СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН Российский патент 2021 года по МПК C07K14/33 A61K38/48 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка заявляет приоритет согласно Своду федеральных законов США 119(е) по предварительной заявке США № 62/138818, поданной 26 марта 2015 года, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА

[0002] Настоящее изобретение было сделано при государственной поддержке NIH NCRR RR000168, присужденной Национальным институтом здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение относится к области модифицированных нейротоксинов и их применению для лечения болезней и/ или эстетических нарушений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Ботулинические нейротоксины представляют собой семейство бактериальных токсинов, включая семь основных серотипов (BoNT/A-G)1. Эти токсины действуют, блокируя высвобождение нейротрансмиттера из нейронов, таким образом парализуя животных и людей. В последние годы BoNT широко используются для лечения растущего списка патологических состояний: местные инъекции незначительного количества токсинов могут ослаблять активность нейронов в целевых областях, что может быть полезным во многих патологических состояних, а также в косметических целях^2-4.

[0005] BoNT/A и BoNT/B являются единственными двумя BoNT, которые в настоящее время одобрены FDA (Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США) для применения у людей^2-4. Это токсины, очищенные от бактерий без каких-либо модификаций последовательности (определенные как дикий тип, ДТ). По мере того, как растет применение BoNT, сообщают об ограничениях и побочных эффектах. Основным ограничением является генерация нейтрализующих антител у пациентов, что делает будущее лечение неэффективным⁵. Прекращение использования BoNT часто оставляет пациентов без других эффективных способов лечения/облегчения их расстройств. Вероятность образования антител напрямую связана с дозами токсинов и частотой инъекций⁵. Поэтому это ограничение в основном происходит при лечении мышечных спазмов, которое связаны с относительно высокими дозами токсинов. Равным образом, образование антител не наблюдали при применениях в косметических целях, в которых используют чрезвычайно низкие дозы токсинов⁵.

[0006] Основные побочные эффекты также часто связаны с лечением мышечных спазмов, но не с применениями в косметических целях. Это связано с тем, что побочные эффекты в значительной степени обусловлены диффузией токсинов в другие области тела, и возможность диффузии токсинов напрямую связана с вводимыми дозами. Побочные эффекты варьируются от временных несерьезных явлений, таких как птоз и диплопия, до опасных для жизни явлений, даже смерти^6,7. В письме с ходатайством, поданном в 2008 году доктором Сиднеем Вулфом в FDA, было зарегистрировано в общей сложности 180 серьезных побочных эффектов, включая 16 смертей. В результате FDA теперь требует «предостережения в черной рамке» ко всем продуктам BoNT, подчеркивая риск распространения токсинов, следуя аналогичным предупреждениям, выпущенным Европейским союзом.

[0007] Поскольку как генерация нейтрализующих антител, так и диффузия токсинов напрямую связаны с вводимыми дозами, очень желательно снизить дозы токсинов (при сохранении одинаковых уровней активности токсинов), что означает, что эффективность отдельных молекул токсинов должна быть повышена. Такие модифицированные BoNT с улучшенной специфичностью к нейронам также уменьшают любые потенциальные побочные эффекты из-за неспецифического входа в другие типы клеток.

[0008] BoNT нацеливают и поступают в нейроны путем связывания с их специфическими рецепторами через их рецептор-связывающие домены, которые хорошо определены в литературе (BoNT-H_C, Фигура 1A, Б)¹. Связывание рецепторов обуславливает эффективность и специфичность BoNT для распознавания нейронов. Улучшение способности связывания рецепторов BoNT повысит их эффективность и специфичность для целевых нейронов. Рецепторы для большинства BoNT были идентифицированы (Фигура 1В). BoNT/B, D-C и G имеют два гомологичных синаптических везикулярных белка, синаптотагмин I и II, (Syt I/II) в качестве их рецепторов^8-13, в то время как BoNT/A, E, D и F используют другой синаптический везикулярный белок SV2^9,14-18. В дополнение к рецепторам белка все BoNT нуждаются в липидных корецепторных ганглиозидах (Фигура 1Г), которые многочисленны на поверхностях нейронов¹⁹. Среди двух Syt-изоформ Syt II имеет ~10-кратную аффинность связывания для BoNT/B, чем для Syt I, и также является доминирующей изоформой, экспрессирующейся в окончаниях двигательных нервов, которые являются целевыми нейронами для BoNT (Фигура 2A)^20,21. Таким образом, Syt II считается основным рецептором токсинов для BoNT/B, D-C и G, тогда как Syt I является минорным рецептором токсинов на окончаниях двигательного нерва. Это имеет место у грызунов и, вероятно, у большинства млекопитающих.

[0009] Можно утверждать, что BoNT уже обладают высокой специфичностью к нейронам и спрашивается, возможно ли дальнейшее улучшение их связывания с нейронами? Ответ - «Да» для людей, по меньшей мере частично, в свете недавнего открытия того, что человеческий Syt II значительно уменьшает связывание и функционирует как рецептор для BoNT/B из-за уникального изменения аминокислот от Syt II грызунов (крыса/мышь) в месте связывания токсина^13,22. Это изменение фенилаланина (F) на лейцин (L) в положении 54 (последовательность Syt II мыши) (Фигура 2Б). Выравнивания последовательностей показали, что фенилаланин в этом положении является высококонсервативным как у Syt I, так и у Syt II у позвоночных, включая утконосов, рыб, грызунов и обезьян²³. Только Syt II человека и шимпанзе содержит лейцин в этом положении. В результате данного изменения остатка, Syt II человека и шимпанзе значительно уменьшил связывание с BoNT/B, D-C и G (Фигура 2В) и значительно менее эффективен при опосредовании входа BoNT/B (Фигура 2Г) по сравнению с Syt II мыши. Поскольку Syt I человека и шимпанзе все еще содержит фенилаланин в одном и том же положении и может связывать BoNT/B, D-C и G (Фигура 2Д), высокоаффинный рецептор для BoNT/B, D-C и G у людей ограничен минорным рецептором Syt I. Эти данные дают объяснение клиническим наблюдениям, что для достижения тех же уровней терапевтических эффектов у пациентов требуется гораздо более высокая доза BoNT/B, чем BoNT/A (который связывает другой рецептор)^24,25. Ранее эти наблюдения связывали с другими причинами, такими как процент активного нейротоксина в используемых препаратах. Недавние наблюдения таких связующих различий BoNT/B с Syt II человека и Syt II других видов демонстрируют, что различные остатки BoNT/B могут быть вовлечены в связывание с Syt II человека. Таким образом, модификация последовательности к BoNT/B, которая, как ожидается, повлияет на связывание с SytII грызуна, может иметь непредсказуемые последствия для связывания BoNT/B с Syt II человека.

[0010] Таким образом, существует большая потребность в улучшении связывания BoNT/B с человеческим рецептором Syt II в качестве способа повышения его эффективности и специфичности для целевых нейронов человека и снижения дозы токсинов, необходимой для применения в терапевтических целях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Один аспект настоящего изобретения относится к полипептиду ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащему протеазный домен, протеазный сайт расщепления, транслокационный домен и модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующие мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранную из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения модифицированный (B-H_c) содержит одну мутацию по типу замены, соответствующую мутации по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранную из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191C в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191V в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит две мутации по типу замены.

[0012] Другой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащему протеазный домен, протеазный сайт расщепления, транслокационный домен и модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующие мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, причем одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L и E1191Y. В одном варианте реализации изобретения одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.

[0013] Другой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащему протеазный домен, протеазный сайт расщепления, транслокационный домен и модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий мутацию по типу замены в положении, соответствующем S1199 или S1201 серотипа B штамма 1.

[0014] В одном варианте реализации любого из полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный B-H_c содержится в штамме 1. В одном варианте реализации любого из полипептидов, описанных в данном документе, протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу, выбранному из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций. В одном варианте реализации любого из полипептидов, описанных в данном документе, протеазный домен, транслокационный домен, и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу B штамма 1. В одном варианте реализации любого из полипептидов, описанных в данном документе, протеазный домен, транслокационный домен, и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу А штамма 1. В одном варианте реализации любого из полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный B-Hc не содержится в штамме 1.

[0015] Другой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранном из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации. В одном варианте реализации изобретения модифицированный (B-H_c) содержит две мутации по типу замены.

[0016] Другой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, в котором одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L и E1191Y. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный B-H_c содержится в штамме 1. В одном варианте реализации полипептидов, описанных в данном документе, модифицированный B-Hc не содержится в штамме 4. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8.

[0017] Другой аспект настоящего изобретения относится к химерной молекуле, содержащей первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H_c содержит одну или более мутаций по типу замены, выбранных из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-H_c содержит две мутации по типу замены.

[0018] Другой аспект настоящего изобретения относится к химерной молекуле, содержащей первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H_c содержит две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, при этом одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L и E1191Y. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации химерных молекул, описанных в данном документе, три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.

[0019] В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, модифицированный B-H_c содержится в штамме 1. В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, модифицированный B-Hc не содержится в штамме 4. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8.

[0020] В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, первая часть и вторая часть связаны ковалентно. В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, первая часть и вторая часть связаны нековалентно. В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, вторая часть выбрана из группы, состоящей из малой молекулы, нуклеиновой кислоты, короткого полипептида и белка. В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, вторая часть представляет собой биоактивную молекулу. В одном варианте реализации любой из химерных молекул, описанных в данном документе, вторая часть представляет собой терапевтический полипептид или неполипептидное лекарственное средство.

[0021] Аспекты настоящего изобретения дополнительно относятся к любому из полипептидов BoNT, полипептидов или химерных молекул, описанных в данном документе, который проявляет значительно усиленное связывание модифицированного B-Hc с человеческим SytII и/или значительно уменьшенное связывание модифицированного B-Hc с человеческим Syt I по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутации(ию) по типу замены.

[0022] Аспекты настоящего изобретения дополнительно относятся к любому из полипептидов BoNT, полипептидов или химерных молекул, описанных в данном документе, причем мутация по типу замены приводит к значительно усиленному связыванию с SytII человека и/или значительно усиленному связыванию с Syt I человека по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутации(ию) по типу замены.

[0023] Другой аспект настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид BoNT, полипептид или химерную молекулу, описанную в данном документе. Другой аспект настоящего изобретения относится к вектору нуклеиновой кислоты, содержащему нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид BoNT, полипептид или химерную молекулу, описанную в данном документе. Другой аспект настоящего изобретения относится к клетке, содержащей нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид BoNT, полипептид или химерную молекулу, описанную в данном документе, или вектор нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту.

[0024] Другой аспект настоящего изобретения относится к клетке, экспрессирующей любой из полипептидов BoNT, полипептидов или химерных молекул, описанных в данном документе.

[0025] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из полипептидов, описанных в данном документе, ботулинического нейротоксина (BoNT).

[0026] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из полипептидов, описанных в данном документе.

[0027] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из химерных молекул, описанных в данном документе.

[0028] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из нуклеиновых кислот или векторов нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе.

[0029] В одном варианте реализации любой из фармацевтических композиций, описанных в данном документе, фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0030] Другой аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему любую из фармацевтических композиций, описанных в данном документе, и направления для терапевтического назначения фармацевтической композиции.

[0031] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения любого из полипептидов, описанных в данном документе, ботулинического нейротоксина (BoNT), включающий стадии культивирования клетки, которая экспрессирует полипептид BoNT в условиях, в которых продуцируется указанный полипептид BoNT. В одном варианте реализации изобретения способ дополнительно включает одну или более стадий извлечения полипептида BoNT из культуры, очистку полипептида BoNT, активацию полипептида BoNT и/или приготовление полипептида BoNT.

[0032] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, включающий введение терапевтически эффективного количества, описанного в данном документе полипептида BoNT для приведения в контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную активность нейронов, таким образом, чтобы лечить патологическое состояние. В одном варианте реализации изобретения патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спазматического кривошея, дистонии мышц гортани, oромандибулярной дистонии, лингвальной дистонии, цервикальной дистонии, графоспазма, блефароспазма, косоглазия, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений речи, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря (т.е. все заболевания, связанные с недержанием мочи, такие как, например, нейрогенная гиперактивность детрузора или нейрогенная сверхактивность мышцы-сжимателя), анизмуса, спастичности конечностей, тика, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии и других нарушений мышечного тонуса и других расстройств, характеризующихся непроизвольными движениями мышечных групп, лакримации, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерных желудочно-кишечных выделений, секреторных расстройств, боли от мышечных спазмов, невропатической боли, воспалительной боли, головной боли (например, мигрень), зуда (прурита), акне, и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.

[0033] Другой аспект настоящего изобретения относится к любому из полипептидов ботулинического нейротоксина (BoNT) или к фармацевтическим композициям, или к химерным молекулам, или к полипептидам, описанным в данном документе, для применения в медицине.

[0034] Другой аспект настоящего изобретения относится к любому из полипептидов ботулинического нейротоксина (BoNT) или фармацевтическим композициям, или химерным молекулам или полипептидам, описанным в данном документе, для применения в лечении патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью.

[0035] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации модифицированного рецептор-связывающего домена ботулинического нейротоксина для связывания с рецептором, включающему экспрессию модифицированного рецептор-связывающего домена в качестве первого гибридного белка с субъединицей T18 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе, и экспрессию рецептора в качестве второго гибридного белка с субъединицей T25 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе, анализируя клональную колонию E.coli, которая экспрессирует как первый, так и второй гибридный белок для присутствия положительного признака выше отрицательного контроля, и определение модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, проявляющей положительный признак, такой как связывание с рецептором. В одном варианте реализации изобретения позитивный признак представляет собой появление окраски. В одном варианте реализации способов, описанных в данном документе, способ дополнительно включает стадию анализа колонии на положительный признак против слабоположительного контроля и дальнейшую идентификацию модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, имеющей положительный признак выше слабоположительного контроля, такого как связывание с рецептором с высокой аффинностью. В одном варианте реализации способов, описанных в данном документе, способ осуществляют с помощью библиотеки модифицированных рецептор-связывающих доменов, каждый из которых экспрессирован в соответствующих колониях. В одном варианте реализации способов, описанных в данном документе, рецептор является человеческим. В одном варианте реализации способов, описанных в данном документе, модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более мутаций по типу замены, причем одна из мутаций по типу замены соответствует мутации в серотипе B штамма 1, выбранной из группы, состоящей из: E1191M, E1191 Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и S1199Y.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0036] На Фигуре 1A - Фигуре 1Г (опубликованные данные для краткой информации) показаны схематические модели того, как BoNT нацелены на нейроны (Фигура 1A), их общая структура белка (Фигура 1Б), список идентифицированных рецепторов (Фигура 1В) и структурная модель для BoNT/B, связывающихся с его рецепторами Syt и ганглиозидами (Фигура 1Г). (Фигура 1A) Схематическое изображение механизма действия BoNT: BoNT распознают нейроны путем связывания их специфических рецепторов (стадия 1), поступают в нейроны через рецептор-опосредованный эндоцитоз (стадия 2), легкие цепи BoNT затем транслоцируют через эндосомальные мембраны в цитозоль (стадия 3), где эти легкие цепи действуют как протеазы для расщепления целевых белков хозяина (стадия 4). Фигура 1А адаптирована из Arnon, S. et al, JAMA, 285:1059, 200124. (Фигура 1Б) BoNT состоят из легкой цепи и тяжелой цепи, соединенных посредством дисульфидной связи. Тяжелая цепь может быть далее разделена на две области: транслокационный домен (H_N) и рецептор-связывающий домен (H_C). Эти функциональные области переключаются между различными BoNT. Например, BoNT/B-H_C можно использовать для замены BoNT/A-H_C для получения химерных токсинов. (Фигура 1В) Список идентифицированных рецепторов токсинов. (Фигура 1Г) Структурная модель, демонстрирующая связывание BoNT/B с его белковым рецептором Syt (I/II), а также его липидным корецептором, ганглиозидом, на поверхности клетки. Фигура 1Г адаптирована из Chai et al, Nature, 444:1096, 2006³¹.

[0037] На Фигуре 2A - Фигуре 2Г показаны предварительные данные, адаптированные из опубликованной литературы, указывающие на то, что Syt II человека не является эффективным рецептором для BoNT/B, D-C и G. (A) Syt II человека отличается от Syt II мыши/крысы одним остатком в участке связывания токсина (остаток 54 в Syt II мыши, 51 в Syt II человека). (Показан SytII (мышь) SEQ ID NO: 1 и показан SytII (человек) SEQ ID NO: 14). (Фигура 2Б). Глутатион S-трансфераза (GST), меченная рекомбинантным мышиным Syt II 1-87 (m-Syt II), и мутантный Syt II 1-87 мыши (m-Syt II), имитирующий Syt II человека, (F54L, здесь и далее, как h-Syt II для упрощения текста) были иммобилизованы на гранулах глутатион-сефарозы и использовались для осаждения BoNT/B, BoNT/D-C или BoNT/G с присутствием ганглиозида (Gangl) или без него. Все три токсина связываются с m-Syt II 1-87, но не с h-Syt II в тесте на связывания. (Фигура 2В) Культивируемые нейроны гиппокампа крысы экспрессируют только Syt I, но не Syt II8. Поэтому нокдаун (KD) Syt I приводит к образованию нейронов без рецепторов эндогенных токсинов. Полноразмерные m-Syt II и h-Syt II затем экспрессировались в нейронах гиппокампа Syt I KD, и эти нейроны подвергались воздействию BoNT/B (20 нмоль/л, 5 мин экспозиции, 24 часа инкубации) или BoNT/DC (0,3 нмоль/л, 5 мин экспозиции, 6 часов инкубации), или BoNT/G (40 нмоль/л, 5 мин экспозиции, 24 часа инкубации). h-Syt II был признан значительно менее эффективным при опосредовании поступления BoNT/B, BoNT/D-C и BoNT/G в нейроны Syt I KD по сравнению с Syt II мышей дикого типа, о чем свидетельствуют степени расщепления субстрата токсина синаптобревина (Syb). (Фигура 2Г) Крысиный Syt I 1-83 и человеческий Syt I 1-80 использовали для осаждения BoNT/B, BoNT/D-C и BoNT/G, как описано в панели C. Человеческий Syt I опосредовал аналогичные уровни связывания токсинов крысиному Syt I для всех трех токсинов. Данная фигура адаптирована из нашей недавней публикации: Peng et al., J. Cell Science, 201213.

[0038] На Фигуре 3А - Фигуре 3Б показаны остатки, расположенные в поверхности связывания Syt II на BoNT/B-H_C, которые являются кандидатами на сайт-направленный мутагенез для изменения аффинности связывания. (Фигура 3A) Здесь показан вид сверху поверхности связывания между BoNT/B-H_C и мышиным Syt II. Остатки в BoNT/B-H_C, которые способствуют связыванию, выделены жирным шрифтом, тогда как остатки в Syt II не выделены жирным шрифтом. Остаток F54 в Syt II, посередине и показанный чуть большим размером шрифта, изменяется на остаток L в человеческом Syt II. (Фигура 3Б) Список из 19 ключевых остатков в BoNT/B, которые образуют связывающий карман Syt II-связывающего домена в BoNT/B. Эти остатки являются кандидатами для сайт-направленного мутагенеза.

[0039] Фигура 4A - Фигура 4Б представляют собой иллюстрации бактериальной двугибридной системы на основе аденилатциклазы (BACTH), которая используется для скрининга мутантов BoNT/B-H_C на их способность связывать Syt II человека. (Фигура 4A) Пул мутантов BoNT/B-H_C, который охватывает все 20 различных аминокислот в выбранном положении, генерируется путем ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими случайные тринуклеотиды (NNN) на выбранном сайте. Всего было создано 19 различных пулов для всех 19 остатков, выбранных на фиг. 3Б. (Фигура 4Б) Схематическое изображение системы BACTH. Вкратце, бактериальная аденилатциклаза разделяется на два домена, обозначенных как T25 и T18. T25 слит с человеческим Syt II (остатки 1-87), который содержит сайт связывания с токсином, тогда как T18 слит с BoNT/B-H_C, полученным, как описано на Фигуре 4A. Эти два гибридных белка кодируют на двух разделенных плазмидах и совместно трансформируют в те же бактерии. Связывание мутированного BoNT/B-H_C с человеческим Syt II объединяет домены T25 и T18 в бактериях, которые восстанавливают активность бактериальной аденилатциклазы. Это приводит к получению цАМФ у бактерий, который активирует белок CAP и вызывает экспрессию репортерного гена lacZ, который кодирует β-галактозидазу. Активность β-галактозидазы приводит к образованию синих колоний в чашках с X-gal (раствор 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозида), которые можно легко идентифицировать. Плазмиды, которые кодируют BoNT/B-H_C, затем могут быть извлечены из синих колоний и секвенированы для идентификации специфических мутаций в BoNT/B-H_C.

[0040] Фигура 5A - Фигура 5Б представляют собой таблицы, в которых приведены результаты скрининга с использованием BACTH мутантов BoNT/B-H_C. (Фигура 5A) Список общего количества колоний и количество синих колоний для каждого пула мутантов BoNT/B-H_C, слитых с T18, совместно экспрессированных в бактериях с человеческим Syt II, слитым с T25. Основываясь на уравнении Clark-Carbon, количество полных колоний должно быть больше 380, чтобы достичь 99,8% возможности покрытия всех 20 возможных аминокислот в одной позиции. Четыре позиции привели к значительному количеству синих колоний (68 часов после нанесения покрытия). (Фигура 5Б). Плазмиды из синих колоний, идентифицированных на фиг. 5А, экстрагировали и секвенировали для определения конкретного остатка, введенного в указанном положении в BoNT/B-H_C. Идентифицированные остатки перечислены. Следует отметить, что синие колонии были далее разделены на «темно-синие колонии», у которых обнаружили положение 1191 BoNT/B-H_C и «светло-синие колонии», у которых обнаружили положения 1183, 1199 и 1178. Термин «темно-синие колонии» по сравнению со «светло-синими колониями» искусственно оценивался экспериментатором на основе различий между синим цветом колоний.

[0041] На Фигуре 6A - Фигуре 6Б показаны экспериментальные результаты, которые указывают на полуколичественное измерение взаимодействий между указанными мутантами BoNT/B-H_C с человеческим Syt II в анализе BACTH. (Фигура 6A) Активность β-галактозидазы измеряли из лизатов бактерий, которые экспрессируют как Syt II человека, слитого с T25, так и обозначенных мутантов BoNT/B-H_C, слитых с T18. Активность β-галактозидазы, по-видимому, отражает силу взаимодействия между Syt II человека и BoNT/B-H_C. BoNT/B-H_C ДТ служил в качестве контроля. Замена остатков E1191 на M, C, V или Q обеспечило наиболее сильную экспрессию β-галактозидазы. Замена остатков E1191 на S/A/T/N, Y1183 на C/P, S1199 на W/E/Y/H, W1178 на Y/Q/S показала небольшое увеличение взаимодействий. N=6 образцов/группа. (Фигура 6Б) Связывание указанных мутантов BoNT/B-H_C или с мышиным Syt II (m-Syt II), или с человеческим Syt II (h-Syt II), сайты связывания которых показаны на фиг. 2A, анализировали при помощи теста на связывание. Замена остатков E1191 на M, C, V или Q также показали самое сильное связывание с h-Syt II.

[0042] На Фигуре 7A - Фигуре 7Б показаны экспериментальные результаты скрининга вторичных мутаций в дополнение к положению E1191, которые могут усилить связывание с h-Syt II. (Фигура 7A) Двойные мутации были созданы путем объединения E1191M со всеми остальными десятью изменениями остатков, указанными на фиг. 5Б, в положениях S1199/Y1183/W1178, соответственно. Эти двойные мутации анализировали на их способность связывать h-Syt II при помощи теста на связывание. Мутанты, которые демонстрируют сильное связывание с h-Syt II, обозначены символом* (Фигура 7Б). Предлагаемые мутации для комбинации, которые могут усилить аффинность между BoNT/B и человеческим Syt II, перечислены в таблице.

[0043] На Фигуре. 8A - Фигуре 8Б показан количественный анализ аффинности связывания между указанными BoNT/B-H_C и h-Syt II. (Фигура 8А). Связывание GST, меченной h-Syt II, с His-меченным BoNT/B-H_C ДТ и E1191M/S1199Y измеряли с помощью интерферометрии биослоев. Вкратце, анти-GST-биосенсоры были загружены GST-h-Syt II. Загруженные биосенсоры инкубировали с 1 мкмоль/л белков BoNT/B-H_C для измерения кинетики ассоциации с последующими стадиями промывки для измерения кинетики диссоциации. Показаны типичные кривые ассоциации и диссоциации. (Фигура 8Б) Аффинность связывания между указанными BoNT/B-H_C и Syt II измеряли с помощью интерферометрии биослоев, как описано в панели A. Кинетические параметры (k_on и k_off) и общая аффинность связывания (K_D) были рассчитаны по нелинейной подгонке кривых ассоциации и диссоциации. Связывание BoNT/B-H_C ДТ с h-Syt II слишком слабо для того, чтобы быть достоверно определенным, с расcчитанным K_D выше пределу детектирования (>20 мкмоль/л), тогда как большинство двойных и тройных мутантов показали резко увеличенную аффинность связывания в диапазоне от 0,59 до 4,30 мкмоль/л.

[0044] На Фигуре 9A- Фигуре 9В показаны экспериментальные результаты, которые указывают на что, что выбранные мутанты BoNT/B-H_C имеют усиленное связывание с человеческим Syt I. (Фигура. 9А) BoNT /B-H_C ДТ и мутант E1191M очищали в виде His6-меченых рекомбинантных белков (His₆, представленный SEQ ID NO: 13) и инкубировали с иммобилизованным GST-меченным h-Syt I (1-80), с или без присутствия корецепторных ганглиозидов (Gangl). Связывание BoNT/B-H_C ДТ с h-Syt I требует наличия корецепторных ганглиозидов, что указывает на относительно слабые взаимодействия между BoNT/B-H_C ДТ и h-Syt. Мутант E1191M может связываться с h-Syt I без ганглиозидов, демонстрируя улучшенную аффинность связывания с h-Syt I. (Фигура 9Б) Связывание ДТ и указанного мутантного BoNT/B-H_C с h-Syt I измеряли с помощью интерферометрии биослоев, как описано на фиг. 8А. (Фигура 9В) Кинетические параметры (k_on и k_off) и общая аффинность (K_D) для BoNT/B-H_C ДТ, BoNT/B-H_C (E1191M/S1199Y) («B H_C MY») и BoNT/B-H_C (E1191V/S1199Y) («B H_C VY») с h-Syt I измеряли и рассчитывали, как описано на фиг. 8Б. Связывание BoNT/B-H_C ДТ (B H_C дт) с h-Syt I не может быть надежно определено с рассчитанным KD выше предела детектирования (> 20 мкмоль/л). BoNT/B-H_C (E1191M/S1199Y, B H_C, MY) и BoNT/B-H_C (E1191V/S1199Y, B H_C VY) показали резко увеличенную аффинность связывания с K_D ≥ 2,9 мкмоль/л и 5,82 мкмоль/л, соответственно.

[0045] На Фигуре 10A - Фигуре 10Б представлены фотографии иммуноокрашивания in situ, указывающие на то, что H_CB_MY продемонстрировал надежное связывание с гуманизированными нейронами, которые экспрессируют h-Syt II. (Фигура 10A) Гуманизированные нейроны были созданы путем нокдауна эндогенного Syt I и экспрессии полноразмерного h-Syt II в культивируемых кортикальных нейронах крыс. Нейроны, которые экспрессируют полноразмерный m-Syt II или m-Syt II (F54L), служили в качестве дополнительного контроля. Эти нейроны подвергали воздействию H_CB ДТ с последующим анализом иммуноокрашивания. Связанный H_CB был обнаружен с помощью метки HA (гемаглютинин), слитой с H_CB. Синапсин был помечен как маркер пресинаптических нервных окончаний. H_CB ДТ связан с синапсами нейронов ДТ, но не с нейронами Syt I KD. Экспрессия полноразмерного m-Syt II посредством лентивирусной трансдукции восстанавливала связывание H_CB, в то время как экспрессия полноразмерного m-Syt II (F54L) или полноразмерного h-Syt II не смогла восстановить связывание. (Фигура 10Б) Syt I KD также аннулировал связывание H_CB_MY с нейронами. Связывание восстанавливали экспрессией полноразмерного m-Syt II, m-Syt II (F54L) и h-Syt II.

[0046] На Фигуре 11A - Фигуре 11В представлены экспериментальные результаты, которые показывают, что BoNT/B_MY демонстрируют повышенную эффективность при блокировании передачи нервных импульсов в гуманизированных нейронах. (Фигура. 11A) Гуманизированные нейроны были получены, как описано на Фигура 11A. Эти нейроны подвергались воздействию градиента концентраций полноразмерного BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY в течение 24 часов. Лизаты клеток собирали и подвергали иммуноблоттингу. β-тубулин служил в качестве внутреннего контроля для нанесения. При помощи BoNT/B_MY было расщеплено больше VAMP2, чем при помощи BoNT/B ДТ при тех же концентрациях, что указывает на то, что BoNT/B_MY поступали в нейроны более эффективно, чем BoNT/B ДТ. Гуманизированные нейроны подвергались воздействию градиенту концентраций BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY в течение 24 часов, а затем активность mIPSC регистрировали при помощи метода локальной фиксации потенциала по всей клетке. На Фигуре. 11Бпоказаны типичные записи mIPSC при 30 мкмоль/л токсинов. На Фигуре 11В изображена активность mIPSC против концентрации токсинов, нормированной на нейроны, которые не подвергались воздействию каких-либо токсинов. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (ИК₅₀) составляет 89 пмоль/л для BoNT/B ДТ и 7,8 пмоль/л для BoNT/B_MY, демонстрируя, что усиленное связывание с рецепторами человека приводит к повышению эффективности токсина при функциональных уровнях в нейронах.

[0047] На Фигуре 12 показана аминокислотная последовательность штамма BoNT/B-H_c (штамм 1, штамм Okra BoNT/B1). Остатки 857-1291 BoNT/B, штамм 1, GenBank: AB232927.1. (SEQ ID NO: 2).

[0048] На Фигуре 13 показана последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая штаммы BoNT/B-Hc (штамм B1, штамм Okra) 857-1291 BoNT/B, штамм 1, на основе GenBank: AB232927.1), который был оптимизирован для экспрессии в E. coli. (SEQ ID NO: 3)

[0049] На Фигуре 14 показана аминокислотная последовательность серотипа A C. botulinum (1296 АК(аминокислот)). (SEQ ID NO: 4)

[0050] На Фигуре 15 показана аминокислотная последовательность серотипа B C. botulinum (1291 АК). (SEQ ID NO: 5)

[0051] На Фигуре 16 показана аминокислотная последовательность серотипа C1 C. botulinum (1291 АК). (SEQ ID NO: 6)

[0052] На Фигуре 17 показана аминокислотная последовательность серотипа D C. botulinum (1276 АК). (SEQ ID NO: 7)

[0053] На Фигуре 18 показана аминокислотная последовательность серотипа E C. botulinum (1252 АК). (SEQ ID NO: 8)

[0054] На Фигуре 19 показана аминокислотная последовательность серотипа F C. botulinum (1274 АК). (SEQ ID NO: 9)

[0055] На Фигуре 20 показана аминокислотная последовательность серотипа G C. botulinum (1297 АК). (SEQ ID NO: 10)

[0056] На Фигуре 21 показана аминокислотная последовательность серотипа B штамма Eklund 17B С. botulinum (BoNT/B4) (SEQ ID NO: 11) Genbank Ref: EF051570.1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0057] Аспекты настоящего изобретения относятся к генерации полипептидов и нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, содержащих модифицированный рецептор-связывающий домен Clostridium botulinum (например, серотип B (B-H_c)) и, более конкретно, к полипептиду нейротоксина C. botulinum (BoNT), который имеет улучшенное связывание с его рецепторами человека посредством введения модифицированного рецептор-связывающего домена и нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид. Исходя из этих результатов, новое поколение терапевтических BoNT может быть создано путем применения модифицированного рецептор-связывающего домена, идентифицированного в данном документе, с улучшенной эффективностью и специфичностью для целевых нейронов человека, по сравнению с применяемыми в настоящее время BoNT ДТ.

Определения

[0058] Используемый в данном документе термин «аффинность связывания» означает, насколько сильна связывающая активность молекулы к конкретной рецепторной системе. В общем, высокая аффинность связывания обусловлена большей силой межмолекулярного взаимодействия между связывающим доменом и его рецепторной системой, в то время как низкая аффинность связывания обусловлена меньшей силой межмолекулярного взаимодействия между лигандом и его рецептором. Высокая аффинность связывания включает более длительное время удержания для связывающего домена в его рецептор-связывающем сайте, по сравнению со случаем с низкой аффинностью связывания. Таким образом, молекула с высокой аффинностью связывания означает, что более низкая концентрация этой молекулы требуется для максимального заполнения сайтов связывания рецепторной системы и инициирования физиологического ответа. И наоборот, низкая аффинность связывания означает, что требуется относительно высокая концентрация молекул, прежде чем рецептор-связывающие сайты рецепторной системы будут максимально заполнены и максимальный физиологический ответ будет достигнут. Таким образом, ботулинический нейротоксин согласно настоящему изобретению с повышенной связывающей активностью из-за высокой аффинности связывания позволит вводить уменьшенные дозы токсина, тем самым уменьшая или предотвращая нежелательные побочные эффекты, связанные с рассеиванием токсинов в нецелевые области.

[0059] Один параметр, который часто используется для измерения аффинности связывания, определяется как связывающая K_D. Поскольку K_D определяется как отношение константы диссоциации (K_off) и константы ассоциации (K_on), то чем ниже значение K_D, тем выше аффинность связывания.

[0060] Как используется в данном документе термин «значительно усиленное связывание», при использовании для описания аффинности связывания молекулы нейротоксина C. botulinum или его связывающего фрагмента BoNT/B-H_c согласно настоящему изобретению со специфическим рецептором (например, человеческий Syt II или человеческий Syt I), относится к увеличению аффинности связывания со специфическим рецептором, которая существенно увеличивается (например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% аффинности связывания молекулы дикого типа) по сравнению с аффинностью связывания незамещенного варианта молекулы. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание замещенной молекулы демонстрируется при помощи аффинности связывания, которая на порядок или еще больше, чем аффинность связывания незамещенной молекулы (например, нейротоксин с природной молекулой BoNT H_C). Другими словами, K_D замещенной молекулы на порядок или более ниже, чем K_D незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание демонстрируется при помощи аффинности связывания, которая значительно выше (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем аффинность связывания незамещенной молекулы. Другими словами, K_D замещенной молекулы значительно ниже (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т.д.), чем K_D незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения продемонстрированное усиленное связывание находится в диапазоне от около 0,59 мкмоль/л до 5,82 мкмоль/л K_D. В одном варианте реализации изобретения продемонстрированное усиленное связывание находится в диапазоне от около 0,59 мкмоль/л до 4,3 мкмоль/л K_D. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание демонстрируется K_D ≤5,82 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание демонстрируется K_D ≤4,30 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание демонстрируется K_D ≤2,9 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание демонстрируется K_D ≤0,59 мкмоль/л.

[0061] В одном варианте реализации изобретения K_D замещенной молекулы для человеческой Syt II составляет ≤10 мкмоль/л, предпочтительно ≤9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 мкмоль/л, более предпочтительно ≤1 или 0,6 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения K_D замещенной молекулы для человеческой Syt I составляет ≤10 мкмоль/л, предпочтительно ≤9, 8, 7, 6, 5, 4 мкмоль/л, более предпочтительно ≤3 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения K_D замещенной молекулы для человеческого Syt II составляет ≤7 мкмоль/л, и K_D замещенной молекулы для человеческого Syt I составляет ≤6 мкмоль/л. В одном варианте реализации изобретения K_D замещенной молекулы для человеческого Syt II составляет ≤1 мкмоль/л, и K_D замещенной молекулы для человеческого Syt I составляет ≤3 мкмоль/л.

[0062] В одном варианте реализации изобретения усиленное связывание приводит к детектируемому связыванию с человеческим Syt I при отсутствии корецепторных ганглиозидов, такому, как проиллюстрировано с помощью экспериментов, описанных в данном документе.

[0063] Термин «значительно усиленное связывание» или «значительно уменьшенное связывание» при использовании для описания аффинности связывания связывающего фрагмента BoNT/B-H_C, продуцируемого точечными мутациями, описанными в данном документе, относится к увеличению или уменьшению, соответственно, аффинности связывания (например, экспрессированный как отдельный фрагмент или связанные с более крупным полипептидом) к определенному рецептору (например, человеческий Syt II или человеческий Syt I), как обсуждалось непосредственно выше.

[0064] Как используется в данном документе термин «значительно сниженное связывание», при использовании для описания аффинности связывания молекулы ботулинического нейротоксина или его связывающего фрагмента (например, BoNT/B-Hc) согласно настоящему изобретению со специфическим рецептором (например, человеческий Syt I или человеческий Syt II), относится к уменьшению аффинности связывания специфического рецептора, которая существенно снижается (например, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% аффинности связывания молекулы дикого типа) по сравнению с афиинностью связывания незамещенного варианта молекулы. В одном варианте реализации изобретения сниженное связывание замещенной молекулы приводит к аффинности связывания, которая на порядок или еще меньше, чем аффинность связывания незамещенного нейротоксина (например, нейротоксин с природной молекулой BoNT H_C). Иными словами, K_D замещенной молекулы на порядок или еще выше, чем K_D незамещенного нейротоксина. В одном варианте реализации изобретения сниженное связывание замещенной молекулы приводит к аффинности связывания, которая значительно ниже (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем аффинность связывания незамещенной молекулы. Другими словами, K_D замещенной молекулы значительно выше (например, 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X и т. д.), чем K_D незамещенной молекулы. В одном варианте реализации изобретения значительно уменьшенное связывание приводит к потере детектируемого связывания с человеческим Syt I в отсутствие корецепторных ганглиозидов.

[0065] Используемый в данном документе термин «ботулинический нейротоксин» означает любой полипептид, который может осуществлять общий клеточный механизм, при котором токсин C. botulinum поступает в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттера. Этот механизм охватывает связывание токсина C. botulinum с рецепторным комплексом с низкой или высокой аффинностью, интернализацию токсина, транслокацию легкой цепи токсина в цитоплазму и ферментативную модификацию субстрата токсина C. botulinum. Термин «полипептид» и «белок» взаимозаменяемы в данном документе в отношении молекулы нейротоксина C. botulinum и его фрагментов.

[0066] «Модифицированный рецептор-связывающий домен» или «модифицированный H_C», в качестве используемого в данном документе термина, облегчает связывание молекулы нейротоксина C. botulinum, в которую он содержится, к рецептору для нейротоксина C. botulinum, расположенного на поверхности целевой клетки. Такая молекула обычно генерируется при помощи технологии генетической рекомбинации. Модифицированный H_C имеет связывающую активность к рецептору нейротоксина C. botulinum, расположенного на поверхности целевой клетки. Используемый в данном документе термин «связывающая активность» означает, что одна молекула прямо или косвенно контактирует с другой молекулой посредством по меньшей мере одной силы межмолекулярного или внутримолекулярного взаимодействия, включая, без ограничений, ковалентную связь, ионную связь, металлическую связь, водородную связь, гидрофобное взаимодействие, взаимодействие Ван-дер-Ваальса и тому подобное или любую их комбинацию. «Связанные» и «связывать» считаются терминами для связывания.

[0067] Как используется в данном документе, термин «протеазный домен токсина C. botulinum» означает домен токсина C. botulinum, который может осуществлять этап ферментативной модификации мишени в процессе интоксикации. Таким образом, протеазный домен токсина C. botulinum специфически нацелен на субстрат токсина C. botulinum и охватывает протеолитическое расщепление субстрата токсина C. botulinum, такого как, например, SNARE-белки, такие как субстрат SNAP-25, субстрат VAMP и субстрат синтаксина.

[0068] Неограничивающие примеры протеазных доменов токсина C. botulinum приведены в таблицах 1 и 2.

[0069] Как используется в данном документе, термин «транслокационный домен токсина C. botulinum» или «H_N» означает домен токсина C. botulinum, который может выполнять этап транслокации процесса интоксикации, который опосредует транслокацию легкой цепи токсина C. botulinum. Таким образом, H_N облегчает перемещение легкой цепи токсина C. botulinum через мембрану и охватывает перемещение легкой цепи токсина C. botulinum через мембрану внутриклеточным везикулом в цитоплазму клетки. Неограничивающие примеры H_N включают BoNT/A H_N, BoNT/B H_N, BoNT/C1 H_N, BoNT/D H_N, BoNT/E H_N, BoNT/F H_N, и BoNT/G H_N, аминокислотные последовательности которых приведены в таблице 1 и на Фигурах 12, 14-20.

[0070] Используемый в данном документе термин «рецептор-связывающий домен С. botulinum» является синонимом «домена H_C» и означает любой природный рецептор-связывающий домен С. botulinum, который может выполнять этап связывания клеток в процессе интоксикации, включая, например, связывание токсина C. botulinum со специфическим для токсина C. botulinum рецептором, расположенным на поверхности плазматической мембраны целевой клетки. Предполагается, что изменение активности связывания может быть достигнуто, например, путем замены всего домена H_C C. botulinum модифицированным (например, улучшенным) доменом H_C.

[0071] Используемый в данном документе термин «целевая клетка токсина C. botulinum » означает клетку, которая является природной клеткой, которая восприимчива к интоксикации природным токсином C. botulinum, включая, без ограничения, двигательные нейроны; чувствительные нейроны; вегетативные нейроны; такие как, например, симпатические нейроны и парасимпатические нейроны; непептидергические нейроны, такие как, например, холинергические нейроны, адренергические нейроны, норадренергические нейроны, серотонинергические нейроны, ГАМКергические нейроны; и пептидергические нейроны, такие как, например, нейроны сусбстанция P, нейроны, связанные с генами кальцитонина, вазоактивные интестинальные пептидные нейроны, нейропептидные Y нейроны, холецистокининовые нейроны.

[0072] Под «выделенным» подразумевается материал, который в разной степени свободен от компонентов, которые обычно сопровождают его, как обнаружено в его нативном состоянии. «Изолят» означает степень отделения от исходного источника или окружающей среды, например, из фланкирующей ДНК или из природного источника ДНК, или из фланкирующих аминокислот.

[0073] Термин «очищенный» используется для обозначения вещества, такого как полипептид, который является «по существу чистым», по отношению к другим компонентам препарата (например, другим полипептидам). Он может относится к полипептиду, который составляет по меньшей мере около 50%, 60%, 70% или 75%, предпочтительно по меньшей мере около 85%, более предпочтительно по меньшей мере около 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 95% по отношению к другим компонентам. Трактованные по-новому термины «по существу чистый» или «по существу очищенный» в отношении полипептида относятся к препарату, который содержит менее около 20%, более предпочтительно менее около 15%, 10%, 8%, 7%, более предпочтительно менее около 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее 1% одного или более других компонентов (например, других полипептидов или клеточных компонентов).

[0074] Используемый в данном документе термин «консервативная» или «консервативная мутация по типу замены» относится к мутации, где аминокислота замещена другой аминокислотой, которая имеет схожие свойства, так что специалист в области химии пептидов ожидает, что вторичная структура, химические свойства и/или гидропатическая природа полипептида практически не изменятся. в котором аминокислота замещена на другую аминокислоту, которая имеет схожие свойства, так что квалифицированный специалист в области химии пептидов ожидает, что вторичная структура, химические свойства и/или гидрофобный характер полипептида останутся, по существу, неизменными. Следующие группы аминокислот были исторически заменены друг на друга в виде консервативных изменений: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Другие общепринятые консервативные замены перечислены ниже:

Остаток Консервативные замены Остаток Консервативные замены Ala Ser Leu lle; Val Arg Lys Lys Arg; Gln Asn Gln; His Met Leu; lle Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr Gln Asn Ser Thr; Gly Cys Ser Thr Ser; Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp; Phe His Asn; Gln Val lle; Leu lle Leu; Val

[0075] Термин «мутация по типу замены» без ссылки на конкретную аминокислоту может включать любую аминокислоту, отличную от остатка дикого типа, обычно находящегося в этом положении. Такие замещения могут быть заменами неполярными (гидрофобными) аминокислотами, такими как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан и пролин. Замещения могут быть заменами полярными (гидрофильными) аминокислотами, такими как серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Замещения могут быть заменами электрически заряженными аминокислотами, например, отрицательно электрически заряженными аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, и положительно электрически заряженные аминокислоты, такие как лизин, аргинин и гистидин.

[0076] Мутации по типу замены, описанные в данном документе, обычно будут заменами другим природным аминокислотным остатком, но в некоторых случаях также могут быть заменами неприродных аминокислотных остатков. Ненатуральные аминокислоты, как этот термин используется в данном документе, являются непротеиногенными (то есть не кодирующими белок) аминокислотами, которые или естественного происхождения, или синтезируются химически. Примеры включают, но не ограничиваются ими, β-аминокислоты (β3 и β2), гомо-аминокислоты, производные пролина и пировиноградной кислоты, 3-замещенные производные аланина, производные глицина, замещенные в цикле производные фенилаланина и тирозина, линейные основные аминокислоты, диаминокислоты, D-аминокислоты и N-метиламинокислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота может быть замещенной или незамещенной. Замещенная аминокислота или заместитель может представлять собой галогенированную ароматическую или алифатическую аминокислоту, галогенированную алифатическую или ароматическую модификацию на гидрофобной боковой цепи или алифатическую, или ароматическую модификацию.

[0077] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое является достаточным для осуществления терапевтически значимого снижения одного или более симптомов патологического состояния при введении типичному субъекту, который страдает этим патологическим состоянием. Терапевтически значимое уменьшение симптома, например, на около 10%, на около 20%, на около 30%, на около 40%, на около 50%, на около 60%, на около 70%, на около 80%, на около 90%, на около 100% или более по сравнению с контрольным или субъектом, не получающим лечение.

[0078] Термин «лечить» или «лечение» относится к терапевтическому лечению, в котором объектом является устранение или уменьшение симптомов. Полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, устранение симптомов, облегчение симптомов, уменьшение степени патологического состояния, стабилизированное (то есть не ухудшение) патологическое состояние, задержку или замедление прогрессирования заболевания.

[0079] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или животному. Обычно животное является позвоночным, например, приматом, грызуном, домашним животным или охотничье-промысловым животным. Приматы включают шимпанзе, яванских макак, паукообразных обезьян и макак, например, макаку-резус. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и охотничьи-промысловые животные включают коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, животных из семейства кошачьих, например, домашнюю кошку, животных, относящихся к семейству псовых, например, собак, лисиц, волков, животных из класса птиц, например, цыпленка, эму, страуса и рыб, например, форель, сома и лосося. Пациент или субъект включает любое подмножество вышеприведенного, например, все из вышеизложенного, но исключая одну или более групп, или видов, таких как люди, приматы или грызуны. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, субъект представляет собой млекопитающее, например, примата, например, человека. Термины «пациент» и «субъект» используются в данном документе взаимозаменяемо. Субъект может представлять собой мужчину или женщину. Субъект может быть полностью развитым субъектом (например, взрослым) или субъектом в процессе развития (например, ребенком, младенцем или плодом).

[0080] Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее. Млекопитающее может быть человеком, отличным от человека приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, но не ограничиваясь этими примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут с успехом использоваться в качестве субъектов, которые представляют собой животные модели расстройств, связанных с нежелательной нейронной активностью. Кроме того, описанные в данном документе способы и композиции могут использоваться для лечения одомашненных животных и/или домашних животных.

Варианты реализации изобретения

[0081] Наблюдение, что BoNT/B является менее специфичным и мощным у людей из-за его неспособности связывать человеческий Syt II, может объяснить, почему требуются сравнительно более высокие дозы, чем BoNT/A. Более высокие дозы BoNT/B соответствуют повышенной вероятности для запуска образования антител и для серьезных побочных эффектов. Поэтому улучшенное связывание BoNT/B с человеческим рецептором Syt II для повышения его эффективности и специфичности к целевым человеческим нейронам должно позволить уменьшить дозы токсинов, используемых для применения в терапевтических целях.

[0082] Аспекты настоящего изобретения основаны на том, что модификация последовательности белка BoNT/B-H_C изменяет связывание фрагмента, содержащего рецептор-связывающий домен, с рецептором человеческим Syt II. Определены специфические модификации, которые улучшают связывание, как следствие, создавая домен, который связывает человеческий Syt II с высокой аффинностью. Модифицированный BoNT/B-H_C, в отношении полноразмерного белка BoNT, сохраняет эти связывающие свойства. Включение модифицированного рецептор-связывающего домена с улучшенным связыванием в молекулу, содержащую другие домены BoNT, тем самым генерирует полноразмерную молекулу BoNT с аналогично улучшенным связыванием с рецепторами. Таким образом, генерируются новые версии BoNT с высокой аффинностью связывания с человеческим Syt II. BoNT со значительно улучшенным связыванием может использоваться в аналогичных терапиях, хотя и при более низких дозах, чем имеющиеся в настоящее время молекулы BoNT, тем самым обеспечивая более безопасные способы лечения.

[0083] Полипептиды BoNT, включая полноразмерные полипептиды BoNT и фрагменты или домены полипептида BoNT, описанные в данном документе (например, модифицированные BoNT/H_C), и молекулы нуклеиновой кислоты, которые их кодируют, явно включены в настоящее изобретение. Данные полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены при помощи метода рекомбинантных ДНК, известного в данной области техники. Такие полипептиды обычно называют «рекомбинантными полипептидами» или «рекомбинантными нуклеиновыми кислотами».

Белок ботулинического нейротоксина

[0084] Один аспект настоящего изобретения относится к белку ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен (например, серотип В Clostridium botulinum), как описано в данном документе. Белок BoNT дополнительно содержит протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления. Как правило, они расположены в единственном линейном амино-карбоксильном полипептидном порядке: протеазный домен, протеазный сайт расщепления, транслокационный домен и модифицированный рецептор-связывающий домен. Однако ожидается, что различный порядок разных доменов будет функционировать надлежащим образом. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более мутаций по типу замены, которые приводят к значительному усилению связывания с рецептором Syt I человека и/или с рецептором Syt II человека.

[0085] Белок BoNT может дополнительно содержать домен, который полезен для очистки молекулы, такой как гексагистидиновая метка (His6) (SEQ ID NO: 13), или эпитопная метка, такая как гемаглютининовая метка (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)). Различные такие домены известны и используются в данной области техники для таких целей.

[0086] BoNT имеет общую структуру, показанную на Фигуре 1Б. BoNT состоит из трех доменов, каждый из которых имеет определенную и независимую функцию: протеазный домен (также называемый легкой цепью), транслокационный домен (H_N) и рецептор-связывающий домен (H_C). Было показано, что домены нейротоксина различных штаммов C. botulinum в значительной степени взаимозаменяемы (как показали естественные химерные токсины, такие как BoNT/CD, который состоит из легкой цепи и H_N BoNT/C, с H_C BoNT/D,34 в патенте США 8052979, включенном в данный документ в качестве ссылки). Белок может быть в одноцепочечной форме или двухцепочечной форме. Двухцепочечная форма является результатом процессинга природной протеазы протеазного сайта расщепления, расположенного между протеазным доменом и транслокационным доменом. Белок поддерживается в двухцепочечной форме после обработки протеазой при наличии дисульфидной связи.

[0087] Штаммы Clostridium botulinum продуцируют семь антигенно различимым типов ботулинических токсинов, которые были идентифицированы путем исследования вспышек ботулизма у человека (BoNT/A, /B, /E и /F), животных (BoNT/C1 и /D) или выделены из почвы (BoNT/G). Хотя все семь серотипов BoNT имеют сходную структуру и фармакологические свойства, при этом каждый проявляет гетерогенные бактериологические характеристики. Генетическое разнообразие штаммов C. botulinum подробно описано в Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, p. 818-832 (2007))35, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения, BoNT согласно настоящему изобретению содержит домены, которые принадлежат одному и тому же серотипу (A, B, C, D, E, F или G). В одном варианте реализации изобретения один или более из этих доменов одного и того же серотипа отличаются от их штамма и/или подтипа.

[0088] Токсины из различных серотипов/штаммов C. botulinum имеют одну и ту же функциональную доменную организацию, и общую структурную архитектуру. Токсины C. botulinum переводится как одноцепочечный полипептид в приблизительно 150 кДа, который затем расщепляется путем протеолитического разрыва в пределах дисульфидной петли с помощью природной протеазы, такой как, например, эндогенная протеаза токсина С. botulinum или приодные протеазы, продуцируемые в окружающей среде. Эта посттрансляционная обработка дает двухцепочечную молекулу, содержащую легкую цепь в приблизительно 50 кДа (LC) и тяжелую цепь в приблизительно 100 кДа (HC), удерживаемых вместе одной дисульфидной связью и нековалентными взаимодействиями. Каждая зрелая двухцепочечная молекула содержит три функционально различных домена: 1) протеолитический домен, расположенный в LC, который содержит область металлопротеазы, содержащую цинк-зависимую эндопептидазную активность, которая конкретно нацелена на основные компоненты системы высвобождения нейротрансмиттеров; 2) транслокационный домен, содержащийся в аминоконцевой половине HC (H_n), который облегчает высвобождение LC из внутриклеточных везикул в цитоплазму целевой клетки; и 3) связывающий домен, находящийся в карбоксиконцевой части HC, который определяет активность связывания и специфичность связывания токсина с рецепторным комплексом, расположенным на поверхности целевой клетки. Расположение специфических доменов внутри токсина различных серотипов/штаммов приведено в таблице 1:

ТАБЛИЦА 1

Домены токсина C. botulinum из различных серотипов/штаммов

Токсин LC H_N H_C

BoNT/A M1-K448 A449-K871 N872-L1296

BoNT/B M1-K441 A442-S858 E859-E1291

BoNT/C1 M1-K449 T450-N866 N867-E1291

BoNT/D M1-R445 D446-N862 S863-E1276

BoNT/E M1-R422 K423-K845 R846-K1252

BoNT/F M1-K439 A440-K864 K865-E1274

BoNT/G M1-K446 S447-S863 N864-E1297

[0089] Полные аминокислотные последовательности токсинов представлены на Фигурах 14-21.

[0090] Связывание, транслокация и протеазная активность этих трех функциональных доменов необходимы для токсичности. Общий механизм клеточной интоксикации, при котором токсины C. botulinum поступают в нейрон и ингибируют высвобождение нейротрансмиттера, аналогичны, независимо от серотипа или подтипа. Не желая связывать себя теорией, механизм интоксикации включает как минимум четыре этапа: 1) связывание рецептора, 2) интернализация комплекса, 3) транслокация легкой цепи и 4) модификация мишеней протеазы. Процесс инициируется, когда домен H_C токсина C. botulinum связывается с токсинспецифическим рецептором, расположенным на поверхности плазматической мембраны целевой клетки. Считается, что связывающая специфичность рецепторного комплекса достигается, в частности, конкретными комбинациями ганглиозидов и белковых рецепторов. После связывания токсин-рецепторные комплексы интернализуются эндоцитозом, а интернализованные везикулы распределяются по определенным внутриклеточным путям. Этап транслокации инициируется подкислением компартмента везикул. После транслоцирования эндопептидаза легкой цепи токсина высвобождается из внутриклеточного везикула в цитозоль, где она конкретно нацелена на один из трех белков, известных как основные компоненты системы высвобождения нейротрансмиттера (связанный с везикуло-ассоциированным мембранным белком (VAMP)/синаптобревином, синаптосомально-ассоциированным белком размером в 25 кДа (SNAP-25) и синтаксином). Эти основные компоненты необходимы для докинга и слияния синаптических пузырьков на нервном окончании и являются членами семейства растворимого, чувствительного к N-этилмалеимиду рецептора стыковочных белков (SNARE). BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP-25 в карбоксиконцевой области, высвобождая сегмент из девяти или двадцати шести аминокислот, соответственно, и BoNT/C1 также расщепляет SNAP-25 вблизи карбоксильного конца. Ботулинические серотипы BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F и BoNT/G и столбнячный токсин действуют на консервативную центральную часть VAMP и высвобождают аминоконцевую часть VAMP в цитозоль. BoNT/C1 расщепляет синтаксин в одном месте вблизи поверхности цитозольной плазматической мембраны. Селективный протеолиз синаптических SNARE составляет блок высвобождения нейротрансмиттера, вызванный токсинами C. botulinum in vivo. SNARE-белковые мишени токсинов C. botulinum являются общими для экзоцитоза во множестве не нейронных типах; в этих клетках, как и в нейронах, пептидазная активность легкой цепи ингибирует экзоцитоз, см., например, Yann Humeau et al., How Release of Neurotransmitter Botulinum and Tetanus Neurotoxins, 82 (5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

Домены и химерные нейротоксины

[0091] Ботулинический нейротоксин согласно настоящему изобретению содержит модифицированный рецептор-связывающий домен (H_C). Модифицированный рецептор-связывающий домен проявляет значительно усиленное связывание с одним или более человеческими рецепторами, обычно связанными и используемыми одним или более токсинами штаммов C. botulinum (например, SytII, SytI). Модифицированный рецептор-связывающий домен может быть любого серотипа (A, B, C, D, E, F или G), штамма или подтипа (как описано в данном документе). Это может быть тот же самый или другой серотип, штамм/подтип в виде одного или более других доменов в BoNT. Примеры конкретных модифицированных рецептор-связывающих доменов приведены в данном документе Выделенный полипептид модифицированного рецептор-связывающего домена, описанный в данном документе, также охватывается настоящим изобретением, равно как и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, с помощью которой он кодируется. В одном варианте реализации изобретения H_C принадлежит серотипу B. В одном варианте реализации изобретения H_C принадлежит серотипу A.

[0092] Ботулинический нейротоксин согласно настоящему изобретению также содержит протеазный домен, также известный в данной области техники как вариант легкой цепи. Вариант легкой цепи может быть природным вариантом легкой цепи, таким как, например, изоформы легкой цепи токсина C. botulinum и подтипы легкой цепи токсина C. botulinum; или неприродный вариант легкой цепи токсина C. botulinum, такой как, например, консервативный вариант замещения легкой цепи токсина C. botulinum. Протеазный домен может быть любого серотипа (A, B, C, D, E, F или G), штамма или подтипа (как описано в данном документе). Это может быть тот же самый или другой серотип, штамм/подтип в виде одного или более других доменов в BoNT. В одном варианте реализации изобретения протеазный домен принадлежит серотипу В. В одном варианте реализации изобретения протеазный домен принадлежит серотипу А.

[0093] Ботулинический нейротоксин согласно настоящему изобретению также содержит транслокационный домен токсина (H_N). Транслокационный домен может быть любого серотипа (A, B, C, D, E, F или G), штамма или подтипа (как описано в данном документе). Это может быть тот же самый или другой серотип, штамм/подтип в виде одного или более других доменов в BoNT. В одном варианте реализации изобретения H_N принадлежит серотипу B. В одном варианте реализации изобретения H_N принадлежит серотипу A.

[0094] Различные области, описанные в данном документе (например, H_N, H_C или протеазный домен), включают, без ограничения, природные варианты, такие как, например, изоформы и подтипы; не встречающиеся в природе варианты, такие как, например, консервативные мутации по типу замены. Необычные варианты относятся к домену, который имеет по меньшей мере одно изменение аминокислоты из соответствующей области эталонных последовательностей (например, из таблицы 1 или Фигуры 14, 16-23) и могут быть описаны в процентах идентичности к соответствующей области данной эталонной последовательности.

[0095] Специалистам в данной области техники известно, что в каждом серотипе токсина C. botulinum могут быть природные варианты домена C. botulinum, которые несколько отличаются друг от друга по своей аминокислотной последовательности, а также в нуклеиновых кислотах, кодирующих эти белки. Природный вариант домена токсина С. botulinum (например, легкая цепь, H_N или H_C), предусмотренный для использования в генерации BoNT согласно настоящему изобретению, может функционировать, по существу, таким же образом, как и референсный домен C. botulinum, на котором основан природный вариант домена C. botulinum, и может быть заменен референсным доменом токсина C. botulinum в любом аспекте настоящего изобретения.

[0096] Неограничивающим примером природного варианта домена токсина C. botulinum является изоформа домена токсина C. botulinum, такая как, например, изоформа домена BoNT/A, изоформа домена BoNT/B, изоформа домена BoNT/C1, изоформа домена BoNT/D, изоформа домена BoNT/E, изоформа домена BoNT/F и изоформа домена BoNT/G. Изоформа домена токсина C. botulinum может функционировать, по существу, таким же образом, как и референсный домен токсина C. botulinum, на котором основана изоформа домена токсина C. botulinum, и может быть заменена референсным доменом токсина C. botulinum в любом аспекте настоящего изобретения.

[0097] Другим неограничивающим примером природного варианта домена токсина С. botulinum является подтип домена токсина C. botulinum, такой как, например, домен из подтипа BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5; домен из подтипа BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6, BoNT/B7; домен из подтипа BoNT/C1-1, BoNT/C1-2, BoNT/D-C; домен из подтипа BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7, BoNT/E8; и домен из подтипа BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6, BoNT/F7. Подтип домена токсина C. botulinum может функционировать, по существу, таким же образом, как и референсный домен токсина C. botulinum, на котором основан подтип домена токсина C. botulinum, и может быть заменен референсным доменом токсина C. botulinum в любом аспекте настоящего изобретения.

[0098] Используемый в данном документе термин «неприродный вариант» (например, вариант легкой цепи токсина C. botulinum, H_C и H_N) означает домен C. botulinum, полученный с помощью манипулирования, осуществляемого человеком, включая, без ограничения, домены, полученные при помощи генетической инженерии с использованием случайного мутагенеза или рационального дизайна и домены C. botulinum, полученные при помощи химического синтеза. Неограничивающие примеры неприродных вариантов домена C. botulinum домена включают, например, консервативные варианты домена C. botulinum. Используемый в данном документе термин «консервативный вариант домена С. botulinum» означает домен C. botulinum, который имеет по меньшей мере одну аминокислоту, замещенную другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, которая имеет по меньшей мере одно свойство, сходное с таковым у исходной аминокислоты из референсной последовательности С. botulinum (например, таблица 1 и Фигуры 12, 14-21). Вариант может иметь одну, две, три, четыре, пять или более консервативных аминокислотных замен по сравнению с референсной последовательностью домена. Примеры свойств включают, без ограничения, аналогичный размер, конфигурацию, заряд, гидрофобность, гидрофильность, липофильность, способность к образованию ковалентной связи, способность к образованию водородной связи, физико-химическое свойство, подобное или любую их комбинацию. Консервативный вариант домена C. botulinum может функционировать, по существу, таким же образом, как и референсный домен токсина C. botulinum, на котором основан консервативном варианте домена токсина C. botulinum, и может быть заменен референсным доменом токсина C. botulinum в любом аспекте настоящего изобретения.

[0099] Вариант ненатурального домена токсина C. botulinum, может заменить одну или более аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и более) из референсного домена токсина C. botulinum, на котором основан натуральный домен токсина C. botulinum. Вариант неприродного домена токсина C. botulinum, также может обладать 95% или более (например, 96%, 97%, 98% или 99%) аминокислотной идентичностью с референсным доменом токсина C. botulinum, на котором основан вариант природного домена C. botulinum.

[00100] Различные неприродные нейротоксины C. botulinum или их специфические домены описаны в международных патентных публикациях WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 и WO99/17806, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Описанный в данном документе нейротоксин C. botulinum или его специфический домен, как правило, содержит природные аминокислотные остатки, но в некоторых случаях также могут присутствовать неприродные аминокислотные остатки. Поэтому в контексте настоящего изобретения могут также использоваться так называемые «пептидные миметики» и «пептидные аналоги», которые могут содержать химические структуры, не являющиеся аминокислотами, но которые имитируют структуру конкретной аминокислоты или пептида. Такие миметики или аналоги характеризуются, как правило, такими же физическими характеристиками, как размер, заряд или гидрофобность, и соответствующей пространственной ориентацией, которая обнаруживается в их природных аналогах пептидов. Конкретным примером пептидного миметического соединения является соединение, в котором амидная связь между одной или более аминокислотами заменена, например, углерод-углеродной связью или другой неамидной связью, как хорошо известно в данной области технике (см., например, Sawyer, in Peptide Based Drug Design, pp. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995).

[00101] В одном аспекте настоящего изобретения ботулинический нейротоксин (BoNT) согласно настоящему изобретению содержит модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В C. botulinum (BoNT/B-H_C). Модифицированный BoNT/B-H_C содержит одну или более мутаций по типу замены, которые приводят к значительному усилению связывания с рецептором Syt I человека и/или с рецептором Syt II человека. В одном варианте реализации изобретения BoNT/B-H_c получен из BoNT/B1 (номер доступа GenBank: AB232927.1). Аминокислотная последовательность штамма BoNT/B1-H_C Okra, используемая в качестве референсной матрицы в настоящем изобретении, показана на Фигуре 12. Генерация B-H_c из других штаммов и подтипов путем замены аминокислот, которые соответствуют указанному положению (-ам) в B1, описанном в данном документе, также предусмотрена, а также генерация более длинных молекул, которые содержат B-H_c, такие как полный BoNT или полипептид, содержащий модифицированный B-H_c. Такие молекулы также включены в настоящее изобретение. В одном варианте реализации изобретения BoNT или полипептид согласно настоящему изобретению содержит модифицированный рецептор-связывающий домен, который не относится к штамму BoNT/B4, известному как штамм Eklund (референсная последовательность NCBI: YP_001893661.1, Genbank ссылка: EF051570.1), показан на Фигуре 21. В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8.

[00102] Диффузия токсинов и генерация нейтрализующих антител представляют собой проблему, связанную, но не ограничиваясь ими, с BoNT/B, поскольку она также наблюдаются с BoNT/A. Улучшение аффинности связывания BoNT/A с его рецептором SV2 уменьшит эти проблемы. Поскольку связывание BoNT/B с Syt I II имеет гораздо более высокую аффинность, чем связывание BoNT/A с SV2^14,20,26,27, модифицированный рецептор-связывающий домен BoNT/B (BoNT/B-H_C) со способностью связывать человеческий Syt II также можно использовать для замены BoNT/A-H_C для получения модифицированного химерного BoNT/A, который может иметь большую эффективность и специфичность к нейронам человека, чем BoNT/A ДТ.28 29 30

[00103] Кроме того, предполагается, что модифицированный H_C, описанный выше (например, BoNT/B-H_C), можно использовать для замены H_C всех других серотипов/штаммов BoNT. Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является полипептид BoNT, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен (H_C) серотипа (A, B, C, D, E, F или G), соединенный с одним или болеедоменами другого серотипа (A, B, C, D, E, F или G), штамма или подтипа, чтобы таким образом получить химерный нейротоксин. Область H_C каждого BoNT хорошо определена и соответствующие области H_C могут быть обменены в молекуле BoNT (например, с помощью генной инженерии). Такая манипуляция обычно выполняется квалифицированным специалистом с использованием стандартного ПЦР для получения ДНК, кодирующей BoNT/ B-H_C, с легкой цепью (LC) и транслокационной областью (H_N) или H_N-LC других BoNT, который был отработан в данной области техники. Кроме того, замена может также выполняться с использованием C-концевой части BoNT/B-H_C (обозначенной как H_CC), которая является областью, содержащей сайт связывания для белковых рецепторов и ганглиозидов в каждом BoNT. Полученные химерные токсины будут иметь способность к нацеливанию на человеческие нейроны посредством связывания с человеческим Syt I/II. В качестве неограничивающего примера для замены H_C (или H_CC) BoNT/A можно использовать модифицированный BoNT/B-H_C (или BoNT/B-H_CC). Полученные полипептиды охватываются настоящим изобретением. Эти химерные токсины могут иметь более высокую эффективность и специфичность нацеливания на нейроны человека, чем BoNT/A ДТ. Такой химерный токсин BoNT/A можно использовать для применения в терапевтических целях у людей и предлагает значительные улучшения по сравнению с BoNT/A ДТ.

[00104] Один аспект настоящего изобретения относится к выделенному, очищенному модифицированному полипептиду рецептор-связывающего домена, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен представляет собой BoNT/B-H_C (например, из BoNT/B1). В одном варианте реализации изобретения B-H_c генерируется из другого штамма и/или подтипа BoNT путем замены аминокислот, которые соответствуют указанному положению(ям) в B1, описанном в данном документе. В одном варианте реализации изобретения H_C является подтипом B2, B3, B4, B5, B6 или B7. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен не относится к BoNT/B4 (штамм Eklund). В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8.

[00105] Настоящее изобретение охватывает мутантный полноразмерный BoNT, который содержит модифицированный H_C (например, B-H_C) с аминокислотными заменами, как описано в данном документе, для применения в терапевтических целях у людей. В одном варианте реализации изобретения полноразмерный BoNT содержит модифицированный H_C (например, B-H_C) с аминокислотной заменой в одном или комбинации аминокислотных остатков, соответствующих положениям E1191, S1199, Y1183 и W1178 из B1 (например, выбранных из тех, которые перечислены в таблице 2). В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C (например, B-H_C) с одной аминокислотной заменой, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C (например, B-H_C) с двумя аминокислотными заменами, как описано в данном документе. В одном варианте реализации изобретения BoNT содержит модифицированный H_C (например, B-H_C) с тремя аминокислотными заменами, как описано в данном документе. Мутации могут быть сделаны таким же образом, как раскрыто в данном документе для BoNT/H_C (например, с использованием любого из подтипов BoNT/B или любого серотипа в качестве матрицы). В одном варианте реализации изобретения мутантный полноразмерный BoNT содержит модифицированный Hc, который не принадлежит BoNT/B4 (штамм Eklund). В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8.

[00106] Полученный токсин BoNT может значительно усилить связывание с Syt II человека и, следовательно, будет иметь более высокую эффективность и специфичность для целевых нейронов человека, чем BoNT ДТ. Полученный мутант может также поддерживать подобное связывание с SytI человека, значительно улучшает связывание с SytI человека или имеет значительно сниженное связывание с SytI человека.

Полипептиды и химерные полипептиды

[00107] Другой аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему модифицированный рецептор-связывающий домен (например, серотип А, В, С, D, Е, F или G). В одном варианте реализации изобретения модифицированный Hc в контексте полипептида значительно улучшает связывание с человеческим Syt II и/или Syt I по сравнению с аналогичным полипептидом с аминокислотами ДТ в определенных положениях, модифицированных в Hc (аналог дикого типа). В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен представляет собой BoNT/B-H_C (например, из BoNT/B1). В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_c генерируется из другого серотипа, штамма и/или подтипа BoNT путем замены аминокислот, которые соответствуют указанному положению(ям) в B1, описанном в данном документе. В одном варианте реализации изобретения модифицированный Hc не относится к BoNT/B4 (штамм Eklund). В одном варианте реализации изобретения модифицированный B-Hc не содержится в штаммах 3, 7 или 8. В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен имеет одну или более модификаций (аминокислотные замены) в С-концевой части BoNT/B-H_C (обозначаемой как H_CC), которая представляет собой область, содержащую сайт связывания для белковых рецепторов и ганглиозидов в каждом BoNT. В одном варианте реализации изобретения полученный полипептид обладает способностью к нацеливанию на человеческие нейроны посредством связывания с SytI/II человека.

[00108] Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, может быть гибридным белком рецептор-связывающего домена и другого функционального полипептида (например, функционального полипептида, используемого в 2-гибридной системе (приманка или жертва, такая как Т18 или Т25, или глутатион-S-трансфераза (GST)). Это также можно назвать химерной полипептидной молекулой. В качестве альтернативы, это может быть слияние модифицированного рецептор-связывающего домена и полипептидной метки для целей идентификации и/или целей очистки (например, гексагистидиновая метка (His6) (SEQ ID NO: 13)) или эпитопная метка, такая как гемаглютининовая метка (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)) или GST), многие из которых известны и обычно используются в данной области техники. Слияние может иметь участок аминокислот между соответствующими функциональными доменами, которые облегчают связывание, служат в качестве сайта расщепления или сохраняет независимую конформацию и/или функцию. В одном варианте реализации изобретения связь сохраняет функцию модифицированного рецептор-связывающего домена. В одном варианте реализации изобретения связь маскирует функцию модифицированного рецептор-связывающего домена. Другой аспект настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует любой из таких полипептидов.

[00109] Модифицированный BoNT/H_C (например, B-H_C) может быть связан с другими агентами (например, белками, малыми молекулами, короткими полипептидами, нуклеиновыми кислотами) ковалентно (например, в виде гибридного белка) или нековалентно. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к химерной молекуле, содержащей первую часть, которая является модифицированным рецептор-связывающим доменом C. botulinum (например, серотипом B), как описано в данном документе, связанным со второй частью. Вторая часть молекулы может быть биоактивной (или «биологически активной») молекулой, такой как терапевтический агент (например, полипептид или неполипептидный лекарственный препарат, такой как небольшая молекула или нуклеиновая кислота). Связывание первой и второй частей молекулы может быть ковалентным (например, в виде слитого белка) или нековалентным. Способы такого связывания известны в данной области техники и могут быть легко применены специалистом-практиком. Одним из таких применений химерной молекулы согласно настоящему изобретению является способ доставки к целевым нейронам у людей. Например, модифицированный BoNT/H_C может быть связан с другими терапевтическими агентами, чтобы служить в качестве нацеливающего средства для доставки терапевтических агентов к нейронам у людей путем связывания с человеческим Syt I и/или Syt II.

Модификации рецептор-связывающего домена (Hc)

[00110] Как обсуждалось в данном документе, изобретение относится к модифицированному Hc и полипептидам, содержащим модифицированный Hc (например, BoNT или слитый, или химерный полипептид). Модификация аминокислотной последовательности H_C, используемой для получения этих различных полипептидов согласно настоящему изобретению, может быть осуществлена ​​различными способами, известными квалифицированному практику. Примеры включают, без ограничения, направленный мутагенез (сайт-направленный мутагенез) или случайный мутагенез каждого аминокислотного остатка в области, известной для связывания Syt I/II. Эти Syt-связывающие области хорошо определены в предыдущих исследованиях, касающихся рецепторов Syt мыши или крысы^{1,29,36,31,32}, но не были четко определены во взаимодействии между BoNT/B-H_c и человеческими рецепторами Syt. В качестве матрицы могут использоваться различные подтипы BoNT/B или другие серотипы, которые связываются с Syt I/II (D-C или G), для создания таких же или подобных мутаций путем генерирования соответствующих мутаций, описанных в данном документе для B1-H_C. Соответствующее положение для выбранных остатков, подлежащих мутации, может быть легко идентифицирована путем выравнивания последовательностей с использованием подтипа B1. Полученные полипептидные продукты, а также полипептиды, содержащие указанные продукты и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные полипептиды и продукты, охватываются настоящим изобретением

[00111] Модификации аминокислотной последовательности H_C для получения модифицированного рецептор-связывающего домена могут быть мутацией одного остатка на другую аминокислоту (замещение одного сайта), одновременной мутацией множества остатков (замещение нескольких сайтов), делецией одного или более остатков (делеция) и вставкой одного или более остатков (вставка), а также их комбинации. Способы для мутирования белков хорошо известны в данной области техники (например, нацеленные замены одного сайта и множества сайтов в ДНК, кодирующей последовательность BoNT/H_C).

[00112] В одном варианте реализации изобретения модифицировали один или более остатков в H_C, которые или контактируют с Syt II грызуна, или с окружающими областями, на основании опубликованной литературы, на рецептор-связывающем домене BoNT/B29 и описанной структуре BoNT/B-Syt II (PDB ID: 2NM1)^31,32. К ним относятся, без ограничения, те положения, которые соответствуют положению Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, Y1256, D1115, E1203 BoNT/B-B1. В одном варианте реализации изобретения один или более из этих остатков систематически заменяются другими аминокислотами. Также предусмотрены комбинации различных модификаций, в том числе, без ограничений, мутации двух или более приведенных позиций с любым разнообразием аминокислот, как, например, приведенные в данном документе.

[00113] Множественные замены сайтов (например, 2 или 3) могут быть получены путем объединения мутаций в этих идентифицированных ключевых остатков. Такие мутанты с множественными заменами сайтов могут иметь еще более улучшенное связывание с h-Syt II и могут дополнительно поддерживать или улучшать связывание с человеческим Syt I. В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_C имеет первую замену аминокислоты, которая соответствует E1191 серотипа B штамма 1, замещенную или Q, M, C, V, L, или Y. В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_C имеет вторую замену сайта, которая соответствует или S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации изобретения модифицированный H_C имеет множественные замены сайтов, которые соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W, E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y или E1191V и W1178Q, серотипа B штамма 1.

[00114] В одном варианте реализации изобретения модифицированный рецептор-связывающий домен содержит мутацию по типу замены, соответствующую Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, D1115, E1203 или Y1256 серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации изобретения мутация по типу замены представляет собой A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y или V, замещенные на S. В в одном варианте реализации изобретения положение соответствует S1199 или S1201 серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации изобретения мутация по типу замены представляет собой W, E или H. В одном варианте реализации изобретения мутация по типу замены находится при S1199 и представляет собой W, E или H. В одном варианте реализации изобретения мутация по типу замены находится при S1201 и представляет собой V. В одном варианте реализации изобретения положения соответствуют W1178, Y1183 или E1191. В одном варианте реализации изобретения положение соответствует W1178, и мутация по типу замены представляет собой Y, Q, A или S. В одном варианте реализации изобретения положение соответствует Y1183, и мутация по типу замены представляет собой C или P. В одном варианте реализации изобретения положение соответствует E1191, и мутация по типу замены представляет собой C, V, L или Y.

[00115] Модифицированный H_C с одной мутацией по типу замены аминокислоты, показанной ниже в таблице 2, также охватывается, как и его включение в различные полипептиды, описанные в данном документе.

Таблица 2

E1191M Y1183C S1199E E1191Q Y1183P S1199H E1191C Y1183M S1199Y P1117S A1196Y E1191V S1199W P1117M E1191L W1178Q S1199F P1117Y Y1181M E1191Y W1178Y S1199L E1191T W1178A V1118M E1191I W1178S S1201V

[00116] В одном варианте реализации изобретения H_C содержит одну или более мутаций, которые соответствуют E1191C/V/L/Y (E1191C, E1191V, E1191L или E1191Y), S1199W/E/H (S1199W, S1199E или S1199H), W1178Y/Q/A/S (W1178Y, W1178Q, W1178A или W1178S) и/или Y1183C/P (Y1183C или Y1183P) серотипа В штамма 1 (Фиг. 3A, 3Б).

[00117] В одном варианте реализации изобретения H_C имеет две мутации пот типу замены, причем одна представляет собой мутацию по типу замены, соответствующую позиции 1191, выбранной из таблицы 2. В одном варианте реализации изобретения Hc имеет улучшенное связывание с h-Syt II по сравнению с аналогичным полипептидом, содержащим аминокислоты ДТ в указанных положениях (также упоминаемая в данном документе как аналог дикого типа). В одном варианте реализации изобретения созданный мутант также поддерживает или имеет значительно усиленное связывание с человеческим Syt I по сравнению с аналогами дикого типа. В частности, мутация представляет собой E1191C, E1191V, E1191L или E1191Y. Более конкретно, мутация, которая соответствует положению E1191C, E1191V, E1191L или E1191Y, объединяется со второй мутацией (например, описанной в данном документе) для получения модифицированного H_C, который имеет улучшенное связывание с h-Syt II по сравнению с аналогичным полипептидом, содержащим аминокислоты ДТ в указанных положениях (также упоминаемый в данном документе как аналог дикого типа). В одном варианте реализации изобретения созданный мутант также поддерживает или имеет значительно усиленное связывание с человеческим Syt I по сравнению с аналогом дикого типа (Фигура 4A). В одном варианте реализации изобретения вторая мутация представляет собой мутацию по типу замены, соответствующую замене, показанной для положений 1183, 1199, 1201, 1178, 1117 или 1181 в таблице 2. В одном варианте реализации изобретения вторая мутация представляет собой S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L. В одном варианте реализации изобретения H_C имеет две мутации по типу замены, которые соответствуют тем, которые показаны для серотипа B штамма 1 в таблице 3:

Таблица 3

E1191M и S1199Y E1191Q и S1199Y E1191C и S1199Y E1191M и S1199W E1191Q и S1199W E1191C и S1199W E1191M и S1199L E1191Q и S1199L E1191V и S1199Y E1191M и S1199Y E1191Q и S1199Y E1191V и S1199W E1191M и S1199F E1191Q и S1199F E1191M и W1178Q E1191Q и W1178Q E1191C и W1178Q E1191V и W1178Q

[00118] В одном варианте реализации изобретения H_C имеет три мутации по типу замены, также упоминаемые в данном докменте как тройная мутация. В одном варианте реализации тройной мутации, первая мутация соответствует E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A или W1178S серотипа B штамма 1. В одном варианте реализации изобретения вторая мутация соответствует E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A или W1178S серотипа B штамма 1 (за исключением положения, выступающего в качестве первой мутации). В одном варианте реализации изобретения третья замена соответствует E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A или W1178S серотипа B штамма 1 (за исключением положений, выступающих в качестве первой и второй мутаций). В одном варианте реализации изобретения двойная или тройная мутация не содержит Q, замещенного в обоих положениях, соответствующих E1191 и W1178.

[00119] В одном варианте реализации тройной мутации одна мутация представляет собой мутацию по типу замены, которая соответствует замене, показанной для E1191 в таблице 2 (например, E1191Q/M/C/V/L или Y). Вторая мутация может быть мутацией по типу замены, соответствующей замене, показанной для S1199 в таблице 2 (например, S1199W/E/H/Y/F или L). Третьей мутацией может быть мутация по типу замены, соответствующая замене, показанной для W1178 в таблице 2 (например, W1178Y/Q/A или S). Альтернативно, третья мутация может быть мутацией по типу замены, соответствующей замене, показанной для Y1183 в таблице 2. (например, Y1183C, Y1183P). В одном варианте реализации изобретения тройная мутация соответствует E1191M/S1199W/W1178Q.

Молекулы нуклеиновых кислот

[00120] Другой аспект настоящего изобретения относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует описанные в данном документе полипептиды (например, модифицированный рецептор-связывающий домен или полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, или нейротоксин ботулина, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен, описанный в данном документе). В одном варианте реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, показанную на Фигуре 13. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены квалифицированным практиком, например, при помощи технологии рекомбинантной ДНК. Желаемую замену аминокислоты получают, например, при помощи модификации кодирующей ДНК. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные в данном документе полипептиды, создают при помощи мутации кодона нуклеиновой кислоты, кодирующего указанную аминокислоту, на нужную аминокислоту с использованием генетического кода, показанного ниже:

[00121] В одном варианте реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована для экспрессии в E. coli (например, последовательность нуклеиновой кислоты на основе GenBank AB232927.1, соответствующая часть которой показана на Фигуре.13).

[00122] Другой аспект настоящего изобретения относится к вектору нуклеиновой кислоты, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. В одном варианте реализации изобретения вектор представляет собой вектор экспрессии. Такой вектор экспрессии упоминается в данном документе как экспрессирующий конструкт и содержит молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, функционально связанную с вектором экспрессии, используемым для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клеточном или бесклеточном экстракте. Широкое разнообразие векторов экспрессии может быть использовано для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей нейротоксин C. botulinum согласно настоящему изобретению, включая, без ограничения, вирусный вектор экспрессии; прокариотический вектор экспрессии; эукариотические векторы экспрессии, такие как, например, дрожжевой вектор экспрессии, вектор экспрессии насекомых и вектор экспрессии млекопитающих; и вектор экспрессии в бесклеточном экстракте. Кроме того, понятно, что векторы экспрессии, полезные для практического применения этих способов, могут включать те, которые экспрессируют нейротоксин C. botulinum под контролем конститутивного, тканеспецифического, клеточного или индуцируемого промоторного элемента, энхансерного элемента или того и другого. Неограничивающие примеры векторов экспрессии, а также хорошо зарекомендовавшие себя реагенты и условия для создания и использования экспрессирующего конструкта из таких векторов экспрессии легко доступны от коммерческих поставщиков, которые включают, без ограничения, BD Biosciences-Clontech, Пало-Альто, Калифорния; BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния; Invitrogen, Inc, Карлсбад, Калифорния; EMD Biosciences-Novagen, Мэдисон, Висконсин; QIAGEN, Inc., Валенсия, Калифорния; и Stratagene, Ла-Холья, Калифорния. Выбор, создание и использование соответствующего вектора экспрессии относятся к общепринятым процедурам, которые хорошо известны специалисту в данной области техники и из приведенного в данном документе описания.

Клетки

[00123] Другой аспект настоящего изобретения относится к клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты или экспрессирующий конструкт, описанный в данном документе. Клетка может быть предназначена для репродукции нуклеиновой кислоты или для экспрессии нуклеиновой кислоты, или того и другого. Такие клетки включают, без ограничения, прокариотические клетки, включая, без ограничения, штаммы аэробных, микроаэрофильных, капнофильных, факультативных, анаэробных, грамотрицательных и грамположительных бактериальных клеток, таких как те, которые получены из, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens и Salmonella typhimurium; и эукариотические клетки, включая, без ограничения, штаммы дрожжей, такие как, например, те, которые получены из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica; клетки насекомых и клеточные линии, полученные из насекомых, такие как, например, те, которые получены из Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster и Manduca sexta; и клетки млекопитающих и клеточные линии, полученные из клеток млекопитающих, такие как, например, те, которые получены из мыши, крысы, хомяка, свиньи, быка, лошади, примата и человека. Клеточные линии могут быть получены из Американской коллекции типовых культур, Европейской коллекции клеточных культур и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур. Неограничивающие примеры конкретных протоколов для отбора, создания и использования соответствующей клеточной линии описаны, например, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. Eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); и CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004). Эти протоколы являются общепринятыми процедурами, которые хорошо известны специалисту в данной области техники и из приведенного в данном документе описания.

[00124] Клетка может быть предназначена для экспрессии нуклеиновой кислоты, чтобы тем самым создавать кодируемый полипептид. Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является способ получения белка ботулинического нейротоксина, выделенного HC или полипептида, содержащего модифицированный HC, описанный в данном документе. Такие полипептиды получают путем культивирования клетки-хозяина, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, в пределах экспрессирующего конструкта. Культивирование проводят в условиях, подходящих для получения полипептида BoNT. Экспрессированный полипептид может быть выделен из культуры, очищен и приготовлен способами, известными в данной области техники. Экспрессированный полипептид также может быть активирован по необходимости способами, известными в данной области техники. Один из способов активации экспрессированного полипептида заключается в расщеплении (или внесения разрыва в одну цепь ДНК) при помощи протеаз в активную двухцепочечную форму. Такие способы могут быть адаптированы из известных в данной области техники, например, как описано Peter F. Bonventre и Lloyd L. KLempe (J. Bacteriol 1960, 79 (1): 23 and Michaeal L. Dekleva and Bibhuti R. DasGupta (Biochemical and Biophysical Research Communicaitons 1989, 162: 767-772).

Фармацевтические композиции

[00125] Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей нейротоксин C. botulinum или химерную молекулу, описанную в данном документе. В одном варианте реализации изобретения полипептид, описанный в данном документе, представляет собой активный ингредиент в композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель (называемой в данном документе фармацевтической композицией). «Фармацевтически приемлемый носитель» означает любое фармацевтически приемлемое средство для смешивания и/или доставки композиции для направленной доставки субъекту. Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, вспомогательное вещество, растворитель или материал для инкапсулирования, предназначенный для переноса или транспортировки агентов субъекта из одного органа или части тела в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и совместим с введением субъекту, например, человеку. Такие композиции могут быть специально приготовлены для введения посредством одного или более из нескольких путей введения, таких как пути введения, описанные в данном документе. Дополнительные ингредиенты также могут быть включены в композиции. Когда описанный в данном документе агент, состав или фармацевтическую композицию вводят субъекту, предпочтительно вводится терапевтически эффективное количество. Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое приводит к улучшению или восстановлению состояния. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция составлена для введения путем инъекции. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, инкапсулированный в микросферы. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, приготовленный для трансэпителиальной доставки. В одном варианте реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит ботулинический нейротоксин, приготовленный для медленного высвобождения.

[00126] В одном варианте реализации изобретения ботулинический нейротоксин, полипептид или химерная молекула согласно настоящему изобретению находится в форме состава с контролируемым высвобождением. Такие композиции и способы для введения представлены в патентной публикации США № 2007/0020295, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

[00127] Ботулинический нейротоксин можно получить путем инокуляции и выращивания культур Clostridium botulinum в ферментере, а затем сбора и очистки ферментированной смеси в соответствии с известными процедурами. Все серотипы ботулинического токсина первоначально синтезируются как неактивные одноцепочечные белки, которые должны быть расщеплены или разрезаны протеазами, чтобы стать нейроактивными. Таким образом, бактериальные штаммы, которые производят серотипы ботулинического токсина А и G, обладают эндогенными протеазами, а серотипы А и G могут быть выделены из бактериальных культур преимущественно в их активной форме. Напротив, серотипы ботулинического токсина C₁, D и E синтезируются непротеолитическими штаммами и поэтому, как правило, неактивны при извлечении из культуры. Серотипы В и F продуцируются как протеолитическими, так и непротеолитическими штаммами и поэтому могут быть восстановлены либо в активной, либо в неактивной форме. Протеолитические штаммы, которые производят, например, серотип типа B ботулинического токсина, могут только отщеплять часть продуцируемого токсина. Точная доля молекул с разрывами к молекулам без разрывов зависит от продолжительности инкубации и температуры культуры. Следовательно, определенный процент препарата, например, ботулинического токсина типа B, может быть неактивным. В одном варианте реализации изобретения нейротоксин согласно настоящему изобретению находится в активном состоянии. В одном варианте реализации изобретения нейротоксин находится в неактивном состоянии. В одном варианте реализации изобретения предлагается комбинация активного и неактивного нейротоксина.

Наборы

[00128] В настоящем изобретении также включен набор, содержащий описанный в данном документе BoNT или полипептид (например, в форме фармацевтической композиции). Набор может содержать одну или более композиций, описанных в данном документе, упакованных во флаконе. Набор может дополнительно содержать средство доставки или устройство для терапевтического введения композиции и/или инструкции для терапевтического введения. Комплект может содержать все компоненты, упакованные в формованный контейнер.

[00129] Другой аспект настоящего изобретения относится к средству доставки или устройству для введения описанных в данном документе фармацевтических композиций, предварительно загруженных фармацевтической композицией (например, для однократного применения). Такими устройствами может быть шприц или устройство с микроиглой для введения композиций. Шприц может быть одноразовым шприцем, предварительно загруженным эффективным количеством композиции. Устройство с микроиглой может содержать одну или более микроигл, покрытых описанной в данном документе композицией, такой как описано в публикации США 2010/0196445, содержание которой включено в данной описание полностью.

Методы лечения

[00130] Настоящее изобретение также включает способы лечения патологического состояния, которое обычно лечат с использованием нейротоксина (например, патологические состояния скелетных мышц, патологические состояния гладкой мускулатуры, патологические состояния железистой оболочки, нервно-мышечное расстройство, вегетативное расстройство, боль или эстетическое/косметическое патологическое состояние). Такие состояния связаны с нежелательной нейронной активностью, определенной квалифицированным практиком. Способ включает стадию введения терапевтически эффективного количества BoNT или полипептидной/химерной молекулы, описанной в данном документе (например, в виде фармацевтической композиции), в соответствующее место у млекопитающего, чтобы уменьшить нежелательную активность нейронов, чтобы таким образом вылечить патологическое состояние. Введение осуществляется по пути, который приводит в контакт эффективное количество композиции с нейронами, проявляющими нежелательную активность.

[00131] Конкретные патологические состояния, предусмотренные для лечения описанными в данном документе способами, включают, без ограничения спастическую дисфонию, спазматическую кривошею, дистонию мышц гортани, oромандибулярную дистонию, лингвальную дистонию, цервикальную дистонию, графоспазм, блефароспазм, косоглазие, гемифациальный спазм, расстройство век, церебральный паралич, фокальную спастичность и другие нарушения речи, спастический колит, нейрогенный мочевой пузырь (т.е. все заболевания, связанные с недержанием мочи, такие как, например, нейрогенная гиперактивность детрузора или нейрогенная сверхактивность мышцы-сжимателя), рак простаты и другие виды рака, анизмус, спастичность конечностей, тик, тремор, бруксизм, анальную трещину, ахалазию, дисфагию и другие нарушения мышечного тонуса и другие расстройства, характеризующиеся непроизвольными движениями мышечных групп, лакримацию, гипергидроз, чрезмерное слюноотделение, чрезмерные желудочно-кишечные выделения, а также другие секреторные расстройства, боль от мышечных спазмов, невропатическую боль, воспалительную боль, головную боль, такую как, например, мигрень, зуд (прурит), акне. Кроме того, настоящее изобретение может быть использовано для лечения дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний, например, уменьшения межбровной складки, уменьшения морщин на коже. Настоящее изобретение также может быть использовано для лечения спортивных травм.

[00132] Кроме того, модифицированный нейротоксин можно вводить для лечения других нервно-мышечных нарушений с использованием хорошо известных методов, которые обычно выполняются с использованием ботулинического токсина типа А. Например, настоящее изобретение может быть использовано для лечения боли, например, головной боли, боли от мышечных спазмов и различных форм воспалительной боли. Например, в патенте США № 5721215 Aoki и в патенте США № 6113915 Aoki раскрыты способы использования ботулинического токсина типа А для лечения боли. Раскрытие этих двух патентов включено в настоящее описание посредством ссылки.

[00133] Расстройства вегетативной нервной системы также можно лечить модифицированным нейротоксином. Например, нарушение работы железы является расстройством вегетативной нервной системы. Нарушение работы желез включает чрезмерное потоотделение и чрезмерное слюноотделение. Нарушение работы органов дыхания является еще одним примером расстройства вегетативной нервной системы. Нарушение работы органов дыхания включает хроническую обструктивную болезнь легких и астму. Sanders et al. в патенте США № 5766605 раскрывает способы лечения вегетативной нервной системы; например, лечение расстройств вегетативной нервной системы, таких как чрезмерное потоотделение, чрезмерное слюноотделение, астма и т.д., с использованием природных ботулинических токсинов. Раскрытие Sander et al. полностью включено в настоящее описание посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения по существу аналогичные методы, описанные Sanders et al., могут быть использованы, но с использованием модифицированного нейротоксина для лечения расстройств автономной нервной системы, таких как те, которые обсуждались выше. Например, модифицированный нейротоксин может быть локально применен к носовой полости млекопитающего в количестве, достаточном для дегенерации холинергических нейронов автономной нервной системы, которые контролируют слизистую секрецию в полости носа.

[00134] Боль, которую можно лечить с помощью модифицированного нейротоксина, включает боль, вызванную мышечным напряжением, спазмом или болью, которая не связана с мышечным спазмом. Например, Binder в патенте США № 5714468 раскрывает, что головная боль, вызванная сосудистыми нарушениями, мышечным напряжением, невралгией и невропатией, может лечиться природным ботулиническим токсином, например, ботулином типа А. Раскрытия Binder полностью включены в данное описание посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения могут быть использованы, по существу, аналогичные методы, такие как у Binder, но с использованием модифицированного нейротоксина для лечения головной боли, в особенности такой, которая вызвана сосудистыми нарушениями, мышечным напряжением, невралгией и невропатией. Боль, вызванная спазмом мышц, также может лечиться путем введения, модифицированного нейротоксина. Например, в WO2006001676 (Kang Ahn) раскрыты способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли в коленном суставе, вызванной ущемлением подкожного нерва, в WO2008059126 (Christine Favre et al.) раскрывы способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, вызванной химиотерапией, в WO2008090287 (Christine Favre et al.) раскрыты способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, вызванной лечением ВИЧ-инфекции, в WO2009130600 (Christine Favre et al.) раскрыты способы применения ботулинического нейротоксина для лечения боли, связанной с диабетической невропатией, и в WO2007144493 ( Michel Auguet и др.) раскрыты способы применения ботулинического нейротоксина в комбинации с опиатным производным для лечения боли. Раскрытия WO2006001676, WO2008059126, WO2008090287, WO2009130600, WO2007144493 полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, модифицированный нейротоксин можно вводить млекопитающему для лечения боли, которая не связана с мышечным расстройством, таким как спазм. В одном широкой реализации изобретения способы согласно настоящему изобретению для лечения боли, не связанной со спазмом, включают центральное введение или периферическое введение модифицированного нейротоксина.

[00135] Острая или хроническая боль, которая не связана с мышечным спазмом, также может быть уменьшена при местном периферическом введении модифицированного нейротоксина в фактическое или воспринимаемое место боли у млекопитающего. В одном варианте реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводят подкожно в место нахождения или вблизи места боли, например, у или вблизи разреза. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводят внутримышечно в место или вблизи места боли, например, в место расположения синяков у млекопитающего или вблизи от него. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный нейротоксин вводится непосредственно в сустав млекопитающего для лечения или облегчения боли, вызванной артритом. Кроме того, часто повторяемая инъекция или инфузия модифицированного нейротоксина в периферическое место боли входит в объем настоящего изобретения

[00136] Пути введения для таких способов известны в данной области техники и легко адаптированы к способам, описанным в данном документе квалифицированным специалистом (см., например, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), под редакцией Anthony Fauci et al., 14-е издание, опубликованный McGraw Hill). В качестве неограничивающего примера лечение нервно-мышечного расстройства может включать стадию локального введения эффективного количества молекулы в мышцу или группу мышц, лечение вегетативного нарушения может включать стадию локального введения эффективной молекулы в железу или железы, и лечение боли может включать стадию введения эффективного количества молекулы в место боли. Кроме того, лечение боли может включать стадию введения эффективного количества модифицированного нейротоксина в спинной мозг.

[00137] Также предполагается, что модифицированный H_C (например, B-H_C), описанный в данном документе, может быть использован в качестве средства доставки для нацеливания на нейроны и другие типы клеток, которые экспрессируют человеческий синаптотагмин II у людей. Например, модифицированный H_C, связанный с другой биологически активной молекулой (например, терапевтическим агентом), ковалентно или нековалентно, чтобы таким образом образовывать химерную молекулу, описанную в данном документе, может служить в качестве нацеливающего носителя для доставки биоактивной молекулы к нейронам и другим типам клеток, которые экспрессируют человеческий синаптотагмин II у людей путем связывания с человеческим Syt I и/или Syt II. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к применению описанной в данном документе молекулы химерного полипептида для доставки биоактивной молекулы в нейрон человека. Вторая часть молекулы может быть биоактивной молекулой, такой как терапевтический агент (например, полипептид или лекарственное средство). Связывание первой и второй частей молекулы может быть ковалентным (например, в виде гибридного белка) или нековалентным. Способы такого связывания известны в данной области техники и могут быть легко применены специалистом-практиком. Молекулу химерного полипептида можно было бы вводить по пути, который приводил бы в контакт полипептид с нейронами, экспрессирующими рецептор, с которым специфически связывается модифицированный B-H_C (целевой нейрон), как описано в данном документе.

Определение рецептор-связывающей активности

[00138] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу идентификации модифицированного рецептор-связывающего домена BoNT в его способности связываться с рецептором (например, человеческим Syt I или человеческим Syt II, или человеческим SV2). Метод использует 2-гибридную систему анализа и использует гибридные белки, сделанные из рецептора, и модифицированного Hc, соответственно слитого (экспрессированные как гибридные белки), с соответствующими субъединицами «приманки» и «жертвы», используемыми в 2-гибридном анализе (например, система активации транскрипции Gal 4 с использованием домена активации и ДНК-связывающего домена). 2-гибридный анализ обычно проводят в дрожжах (S. cerevisiae), но аналогичные системы анализа были разработаны для использования в других организмах с одной клеткой, а также для E. coli. Эти системы одинаково сопоставимы. В одном варианте реализации изобретения используется бактериальная 2-гибридная система на основе аденилатциклазы (Karimova et al., Proc Natl Acad Sci US A. 12 мая 1998 г., 95 (10): 5752-5756, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки). Система использует T18 и T25 в качестве приманки и жертвы и может использовать клетки BTH101 E. coli.

[00139] Модифицированный Hc экспрессируется как гибридный белок с T18 (называемый первым гибридным белком) в E. coli 2-гибридного анализа. В способе рецептор (или его связывающий фрагмент, такой как АК 1-87 h-Syt II) совместно экспрессируется как гибридный белок с T25 (называемый вторым гибридным белком) в E. coli 2-гибридного анализа. Анализ использует положительный показатель взаимодействия между соответствующими молекулами через их соответствующие слияния. Одним из возможных положительных показателей является появление окраски. Клональные колонии E. coli, экспрессирующие как первый, так и второй гибридные белки, выращивают на твердых питательных средах, содержащих соответствующие селективные и репортерные среды (например, ампициллин, канамицин, X-gal и IPTG) в течение некоторого времени, чтобы обеспечить образование (например, появление окраски) из положительных колоний. Связывание модифицированного связывающего домена с фрагментом рецептора приведет к положительному показателю (например, экспрессии гена LacZ и приводит к образованию синего цвета в колониях, выращенных на чашках с X-gal).

[00140] Колонии анализируются на такой положительной показатель (например, появление окраски) по сравнению с соответствующими контролями (положительными и отрицательными). Анализ может быть визуальным или без помощи человека. Используется подходящий отрицательный контроль, который не создает заметного положительного показателя (например, экспрессия LacZ) (например, клональная колония, лишенная ключевого компонента системы анализа, такой как наличие приманки и жертвы, которые экспрессируются без слияния). Также можно использовать соответствующий сильный положительный контроль. Одним из примеров сильного положительного контроля рецептора Syt II человека в анализе является B1-Hc с мутацией по типу замены при E1191 (M/C/V или Q). Слабоположительный контроль также можно использовать для определения силы связывания. Одним из примеров слабоположительного контроля рецептора Syt II человека в анализе является B1-Hc с мутацией по типу замены при W1178 (Q/Y/A или S). Идентификация положительного показателя (например, появление окраски) указывает на то, что модифицированный Hc связывает рецептор. Идентификация сильного положительного показателя, такого как сильное развитие цвета (например, выше слабоположительного контроля), указывает на то, что Hc связывает рецептор с высокой аффинностью.

[00141] Модифицированный Hc, используемый в анализе, может быть любым модифицированным Hc, описанным в данном документе. В качестве неограничивающего примера модифицированный Hc может содержать одну, две или три мутации по типу замены, такие как описанные в данном документе. Модифицированный Hc может быть любого серотипа/штамма или подтипа, как описано в данном документе.

[00142] Варианты реализации изобретения, описанные в данном документе и в следующих примерах, приведены только для иллюстративных целей, и различные модификации или изменения, очевидные для специалистов в данной области техники, включены в объем настоящего изобретения.

[00143] Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, должны иметь значения, которые обычно понятны специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе включают формы в множественном числе и термины в множественном числе включают формы в единственном числе.

[00144] Следует понимать, что это настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами и т.д., описанными в данном документе и, как таковое, может варьироваться. Терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.

[00145] За исключением случаев, когда в рабочих примерах или если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов или условия реакции, используемые в данном документе, следует понимать, как модифицированные во всех случаях термином «около». При использовании для описания настоящего изобретения термин «около» по отношению к процентам означает ±1%.

[00146] В одном отношении настоящее изобретение относится к описанным в данном документе композициям, способам и их соответствующим компонентам(у), что является существенным для изобретения, но открытым для включения неуточненных элементов, существенных или нет («содержащий»). В некоторых вариантах реализации изобретения другие элементы, которые должны быть включены в описание композиции, способа или соответствующего ее компонента, ограничены теми, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику(ы) изобретения («состоящей в основном из»). Это в равной степени относится к этапам описанного способа, а также к композициям и компонентам. В других вариантах реализации изобретения, композиции, способы и их соответствующие компоненты, описанные в данном документе, предназначены исключительно для любого элемента, который не считается существенным элементом для компонента, композиции или способа («состоящий из»).

[00147] Все патенты, заявки на патент и опубликованные публикации прямо включены сюда посредством ссылки для целей описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации предоставляются исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этом отношении не должно толковаться как признание того, что изобретатели не имеют права преподносить такое раскрытие в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления о дате или представлении в отношении содержания этих документов основаны на информации, доступной для заявителей, и не являются признанием правильности дат или содержания этих документов.

Ссылки на уровень техники и подробное описание сущности изобретения

1. Schiavo, G., Matteoli, M. & Montecucco, C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol Rev 80, 717-766 (2000).

2. Johnson, E.A. Clostridium toxins as therapeutic agents: benefits of nature's most toxic proteins. Annu Rev Microbiol 53, 551-575 (1999).

3. Aoki, K.R. Botulinum toxin: a successful therapeutic protein. Curr Med Chem 11, 3085-3092 (2004).

4. Montecucco, C. & Molgo, J. Botulinal neurotoxins: revival of an old killer. Curr Opin Pharmacol 5, 274-279 (2005).

5. Lange, O., et al. Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: much ado about nothing? Clin Neuropharmacol 32, 213-218 (2009).

6. Chapman, M.A., Barron, R., Tanis, D.C., Gill, C.E. & Charles, P.D. Comparison of botulinum neurotoxin preparations for the treatment of cervical dystonia. Clin Ther 29, 1325-1337 (2007).

7. Cote, T.R., Mohan, A.K., Polder, J.A., Walton, M.K. & Braun, M.M. Botulinum toxin type A injections: adverse events reported to the US Food and Drug Administration in therapeutic and cosmetic cases. J Am Acad Dermatol 53, 407-415 (2005).

8. Dong, M., Tepp, W.H., Liu, H., Johnson, E.A. & Chapman, E.R. Mechanism of botulinum neurotoxin B and G entry into hippocampal neurons. J Cell Biol 179, 1511-1522 (2007).

9. Peng, L., Tepp, W.H., Johnson, E.A. & Dong, M. Botulinum neurotoxin D uses synaptic vesicle protein SV2 and gangliosides as receptors. PLoS Pathog 7, e1002008 (2011).

10. Dong, M., et al. Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J Cell Biol 162, 1293-1303 (2003).

11. Nishiki, T., et al. Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J Biol Chem 269, 10498-10503 (1994).

12. Rummel, A., Karnath, T., Henke, T., Bigalke, H. & Binz, T. Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J Biol Chem 279, 30865-30870 (2004).

13. Peng, L., et al. Botulinum neurotoxin D-C uses synaptotagmin I/II as receptors and human synaptotagmin II is not an effective receptor for type B, D-C, and G toxins. J Cell Sci (2012).

14. Dong, M., et al. SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A. Science 312, 592-596 (2006).

15. Dong, M., et al. Glycosylated SV2A and SV2B mediate the entry of botulinum neurotoxin E into neurons. Mol Biol Cell 19, 5226-5237 (2008).

16. Mahrhold, S., Rummel, A., Bigalke, H., Davletov, B. & Binz, T. The synaptic vesicle protein 2C mediates the uptake of botulinum neurotoxin A into phrenic nerves. FEBS Lett 580, 2011-2014 (2006).

17. Rummel, A., et al. Botulinum neurotoxins C, E and F bind gangliosides via a conserved binding site prior to stimulation-dependent uptake with botulinum neurotoxin F utilising the three isoforms of SV2 as second receptor. J Neurochem 110, 1942-1954 (2009).

18. Fu, Z., Chen, C., Barbieri, J.T., Kim, J.J. & Baldwin, M.R. Glycosylated SV2 and gangliosides as dual receptors for botulinum neurotoxin serotype F. Biochemistry 48, 5631-5641 (2009).

19. Montecucco, C. How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronal membranes? TIBS, 314-317 (1986).

20. Nishiki, T., et al. The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a. FEBS Lett 378, 253-257 (1996).

21. Pang, Z.P., et al. Synaptotagmin-2 is essential for survival and contributes to Ca2+ triggering of neurotransmitter release in central and neuromuscular synapses. J Neurosci 26, 13493-13504 (2006).

22. Strotmeier, J., Willjes, G., Binz, T. & Rummel, A. Human synaptotagmin-II is not a high affinity receptor for botulinum neurotoxin B and G: increased therapeutic dosage and immunogenicity. FEBS Lett 586, 310-313 (2012).

23. Craxton, M. A manual collection of Syt, Esyt, Rph3a, Rph3al, Doc2, and Dblc2 genes from 46 metazoan genomes--an open access resource for neuroscience and evolutionary biology. BMC Genomics 11, 37 (2010).

24. Brin, M.F., et al. Safety and efficacy of NeuroBloc (botulinum toxin type B) in type A-resistant cervical dystonia. Neurology 53, 1431-1438 (1999).

25. Pappert, E.J. & Germanson, T. Botulinum toxin type B vs. type A in toxin-naive patients with cervical dystonia: Randomized, double-blind, noninferiority trial. Mov Disord 23, 510-517 (2008).

26. Wang, J., et al. Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochem J 444, 59-67 (2012).

27. Rummel, A., Mahrhold, S., Bigalke, H. & Binz, T. Exchange of the H(CC) domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS J 278, 4506-4515 (2011).

28. Kozaki, S., et al. Characterization of Clostridium botulinum type B neurotoxin associated with infant botulism in japan. Infect Immun 66, 4811-4816 (1998).

29. Ihara, H., et al. Sequence of the gene for Clostridium botulinum type B neurotoxin associated with infant botulism, expression of the C-terminal half of heavy chain and its binding activity. Biochim Biophys Acta 1625, 19-26 (2003).

30. Rummel, A., Mahrhold, S., Bigalke, H. & Binz, T. The HCC-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction. Mol Microbiol 51, 631-643 (2004).

31. Chai, Q., et al. Structural basis of cell surface receptor recognition by botulinum neurotoxin B. Nature 444, 1096-1100 (2006).

32. Jin, R., Rummel, A., Binz, T. & Brunger, A.T. Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity. Nature 444, 1092-1095 (2006).

33. Arnon, S.S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. Jama 285, 1059-1070 (2001).

34. Moriishi, K., et al. Mosaic structures of neurotoxins produced from Clostridium botulinum types C and D organisms. Biochim Biophys Acta 1307, 123-126 (1996).

35. Hill, K.K., et al. Genetic diversity among Botulinum Neurotoxin-producing Clostridium strains. J Bacteriol 189, 818-832 (2007).

36. Lalli, G., et al. Functional characterisation of tetanus and botulinum neurotoxins binding domains. J Cell Sci 112 ( Pt 16), 2715-2724 (1999).

[00148] Настоящее изобретение может быть таким, как определено в любом из следующих пронумерованных абзацев.

1. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:

а) протеазный домен;

b) протеазный сайт расщепления;

c) транслокационный домен; и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотип В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранном из группы, состоящей из:

E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.

2. Полипептид BoNT по абзацу 1, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит одну мутацию по типу замены, соответствующую мутации по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранную из группы, состоящей из E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C и Y1183P.

3. Полипептид BoNT по абзацу 2, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191C в серотипе B штамма 1.

4. Полипептид BoNT по абзацу 2, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит мутацию по типу замены, соответствующую E1191V в серотипе B штамма 1.

5. Полипептид BoNT по абзацу 1, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит две мутации по типу замены.

6. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:

а) протеазный домен;

b) протеазный сайт расщепления;

c) транслокационный домен; и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, при этом одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из:

E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, и E1191Y.

7. Полипептид BoNT по абзацу 6, отличающийся тем, что одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.

8. Полипептид BoNT по любому из абзацев 5-7, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1.

9. Полипептид BoNT по любому из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.

10. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.

11. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.

12. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.

13. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.

14. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.

15. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.

16. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.

17. Полипептид BoNT по одному из абзацев 5-8, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.

18. Полипептид BoNT по абзацу 6, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены.

19. Полипептид BoNT по абзацу 18, отличающийся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.

20. Полипептид BoNT по абзацу 19, отличающийся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.

21. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:

а) протеазный домен;

b) протеазный сайт расщепления;

c) транслокационный домен; и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий мутацию по типу замены в положении, соответствующем S1199 или S1201 серотипа B штамма 1.

22. Полипептид BoNT по любому из абзацев 1 -21, отличающийся тем, что модифицированный B-H_c содержится в штамме 1.

23. Полипептид BoNT по любому из абзацев 1-22, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу, выбранному из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций.

24. Полипептид BoNT по абзацу 23, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу B штамма 1.

25. Полипептид BoNT по абзацу 23, отличающийся тем, что протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат серотипу А штамма 1.

26. Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий одну или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, выбранным из группы, состоящей из:

E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.

27. Полипептид по абзацу 26, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит две мутации по типу замены.

28. Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), содержащий две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, причем одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L и E1191Y.

29. Полипептид по абзацу 26, отличающийся тем, что одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.

30. Полипептид по любому из абзацев 27-29, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1.

31. Полипептид по любому из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.

32. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.

33. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.

34. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.

35. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.

36. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.

37. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.

38. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.

39. Полипептид по одному из абзацев 27-30, отличающийся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.

40. Полипептид по абзацу 30, отличающийся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены.

41. Полипептид по абзацу 40, отличающийся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.

42. Полипептид по абзацу 41, отличающийся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.

43. Полипептид по любому из абзацев 26-42, отличающийся тем, что модифицированный B-H_c содержится в штамме 1.

44. Химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-H_c), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H_c содержит одну или более мутаций по типу замены, выбранных из группы, состоящей из

E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.

45. Химерная молекула по абзацу 44, отличающаяся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит две мутации по типу замены.

46. Химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа B Clostridium botulinum (B-H_c), связанную со второй частью, причем модифицированный B-H_c содержит две или более мутаций по типу замены, соответствующих мутациям по типу замены в серотипе B штамма 1, при этом одна из мутаций по типу замены выбрана из группы, состоящей из:

E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, и E1191Y.

47. Химерная молекула по абзацу 46, отличающаяся тем, что одна из мутаций по типу замены соответствует S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F или S1199L в серотипе B штамма 1.

48. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W; E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y, или E1191V и W1178Q, в серотипе B штамма 1.

49. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и S1199W в серотипе B штамма 1.

50. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191M и W1178Q в серотипе B штамма 1.

51. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199W в серотипе B штамма 1.

52. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и S1199Y в серотипе B штамма 1.

53. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191C и W1178Q в серотипе B штамма 1.

54. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191Q и S1199W в серотипе B штамма 1.

55. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199W в серотипе B штамма 1.

56. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и S1199Y в серотипе B штамма 1.

57. Химерная молекула по любому из абзацев 45-47, отличающаяся тем, что две мутации по типу замены соответствуют E1191V и W1178Q в серотипе B штамма 1.

58. Химерная молекула по одному из абзацев 45 или 46, отличающаяся тем, что модифицированный (B-H_c) содержит три мутации по типу замены.

59. Химерная молекула по абзацу 58, отличающаяся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178 серотипа B штамма 1.

60. Химерная молекула по абзацу 59, отличающаяся тем, что три мутации по типу замены соответствуют E1191M, S1199W и W1178Q серотипа B штамма 1.

61. Химерная молекула по любому из абзацев 44-60, отличающаяся тем, что модифицированный B-H_c содержится в штамме 1.

62. Химерная молекула по любому из абзацев 44-61, отличающаяся тем, что первая часть и вторая часть связаны ковалентно.

63. Химерная молекула по любому из абзацев 46-61, отличающаяся тем, что первая часть и вторая часть связаны нековалентно.

64. Химерная молекула по любому из абзацев 44-61, отличающаяся тем, что вторая часть выбрана из группы, состоящей из малой молекулы, нуклеиновой кислоты, короткого полипептида и белка.

65. Химерная молекула по абзацу 64, отличающаяся тем, что вторая часть представляет собой биоактивную молекулу.

66. Химерная молекула по абзацу 64 или 65, отличающаяся тем, что вторая часть представляет собой терапевтический полипептид или неполипептидный лекарственный препарат.

67. Полипептид BoNT, полипептид или химерная молекула по любому из абзацев 1-66, который демонстрирует значительно усиленное связывание модифицированного B-H_c с человеческим SytII и/или значительно уменьшенное связывание модифицированного B-H_c с человеческим Syt I по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутации(мутаций) по типу замены.

68. Полипептид BoNT, полипептид или химерная молекула по любому из абзацев 1- 66, отличающийся тем, что мутация по типу замены дает значительно усиленное связывание с SytII человека и/или значительно усиленное связывание с Syt I человека по сравнению с идентичной молекулой, не содержащей мутации(ий) по типу замены.

69. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид или химерную молекулу по любому из абзацев 1- 68.

70. Вектор нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по абзацу 69.

71. Клетка, содержащая вектор нуклеиновой кислоты по абзацу 70 или нуклеиновую кислоту по абзацу 69.

72. Клетка, экспрессирующая полипептид или химерную молекулу по любому из абзацев 1- 68.

73. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из абзацев 1-25, 67 или 68 или химерную молекулу по любому из абзацев 44-66 или вектор нуклеиновой кислоты по абзацу 70 или нуклеиновую кислоту по абзацу 69.

74. Фармацевтическая композиция по абзацу 73, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

75. Набор, содержащий фармацевтическую композицию по абзацу 73 или 74 и направления для терапевтического введения фармацевтической композиции.

76. Способ получения полипептида ботулинического нейротоксина (BoNT), включающий стадии культивирования клетки по абзацу 72 в условиях, в которых продуцируется полипептид BoNT.

77. Способ по абзацу 76, дополнительно включающий одну или более из следующих стадий:

- извлечения полипептида BoNT из культуры,

- очистку полипептида BoNT,

- активацию полипептида BoNT, и/или

- создание препарата на основе полипептида BoNT.

78. Способ лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, включающий введение терапевтически эффективного количества полипептида BoNT по любому из абзацев 1-25, 67 или 68 субъекту, чтобы таким образом обеспечивать контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную активность нейронов, таким образом, чтобы лечить патологическое состояние.

79. Способ по абзацу 78, отличающийся тем, что патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спазматического кривошея, дистонии мышц гортани, oромандибулярной дистонии, лингвальной дистонии, цервикальной дистонии, графоспазма, блефароспазма, косоглазия, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений речи, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тика, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии и других нарушений мышечного тонуса и других расстройств, характеризующихся непроизвольными движениями мышечных групп, лакримации, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерных желудочно-кишечных выделений, секреторные расстройства, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени, и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.

80. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из абзацев 1-25, 67 или 68, фармацевтическая композиция по одному из абзацев 73 или 74 или химерная молекула по любому из абзацев 44-66 или полипептид по любому из абзацев 26-43, для применения в медицине.

81. Полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) по любому из абзацев 1-25, 67 или 68, фармацевтическая композиция по одному из абзацев 73 или 74 или химерная молекула по любому из абзацев 44-66 или полипептид по любому из них абзацев 67-43, для использования при лечении патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью.

82. Способ идентификации модифицированного рецептор-связывающего домена ботулинического нейротоксина для связывания с рецептором;

а) экспрессию модифицированного рецептор-связывающего домена в качестве первого гибридного белка с субъединицей T18 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе и экспрессию рецептора в качестве второго гибридного белка с субъединицей T25 бактериальной аденилатциклазы в 2-гибридном анализе;

b) анализ клональной колонии E. coli, которая экспрессирует как первый, так и второй гибридный белок на наличие положительного признака выше отрицательного контроля; и

c) идентификацию модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, демонстрирующей положительный признак в виде связывания с рецептором.

83. Способ по абзацу 82, отличающийся тем, что положительный признак представляет собой появление окраски.

84. Способ по любому из абзацев 82-83, дополнительно включающий стадию анализа колонии на положительный признак против слабоположительного контроля и дальнейшую идентификацию модифицированного рецептор-связывающего домена, экспрессируемого колонией, проявляющей выше слабоположительного контроля в виде связывания с рецептором с высокой аффинностью.

85. Способ по абзацу 82-84, который осуществляют с использованием библиотеки модифицированных рецептор-связывающих доменов, каждый из которых экспрессирован в соответствующих колониях.

86. Способ по любому из абзацев 82-85, отличающийся тем, что рецептор является человеческим.

87. Способ по любому из абзацев 82-86, отличающийся тем, что модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более мутаций по типу замены, при этом одна из мутаций по типу замены соответствует мутации в серотипе B штамма 1, выбранном из группы, состоящей из: E1191M, E1191 Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и S1199Y.

[00149] Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не следует истолковывать как дополнительное ограничение.

ПРИМЕРЫ

Идентификация отдельных мутаций, которые усиливают связывание BoNT/B с h-Syt II

[00150] Сокристаллическая структура BoNT/B, связанная с люминальным доменом Syt II крысы, была раскрыта при помощи двух исследований в 2006 году^25,26. Структурные данные обеспечили прочную основу для того, чтобы мы сосредоточились на ограниченном количестве остатков на поверхности связывания для исследований рационального дизайна мутагенеза. Консервативный фенилаланин в положении 54 образует несколько гидрофобных связей с BoNT/B. Поскольку лейцин (у человека) также является гидрофобным, нарушение связывания BoNT/B, вероятно, связано с различиями в размере/форме между фенилаланином и лейцином. Ключевым моментом было выявление возможных изменений в области H_C BoNT/B, которые могут вместить изменение от фенилаланина до лейцина.

[00151] Были исследованы все остатки в BoNT/B, которые определяют взаимодействие между BoNT/B и Syt II. Эти остатки были хорошо определены сокристаллической структурой BoNT/B-Syt II, включая K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245, и Y1256 (Фигура 3), в общей сложности 19 положений. Стратегия заключалась в том, чтобы сначала систематически заменять остатки в каждой из этих 19 положений на все остальные 19 возможных аминокислот, а затем проверить связывание этих мутированных BoNT/B-H_C с h-Syt II. Таким образом, необходимо было собрать и протестировать в общей сложности 19 x19=361 одноточечных мутаций.

[00152] Для генерации этих 361 мутаций и тестирования их связывания с h-Syt II использовали бактериальную 2-гибридную систему на основе аденилатциклазы (BACTH), как описано на Фигуре 4. Вкратце, BoNT/B-H_C дикого типа (ДТ) субклонировали в вектор в рамке с расщепленным фрагментом (T18) бактериальной аденилатциклазы. Этот гибридный конструкт T18-BoNT/B-H_C амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами, несущими случайные тринуклеотиды (NNN) в выбранном положении в BoNT/B-H_C (Фигура 4A). Это создало пул конструктов, которые кодируют все 20 различных аминокислот на выбранном сайте. Затем этот пул конструктов был совместно трансформирован в бактерии (штамм BTH101 E. coli) вместе с конструктом, который экспрессирует h-Syt II (1-87), слитый с другой половиной расщепленной бактериальной аденилатциклазы (T25). Связывание мутанта BoNT/B-H_C с h-Syt II объединяло T18 и T25 вместе и восстанавливало активность аденилатциклазы, что приводило к экспрессии гена lacZ и приводило к формированию синих колоний на чашках с Х-gel (Фигура 4Б). Специфические мутации, введенные в BoNT/B-H_C, были идентифицированы путем извлечения и секвенирования конструктов из этих синих колоний.

[00153] Используя этот метод BACTH, все 19 выбранных сайтов были скринированы на BoNT/B-H_C. Количество колоний и синих колоний для каждого сайта приведены на Фигуре 5A. Для каждого положения подсчитывали более 380 колоний суммарно. Общее количество колоний определило возможность охвата всех 20 аминокислот на выбранном сайте мутации. Это было рассчитано при помощи уравнения Clark-Carbon: P=1-(1-f)^N, где f отражает количество возможных остатков (здесь f=1/20, так как существует 20 различных аминокислот), а N - общее количество колоний. При минимальном количестве 380 колоний вероятность охвата всех 20 аминокислот в положении составляет 99,8%. Поэтому вполне вероятно, что все 20 возможных остатков были охвачены, как только количество колоний в чашках превысило 380.

[00154] Как показано на Фигуре. 5А, было обнаружено, что четыре положения приводят к образованию синих колоний, включая E1191 (22,7%), W11178 (7,8%), Y1183 (4,0%), и S1199 (5,1%). Среди этих четырех положений E1191 имел самые высокие уровни синих колоний. Кроме того, синие колонии с E1191 также показали более глубокий синий цвет по сравнению с другими тремя сайтами, что предполагало, что взаимодействие между BoNT/B-H_C и h-Syt II может быть сильнее с мутациями E1191. Плазмиды экстрагировали и секвенировали из этих синих колоний. Идентифицированные остатки на каждом сайте приведены на Фигуре 5Б: E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183/C/P, S1199W/E/Y/H, W1178Y/Q/A/S.

[00155] Взаимодействия между человеческим Syt II и идентифицированными мутантами были дополнительно проверены путем измерения уровней β-галактозидазы, продуцируемой бактериями, которая была пропорциональна общему уровню активности аденилатциклазы, восстановленному взаимодействием между T18-BoNT/B-H_C и T25-h-Syt II. Четыре мутации на сайтах E1191, E1191M/C/V/Q, показали самую сильную активность β-галактозидазы среди всех тестируемых мутаций (Фигура. 6A), предполагая, что замена E1191 на один из этих четырех остатков значительно улучшает связывание T18-BoNT/B-H_C до T25-h-Syt II.

[00156] Связывание мутантного BoNT/B-H_C с h-Syt II было дополнительно проанализировано с использованием теста на связывание в качестве альтернативного подхода (Фигура 6Б). Вкратце, GST-меченный люминальный домен Syt II мыши (m-Syt II) и люминальный домен Syt II человека (h-Syt II) иммобилизовали на гранулах GST и использовали для осаждения мутантного BoNT/B-H_C, экспрессируемого в бактериях. Связывание BoNT/B-H_C с GST-меченным Syt II детектировали с помощью иммуноблот-анализа, детектируя метку HA, слитую с BoNT/B-H_C. Как показано на Фигуре 6Б, E1191M/C/V/Q приводит к значительным уровням связывания с h-Syt II, что согласуется с обнаружением того, что эти четыре мутации также проявляют самую сильную активность β-галактозидазы (Фигура 6A). Вместе эти результаты показали, что E1191M/C/V/Q являются четырьмя первичными мутациями, которые обладают способностью к сильному связыванию h-Syt II.

Комбинационные мутации в HCB дополнительно усилили его связывание с h-Syt II

[00157] Затем была изучена возможность связывания BoNT/B-H_C E1191M/C/V/Q с h-Syt II путем включения вторичной мутации в другой сайт. Сосредотачивались на сайтах 1183, 1199 и 1178 как на кандидатах на сайты вторичных мутаций, так как это были наиболее подходящими тремя сайтами, которые также приводили к образованию синих колоний (Фигура 5). Используя E1191M в качестве первичных мутаций, были созданы двойные мутации, объединяющие E1191M со всеми остальными 10 изменениями остатков, идентифицированными при скрининге BACTH на сайтах 1183, 1199 и 1178, как показано на Фигуре 5Б. Эти 10 двойных мутаций анализировали на их способность связывать h-Syt II в тесте на связывание, как показано на Фигура 7A. Три из них E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y и E1191M/W1178Q привели к существенному связыванию с h-Syt II (Фигура 7A). Эти результаты предполагают, что включение S1199W/Y и W1178Q в качестве сайта вторичной мутации дополнительно улучшит связывание BoNT/B-H_C E1191M/C/V/Q с h-Syt II. Вместе эти данные показали, что существует четыре варианта первичной мутации на сайте E1191 (M/C/V/Q) и три варианта сайтов вторичной мутации (S1199W/Y и W1178Q) (Фигура 7Б) и комбинация первичной мутации с вторичной мутацией может дополнительно усилить связывание с h-Syt II.

[00158] Комбинирование E1191M с Y1183C/P фактически уменьшало связывание с h-Syt II (Фигура 7A). Как сообщалось ранее, поверхность связывания Syt II BoNT/B состоит из двух гидрофобных карманов. E1191 и Y1183 расположены в одном кармане, в то время как S1199 и W1178 расположены в другом. Поскольку E1191 пространственно близок к Y1183, потенциальный структурный конфликт может возникать при мутации обоих из них, что может объяснить, почему двойные мутации в этих двух положениях уменьшают связывание с h-Syt II.

[00159] Было проведено определение и сравнение аффинности связывания между мутантным BoNT/B-H_C до h-Syt II с целью выбора двойных мутаций с лучшей аффинностью связывания. Аффинность связывания (K_D) определяли с использованием хорошо зарекомендовавшего себя анализа нтерферометрии биослоев (Фигура 8А). Вкратце, GST-меченные белки Syt иммобилизовали на зонд. Зонд сначала подвергали очистке BoNT/B-H_C в разных концентрациях (фаза ассоциации, Фигура 8A), а затем стадии отмывания (фаза диссоциации, Фигура 8A). Связывание BoNT/B-H_C с GST-меченным Syt увеличивает общую молекулярную массу/размер на зонде, что приводит к изменению отражения света на зонде, который может быть обнаружен и проанализирован. Параметры связывания, такие как константа ассоциации (K_on), константа диссоциации (K_off) и кажущаяся аффинность связывания (K_D), могут быть рассчитаны на основе кривой ассоциации и диссоциации, как показано на Фигуре 8A.

[00160] Используя этот анализ, все комбинации четырех первичных мутаций (E1191M/C/Q/V) систематически характеризовали с использованием трех вторичных мутаций (S1199W/Y, W1178Q). Кроме того, была также получена и проанализирована тройная мутация E1191M/S1199W/W1178Q. Связывание BoNT/B-H_C ДТ с Syt II мыши (m-Syt II) определяли, как положительный контроль, который демонстрировал связывание K_D при 0,13 мкмоль/л (Фигура 8Б). Как и ожидалось, связывание BoNT/B-H_C ДТ с h-Syt II было слишком слабым, чтобы быть надежно определенным с рассчитанным K_D выше предела детектирования (>20 мкмоль/л). Одна первичная мутация E1191M приводила к связыванию K_D при 6,7 мкмоль/л, к значительному улучшению по сравнению с BoNT/B-H_C ДТ. Двойные мутации, которые объединяли сайт первичной мутации с сайтами вторичных мутаций, дополнительно улучшали аффинность связывания до 0,59 мкмоль/л (E1191V/S1199Y). Как и ожидалось, большинство двойных мутаций улучшало аффинность связывания с h-Syt II с K_D между 0,59 мкмоль/л до 4,3 мкмоль/л. E1191Q/W1178Q был единственным, который не связывался с h-Syt II. Причина неизвестна, но возможно, что эта двойная мутация может вызвать неожиданные конформационные изменения белка. Тройная мутация E1191M/S1199W/W1178Q продемонстрировала почти такую ​​же аффинность связывания, что и двойная мутация E1191M/S1199W, что указывает на то, что добавление сайта третьей мутации не может дополнительно улучшить аффинность связывания. Вместе эти данные подтвердили, что все двойные мутации между E1191M/C/Q/V и S1199W/Y, W1178Q, за исключением E11191Q/W1178Q, приводили к образованию мутанта BoNT/B-H_C, который может сильно связываться с h-Syt II.

Мутанты HCB показали усиленное связывание с h-Syt I

[00161] В дополнение к Syt II, Syt I также функционирует как рецептор для BoNT/B. Чтобы достичь максимально возможного связывания с человеческими нейронами, модифицированные мутанты BoNT/B не должны влиять на связывание с человеческим Syt I. В идеальном случае они могут даже увеличивать связывание с Syt I. Действительно, было обнаружено, что E1191M значительно улучшает связывание BoNT/B-H_C с h-Syt I, поскольку устойчивое связывание может быть обнаружено без присутствия липидных корецепторных ганглиозидов (Фигура 9A). Аффинность связывания между выбранными двойными мутациями и h-Syt I измеряли с использованием интерферометрии биослоев. Как показано на Фигурах 9Б, В, двойные мутации E1191M/S1199Y (B-H_C MY) и E1191V/S1199Y (B-H_C VY) проявляли K_D при 2,9 мкмоль/л и 5,82 мкмоль/л, соответственно, тогда как связывание BoNT/B-H_C ДТ с h-Syt I был слишком слабым, чтобы быть надежно определенным, с расчитанным K_D выше предела детектирования (>20 мкмоль/л).

H_CB_MY связывается с h-Syt II на поверхности нейронов

[00162] Далее мы рассмотрели, может ли мутант H_CB_MY связываться с h-Syt II на физиологически значимых поверхностях нейронов. С этой целью мы использовали культивируемые кортикальные нейроны крыс в качестве модели нейронов, которые экспрессируют Syt I, но не Syt II (Dong et al., Journal of cell biology 179 (7): 1511-1522 (2007)). Таким образом, нокдаун Syt I генерировал нейроны без эндогенных рецепторов. Экспрессия полноразмерного h-Syt II в этих Syt I KD нейронах приводила к образованию «гуманизированных» нейронов с только h-Syt II в качестве рецептора токсина, как нами было ранее описано (Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42(2012)). Как и ожидалось, H_CB ДТ сильно связывался с нейронами крыс, и связывание разрушалось после нокдауна эндогенного Syt I. Экспрессия полноразмерного m-Syt II, но не h-Syt II, а m-Syt II, содержащего мутацию F54L, восстановливало связывание H_CB ДТ (Фигура 10A). Напротив, H_CB_MY продемонстрировал устойчивое связывание с нейронами, которые экспрессируют m-Syt II, h-Syt II или m-Syt II (F54L), демонстрируя, что H_CB_MY увеличивает усиленную способность связывать h-Syt II на поверхностях нейронов (Фигура 10Б).

Мутант BoNT/B проявил повышенную эффективность в блокировании передачи нервных импульсов в гуманизированных нейронах

[00163] Чтобы решить ключевой вопрос, приводит ли усиленное связывание с h-Syt II к повышению эффективности на функциональных уровнях в нейронах, мы получали полноразмерный BoNT/B ДТ и мутантный токсин, содержащий точечные мутации E1191M/S1199Y (BoNT/B_MY) рекомбинантно в E.coli. Гуманизированные нейроны подвергали воздействию градиента токсинов ДТ или BoNT/B_MY. Расщепление VAMP2 анализировали при помощи анализа методом иммуноблоттинга. Как показано на Фигуре 11А, большее количество VAMP2 было расщеплено в нейронах, которые подвергали воздействию BoNT/B_MY, по сравнению с нейронами, которые подвергали воздействию BoNT/B ДТ, при каждой тестируемой концентрации токсинов, что указывает на то, что BoNT/B_MY нацеливают и поступают в нейроны более эффективно, чем токсин ДТ.

[00164] Затем мы следили за высвобождением нейротрансмиттера, регистрируя миниатюрные тормозные постсинаптические токи (mIPSC), используя метод локальной фиксации потенциала по всей клетке. Частота mIPSC отражает активность высвобождения нейротрансмиттера в совокупности нейронов. Ввод BoNT/B в пресинаптические окончания блокирует высвобождение нейротрансмиттера, тем самым снижая частоту mIPSC (Фигура 11Б). Гуманизированные нейроны подвергали воздействию градиента BoNT/B ДТ или BoNT/B_MY. Как показано на фиг. 11В, BoNT/B_MY продемонстрировал значительно повышенную активность, причем полумаксимальная ингибирующая концентрация (ИК₅₀) была примерно в 11 раз ниже, чем для токсина ДТ: BoNT/B_MY может достичь такого же уровня блокировки высвобождения нейротрансмиттеров с 11-кратным снижением концентрации токсинов по сравнению с токсином ДТ. Эти данные показали, что усиленное связывание с рецепторами человека приводит к повышению эффективности токсина на функциональных уровнях в нейронах.

[00165] Метод BACTH использовали для скрининга всех возможных одиночных мутаций на всех 19 ключевых остатках в BoNT/B-H_C, которые формируют связывающий карман для Syt II. Определены четыре позиции, которые могут быть мутированы для увеличения аффинности связывания с h-Syt II, причем сайт E1191 является основным сайтом, а S1199, W1178 и Y1183 являются сайтами вторичной мутации. Были созданы и протестированы двойные мутации, объединяющие первичные и вторичные сайты мутаций, и показали, что комбинирование E1191M/C/V/Q с S1199Y/W или W1178Q дает двойные мутации с сильным связыванием с h-Syt II и h-Syt I.

Обсуждение

[00166] Путем комбинирования рационального дизайна на основе доступной сокристаллической структуры комплекса BoNT/B-Syt II с использованием метода BACTH, который насыщает все возможные одноточечные мутации в каждом выбранном целевом остатке, была определена серия точечных мутаций в BoNT/B, которые могут связываться с h-Syt II. Эти точечные мутации были дополнительно исследованы в комбинациях, выявляя двойные мутанты, которые получили связывание с высокой аффинностью к h-Syt II. Важно отметить, что полноразмерный BoNT/B, содержащий сконструированную мутацию, показал в 11 раз более высокую эффективность, чем BoNT/B ДТ в гуманизированных нейронах, демонстрируя, что усиленное связывание с рецепторами токсинов приводит к более высокой активности на функциональных уровнях в нейронах.

Материалы и способы

[00167] Материалы и конструкты

Следующие антитела были приобретены у указанных поставщиков: Синапсин I (клон 46.1, Synaptic Systems), VAMP2 (клон 69.1, Synaptic Systems), HA (16B12, Covance), и β-тубулин III (ab18207, Abcam). Комбинированные ганглиозиды головного мозга были приобретены у Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) и были восстановлены в трис-буферном солевом растворе (TBS: 20 ммоль/л Трис, 150 ммол/л NaCl), как описано выше (Peng et al., PLoS pathogens 7(3):e1002008(2011)). КДНК, кодирующая H_CB, (остатки 857-1291, Genbank: ACA46990.1) была кодоном, оптимизированным для экспрессии в E. coli и синтезированным Genscript Inc. (Нью-Брансуик, Нью-Джерси). Следующие кДНК были щедро предоставлены указанными группами: Syt I крысы (T.C. Sudhof, Пало-Альто, Калифорния), Syt II мыши (M. Fukuda, Ибараки, Япония), Syt I человека (R.B. Sutton, Лаббок, Техас). ДНК, кодирующую H_CB, субклонировали в вектор pET28a, как с меткой His6 (SEQ ID NO: 13), так и с меткой HA (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)), слитые с его N-концом. Мутации в H_CB генерировали с помощью ПЦР с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (Agilent Technologies, Калифорния). GST-меченные фрагменты Syt I/II и мутант Syt II F54L были описаны ранее (Dong M, et al. Journal of cell biology 162 (7): 1293-1303 (2003); Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42 (2012); Dong M, et al. Science 312(5773):592-596 (2006)).

[00168] BACTH (бактериальная 2-гибридная система на основе аденилатциклазы): Анализ BACTH выполняли в соответствии с инструкцией производителя (Euromedex). Для теста были выбраны две совместимые плазмиды pUT18C и pKT25. Люминальный домен h-Syt II (остатки 1-80) клонировали в pKT25 для получения pKT25-h-Syt II. HCB клонировали в pUT18C для получения T18-HCB. Библиотеки мутантов HCB были созданы с помощью праймеров, содержащих случайные нуклеотидные триплеты (NNN) в определенных положениях. Каждую библиотеку совместно трансформировали с использованием плазмиды pKT25-h-Syt II в индикаторный штамм BTH101 E. coli путем электропорации и скринировали на чашках с агаром Луриа-Бертани, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина, 0,5 ммоль/л IPTG и 40 мкг/мл X-Gal. Чашки инкубировали при температуре 30°С в течение 64 часов. Плазмиды экстрагировали из синих колоний и секвенировали. Общее количество колоний определило возможность охвата всех 20 аминокислот на выбранном сайте мутации. Это было рассчитано при помощи уравнения Clark-Carbon: P=1-(1-f)^N, где f отражает количество возможных остатков (здесь f=1/20, так как существует 20 различных аминокислот), а N - общее количество колоний. При минимальном количестве 380 колоний в анализах, вероятность охвата всех 20 аминокислот в каждом положении составляет >99,8%.

[00169] Анализ β-галактозидазы: Клетки BTH101 E. coli с экспрессируемыми белками были инокулированы в жидкую среду LB (Луриа-Бертани), содержащую ампициллин, канамицин и IPTG (0,5 ммоль/л). Культуру выращивали в течение ночи при температуре 37°С для достижения стационарной фазы. ОП₆₀₀ культуры, выращенной в течение ночи, регистрировали до сбора урожая. Один миллилитр культуры, выращиваемой в течение ночи, центрифугировали и клеточный осадок дважды промывали PBS (фосфатно-солевой буфер) и суспендировали в равном объеме Z-буфера (60 ммоль/л Na₂HPO₄, 40 ммоль/л Na₂HPO₄, 10 ммоль/л KCl, 1 ммоль/л MgSO₄ и 20 ммоль/л дитиотреитола [ДТТ]). Сто микролитров ресуспендированных бактериальных клеток разводили в 1 мл Z-буфера (коэффициент разбавления [DF]=10). Затем добавляли 100 мл хлороформа и 50 мл 0,1% ДСН (додецилсульфат натрия) и хорошо перемешивали для проницаемости клеток. Двести пятьдесят микролитров смеси затем переносили в новую пробирку для микроцентрифуги и доводили до температуры 28°С, добавляли 50 мл предварительно нагретого о-нитрофенил-β-галактозида (4 мг/мл в Z-буфере) и смесь инкубировали при температуре 28°С до образования желтого цвета. Реакцию останавливали добавлением 200 мл 1 М Na₂CO₃. Были записаны A₄₂₀ и точный период времени реакции в минутах(T). Активность β-галактозидазы определяли как (1000 × A₄₂₀ × DF)/(T × ОП₆₀₀) в единицах Миллера.

[00170] Экспрессия белка и очистка: ДТ и мутанты BoNT/B-H_C экспрессировали как His₆-меченные рекомбинантные белки (His₆, представленный SEQ ID NO: 13) в E.coli. Фрагменты Syt I/II и мутанты экспрессировали как GST-меченные рекомбинантные белки в E. coli. Как GST-слитые, так и His₆-слитые белки (His₆, представленный SEQ ID NO: 13) очищали, как описано выше⁹, с температурой индукции 20°C в течение ночи с 0,25 ммоль/л IPTG.

[00171] Тесты на связывание GST: были проведены два типа тестов на связывание. Первая серия была использована для тестов на связывание мутантного BoNT/B-H_C с GST-меченным Syt II мыши (m-Syt II) и мутантным Syt II мыши (F54L), имитирующем последовательность Syt II человека (обозначаемую как h-Syt II). Вкратце, 6 мл E. coli, экспрессирующих BoNT/B H_C, осаждали, повторно суспендировали в 800 мкл TBS, обрабатывали ультразвуком, а затем инкубировали с 2% Тритон X-100 в течение 1 часа при температуре 4°C. Образцы затем центрифугировали при максимальной скорости в течение 15 мин в микроцентрифуге при 4°С. Супернатанты собирали и использовали для анализов на связывание путем инкубации с 10 мкг белков Syt, иммобилизованных на гранулах глутатион-сефарозы (GE bioscience, Пискатауэй, Нью-Джерси), при температуре 4°C в течение 1 часа. Образцы промывали три раза в отмывочном буфере (TBS с 0,5% Тритон X-100) и анализировали с помощью иммуноблоттинга BoNT/B-H_C с использованием антитела против HA. Для мутантов с улучшенным связыванием с h-Syt II дальнейшие анализы на связывание проводили путем очистки этих мутантов BoNT/B-H_C в качестве His6-меченных белков (His₆, представленный SEQ ID NO: 13), как описано ранее⁹. Затем проводили анализы на связывание с использованием иммобилизованных фрагментов Syt в 100 мкл буфера TBS плюс 0,5% Тритона X-100 с ганглиозидами или без них (60 мкг/мл) в течение 1 часа при 4°C. Гранулы промывали три раза, используя буфер TBS плюс 0,5% Тритона X-100. Десять процентов связанных материалов подвергали ДСН-ПААГ-электрофорезу с последующим иммуноблот-анализом.

[00172] Интерферометрия биослоев. Аффинность связывания между вариантами H_CB и Syt I/Syt II измеряли с помощью анализа BLI (интерферометрии биослоев) с помощью системы Blitz (ForteBio). Вкратце, GST-тег Syt I или Syt II (20 мкг/мл) иммобилизуют на биосенсоры Dip and Read^TM Anti-GST Biosensors (ForteBio) и балансируют с помощью PBS-буфера. Затем биосенсоры подвергали последовательному концентрированию H_CB, затем промывали с использованием PBS. Аффинность связывания (K_D) рассчитывали с использованием программного обеспечения системы Blitz по инструкции производителя (ForteBio).

[00173] Культура нейронов, лентивирус и анализ связывания/входа токсинов. Кортикальные нейроны крысы были получены из эмбрионов E18-19, как описано ранее (Peng et al., PLoS pathogens 7(3): e1002008 (2011)). Ранее были описаны конструкты для экспрессии Syt I KD, mSyt II и h-Syt II в нейронах (Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42(2012)). Лентивирусы добавляли к культурам нейронов в DIV5 (сутки в in vitro), а эксперименты по связыванию/вход токсинов проводили на DIV12-14. Токсины разбавляли в буфере с высоким содержанием K⁺ (87 ммоль/л NaCl, 56 ммоль/л KCl, 1,5 ммоль/л KH₂PO₄, 8 ммоль/л Na₂HPO₄, 0,5 ммоль/л MgCl₂ и 1 ммоль/л CaCl) и предварительно нагревали до температуры 37°C. Нейроны подвергали воздействию буферов, содержащих токсины, в течение 5 мин при температуре 37°C с последующей промывкой PBS. Эти нейроны или подвергали иммунному окрашиванию, или инкубировали в бестоксичной среде в течение дополнительных 24 часов с последующим иммуноблоттингом.

[00174] Запись mIPSC. Локальные фиксации потенциалов по всей клетке производили для культивируемых кортикальных нейронов на DIV 14-18 (DIV 14-18). Раствор пипетки содержал (в ммоль/л): 135 CsCl, 10 ГЭПЭС, 1 EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), 1 Na-ГТФ, 4 Mg-АТФ и 10 QX-314 (pH 7,4, доводили с использованием CsOH). Сопротивление пипеток, заполненных внутриклеточным раствором, варьировало от 4 до 5 МОм. После формирования конфигурации целой клетки и уравновешивания внутриклеточного раствора в пипетке, последовательное сопротивление было доведено до 10 МОм. Синаптические токи контролировали с помощью усилителя EPC-10/2 (HEKA) при исходном потенциале -70 мВ. Омывающий раствор содержал (в ммоль/л): 140 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl, 1 MgCl₂, 10 ГЭПЭС, 10 глюкозы (pH 7,4, доводили с использованием NaOH). Спонтанные ингибирующие постсинаптические токи (sIPSC) и вызванные ингибиторные постсинаптические токи (eIPSC) были фармакологически ингибированы путем добавления блокаторов рецепторов AMPA и NMDA CNQX и APV к экстрацеллюлярному омывающему раствору. Спонтанные миниатюрные тормозные постсинаптические токи (mIPSC) контролировали в присутствии тетрадотоксина (TTX) для блокирования потенциалов действия. Данные анализировали с использованием Clampfit¹⁰ (Molecular Devices), программного обеспечения Origin8 (Mocrocal Inc.), программного обеспечения MiniAnalysis (Synaptosoft) и Igor (Wavemetrics). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента (* P <0,01). Все показанные данные представляют собой средние ± СОС.

Выводы:

[00175] Вышеприведенные результаты демонстрируют новые способы и композиции для улучшения связывания BoNT/B с его рецепторами человека и обеспечивают способ создания новых поколений терапевтических BoNT с использованием модифицированного рецептор-связывающего домена, созданного в настоящем изобретении, с улучшенной эффективностью и специфичностью для целевых нейронов человека, чем используемые в настоящее время BoNT ДТ.

[00176] Эти результаты демонстрируют, что модификация белковой последовательности BoNT/B-H_C может создавать новые версии, которые могут связывать Syt II человека с высокой аффинностью. Модификацию последовательности белка BoNT/B-H_C можно осуществлять или путем направленного мутагенеза (сайт-направленный мутагенез), или случайного мутагенеза каждого аминокислотного остатка в области, известной связыванием Syt I/II. Эти Syt-связывающие области хорошо определены предыдущими исследованиями сокристаллической структуры^25,26. Например, состоят из остатков 1078-1291 в последовательности BoNT/B1 (номер доступа GenBank: P10844). Хотя эти исследования были выполнены с использованием последовательности BoNT/B1, все подтипы BoNT/B можно использовать в качестве матрицы для повторного создания тех же или подобных мутаций, как описано в данном документе. Хотя точное положение для выбранных остатков может быть не одинаковым в разных подтипах BoNT/B, аналогичные остатки в разных подтипах BoNT/B могут быть легко идентифицированы (например, путем выравнивания по последовательности, когда она не в точно таком же положении).

[00177] В частности, были изучены все остатки на поверхности связывания Syt II BoNT/B на основе описанной комплексной структуры BoNT/B-Syt II (PDB ID: 2NM1), включая K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245, и Y1256, как показано на фиг. 3Б.

[00178] Мутагенез - это общепринятая лабораторная методика для создания искусственных белковых продуктов. Доступны несколько способов введения мутаций, включая сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, комбинаторный мутагенез и инсерционный мутагенез. Для введения мутаций в последовательность BoNT/B-H_C применяли сайт-направленный мутагенез и случайный мутагенез. Случайный мутагенез представляет собой мощный инструмент для создания мутантных библиотек для скрининга. Используя ПЦР-праймеры с легированными нуклеотидами, был создан пул мутантов, содержащий замены для всех других 19 аминокислот в положениях, перечисленных на фиг. 3Б. Затем скрининг выполняли с использованием системы BACTH, как показано на Фигуре. 4.

[00179] Остатки в положениях 1191, 1178, 1183 и 1199 были идентифицированы как важные для мутаций по типу замены для генерации мутантов BoNT/B-H_C с усиленным связыванием с Syt II человека. Конкретными заменами были E1191M /C/V/Q/L/Y, Y1183C/P, S1199Y/W/E/H, W1178Y/Q/A/S (Фигура 5A, Б).

[00180] Дальнейшие количественные анализы показали, что изменение остатка E1991 на M/C/V/Q привело к сильнейшему связыванию с h-Syt II, как измерено по активности β-галактозидазы (Фигура. 6A) и анализу на связывание (Фигура 6Б). Таким образом, E1191 был идентифицирован как первичный сайт для введения мутаций, которые улучшают связывание с h-Syt II, а мутации по типу замены E1191/M/C/V/Q были идентифицированы как первичные мутации.

[00181] E1191M использовали в качестве первичной мутации для изучения того, может ли добавление вторичной мутации дополнительно усилить связывание с h-Syt II (Фигура 7A). Поскольку мутации по типу замены Y1183C/P, S1199Y/W/E/H и W1178Y/Q/A/S приводили к «светло-синим» колониям в скрининге BACTH (Фигура 5Б), эти сайты были выбраны в качестве потенциального сайта вторичной мутации. Были созданы и протестированы двойные мутации, объединяющие E1191M с этими потенциальными вторичными мутациями. Было обнаружено, что три мутации S1199W, S1199Y и W1178Q усиливают связывание с h-Syt II в комбинации с первичной мутацией на E1191M в анализах на связывание (Фигура 7A, Б). Эти три мутации по типу замены были выбраны как вторичные мутации.

[00182] Дальнейшие количественные анализы проводили для определения аффинности связывания между мутантами BoNT/B-H_C и h-Syt II с использованием интерферометрии биослоев, как описано на Фигуре 8А. Были исследованы двойные мутации с одной из первичных мутаций (M1191M/C/Q/V), а другие - из вторичных мутаций (S1199W/Y, W1178Q) на их аффинности связывания с h-Syt II (Фигура 8Б). Результаты показали, что следующие двойные мутации: E1191M/C/Q/V в комбинации с S1199W/Y и E1191M/C/V в комбинации с W1178Q имеют значительно повышенную аффинность связывания с h-Syt II (Фигура 8Б). Таким образом, эти одиннадцать двойных комбинаций были идентифицированы как мутации в BoNT/B-H_C, которые больше всего связывают с h-Syt II.

[00183] Установлено, что мутанты BoNT/B-H_C не только улучшают связывание с Syt II человека, но и Syt I человека. E1191M/S1199Y и E1191V/S1199Y использовали для того, чтобы показать, что эти мутанты демонстрируют значительно улучшенные способности к связыванию с Syt I человека по сравнению с BoNT/B-H_C ДТ (Фигура 9).

[00184] Модифицированные мутанты BoNT/B-H_C могут содержать аминокислотные замены в одной или комбинации аминокислотных остатков E1191, Y1183, W1178 и S1199, таких как E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y, и E1191V/W1178Q.

[00185] Также были протестированы выбранные тройные мутации путем комбинирования мутаций на сайтах E1191/S1199/W1178 и обнаружили, что они имеют сходную аффинность связывания с таковой у двойной мутации на сайтах E1191/S1199. Например, E1191M/S1199W/W1178Q имеет сходную аффинность связывания, как и E1191M/S1199W (фиг. 8Б). Таким образом, тройные мутации проявляли повышенную аффинность связывания как у двойных мутаций, хотя они, похоже, не имели существенного преимущества по сравнению с двойными мутациями в отношении увеличения аффинности связывания.

[00186] Эти результаты демонстрируют, что полипептиды, содержащие BoNT/B-H_C с модифицированной аминокислотной последовательностью, связанной с последовательностью BoNT/B-H_C ДТ, причем модифицированный BoNT/B-H_C имеет улучшенную способность связывать человеческие Syt I и II по сравнению с BoNT/B-H_C ДТ, которые можно изготовить и использовать терапевтически. Полипептиды могут быть, например, в форме полноразмерных мутантов BoNT/B, процессированные мутантные BoNT/B или рекомбинированных белков, которые содержат те же аминокислотные замены в рецептор-связывающем домене (BoNT/B-H_C), как описано выше, а также подтипы BoNT/B с аминокислотными заменами в соответствующих положениях. Кроме того, подтип BoNT/B можно модифицировать для связывания h-Syt II путем замены остатков в их рецептор-связывающем домене, которые отличаются от BoNT/B1.

[00187] Полноразмерные мутанты BoNT/B содержат аминокислотные замены в одной или комбинации (например, 2 или 3) аминокислотных остатков E1191, Y1183, W1178 и S1199, таких как E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y и E1191V/W1178Q. Мутации могут быть сделаны таким же образом, как описано выше для BoNT/B-H_C, с использованием любого из подтипов BoNT/B в качестве матриц. Эти мутированные токсины BoNT/B усиливают связывание как с Syt II человека, так и с Syt I человека, поэтому будут иметь более высокую эффективность и специфичность для целевых нейронов человека, чем BoNT/B ДТ.

Ссылки для раздела «Примеры»

1. Schiavo, G., Matteoli, M. & Montecucco, C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol Rev 80, 717-766 (2000).

2. Johnson, E.A. Clostridium toxins as therapeutic agents: benefits of nature's most toxic proteins. Annu Rev Microbiol 53, 551-575 (1999).

3. Aoki, K.R. Botulinum toxin: a successful therapeutic protein. Curr Med Chem 11, 3085-3092 (2004).

4. Montecucco, C. & Molgo, J. Botulinal neurotoxins: revival of an old killer. Curr Opin Pharmacol 5, 274-279 (2005).

5. Lange, O., et al. Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: much ado about nothing? Clin Neuropharmacol 32, 213-218 (2009).

6. Chapman, M.A., Barron, R., Tanis, D.C., Gill, C.E. & Charles, P.D. Comparison of botulinum neurotoxin preparations for the treatment of cervical dystonia. Clin Ther 29, 1325-1337 (2007).

7. Cote, T.R., Mohan, A.K., Polder, J.A., Walton, M.K. & Braun, M.M. Botulinum toxin type A injections: adverse events reported to the US Food and Drug Administration in therapeutic and cosmetic cases. J Am Acad Dermatol 53, 407-415 (2005).

8. Dong, M., Tepp, W.H., Liu, H., Johnson, E.A. & Chapman, E.R. Mechanism of botulinum neurotoxin B and G entry into hippocampal neurons. J Cell Biol 179, 1511-1522 (2007).

9. Peng, L., Tepp, W.H., Johnson, E.A. & Dong, M. Botulinum neurotoxin D uses synaptic vesicle protein SV2 and gangliosides as receptors. PLoS Pathog 7, e1002008 (2011).

10. Dong, M., et al. Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J Cell Biol 162, 1293-1303 (2003).

11. Nishiki, T., et al. Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J Biol Chem 269, 10498-10503 (1994).

12. Rummel, A., Karnath, T., Henke, T., Bigalke, H. & Binz, T. Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J Biol Chem 279, 30865-30870 (2004).

13. Peng, L., et al. Botulinum neurotoxin D-C uses synaptotagmin I/II as receptors and human synaptotagmin II is not an effective receptor for type B, D-C, and G toxins. J Cell Sci (2012).

14. Montecucco, C. How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronal membranes? TIBS, 314-317 (1986).

15. Nishiki, T., et al. The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a. FEBS Lett 378, 253-257 (1996).

16. Pang, Z.P., et al. Synaptotagmin-2 is essential for survival and contributes to Ca2+ triggering of neurotransmitter release in central and neuromuscular synapses. J Neurosci 26, 13493-13504 (2006).

17. Strotmeier, J., Willjes, G., Binz, T. & Rummel, A. Human synaptotagmin-II is not a high affinity receptor for botulinum neurotoxin B and G: increased therapeutic dosage and immunogenicity. FEBS Lett 586, 310-313 (2012).

18. Craxton, M. A manual collection of Syt, Esyt, Rph3a, Rph3al, Doc2, and Dblc2 genes from 46 metazoan genomes--an open access resource for neuroscience and evolutionary biology. BMC Genomics 11, 37 (2010).

19. Brin, M.F., et al. Safety and efficacy of NeuroBloc (botulinum toxin type B) in type A-resistant cervical dystonia. Neurology 53, 1431-1438 (1999).

20. Pappert, E.J. & Germanson, T. Botulinum toxin type B vs. type A in toxin-naive patients with cervical dystonia: Randomized, double-blind, noninferiority trial. Mov Disord 23, 510-517 (2008).

21. Wang, J., et al. Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochem J 444, 59-67 (2012).

22. Rummel, A., Mahrhold, S., Bigalke, H. & Binz, T. Exchange of the H(CC) domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS J 278, 4506-4515 (2011).

23. Dong, M., et al. SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A. Science 312, 592-596 (2006).

24. Arnon, S.S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. Jama 285, 1059-1070 (2001).

25. Jin, R., Rummel, A., Binz, T. & Brunger, A.T. Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity. Nature 444, 1092-1095 (2006).

26. Chai, Q., et al. Structural basis of cell surface receptor recognition by botulinum neurotoxin B. Nature 444, 1096-1100 (2006).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE

<120> СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН

<130> 002806-081761-PCT

<140> PCT/US2016/024211

<141> 2016-03-25

<150> 62/138818

<151> 2015-03-26

<160> 14

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> Белок

<213> Mus sp.

<400> 1

Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Phe Phe

1 5 10 15

Asn Glu Ile Asn Lys Ile

20

<210> 2

<211> 435

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 2

Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr

20 25 30

Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser

35 40 45

Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn

50 55 60

Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys

65 70 75 80

Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile

85 90 95

Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly

100 105 110

Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser

115 120 125

Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn

130 135 140

Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg

165 170 175

Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile

180 185 190

Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr

195 200 205

Glu Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr

210 215 220

Ser Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys

225 230 235 240

Glu Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu

245 250 255

Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

260 265 270

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys

275 280 285

Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile

290 295 300

Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln

305 310 315 320

Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys

325 330 335

Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile

340 345 350

Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu

355 360 365

Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile

370 375 380

His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr

385 390 395 400

Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr

405 410 415

Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly

420 425 430

Trp Thr Glu

435

<210> 3

<211> 1308

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетический

      полинуклеотид"

<400> 3

aacagcgaaa tcctgaacaa cattattctg aacctgcgct ataaagataa caacctgatt 60

gatctgagcg gctatggcgc gaaagtggaa gtgtatgatg gcgtggaact gaacgataaa 120

aaccagttca aactgaccag ctctgcgaac agcaaaattc gtgtgaccca gaaccagaac 180

attatcttca acagcgtgtt tctggatttt agcgtgagct tttggattcg catcccgaaa 240

tataaaaacg atggcatcca gaactatatc cacaacgaat acaccattat caactgcatg 300

aaaaacaaca gcggctggaa aattagcatt cgtggcaacc gtattatttg gaccctgatc 360

gatattaacg gcaaaaccaa aagcgtgttc ttcgaataca acatccgcga agatatcagc 420

gaatacatta accgctggtt ctttgtgacc attaccaaca acctgaacaa cgcgaaaatt 480

tatatcaacg gtaaactgga aagcaacacc gatatcaaag atatccgcga agtgattgcg 540

aacggcgaaa tcatctttaa actggatggc gatattgatc gtacccagtt catctggatg 600

aaatacttca gcatcttcaa caccgaactg agccagagca acattgaaga acgctacaaa 660

atccagagct atagcgaata cctgaaagat ttttggggca atccgctgat gtataacaaa 720

gagtattaca tgttcaacgc gggtaacaaa aacagctata tcaaactgaa aaaagatagc 780

ccggtgggcg aaattctgac ccgtagcaaa tataaccaga acagcaaata catcaactat 840

cgcgatctgt atatcggcga aaaatttatc attcgccgca aaagcaacag ccagagcatt 900

aacgatgata tcgtgcgcaa agaagattat atctacctgg attttttcaa cctgaaccag 960

gaatggcgcg tttataccta taaatatttc aaaaaagagg aagagaaact gtttctggcc 1020

ccgattagcg atagcgatga attttacaac accatccaaa ttaaagaata cgatgaacag 1080

ccgacctata gctgccagct gctgtttaaa aaagatgaag aaagcaccga tgaaattggc 1140

ctgattggca tccatcgttt ctatgaaagc ggcatcgtgt tcgaagaata taaagattat 1200

ttctgcatca gcaaatggta tctgaaagaa gtgaaacgca aaccgtataa cctgaaactg 1260

ggctgcaact ggcagtttat tccgaaagat gaaggctgga ccgaataa 1308

<210> 4

<211> 1296

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 4

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys

435 440 445

Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe

450 455 460

Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu

465 470 475 480

Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu

485 490 495

Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro

500 505 510

Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu

515 520 525

Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu

530 535 540

Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu

545 550 555 560

His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu

565 570 575

Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys

580 585 590

Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu

595 600 605

Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr

610 615 620

Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala

625 630 635 640

Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu

645 650 655

Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala

660 665 670

Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys

675 680 685

Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu

690 695 700

Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys

705 710 715 720

Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu

725 730 735

Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn

740 745 750

Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp

755 760 765

Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile

770 775 780

Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met

785 790 795 800

Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys

805 810 815

Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly

820 825 830

Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp

835 840 845

Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser

850 855 860

Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn

865 870 875 880

Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser

885 890 895

Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn

900 905 910

Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu

915 920 925

Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser

930 935 940

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu

980 985 990

Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser

995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg

1010 1015 1020

Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln

1025 1030 1035

Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile

1040 1045 1050

Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp

1055 1060 1065

Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

1070 1075 1080

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys

1085 1090 1095

Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met

1100 1105 1110

Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val

1115 1120 1125

Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val

1130 1135 1140

Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr

1145 1150 1155

Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile

1160 1165 1170

Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn

1175 1180 1185

Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu

1190 1195 1200

Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser

1205 1210 1215

Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn

1220 1225 1230

Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly

1235 1240 1245

Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala

1250 1255 1260

Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu

1265 1270 1275

Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1280 1285 1290

Arg Pro Leu

1295

<210> 5

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 5

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile

835 840 845

Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn

1160 1165 1170

Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys

1175 1180 1185

Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile

1235 1240 1245

Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 6

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 6

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn

1 5 10 15

Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Ile Pro Asp

35 40 45

Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val

50 55 60

Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Ser Asp Lys Asp Pro Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn

130 135 140

Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly

145 150 155 160

Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser Thr Phe Lys Leu Thr

165 170 175

Asn Asn Thr Phe Ala Ala Gln Glu Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile Ile

180 185 190

Ser Ile Ser Pro Arg Phe Met Leu Thr Tyr Ser Asn Ala Thr Asn Asp

195 200 205

Val Gly Glu Gly Arg Phe Ser Lys Ser Glu Phe Cys Met Asp Pro Ile

210 215 220

Leu Ile Leu Met His Glu Leu Asn His Ala Met His Asn Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Asn Asp Gln Thr Ile Ser Ser Val Thr Ser Asn Ile

245 250 255

Phe Tyr Ser Gln Tyr Asn Val Lys Leu Glu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala

260 265 270

Phe Gly Gly Pro Thr Ile Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Lys Tyr

275 280 285

Phe Glu Glu Lys Ala Leu Asp Tyr Tyr Arg Ser Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Ser Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Ser Phe Asn Lys Tyr Ile Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Gln Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Arg Phe Val Val Glu Ser

325 330 335

Ser Gly Glu Val Thr Val Asn Arg Asn Lys Phe Val Glu Leu Tyr Asn

340 345 350

Glu Leu Thr Gln Ile Phe Thr Glu Phe Asn Tyr Ala Lys Ile Tyr Asn

355 360 365

Val Gln Asn Arg Lys Ile Tyr Leu Ser Asn Val Tyr Thr Pro Val Thr

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Val Tyr Asp Ile Gln Asn Gly Phe Asn

385 390 395 400

Ile Pro Lys Ser Asn Leu Asn Val Leu Phe Met Gly Gln Asn Leu Ser

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Arg Lys Val Asn Pro Glu Asn Met Leu Tyr Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Phe Cys His Lys Ala Ile Asp Gly Arg Ser Leu Tyr Asn

435 440 445

Lys Thr Leu Asp Cys Arg Glu Leu Leu Val Lys Asn Thr Asp Leu Pro

450 455 460

Phe Ile Gly Asp Ile Ser Asp Val Lys Thr Asp Ile Phe Leu Arg Lys

465 470 475 480

Asp Ile Asn Glu Glu Thr Glu Val Ile Tyr Tyr Pro Asp Asn Val Ser

485 490 495

Val Asp Gln Val Ile Leu Ser Lys Asn Thr Ser Glu His Gly Gln Leu

500 505 510

Asp Leu Leu Tyr Pro Ser Ile Asp Ser Glu Ser Glu Ile Leu Pro Gly

515 520 525

Glu Asn Gln Val Phe Tyr Asp Asn Arg Thr Gln Asn Val Asp Tyr Leu

530 535 540

Asn Ser Tyr Tyr Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Asn Val Glu

545 550 555 560

Asp Phe Thr Phe Thr Arg Ser Ile Glu Glu Ala Leu Asp Asn Ser Ala

565 570 575

Lys Val Tyr Thr Tyr Phe Pro Thr Leu Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly

580 585 590

Val Gln Gly Gly Leu Phe Leu Met Trp Ala Asn Asp Val Val Glu Asp

595 600 605

Phe Thr Thr Asn Ile Leu Arg Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp

610 615 620

Val Ser Ala Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Ser Asn

625 630 635 640

Ser Val Arg Arg Gly Asn Phe Thr Glu Ala Phe Ala Val Thr Gly Val

645 650 655

Thr Ile Leu Leu Glu Ala Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly

660 665 670

Ala Phe Val Ile Tyr Ser Lys Val Gln Glu Arg Asn Glu Ile Ile Lys

675 680 685

Thr Ile Asp Asn Cys Leu Glu Gln Arg Ile Lys Arg Trp Lys Asp Ser

690 695 700

Tyr Glu Trp Met Met Gly Thr Trp Leu Ser Arg Ile Ile Thr Gln Phe

705 710 715 720

Asn Asn Ile Ser Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Asn Tyr Gln Ala Gly

725 730 735

Ala Ile Lys Ala Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser

740 745 750

Asp Lys Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu

755 760 765

Asp Val Lys Ile Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg

770 775 780

Glu Cys Ser Val Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile

785 790 795 800

Asp Glu Leu Asn Glu Phe Asp Arg Asn Thr Lys Ala Lys Leu Ile Asn

805 810 815

Leu Ile Asp Ser His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Ala Lys Val Asn Asn Ser Phe Gln Asn Thr Ile Pro Phe Asn Ile

835 840 845

Phe Ser Tyr Thr Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr

850 855 860

Phe Asn Asn Ile Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Arg Lys

865 870 875 880

Asn Thr Leu Val Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Ser Glu Glu

885 890 895

Gly Asp Val Gln Leu Asn Pro Ile Phe Pro Phe Asp Phe Lys Leu Gly

900 905 910

Ser Ser Gly Glu Asp Arg Gly Lys Val Ile Val Thr Gln Asn Glu Asn

915 920 925

Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Ser Phe Ser Ile Ser Phe Trp Ile

930 935 940

Arg Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn Leu Pro Gly Tyr Thr Ile Ile Asp

945 950 955 960

Ser Val Lys Asn Asn Ser Gly Trp Ser Ile Gly Ile Ile Ser Asn Phe

965 970 975

Leu Val Phe Thr Leu Lys Gln Asn Glu Asp Ser Glu Gln Ser Ile Asn

980 985 990

Phe Ser Tyr Asp Ile Ser Asn Asn Ala Pro Gly Tyr Asn Lys Trp Phe

995 1000 1005

Phe Val Thr Val Thr Asn Asn Met Met Gly Asn Met Lys Ile Tyr

1010 1015 1020

Ile Asn Gly Lys Leu Ile Asp Thr Ile Lys Val Lys Glu Leu Thr

1025 1030 1035

Gly Ile Asn Phe Ser Lys Thr Ile Thr Phe Glu Ile Asn Lys Ile

1040 1045 1050

Pro Asp Thr Gly Leu Ile Thr Ser Asp Ser Asp Asn Ile Asn Met

1055 1060 1065

Trp Ile Arg Asp Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Glu Leu Asp Gly Lys

1070 1075 1080

Asp Ile Asn Ile Leu Phe Asn Ser Leu Gln Tyr Thr Asn Val Val

1085 1090 1095

Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Asp Leu Arg Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr

1100 1105 1110

Met Val Asn Ile Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Met Tyr Ala Asn Ser

1115 1120 1125

Arg Gln Ile Val Phe Asn Thr Arg Arg Asn Asn Asn Asp Phe Asn

1130 1135 1140

Glu Gly Tyr Lys Ile Ile Ile Lys Arg Ile Arg Gly Asn Thr Asn

1145 1150 1155

Asp Thr Arg Val Arg Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Phe Asp Met Thr

1160 1165 1170

Ile Asn Asn Lys Ala Tyr Asn Leu Phe Met Lys Asn Glu Thr Met

1175 1180 1185

Tyr Ala Asp Asn His Ser Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Ile Gly Leu

1190 1195 1200

Arg Glu Gln Thr Lys Asp Ile Asn Asp Asn Ile Ile Phe Gln Ile

1205 1210 1215

Gln Pro Met Asn Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ala Ser Gln Ile Phe Lys

1220 1225 1230

Ser Asn Phe Asn Gly Glu Asn Ile Ser Gly Ile Cys Ser Ile Gly

1235 1240 1245

Thr Tyr Arg Phe Arg Leu Gly Gly Asp Trp Tyr Arg His Asn Tyr

1250 1255 1260

Leu Val Pro Thr Val Lys Gln Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Leu Glu

1265 1270 1275

Ser Thr Ser Thr His Trp Gly Phe Val Pro Val Ser Glu

1280 1285 1290

<210> 7

<211> 1276

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 7

Met Thr Trp Pro Val Lys Asp Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asn Asp Ile Leu Tyr Leu Arg Ile Pro Gln Asn Lys Leu Ile Thr Thr

20 25 30

Pro Val Lys Ala Phe Met Ile Thr Gln Asn Ile Trp Val Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Ser Ser Asp Thr Asn Pro Ser Leu Ser Lys Pro Pro Arg Pro

50 55 60

Thr Ser Lys Tyr Gln Ser Tyr Tyr Asp Pro Ser Tyr Leu Ser Thr Asp

65 70 75 80

Glu Gln Lys Asp Thr Phe Leu Lys Gly Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg

85 90 95

Ile Asn Glu Arg Asp Ile Gly Lys Lys Leu Ile Asn Tyr Leu Val Val

100 105 110

Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp

115 120 125

Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly

130 135 140

Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly

165 170 175

Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn

195 200 205

Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val

210 215 220

Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly

245 250 255

Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln

275 280 285

Leu Arg Glu Lys Ala Leu Gly His Tyr Lys Asp Ile Ala Lys Arg Leu

290 295 300

Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp

305 310 315 320

Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn

325 330 335

Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser

340 345 350

Asp Leu Thr Asn Val Met Ser Glu Val Val Tyr Ser Ser Gln Tyr Asn

355 360 365

Val Lys Asn Arg Thr His Tyr Phe Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Phe

370 375 380

Ala Asn Ile Leu Asp Asp Asn Ile Tyr Thr Ile Arg Asp Gly Phe Asn

385 390 395 400

Leu Thr Asn Lys Gly Phe Asn Ile Glu Asn Ser Gly Gln Asn Ile Glu

405 410 415

Arg Asn Pro Ala Leu Gln Lys Leu Ser Ser Glu Ser Val Val Asp Leu

420 425 430

Phe Thr Lys Val Cys Leu Arg Leu Thr Lys Asn Ser Arg Asp Asp Ser

435 440 445

Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys

450 455 460

Asp Ser Ile Ser Gln Glu Ile Phe Glu Asn Lys Ile Ile Thr Asp Glu

465 470 475 480

Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile

485 490 495

Leu Asp Gly Gln Val Pro Ile Asn Pro Glu Ile Val Asp Pro Leu Leu

500 505 510

Pro Asn Val Asn Met Glu Pro Leu Asn Leu Pro Gly Glu Glu Ile Val

515 520 525

Phe Tyr Asp Asp Ile Thr Lys Tyr Val Asp Tyr Leu Asn Ser Tyr Tyr

530 535 540

Tyr Leu Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asn Asn Val Glu Asn Ile Thr Leu

545 550 555 560

Thr Thr Ser Val Glu Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Asn Lys Ile Tyr Thr

565 570 575

Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly

580 585 590

Leu Phe Leu Asn Trp Ala Asn Glu Val Val Glu Asp Phe Thr Thr Asn

595 600 605

Ile Met Lys Lys Asp Thr Leu Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Val Ile

610 615 620

Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Ser Ala Leu Arg

625 630 635 640

Gly Asn Phe Asn Gln Ala Phe Ala Thr Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu

645 650 655

Glu Gly Phe Pro Glu Phe Thr Ile Pro Ala Leu Gly Val Phe Thr Phe

660 665 670

Tyr Ser Ser Ile Gln Glu Arg Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Glu Asn

675 680 685

Cys Leu Glu Gln Arg Val Lys Arg Trp Lys Asp Ser Tyr Gln Trp Met

690 695 700

Val Ser Asn Trp Leu Ser Arg Ile Thr Thr Gln Phe Asn His Ile Asn

705 710 715 720

Tyr Gln Met Tyr Asp Ser Leu Ser Tyr Gln Ala Asp Ala Ile Lys Ala

725 730 735

Lys Ile Asp Leu Glu Tyr Lys Lys Tyr Ser Gly Ser Asp Lys Glu Asn

740 745 750

Ile Lys Ser Gln Val Glu Asn Leu Lys Asn Ser Leu Asp Val Lys Ile

755 760 765

Ser Glu Ala Met Asn Asn Ile Asn Lys Phe Ile Arg Glu Cys Ser Val

770 775 780

Thr Tyr Leu Phe Lys Asn Met Leu Pro Lys Val Ile Asp Glu Leu Asn

785 790 795 800

Lys Phe Asp Leu Arg Thr Lys Thr Glu Leu Ile Asn Leu Ile Asp Ser

805 810 815

His Asn Ile Ile Leu Val Gly Glu Val Asp Arg Leu Lys Ala Lys Val

820 825 830

Asn Glu Ser Phe Glu Asn Thr Met Pro Phe Asn Ile Phe Ser Tyr Thr

835 840 845

Asn Asn Ser Leu Leu Lys Asp Ile Ile Asn Glu Tyr Phe Asn Ser Ile

850 855 860

Asn Asp Ser Lys Ile Leu Ser Leu Gln Asn Lys Lys Asn Ala Leu Val

865 870 875 880

Asp Thr Ser Gly Tyr Asn Ala Glu Val Arg Val Gly Asp Asn Val Gln

885 890 895

Leu Asn Thr Ile Tyr Thr Asn Asp Phe Lys Leu Ser Ser Ser Gly Asp

900 905 910

Lys Ile Ile Val Asn Leu Asn Asn Asn Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Tyr

915 920 925

Glu Asn Ser Ser Val Ser Phe Trp Ile Lys Ile Ser Lys Asp Leu Thr

930 935 940

Asn Ser His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Glu Gln Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Leu Cys Ile Arg Asn Gly Asn Ile Glu Trp Ile Leu Gln

965 970 975

Asp Val Asn Arg Lys Tyr Lys Ser Leu Ile Phe Asp Tyr Ser Glu Ser

980 985 990

Leu Ser His Thr Gly Tyr Thr Asn Lys Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Ile Met Gly Tyr Met Lys Leu Tyr Ile Asn Gly Glu Leu

1010 1015 1020

Lys Gln Ser Gln Lys Ile Glu Asp Leu Asp Glu Val Lys Leu Asp

1025 1030 1035

Lys Thr Ile Val Phe Gly Ile Asp Glu Asn Ile Asp Glu Asn Gln

1040 1045 1050

Met Leu Trp Ile Arg Asp Phe Asn Ile Phe Ser Lys Glu Leu Ser

1055 1060 1065

Asn Glu Asp Ile Asn Ile Val Tyr Glu Gly Gln Ile Leu Arg Asn

1070 1075 1080

Val Ile Lys Asp Tyr Trp Gly Asn Pro Leu Lys Phe Asp Thr Glu

1085 1090 1095

Tyr Tyr Ile Ile Asn Asp Asn Tyr Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Pro

1100 1105 1110

Glu Ser Asn Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Pro Asp Arg Ser Lys

1115 1120 1125

Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ile Lys Ser Val Ser Asp Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Tyr Ser Arg Ile Leu Asn Gly Asp Asn Ile Ile Leu His

1145 1150 1155

Met Leu Tyr Asn Ser Arg Lys Tyr Met Ile Ile Arg Asp Thr Asp

1160 1165 1170

Thr Ile Tyr Ala Thr Gln Gly Gly Glu Cys Ser Gln Asn Cys Val

1175 1180 1185

Tyr Ala Leu Lys Leu Gln Ser Asn Leu Gly Asn Tyr Gly Ile Gly

1190 1195 1200

Ile Phe Ser Ile Lys Asn Ile Val Ser Lys Asn Lys Tyr Cys Ser

1205 1210 1215

Gln Ile Phe Ser Ser Phe Arg Glu Asn Thr Met Leu Leu Ala Asp

1220 1225 1230

Ile Tyr Lys Pro Trp Arg Phe Ser Phe Lys Asn Ala Tyr Thr Pro

1235 1240 1245

Val Ala Val Thr Asn Tyr Glu Thr Lys Leu Leu Ser Thr Ser Ser

1250 1255 1260

Phe Trp Lys Phe Ile Ser Arg Asp Pro Gly Trp Val Glu

1265 1270 1275

<210> 8

<211> 1252

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 8

Met Pro Lys Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp Arg

1 5 10 15

Thr Ile Leu Tyr Ile Lys Pro Gly Gly Cys Gln Glu Phe Tyr Lys Ser

20 25 30

Phe Asn Ile Met Lys Asn Ile Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile

35 40 45

Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn

85 90 95

Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro

100 105 110

Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp

115 120 125

Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu

130 135 140

Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr

145 150 155 160

Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His

165 170 175

Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe

180 185 190

Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu

195 200 205

Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala

210 215 220

Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu

225 230 235 240

Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr

260 265 270

Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys

275 280 285

Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu

290 295 300

Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn

305 310 315 320

Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu

325 330 335

Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile

340 345 350

Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile

355 360 365

Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe

370 375 380

Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr

385 390 395 400

Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val

405 410 415

Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly

420 425 430

Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile

435 440 445

Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr

450 455 460

Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala

465 470 475 480

Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala

485 490 495

Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His

500 505 510

Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val

515 520 525

Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala

530 535 540

Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile

545 550 555 560

Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile

565 570 575

Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr

580 585 590

Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu

595 600 605

Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu

625 630 635 640

Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser

645 650 655

Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys

660 665 670

Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn

675 680 685

Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met

690 695 700

Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu

705 710 715 720

Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn

725 730 735

Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser

740 745 750

Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser

755 760 765

Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu

770 775 780

Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His

785 790 795 800

Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr

805 810 815

Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp

820 825 830

Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys

835 840 845

Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys

865 870 875 880

Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser

885 890 895

Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr

900 905 910

Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn

915 920 925

Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg

930 935 940

Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile

945 950 955 960

Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn

965 970 975

Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe

980 985 990

Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile

1010 1015 1020

His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr

1025 1030 1035

Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu

1040 1045 1050

Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn

1055 1060 1065

Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp

1070 1075 1080

Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile

1085 1090 1095

Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser

1100 1105 1110

Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg

1130 1135 1140

Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His

1145 1150 1155

Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys

1160 1165 1170

Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val

1175 1180 1185

Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn

1190 1195 1200

Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr

1205 1210 1215

Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr

1220 1225 1230

Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly

1235 1240 1245

Trp Gln Glu Lys

1250

<210> 9

<211> 1274

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 9

Met Pro Val Ala Ile Asn Ser Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Val Asn Asp

1 5 10 15

Asp Thr Ile Leu Tyr Met Gln Ile Pro Tyr Glu Glu Lys Ser Lys Lys

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Glu Ile Met Arg Asn Val Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Asn Thr Ile Gly Thr Asn Pro Ser Asp Phe Asp Pro Pro Ala Ser

50 55 60

Leu Lys Asn Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Thr Thr

65 70 75 80

Asp Ala Glu Lys Asp Arg Tyr Leu Lys Thr Thr Ile Lys Leu Phe Lys

85 90 95

Arg Ile Asn Ser Asn Pro Ala Gly Lys Val Leu Leu Gln Glu Ile Ser

100 105 110

Tyr Ala Lys Pro Tyr Leu Gly Asn Asp His Thr Pro Ile Asp Glu Phe

115 120 125

Ser Pro Val Thr Arg Thr Thr Ser Val Asn Ile Lys Leu Ser Thr Asn

130 135 140

Val Glu Ser Ser Met Leu Leu Asn Leu Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro

145 150 155 160

Asp Ile Phe Glu Ser Cys Cys Tyr Pro Val Arg Lys Leu Ile Asp Pro

165 170 175

Asp Val Val Tyr Asp Pro Ser Asn Tyr Gly Phe Gly Ser Ile Asn Ile

180 185 190

Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Glu Tyr Thr Phe Asn Asp Ile Ser Gly

195 200 205

Gly His Asn Ser Ser Thr Glu Ser Phe Ile Ala Asp Pro Ala Ile Ser

210 215 220

Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala Arg

225 230 235 240

Gly Val Thr Tyr Glu Glu Thr Ile Glu Val Lys Gln Ala Pro Leu Met

245 250 255

Ile Ala Glu Lys Pro Ile Arg Leu Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly Gly

260 265 270

Gln Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Met Lys Glu Lys Ile Tyr Asn

275 280 285

Asn Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Lys Ile Ala Thr Arg Leu Ser Glu Val

290 295 300

Asn Ser Ala Pro Pro Glu Tyr Asp Ile Asn Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

305 310 315 320

Gln Trp Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asn Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Val

325 330 335

Asn Glu Asn Lys Phe Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr

340 345 350

Glu Ser Asp Leu Ala Asn Lys Phe Lys Val Lys Cys Arg Asn Thr Tyr

355 360 365

Phe Ile Lys Tyr Glu Phe Leu Lys Val Pro Asn Leu Leu Asp Asp Asp

370 375 380

Ile Tyr Thr Val Ser Glu Gly Phe Asn Ile Gly Asn Leu Ala Val Asn

385 390 395 400

Asn Arg Gly Gln Ser Ile Lys Leu Asn Pro Lys Ile Ile Asp Ser Ile

405 410 415

Pro Asp Lys Gly Leu Val Glu Lys Ile Val Lys Phe Cys Lys Ser Val

420 425 430

Ile Pro Arg Lys Gly Thr Lys Ala Pro Pro Arg Leu Cys Ile Arg Val

435 440 445

Asn Asn Ser Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Ser Ser Tyr Asn Glu

450 455 460

Asn Asp Ile Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Thr Asn Leu Asn

465 470 475 480

Asn Asn Tyr Arg Asn Asn Leu Asp Glu Val Ile Leu Asp Tyr Asn Ser

485 490 495

Gln Thr Ile Pro Gln Ile Ser Asn Arg Thr Leu Asn Thr Leu Val Gln

500 505 510

Asp Asn Ser Tyr Val Pro Arg Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Tyr Asp Val Val Asp Phe Asn Val Phe Phe Tyr Leu His Ala

530 535 540

Gln Lys Val Pro Glu Gly Glu Thr Asn Ile Ser Leu Thr Ser Ser Ile

545 550 555 560

Asp Thr Ala Leu Leu Glu Glu Ser Lys Asp Ile Phe Phe Ser Ser Glu

565 570 575

Phe Ile Asp Thr Ile Asn Lys Pro Val Asn Ala Ala Leu Phe Ile Asp

580 585 590

Trp Ile Ser Lys Val Ile Arg Asp Phe Thr Thr Glu Ala Thr Gln Lys

595 600 605

Ser Thr Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Val

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Glu Ala Glu Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Glu Ala Phe Glu Leu Leu Gly Val Gly Ile Leu Leu Glu Phe Val Pro

645 650 655

Glu Leu Thr Ile Pro Val Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Ser Tyr Glu Asn Lys Asn Lys Ala Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ser

675 680 685

Leu Ile Glu Arg Glu Ala Lys Trp Lys Glu Ile Tyr Ser Trp Ile Val

690 695 700

Ser Asn Trp Leu Thr Arg Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu

705 710 715 720

Gln Met Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asp Ala Ile Lys Thr Ala

725 730 735

Ile Glu Tyr Lys Tyr Asn Asn Tyr Thr Ser Asp Glu Lys Asn Arg Leu

740 745 750

Glu Ser Glu Tyr Asn Ile Asn Asn Ile Glu Glu Glu Leu Asn Lys Lys

755 760 765

Val Ser Leu Ala Met Lys Asn Ile Glu Arg Phe Met Thr Glu Ser Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Ala Lys Val Gly Lys Leu

785 790 795 800

Lys Lys Tyr Asp Asn His Val Lys Ser Asp Leu Leu Asn Tyr Ile Leu

805 810 815

Asp His Arg Ser Ile Leu Gly Glu Gln Thr Asn Glu Leu Ser Asp Leu

820 825 830

Val Thr Ser Thr Leu Asn Ser Ser Ile Pro Phe Glu Leu Ser Ser Tyr

835 840 845

Thr Asn Asp Lys Ile Leu Ile Ile Tyr Phe Asn Arg Leu Tyr Lys Lys

850 855 860

Ile Lys Asp Ser Ser Ile Leu Asp Met Arg Tyr Glu Asn Asn Lys Phe

865 870 875 880

Ile Asp Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Asn Ile Ser Ile Asn Gly Asn Val

885 890 895

Tyr Ile Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Ser Arg

900 905 910

Leu Ser Glu Val Asn Ile Ala Gln Asn Asn Asp Ile Ile Tyr Asn Ser

915 920 925

Arg Tyr Gln Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Lys His

930 935 940

Tyr Lys Pro Met Asn His Asn Arg Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met

945 950 955 960

Gly Asn Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Leu Arg Thr Val Arg Asp

965 970 975

Cys Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Gly Asn Lys Glu Asn

980 985 990

Leu Ile Phe Arg Tyr Glu Glu Leu Asn Arg Ile Ser Asn Tyr Ile Asn

995 1000 1005

Lys Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Gly Asn Ser

1010 1015 1020

Arg Ile Tyr Ile Asn Gly Asn Leu Ile Val Glu Lys Ser Ile Ser

1025 1030 1035

Asn Leu Gly Asp Ile His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile

1040 1045 1050

Val Gly Cys Asp Asp Glu Thr Tyr Val Gly Ile Arg Tyr Phe Lys

1055 1060 1065

Val Phe Asn Thr Glu Leu Asp Lys Thr Glu Ile Glu Thr Leu Tyr

1070 1075 1080

Ser Asn Glu Pro Asp Pro Ser Ile Leu Lys Asn Tyr Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Lys Tyr Tyr Leu Phe Asn Leu Leu Arg

1100 1105 1110

Lys Asp Lys Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Gly Ile Leu Asn Ile Asn

1115 1120 1125

Gln Gln Arg Gly Val Thr Glu Gly Ser Val Phe Leu Asn Tyr Lys

1130 1135 1140

Leu Tyr Glu Gly Val Glu Val Ile Ile Arg Lys Asn Gly Pro Ile

1145 1150 1155

Asp Ile Ser Asn Thr Asp Asn Phe Val Arg Lys Asn Asp Leu Ala

1160 1165 1170

Tyr Ile Asn Val Val Asp Arg Gly Val Glu Tyr Arg Leu Tyr Ala

1175 1180 1185

Asp Thr Lys Ser Glu Lys Glu Lys Ile Ile Arg Thr Ser Asn Leu

1190 1195 1200

Asn Asp Ser Leu Gly Gln Ile Ile Val Met Asp Ser Ile Gly Asn

1205 1210 1215

Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly

1220 1225 1230

Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr

1235 1240 1245

Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp

1250 1255 1260

Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu

1265 1270

<210> 10

<211> 1297

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 10

Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Phe Thr Tyr Gly Phe Gln Pro Asp Gln Phe Asn Ala Ser Thr Gly

50 55 60

Val Phe Ser Lys Asp Val Tyr Glu Tyr Tyr Asp Pro Thr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

Thr Asp Ala Glu Lys Asp Lys Phe Leu Lys Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Asn Ser Lys Pro Ser Gly Gln Arg Leu Leu Asp Met Ile

100 105 110

Val Asp Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ala Ser Thr Pro Pro Asp Lys

115 120 125

Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln

130 135 140

Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile

165 170 175

Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met

180 185 190

Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe

245 250 255

Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile

275 280 285

Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn

290 295 300

Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys

305 310 315 320

Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys

325 330 335

Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met

340 345 350

Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr

355 360 365

Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala

385 390 395 400

Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn

405 410 415

Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg

420 425 430

Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu

435 440 445

Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys

450 455 460

Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn

465 470 475 480

Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr

500 505 510

Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys

515 520 525

Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu

530 535 540

Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu

545 550 555 560

Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr

565 570 575

Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala

580 585 590

Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser

595 600 605

Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile

610 615 620

Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala

625 630 635 640

Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu

645 650 655

Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr

660 665 670

Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser

675 680 685

Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu

690 695 700

Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile

705 710 715 720

Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu

725 730 735

Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met

740 745 750

Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser

755 760 765

Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser

770 775 780

Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu

785 790 795 800

Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp

805 810 815

Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys

820 825 830

Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr

835 840 845

Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn

850 855 860

Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu

865 870 875 880

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val

885 890 895

Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu

900 905 910

Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser

915 920 925

Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr

930 935 940

Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile

945 950 955 960

Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn

965 970 975

Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile

980 985 990

Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys

995 1000 1005

Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn

1025 1030 1035

Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile

1040 1045 1050

Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn

1055 1060 1065

Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr

1070 1075 1080

Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn

1085 1090 1095

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met

1100 1105 1110

Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln

1130 1135 1140

Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn

1145 1150 1155

Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr

1160 1165 1170

Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val

1175 1180 1185

Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu

1190 1195 1200

Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile

1205 1210 1215

Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys

1220 1225 1230

Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe

1235 1240 1245

Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe

1250 1255 1260

Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn

1265 1270 1275

Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu

1280 1285 1290

Gly Trp Thr Glu

1295

<210> 11

<211> 1291

<212> Белок

<213> Clostridium botulinum

<400> 11

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

1 5 10 15

Asp Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Gln Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Thr Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Ser Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asn Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Ile Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asn Met Gly Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Ile Cys Ile Asp

435 440 445

Val Asp Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser

450 455 460

Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Val Glu Tyr Asn Thr Gln Asn Asn

465 470 475 480

Tyr Ile Gly Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp

485 490 495

Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr

500 505 510

Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys

515 520 525

Lys Val Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln

530 535 540

Thr Phe Pro Leu Asn Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp

545 550 555 560

Asp Ala Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp

565 570 575

Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly

580 585 590

Trp Val Lys Gln Ile Val Asp Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser

595 600 605

Ser Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile

610 615 620

Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu

625 630 635 640

Ser Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro

645 650 655

Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Val Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile

660 665 670

Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys

675 680 685

Arg Val Glu Lys Trp Ile Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp

690 695 700

Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr

705 710 715 720

Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr

725 730 735

Lys Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asn

740 745 750

Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Asp Gly Ile Asn Gln Ala Met

755 760 765

Asp Asn Ile Asn Asp Phe Ile Asn Glu Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met

770 775 780

Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn

785 790 795 800

Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr

805 810 815

Leu Ile Gly Ser Val Glu Asp Glu Lys Ser Lys Val Asp Lys Tyr Leu

820 825 830

Lys Thr Ile Ile Pro Phe Asp Leu Ser Thr Tyr Thr Asn Asn Glu Ile

835 840 845

Leu Ile Lys Ile Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile

850 855 860

Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Arg Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly

865 870 875 880

Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Lys Leu Asn Asp Lys

885 890 895

Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asp Ser Lys Ile Arg Val Thr

900 905 910

Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Met Phe Leu Asp Phe Ser Val

915 920 925

Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Arg Asn Asp Asp Ile Gln Asn

930 935 940

Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser

945 950 955 960

Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile

965 970 975

Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg

980 985 990

Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr

995 1000 1005

Asn Asn Leu Asp Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Thr Leu Glu

1010 1015 1020

Ser Asn Met Asp Ile Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Val Asn Gly

1025 1030 1035

Glu Ile Thr Phe Lys Leu Asp Gly Asp Val Asp Arg Thr Gln Phe

1040 1045 1050

Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Gln Leu Asn Gln

1055 1060 1065

Ser Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr

1070 1075 1080

Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr

1085 1090 1095

Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Val

1100 1105 1110

Lys Asp Ser Ser Val Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn

1115 1120 1125

Gln Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Arg Asn Leu Tyr Ile Gly Glu

1130 1135 1140

Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp

1145 1150 1155

Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile His Leu Asp Phe Val Asn

1160 1165 1170

Ser Asn Glu Glu Trp Arg Val Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe Lys Glu

1175 1180 1185

Gln Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ser Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Glu

1190 1195 1200

Phe Tyr Lys Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr

1205 1210 1215

Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp

1220 1225 1230

Asp Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Val

1235 1240 1245

Leu Arg Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr

1250 1255 1260

Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Ser Asn Leu Gly Cys

1265 1270 1275

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu

1280 1285 1290

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетическая

гемаглютининовая метка"

<400> 12

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /note="Описание искусственной последовательности: синтетическая гексагистидиновая метка"

<400> 13

His His His His His His

1 5

<210> 14

<211> 22

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Phe

1 5 10 15

Asn Glu Ile Asn Lys Ile

20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. В настоящем изобретении раскрыт полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT) с модифицированным рецептор-связывающим доменом (HC), имеющим одну или более аминокислотных мутаций, которые модифицируют связывание BoNT с рецептором. Также описаны специфические мутации и комбинации мутаций. Также раскрыты выделенные модифицированные нуклеиновые кислоты, химерные молекулы, фармацевтические композиции и способы их получения и применения. 10 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр., 21 ил.

1. Полипептид, содержащий модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-Hc), содержащий одну или более аминокислотные замены относительно эталонного рецептор-связывающего домена дикого типа Clostridium botulinum серотипа B штамма 1, где одна или более аминокислотных замен находятся в положениях, выбранных из группы, состоящей из E1191, S1199, W1178, Y1183 и их комбинации, где:

замена в положении 1191 представляет собой E1191A;

замены в положении 1199 выбраны из группы, состоящей из S1199W, S1199E и S1199H;

замены в положении 1178 выбраны из группы, состоящей из W1178Y, W1178Q, W1178A и W1178S; и

замены в положении 1183 выбраны из группы, состоящей из Y1183C и Y1183P,

где полипептид характеризуется усиленным связыванием с SytII человека по сравнению с наблюдаемым у эталонного рецептор-связывающего домена дикого типа.

2. Полипептид по п. 1, в котором:

i) модифицированный рецептор-связывающий домен обладает 95% или более идентичностью аминокислотной последовательности с эталонным рецептор-связывающим доменом дикого типа;

ii) эталонный рецептор-связывающий домен дикого типа находится в SEQ ID NO: 5;

iii) модифицированный рецептор-связывающий домен соответствует остаткам 1078-1291 SEQ ID NO: 5 или остаткам 859-1291 SEQ ID NO: 5; и/или

iv) модифицированный B-Hc содержится в штамме 1.

3. Полипептид по п. 1, который представляет собой полипептид ботулинического нейротоксина (BoNT), содержащий:

а) протеазный домен;

b) протеазный сайт расщепления;

c) транслокационный домен; и

d) модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-Hc).

4. Полипептид по п. 3, в котором протеазный домен, транслокационный домен и протеазный сайт расщепления принадлежат к серотипу, выбранному из группы, состоящей из A, B, C, D, E, F, G и их комбинаций, предпочтительно, где протеазный домен, домен транслокации и протеазный сайт расщепления происходят от серотипа B штамма 1 или от серотипа A штамма 1.

5. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный (B-Hc) содержит две мутации по типу замены.

6. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что по меньшей мере одна замена представляет собой S1199E, S1199H, W1178Y, W1178A, W1178S, Y1183C или Y1183P, и полипептид дополнительно включает замену E1191M.

7. Полипептид по п. 1, в котором модифицированный (B-Hc) содержит:

i) три мутации по типу замены; или

ii) три мутации по типу замены, отличающиеся тем, что три мутации по типу замены находятся в положениях, которые соответствуют E1191, Y1183 и S1199 или E1191, S1199 и W1178.

8. Химерная молекула, содержащая первую часть, которая представляет собой модифицированный рецептор-связывающий домен серотипа В Clostridium botulinum (B-Hc), связанную со второй частью, причем модифицированный рецептор-связывающий домен содержит одну или более аминокислотные замены по сравнению с эталонным рецептор-связывающим доменом дикого типа Clostridium botulinum серотипа В штамма 1, где одна или более аминокислотная замена находятся в положениях, выбранных из группы, состоящей из E1191, S1199, W1178, Y1183 и их комбинации, где:

замена в положении 1191 представляет собой E1191A;

замены в положении 1199 выбраны из группы, состоящей из S1199W, S1199E и S1199H;

замены в положении 1178 выбраны из группы, состоящей из W1178Y, W1178Q, W1178A и W1178S; и

замены в положении 1183 выбраны из группы, состоящей из Y1183C и Y1183P;

где вторая часть представляет собой биоактивную молекулу, терапевтический полипептид или неполипептидный лекарственный препарат;

где химерная молекула характеризуется усиленным связыванием с SytII человека по сравнению с наблюдаемым у эталонного рецептор-связывающего домена дикого типа.

9. Химерная молекула по п. 8, отличающаяся тем, что первая часть и вторая часть связаны ковалентно или нековалентно и где вторая часть выбрана из группы, состоящей из малой молекулы, нуклеиновой кислоты, короткого полипептида и белка.

10. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид по любому из пп. 1-7.

11. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует химерную молекулу по п. 8 или 9.

12. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 10 или 11.

13. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 10 или 11 или вектор по п. 12.

14. Фармацевтическая композиция для лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида по любому из пп. 1-7, или химерной молекулы по п. 8 или 9, или нуклеиновой кислоты по п. 10 или п. 11, или вектора экспрессии по п. 12 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

15. Набор для лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, содержащий фармацевтическую композицию по п. 14 и инструкции для терапевтического введения фармацевтической композиции.

16. Способ получения полипептида, содержащего модифицированный B-Hc, включающий стадии культивирования клетки по п. 13 в условиях, в которых продуцируется указанный полипептид.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий одну или более из следующих стадий:

- извлечения полипептида из культуры,

- очистку полипептида,

- активацию полипептида, и/или

- приготовление полипептида.

18. Способ лечения патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью, включающий введение терапевтически эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-8 субъекту, чтобы таким образом обеспечивать контакт с одним или более нейронами, проявляющими нежелательную нейронную активность, чтобы таким образом лечить патологическое состояние.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что патологическое состояние выбрано из группы, состоящей из спастической дисфонии, спастической кривошеи, дистонии мышц гортани, oромандибулярной дистонии, лингвальной дистонии, цервикальной дистонии, графоспазма, блефароспазма, косоглазия, гемифациального спазма, расстройства век, церебрального паралича, фокальной спастичности и других нарушений речи, спастического колита, нейрогенного мочевого пузыря, анизмуса, спастичности конечностей, тика, тремора, бруксизма, анальной трещины, ахалазии, дисфагии и других нарушений мышечного тонуса и других расстройств, характеризующихся непроизвольными движениями мышечных групп, лакримации, гипергидроза, чрезмерного слюноотделения, чрезмерных желудочно-кишечных выделений, секреторных расстройств, боли от мышечных спазмов, головной боли, мигрени и дерматологических или эстетических/косметических патологических состояний.

20. Применение полипептида по любому из пп. 1-7, химерной молекулы по п. 8 или 9, нуклеиновой кислоты по п. 10 или 11, вектора экспрессии по п. 12, клетки по п. 13, фармацевтической композиции по п. 14 или набора по п. 15 в лечении патологического состояния, связанного с нежелательной нейронной активностью.