2190

Glu Val Cys Lys Gln Leu Ala Glu Arg Arg Lys Arg Leu Glu Glu

2195 2200 2205

Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe

2210 2215 2220

Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Thr Ser Ile Pro Leu

2225 2230 2235

Glu Pro Gly Asn Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val

2240 2245 2250

Lys Leu Leu Ala Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys

2255 2260 2265

Gln Leu Asn Glu Ala Gly Gly Thr Ala Leu Val Ser Ala Pro Ile

2270 2275 2280

Ser Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr

2285 2290 2295

Asn Leu Gln Trp Ile Lys Val Ser Lys Ala Leu Pro Glu Lys Gln

2300 2305 2310

Glu Glu Ile Val Ala His Val Lys Glu Leu Gly Gln Leu Glu Glu

2315 2320 2325

Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp Leu Thr Pro Ile Arg Asn Gln

2330 2335 2340

Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn Gln Thr Gly Pro Phe Asp Ile

2345 2350 2355

Lys Glu Thr Glu Val Ala Val Gln Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu

2360 2365 2370

Arg Ile Leu Ser Lys Gly Gln His Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala

2375 2380 2385

Thr Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp

2390 2395 2400

Lys Val Val Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Lys Arg Pro

2405 2410 2415

Asp Leu Pro Pro Gly Pro Ala Thr Ile Gly Ala Ser Pro Ser Gln

2420 2425 2430

Thr Val Thr Leu Val Thr Gln Thr Val Val Thr Lys Glu Ile Ser

2435 2440 2445

Leu Ser Glu Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Leu Leu Glu Val Pro

2450 2455 2460

Ala Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp

2465 2470 2475

Leu Ser Leu Leu Asp Arg Val Leu Lys Ser Gln Gln Val Ile Val

2480 2485 2490

Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala

2495 2500 2505

Thr Leu Gln Glu Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu

2510 2515 2520

Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu

2525 2530 2535

Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln

2540 2545 2550

Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn Arg Ser Ser Ser Leu

2555 2560 2565

Asn Xaa Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu

2570 2575 2580

Glu Leu Ser Ser Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys Leu Ser Xaa Met

2585 2590 2595

Glu Glu Gly Pro Tyr Pro Met Asn Ala Leu Gln Lys Lys Ile Glu

2600 2605 2610

Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln Ile Asn

2615 2620 2625

Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr

2630 2635 2640

Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile

2645 2650 2655

Asn Ala Ser Trp Gly Ser Ile His Lys Arg Val Asn Glu Arg Glu

2660 2665 2670

Ala Thr Leu Glu Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu

2675 2680 2685

Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr

2690 2695 2700

Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr His Lys Glu Arg Leu Pro Glu

2705 2710 2715

Asp Ser Lys Gly Val Arg Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu

2720 2725 2730

Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Ile Tyr His Asn Leu Asp

2735 2740 2745

Glu Asn Gly Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Glu

2750 2755 2760

Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp

2765 2770 2775

Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu

2780 2785 2790

Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu

2795 2800 2805

Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Asn Arg Gln

2810 2815 2820

Ala Pro Val Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp

2825 2830 2835

Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val

2840 2845 2850

Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln

2855 2860 2865

Pro Leu Gly Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu

2870 2875 2880

Pro Pro Asp Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys

2885 2890 2895

Gln Ala Glu Glu Val Asn Ala Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His

2900 2905 2910

Ser Thr Asp Trp Gln Arg Lys Leu Asp Glu Ala Leu Glu Arg Leu

2915 2920 2925

Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg

2930 2935 2940

Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu

2945 2950 2955

Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu

2960 2965 2970

Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn

2975 2980 2985

Asp Leu Gly Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro

2990 2995 3000

Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu

3005 3010 3015

Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Ile Arg Gln Leu His Glu Ala

3020 3025 3030

His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser

3035 3040 3045

Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro

3050 3055 3060

Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro

3065 3070 3075

Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val

3080 3085 3090

Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln

3095 3100 3105

Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Thr Leu Ser Ala Ala Cys Asp

3110 3115 3120

Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp

3125 3130 3135

Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Val Tyr Asp Arg Leu

3140 3145 3150

Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp

3155 3160 3165

Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr

3170 3175 3180

Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu

3185 3190 3195

Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln

3200 3205 3210

Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu

3215 3220 3225

Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val

3230 3235 3240

Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys

3245 3250 3255

Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe

3260 3265 3270

Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro

3275 3280 3285

Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala

3290 3295 3300

Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr

3305 3310 3315

Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe

3320 3325 3330

Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met

3335 3340 3345

Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp

3350 3355 3360

Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe

3365 3370 3375

Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu

3380 3385 3390

Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Val Thr Leu Ile Asn Phe Trp

3395 3400 3405

Pro Val Asp Ser Ala Pro Ala Ser Ser Pro Gln Leu Ser His Asp

3410 3415 3420

Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser Arg Leu Ala Glu

3425 3430 3435

Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile Ser Pro

3440 3445 3450

Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His Tyr Cys

3455 3460 3465

Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro Arg Ser Pro

3470 3475 3480

Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly Glu Leu

3485 3490 3495

Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln

3500 3505 3510

Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys Gly Leu

3515 3520 3525

Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser Pro Gln

3530 3535 3540

Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala Lys Leu Leu Arg

3545 3550 3555

Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile Leu Glu Asp

3560 3565 3570

His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg Gln Leu

3575 3580 3585

Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr Val

3590 3595 3600

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro

3605 3610 3615

Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Glu Ser Met Gly

3620 3625 3630

Glu Glu Asp Leu Pro Ser Pro Pro Gln Asp Thr Ser Thr Gly Leu

3635 3640 3645

Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe Pro Ser Ser Arg

3650 3655 3660

Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys Pro Met Arg Glu Asp Thr Met

3665 3670 3675

<210> 9

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

Asp Asp Ala Met His

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 11

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 12

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 12

Glu Tyr Thr Ile His

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 13

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 14

Asp Phe Ser Met His

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 15

Ala Tyr Ser Met His

1 5

<210> 16

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 16

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 17

Asp Tyr Ser Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 18

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 19

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 20

Gly Ile Asn Cys Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Thr Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 21

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Asp Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 26

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 26

Xaa Leu Asp Phe

1

<210> 27

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 27

Gly Ala Ser Gly Tyr

1 5

<210> 28

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

Arg Phe Phe Tyr Gly Ser Ser Gln Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

Arg Gly Glu Phe

1

<210> 30

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

Arg Gly Asp Tyr

1

<210> 31

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

Arg Gly Asp Tyr

1

<210> 32

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 32

Arg Gly Asp Tyr

1

<210> 33

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 33

Gly Arg Ser Ala Tyr

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 34

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 35

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 35

Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Lys Asn Val Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 36

Arg Ala Ser Lys Ser Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 37

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 37

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Lys Asn Val Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Ile Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 39

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Arg Ser Asn Arg Asn Ile Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 40

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 40

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn Asn Arg Asn Ile Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 41

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 41

Lys Ala Ser Gln Thr Val Ser Asn Asn Val Ala

1 5 10

<210> 42

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 42

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

Ser Ser Ser Lys Arg Tyr Ser

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 44

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 45

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 45

Ser Ala Ser Lys Arg Tyr Thr

1 5

<210> 46

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 46

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 47

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 47

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 48

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 49

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

His Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

Leu Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

Ser Gln Asp Lys Tyr Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

Ser Gln Asp Ser His Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

Ser Gln Asp Arg Tyr Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

Thr Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

Thr Tyr Gly Met Thr

1 5

<210> 60

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

Trp Ile Asn Thr Ser Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asn Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 62

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 62

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Leu Pro Thr Tyr Thr Asn Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 63

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 63

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Leu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 64

Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 65

Trp Ile Asn Thr Phe Ser Gly Val Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 66

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 66

Pro Ile His Met Val Val Ala Glu Asp Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 67

Pro Ile His Lys Val Val Ala Glu Asp Tyr

1 5 10

<210> 68

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 68

Pro Ile Thr Thr Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 69

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 69

Pro Ile Thr Thr Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 70

Pro Ile Thr Lys Val Val Ala Gly Asp Phe

1 5 10

<210> 71

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 71

Pro Ile Thr Thr Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 72

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 72

Lys Ser Ser Gln Ile Leu Leu Tyr Gly Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 73

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 73

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 74

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 74

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Thr Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 75

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 75

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Asn Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 76

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 76

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 77

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 77

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 78

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 78

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 79

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 79

Trp Ala Ser Thr Trp Glu Ser

1 5

<210> 80

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 80

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 81

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 81

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 82

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 82

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 83

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 83

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 84

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 84

Gln Gln Tyr Tyr Ser Lys Pro Tyr Thr

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 85

Gln Gln Tyr Tyr Thr Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 86

Ser Gln Ser Arg His Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 87

Ser Gln Ser Arg His Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 88

Gln Gln Tyr Phe Ser Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 89

Ser Gln Ser Arg His Gly Pro Trp Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитело или его связывающий фрагмент, которые специфично связываются с белком-переносчиком глюкозы 4 (GLUT4). Также изобретение относится к композициям и способам доставки полезной нагрузки в клетки или ткани, которые экспрессируют GLUT4. Композиции содержат указанные антитело или его связывающий фрагмент, конъюгированные с терапевтической полезной нагрузкой. Полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок дистрофин или его функциональный фрагмент. Композиции по изобретению применимы для способов лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин. Изобретение обеспечивает невирусные векторные платформы, которые могут специфично доставлять терапевтическую полезную нагрузку в мышечные клетки без ограничений по размеру полезной нагрузки. 4 н. и 23 з.п. ф-лы, 25 ил., 3 табл.

1. Анти-GLUT4 антитело или его связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (V_H) и вариабельную область легкой цепи (V_L), где:

а) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:18, и VH-CDR3, имеющую последовательность LDF; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:34, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:42, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:50;

b) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:19, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:27; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:35, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:43, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:51;

c) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:12, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:20, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:28; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:36, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:44, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:52;

d) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:14, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:22, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:30; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:38, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:46, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:54;

e) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:15, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:23, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:31; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:39, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:47, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:55;

f) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:16, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:24, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:32; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:40, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:48, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:56; или

g) V_H содержит VH-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:17, VH-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:25, и VH-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:33; и V_L содержит VL-CDR1, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:41, VL-CDR2, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:49, и VL-CDR3, имеющую последовательность, приведенную в SEQ ID NO:57.

2. Композиция для доставки терапевтической полезной нагрузки в клетку, которая экспрессирует GLUT4, где композиция содержит антитело или его связывающий фрагмент по п. 1, конъюгированные с терапевтической полезной нагрузкой.

3. Композиция по п. 2, где антитело или его связывающий фрагмент представляют собой или содержат одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело.

4. Композиция по п. 3, где одноцепочечное антитело представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab).

5. Композиция по п. 2, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, белок или пептид, липид, низкомолекулярный фармацевтический препарат или радиоизотоп.

6. Композиция по п. 5, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, при этом нуклеиновая кислота выбрана из ДНК, мРНК, киРНК и кшРНК.

7. Композиция по п. 5, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту, при этом нуклеиновая кислота содержит открытую рамку считывания, функционально связанную с промоторной последовательностью.

8. Композиция по п. 5, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту в линейной форме, нуклеиновую кислоту в форме плазмиды или нуклеиновую кислоту в форме мини-кольца.

9. Композиция по п. 5, дополнительно содержащая гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой.

10. Композиция по п. 8, дополнительно содержащая липосому, связанную с нуклеиновой кислотой.

11. Композиция по п. 8, дополнительно содержащая множество катионных пептидных фрагментов, связанных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота.

12. Композиция по п. 2, где терапевтическая полезная нагрузка содержит нуклеиновую кислоту с промоторной последовательностью, функционально связанной с последовательностью, кодирующей белок дистрофин или его функциональный фрагмент.

13. Композиция по п. 12, где белок дистрофин представляет собой по существу полноразмерный белок дистрофин человека, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:5.

14. Способ таргетинга терапевтической полезной нагрузки для доставки в клетку, которая экспрессирует GLUT4, включающий приведение клетки в контакт с композицией по любому из пп. 2-13.

15. Способ по п. 14, дополнительно включающий контакт клетки в контакт с инсулином до контакта клетки с композицией.

16. Способ по п. 14, где клетка представляет собой клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы, клетку гладкой мышцы, клетку жировой ткани, клетку гиппокампа или клетку мозжечка.

17. Способ по п. 14, где клетка представляет собой клетку меланомы, клетку рака простаты, клетку рака мышечной ткани, такую как клетка рабдомиосаркомы, или клетку рака молочной железы.

18. Способ лечения заболевания или состояния у субъекта с генетической мутацией в гене, кодирующем белок дистрофин, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции по п. 12.

19. Способ по п. 18, где субъект имеет или является генетическим носителем мышечной дистрофии Дюшенна («DMD») или мышечной дистрофии Беккера («BMD»).

20. Способ по п. 18, где антитело или его связывающий фрагмент представляет собой или содержит одноцепочечное антитело, Fab-фрагмент, F(ab)₂-фрагмент, V_HH-фрагмент, V_NAR-фрагмент или нанотело.

21. Способ по п. 20, где одноцепочечное антитело представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или одноцепочечный Fab-фрагмент (scFab).

22. Способ по п. 18, где нуклеиновая кислота находится в линейной форме, плазмидной форме или форме мини-кольца.

23. Способ по п. 22, где композиция дополнительно содержит гистоновый белок или множество гистоновых белков, связанных с нуклеиновой кислотой.

24. Способ по п. 22, где композиция дополнительно содержит липосому, связанную с нуклеиновой кислотой.

25. Способ по п. 18, дополнительно включающий множество катионных пептидных фрагментов, связанных с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется конденсированная нуклеиновая кислота.

26. Способ по п. 18, где кодируемый белок дистрофин имеет идентичности последовательности по меньшей мере 80% с SEQ ID NO:5.

27. Способ по п. 18, где субъектом является человек.