ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к лечению спастичности конечностей с использованием модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Спастичность представляет собой моторный симптом, характеризующийся увеличением зависящих от скорости рефлексов растяжения с преувеличенными сухожильными подергиваниями, возникающими в результате повышенной возбудимости рефлекса растяжения, как одного из компонентов синдрома мотонейронов. Спастичность связана с различными неврологическими нарушениями, например рассеянным склерозом, повреждениями головного или спинного мозга, черепно-мозговой травмой (ЧМТ) и цереброваскулярными нарушениями (инсульт). Для него характерны моторные нарушения (повышение мышечного тонуса, неправильное положение конечностей, чрезмерное сокращение мышц-антагонистов и гиперактивные рефлексы), функциональная недостаточность, боль и дискомфорт.
Спастичность верхних конечностей (AUL) у взрослых является частым осложнением после инсульта; это часто болезненно (связано со спастическим сокращением мышц) и может привести к значительной инвалидности, препятствуя движению верхней конечности и ограничивая использование конечности для активных функциональных задач. В тяжелых случаях, это также может препятствовать «пассивным функциям», таким как мытье, одевание и уход за пораженной конечностью, тем самым увеличивая нагрузку на лиц, осуществляющих уход. Вторичные осложнения могут включать низкую самооценку и образ тела, ухудшение качества жизни (снижение социального и семейного взаимодействия) и пролежни.
Лечение постинсультной спастичности верхних конечностей является сложной задачей из-за разнообразия пациентов и их целей. У этих пациентов, мышечный гипертонус обычно проявляется несколькими общими клиническими паттернами, определяемыми пораженными мышцами, что, в свою очередь, связано с размером, локализацией и возрастом поражений центральной нервной системы. Эти паттерны были описаны в международном перекрестном опросе лечащих специалистов в 31 стране и впоследствии были использованы для разработки классификации 5 типичных паттернов спастичности AUL. Они определяются положением плечевого, локтевого, предплечного и лучезапястного суставов. Текущий клинический консенсус и существующие руководства рекомендуют учитывать точную картину спастичности при выборе лечения для пациентов, и терапию ботулиническим нейротоксином А (BoNT/A) следует адаптировать в соответствии с соответствующими мышцами, выбранными для инъекции. Тем не менее, нет двух одинаковых пациентов, и существует потребность в индивидуальных/персонализированных схемах лечения.
Группа экспертов дополнительно изучила эти модели, чтобы предоставить рекомендации по параметрам лечения спастичности верхних конечностей (ULS) и целевых мышц для каждой из клинических моделей (см. фигуру 1). Примечательно, что комиссия определила три совокупные комбинации поз для лечения BoNT. Они представляют собой:
(1) Приведенное плечо, Согнутый локоть, Пронированное предплечье, Согнутое запястье, Сжатый кулак;
(2) Согнутый локоть, Пронированное предплечье, Согнутое запястье, Сжатый кулак; и
(3) Согнутое запястье, Сжатый кулак.
Известно, что четыре сустава верхних конечностей, показанные на фигуре 1, поражаются у >90% субъектов (см. фигуру 1). Большинство паттернов спастичности верхних конечностей (четыре из пяти) возникают в результате внутренней ротации и приведения плеча, а также сгибания в локтевом суставе, с различиями в положении, возникающими в результате положения предплечья и запястья.
Общее лечение ULS направлено на облегчение признаков и симптомов спастичности - уменьшение мышечных спазмов и боли, улучшение осанки, облегчение подвижности и ловкости (произвольных моторных функций дотягивания, схватывания, перемещения и отпускания), сведение к минимуму контрактур и деформаций и облегчение удобства ухода за пациентом, а также гигиены/самообслуживания и/или качества жизни. Доступные варианты фармакологического лечения, такие как пероральные (бензодиазепины, баклофен, тизанидин и дантролен) и интратекальные (баклофен) препараты, в основном вызывают неселективную мышечную слабость с побочными эффектами, такими как общая слабость и неблагоприятное воздействие на центральную нервную систему, включая атаксию, сонливость, седативный эффект и даже симптомы отмены.
Наиболее эффективный подход к лечению спастичности представляет собой сочетание физиотерапии и внутримышечных (в/м) инъекций BoNT/A, рекомендованное несколькими руководствами последних лет. BoNT/A стал лечением выбора, так как он имеет минимальные системные побочные эффекты и, будучи местным инъекционным лечением, может быть адаптирован к индивидуальной картине заболевания путем избирательного воздействия на пораженные мышцы.
Dysport® представляет собой медицинский продукт, содержащий комплекс лекарственного вещества BoNT/A и гемагглютинина (BTX-A-HAC), выделенный и очищенный из штамма Clostridium botulinum типа А. Некоторые другие лекарственные продукты BoNT/A, в природе произведенные Clostridium botulinum, также представлены на рынке (например, BOTOX® и XEOMIN®).
BoNT/A селективно ингибирует высвобождение ацетилхолина из пресинаптических нервных окончаний и, таким образом, блокирует холинергическую передачу в нервно-мышечном соединении, вызывая снижение мышечного сокращения и мышечного тонуса, вызывая расслабление инъецированных мышц. Этот механизм действия использовался в терапевтических целях для лечения нескольких клинических неврологических состояний, включая фокальные дистонии, фокальную мышечную спастичность и эстетические состояния, на протяжении более двух десятилетий.
Тем не менее, продолжительность действия доступных в настоящее время продуктов BoNT/A составляет от 12 до 14 недель, когда прорастают новые нервные окончания, позволяя нервной функции вернуться к норме, и вновь появляются первоначальные симптомы. Следовательно, для поддержания эффекта, инъекции необходимо периодически повторять.
Таким образом, частота инъекций BoNT/А является важным фактором для лечения спастичности, учитывая хронический характер состояния и длительный характер необходимого лечения. Действительно, это влияет на прямые и косвенные расходы на здоровье пациентов и лиц, осуществляющих уход, на логистику инъекций в больницах/клиниках и, что наиболее важно, на качество жизни пациентов.
Dysport® одобрен для лечения спастичности верхних и нижних конечностей с максимальной общей дозой за сеанс лечения 1500 единиц (см. фигуру 2 - максимум 1000 единиц для лечения спастичности верхних конечностей). Лечащему специалисту необходимо вводить Dysport® во множество мышц конечностей до верхнего порога в 1500 единиц всего за сеанс лечения. Лечащий специалист вынужден делать трудный выбор во время лечения пациента. Другими словами, в обычных схемах лечения, лечащий специалист должен найти баланс между относительно низким общим количеством BoNT/А, которое может быть введено (1500 единиц или 1000 единиц при спастичности верхних конечностей - обусловлено высокотоксичной природой BoNT/А) и эффективное количество для множества различных мышц. Следовательно, некоторые мышцы игнорируются, в то время как другие получают субоптимальное количество BoNT/А, что приводит к субоптимальной терапии. Кроме того, современные схемы лечения исключают лечение плеча, которое требует многократного введения единичных доз во множество его мышц.
Более того, обычные схемы лечения сложны и приводят к тому, что лечащий специалисты занижают дозировку, чтобы избежать токсичности для пациента. Таким образом, существует потребность в удобной, безопасной и эффективной однократной дозе и соответствующем руководстве по количеству единиц, которые можно вводить в конечность (включая количество мест инъекции на мышцу) во время сеанса лечения без токсичности для пациента.
В заключение, существует потребность в улучшенном лечении спастичности конечностей, которое позволило бы использовать индивидуальный подход, ориентированный на пациента, для адаптации лечения в соответствии с целевой клинической картиной, позволяющей вводить различные комбинации мышц конечностей в зависимости от распределения, степени и тяжести спастичности, избегая при этом токсичности и обеспечивая более продолжительное лечение (что приводит к менее частому введению). Также существует потребность в улучшенной схеме лечения, позволяющей лечить оставшиеся без лечения мышцы, например мышцы плеча.
Настоящее изобретение преодолевает одну или несколько вышеупомянутых проблем.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что модифицированный BoNT/A особенно полезен при лечении спастичности конечностей. Модифицированный BoNT/A может содержать одну или несколько модификаций аминокислотных остатков, экспонированных на поверхности, что приводит к увеличению суммарного положительного заряда. Повышенный заряд способствует электростатическим взаимодействиям между полипептидом и анионными внеклеточными компонентами, тем самым способствуя связыванию между полипептидом и клеточной поверхностью. В свою очередь, это увеличивает удержание (уменьшает диффузию из) в месте введения и приводит к увеличению продолжительности действия (например, 6-9 месяцев). Альтернативно, модифицированный BoNT/A может содержать домен легкой цепи и транслокации BoNT/A и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC), что аналогичным образом приводит к модифицированному BoNT/A, который демонстрирует повышенное удержание (сниженной диффузии из) в месте введения и увеличения продолжительности действия (например, 6-9 месяцев). Преимущественно, модифицированный BoNT/A имеет улучшенный профиль безопасности по сравнению с не модифицированным BoNT/A (например, Dysport®). Этот улучшенный профиль безопасности может быть выражен высоким коэффициентом безопасности, описанным здесь для модифицированного BoNT/A.
На основании представленных здесь доклинических данных (см. пример 6) было показано, что субъекту можно вводить более высокое общее количество модифицированного BoNT/А при достижении профиля безопасности, аналогичного не модифицированному BoNT/A (например, Dysport®), хотя и в таких высоких дозах. Таким образом, модифицированный BoNT/A можно вводить в большее количество мышц/участков при лечении спастичности конечностей до достижения максимальной общей дозы. Это является важным и полезным открытием, которое позволяет улучшить лечение спастичности конечностей, предоставляя лечащим специалистам более широкий спектр вариантов лечения. Впервые, он также предоставляет возможность лечения дополнительных крупных мышц, таких как мышцы плеча, а также лечения локтя, предплечья и/или запястья в максимальной дозе. Лечение может быть улучшено тем, что оно обеспечивает более продолжительное лечение (что приводит к менее частому введению) и/или может быть адаптировано для субъекта, и/или приводит к улучшению качества жизни субъекта по сравнению с лечением с помощью не модифицированного BoNT/A (например, Dysport®). Лечение по изобретению улучшено по сравнению с обычными схемами лечения.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает удобную, безопасную и эффективную стандартную дозу, а также общую (максимальную) дозу, которую можно безопасно вводить при однократном лечении. Настоящее изобретение также предлагает соответствующее руководство по количеству раз, когда указанная стандартная доза может быть введена в конечность (например, включая количество мест инъекции на мышцу) без результирующей токсичности для пациента. Таким образом, лечение в соответствии с настоящим изобретением является намного менее сложным для лечащего специалиста и помогает избежать недостаточной дозировки и/или передозировки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбраны из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) в множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбраны из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят с помощью путем введения стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множестве пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая доза вводимого во время лечения, составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В родственном аспекте изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая доза вводимого во время лечения, составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекту,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекту,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множестве пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая доза вводимого во время лечения, составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 15,5 до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 14220 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят с помощью путем введения стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекту,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множестве пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 10605 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекту,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции).) во множестве пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекту,
где модифицированный ботулотоксин вводят в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множестве пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 7110 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В родственном аспекте, изобретение предлагает способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) путем внутримышечной инъекции во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует рассчитанной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом родственном аспекте, изобретение предлагает применение модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A) в производстве лекарственного средства для лечения спастичности конечностей у детей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 15,5 до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 15,5 до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A в место инъекции) во множество пораженных мышц, и где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 5302,5 единиц, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
«Пораженная мышца» представляет собой мышцу, проявляющую симптом спастичности или способствующую спастичности пораженной конечности. Например, указанная мышца может проявлять повышенный мышечный тонус или жесткость.
Множество пораженных мышц выбрано из первой и второй групп, как описано в настоящем документе. Выбранное множество пораженных мышц может представлять собой, по меньшей мере, одну мышцу первой группы и/или, по меньшей мере, одну мышцу второй группы. Альтернативно, множество пораженных мышц может представлять собой две или несколько мышц из одной и той же группы (например, две или несколько мышц из первой группы или две или несколько мышц из второй группы). Предпочтительно, множество пораженных мышц включает, по меньшей мере, одну мышцу из первой группы и, по меньшей мере, одну мышцу из второй группы.
Множество мышц может быть мышцами одной конечности или мышцами разных конечностей. Однако предпочтительно, чтобы множество мышц представляло собой мышцы одной и той же конечности. Настоящее изобретение охватывает одновременное лечение спастичности одной или нескольких конечностей. Например, модифицированный BoNT/A можно вводить в одну или обе верхние конечности субъекта за сеанс лечения, в одну или обе нижние конечности за сеанс лечения или в комбинацию нижних и верхних конечностей за сеанс лечения. Независимо от того, лечатся ли две или несколько конечностей, предпочтительно, чтобы лечили, по меньшей мере, 2 мышцы на конечность, например, по меньшей мере, 3, 4 или 5 мышц на конечность.
Модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении может быть либо модифицированным BoNT/A, содержащим модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком; замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком; вставки основного аминокислотного остатка; и делеции аминокислотного остатка, экспонированного на кислой поверхности, либо модифицированным BoNT/A, содержащим легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в настоящем изобретении представляет собой модифицированный BoNT/A, содержащий модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком; замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком; вставки основного аминокислотного остатка; и делеции аминокислотного остатка, экспонированного на кислой поверхности.
Эффективность модифицированного BoNT/A для применения по изобретению предпочтительно, определяют с помощью анализа LD50 на мышах в соответствии со стандартными методами. В указанном анализе, 1 единица определена как количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей. Предпочтительно, вычисляют медиану летальной внутрибрюшинной дозы у мышей. Количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует 1 единице в указанном анализе, может составлять, по меньшей мере, 1 пг, 2 пг, 3 пг, 4 пг, 5 пг, 6 пг, 7 пг, 8 пг или 9 пг. Количество модифицированного BoNT/A, соответствующее 1 единице в указанном анализе, может составлять ≤45 пг, ≤40 пг, ≤30 пг, ≤25 пг, ≤20 пг, ≤19 пг, ≤18 пг, ≤17 пг, ≤16 пг, ≤15 пг, ≤14 пг, ≤13 пг, ≤12 пг, ≤11 пг, ≤10 пг, ≤9 пг, ≤8 пг, ≤7 пг или ≤6 пг.
Если модифицированный BoNT/A для использования в изобретении представляет собой модифицированный BoNT/A, содержащий модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком; замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком; замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности основным аминокислотным остатком; вставки основного аминокислотного остатка; и делеции аминокислотного остатка, экспонированного на кислой поверхности, количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует 1 единице в указанном анализе, может составлять 1-15 пг, например, 5-10 пг. Предпочтительно, количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует 1 единице в указанном анализе, может составлять 8-9 пг, более предпочтительно, 8,4 пг.
Если модифицированный BoNT/A для использования в изобретении представляет собой модифицированный BoNT/A, содержащий легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC), количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует 1 единице в указанном анализе, может составлять 15-35 пг, например, 20-30 пг. Предпочтительно, количество модифицированного BoNT/A, которое соответствует 1 единице в указанном анализе, может составлять 23-25 пг, более предпочтительно, 24,0 пг.
Термин «до» при использовании в отношении значения (например, до 14220 единиц) означает вплоть до указанного значения, включительно. Таким образом, например, ссылка на введение «до 14220 единиц» модифицированного BoNT/A включает введение 14220 единиц модифицированного BoNT/A, и введение менее 14220 единиц модифицированного BoNT/A.
Предпочтительно, дозу модифицированного BoNT/A вводят внутримышечно в пораженную мышцу. Более предпочтительно, в одно место инъекции вводят разовую стандартную дозу. Термин «вводят разовую стандартную дозу» означает, что вводится практически вся разовая стандартная доза. Например, остаточное количество (например, до 1%, 0,1% или 0,01%) стандартной дозы может оставаться во флаконе, в котором был восстановлен модифицированный BoNT/A. Однако предпочтительно, вводить всю разовую стандартную дозу (например, в одно или несколько мест инъекции). В зависимости от природы мышцы, либо вводят одну стандартную дозу (т.е. в мышцу, выбранную из первой группы, описанной в настоящем документе), либо вводят несколько стандартных доз (т.е. в мышцу, выбранную из второй группы, описанной в настоящем документе). Указанная одна стандартная доза или несколько стандартных доз могут быть введены в одно или несколько мест инъекции (например, в мышцу). Например, в некоторых вариантах осуществления, в одно место инъекции можно вводить менее одной стандартной дозы. В предпочтительном варианте осуществления, некоторые мышцы инъецируют только в одно место (т.е. мышцы, выбранные из первой группы, описанной в настоящем документе), и некоторые мышцы инъецируют в два или несколько мест (т.е. мышцы, выбранные из второй группы, описанной в настоящем документе).
В одном варианте осуществления, одну стандартную дозу вводят во множество мест инъекций в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят во множество мест инъекций в пораженную мышцу второй группы.
Стандартная доза может быть выражена в единицах модифицированного BoNT/А.
Стандартная доза может составлять от 53 единиц до 948 единиц модифицированного BoNT/А. Верхний предел диапазона стандартных доз может составлять 925, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 единиц модифицированного BoNT/А, предпочтительно, верхний предел составляет 889 единиц. Нижний предел диапазона стандартных доз может составлять 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 59 единиц. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 59 до 889 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 200 до 600 единиц.
Наиболее предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 237 до 355 единиц, например от 284 до 308 единиц.
Стандартная доза может составлять от 31 единиц до 707 единиц модифицированного BoNT/А. Верхний предел диапазона стандартных доз может составлять 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 666 единиц. Нижний предел диапазона стандартных доз может составлять 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 42 единицы. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 42 до 666 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 200 до 400 единиц. Эти стандартные дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Альтернативно или дополнительно, стандартная доза может быть выражена в единицах количества модифицированного BoNT/A. Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) в множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 120000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) в множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 120000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 255000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Также предложены соответствующие области применения (при изготовлении лекарственного средства) и способы лечения.
В одном аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) в множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 120000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину A (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) в множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 120000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
В другом аспекте, изобретение относится к модифицированному ботулиническому нейротоксину А (BoNT/A) для применения при лечении спастичности конечностей, где модифицированный BoNT/A вводят внутримышечно во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A (предпочтительно, в виде стандартной дозы от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A на место инъекции) во множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев и длинный сгибатель большого пальца стопы; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу и заднюю большеберцовую мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят (предпочтительно, в выбранное место инъекции) в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят (предпочтительно, в выбранные разные места инъекции) в пораженную мышцу второй группы, и где общая вводимая доза при лечении составляет до 255000 пг, и
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Также предусмотрены соответствующие области применения (при производстве лекарственного средства) и способы лечения.
Стандартная доза может составлять от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона стандартных доз может составлять 7750, 7500, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 7500 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз может составлять 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 или 7000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 500 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 500 пг до 7500 пг модифицированного BoNT/A, например от 4000 пг до 6000 пг.
Наиболее предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 2000 до 3000 пг, например от 2400 до 2600 пг.
Стандартная доза может составлять от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел диапазона стандартных доз может составлять 16500, 15500, 14500, 13500, 12500, 11500, 10500, 9500, 8500, 7500, 6500, 5500, 4500, 3500, 2500, 1500 или 500 пг модифицированного BoNT, предпочтительно, верхний предел составляет 16000 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз может составлять 750, 850, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 1000 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A составляет от 1000 пг до 16000 пг модифицированного BoNT/A, например, от 4000 пг до 6000 пг. Эти стандартные дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Единичная доза модифицированного BoNT/A также может быть выражена как в единицах, так и в количествах (пг) одновременно.
Разовую стандартную дозу модифицированного BoNT/A вводят в мышцу, выбранную из первой группы, описанной в настоящем документе, когда указанная мышца первой группы выбрана для лечения.
Множество стандартных доз модифицированного BoNT/А вводят в мышцу, выбранную из второй группы. Например, можно вводить, по меньшей мере, 2х, 3х или 4х стандартные дозы. В некоторых вариантах осуществления, можно вводить 2-4х стандартные дозы. Предпочтительно, в мышцу, выбранную из второй группы, вводят 2х стандартные дозы модифицированного BoNT/A.
Некоторые мышцы могут присутствовать в первой группе мышц и во второй группе мышц. Таким образом, лечащий специалист может решить, следует ли вводить в указанную мышцу одну стандартную дозу или несколько стандартных доз.
Спастичность конечностей может быть спастичностью верхних конечностей или спастичностью нижних конечностей.
При лечении спастичности нижних конечностей, модифицированный BoNT/А можно вводить во множество мышц, выбранных из: первой группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, икроножную мышцу, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца стопы и короткий сгибатель большого пальца стопы; и второй группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, подвздошно-поясничную и икроножную мышцы.
При введении в длинный сгибатель большого пальца, стопы в некоторых случаях можно вводить разовую стандартную дозу, тогда как в других случаях можно вводить 2х стандартную дозу.
Подходящие дозировки для мышц нижних конечностей показаны ниже:
Модифицированный BoNT/A можно вводить в одну или несколько мышц, в дозировках, указанных в таблице выше.
Модифицированный BoNT/A можно вводить в одну или несколько из следующих мышц следующим образом в следующих дозах:
Предпочтительно, спастичность конечности представляет собой спастичность верхней конечности.
При лечении спастичности верхних конечностей, модифицированный ботулотоксин можно вводить во множество пораженных мышц, выбранных из: первой группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу и мышцу, противопоставляющую большой палец; и второй группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, грудную мышцу (например, большую грудную мышцу), широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, плечелучевую мышцу и большую круглую мышцу.
Предпочтительно, при лечении спастичности верхних конечностей модифицированный ботулотоксин можно вводить во множество пораженных мышц, выбранных из: первой группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор и двуглавую мышцу плеча; и второй группы, включающей (предпочтительно, состоящей из): трехглавую мышцу плеча (длинную головку), подлопаточную мышцу, большую грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча и плечевую мышцу.
Более предпочтительно, модифицированный BoNT/A можно вводить в мышцу, связанную со спастичностью плеча, такую как приведенное плечо. Модифицированный BoNT/A можно вводить, по меньшей мере, в одну из широчайшей мышцы спины, подлопаточной мышцы, большой грудной мышцы и трехглавой мышцы плеча (длинной головки). Например, модифицированный BoNT/A можно вводить, по меньшей мере, в две или три (предпочтительно, во все) мышцы широчайшей мышцы спины, подлопаточной мышцы, большой грудной мышцы или трехглавой мышцы плеча (длинной головки).
При введении в двуглавую мышцу плеча, в некоторых случаях можно вводить одну стандартную дозу, тогда как в других случаях можно вводить 2х стандартную дозу. Таким образом, двуглавая мышца плеча относится как к первой, так и ко второй группе мышц. Предпочтительно, 2х дозу вводят в двуглавую мышцу плеча, и эта мышца включается во вторую группу мышц.
Подходящие дозировки для мышц верхних конечностей показаны ниже:
1х или 2х СД
Модифицированный BoNT/A можно вводить в одну или несколько мышц в дозах, указанных в таблице выше.
Модифицированный BoNT/A можно вводить в одну или несколько из следующих мышц следующим образом в следующих дозах:
Общее количество стандартных доз, вводимых при настоящем лечении, может быть вплоть до 15х стандартных доз. Другими словами, в одном варианте осуществления, 15х разовые дозы можно вводить в 15х мест инъекций. В другом варианте осуществления, 15х разовые дозы можно вводить более чем в 15х мест инъекций. Общее количество стандартных доз будет разделено в соответствии с подвергаемыми лечению мышцами, например, 2х стандартных дозы можно вводить в широчайшую мышцу спины, 2х - в подлопаточную, 2х - в большую грудную и 1х - в локтевой сгибатели запястья, что дает общее количество вводимых единичных доз 7x. Например, общее количество вводимых стандартных доз может составлять до 14х, 13х, 12х, 11х, 10х, 9х, 8х или 7х. Общее количество вводимых стандартных доз может быть, по меньшей мере, в 2х, 3х, 4х, 5х, 6х, 7х стандартной дозы, предпочтительно, по меньшей мере, в 2х. Общее количество вводимых стандартных доз может составлять от 2х до 15х, от 7х до 15х или от 10х до 14х. Предпочтительно, количество вводимых стандартных доз составляет 15х.
Общая доза, вводимая при проведении схемы лечения по настоящему изобретению, может составлять до 14220 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого за один сеанс лечения, может составлять до 14220 единиц. Общая доза может составлять до 14000, 13000, 12000, 11000, 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 единиц. Предпочтительно, общая доза может составлять до 13335 единиц модифицированного BoNT/A. Суммарная доза может составлять по меньшей мере, 106, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000 или 13000 единиц. Предпочтительно, общая доза может составлять, по меньшей мере, 106 единиц, более предпочтительно, по меньшей мере, 118 единиц модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 795 единиц. Общая доза может составлять 118-13335 единиц, предпочтительно, 795-13335 единиц. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 9000-13335 единиц.
Общая доза, вводимая при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению, может составлять до 120000 пг. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/А, вводимого во время данного лечебного сеанса, может составлять до 120000 пг. Общая доза может составлять до 115000, 110000, 100000, 90000, 80000, 70000, 60000, 50000, 40000, 30000, 20000, 10000 или 5000 пг. Предпочтительно, общая доза может составлять до 112500 пг модифицированного BoNT/A. Общая доза может составлять, по меньшей мере, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 или 100000 пг. Предпочтительно, общая доза может составлять, по меньшей мере, 900 пг, более предпочтительно, по меньшей мере, 1000 пг модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере 6000 пг. Общая доза может составлять 1000-112500 пг, предпочтительно, 60000-112500 пг. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 7500-112500 пг.
Общая доза, вводимая при проведении схемы лечения по настоящему изобретению, может составлять до 10605 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого за один сеанс лечения, может составлять до 10605 единиц. Общая доза может составлять до 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 единиц. Предпочтительно, общая доза может составлять до 9990 единиц модифицированного BoNT/А. Общая доза может составлять по меньшей мере, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 или 9000. Предпочтительно, общая доза может составлять по меньшей мере, 62 единиц, более предпочтительно, по меньшей мере, 84 единиц модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 465 единиц. Общая доза может составлять 84-9990 единиц, предпочтительно, 465-9990 единиц. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 630-9990 единиц. Эти общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Общая доза, вводимая при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению, может составлять до 255000 пг. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/А, вводимого во время данного лечебного сеанса, может составлять до 255000 пг. Общая доза может составлять до 240000, 220000, 200000, 180000, 160000, 140000, 110000, 100000, 90000, 80000, 70000, 60000, 50000, 40000, 30000, 20000, 10000 или 5000 пг. Предпочтительно, общая доза может составлять до 240000 пг модифицированного BoNT/A. Общая доза может составлять по меньшей мере, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 120000, 150000, 175000, 200000 или 220000 пг. Предпочтительно, общая доза может составлять, по меньшей мере, 1500 пг, более предпочтительно, по меньшей мере, 2000 пг модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 12000 пг. Общая доза может составлять 2000-240000 пг, предпочтительно, 128000-240000 пг. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 15000-240000 пг. Эти общие дозировки могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Специалист в данной области техники примет во внимание, если субъект недавно прошел (или впоследствии будет проходить) дополнительное лечение клостридиальным нейротоксином (например, BoNT), например, как часть косметического лечения или лечения по другому показанию. Используя обычные методы в данной области техники, специалист в данной области техники соответствующим образом адаптирует настоящую схему лечения.
Предпочтительно, чтобы спастичность конечностей для лечения в соответствии с настоящим изобретением представляла собой спастичность конечностей взрослых. Предпочтительно, указанные выше дозировки предназначены для лечения спастичности конечностей у взрослых. Тем не менее, лечение спастичности конечностей у детей также включено. При лечении спастичности конечностей у детей комбинированная общая доза обычно составляет 50% или меньше, чем при лечении спастичности конечностей у взрослых. В некоторых вариантах осуществления комбинированная общая доза обычно составляет 70% или менее (например, 67% или менее), чем доза, используемая при лечении спастичности конечностей у взрослых.
Подходящая стандартная доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 7110 единиц. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 444,5 единиц. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 29,5 единиц. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 29,5 до 474 единиц (более предпочтительно, от 29,5 до 444,5 единиц) модифицированного BoNT/A, например, от 100 до 300 единиц.
Подходящая стандартная доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 37,1 до 663,6 единиц модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 9954 единиц. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 622,3 единиц Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 41,3 единицы. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/А для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 41,3 до 622,3 единиц модифицированного BoNT/А, например, от 100 единиц до 700 единиц.
Подходящая стандартная доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 35,1 до 635,16 единиц модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 9527,4 единиц. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 595,63 единиц Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 39,5 единиц. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/А для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 39,5 единиц до 635,2 единиц модифицированного BoNT/А, например, от 100 единиц до 700 единиц.
Подходящая стандартная доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 225 пг до 4000 пг модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 60000 пг. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 3500, 3000, 2000, 1000 или 500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 3750 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000 или 3500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 250 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 250 до 3750 пг модифицированного BoNT/A, например от 2000 до 3000 пг.
Подходящая стандартная доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 315 до 5600 пг модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 84000 пг. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 5,000, 4000, 3000, 2000, 1000 или 500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 5250 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000 или 3500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 350 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 350 до 5250 пг модифицированного BoNT/A, например от 2000 до 3000 пг.
Подходящая стандартная для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 301,5 до 5360 пг модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 80400 пг. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 или 500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 5025 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000 или 3500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 335 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 335 пг до 5025 пг модифицированного BoNT/A, например, от 2000 пг до 3000 пг.
Общая доза, вводимая при применении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 7110 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого во время данного лечебного сеанса для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 7110 единиц. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 или 500 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 6667,5 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 53, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 или 7000 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 53 единицы, более предпочтительно, по меньшей мере, 59 единиц модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 397,5 единиц. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 59-6667,5 единиц, предпочтительно, 397,5-6667,5 единиц. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 4500-6667,5 единиц.
Общая доза, вводимая при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 60000 пг. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого во время данного лечебного сеанса для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 60000 пг. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 55000, 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 3000 или 2500 пг. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 56250 пг модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять по меньшей мере, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 20000, 30000, 40000. 50000 или 55000 пг. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять по меньшей мере 450 пг, более предпочтительно, по меньшей мере, 500 пг модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 3000 пг. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 500-56250 пг, предпочтительно, 30000-56250 пг. Более предпочтительно, общая доза, вводимая для лечения спастичности конечностей у детей, составляет 3750-56250 пг.
Общее количество стандартных доз, вводимых при настоящем лечении спастичности конечностей у детей, может составлять до 10х стандартной дозы. Другими словами, в одном варианте осуществления 10х стандартные дозы можно вводить в 10х мест инъекций. В другом варианте осуществления 10х стандартные дозы можно вводить в более чем 10х мест инъекций. Общее количество стандартных доз будет разделено в соответствии с подвергаемыми лечению мышцами, например, 2х стандартных дозы можно вводить в широчайшую мышцу спины, 2х - в подлопаточную мышцу, 2х - в большую грудную мышцу и 1х - в локтевой сгибатель запястья, что дает общее количество вводимых стандартных доза 7x. Например, общее количество вводимых стандартных доз может составлять до 9х, 8х, 7х, 6х, 5х, 4х или 3х. Общее количество вводимых стандартных доз может составлять, по меньшей мере, 2х, 3х, 4х, 5х, 6х, 7х стандартных доз, предпочтительно, по меньшей мере, 2х. Общее количество вводимых стандартных доз может составлять от 2х до 10х, от 7х до 10х или от 4х до 8х. Предпочтительно, количество вводимых стандартных доз составляет 10х.
Общая доза, вводимая при применении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 4740 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого на данном лечебном сеансе для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 4740 единиц. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 4500, 4000, 3000, 2000, 1000 или 500 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 4445 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 3000 или 4000 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 265 единиц, более предпочтительно, по меньшей мере, 295 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 265-4740 единиц, предпочтительно, 295-4445 единиц.
Подходящая стандартная для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 5302,5 единиц. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 300, 250, 200, 150, 100, 50 или 25 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 333 единицы. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300 или 325 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 21 единицу. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/А для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 21 единицы до 333 единиц модифицированного BoNT/А, например, от 100 единиц до 200 единиц. Эти стандартные дозы и общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Подходящая стандартная для лечения спастичности конечностей у детей может составлять от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A, и общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 127500 пг. Верхний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 8000 пг. Нижний предел диапазона стандартных доз для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 или 1000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 500 пг. Предпочтительно, стандартная доза модифицированного BoNT/A для лечения спастичности конечностей у детей составляет от 500 до 8000 пг модифицированного BoNT/A, например от 4000 до 6000 пг. Эти стандартные дозы и общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Общая доза, вводимая при применении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 5302,5 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого на данном лечебном сеансе для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 5302,5 единиц. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 5000, 4000, 3000, 2000, 1000 или 500 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 4995 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 20, 40, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 или 5000 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 31 единицу, более предпочтительно, по меньшей мере, 42 единицы модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 232,5 единицы. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 42-4995 единиц, предпочтительно, 232,5-4995 единиц. Более предпочтительно, общая вводимая доза составляет 4725-4995 единиц. Эти общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Общая доза, вводимая при осуществлении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 127500 пг. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого во время данного лечебного сеанса для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 127500 пг. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 127000, 125000, 120000, 110000, 100000, 80000, 60000, 40000, 30000, 20000 или 10000 пг. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 120000 пг модифицированного BoNT/A. Общая доза лечения спастичности педиатрической конечности может составлять, по меньшей мере, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10000, 12500, 15000, 20000, 30000, 40000 или 120000 пг. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 750 пг, более предпочтительно, по меньшей мере, 1000 пг модифицированного BoNT/A, например, по меньшей мере, 6000 пг. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 1000-120000 пг, предпочтительно, 64000-120000 пг. Более предпочтительно, общая доза, вводимая для лечения спастичности конечностей у детей, составляет 7500-120000 пг. Эти общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Общая доза, вводимая при применении схемы лечения по настоящему изобретению для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 3535 единиц. Другими словами, общее количество модифицированного BoNT/A, вводимого на данном лечебном сеансе для лечения спастичности конечностей у детей, может составлять до 3535 единиц. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 3000, 2000, 1000 или 500 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять до 3330 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 25, 50, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000 или 3000 единиц. Предпочтительно, общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять, по меньшей мере, 150 единиц, более предпочтительно, по меньшей мере, 210 единиц модифицированного BoNT/A. Общая доза для лечения спастичности конечностей у детей может составлять 150-3535 единиц, предпочтительно, 210-3330 единиц. Эти стандартные дозы и общие дозы могут быть особенно актуальны, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Модифицированный BoNT/A по изобретению, предпочтительно, имеет большую продолжительность действия по сравнению с немодифицированным BoNT/A (например, Dysport®). Указанная продолжительность действия может быть, по меньшей мере, в 1,25х, 1,5х, 1,75х, 2,0х или 2,25х больше. Продолжительность действия модифицированных BoNT/A может составлять от 6 до 9 месяцев. Например, продолжительность действия может быть, по меньшей мере: 4,5 месяца (от начала), 5,0 месяцев, 5,5 месяцев, 6 месяцев, 6,5 месяцев, 7,0 месяцев, 7,5 месяцев, 8,0 месяцев, 8,5 месяцев или 9,0 месяцев.
Введение во множество мышц в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, происходит во время одного и того же лечебного сеанса.
Лечение можно повторить через соответствующий период времени после введения модифицированного BoNT/A. Учитывая, что продолжительность действия примерно в два раза больше, чем у не модифицированного BoNT/A (например, Dysport®), между последующими введениями должны быть более длительные периоды, чем при лечении субъекта немодифицированным BoNT/A (например, Dysport®). Субъекту можно повторно вводить модифицированный BoNT/A в соответствии с настоящим изобретением, по меньшей мере, через 18, 20, 25 или 30 недель после предыдущего введения. Например, субъекту можно повторно вводить модифицированный BoNT/A в соответствии с настоящим изобретением, по меньшей мере, через 18-45 недель, предпочтительно, через 20-35 недель после предыдущего введения.
Используемый в настоящем документе термин «субъект» может быть млекопитающим, таким как человек или другое млекопитающее. Предпочтительно, «субъект» означает человека.
Используемый в настоящем документе термин «лечить» или «лечение» охватывает профилактическое лечение (например, для профилактики возникновения нарушения), и корректирующее лечение (лечение субъекта, уже страдающего нарушением). Предпочтительно, «лечить» или «лечение» в контексте настоящего описания означает корректирующее лечение. Используемый в настоящем документе термин «лечить» или «лечение» относится к расстройству и/или его симптому.
Подходящие модифицированные полипептиды BoNT/A (и нуклеотидные последовательности, кодирующие их, если они присутствуют) описаны в WO 2015/004461 A1 и WO 2017/191315, обе из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
BoNT/A является одним из примеров клостридиального нейротоксина, продуцируемого бактериями рода Clostridia. Другие примеры таких клостридиальных нейротоксинов включают те, которые продуцируются C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипов B-G, и те, которые продуцируются C. baratii и C. butyricum. Указанные нейротоксины обладают высокой активностью и специфичностью и могут отравлять нейроны и другие клетки, в которые они доставляются. Клостридиальные токсины включают некоторые из самых сильнодействующих известных токсинов. Например, ботулинические нейротоксины имеют значения средней летальной дозы (LD50) для мышей в диапазоне от 0,5 до 5 нг/кг в зависимости от серотипа. Как столбнячный, так и ботулинический токсины действуют путем ингибирования функции пораженных нейронов, в частности высвобождения нейротрансмиттеров. В то время как BoNT/A действует на нервно-мышечные соединения и ингибирует холинергическую передачу в периферической нервной системе, столбнячный токсин действует в центральной нервной системе.
В природе, клостридиальные нейротоксины (включая BoNT/A) синтезируются в виде одноцепочечного полипептида, который пост-трансляционно модифицируется в результате протеолитического расщепления с образованием двух полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью. Расщепление происходит в конкретном сайте расщепления, часто называемом сайтом активации, который расположен между цистеиновыми остатками, которые обеспечивают межцепочечную дисульфидную связь. Именно эта двухцепочечная форма является активной формой токсина. Две цепи называются тяжелой цепью (Н-цепью), молекулярная масса которой составляет приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), молекулярная масса которой составляет приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой компонент транслокации (HN домен) и C-концевой таргетирующий компонент (HC домен). Сайт расщепления расположен между компонентами L-цепи и домена транслокации. После связывания HC домена с нейроном-мишенью и интернализации связанного токсина в клетку через эндосому, домен HN транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану в цитозоль, и L-цепь обеспечивает функцию протеазы (также известную как не цитотоксическая протеаза).
Не цитотоксические протеазы действуют путем протеолитического расщепления внутриклеточных транспортных белков, известных как белки SNARE (например, SNAP-25, VAMP или Syntaxin) - см. Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Аббревиатура SNARE происходит от термина «растворимый рецептор прикрепления NSF», где NSF означает фактор, чувствительный к N-этилмалеимиду. Белки SNARE являются неотъемлемой частью слияния внутриклеточных везикул и, таким образом, секреции молекул посредством везикулярного транспорта из клетки. Функция протеазы заключается в цинк-зависимой эндопептидазной активности и проявляет высокую субстратную специфичность в отношении белков SNARE. Соответственно, будучи доставленной в желаемую клетку-мишень, не цитотоксическая протеаза способна ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. Протеазы L-цепи клостридиальных токсинов представляют собой не цитотоксические протеазы, расщепляющие белки SNARE.
Термин «HC домен» означает функционально отличающуюся область тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обеспечивает связывание нейротоксина с рецептором, расположенным на поверхности клетки-мишени. Домен HC состоит из двух структурно различных субдоменов, «субдомена HCN» (N-концевой части домена HC) и «субдомена HCC» (C-концевой части домена HC), каждый из которых имеет молекулярную массу приблизительно 25 кДа.
Термин «домен LHN», используемый в настоящем документе, означает нейротоксин, который лишен домена HC и состоит из домена эндопептидазы («L» или «легкой цепи») и домена, ответственного за транслокацию эндопептидазы в цитоплазму (HN домена тяжелой цепи).
Как обсуждалось выше, клостридиальные токсины образуются из двух полипептидных цепей: тяжелой цепи (Н-цепи), имеющей молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепи (L-цепи), имеющей молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Н-цепь содержит С-концевой таргетный компонент (рецептор-связывающий домен или НС домен) и N-концевой транслокационный компонент (HN домен).
Примеры эталонных последовательностей легкой цепи включают:
Ботулинический нейротоксин типа А: аминокислотные остатки 1-448
Ботулинический нейротоксин типа В: аминокислотные остатки 1-440
Вышеуказанные эталонные последовательности следует рассматривать как руководство, поскольку в зависимости от подсеротипа могут возникать небольшие вариации. Например, в US 2007/0166332 (полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки) цитируются несколько отличающиеся клостридиальные последовательности:
Ботулинический нейротоксин типа А: аминокислотные остатки M1-K448
Ботулинический нейротоксин типа В: аминокислотные остатки M1-K441
Предпочтительным модифицированным BoNT/A является такой, который включает модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277. Такой модифицированный BoNT/A демонстрирует снижение или отсутствие побочных эффектов по сравнению с использованием известного BoNT/A. Повышенные свойства удержания в ткани модифицированного BoNT/A по изобретению также обеспечивают повышенную эффективность и/или продолжительность действия и могут позволить использовать уменьшенные дозы по сравнению с известными терапевтическими средствами на основе клостридиального токсина (или повышенные дозы без каких-либо дополнительных побочных эффектов), тем самым обеспечивая дополнительные преимущества.
Модификация может быть модификацией по сравнению с немодифицированным BoNT/A, показанным как SEQ ID NO: 2, где нумерация аминокислотных остатков определяется путем сопоставления с SEQ ID NO: 2. Поскольку наличие метионинового остатка в положении 1 SEQ ID NO: 2 (а также в SEQ ID NO, соответствующих модифицированным полипептидам BoNT/A, описанным в настоящем документе) является необязательным, специалист в данной области техники примет во внимание наличие/отсутствие метионинового остатка при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, если SEQ ID NO: 2 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, ASN 886 будет представлять собой ASN 886 SEQ ID NO: 2). Альтернативно, если метионин отсутствует в SEQ ID NO: 2, нумерация аминокислотных остатков должна быть изменена на -1 (например, ASN 886 будет представлять собой ASN 885 SEQ ID NO: 2). Аналогичные соображения применимы, когда метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, описанных в настоящем документе, присутствует/отсутствует, и специалист в данной области техники легко определит правильную нумерацию аминокислотных остатков, используя методы, общепринятые в данной области техники.
Аминокислотный(ые) остаток(и), указанные для модификации, представляют собой аминокислотный(ые) остаток(и), экспонированный(ые) на поверхности.
Модифицированный BoNT/A может содержать модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277. Модифицированный BoNT/A может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, на 70% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7 и 9. Например, последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 3, 5, 7 и 9. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в изобретении может кодироваться нуклеиновой кислотой, содержащей (или состоящей из) SEQ ID NO: 3, 5, 7 или 9. Модифицированный BoNT/A может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10. Например, полипептидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности с последовательностью полипептида, выбранной из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для применения в изобретении может содержать (более предпочтительно, состоять из) полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4, 6, 8 и 10.
Термин «один или несколько аминокислотных остатков» при использовании в контексте модифицированного BoNT/A предпочтительно, означает, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 указанных аминокислотных остатков. Таким образом, модифицированный BoNT/A может содержать, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 (предпочтительно, 7) модификаций по указанному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам). Модифицированный BoNT/A может содержать 1-30, 3-20 или 5-10 аминокислотных модификаций. Более предпочтительно, термин «один или несколько аминокислотных остатков» при использовании в контексте модифицированного BoNT/A означает все указанные аминокислотные остатки.
Предпочтительно, помимо одной или нескольких аминокислотных модификаций в указанном(ых) аминокислотном(ых) остатке(ах), модифицированный BoNT/A не содержит каких-либо дополнительных аминокислотных модификаций по сравнению с SEQ ID NO: 2.
Наиболее предпочтительно, модифицированный BoNT/A содержит (более предпочтительно, состоит из) модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 930, SER 955, GLN 991, ASN 1026, ASN 1052 и GLN 1229. Модифицированный BoNT/A может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 3. Например, последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в изобретении может кодироваться нуклеиновой кислотой, содержащей (или состоящей из) SEQ ID NO: 3. Модифицированный BoNT/A может содержать полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности SEQ ID NO: 4. Например, полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 4. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для использования в изобретении может содержать (более предпочтительно, состоять из) SEQ ID NO: 4.
Модификация может быть выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
Модификация, как указано выше, дает модифицированный BoNT/A, который имеет повышенный положительный поверхностный заряд и повышенную изоэлектрическую точку по сравнению с соответствующим не модифицированным BoNT/A.
Изоэлектрическая точка (pI) является специфическим свойством данного белка. Как хорошо известно в данной области техники, белки состоят из определенной последовательности аминокислот (также называемых в белке аминокислотными остатками). Каждая аминокислота из стандартного набора из двадцати имеет другую боковую цепь (или группу R), и это означает, что каждый аминокислотный остаток в белке проявляет различные химические свойства, такие как заряд и гидрофобность. На эти свойства может влиять окружающая химическая среда, такая как температура и рН. Общие химические характеристики белка будут зависеть от суммы этих различных факторов.
Некоторые аминокислотные остатки (подробно описанные ниже) обладают ионизируемыми боковыми цепями, которые могут проявлять электрический заряд в зависимости от окружающего рН. Заряжена такая боковая цепь или нет при данном pH, зависит от pKa соответствующей ионизируемой части, где pKa представляет собой отрицательный логарифм константы диссоциации кислоты (Ka) для обозначенного протона из конъюгированного основания.
Например, кислотные остатки, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, имеют карбоксильные группы боковой цепи со значениями pKa приблизительно 4,1 (точные значения pKa могут зависеть от температуры, ионной силы и микроокружения ионизируемой группы). Таким образом, эти боковые цепи проявляют отрицательный заряд при рН 7,4 (часто называемом «физиологическим рН»). При низких значениях pH эти боковые цепи становятся протонированными и теряют заряд.
Наоборот, основные остатки, такие как лизин и аргинин, имеют азотсодержащие группы боковых цепей со значениями pKa приблизительно 10-12. Таким образом, эти боковые цепи проявляют положительный заряд при рН 7,4. Эти боковые цепи депротонируются и теряют заряд при высоких значениях рН.
Таким образом, общий (суммарный) заряд белковой молекулы зависит от количества кислотных и основных остатков, присутствующих в белке (и степени их экспонирования на поверхности) и от окружающего рН. Изменение окружающего рН изменяет общий заряд белка. Соответственно, для каждого белка существует заданный рН, при котором количество положительных и отрицательных зарядов одинаково, и белок демонстрирует отсутствие общего суммарного заряда. Эта точка известна как изоэлектрическая точка (pI). Изоэлектрическая точка представляет собой стандартное понятие в биохимии белков, с которым должен быть знаком специалист в данной области техники.
Таким образом, изоэлектрическая точка (pI) определяется как значение pH, при котором белок демонстрирует нулевой суммарный заряд. Увеличение pI означает, что для того, чтобы белок имел нулевой суммарный заряд, требуется более высокое значение pH. Таким образом, увеличение pI представляет собой увеличение суммарного положительного заряда белка при данном pH. И наоборот, снижение pI означает, что для того, чтобы белок имел нулевой суммарный заряд, требуется более низкое значение pH. Таким образом, снижение pI представляет собой снижение суммарного положительного заряда белка при данном pH.
Способы определения pI белка известны в данной области техники и должны быть знакомы специалисту в данной области техники. Например, pI белка можно рассчитать из средних значений pKa каждой аминокислоты, присутствующей в белке («расчетная pI»). Такие расчеты можно выполнять с использованием известных в данной области компьютерных программ, таких как Compute pI/MW Tool от ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/), которая является предпочтительным способом расчета pI в соответствии с настоящим изобретением. Сравнение значений pI между различными молекулами следует проводить с использованием одной и той же методики/программы расчета.
При необходимости, расчетная pI белка может быть подтверждена экспериментально с использованием метода изоэлектрического фокусирования («наблюдаемая pI»). Этот метод использует электрофорез для разделения белков в соответствии с их pI. Изоэлектрическое фокусирование обычно проводят с использованием геля с иммобилизованным градиентом рН. Когда приложено электрическое поле, белок мигрирует по градиенту pH до тех пор, пока не достигнет pH, при котором он имеет нулевой суммарный заряд, и эта точка является pI белка. Результаты, полученные с помощью изоэлектрической фокусировки, обычно имеют относительно низкое разрешение по своей природе, и поэтому авторы настоящего изобретения считают, что результаты, полученные с помощью вычисленного значения pI (как описано выше), являются более подходящими для использования.
В настоящем описании «pI» означает «расчетную pI», если не указано иное.
pI белка можно увеличить или уменьшить, изменив количество основных и/или кислотных групп, находящихся на его поверхности. Этого можно достичь путем модификации одной или нескольких аминокислот белка. Например, увеличение pI может быть обеспечено за счет уменьшения количества кислотных остатков или за счет увеличения количества основных остатков.
Модифицированный BoNT/A по изобретению может иметь значение pI, которое, по меньшей мере, на 0,2, 0,4, 0,5 или 1 единиц pI выше, чем у не модифицированного BoNT/A (например, SEQ ID NO: 2). Предпочтительно, модифицированный BoNT/A может иметь pI, по меньшей мере, 6,6, например, по меньшей мере, 6,8.
Свойства 20 стандартных аминокислот указаны в таблице ниже:
Следующие аминокислоты считаются заряженными аминокислотами: аспарагиновая кислота (отрицательная), глутаминовая кислота (отрицательная), аргинин (положительная) и лизин (положительная).
При pH 7,4 боковые цепи аспарагиновой кислоты (pKa 3,1) и глутаминовой кислоты (pKa 4,1) имеют отрицательный заряд, и боковые цепи аргинина (pKa 12,5) и лизина (pKa 10,8) имеют положительный заряд. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота относятся к кислым аминокислотным остаткам. Аргинин и лизин относятся к основным аминокислотным остаткам.
Следующие аминокислоты считаются незаряженными, полярными (то есть могут участвовать в образовании водородных связей) аминокислотами: аспарагин, глутамин, гистидин, серин, треонин, тирозин, цистеин, метионин и триптофан.
Следующие аминокислоты считаются незаряженными, гидрофобными аминокислотами: аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, пролин и глицин.
В аминокислотной вставке дополнительный аминокислотный остаток (который в норме не присутствует) встраивается в полипептидную последовательность BoNT/A, таким образом увеличивая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности. При аминокислотной делеции, аминокислотный остаток удаляется из аминокислотной последовательности клостридиального токсина, тем самым уменьшая общее количество аминокислотных остатков в указанной последовательности.
Предпочтительно, модификация представляет собой замену, при которой в модифицированном BoNT/A предпочтительно, сохраняется такое же количество аминокислотных остатков. При аминокислотной замене, аминокислотный остаток, который является частью полипептидной последовательности BoNT/A, заменяется другим аминокислотным остатком. Заменяющий аминокислотный остаток может представлять собой одну из 20 стандартных аминокислот, как описано выше. Альтернативно, заменяющая аминокислота при замене аминокислоты может быть нестандартной аминокислотой (аминокислотой, которая не является частью стандартного набора из 20, описанного выше). Например, заменяющая аминокислота может представлять собой основную нестандартную аминокислоту, например, L-орнитин, L-2-амино-3-гуанидинопропионовую кислоту или D-изомеры лизина, аргинина и орнитина). Способы введения нестандартных аминокислот в белки известны в данной области техники и включают синтез рекомбинантных белков с использованием ауксотрофных хозяев экспрессии E. coli.
В одном варианте осуществления, замена выбрана из: замены кислого аминокислотного остатка на основной аминокислотный остаток, замены кислого аминокислотного остатка на незаряженный аминокислотный остаток и замены незаряженного аминокислотного остатка на основной аминокислотный остаток. В одном варианте осуществления, где замена представляет собой замену кислого аминокислотного остатка незаряженным аминокислотным остатком, кислый аминокислотный остаток заменяется соответствующим ему незаряженным амидным аминокислотным остатком (т.е. аспарагиновая кислота заменяется аспарагином, и глутаминовая кислота заменяется глутамином).
Предпочтительно, основной аминокислотный остаток представляет собой лизиновый остаток или аргининовый остаток. Другими словами, замена представляет собой замену лизином или аргинином. Наиболее предпочтительно, модификация представляет собой замену лизином.
После модификации в соответствии с изобретением, модифицированный BoNT/A способен связываться с рецепторами клеток-мишеней, с которыми связывается не модифицированный BoNT/A (например, SEQ ID NO: 2).
Модифицированный BoNT/A для применения в изобретении может содержать домен легкой цепи BoNT/A и домен транслокации (домен BoNT/A LHN) и домен BoNT/B HC. Домен BoNT/A LHN ковалентно связан с доменом BoNT/B HC. Указанный модифицированный BoNT/A также упоминается в настоящем документе как «BoNT/AB» или «химера BoNT/AB».
С-концевой аминокислотный остаток домена LHN может соответствовать первому аминокислотному остатку спирали 310, разделяющей домены LHN и HC BoNT/A, и N-концевой аминокислотный остаток домена HC домен может соответствовать второму аминокислотному остатку спирали 310, разделяющей домены LHN и HC в BoNT/B.
Пример последовательности полипептида BoNT/B представлен как SEQ ID NO: 16 (№ доступа UniProt B1INP5).
Ссылка в настоящем документе на «первый аминокислотный остаток спирали 310, разделяющий домены LHN и HC BoNT/A», означает N-концевой остаток спирали 310, разделяющий домены LHN и HC.
Ссылка в настоящем документе на «второй аминокислотный остаток спирали 310, разделяющий домены LHN и HC BoNT/В», означает аминокислотный после N-концевого остатка спирали 310, разделяющий домены LHN и HC.
«Спираль 310» представляет собой тип вторичной структуры, встречающийся в белках и полипептидах, наряду с α-спиралями, β-листами и обратными витками. Аминокислоты в спирали 310 располагаются в правозакрученной спиральной структуре, где каждый полный оборот завершается тремя остатками и десятью атомами, разделяющими внутримолекулярную водородную связь между ними. Каждая аминокислота соответствует повороту спирали на 120° (т. е. спираль имеет три остатка на виток) и смещению на 2,0Å (= 0,2 нм) вдоль оси спирали и имеет 10 атомов в кольце, образованном путем образования водородной связи. Наиболее важно, что группа N-H аминокислоты образует водородную связь с группой C=O аминокислоты на три остатка раньше; эта повторяющаяся водородная связь i+3 → i определяет спираль 310. Спираль 310 является стандартной концепцией в структурной биологии, с которой знаком специалист в данной области техники.
Эта спираль 310 соответствует четырем остаткам, которые образуют настоящую спираль, и двум кэп-(или переходным) остаткам, по одному на каждом конце этих четырех остатков. Используемый в настоящем документе термин «спираль 310, разделяющая домены LHN и HC», состоит из этих 6 остатков.
Путем проведения структурных анализов и выравнивания последовательностей была идентифицирована спираль 310, разделяющая домены LHN и HC. Эта спираль 310 окружена α-спиралью на своем N-конце (т. е. в С-концевой части домена LHN) и β-спиралью на своем С-конце (т. е. в N-концевой части домена HC). Первый (N-концевой) остаток (кэп или переходный остаток) спирали 310 также соответствует С-концевому остатку этой α-спирали.
Спираль 310, разделяющая домены LHN и HC, может быть, например, определена из общедоступных кристаллических структур ботулинических нейротоксинов, например, 3BTA (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3BTA) и 1EPW (http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1EPW) для ботулинических нейротоксинов A1 и B1, соответственно.
Моделирование in silico также можно использовать для определения местоположения спирали 310, разделяющей домены LHN и HC в других нейротоксинах, например, серверы моделирования гомологии LOOPP (Learning, Observing and Outputting Protein Patterns, http://loopp.org), PHYRE (Protein Homology/AnalogY Recognition Engine, http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/) и Rosetta (https://www.rosettacommons.org/), сервер слвмещения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/), программу выравнивания Clustal Omega (http://www.clustal.org/omega/) и ряд других инструментов/услуг, перечисленных на Интернет-ресурсах для молекулярных и клеточных биологов (http://molbiol-tools.ca/). В частности, область вокруг соединения «HN/HCN» является структурно высококонсервативной, что делает ее идеальной областью для совмещения различных серотипов.
Например, для определения последовательности этой спирали 310 в других нейротоксинах используют следующую методологию:
1. Инструмент моделирования структурной гомологии LOOP (http://loopp.org) используют для получения спрогнозированной структуры других серотипов BoNT на основе кристаллической структуры BoNT/A1 (3BTA.pdb);
2. Структурные (pdb) файлы, полученные таким образом, редактируют для включения только N-конца домена HCN и примерно 80 остатков перед ним (которые являются частью домена HN), тем самым сохранив «HN/HCN» область, которая является структурно высококонсервативной;
3. Сервер совмещения белков SuperPose (http://wishart.biology.ualberta.ca/superpose/) используют для совмещения каждого серотипа на структуру 3BTA.pdb;
4. Совмещенные файлы pdb проверяют, чтобы определить местонахождение спирали 310 в начале домена HC BoNT/A1, и затем идентифицируют соответствующие остатки в другом серотипе.
5. Последовательности других серотипов BoNT выравнивают с Clustal Omega, чтобы проверить правильность соответствующих остатков.
Примеры доменов LHN, HC и 310 спирали, определенных этим способом, представлены ниже:
С помощью структурного анализа и выравнивания последовательностей было обнаружено, что β-цепь, следующая за спиралью 310, разделяющей домены LHN и HC, является консервативной структурой во всех ботулинических и столбнячных нейротоксинах и начинается с 8 остатка, если начинать с первого остатка спирали 310, разделяющей домены LHN и HC (например, остаток 879 для BoNT/A1).
Химера BoNT/AB может содержать домен LHN из BoNT/A, ковалентно связанный с доменом HC из BoNT/B,
• где С-концевой аминокислотный остаток домена LHN соответствует восьмому аминокислотному остатку на N-конце β-цепи, расположенной в начале (N-конце) домена HC BoNT/A, и
• где N-концевой аминокислотный остаток домена HC соответствует седьмому аминокислотному остатку на N-конце β-цепи, расположенной в начале (N-конце) домена HC BoNT/B.
Химера BoNT/AB может содержать домен LHN из BoNT/A, ковалентно связанный с доменом HC из BoNT/B,
• где С-концевой аминокислотный остаток домена LHN соответствует С-концевому аминокислотному остатку α-спирали, расположенному на конце (С-конце) домена LHN BoNT/A, и
• где N-концевой аминокислотный остаток домена HC соответствует аминокислотному остатку, непосредственно расположенному на С-конце по отношению к С-концевому аминокислотному остатку α-спирали, расположенному на конце (С-конце) домена LHN BoNT/В.
Смысл процесса проектирования химеры BoNT/AB состоит в том, чтобы попытаться гарантировать, что вторичная структура не будет нарушена, и тем самым свести к минимуму любые изменения третичной структуры и функции каждого домена. Не желая быть связанными какой-либо теорией, предполагается, что отсутствие разрушения четырех центральных аминокислотных остатков спирали 310 в химере BoNT/AB обеспечивает оптимальную конформацию химерного нейротоксина, тем самым позволяя химерному нейротоксину проявлять свои функции на полную мощность.
На самом деле, как ни удивительно, сохранение только первого аминокислотного остатка спирали 310 BoNT/A и второго аминокислотного остатка спирали 310 начиная с BoNT/B не только позволяет производить растворимые и функциональные химеры BoNT/AB, но также приводит к улучшенным свойствам по сравнению с другими химерами BoNT/AB, в частности к повышенной активности, повышенному коэффициенту безопасности и/или большей продолжительности действия (и к повышенному коэффициенту безопасности и/или продолжительности действия по сравнению с немодифицированным BoNT/А).
Домен LHN из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам с 1 по 872 SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности. Домен LHN из BoNT/A может соответствовать аминокислотным остаткам с 1 по 872 SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80%, 90% или 95% идентичность последовательности. Предпочтительно, домен LHN из BoNT/A соответствует аминокислотным остаткам с 1 по 872 SEQ ID NO: 2.
Домен НС из BoNT/В может соответствовать аминокислотным остаткам с 860 по 1291 SEQ ID NO: 16 или полипептидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности. Домен НС из BoNT/В может соответствовать аминокислотным остаткам с 860 по 1291 SEQ ID NO: 16 или полипептидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 80%, 90% или 95% идентичности последовательности. Предпочтительно, домен НС из BoNT/В соответствует аминокислотным остаткам с 860 по 1291 SEQ ID NO: 16.
Предпочтительно, химера BoNT/AB содержит домен LHN из BoNT/A1 и домен НС из BoNT/В1. Более предпочтительно, домен LHN соответствует аминокислотным остаткам с 1 по 872 BoNT/A1 (SEQ ID NO: 2), и домен НС соответствует аминокислотным остаткам с 860 по 1291 BoNT/B1 (SEQ ID NO: 16).
Предпочтительно, домен НС из BoNT/В дополнительно содержит замену, добавление или делецию, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в субдомене HCC, что приводит к увеличению аффинности связывания нейротоксина BoNT/B с Syt II человека по сравнению с природной последовательностью BoNT/B. Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотных остатков в субдомене HCC BoNT/B описаны в WO 2013/180799 и WO 2016/154534 (оба включены в настоящий документ посредством ссылки).
Подходящие замены, добавления или делеции аминокислотных остатков в субдомене HCC BoNT/B включают заменяющие мутации, выбранные из группы, состоящей из: V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинации.
Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотных остатков в субдомене HCC BoNT/B дополнительно включает комбинации двух заменяющих мутаций, выбранных из группы, состоящей из: E1191M и S1199L, E1191M и S1199Y, E1191M и S1199F, E1191Q и S1199L, E1191Q и S1199Y, E1191Q и S1199F, E1191M и S1199W, E1191M и W1178Q, E1191C и S1199W, E1191C и S1199Y, E1191C и W1178Q, E1191Q и S1199W, E1191V и S1199W, E1191V и S1199Y или E1191V и W1178Q.
Подходящая замена, добавление или делеция аминокислотных остатков в субдомене HCC BoNT/B также включает комбинацию трех заменяющих мутаций, которые представляют собой E1191M, S1199W и W1178Q.
Предпочтительно, подходящая замена, добавление или делеция аминокислотного остатка в субдомене HCC BoNT/B включает комбинацию двух замещающих мутаций, которые представляют собой E1191M и S1199Y. Такие модификации присутствуют в химерах BoNT/AB SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14.
Модификация может быть модификацией по сравнению с не модифицированным BoNT/B, показанным как SEQ ID NO: 16, где нумерация аминокислотных остатков определяется путем сопоставления с SEQ ID NO: 16. Поскольку наличие метионинового остатка в положении 1 SEQ ID NO: 16 (а также SEQ ID NO, соответствующих модифицированным полипептидам BoNT/A, описанным в настоящем документе) является необязательным, специалист в данной области техники примет во внимание наличие/отсутствие метионинового остатка при определении нумерации аминокислотных остатков. Например, если SEQ ID NO: 16 включает метионин, нумерация положений будет такой, как определено выше (например, E1191 будет представлять собой E1191 в SEQ ID NO: 16). Альтернативно, если метионин отсутствует в SEQ ID NO: 16, нумерация аминокислотных остатков должна быть изменена на -1 (например, E1191 будет представлять собой E1190 в SEQ ID NO: 16). Аналогичные соображения применимы, когда метионин в положении 1 других полипептидных последовательностей, описанных в настоящем документе, присутствует/отсутствует, и специалист в данной области техники легко определит правильную нумерацию аминокислотных остатков, используя методы, общепринятые в данной области техники.
Модифицированный BoNT/A для применения в изобретении может содержать полипептидную последовательность, по меньшей мере, на 70% идентичную полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11-15. Например, полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности с полипептидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 11-15. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для применения в изобретении может содержать (более предпочтительно, состоять из) полипептидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 11-15.
Когда модифицированный BoNT/A представляет собой химеру BoNT/AB, предпочтительно, чтобы модифицированный BoNT/A содержал полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. Например, полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% или 99,9% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14. Предпочтительно, модифицированный BoNT/A для применения в изобретении может содержать (более предпочтительно, состоять из) SEQ ID NO: 14.
Способы модификации белков путем замены, вставки или делеции аминокислотных остатков известны в данной области техники. Например, аминокислотные модификации могут быть введены путем модификации последовательности ДНК, кодирующей BoNT/A (например, кодирующей не модифицированный BoNT/A). Этого можно достичь с помощью стандартных методов молекулярного клонирования, например, путем направленного мутагенеза, при котором короткие нити ДНК (олигонуклеотиды), кодирующие желаемую(ые) аминокислоту(ы), используются для замены исходной кодирующей последовательности с использованием фермента полимеразы, или путем вставки/делеции частей гена различными ферментами (например, лигазами и эндонуклеазами рестрикции). Альтернативно, модифицированную последовательность гена можно синтезировать химическим путем.
Как обсуждалось выше, модифицированный BoNT/A, описанный в настоящем документе, обладает повышенными свойствами удержания в ткани, что также обеспечивает повышенную эффективность и/или продолжительность действия и позволяет увеличить дозировку без каких-либо дополнительных отрицательных эффектов. Одним из способов определения этих преимущественных свойств является коэффициент безопасности модифицированного BoNT/A. В связи с этим нежелательные эффекты клостридиального токсина (вызванные диффузией токсина от места введения) можно оценить экспериментально путем измерения доли потери массы тела на соответствующей животной модели (например, на мышах, у которых потеря массы тела обнаруживается в течение семи дней введения). И наоборот, желаемые целевые эффекты клостридиального токсина могут быть оценены экспериментально с помощью анализа оценки отведения пальцев (DAS), измерения мышечного паралича. Анализ DAS может быть выполнен путем инъекции 20 мкл клостридиального токсина, приготовленного в желатин-фосфатном буфере, в комплекс икроножной/камбаловидной мышцы мыши с последующей оценкой показателя отведения пальца с использованием метода Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001). В анализе DAS мышей ненадолго подвешивают за хвост, чтобы вызвать характерную реакцию испуга, при которой мышь вытягивает задние конечности и отводит пальцы задних конечностей. После инъекции клостридиального токсина различные степени отведения пальцев оценивают по пятибалльной шкале (от 0=норма до 4=максимальное уменьшение отведения пальцев и разгибания ног).
Коэффициент безопасности модифицированного BoNT/A по изобретению (или не модифицированного BoNT/A для сравнения) может быть выражен как отношение количества токсина, необходимого для снижения массы тела на 10% (измерено при пиковом эффекте в течение первого через семь дней после введения дозы мышам) и количества токсина, необходимого для оценки DAS, равной 2. Таким образом, желательны высокие оценки коэффициента безопасности, которые указывают на токсин, способный эффективно парализовать мышцу-мишень с небольшими нежелательными побочными эффектами. Модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности, который выше, чем коэффициент безопасности эквивалентного не модифицированного (нативного) BoNT/A.
Таким образом, в одном варианте осуществления, модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности, превышающий 7 (например, по меньшей мере, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50), где коэффициент безопасности рассчитывается как: доза токсина, необходимая для изменения массы тела на -10% (пг/мышь), деленная на DAS ED50 (пг/мышь) [ED50=доза, необходимая для получения оценки DAS, равной 2].
В одном варианте осуществления, модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности, по меньшей мере, 10. В одном варианте осуществления, модифицированный BoNT/A по настоящему изобретению имеет коэффициент безопасности, по меньшей мере, 15.
Предпочтительно, когда модифицированный BoNT/A содержит один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1052, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, как описано в настоящем документе, указанный модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности, по меньшей мере, 20, более предпочтительно, по меньшей мере, 22 (например, 23-25).
Предпочтительно, когда модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и HC домен BoNT/B, модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности, по меньшей мере, 10, более предпочтительно, по меньшей мере, 12 (например, 14-15).
При использовании, модифицированный BoNT/A по изобретению находится в двухцепочечной форме.
Модифицированный BoNT/A, предпочтительно, находится не в форме комплекса (т.е. свободен от комплексообразующих белков, которые присутствуют в природном BoNT/A). Примеры таких комплексообразующих белков включают нейротоксин-ассоциированные белки (NAP) и нетоксичный негемагглютининовый компонент (NTNH). Предпочтительно, чтобы модифицированный BoNT/A представлял собой рекомбинантный модифицированный BoNT/A.
Модифицированный BoNT/A может быть получен способом получения одноцепочечного модифицированного BoNT/A, имеющего легкую цепь и тяжелую цепь, где способ включает экспрессию нуклеиновой кислоты (указанная нуклеиновая кислота является такой, как описано выше) в подходящей клетке-хозяине, лизис клетки-хозяина с получением гомогената клетки-хозяина, содержащего одноцепочечный модифицированный BoNT/A, и выделение одноцепочечного модифицированного BoNT/A. Затем модифицированный BoNT/A можно активировать способом, включающим получение одноцепочечного модифицированного белка BoNT/A, который можно получить способом получения одноцепочечного модифицированного BoNT/A, как описано выше, при контакте модифицированного BoNT/A с протеазой, которая расщепляет полипептид в сайте распознавания (сайте расщепления), расположенном между легкой цепью и тяжелой цепью, тем самым превращая полипептид в двухцепочечный модифицированный BoNT/A, где легкая цепь и тяжелая цепь соединены вместе дисульфидной связью.
Модифицированный BoNT/A по изобретению может быть составлен любым подходящим способом для введения субъекту, например, как часть фармацевтической композиции. Таким образом, в одном аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую модифицированный BoNT/A по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль.
В одном аспекте, изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 5,3 до 948 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: 886, 905, 915, 918, 920, 930, 954, 955, 991, 992, 995, 1006, 1025, 1026, 1032, 1043, 1046, 1052, 1058, 1064, 1080, 1081, 1083, 1086, 1188, 1213, 1215, 1216, 1229, 1242, 1243, 1274 и 1277, по сравнению с не модифицированным BoNT/A, показанным как SEQ ID NO: 2, где нумерация аминокислотных остатков определена путем выравнивания с SEQ ID NO: 2, и где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции аминокислотного остатка, экспонированного на кислой поверхности.
В одном аспекте, изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 53 единиц до 948 единиц модифицированного BoNT/А, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/А, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 450 до 8000 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Стандартная дозированная форма может содержать от 53 до 948 единиц модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 925, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 889 единиц. Нижний предел указанного диапазона может составлять 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 59 единиц. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 59 до 889 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 200 до 600 единиц.
Стандартная дозированная форма может содержать от 450 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 7750, 7500, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000 или 1000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 7500 пг. Нижний предел указанного диапазона может составлять 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 или 7000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 500 пг. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 500 пг до 7500 пг модифицированного BoNT/A, например, от 4000 пг до 6000 пг.
В другом аспекте, изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 750 до 17000 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Стандартная дозированная форма может содержать от 31 до 707 единиц модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 или 100 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 666 единиц. Нижний предел указанного диапазона может составлять 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 единиц модифицированного BoNT/А, предпочтительно, нижний предел составляет 42 единицы. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 42 до 666 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 200 до 400 единиц.
Стандартная дозированная форма может содержать от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 16500, 15500, 14500, 13500, 12500, 11500, 10500, 9500, 8500, 7500, 6500, 5500, 4500, 3500, 2500, 5000 пг модифицированного BoNT/А, предпочтительно, верхний предел составляет 16000 пг. Нижний предел указанного диапазона может составлять 750, 850, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 1000 пг. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 1000 пг до 16000 пг модифицированного BoNT/A, например, от 4000 пг до 6000 пг.
Как обсуждалось ранее, стандартная доза для применения в педиатрии может составлять 50% или меньше указанной выше. В некоторых вариантах осуществления, стандартная доза обычно составляет 70% или менее (например, 67% или менее), чем доза, используемая при лечении спастичности конечностей у взрослых.
В одном аспекте изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 225 пг до 4000 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков, выбранных из: ASN 886, ASN 905, GLN 915, ASN 918, GLU 920, ASN 930, ASN 954, SER 955, GLN 991, GLU 992, GLN 995, ASN 1006, ASN 1025, ASN 1026, ASN 1032, ASN 1043, ASN 1046, ASN 1052, ASP 1058, HIS 1064, ASN 1080, GLU 1081, GLU 1083, ASP 1086, ASN 1188, ASP 1213, GLY 1215, ASN 1216, GLN 1229, ASN 1242, ASN 1243, SER 1274 и THR 1277, где модификация выбрана из:
i. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
ii. замены кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, незаряженным аминокислотным остатком;
iii. замены незаряженного аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности, основным аминокислотным остатком;
iv. вставки основного аминокислотного остатка; и
v. делеции кислого аминокислотного остатка, экспонированного на поверхности.
В другом аспекте, изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 26,5 единиц до 474 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 225 пг до 4000 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Стандартная дозированная форма может содержать от 26,5 до 474 единиц модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 425, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 444,5 единицы. Нижний предел указанного диапазона может составлять 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 29,5 единиц. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 29,5 до 444,5 единицы модифицированного BoNT/A, например, от 100 до 300 единиц.
Стандартная дозированная форма может содержать от 225 пг до 4000 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 3750, 3500, 3000, 2000, 1000, 4000 или 500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 3750 пг. Нижний предел указанного диапазона может составлять 225, 250, 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 или 3500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 250 пг. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 250 пг до 3750 пг модифицированного BoNT/A, например, от 2000 пг до 3000 пг.
В другом аспекте, изобретение предлагает стандартную дозированную форму модифицированного ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), где стандартная дозированная форма содержит:
а. от 15,5 единиц до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A, где 1 единица представляет собой количество модифицированного BoNT/A, соответствующее расчетной средней летальной дозе (LD50) у мышей; или
b. от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A; и
с. необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль,
где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
Стандартная дозированная форма может содержать от 15,5 до 353,5 единиц модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 333 единицы. Нижний предел указанного диапазона может составлять 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 единиц модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 21 единицу. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 21 до 33 единиц модифицированного BoNT/A, например, от 200 до 400 единиц.
Стандартная дозированная форма может содержать от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A. Верхний предел указанного диапазона может составлять 7500, 7000, 6500, 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000 или 500 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, верхний предел составляет 8000 стр. Нижний предел указанного диапазона может составлять 450, 550, 650, 750, 850, 950, 1000, 1500, 2000, 2500 или 3000 пг модифицированного BoNT/A, предпочтительно, нижний предел составляет 500 пг. Предпочтительно, стандартная дозированная форма содержит от 500 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A, например, от 2000 пг до 4000 пг.
В другом аспекте, изобретение предлагает набор, содержащий:
а. стандартную дозированную форму по настоящему изобретению; и
b. инструкции по их применению при лечении спастичности конечностей; и
с. необязательно, разбавитель.
Варианты осуществления, относящиеся к различным терапевтическим применениям изобретения, могут применяться к способам, композициям (например, стандартным дозированным формам) и наборам по изобретению и наоборот.
ГОМОЛОГИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Для определения доли идентичности можно использовать любой из множества способов выравнивания последовательностей, включая, без ограничения, глобальные методы, локальные методы и гибридные методы, такие как, например, методы сегментного подхода. Протоколы для определения доли идентичности представляют собой рутинные процедуры, доступные специалисту в данной области техники. Глобальные методы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют наилучшее выравнивание путем суммирования оценок отдельных пар остатков и наложения штрафов за гэпы. Неограничивающие способы включают, например, CLUSTAL W, см., например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и итеративное уточнение, см., например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996). Локальные способы выравнивают последовательности, идентифицируя один или несколько консервативных мотивов, общих для всех входных последовательностей. Неограничивающие способы включают, например, Match-box, см., например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); сэмплирование Гиббса, см., например, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, см., например, Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
Таким образом, долю идентичности последовательности определяют обычными способами. См., например, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Коротко, две аминокислотные последовательности выравнивают для оптимизации показателей выравнивания с использованием штрафа за открытие гэпа, равного 10, штрафа за удлинение гэпа, равного 1, и матрицы оценки "blosum 62" Henikoff and Henikoff (там же), как показано ниже (аминокислоты обозначены стандартными однобуквенными кодами).
«Доля идентичности последовательности» между двумя или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей. Таким образом, % идентичности можно рассчитать как количество идентичных нуклеотидов/аминокислот, деленное на общее количество нуклеотидов/аминокислот, умноженное на 100. При расчетах % идентичности последовательности также можно учитывать количество гэпов и длину каждого гэпа, который необходимо ввести для оптимизации выравнивания двух или нескольких последовательностей. Сравнение последовательностей и определение доли идентичности между двумя или несколькими последовательностями можно проводить с использованием конкретных математических алгоритмов, таких как BLAST, которые знакомы специалисту в данной области техники.
ОЦЕНКИ ВЫРАВНИВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИДЕНТИЧНОСТИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Затем доля идентичности рассчитывается как:
По существу гомологичные полипептиды характеризуются наличием одной или нескольких аминокислотных замен, делеций или добавлений. Эти изменения, предпочтительно, носят незначительный характер, то есть замены консервативных аминокислот (см. ниже) и другие замены, которые существенно не влияют на укладку или активность полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до примерно 30 аминокислот; и небольшие удлинения на амино или карбоксильных концах, такие как амино-концевой остаток метионина, небольшой линкерный пептид, состоящий примерно из 20-25 остатков, или аффинная метка.
КОНСЕРВАТИВНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ЗАМЕНЫ
лизин
гистидин
аспарагиновая кислота
аспарагин
изолейцин
валин
триптофан
тирозин
аланин
серин
треонин
метионин
В дополнение к 20 стандартным аминокислотам, нестандартные аминокислоты (такие как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и α-метилсерин) могут использоваться вместо аминокислотных остатков полипептидов по настоящему изобретению. Ограниченное количество не консервативных аминокислот, аминокислот, не кодируемых генетическим кодом, и аминокислот неприродного происхождения могут использоваться вместо аминокислотных остатков полипептида. Полипептиды по настоящему изобретению могут также содержать не встречающиеся в природе аминокислотные остатки.
Не встречающиеся в природе аминокислоты включают, без ограничений, транс-3-метилпролин, 2,4-метанопролин, цис-4-гидроксипролин, транс-4-гидроксипролин, N-метилглицин, аллотреонин, метилтреонин, гидроксиэтилцистеин, гидроксиэтилгомоцистеин, нитроглутамин, гомоглутамин, пипеколиновую кислоту, трет-лейцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-азафенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-фторфенилаланин. В данной области техники известно несколько способов включения аминокислотных остатков неприродного происхождения в белки. Например, можно использовать систему in vitro, в которой нонсенс-мутации подавляют с помощью химически аминоацилированных супрессорных тРНК. Способы синтеза аминокислот и аминоацилирования тРНК известны в данной области техники. Транскрипцию и трансляцию плазмид, содержащих нонсенс-мутации, проводят в бесклеточной системе, включающей экстракт E. coli S30 и коммерчески доступные ферменты и другие реагенты. Белки очищают хроматографией. См., например, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; and Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). Во втором способе трансляцию осуществляют в ооцитах Xenopus путем микроинъекции мутантной мРНК и химически аминоацилированных супрессорных тРНК (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). В рамках третьего способа, клетки E. coli культивируют в отсутствие природной аминокислоты, подлежащей замене (например, фенилаланина), и в присутствии желаемой(ых) не встречающейся(их) в природе аминокислоты (например, 2-азафенилаланина, 3-азафенилаланина, 4-азафенилаланина или 4-фторфенилаланина). Не встречающаяся в природе аминокислота включена в полипептид вместо ее природного аналога. См. Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Встречающиеся в природе аминокислотные остатки могут быть превращены в не встречающиеся в природе виды посредством химической модификации in vitro. Химическую модификацию можно комбинировать с сайт-направленным мутагенезом для дальнейшего расширения диапазона замен (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
Ограниченное количество не консервативных аминокислот, аминокислот, не кодируемых генетическим кодом, не существующих в природе аминокислот и аминокислот неприродного происхождения могут использоваться вместо аминокислотных остатков полипептидов по настоящему изобретению.
Незаменимые аминокислоты в полипептидах по настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с методами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Сайты биологического взаимодействия также можно определить с помощью физического анализа структуры, определяемого такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого сайта контакта. См., например, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот также может быть установлена на основании анализа гомологии с родственными компонентами (например, транслокационными или протеазными компонентами) полипептидов по настоящему изобретению.
Множественные аминокислотные замены могут быть сделаны и протестированы с использованием известных способов мутагенеза и скрининга, таких как описаны Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988) или Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Коротко, эти авторы описывают способы одновременной рандомизации двух или более положений в полипептиде, селекции функционального полипептида и последующего секвенирования мутагенизированных полипептидов для определения спектра допустимых замен в каждом положении. Другие способы, которые могут быть использованы, включают фаговый дисплей (например, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., патент США № 5,223,409; Huse, публикация ВОИС WO 92/06204) и мутагенез, целенаправленно воздействующий на область (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится данное описание. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) предоставляют специалисту в данной области техники общий словарь многих терминов, используемых в этом описании.
Это описание не ограничивается типовыми способами и материалами, описанными в настоящем документе, и любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике или при тестировании вариантов осуществления этого описания. Числовые диапазоны являются включительными для чисел, определяющих диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновых кислот записываются слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записываются слева направо в ориентации от амино к карбокси, соответственно.
Представленные в настоящем документе заголовки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего описания.
Аминокислоты упоминаются в настоящем документе с использованием названия аминокислоты, трехбуквенной аббревиатуры или однобуквенной аббревиатуры. Используемый в настоящем документе термин «белок» включает белки, полипептиды и пептиды. Используемый в настоящем документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «пептид». В некоторых случаях, термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «фермент». Термины «белок» и «полипептид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В настоящем описании и формуле изобретения могут использоваться обычные однобуквенные и трехбуквенные коды аминокислотных остатков. 3-буквенный код аминокислот определен в соответствии с IUPACIUB Объединенной комиссией по биохимической номенклатуре (JCBN). Также понятно, что полипептид может кодироваться более чем одной нуклеотидной последовательностью из-за вырожденности генетического кода.
В описании могут встречаться другие определения терминов. Перед более подробным описанием типовых вариантов осуществления следует понимать, что это описание не ограничено конкретными описанными вариантами осуществления и, как таковое, может варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего описания будет определяться только прилагаемой формулой изобретения.
Когда представлен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение с точностью до десятой доли единицы нижнего предела, если контекст явно не указывает иное, между верхним и нижним пределами этого диапазона, конкретно описывается. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне, охватывается данным описанием. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в диапазон или исключаться из него, и каждый диапазон, в котором любой из этих пределов, ни один из них или оба предела не включены в меньшие диапазоны, также охватывается настоящим описанием с учетом любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в данное описание.
Следует отметить, что используемые в настоящем документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа «a», «an» и «the» включают ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на «ботулинический нейротоксин А» включает множество таких агентов-кандидатов, и ссылка на «ботулинический нейротоксин А» включает ссылку на один или несколько клостридиальных нейротоксинов и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и так далее.
Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, предоставлены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как допущение того, что такие публикации составляют предшествующий уровень техники для прилагаемой формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Далее будут описаны варианты осуществления изобретения, только в качестве примера, со ссылкой на следующие фигуры и примеры.
На фигуре 1 показаны пять наиболее распространенных клинических моделей спастичности верхних конечностей с участием суставов плеча.
На фигуре 2 показаны одобренные FDA дозы Dysport® для лечения спастичности у взрослых.
На фигуре 3 показан гель изоэлектрической фокусировки (IEF) катионных конструкций.
На фигуре 4 показана доля расщепления SNAP-25 в эмбриональных нейронах спинного мозга крысы (eSCN) для Cat5v2(K1064H/N954K) (A), Cat5v2(K1064H/N886K) (B) и Cat5v2(K1064H/N1025K) (C), и сводка pEC50 по сравнению с nBoNT/A1. (A, B, C) Эмбриональные нейроны спинного мозга крыс культивируют в течение трех недель и обрабатывают Cat5v4 в течение 24 часов перед вестерн-блоттингом с использованием специфического антитела SNAP-25. Данные представляют собой среднее значение ± СОС по трем независимым экспериментам в трех повторах. (D) Относительная эффективность Cat5v2(K1064H/N886K), Cat5v2(K1064H/N954K) и Cat5v2(K1064H/N1025K) по отношению к nBoNT/A1 (List Biological Laboratories) в анализе эффективности расщепления eSCN SNAP-25 на крысах. Каждая точка соответствует отдельной партии и представляет собой среднее значение 3 независимых определений pEC50 на основе 8-точечной кривой концентрация-ответ (CRC). Каждую концентрацию в CRC оценивают в трех повторах. Сравнение эффективности проводят со средним значением партий List, объединенные данные n=24. Данные представляют собой среднее значение ± СОС для n=3 партий на Cat5v4.
На фигуре 5 показана активность (t50) nBoNT/A1 и Cat5v4 в анализе полудиафрагмы диафрагмального нерва мыши (mPNHD). Ткань полудиафрагмы диафрагмального нерва мыши инкубируют с Cat5v4 или нативным BoNT/A1, как указано. Сократительную силу диафрагмы регистрируют до тех пор, пока сокращение не перестает обнаруживаться, или через 140 минут. Каждая точка соответствует независимым определениям. Значение t50 представляет собой время, необходимое для ингибирования сократительной силы полудиафрагмы мыши на 50%.
На фигуре 6 показан SDS-PAGE очищенной рекомбинантной химеры BoNT/AB 1, 2 и 3A (SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно). Дорожки помечены как «Маркер» (маркер молекулярной массы), «-DTT» (образец окисленной химеры BoNT/AB) и «+DTT» (образец восстановленной химеры BoNT/AB).
На фигуре 7 показано расщепление SNAP-25 в нейронах спинного мозга крыс рекомбинантными химерами BoNT/AB 1, 2 и 3A (SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно). Культивируемые первичные нейроны спинного мозга крыс (SCN) подвергают воздействию различных концентраций рекомбинантной химеры BoNT/AB 1, 2 или 3A в течение 24 часов при 37°C во влажной атмосфере с 10% CO2. Затем клетки лизируют 1x буфером NuPAGE, дополненным DTT и бензоназой. Образцы переносят в микроцентрифужные пробирки, нагревают в течение 5 мин при 90°С на термоблоке и хранят при -20°С перед анализом расщепления SNAP-25 вестерн-блоттингом. SNAP-25 обнаруживают с использованием поликлонального антитела, которое обнаруживает как полноразмерные, так и расщепленные формы SNAP-25 (Sigma #S9684). В качестве вторичного антитела используют анти-кроличью HRP (Sigma #A6154).
На фигуре 8 показан анализ оценки отведения пальцев мыши. Мышей инъецируют в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса одной задней конечности под кратковременной общей анестезией; ослабление мышц измеряют по шкале от 0 до 4 с использованием шкалы отведения пальцев (DAS). Максимальные значения DAS определяют для каждой дозы и наносят на график зависимости от дозы, и данные подгоняют к 4-параметрическому логистическому уравнению, определяют значения ED50 и дозы, приводящие к DAS 4 (доза DAS 4).
На фигуре 9 показан SDS-PAGE очищенной рекомбинантной химеры BoNT/AB 3B и 3C (SEQ ID NO: 14 и 15, соответственно). Дорожки помечены как «Маркер» (маркер молекулярной массы), «-DTT» (образец окисленной химеры BoNT/AB) и «+DTT» (образец восстановленной химеры BoNT/AB).
На фигуре 10 показано расщепление SNAP-25 не модифицированными химерами BoNT/A и BoNT/AB 3B и 3C (SEQ ID NO: 2, 14 и 15, соответственно) в периферических нейронах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (PERI.4U - Axiogenesis, Germany). Клетки PERI.4U подвергают воздействию различных концентраций рекомбинантного BoNT/A или химеры BoNT/AB 3B или 3C в течение 24 часов при 37°C во влажной атмосфере CO2, содержащей 5% CO2. Затем клетки лизируют 1x буфером NuPAGE, дополненным DTT и бензоназой. Образцы переносят в микроцентрифужные пробирки, нагревают в течение 5 мин при 90°С на термоблоке и хранят при -20°С перед анализом расщепления SNAP-25 вестерн-блоттингом. SNAP-25 обнаруживают с использованием поликлонального антитела, которое обнаруживает как полноразмерные, так и расщепленные формы SNAP-25 (Sigma #S9684). В качестве вторичного антитела используют анти-кроличью HRP (Sigma #A6154).
На фигуре 11 показана продолжительность ослабления мышц с течением времени в анализе оценки отведения пальцев мыши. Мышей инъецируют в мышцы икроножно-камбаловидного комплекса одной задней конечности под кратковременной общей анестезией; ослабление мышц измеряют по шкале от 0 до 4 с использованием шкалы отведения пальцев (DAS). За животными в группе, которой вводят самую низкую дозу, вызывающую в течение первых четырех дней инъекции DAS 4, наблюдают до полного восстановления мышечной слабости до DAS 0 (отсутствие наблюдаемой мышечной слабости).
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Если начальный аминокислотный остаток Met или соответствующий начальный кодон указаны в любой из следующих SEQ ID NO, указанный остаток/кодон является необязательным.
SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность не модифицированного BoNT/A)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 2 (полипептидная последовательность не модифицированного BoNT/A)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 3 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-A»)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAAGCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCcGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 4 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-A»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESKHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 5 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-B»)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACaAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAaTCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAAGAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 6 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-B»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFKKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 7 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-C»)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTGGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAAGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCAAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAATTGCTGATATTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCAATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATTGATCTGAGCCGTTATGCTAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAAGGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAAGATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCAAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAAGAAGAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAAGATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGAATAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTGATGTCGGTAATCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACAAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACAACAATGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCAGCAGCCGTACTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 8 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-C»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKKAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNKISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTKEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLKKSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNKIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDKGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 9 (нуклеотидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-D»)
ATGCCATTCGTCAACAAGCAATTCAACTACAAAGACCCAGTCAACGGCGTCGACATCGCATACATCAAGATTCCGAACGCCGGTCAAATGCAGCCGGTTAAGGCTTTTAAGATCCACAACAAGATTTGGGTTATCCCGGAGCGTGACACCTTCACGAACCCGGAAGAAGGCGATCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAGCAAGTCCCTGTCAGCTACTACGATTCGACGTACCTGAGCACGGATAACGAAAAAGATAACTACCTGAAAGGTGTGACCAAGCTGTTCGAACGTATCTACAGCACGGATCTGGGTCGCATGCTGCTGACTAGCATTGTTCGCGGTATCCCGTTCTGGGGTGGTAGCACGATTGACACCGAACTGAAGGTTATCGACACTAACTGCATTAACGTTATTCAACCGGATGGTAGCTATCGTAGCGAAGAGCTGAATCTGGTCATCATTGGCCCGAGCGCAGACATTATCCAATTCGAGTGCAAGAGCTTTGGTCACGAGGTTCTGAATCTGACCCGCAATGGCTATGGTAGCACCCAGTACATTCGTTTTTCGCCGGATTTTACCTTCGGCTTTGAAGAGAGCCTGGAGGTTGATACCAATCCGTTGCTGGGTGCGGGCAAATTCGCTACCGATCCGGCTGTCACGCTGGCCCATGAACTGATCCACGCAGGCCACCGCCTGTACGGCATTGCCATCAACCCAAACCGTGTGTTCAAGGTTAATACGAATGCATACTACGAGATGAGCGGCCTgGAAGTCAGCTTCGAAGAACTGCGCACCTTCGGTGGCCATGACGCTAAATTCATTGACAGCTTGCAAGAGAATGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAATTCAAAGACATTGCAAGCACGTTGAACAAGGCCAAAAGCATCGTTGGTACTACCGCGTCGTTGCAGTATATGAAGAATGTGTTTAAAGAGAAGTACCTGCTGTCCGAGGATACCTCCGGCAAGTTTAGCGTTGATAAGCTGAAGTTTGACAAACTGTACAAGATGCTGACCGAGATTTACACCGAGGACAACTTTGTGAAATTCTTCAAaGTGTTGAATCGTAAAACCTATCTGAATTTTGACAAAGCGGTTTTCaAGATTAACATCGTGCCGAAGGTGAACTACACCATCTATGACGGTTTTAACCTGCGTAACACCAACCTGGCGGCGAACTTTAACGGTCAGAATACGGAAATCAACAACATGAATTTCACGAAGTTGAAGAACTTCACGGGTCTGTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGCGTGCGCGGTATCATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGACAAAGGCTACAACAAGGCGCTGAATGACCTGTGCATTAAGGTAAACAATTGGGATCTGTTCTTTTCGCCATCCGAAGATAATTTTACCAACGACCTGAACAAGGGTGAAGAAATCACCAGCGATACGAATATTGAAGCAGCGGAAGAGAATATCAGCCTGGATCTGATCCAGCAGTACTATCTGACCTTTAACTTCGACAATGAACCGGAGAACATTAGCATTGAGAATCTGAGCAGCGACATTATCGGTCAGCTGGAACTGATGCCGAATATCGAACGTTTCCCGAACGGCAAAAAGTACGAGCTGGACAAGTACACTATGTTCCATTACCTGCGTGCACAGGAGTTTGAACACGGTAAAAGCCGTATCGCGCTGACCAACAGCGTTAACGAGGCCCTGCTGAACCCGAGCCGTGTCTATACCTTCTTCAGCAGCGACTATGTTAAGAAAGTGAACAAAGCCACTGAGGCCGCGATGTTCCTGGGCTGGGTGGAACAGCTGGTATATGACTTCACGGACGAGACGAGCGAAGTGAGCACTACCGACAAAaTTGCTGATaTTACCATCATTATCCCGTATATTGGTCCGGCACTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGATTTTGTGGGTGCCCTGATCTTCTCCGGTGCCGTGATTCTGCTGGAGTTCATTCCGGAGATTGCGATCCCGGTGTTGGGTACCTTCGCGCTGGTGTCCTACATCGCGAATAAGGTTCTGACGGTTCAGACCATCGATAACGCGCTGTCGAAACGTAATGAAAAATGGGACGAGGTTTACAAATACATTGTTACGAATTGGCTGGCGAAAGTCaATACCCAGATCGACCTGATCCGTAAGAAAATGAAAGAGGCGCTGGAGAATCAGGCGGAGGCCACCAAAGCAATTATCAACTACCAATACAACCAGTACACGGAAGAAGAGAAGAATAACATTAACTTCAATATCGATGATTTGAGCAGCAAGCTGAATGAATCTATCAACAAAGCGATGATCAATATCAACAAGTTTTTGAATCAGTGTAGCGTTTCGTACCTGATGAATAGCATGATTCCGTATGGCGTCAAACGTCTGGAGGACTTCGACGCCAGCCTGAAAGATGCGTTGCTGAAATACATTTACGACAATCGTGGTACGCTGATTGGCCAAGTTGACCGCTTGAAAGACAAAGTTAACAATACCCTGAGCACCGACATCCCATTTCAACTGAGCAAGTATGTTGATAATCAACGTCTGTTGAGCACTTTCACCGAGTATATCAAAAACATCATCAATACTAGCATTCTGAACCTGCGTTACGAGAGCAATCATCTGATtGATCTGAGCCGTTATGCAAGCAAGATCAACATCGGTAGCAAGGTCAATTTTGACCCGATCGATAAGAACCAGATCCAGCTGTTTAATCTGGAATCGAGCAAAATTGAGGTTATCCTGAAAAACGCCATTGTCTACAACTCCATGTACGAGAATTTCTCCACCAGCTTCTGGATTCGCATCCCGAAATACTTCAACAGCATTAGCCTGAACAACGAGTATACTATCATCAACTGTATGGAGAACAACAGCGGTTGGAAGGTGTCTCTGAACTATGGTGAGATCATTTGGACCTTGCAGGACACCCAAGAGATCAAGCAGCGCGTCGTGTTCAAGTACTCTCAAATGATCAACATTTCCGATTACATTAATCGTTGGATCTTCGTGACCATTACGAATAACCGTCTGAATAACAGCAAGATTTACATCAATGGTCGCTTGATCGATCAGAAACCGATTAGCAACCTGGGTAATATCCACGCAAGCAACAACATTATGTTCAAATTGGACGGTTGCCGCGATACCCATCGTTATATCTGGATCAAGTATTTCAACCTGTTTGATAAAGAACTGAATGAGAAGGAGATCAAAGATTTGTATGACAACCAATCTAACAGCGGCATTTTGAAGGACTTCTGGGGCGATTATCTGCAATACGATAAGCCGTACTATATGCTGAACCTGTATGATCCGAACAAATATGTGGATGTCAATAATGTGGGTATTCGTGGTTACATGTATTTGAAGGGTCCGCGTGGCAGCGTTATGACGACCAACATTTACCTGAACTCTAGCCTGTACCGTGGTACGAAATTCATCATTAAGAAATATGCCAGCGGCAACAAAGATAACATTGTGCGTAATAACGATCGTGTCTACATCAACGTGGTCGTGAAGCGTAAAGAGTACCGTCTGGCGACCAACGCTTCGCAGGCGGGTGTTGAGAAAATTCTGAGCGCGTTGGAGATCCCTCGTGTCCGTCGTCTGAGCCAAGTCGTGGTTATGAAGAGCAAGAACGACCAGGGTATCACTAACAAGTGCAAGATGAACCTGCAAGACCGTCGTGGTAACGACATCGGCTTTATTGGTTTCCACCAGTTCAACAATATTGCTAAACTGGTAGCGAGCAATTGGTACAATCGTCAGATTGAGCGCCGTAGCCGTCGTTTGGGCTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGATGATGGTTGGGGCGAACGTCCGCTG
SEQ ID NO: 10 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Cat-D»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKRKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPRVRRLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDRRGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERRSRRLGCSWEFIPVDDGWGERPL
SEQ ID NO: 11 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Химера 1»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 12 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Химера 2»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIIELGGGGSELSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 13 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Химера 3А»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVENDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTEHHHHHHHHHH
SEQ ID NO: 14 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Химера 3B»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEMKLFLAPIYDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO: 15 (полипептидная последовательность модифицированного BoNT/A «Химера 3C»)
MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
SEQ ID NO: 16 (полипептидная последовательность BoNT/B)
MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Клонирование, экспрессия и очистка
Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, которая кодирует BoNT/A дикого типа (SEQ ID NO: 2), мутируют для введения следующих замен с образованием четырех конструкций, показанных в Таблице 1 ниже:
Таблица 1. Конструкции.
*Cat-D имеет расчетную pI 7,45 и молекулярную массу 149859.
Конструкции ДНК, кодирующие указанные выше модифицированные молекулы BoNT/A, синтезируют, клонируют в вектор экспрессии pJ401 и затем трансформируют в BL21 (DE3) E. coli. Это позволяет обеспечить сверхэкспрессию растворимых рекомбинантных белков Cat-A, Cat-B, Cat-C и Cat-D в BL21(DE3) E.coli.
Рекомбинантные модифицированные BoNT очищают с использованием методов классической хроматографии из лизатов E. coli. Используют начальную стадию очистки с использованием катионообменной смолы, за которой следует промежуточная стадия очистки с использованием смолы гидрофобного взаимодействия. Рекомбинантный модифицированный одноцепочечный BoNT затем расщепляют протеолизом, в результате чего получают активированный двухцепочечный модифицированный BoNT. Затем используют последнюю стадию очистки для удаления оставшихся загрязнений. Подходящие методы описаны в WO2015/166242, WO2017055274A1, EP2524963B1, EP2677029B1 и US10087432B2.
ПРИМЕР 2
Характеризация очищенного модифицированного BoNT/A
Модифицированные BoNT, описанные выше в примере 1, экспериментально характеризуют следующим образом.
Измерение pI показывает, что изоэлектрическая точка модифицированных ботулотоксинов выше, чем у не модифицированных (нативных) BoNT/A1 - см. фигуру 3 и таблицу 2 ниже.
[Cat5v2(K1064H/N886K)] (SEQ ID NO: 4)
[Cat5v2(K1064/N954K)] (SEQ ID NO: 6)
[Cat5v2(K1064H/N1025K)] (SEQ ID NO: 8)
[rBoNT/A1] (SEQ ID NO: 2)
Таблица 2. Значения pI модифицированных BoNT/A.
Способность модифицированных BoNT проникать в нейроны и расщеплять SNAP-25 (мишень BoNT/A1) оценивают с использованием эмбриональных нейронов спинного мозга крысы (eSCN). На фигуре 4 показано, что модифицированные BoNT сохраняют ту же способность проникать в нейрон и расщеплять SNAP-25, что и нативные BoNT/A1.
Эффективность модифицированных BoNT дополнительно оценивают с использованием анализа полудиафрагмы диафрагмального нерва мыши (mPNHD). На фигуре 5 показано, что модифицированные BoNT сохраняют ту же способность ингибировать сократительные способности полудиафрагмы мыши, что и нативные BoNT/A1.
Для оценки эффективности и безопасности по сравнению с нативным BoNT/A1 используют in vivo анализ шкалы отведения пальцев (DAS) у мышей. Обе молекулы (Cat-A [SEQ ID NO: 4] и Cat-B [SEQ ID NO: 6]) демонстрируют более высокий коэффициент безопасности по сравнению с нативным BoNT/A1 и являются немного более активными. Эти данные представлены в Таблице 3 ниже:
(пг/
мышь)
(пг/
мышь)
мышь)
Таблица 3. Анализ DAS и коэффициента безопасности.
-DAS ED50: Расчетная доза, вызывающая DAS 2
-Доза DAS 4: экспериментальная доза, вызывающая DAS 4.
-МТ: Масса тела
- Доза для -10% ∆МТ: расчетная доза, вызывающая снижение МТ на 10% по сравнению с МТ в D0
-Коэффициент безопасности: доза для -10% ∆МТ/DAS ED50
Коэффициент безопасности является мерой негативного эффекта лечения ботулотоксином (потеря веса) по отношению к эффективности (половина максимальной оценки отведения пальцев (DAS)). Он рассчитывается как отношение между -10% массы тела (МТ) и DAS ED50, где -10% МТ относится к количеству BoNT (пг/животное), необходимому для снижения массы тела на 10%, и ED50 относится к количеству BoNT (пг/животное), при котором DAS равна 2.
Анализ DAS проводят путем инъекции 20 мкл модифицированного BoNT/A, приготовленного в желатин-фосфатном буфере, в икроножно/камбаловидный комплекс мышей с последующей оценкой отведения пальцев, как ранее сообщалось Aoki (Aoki KR, Toxicon 39: 1815-1820; 2001).
ПРИМЕР 3
Клонирование, экспрессия и очистка химер BoNT/AB
Химерные конструкции BoNT/AB 1, 2, 3A, 3B и 3C (SEQ ID NO: 11-15, соответственно) конструируют из ДНК, кодирующей молекулу исходного серотипа, и соответствующих олигонуклеотидов с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Затем их клонируют в вектор экспрессии pJ401 с или без С-концевой His10-метки и трансформируют в клетки BLR (DE3) E. coli для сверхэкспрессии. Эти клетки выращивают при 37°C и 225 об/мин при встряхивании в 2-литровых конических колбах с перегородками, содержащих 1 л модифицированного бульона Terrific Broth (mTB) с добавлением соответствующего антибиотика. Как только A600 достигнет >0,5, температуру инкубатора снижают до 16°C, и затем через час индуцируют 1 мМ IPTG в течение 20 ч при встряхивании со скоростью 225 об/мин для экспрессии рекомбинантной конструкции BoNT/AB.
Собранные клетки лизируют ультразвуком и очищают центрифугированием при 4500 об/мин в течение 1 ч при 4°С. Рекомбинантные химерные молекулы BoNT/AB затем экстрагируют сульфатом аммония и очищают стандартными методами быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC). Она включает использование смолы гидрофобного взаимодействия для улавливания и анионообменной смолы для промежуточной стадии очистки. Затем частично очищенные молекулы протеолитически расщепляют эндопротеиназой Lys-C с получением активной двойной цепи. Их дополнительно очищают с помощью второй смолы гидрофобного взаимодействия для получения конечной химеры BoNT/AB.
Для химерных молекул BoNT/AB с декагистидиновой меткой (H10) (химеры 1, 2, 3A) на стадии захвата используют иммобилизованную никелевую смолу вместо смолы гидрофобного взаимодействия.
Последовательность каждой химеры представлена в таблице 4.
Таблица 4. Химерные конструкции BoNT/AB.
ПРИМЕР 4
Сравнение химер BoNT/AB 1, 2 и 3A
Химеры 1, 2 и 3A BoNT/AB, которые имеют С-концевую метку His10 и двойную мутацию E1191M/S1199Y, очищают, как описано в примере 3 (фигура 6) и тестируют на функциональную активность.
АНАЛИЗ НЕЙРОНОВ СПИННОГО МОЗГА КРЫС SNAP-25
Первичные культуры нейронов спинного мозга крысы (SCN) готовят и выращивают в течение 3 недель в 96-луночных планшетах для тканевых культур (как описано в: Masuyer et al., 2011, J. Struct. Biol. Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B; и в: Chaddock et al., 2002, Protein Expr. Purif. Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A). Серийные разведения BoNT/AB готовят в питательной среде SCN. Питательную среду из лунок, подлежащих обработке, собирают и фильтруют (фильтр 0,2 мкм). 125 мкл отфильтрованной среды снова добавляют в каждую тестовую лунку. Затем в планшет добавляют 125 мкл разведенного токсина (тройные лунки). Обработанные клетки инкубируют при 37°C, 10% CO2 в течение 24 ± 1 ч).
Анализ активности BoNT с использованием анализа расщепления SNAP-25
После обработки, BoNT удаляют и клетки однократно промывают в PBS (Gibco, UK). Клетки лизируют в буфере для лизиса 1x NuPAGE (Life Technologies), дополненном 0,1 М дитиотреитола (DTT) и 250 единиц/мл бензоназы (Sigma). Белки лизата разделяют с помощью SDS-PAGE и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны зондируют первичным антителом, специфичным к SNAP-25 (Sigma #S9684), которое распознает нерасщепленный SNAP-25, а также SNAP-25, расщепленный эндопептидазой BoNT/A. Используемое вторичное антитело представляет собой HRP-конъюгированный анти-кроличий IgG (Sigma #A6154). Полосы обнаруживают с помощью усиленной хемилюминесценции и визуализируют с использованием pXi6 Access (Synoptics, UK). Интенсивность полос определяют с использованием программного обеспечения GeneTools (Syngene, Cambridge, UK) и рассчитывают долю SNAP-25, расщепленного при каждой концентрации BoNT. Данные подгоняют к 4-параметрическому логистическому уравнению, и pEC50 рассчитывают с использованием GraphPad Prism версии 6 (GraphPad).
В таблице 5 ниже представлены значения pEC50, определенные для химеры 1, 2 и 3A в анализе расщепления SCN SNAP-25 крысы. Эти результаты показывают, что три химеры BoNT/AB сохраняют способность проникать в нейроны спинного мозга крысы и расщеплять субстрат-мишень. Однако в этом анализе химера 3А является более эффективной, чем химеры 1 и 2 (см. также фигуру 7).
Таблица 5. Значения pEC50.
АНАЛИЗ ОЦЕНКИ ОТВЕДЕНИЯ ПАЛЬЦЕВ (DAS)
Способ измерения активности химер BoNT/AB 1, 2 и 3A в анализе DAS основан на рефлекторном разгибании пальцев мышей в ответ на кратковременное подвешивание за хвост. Этот рефлекс оценивают по шкале отведения пальцев (DAS) и он подавляется после введения BoNT в икроножно-камбаловидные мышцы задней лапы. Мышей ненадолго подвешивают за хвост, чтобы вызвать характерную испуганную реакцию, при которой животное вытягивает заднюю конечность и отводит пальцы (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10).
В день инъекции мышей анестезируют в индукционной камере, подавая изофлуран 3% в кислороде. Каждой мыши внутримышечно вводят химеру BoNT/AB или носитель (фосфатный буфер, содержащий 0,2% желатина) в икроножно-камбаловидную мышцу правой задней лапы.
После инъекции нейротоксина, различные степени отведения пальцев оценивают по шкале от нуля до четырех, где 0=норма, и 4=максимальное уменьшение отведения пальцев и разгибания ног. ED50 определяют с помощью нелинейного корректирующего анализа с использованием среднего значения максимального эффекта при каждой дозе. В качестве математической модели используют логистическую модель с 4 параметрами.
DAS проводят каждые 2 часа в течение первого дня после введения дозы; после этого его проводят 3 раза в день в течение 4 дней.
На фигуре 8 показаны подогнанные кривые для химеры 1, 2 и 3А (SEQ ID NO: 11, 12 и 13, соответственно). Кривая химеры 3A смещена влево, что означает, что более низкие дозы химеры 3A обеспечивают аналогичный ответ DAS по сравнению с химерами 1 и 2, что показывает, таким образом, что химера 3A более эффективна, чем другие, в анализе DAS на мышах; см. также таблицу ниже (таблица 6), в которой приведены значения расчетной ED50 и дозы, приводящей к DAS 4 (наивысший балл) для каждой химеры.
В таблице 6 ниже представлены дозы ED50 и DAS 4, определенные для не модифицированного рекомбинантного BoNT/A1 (rBoNT/A1 - SEQ ID NO: 2) и химер 1, 2 и 3A в анализе DAS на мышах. Эти результаты показывают, что из трех химер химера 3А обладает наибольшей активностью in vivo в отношении индукции ослабления мышц. Исследования, показанные на фигуре 8 и в таблице 6, выполнены на мышах, полученных из лабораторий Charles River.
(пг/мышь)
Таблица 6. Значения ED50.
ПРИМЕР 5
Сравнение химеры BoNT/AB 3B, 3C и не модифицированного BoNT/A1
Немеченые химеры BoNT/AB 3B и 3C, соответственно с и без наличия двойной мутации E1191M/S1199Y (SEQ ID NO: 14 и 15), очищают, как описано в примере 3 (фигура 9), и тестируют на функциональную активность с использованием не модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 2) в качестве ссылки.
АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК SNAP-25 ЧЕЛОВЕКА
Криоконсервированные клетки PERI.4U приобретают у Axiogenesis (Cologne, Germany). Размораживание и посев клеток проводят в соответствии с рекомендациями производителя. Коротко, криопробирки, содержащие клетки, оттаивают на водяной бане при 37°С в течение 2 минут. После осторожного ресуспендирования, клетки переносят в пробирку на 50 мл. Криопробирку промывают 1 мл среды для оттаивания Peri.4U®, поставляемой производителем, и эту среду по каплям переносят в клеточную суспензию в пробирку на 50 мл перед добавлением еще 2 мл среды для оттаивания Peri.4U® по каплям в пробирку 50 мл. Затем клетки подсчитывают с помощью гемоцитометра. После этого, к клеточной суспензии добавляют еще 6 мл среды для оттаивания Peri.4U®. Осадок клеток получают центрифугированием при 260 х g (например, 1100 об/мин) в течение 6 минут при комнатной температуре. Затем клетки ресуспендируют в полной культуральной среде Peri.4U®, поставляемой производителем. Клетки высевают с плотностью от 50000 до 150000 клеток на см2 на планшеты для культивирования клеток, покрытые поли-L-орнитином и ламинином. Клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере СО2, и во время культивирования среду полностью меняют каждые 2-3 дня.
Для обработки токсинами готовят серийные разведения BoNT в культуральной среде Peri.4U®. Среду из лунок, подлежащих обработке, собирают и фильтруют (фильтр 0,2 мкм). 125 мкл отфильтрованной среды снова добавляют в каждую тестовую лунку. Затем в планшет добавляют 125 мкл разбавленного токсина (тройные лунки). Обработанные клетки инкубируют при 37°C, 10% CO2 в течение 48 ± 1 ч).
Анализ активности BoNT с использованием анализа расщепления SNAP-25
После обработки, BoNT удаляют, и клетки однократно промывают в PBS (Gibco, UK). Клетки лизируют в буфере для лизиса 1x NuPAGE (Life Technologies), дополненном 0,1 М дитиотреитола (DTT) и 250 единиц/мл бензоназы (Sigma). Белки лизата разделяют с помощью SDS-PAGE и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны зондируют первичным антителом, специфичным к SNAP-25 (Sigma #S9684), которое распознает не расщепленный SNAP-25, и SNAP-25, расщепленный эндопептидазой BoNT/A. Используемое вторичное антитело представляет собой HRP-конъюгированный анти-кроличий IgG (Sigma #A6154). Полосы обнаруживают с помощью усиленной хемилюминесценции и визуализируют с использованием pXi6 Access (Synoptics, UK). Интенсивность полос определяют с использованием программного обеспечения GeneTools (Syngene, Cambridge, UK) и рассчитывают долю SNAP-25, расщепленного при каждой концентрации BoNT. Данные подгоняют к 4-параметрическому логистическому уравнению, и pEC50 рассчитывают с использованием GraphPad Prism версии 6 (GraphPad).
На фигуре 10 показано, что химеры 3B и 3C проявляют большую активность, чем rBoNT/A1, в расщеплении SNAP-25 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека, но первая значительно сильнее. Это можно объяснить двойной мутацией, которая увеличивает сродство химеры 3В к белковому рецептору синаптотагмина II человека, присутствующему в этих клетках (фигура 10, таблица 7).
Таблица 7. Значения pEC50.
АНАЛИЗ ОЦЕНКИ ОТВЕДЕНИЯ ПАЛЬЦЕВ (DAS) - КОЭФФИЦИЕНТ БЕЗОПАСНОСТИ
Способ измерения активности BoNT в анализе DAS основан на рефлекторном разгибании пальцев мышей в ответ на кратковременное подвешивание за хвост. Этот рефлекс оценивают по шкале отведения пальцев (DAS) и он подавляется после введения BoNT в икроножно-камбаловидные мышцы задней лапы. Мышей ненадолго подвешивают за хвост, чтобы вызвать характерную испуганную реакцию, при которой животное вытягивает заднюю конечность и отводит пальцы (Aoki et al. 1999, Eur. J. Neurol.; 6 (suppl. 4) S3-S10).
В день инъекции мышей анестезируют в индукционной камере, подавая изофлуран 3% в кислороде. Каждой мыши внутримышечно вводят BoNT или носитель (фосфатный буфер, содержащий 0,2% желатина) в икроножно-камбаловидную мышцу правой задней лапы.
После инъекции нейротоксина, различные степени отведения пальцев оценивают по шкале от нуля до четырех, где 0=норма, и 4=максимальное уменьшение отведения пальцев и разгибания ног. ED50 определяют с помощью нелинейного корректирующего анализа с использованием среднего значения максимального эффекта при каждой дозе. В качестве математической модели используют логистическую модель с 4 параметрами.
DAS проводят каждые 2 часа в течение первого дня после введения дозы; после этого его проводят 3 раза в день в течение 4 дней для всех доз. После этого за животными из групп, которым вводят носитель и самую низкую дозу, которая вызывает в течение первых четырех дней инъекции DAS 4, наблюдают до полного восстановления мышечной слабости до DAS 0 (отсутствие наблюдаемой мышечной слабости).
Для расчета коэффициента безопасности всех животных взвешивают за день до инъекции токсина (D0), а затем один раз в день на протяжении всего исследования. Среднюю массу тела, ее стандартное отклонение и среднее значение стандартной ошибки рассчитывают ежедневно для группы каждой дозы. Чтобы получить коэффициент безопасности для BoNT (-10%ΔМТ/ED50), дозу, при которой в любой момент исследования средний вес группы дозы составляет ниже 10% от среднего веса в D0 группы той же самой дозы, делят на ED50 для исследуемого BoNT. Летальную дозу определяют как дозу, при которой погибло одно или несколько животных в группе этой дозы.
На фигуре 11 показана продолжительность ослабления мышц с течением времени в анализе оценки отведения пальцев мыши для не модифицированного BoNT/A, химеры 3B и химеры 3C (SEQ ID NO: 2, 14 и 15), показывая, что химера имеет большую продолжительность действия.
В таблице 8 ниже представлены дозы ED50 и DAS 4, определенные для rBoNT/A1 и химер 3B и 3C в анализе DAS на мышах. В таблице также указана общая продолжительность действия дозы DAS 4 до полного восстановления мышечной слабости до DAS 0 (мышечная слабость не наблюдается). Кроме того, в таблице показаны летальная доза для мышей и коэффициент безопасности (-10%ΔМТ/ED50), как определено в тексте выше. По сравнению с rBoNT/A1, химеры 3B и 3C имеют большую продолжительность действия, лучший коэффициент безопасности и более высокую летальную дозу. Исследования, показанные на фигуре 11 и в таблице 8, выполнены на мышах, полученных из лабораторий Janvier.
(DAS 2) Доза (пг/
мышь)
мышь)
(пг)
(-10%ΔМТ/ED50)
Таблица 8. DAS и коэффициенты безопасности химер BoNT/AB.
ПРИМЕР 6
Доклинические испытания модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4)
Модифицированный BoNT/A «Cat-A» (SEQ ID NO: 4) подвергают дополнительному доклиническому тестированию.
Материалы и методы
Оценка отведения пальцев у крыс (DAS)
Для оценки эффектов модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) на мышечную активность in vivo проводят исследования доза-ответ с использованием анализа DAS на крысах. Анализ DAS на крысах основан на рефлексе отведения пальцев, характерной реакции испуга, когда животное кратковременно хватают. После однократной инъекции нейротоксина в комплекс левой малоберцовой мышцы, мышечная слабость приводит к уменьшению отведения пальцев. Различная степень отведения пальцев оценивается по 5-балльной шкале: от 0=нормальное до 4=максимальное уменьшение отведения пальцев и разгибания ног (Broide RS, Rubino J, Nicholson GS, et al. The rat Digit Abduction Score (DAS) assay: A physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis. Toxicon 2013;71:18-24). Значения DAS измеряют в течение первых пяти дней подряд после инъекции токсина, и затем с интервалами в два-три дня до полного исчезновения влияния модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) на разгибательный рефлекс пальцев стопы для более низких доз, и до восстановления DAS2 для доз, приводящих к DAS4. Временное BoNT-индуцированное дозозависимое воздействие на прибавку массы тела считается свидетельством генерализованного эффекта токсина (Torii Y, Goto Y, Nakahira S, et al. Comparison of Systemic Toxicity between Botulinum Toxin Subtypes A1 and A2 in Mice and Rats. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2015;116:524-528). В каждый момент времени, оценки крыс последовательно взвешивают и отмечают побочные эффекты. Растворы BoNT для дозирования маскируют (обозначают случайными буквами) перед инъекцией и до конца исследования. Эффективность определяют как дозу, необходимую для получения 50% эффекта (ED50: доза, приводящая к значению DAS, равному 2). Для определения ED50 и 95% доверительных интервалов (CI) тестируют дозы в диапазоне от 2,5 до 750 пг/кг. Более высокие дозы 1, 1,5, 2, 2,4, 3, 4 и 5 нг/кг также вводят для оценки возможных побочных эффектов.
Чтобы оценить продолжительность действия модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) и сравнить его с продолжительностью действия не модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 2), среднее время, необходимое для возврата значению DAS2, равному 2, оценивают по максимально переносимой дозе (отсутствию влияния на изменение массы тела по сравнению с нелеченными крысами) для обоих токсинов в двух независимых прямых сравнительных исследованиях.
Исследования однократной дозы на крысах
Крысы получают однократную внутримышечную (в/м) инъекцию модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) в дозах 0, 0,1, 1 и 3 нг/кг, вводимых в правую икроножную мышцу. Контрольным животным вводят SEQ ID NO: 4 разбавитель в правую икроножную мышцу. Животных подвергают эвтаназии через 7 дней после лечения (десять самцов и десять самок на группу) или после 13- или 26-недельного периода наблюдения (пять самцов и пять самок на дозу). Наблюдения теста Ирвина для оценки функции центральной нервной системы проводят до тестирования (-1 день), на 8 день и на 13 и 27 неделях. Другие клинические (побочные) признаки, которые оценивают, представляют собой прихрамывание, размер мышцы в месте инъекции малого токсина и мягкий вздутый живот.
Исследования на обезьянах
Обезьяны получают однократные в/м дозы 0, 0,1, 0,25 и 0,75 нг/кг модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4), вводимые в правую икроножную мышцу. Животных подвергают эвтаназии через 7 дней после лечения (три самца и три самки на группу) или после 13- или 26-недельного периода наблюдения (два самца и две самки на дозу). Сердечно-сосудистые исследования, включая параметры гемодинамики, электрокардиограммы и дыхания, проводят с помощью внешнего дистанционного предварительного теста на 8 и 15 дни.
Предварительно усиленный EFD у беременных крыс
Целью исследования является получение исходной информации о влиянии модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) на эмбриональное и внутриутробное развитие крысы при внутримышечном введении на протяжении всего периода органогенеза. Модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) вводят путем ежедневной в/м инъекции (в икроножную мышцу) в дозах 0,02, 0,05 и 0,1 нг/кг/день группам из девяти спаренных самок крыс Sprague-Dawley с 6 (G6) до 17 (G17) дня гестации, включительно. На протяжении всего исследования контролируют клиническое состояние, массу тела и потребление пищи. Самок подвергают кесареву сечению в G21, и регистрируют параметры помета. При вскрытии, самок исследуют макроскопически, беременные матки взвешивают, и у тех, у кого имеется инъецированная малая икроножная мышца, взвешивают эту мышцу и противоположную мышцу. Все плоды взвешивают. Затем плоды исследуют на наличие внешних и внутренних аномалий и определяют пол. Головы примерно половины плодов фиксируют для внутреннего исследования путем серийных срезов. Туши с извлеченными внутренностями обрабатывают для исследования скелета.
Предварительный расширенный EFD у беременной крольчихи
Целью исследования является получение исходной информации о влиянии модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) на эмбриональное и внутриутробное развитие кролика при внутримышечном введении на протяжении всего периода органогенеза. Модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) вводят путем ежедневной в/м инъекции (в икроножную мышцу) в дозах 0,002, 0,005 и 0,01 нг/кг/день группам из девяти спаренных самок Новозеландских белых кроликов с 6 (G6) до 19 (G19) дня гестации, включительно. На протяжении всего исследования контролируют клиническое состояние, массу тела и потребление пищи. Самок подвергают кесареву сечению в G29, и регистрируют параметры помета. При вскрытии, самок исследуют макроскопически, беременные матки взвешивают, и у тех, у кого имеется инъецированная малая икроножная мышца, взвешивают эту мышцу и противоположную мышцу. Все плоды взвешивают. Затем плоды исследуют на наличие внешних и внутренних аномалий и определяют пол. Головы примерно половины плодов фиксируют для внутреннего исследования путем серийных срезов.
Полученные результаты
Путем проведения исследований, как указано выше, получают следующие фармакологические данные (указанные в таблице 9 ниже) для ряда различных видов животных, которым вводят модифицированный BoNT/A.
DAS4 0,125 пг/кг
0,3 нг/кг: -25%
0,8 нг/кг: -56%
Расчетная летальная 3 нг/кг
Летальная 0,375 нг/кг
NOAEL плода 0,01 нг/кг/день
Таблица 9. Доклинические результаты.
Кроме того, модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 4) тестируют в анализе DAS на крысах для определения продолжительности действия по сравнению с Dysport®. Результаты представлены в таблице 10 ниже:
3 единиц/крысу
15 единиц/кг
150 пг/крысу
0,750 нг/кг
Таблица 10. Продолжительность действия.
Эти данные показывают, что модифицированный BoNT/A имеет продолжительность действия, более чем в два раза превышающую продолжительность действия Dysport®.
ПРИМЕР 7
Расчет стандартной дозы модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 4) для лечения спастичности конечности
С учетом доклинических фармакологических данных, полученных в приведенном выше примере 6, рассчитывают подходящий диапазон стандартных доз (СД) для введения модифицированного BoNT/A людям. Исследования показывают, что модифицированный BoNT/А обеспечивает большую продолжительность действия, чем не модифицированный BoNT/А, и в то же время демонстрирует улучшенный профиль безопасности. Этот улучшенный профиль безопасности может быть выражен высоким коэффициентом безопасности, описанным в настоящем документе для модифицированного BoNT/A.
Поскольку модифицированный BoNT/А имеет тот же механизм действия, что и Dysport® (хотя и с повышенным коэффициентом безопасности благодаря его модифицированным свойствам), самая низкая доза модифицированного BoNT/A для лечения пациентов со спастичностью указана в контексте относительно помеченных доз Dysport® в той же группе мышц:
• В модели оценки отведения пальцев у крыс, ED50 модифицированного BoNT/A составляет 13 пг/кг, что более чем в 100 раз ниже расчетного уровня дозы, не вызывающей наблюдаемых нежелательных явлений (NOAEL), равного 1500 пг/кг, у одного и того же вида животных. В той же модели на крысах, ED50 для Dysport® составляет 0,5 единиц/кг. Основываясь на этих данных о животных, доза 2,6 нг модифицированного BoNT/A соответствует дозе 100 единиц Dysport®, что является нижним пределом указанного диапазона для лечения одной спастической мышцы-сгибателя пальца у взрослого субъекта со спастичностью верхней конечности.
• Внутрибрюшинная LD50 у мышей установлена на уровне 8,44 пг. В этих условиях, доза 0,84 нг модифицированного BoNT/А соответствует дозе 100 единиц Dysport®.
Таким образом, рассчитанная наименьшая доза составляет 500 пг (0,5 нг). Для обеспечения некоторого контекста и использования данных о внутрибрюшинной LD50 у мышей, приведенных выше, 0,5 нг модифицированного BoNT/A соответствует примерно 60 единиц Dysport® и, таким образом, будет активна при внутримышечном введении для лечения спастичности конечностей.
Оцененный NOAEL для 1,5 нг/кг модифицированного BoNT/A для крыс соответствует дозе 90 нг для человека с массой тела 60 кг. У обезьян, более чувствительных из двух протестированных неклинических видов, расчетный NOAEL для 0,125 нг/кг модифицированного BoNT/А соответствует дозе 7,5 нг для человека с массой тела 60 кг.
Таким образом, верхний предел стандартной дозы рассчитывается равным 7500 пг (7,5 нг), поскольку он остается ниже NOAEL для крысы, переведенного в дозу для человека.
Таким образом, подходящую стандартную дозу для лечения спастичности конечностей с использованием модифицированного BoNT/A рассчитывают на уровне 500-7500 пг. Основываясь на полученных доклинических данных, это составляет 59-889 единиц модифицированного BoNT/A (и соответствует 59-889 единиц Dysport®) на основе рассчитанной средней летальной внутрибрюшинной дозы (LD50) у мышей, определенной с помощью анализа внутрибрюшинной летальной дозы на мышах.
Ввиду улучшенного профиля безопасности по сравнению с Dysport®, как определено доклиническими данными примера 6, ожидается, что общие дозы (в единицах), вводимые для лечения спастичности конечностей, будут почти в 10х выше, чем для Dysport®. Максимальная общая доза Dysport® для лечения спастичности верхних и нижних конечностей у взрослых составляет 1500 единиц (см. фигуру 2).
Преимущественно, модифицированный BoNT/A может быть введен в большее количество мышц при лечении спастичности конечностей до достижения максимальной дозы. Это важный и полезный вывод, ведущий к улучшению лечения спастичности конечностей и предоставляющий лечащий специалистам более широкий спектр вариантов лечения. Впервые он также предоставляет возможность лечения дополнительных крупных мышц, таких как мышцы плеча, и лечения локтя, предплечья и/или запястья в максимальной дозе.
ПРИМЕР 8
Схема дозирования для лечения спастичности верхних конечностей у взрослых
Модифицированный BoNT/A (например, SEQ ID NO:4) поставляется в виде лиофилизированного порошка в 2 мл флаконах из прозрачного стекла, содержащих 15 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают смесью стерильного хлорида натрия 0,9% об./масс., не содержащего консервантов, и разбавителя (буфера для составления, содержащего только эксципиенты модифицированного BoNT/A). После восстановления раствор дополнительно разводят по мере необходимости.
Стандартная доза (СД) составляет 500-7500 пг (59-889 единиц).
Спастичность верхних конечностей у взрослых лечат внутримышечной инъекцией в соответствии со следующей схемой дозирования (таблица 11):
1х или 2х СД
1-2 мл
Таблица 11. Схема дозирования.
Максимальная общая вводимая доза составляет 15x СД. Это соответствует 112500 пг/13335 единиц. Это более чем в 10х превышает максимальную общую дозу Dysport®, которую можно вводить во время лечения спастичности верхних конечностей у взрослых без достижения пределов токсичности (что является проблемой для традиционных схем лечения). Таким образом, лечащий специалист может адаптировать лечение к пациенту, зная, что 15x СД можно вводить без каких-либо опасений по поводу токсичности, тем самым позволяя лечить дополнительные мышцы субъекта, включая плечо и/или гарантируя, что каждая мышца получит фармацевтически эффективную дозу.
ПРИМЕР 9
Схема дозирования при лечении спастичности нижних конечностей у взрослых
Модифицированный BoNT/A (например, SEQ ID NO:4) поставляется в виде лиофилизированного порошка в 2 мл флаконах из прозрачного стекла, содержащих 15 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают смесью стерильного хлорида натрия 0,9% об./масс., не содержащего консервантов, и разбавителя (буфера для составления, содержащего только эксципиенты модифицированного BoNT/A). После восстановления раствор дополнительно разводят по мере необходимости.
Стандартная доза (СД) составляет 500-7500 пг (59-889 единиц).
Спастичность нижних конечностей у взрослых лечат внутримышечной инъекцией в соответствии со следующей схемой дозирования (таблица 12):
Таблица 12. Схема дозирования.
Максимальная общая вводимая доза составляет 15x СД. Это соответствует 112500 пг/13335 единиц. Это более чем в 10х превышает максимальную общую дозу Dysport®, которую можно вводить во время лечения спастичности верхних конечностей у взрослых без достижения пределов токсичности (что является проблемой для традиционных схем лечения). Таким образом, лечащий специалист может адаптировать лечение к пациенту, зная, что 15x СД можно вводить без каких-либо опасений по поводу токсичности, тем самым позволяя лечить дополнительные мышцы субъекта и/или гарантируя, что каждая мышца получит фармацевтически эффективную дозу.
ПРИМЕР 10
Дополнительная характеристика химеры BoNT/AB (SEQ ID NO: 14)
Химеру BoNT/AB SEQ ID NO: 14 тестируют в анализе LD50 на мышах с результатом 1,202 нг/кг. Таким образом, 1 единица SEQ ID NO: 14 соответствует 24,04 пг в этом анализе.
Кроме того, указанную химеру BoNT/AB тестируют в анализе DAS на крысах для определения продолжительности действия (согласно примеру 6) по сравнению с Dysport®. Результаты представлены в таблице 13 ниже:
3 единиц/крысу
15 единиц/кг
300 пг/крысу
1,5 нг/кг
Таблица 13. Продолжительность действия.
В заключение следует отметить, что продолжительность действия BoNT/AB намного выше, чем у Dysport®, и аналогична таковой для SEQ ID NO: 4. Таким образом, ожидается, что стандартные дозы и схема дозирования для SEQ ID NO: 4 могут применяться аналогичным образом к BoNT/AB для улучшения лечения спастичности конечностей.
ПРИМЕР 11
Расчет стандартной дозы модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14) для лечения спастичности конечности
С учетом данных доклинической фармакологии рассчитывают подходящий диапазон стандартных доз (СД) для введения модифицированного BoNT/А людям.
Для SEQ ID NO: 14 рассчитывают DAS ED50, равную 13 пг/кг. ED50 рассматривается как минимальная фармакологически активная доза, которая примерно в 300 раз ниже, чем уровень дозы, не вызывающей наблюдаемых нежелательных явлений (NOAEL), равный 4 нг/ кг у одного и того же вида животных. ED50, равная 13 пг/кг для SEQ ID NO: 14 у крыс соответствует дозе 0,8 нг для человека с массой тела 60 кг.
Таким образом, выбран нижний предел стандартной дозы 1000 пг. Выбран верхний предел стандартной дозы 16000 пг, что ниже NOAEL, равного 4 нг/кг, для обоих неклинически безопасных видов (крысы и обезьяны), пересчитанного в дозу для человека на 60 кг массы тела.
Ввиду улучшенного профиля безопасности, максимальная общая доза для лечения спастичности конечностей установлена на уровне 240000 пг, что получено из NOAEL, равного 4 нг/кг, для обоих неклинически безопасных видов (крысы и обезьяны), пересчитанного в дозу для человека на 60 кг массы тела.
Преимущественно, модифицированный BoNT/A (SEQ ID NO: 14) можно вводить инъекцией в большее количество мышц при лечении спастичности конечностей до достижения максимальной дозы. Это важный и полезный вывод, ведущий к улучшению лечения спастичности конечностей и предоставляющий лечащий специалистам более широкий спектр вариантов лечения. Впервые он также предоставляет возможность лечения дополнительных крупных мышц, таких как мышцы плеча, и лечения локтя, предплечья и/или запястья в максимальной дозе.
ПРИМЕР 12
Схема дозирования для лечения спастичности верхних конечностей у взрослых с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)
Модифицированный BoNT/A поставляется в виде лиофилизированного порошка во флаконе, содержащем 36 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают.
Стандартная доза (СД) составляет 1000-16000 пг (42-666 единиц [измерено по LD50 мыши]).
Спастичность верхних конечностей у взрослых лечат внутримышечной инъекцией в соответствии со следующей схемой дозирования (таблица 14):
1х или 2х СД
1-2 мл
Таблица 14. Схема дозирования.
Максимальная общая вводимая доза составляет 15x СД. Это соответствует 240000 пг/9990 единиц. Таким образом, лечащий специалист может адаптировать лечение к пациенту, зная, что 15x СД можно вводить без каких-либо опасений по поводу токсичности, тем самым позволяя лечить дополнительные мышцы субъекта, включая плечо, и/или гарантируя, что каждая мышца получит фармацевтически эффективную дозу.
ПРИМЕР 13
Схема дозирования для лечения спастичности нижних конечностей у взрослых с использованием модифицированного BoNT/A (SEQ ID NO: 14)
Модифицированный BoNT/A поставляется в виде лиофилизированного порошка во флаконе, содержащем 36 нг модифицированного BoNT/A на флакон. Лиофилизированный порошок восстанавливают.
Стандартная доза (СД) составляет 1000-16000 пг (42-666 единиц).
Спастичность нижних конечностей у взрослых лечат внутримышечной инъекцией в соответствии со следующей схемой дозирования (таблица 15):
Таблица 15. Схема дозирования.
Максимальная общая вводимая доза составляет 15x СД. Это соответствует 240000 пг/9990 единиц. Таким образом, лечащий специалист может адаптировать лечение к пациенту, зная, что 15x СД можно вводить без каких-либо опасений по поводу токсичности, тем самым позволяя лечить дополнительные мышцы субъекта и/или гарантируя, что каждая мышца получит фармацевтически эффективную дозу.
Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены сюда посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по настоящему изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. Действительно, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные для специалистов в области биохимии и биотехнологии или смежных областях, входят в объем следующей формулы изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> IPSEN BIOPHARM LIMITED
<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕCКИЙ НЕЙРОТОКСИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
СПАСТИЧНОСТИ КОНЕЧНОСТЕЙ
<130> P66414WO
<150> GB2003803.0
<151> 2020-03-16
<150> GB2003867.5
<151> 2020-03-17
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3888
<212> ДНК
<213> Clostridium botulinum
<400> 1
atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60
tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120
aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180
ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240
gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300
acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360
agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420
gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480
atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540
ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600
gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660
ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720
cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780
gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840
gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900
aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960
tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020
ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080
ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140
aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260
ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320
agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380
gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440
atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500
cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560
agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620
aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680
cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740
cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800
gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860
gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920
ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980
gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040
ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100
aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160
gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220
gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280
aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340
atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400
attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460
aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520
gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580
cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640
ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700
ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760
tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820
ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880
gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940
ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000
tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060
aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120
attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180
cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240
gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300
tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360
aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420
ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480
atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540
tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600
ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660
gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720
gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780
ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840
agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888
<210> 2
<211> 1296
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 2
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 3
<211> 3888
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-A"
<400> 3
atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60
tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120
aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180
ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240
gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300
acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360
agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420
gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480
atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540
ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600
gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660
ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720
cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780
gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840
gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900
aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960
tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020
ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080
ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140
aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260
ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320
agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380
gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440
atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500
cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560
agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620
aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680
cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740
cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800
gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860
gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920
ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980
gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040
ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100
aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160
gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220
gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280
aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340
atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400
attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460
aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520
gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580
cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640
ctgcgttacg agagcaagca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700
ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760
tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820
ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880
gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940
ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000
tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060
aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120
attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180
cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240
gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300
tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360
aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420
ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480
atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540
tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600
ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660
gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720
gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780
ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840
agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888
<210> 4
<211> 1296
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-A"
<400> 4
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Lys His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 5
<211> 3888
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-B"
<400> 5
atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60
tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120
aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180
ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240
gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300
acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360
agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420
gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480
atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540
ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600
gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660
ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720
cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780
gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840
gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900
aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960
tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020
ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080
ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140
aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260
ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320
agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380
gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440
atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500
cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560
agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620
aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680
cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740
cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800
gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860
gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920
ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980
gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040
ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100
aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160
gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220
gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280
aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340
atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400
attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460
aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520
gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580
cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640
ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700
ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760
tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820
ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca agaagattag cctgaacaac 2880
gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940
ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000
tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060
aataaccgtc tgaataagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120
attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180
cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240
gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300
tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360
aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420
ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480
atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540
tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600
ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660
gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720
gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780
ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840
agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888
<210> 6
<211> 1296
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-B"
<400> 6
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Lys Lys Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 7
<211> 3888
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-C"
<400> 7
atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60
tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120
aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180
ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240
gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300
acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360
agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420
gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480
atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540
ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600
gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660
ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720
cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780
gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840
gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900
aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960
tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020
ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080
ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140
aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260
ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320
agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380
gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440
atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500
cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560
agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620
aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680
cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740
cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800
gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860
gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920
ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980
gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040
ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100
aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160
gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220
gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280
aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340
atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400
attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460
aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520
gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580
cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640
ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgctagcaa gatcaacatc 2700
ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760
tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaag gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820
ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acaagattag cctgaacaac 2880
gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940
ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc aaagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000
tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060
aataaccgtc tgaagaagag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120
attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaagatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180
cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240
gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300
tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360
aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420
ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480
atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540
tacatcaacg tggtcgtgaa gaataaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600
ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctgatg tcggtaatct gagccaagtc 3660
gtggttatga agagcaagaa cgacaagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720
gacaacaatg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780
ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgca gcagccgtac tttgggctgt 3840
agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888
<210> 8
<211> 1296
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-C"
<400> 8
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Lys Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Lys Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Lys Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Lys Lys Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Lys Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Asn
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Lys Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 9
<211> 3888
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-D"
<400> 9
atgccattcg tcaacaagca attcaactac aaagacccag tcaacggcgt cgacatcgca 60
tacatcaaga ttccgaacgc cggtcaaatg cagccggtta aggcttttaa gatccacaac 120
aagatttggg ttatcccgga gcgtgacacc ttcacgaacc cggaagaagg cgatctgaac 180
ccgccaccgg aagcgaagca agtccctgtc agctactacg attcgacgta cctgagcacg 240
gataacgaaa aagataacta cctgaaaggt gtgaccaagc tgttcgaacg tatctacagc 300
acggatctgg gtcgcatgct gctgactagc attgttcgcg gtatcccgtt ctggggtggt 360
agcacgattg acaccgaact gaaggttatc gacactaact gcattaacgt tattcaaccg 420
gatggtagct atcgtagcga agagctgaat ctggtcatca ttggcccgag cgcagacatt 480
atccaattcg agtgcaagag ctttggtcac gaggttctga atctgacccg caatggctat 540
ggtagcaccc agtacattcg tttttcgccg gattttacct tcggctttga agagagcctg 600
gaggttgata ccaatccgtt gctgggtgcg ggcaaattcg ctaccgatcc ggctgtcacg 660
ctggcccatg aactgatcca cgcaggccac cgcctgtacg gcattgccat caacccaaac 720
cgtgtgttca aggttaatac gaatgcatac tacgagatga gcggcctgga agtcagcttc 780
gaagaactgc gcaccttcgg tggccatgac gctaaattca ttgacagctt gcaagagaat 840
gagttccgtc tgtactacta taacaaattc aaagacattg caagcacgtt gaacaaggcc 900
aaaagcatcg ttggtactac cgcgtcgttg cagtatatga agaatgtgtt taaagagaag 960
tacctgctgt ccgaggatac ctccggcaag tttagcgttg ataagctgaa gtttgacaaa 1020
ctgtacaaga tgctgaccga gatttacacc gaggacaact ttgtgaaatt cttcaaagtg 1080
ttgaatcgta aaacctatct gaattttgac aaagcggttt tcaagattaa catcgtgccg 1140
aaggtgaact acaccatcta tgacggtttt aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggtc agaatacgga aatcaacaac atgaatttca cgaagttgaa gaacttcacg 1260
ggtctgttcg agttctataa gctgctgtgc gtgcgcggta tcatcaccag caaaaccaaa 1320
agcctggaca aaggctacaa caaggcgctg aatgacctgt gcattaaggt aaacaattgg 1380
gatctgttct tttcgccatc cgaagataat tttaccaacg acctgaacaa gggtgaagaa 1440
atcaccagcg atacgaatat tgaagcagcg gaagagaata tcagcctgga tctgatccag 1500
cagtactatc tgacctttaa cttcgacaat gaaccggaga acattagcat tgagaatctg 1560
agcagcgaca ttatcggtca gctggaactg atgccgaata tcgaacgttt cccgaacggc 1620
aaaaagtacg agctggacaa gtacactatg ttccattacc tgcgtgcaca ggagtttgaa 1680
cacggtaaaa gccgtatcgc gctgaccaac agcgttaacg aggccctgct gaacccgagc 1740
cgtgtctata ccttcttcag cagcgactat gttaagaaag tgaacaaagc cactgaggcc 1800
gcgatgttcc tgggctgggt ggaacagctg gtatatgact tcacggacga gacgagcgaa 1860
gtgagcacta ccgacaaaat tgctgatatt accatcatta tcccgtatat tggtccggca 1920
ctgaacattg gcaacatgct gtacaaagac gattttgtgg gtgccctgat cttctccggt 1980
gccgtgattc tgctggagtt cattccggag attgcgatcc cggtgttggg taccttcgcg 2040
ctggtgtcct acatcgcgaa taaggttctg acggttcaga ccatcgataa cgcgctgtcg 2100
aaacgtaatg aaaaatggga cgaggtttac aaatacattg ttacgaattg gctggcgaaa 2160
gtcaataccc agatcgacct gatccgtaag aaaatgaaag aggcgctgga gaatcaggcg 2220
gaggccacca aagcaattat caactaccaa tacaaccagt acacggaaga agagaagaat 2280
aacattaact tcaatatcga tgatttgagc agcaagctga atgaatctat caacaaagcg 2340
atgatcaata tcaacaagtt tttgaatcag tgtagcgttt cgtacctgat gaatagcatg 2400
attccgtatg gcgtcaaacg tctggaggac ttcgacgcca gcctgaaaga tgcgttgctg 2460
aaatacattt acgacaatcg tggtacgctg attggccaag ttgaccgctt gaaagacaaa 2520
gttaacaata ccctgagcac cgacatccca tttcaactga gcaagtatgt tgataatcaa 2580
cgtctgttga gcactttcac cgagtatatc aaaaacatca tcaatactag cattctgaac 2640
ctgcgttacg agagcaatca tctgattgat ctgagccgtt atgcaagcaa gatcaacatc 2700
ggtagcaagg tcaattttga cccgatcgat aagaaccaga tccagctgtt taatctggaa 2760
tcgagcaaaa ttgaggttat cctgaaaaac gccattgtct acaactccat gtacgagaat 2820
ttctccacca gcttctggat tcgcatcccg aaatacttca acagcattag cctgaacaac 2880
gagtatacta tcatcaactg tatggagaac aacagcggtt ggaaggtgtc tctgaactat 2940
ggtgagatca tttggacctt gcaggacacc caagagatca agcagcgcgt cgtgttcaag 3000
tactctcaaa tgatcaacat ttccgattac attaatcgtt ggatcttcgt gaccattacg 3060
aataaccgtc tgaataacag caagatttac atcaatggtc gcttgatcga tcagaaaccg 3120
attagcaacc tgggtaatat ccacgcaagc aacaacatta tgttcaaatt ggacggttgc 3180
cgcgataccc atcgttatat ctggatcaag tatttcaacc tgtttgataa agaactgaat 3240
gagaaggaga tcaaagattt gtatgacaac caatctaaca gcggcatttt gaaggacttc 3300
tggggcgatt atctgcaata cgataagccg tactatatgc tgaacctgta tgatccgaac 3360
aaatatgtgg atgtcaataa tgtgggtatt cgtggttaca tgtatttgaa gggtccgcgt 3420
ggcagcgtta tgacgaccaa catttacctg aactctagcc tgtaccgtgg tacgaaattc 3480
atcattaaga aatatgccag cggcaacaaa gataacattg tgcgtaataa cgatcgtgtc 3540
tacatcaacg tggtcgtgaa gcgtaaagag taccgtctgg cgaccaacgc ttcgcaggcg 3600
ggtgttgaga aaattctgag cgcgttggag atccctcgtg tccgtcgtct gagccaagtc 3660
gtggttatga agagcaagaa cgaccagggt atcactaaca agtgcaagat gaacctgcaa 3720
gaccgtcgtg gtaacgacat cggctttatt ggtttccacc agttcaacaa tattgctaaa 3780
ctggtagcga gcaattggta caatcgtcag attgagcgcc gtagccgtcg tttgggctgt 3840
agctgggagt ttatcccggt cgatgatggt tggggcgaac gtccgctg 3888
<210> 10
<211> 1296
<212> БЕЛОК
<213> искусственная
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Cat-D"
<400> 10
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser
885 890 895
Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn
900 905 910
Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu
915 920 925
Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser
930 935 940
Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn
945 950 955 960
Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val
965 970 975
Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu
980 985 990
Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser
995 1000 1005
Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln
1025 1030 1035
Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn Asn Ile
1040 1045 1050
Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile Trp
1055 1060 1065
Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
1070 1075 1080
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val
1115 1120 1125
Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val
1130 1135 1140
Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Thr
1145 1150 1155
Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly Asn Lys Asp Asn Ile
1160 1165 1170
Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val Val Val Lys Arg
1175 1180 1185
Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gln Ala Gly Val Glu
1190 1195 1200
Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Arg Val Arg Arg Leu Ser
1205 1210 1215
Gln Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gln Gly Ile Thr Asn
1220 1225 1230
Lys Cys Lys Met Asn Leu Gln Asp Arg Arg Gly Asn Asp Ile Gly
1235 1240 1245
Phe Ile Gly Phe His Gln Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala
1250 1255 1260
Ser Asn Trp Tyr Asn Arg Gln Ile Glu Arg Arg Ser Arg Arg Leu
1265 1270 1275
Gly Cys Ser Trp Glu Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu
1280 1285 1290
Arg Pro Leu
1295
<210> 11
<211> 1315
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 1"
<400> 11
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu
865 870 875 880
Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly
885 890 895
Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln
900 905 910
Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn
915 920 925
Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe
930 935 940
Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile
945 950 955 960
His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp
965 970 975
Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile
980 985 990
Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp
995 1000 1005
Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn
1010 1015 1020
Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser
1025 1030 1035
Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu
1040 1045 1050
Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile
1055 1060 1065
Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser
1070 1075 1080
Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu
1085 1090 1095
Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr
1100 1105 1110
Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys
1115 1120 1125
Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln
1130 1135 1140
Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys
1145 1150 1155
Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp
1160 1165 1170
Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu
1190 1195 1200
Glu Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe
1205 1210 1215
Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr
1220 1225 1230
Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu
1235 1240 1245
Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val
1250 1255 1260
Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu
1265 1270 1275
Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn
1280 1285 1290
Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His
1295 1300 1305
His His His His His His His
1310 1315
<210> 12
<211> 1327
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 2"
<400> 12
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Glu Leu Gly Gly Gly Gly
865 870 875 880
Ser Glu Leu Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr
885 890 895
Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu
900 905 910
Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr
915 920 925
Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile
930 935 940
Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile
945 950 955 960
Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr
965 970 975
Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile
980 985 990
Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr
995 1000 1005
Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu
1010 1015 1020
Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn
1025 1030 1035
Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp
1040 1045 1050
Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe
1055 1060 1065
Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys
1070 1075 1080
Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu
1085 1090 1095
Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys Asp Phe
1100 1105 1110
Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met Phe Asn
1115 1120 1125
Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro
1130 1135 1140
Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn Ser Lys
1145 1150 1155
Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe Ile Ile
1160 1165 1170
Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg
1175 1180 1185
Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu
1190 1195 1200
Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Met Lys
1205 1210 1215
Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr
1220 1225 1230
Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln
1235 1240 1245
Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu
1250 1255 1260
Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu
1265 1270 1275
Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val
1280 1285 1290
Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe
1295 1300 1305
Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His His His His
1310 1315 1320
His His His His
1325
<210> 13
<211> 1314
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3A"
<400> 13
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala
885 890 895
Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe
900 905 910
Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln
915 920 925
Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp
930 935 940
Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His
945 950 955 960
Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys
965 970 975
Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn
980 985 990
Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile
995 1000 1005
Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn
1025 1030 1035
Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile
1040 1045 1050
Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp
1055 1060 1065
Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn
1070 1075 1080
Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp
1115 1120 1125
Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn
1130 1135 1140
Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe
1145 1150 1155
Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile
1160 1165 1170
Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn
1175 1180 1185
Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu
1190 1195 1200
Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr
1205 1210 1215
Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser
1220 1225 1230
Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile
1235 1240 1245
Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe
1250 1255 1260
Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys
1265 1270 1275
Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp
1280 1285 1290
Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu His His His His
1295 1300 1305
His His His His His His
1310
<210> 14
<211> 1304
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3B"
<400> 14
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala
885 890 895
Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe
900 905 910
Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln
915 920 925
Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp
930 935 940
Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His
945 950 955 960
Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys
965 970 975
Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn
980 985 990
Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile
995 1000 1005
Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn
1025 1030 1035
Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile
1040 1045 1050
Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp
1055 1060 1065
Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn
1070 1075 1080
Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp
1115 1120 1125
Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn
1130 1135 1140
Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe
1145 1150 1155
Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile
1160 1165 1170
Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn
1175 1180 1185
Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu
1190 1195 1200
Met Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Tyr
1205 1210 1215
Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser
1220 1225 1230
Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile
1235 1240 1245
Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe
1250 1255 1260
Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys
1265 1270 1275
Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp
1280 1285 1290
Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
1295 1300
<210> 15
<211> 1304
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный BoNT/A "Химера 3C"
<400> 15
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe
450 455 460
Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu
485 490 495
Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro
500 505 510
Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu
515 520 525
Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu
530 535 540
Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu
545 550 555 560
His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu
565 570 575
Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys
580 585 590
Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu
595 600 605
Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr
610 615 620
Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu
645 650 655
Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala
660 665 670
Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys
675 680 685
Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu
690 695 700
Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys
705 710 715 720
Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu
725 730 735
Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn
740 745 750
Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp
755 760 765
Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile
770 775 780
Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met
785 790 795 800
Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys
805 810 815
Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly
820 825 830
Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp
835 840 845
Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser
850 855 860
Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn
865 870 875 880
Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala
885 890 895
Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe
900 905 910
Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln
915 920 925
Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp
930 935 940
Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His
945 950 955 960
Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys
965 970 975
Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn
980 985 990
Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile
995 1000 1005
Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn
1010 1015 1020
Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn
1025 1030 1035
Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile
1040 1045 1050
Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe Ile Trp
1055 1060 1065
Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln Ser Asn
1070 1075 1080
Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr Leu Lys
1085 1090 1095
Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr Tyr Met
1100 1105 1110
Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp
1115 1120 1125
Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln Asn
1130 1135 1140
Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe
1145 1150 1155
Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile
1160 1165 1170
Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn
1175 1180 1185
Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu
1190 1195 1200
Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr
1205 1210 1215
Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser
1220 1225 1230
Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile
1235 1240 1245
Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe
1250 1255 1260
Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys
1265 1270 1275
Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp
1280 1285 1290
Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
1295 1300
<210> 16
<211> 1291
<212> БЕЛОК
<213> Clostridium botulinum
<400> 16
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Thr Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asp Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Ala Pro Gly Ile Cys Ile Asp
435 440 445
Val Asp Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser
450 455 460
Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Ile Glu Tyr Asn Thr Gln Ser Asn
465 470 475 480
Tyr Ile Glu Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr
500 505 510
Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys
515 520 525
Lys Ile Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln
530 535 540
Thr Phe Pro Leu Asp Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp
545 550 555 560
Asp Ala Leu Leu Phe Ser Asn Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp
565 570 575
Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly
580 585 590
Trp Val Lys Gln Ile Val Asn Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser
595 600 605
Asn Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile
610 615 620
Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu
625 630 635 640
Asn Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ala Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro
645 650 655
Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Ala Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile
660 665 670
Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys
675 680 685
Arg Asn Glu Lys Trp Ser Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp
690 695 700
Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr
705 710 715 720
Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr
725 730 735
Arg Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Lys Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asp
740 745 750
Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Glu Gly Ile Asn Gln Ala Ile
755 760 765
Asp Asn Ile Asn Asn Phe Ile Asn Gly Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met
770 775 780
Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Glu Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn
785 790 795 800
Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr
805 810 815
Leu Ile Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Lys Ser Lys Val Asn Lys Tyr Leu
820 825 830
Lys Thr Ile Met Pro Phe Asp Leu Ser Ile Tyr Thr Asn Asp Thr Ile
835 840 845
Leu Ile Glu Met Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile
850 855 860
Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly
865 870 875 880
Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys
885 890 895
Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr
900 905 910
Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Val Phe Leu Asp Phe Ser Val
915 920 925
Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn
930 935 940
Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser
945 950 955 960
Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile
965 970 975
Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg
980 985 990
Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr
995 1000 1005
Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Lys Leu Glu
1010 1015 1020
Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu Val Ile Ala Asn Gly
1025 1030 1035
Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp Arg Thr Gln Phe
1040 1045 1050
Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu Leu Ser Gln
1055 1060 1065
Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr
1070 1075 1080
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr
1085 1090 1095
Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys
1100 1105 1110
Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn
1115 1120 1125
Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu
1130 1135 1140
Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp
1145 1150 1155
Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn
1160 1165 1170
Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu
1190 1195 1200
Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr
1205 1210 1215
Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp
1220 1225 1230
Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile
1235 1240 1245
Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr
1250 1255 1260
Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys
1265 1270 1275
Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
1280 1285 1290
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕЙРОТОКСИНА БОТУЛИНА СЕРОТИПА E | 2019 |
|
RU2800604C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН | 2017 |
|
RU2789302C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЙ БОТУЛИНИЧЕСКИЙ НЕЙРОТОКСИН | 2016 |
|
RU2746736C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2021 |
|
RU2840027C1 |
| ГИБРИДНЫЕ НЕЙРОТОКСИНЫ | 2017 |
|
RU2782382C2 |
| НЕ ТОКСИЧЕСКИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ КЛОСТРИДИАЛЬНОГО НЕЙРОТОКСИНА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ | 2020 |
|
RU2839368C1 |
| НОВЫЕ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРЕМОРА | 2020 |
|
RU2826569C2 |
| БИОГИБРИД БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА | 2019 |
|
RU2816855C2 |
| КОМПЛЕКС, ПРЕПАРАТ И ПРИМЕНЕНИЕ БОТУЛОТОКСИНА ТИПА А CLOSTRIDIUM BOTULINUM | 2020 |
|
RU2783511C1 |
| СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ | 2018 |
|
RU2719164C1 |
Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики. 1 и 2 объекты представляют собой способы лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта и детей, включающие введение модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта, где модифицированный BoNT/A вводят в стандартной дозе от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A у взрослого субъекта и от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A у субъекта-ребенка, во множество пораженных мышц, и модифицированный BoNT/А содержит домен легкой цепи и транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC). 3-6 объекты – стандартные дозированные формы модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) для лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта и детей, а также содержащие их наборы. 7 и 8 объекты – способы лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта и детей, включающие введение субъекту стандартной дозированной формы. Технический результат заключается в лечении спастичности конечностей модифицированным BoNT/A с введением безопасной и эффективной стандартной дозы, а также общей дозы, которую можно безопасно вводить при однократном лечении. 8 н. и 23 з.п. ф-лы, 11 ил., 15 табл., 13 пр.
1. Способ лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в стандартной дозе от 750 пг до 17000 пг модифицированного BoNT/A во множество пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча, подлопаточную мышцу, грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят в пораженную мышцу второй группы, и где общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 255000 пг, и
где модифицированный BoNT/А содержит домен легкой цепи и транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
2. Способ по п. 1:
a) в котором стандартная доза составляет от 1000 пг до 16000 пг модифицированного BoNT/A;
b) в котором общая вводимая доза составляет от 12750 пг до 255000 пг;
c) в котором общая вводимая доза составляет до 240000 пг;
d) в котором общая вводимая доза составляет от 15000 пг до 240000 пг; и/или
e) в котором общая вводимая доза составляет от 85333 пг до 240000 пг.
3. Способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) внутримышечной инъекцией во множество пораженных мышц субъекта,
где модифицированный BoNT/A вводят в стандартной дозе от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A для множества пораженных мышц,
где множество пораженных мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, двуглавую мышцу плеча, медиальную головку икроножной мышцы, латеральную головку икроножной мышцы, длинный сгибатель пальцев, длинный сгибатель большого пальца стопы, икроножную мышцу, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу большого пальца кисти, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу, мышцу, противопоставляющую большой палец кисти, большую приводящую мышцу, длинную приводящую мышцу, короткую приводящую мышцу, тонкую мышцу бедра, медиальные мышцы задней поверхности бедра, латеральные мышцы задней поверхности бедра, напрягатель широкой фасции бедра, прямую мышцу бедра, латеральную широкую мышцу бедра, медиальную широкую мышцу бедра, промежуточную широкую мышцу бедра, большую ягодичную мышцу, переднюю большеберцовую мышцу, короткий сгибатель пальцев, длинный разгибатель большого пальца и короткий сгибатель большого пальца; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча, подлопаточную мышцу, грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, камбаловидную мышцу, заднюю большеберцовую мышцу, плечелучевую мышцу, большую круглую мышцу, подвздошно-поясничную мышцу и икроножную мышцу; и
где одну стандартную дозу вводят в пораженную мышцу первой группы и/или несколько стандартных доз вводят в пораженную мышцу второй группы, и где общая доза, вводимая во время лечения, составляет до 127500 пг, и
где модифицированный BoNT/А содержит домен легкой цепи и транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
4. Способ по п. 3,
a) в котором стандартная доза составляет от 500 пг до 8000 пг модифицированного BoNT/A;
b) в котором общая вводимая доза составляет от 6375 пг до 127500 пг;
c) в котором общая вводимая доза составляет до 120000 пг;
d) в котором общая вводимая доза составляет от 7500 до 120000 пг;
e) в котором общая вводимая доза составляет от 42666,5 пг до 120000 пг; и/или
f) в котором общее количество вводимых стандартных доз до 10х превышает стандартную дозу;
5. Способ по п. 3 или 4,
a) в котором общая вводимая доза составляет от 3750 пг до 85000 пг; и/или
b) в котором общая доза, вводимая во время лечения, составляет 85000 пг.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором модифицированный BoNT/A имеет коэффициент безопасности более 7, где коэффициент безопасности рассчитывается как: доза токсина, необходимая для изменения массы тела на -10%, измеренная как пг/мышь, деленная на DAS ED50, измеренную как пг/мышь, где ED50=доза, необходимая для получения оценки DAS, равной 2.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором спастичность конечности представляет собой спастичность верхней конечности.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором множество мышц выбрано из:
первой группы, включающей: поверхностный сгибатель пальцев, глубокий сгибатель пальцев, лучевой сгибатель запястья, локтевой сгибатель запястья, плечелучевую мышцу, круглый пронатор, дельтовидную мышцу, мышцу, поднимающую лопатку, квадратный пронатор, длинный сгибатель большого пальца кисти, приводящую мышцу, короткий сгибатель большого пальца кисти, длинную ладонную мышцу, червеобразную мышцу и мышцу, противопоставляющую большой палец кисти; и
второй группы, включающей: трехглавую мышцу плеча, подлопаточную мышцу, грудную мышцу, широчайшую мышцу спины, двуглавую мышцу плеча, плечевую мышцу, плечелучевую мышцу и большую круглую мышцу.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором модифицированный BoNT/A содержит полипептидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов:
a) в котором модифицированный BoNT/А вводят в виде стандартной дозы в место инъекции во множество пораженных мышц, где разовую дозу вводят в выбранное место инъекции в пораженную мышцу первой группы и/или вводят несколько стандартных доз в выбранные разные места инъекции пораженной мышцы второй группы; или
b) в котором модифицированный BoNT/A вводят в количестве меньше стандартной дозы на место инъекции; и/или
c) в котором одну стандартную дозу вводят во множество мест инъекций в пораженную мышцу первой группы и/или множество стандартных доз вводят во множество мест инъекций в пораженную мышцу второй группы.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором трехглавая мышца плеча представляет собой длинную головку трехглавой мышцы плеча.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором вторая группа включает большую грудную мышцу.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором модифицированный BoNT/А находится в двухцепочечной форме.
14. Способ по п. 13, в котором двойная цепь содержит легкую цепь и тяжелую цепь, соединенные вместе дисульфидной связью.
15. Способ по п. 13 или 14, в котором двухцепочечный модифицированнй BoNT/A можно получить способом, включающим предоставление одноцепочечного модифицированного BoNT/A, содержащего полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, 11, 12, 13 или 15, и приведение в контакт модифицированного BoNT/A с протеазой, которая расщепляет полипептид в сайте расщепления, расположенном между легкой цепью и тяжелой цепью.
16. Стандартная дозированная форма модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) для лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта, где стандартная дозированная форма содержит от 750 до 17000 пг модифицированного BoNT/A, и где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
17. Стандартная дозированная форма по п. 16, содержащая от 1000 до 16000 пг модифицированного BoNT/A.
18. Стандартная дозированная форма модифицированного ботулинического нейротоксина A (BoNT/A) для лечения спастичности конечностей у детей, где стандартная дозированная форма содержит от 375 пг до 8500 пг модифицированного BoNT/A, где модифицированный BoNT/A содержит легкую цепь и домен транслокации BoNT/A, и рецептор-связывающий домен BoNT/B (домен HC).
19. Стандартная дозированная форма по п. 18, содержащая от 500 до 8000 пг модифицированного BoNT/A.
20. Стандартная дозированная форма по любому из пп. 16-19, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант и/или соль.
21. Стандартная дозированная форма по любому из пп. 16-20, где модифицированный BoNT/А находится в двухцепочечной форме.
22. Стандартная дозированная форма по п. 21, где двойная цепь содержит легкую цепь и тяжелую цепь, соединенные вместе дисульфидной связью.
23. Стандартная дозированная форма по п. 21 или 22, где двухцепочечный модифицированный BoNT/A можно получить способом, включающим предоставление одноцепочечного модифицированного BoNT/A, содержащего полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, 11, 12, 13 или 15, и приведение в контакт модифицированного BoNT/A с протеазой, которая расщепляет полипептид в сайте расщепления, расположенном между легкой цепью и тяжелой цепью.
24. Набор для лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта, содержащий:
а. стандартную дозированную форму по любому из пп. 16, 17 или 20-23; и
b. инструкции по ее применению при лечении спастичности конечностей.
25. Набор для лечения спастичности конечностей у детей, содержащий:
а. стандартную дозированную форму по любому из пп. 18-23; и
b. инструкции по ее применению при лечении спастичности конечностей.
26. Набор по п. 24 или 25, который дополнительно содержит разбавитель.
27. Набор по любому из предшествующих пунктов, где модифицированный BoNT/А находится в двухцепочечной форме.
28. Набор по п. 27, где двойная цепь содержит легкую цепь и тяжелую цепь, соединенные вместе дисульфидной связью.
29. Набор по п. 27 или 28, где двухцепочечный модифицированный BoNT/A можно получить способом, включающим предоставление одноцепочечного модифицированного BoNT/A, содержащего полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 14, 11, 12, 13 или 15, и приведение в контакт модифицированного BoNT/A с протеазой, которая расщепляет полипептид в сайте расщепления, расположенном между легкой цепью и тяжелой цепью.
30. Способ лечения спастичности конечностей у взрослого субъекта, включающий введение указанному субъекту стандартной дозированной формы по любому из пп. 16, 17 или 20-23.
31. Способ лечения спастичности конечностей у детей, включающий введение субъекту стандартной дозированной формы по пп. 18-23.
| US 2019127427 A1, 02.05.2019 | |||
| WO 2019122166 A1, 27.06.2019 | |||
| US 2018298366 A1, 18.10.2018 | |||
| BENTOVGLIO A.R | |||
| et al | |||
| Способ изготовления звездочек для французской бороны-катка | 1922 |
|
SU46A1 |
| Botulinum toxin in movement disorders // Parkinson’s disease & movement disorders, 6th edition | |||
| - Wolters Kluver, 2015 | |||
| - P | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛОРИСТОГО БАРИЯ ИЗ ТЯЖЕЛОГО ШПАТА | 1923 |
|
SU480A1 |
