БИОГИБРИД БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА Российский патент 2024 года по МПК C07K14/33 A61K38/48 A61K8/66 C12N9/52 C12N15/62 A61Q19/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидам ботулинического нейротоксина и, в особенности, к химерной тяжелой цепи ботулинического нейротоксина.

Уровень техники

Ботулинические нейротоксины (BoNT) представляют собой наиболее мощные известные человеку белковые токсины, которые возбуждают ботулизм, редкое вызывающее паралич заболевания. Это семейство бактериальных токсинов состоит из восьми серотипов, BoNT/A-G, и недавно описанного BoNT/X (Montal, 2010; Zhang et al., 2017). Все они имеют общую архитектуру и экспрессируются в виде белка с молекулярной массой 150 кДа, который пост-трансляционно расщепляется в двухцепочечную молекулу, состоящую из легкой цепи (LC, 50 кДа), связанную одним дисульфидным мостиком с тяжелой цепью (HC, 100 кДа). HC содержит два функциональных домена с N-концевым доменом транслокации (H_N) и C-терминальным доменом связывания (H_C), в то время как LC отвечает за внутриклеточную каталитическую активность. BoNT сначала распознают холинергические нервные окончания через специфические рецепторы клеточной поверхности, а затем переносятся в пузырьке путем эндоцитоза. Кислая эндосомальная среда вызывает конформационные изменения, которые позволяют осуществляться транслокации LC внутри цитозоля, также называемой транслокацией токсина. Освобожденный каталитический домен, цинковая протеаза, может затем специфически нацеливаться на один из трех нейрональных SNARE (растворимый чувствительный к N-этилмалеимиду фактор прикрепления белковых рецепторов): BoNT/A, /C и /E расщепляют SNAP-25; BoNT/B, /D, /F, /G и /X нацелены на VAMP (синаптобревин); синтаксин расщепляется под действием BoNT/C (Schiavo et al., 2000; Zhang et al., 2017). Эти три белка образуют комплекс, который обеспечивает слияние синаптических везикул с плазматическую мембраной (Sudhof and Rothman, 2009). Протеолиз любого из SNARE ингибирует экзоцитоз и, следовательно, высвобождение нейротрансмиттеров, эффективно вызывая атонический паралич, симптоматический для ботулизма (Rossetto et al., 2014). Последовательность трех функциональных доменов была описана ранее (Lacy DB, et al. 1999). Каталитический домен состоит из аминокислот 1-437, домен транслокации – из аминокислот 448-872, и связывающий домен – из аминокислот 873-1295, в соответствии с последовательностью BoNT/A, представленной в работе Lacy DB, et al. Поскольку все серотипы BoNT и их подтипы в значительной степени гомологичны, то положение соответствующих доменов в любом другом серотипе или подтипе будет очень похожим.

Высокая эффективность этих токсинов делает их чрезвычайно полезным терапевтическим средством для лечения растущего числа нервно-мышечных расстройств, таких как косоглазие, цервикальная дистония и блефароспазм, а также других состояний, связанных с выделением ацетилхолина, таких как повышенное потоотделение (Chen, 2012). BoNT/A и /B представляют собой единственные серотипы, одобренные и коммерчески доступные в качестве терапевтических средств. Обычно считается, что BoNT/A обладает более высокой эффективностью у людей, и поэтому в большинстве случаев представляет собой предпочтительный серотип (Bentivoglio et al., 2015). Однако лечение с помощью BoNT обычно требует повторных инъекций, поскольку терапевтические эффекты токсинов только временные. Сообщается, что это привело к появлению резистентности у небольшой группы пациентов, у которых развился иммунный ответ на BoNT/A (Lange et al., 2009; Naumann et al., 2013). Хотя BoNT/B представляет собой альтернативу, его более низкая эффективность означает, что требуются более высокие дозы, и, следовательно, увеличивается риск иммуногенности (Dressler and Bigalke, 2005). Кроме того, BoNT/B также связан с рядом неблагоприятных исходов, таких как болезненность инъекции, более короткая продолжительность действия и более частые побочные эффекты (Bentivoglio et al., 2015). Основные побочные эффекты также часто связаны с лечением мышечных спазмов, а не с косметическими применениями. Это связано с тем, что неблагоприятные эффекты в значительной степени связаны с диффузией токсинов в другие области тела, и с вероятностью того, что диффузия токсинов напрямую связана с инъекционными дозами. Побочные эффекты варьируют от кратковременных несерьезных явлений, таких как птоз и диплопия, до угрожающих жизни событий, даже смерти.

Связывание BoNT/A и /B с нейронами было детально охарактеризовано и основано на механизме двойного рецептора, включающем белок синаптической везикулы и ганглиозид, закрепленный на нейрональной мембране. Белковый рецептор для BoNT/A был идентифицирован как SV2 (Dong et al., 2006, Mahrhold et al., 2006). Точнее, BoNT/A может связываться с несколькими человеческими изоформами SV2 A, B и C, хотя токсин распознает только N-гликозилированные формы SV2A и SV2B (Yao et al., 2016). Белковый рецептор для BoNT/B представляет собой синаптотагмин (Syt) (Nishiki et al., 1994, 1996; Dong et al., 2003), с предпочтением для Syt1 по сравнению с Syt2 у людей (Strotmeier et al., 2012). Распознавание ганглиозидов представляет собой первый этап процесса интоксикации для всех BoNT (Binz and Rummel, 2009) и опосредуется общим механизмом связывания, сосредоточенным на консервативном мотиве H…SxWY…G в их последовательности. BoNT/A предпочитает связываться с концевой N-ацетилгалактозамин-галактозной группировкой GT1b и GD1a (Takamizawa et al. 1986; Schengrundet al. 1991), в то время как данные по BoNT/B указывают на предпочтение дисиалильного мотива в GD1b и GT1b. Различные серотипы различаются по своей углеводной специфичности и аффинности (Rummel, 2013).

Модульное расположение и отличительные свойства различных серотипов BoNT сделали токсины предпочтительной мишенью для белковой инженерии. В особенности, несколько исследований показали, что существует возможность менять местами целые домены между серотипами (Masuyer et al., 2014) и, таким образом, получать новые токсины с уникальным фармацевтическим потенциалом. Например, было получено несколько молекул, состоящих из домена связывания BoNT/B, связанного с транслокацией, и каталитических доменов BoNT/A (Rummel et al., 2011; Wang et al., 2012; Kutschenko et al., 2017). Эти так называемые химерные токсины обладали привлекательными фармакологическими свойствами с точки зрения эффективности и продолжительности сохранения активности, которые были связаны с высоким сродством BoNT/B к синаптотагмину, и более высокой экспрессией этого рецептора на нейронах по сравнению с SV2 (Takamori et al., 2006; Вильгельм и др., 2014).

Раскрытие изобретения

Поскольку как генерация нейтрализующих антител, так и диффузия токсина напрямую связаны с введенными дозами, то снижение доз токсина, при сохранении тех же уровней активности токсина, крайне желательно, это означает, что эффективность отдельных молекул токсина должна быть повышена. Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении полипептидов BoNT с улучшенной продолжительностью действия и эффективностью и с меньшим риском распространения от места инъекции. Авторы изобретения определили ключевую проблему, вытекающую из предыдущих упомянутых выше попыток разработать химерные полипептиды BoNT. Ни одна из предыдущих попыток не принимала во внимание структурный аспект полипептида.

Применяя основанный на структуре подход и современные знания о механизмах связывания рецепторов BoNT/A и /B, авторы изобретения разработали новую молекулу TriRecABTox (BoNT/TAB), содержащую специально сконструированный домен H_C (H_C/TAB), который способен распознавать рецептор SV2C, рецептор синаптотагмина и рецептор ганглиозида. Авторы изобретения показали, что BoNT/TAB можно рекомбинантно экспрессировать и очищать. С помощью рентгеновской кристаллографии, авторы изобретения дополнительно продемонстрировали, что BoNT/TAB может связываться с тремя своими рецепторами одновременно. Таким образом, BoNT/TAB должен распознавать нейрональные клетки с повышенной аффинностью и потенциально может быть высокоэффективной альтернативой лечению с помощью BoNT/A.

Таким образом, вышеуказанную цель достигают с помощью первого аспекта, обеспечивающего связывающий домен тяжелой цепи (H_C/TAB) ботулинического нейротоксина (BoNT), в котором H_C/TAB включает а) сайт связывания рецептора синаптотагмина (Syt), b) сайт связывания рецептора синаптической везикулы 2 (SV2) и c) сайт связывания рецептора ганглиозида (Gang), и в котором указанный H_C/TAB адаптирован для синергетического связывания с рецептором синаптотагмина (Syt), рецептором синаптической везикулы 2 (SV2) и рецептором ганглиозида (Gang).

H_C/TAB имеет N-концевую область (H_CN) и C-концевую область (H_CC). В соответствии с одним из воплощений домен H_CC состоит взаимозаменяемо из последовательностей из BoNT серотипа A (BoNT/A) и BoNT серотипа B (BoNT/B).

В соответствии с дополнительным воплощением указанная концевая область H_CC составлена в соответствии с последовательностью A₁B₁A₂B₂A₃, где А обозначает последовательность из BoNT/A, и В обозначает последовательность из BoNT/B.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности B1, A2 и B2 содержат мутации и/или делеции для создания стабильных внутримолекулярных интерфейсов для всего H_C/TAB.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Gang, происходят из любого серотипа BoNT, связывающегося с рецептором Gang, и их подтипов.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания с рецептором Gang, происходят от BoNT/B.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Gang, расположены в B₂.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, происходят из любого серотипа BoNT, связывающегося с рецептором Syt, и их подтипов.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептор Syt, происходят из BoNT B, DC или G.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, локализованы в B₁ и B₂.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательность H_CN происходит от любого связывающего SV2-рецептор серотипа BoNT и их подтипов.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением H_CN происходит от BoNT/A.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением последовательности, формирующие сайт связывания рецептор SV2, локализованы в H_CN и в A₁ и A₃ в H_CC.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением H_C/TAB имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентична любой последовательности из SEQ ID №№ 1, 3, 5, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии со вторым аспектом, обеспечивают полипептид, включающий H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, связанный с любым другим белком, полипептидом, аминокислотной последовательностью или флуоресцентным зондом, непосредственно или через линкер.

В соответствии с воплощением второго аспекта, указанный полипептид представляет собой полипептид BoNT (BoNT/TAB), характеризуемый тем, что указанный BoNT/TAB в дополнение к H_C/TAB включает домен транслокации тяжелой цепи (H_N), легкую цепь (LC) и сайт антипротеазы, расположенный между LC и H_N в полипептидной последовательности, в которой H_N и LC, соответственно и независимо друг от друга, происходят из любого из серотипов BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G или X их подтипов, а также BoNT-подобных полипептидов.

В соответствии с дополнительным воплощением, полипептид может включать любой другой белок, полипептид, аминокислотную последовательность или флуоресцентный зонд, связанный с ним непосредственно или через линкер.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением сайт протеазы представляет собой сайт экзопротеазы. В соответствии с еще одним дополнительным воплощением сайт экспротеазы представляет собой сайт фактора Ха.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением полипептид по второму аспекту имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична последовательности любой из SEQ ID №№ 1, 3, 5, 6, 8, 10 или 12.

В соответствии с третьим аспектом обеспечивают вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта.

В соответствии с четвертым аспектом обеспечивают применение H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта, в терапевтическом способе или в косметическом способе.

В соответствии с одним из воплощений четвертого аспекта, терапевтический способ или косметический способ представляет собой лечение для ослабления и/или инактивации мышц.

В соответствии с дополнительным воплощением четвертого аспекта, терапевтический способ представляет собой лечение и/или профилактику расстройства, выбранного из группы, включающей нервно-мышечные расстройства, состояния, включающие высвобождение ацетилхолина, и спастические мышечные расстройства.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением расстройство выбирают из группы, включающей спастическую дисфонию, спастическую кривошею, дистонию гортани, оромандибулярную дисфонию, лингвальную дистонию, цервикальную дистонию, фокальную дистонию кистей, блефароспазм, косоглазие, гемифациальный спазм, расстройство движения век, церебральный паралич, фокальную спастичность и другие нарушения голоса, спастический колит, нейрогенный мочевой пузырь, анизмус, спастичность конечностей, тики, тремор, бруксизм, анальную трещину, ахалазию, дисфагию и другие расстройства мышечного тонуса и другие расстройства, характеризующиеся непроизвольными движениями мышечных групп, слезоточивость, повышенное потоотделение, чрезмерное слюноотделение, чрезмерную секрецию в желудочно-кишечном тракте, расстройства секреторной функции, боли от мышечных спазмов, головную боль, спортивные травмы и депрессию.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта, может быть применен в фармакологическом тесте для исследования роли указанного белка, полипептида, аминокислотной последовательности или флуоресцентного зонда в синаптическом процессе.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта, может быть применен в качестве носителя для эффективной транспортировки любого белка, полипептида, аминокислотной последовательности или флуоресцентного зонда, связанных с ним, к поверхности нейронов.

В соответствии с еще одним дополнительным воплощением H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта, может быть применен в качестве носителя для эффективной транспортировки любого белка, полипептида, аминокислотной последовательности или флуоресцентного зонда в нейрональный цитозоль с помощью системы транслокации токсина.

В соответствии с пятым аспектом обеспечивают фармацевтическую или косметическую композицию, включающую H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептид в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта.

В соответствии с одним из воплощений пятого аспекта, композиция может дополнительно включать фармацевтически и/или косметически приемлемые вспомогательные вещества, носители или другие добавки.

В соответствии с шестым аспектом обеспечивают составной набор, включающий композицию пятого аспекта и инструкцию для терапевтического введения композиции.

В соответствии с седьмым аспектом обеспечивают способ лечения состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, способ, включающий введение терапевтически эффективного количества H_C/TAB в соответствии с первым аспектом и любым воплощением первого аспекта, или полипептида в соответствии со вторым аспектом и любым воплощением второго аспекта, или композиции по пятому аспекту, субъекту, чтобы таким образом лечить состояние, при котором состояние выбирают из группы, включающей спазматическую дисфонию, спазматическую кривошею, дистонию гортани, оромандибулярную дисфонию, лингвальную дистонию, цевикальную дистонию, фокальную дистонию кистей, блефароспазм, косоглазие, гемифациальный спазм, расстройство движения век, церебральный паралич, фокальную спастичность и другие нарушения голоса, спастический колит, нейрогенный мочевой пузырь, анизмус, спастичность конечностей, тики, тремор, бруксизм, анальную трещину, ахалазию, дисфагию и другие расстройства мышечного тонуса, и другие расстройства, характеризующиеся непроизвольными движениями мышечных групп, слезоточивость, повышенное потоотделение, чрезмерное слюноотделение, чрезмерную секрецию желудочно-кишечного тракта, расстройства секреторной функции, боль от мышечных спазмов, головная боль, спортивные травмы и депрессию, а также дерматологические или эстетические/косметические состояния.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Структурная информация о связывании рецепторов с BoNT/A и /B. (а) Наложение кристаллических структур домена связывания BoNT/A в комплексе с GT1b (PDB 2VU) и гликозилированным SV2C человека (PDB 5JLV). (b) Кристаллическая структура домена связывания BoNT/B в комплексе с GD1a и крысиным синаптотагмином 2 (PDB 4KBB). Белки представлены в виде лент, а углеводы в виде палочек. (c) Выравнивание последовательностей Hc/A (Uniprot P10845) и /B (Uniprot P10844), в котором также обеспечены вторичные структурные элементы (фигура, полученная с помощью ESPript3.0; Robert and Gouet, 2014). Области, непосредственно участвующие в связывании рецептора, выделены для каждого домена линией, расположенной выше последовательности Hc/A для рецептора SV2 и ниже последовательности Hc/B для рецептора Syt; сайт связывания ганглиозидного рецептора подчеркнут полосатой серой линией.

Фигура 2: Выравнивание последовательностей HC/TAB с рецептором связывания с HC/A и /B.

Белковые последовательности были выровнены с помощью ClustalO (Sievers et al., 2011). Сегменты H_C/A и H_C/B, примененные в дизайне H_C/TAB, выделены черным (белая надпись) и светло-серым (черная надпись), соответственно. Позиции, в которые были включены удаления, показаны темно-серым цветом (тире).

Фигура 3: Характеристика HC/TAB. (а) SDS-ПААГ анализ очищенного H_C/TAB и сравнение с контролями H_C/A и H_C/B. (b) Вестерн-блот анализ с применением полигистидинового зонда, те же образцы, что и в (а). «М» обозначает маркеры молекулярной массы.

Фигура 4: Рентгеновская кристаллическая структура домена связывания TriRecABTox в комплексе с SV2C, синаптотагмином 1 человека и GD1a. (a) Ленточное представление H_C/TAB с SV2C, hSyt1 и GD1a. (b-d) Пример карты распределения электронной плотности 2Fo-Fc (сетка) на 2σ вокруг сайта связывания рецептора SV2C (b), GD1a (c) и hSyt1 (d).

Фигура 5: Связывание с рецептором SV2. (a) Наложение кристаллической структуры H_C/TAB и H_C/A (PDB 4JRA) в комплексе с hSV2C. (b) Наложение кристаллической структуры H_C/TAB и H_C/A (PDB 5JLV) в комплексе с гликозилированным hSV2. Остатки, участвующие в связывании (Benoit et al., 2014), показаны в виде палочек и помечены согласно соответствующей позиции в H_C/A.

Фигура 6: Связывание с синаптотагмином. Наложение кристаллической структуры H_C/TAB и H_C/B (PDB 4KBB) в комплексе с Syt1 человека и Syt2 крысы, соответственно. Остатки, участвующие в связывании (Jin et al., 2006; Chai et al., 2006), показаны в виде палочек и помечены согласно соответствующей позиции в H_C/B.

Фигура 7: Связывание с GD1a. Наложение кристаллической структуры H_C/TAB и H_C/B (PDB 4KBB) в комплексе с GD1a (темно- и светло-серый, соответственно). Остатки, участвующие в связывании (Berntsson et al., 2013), показаны в виде палочек и помечены согласно соответствующей позиции в H_C/B.

Фигура 8: Характеристика BoNT/TAB. (a) SDS-ПААГ анализ очищенного BoNT/TAB с контролями H_C/A и H_C/B. (b-d) Вестерн-блот анализ с применением полигистидинового зонда (b); антисыворотка H_C/A (c) и H_C/B (d). Те же образцы, что и в (а), «М» обозначает маркеры молекулярной массы.

Фигура 9: Активация BoNT/TAB. (a) Схематическое представление конструкции BoNT/TAB, описывающее организацию функциональной области. Сконструированный сайт активации протеазой показан пунктирной черной линией. Природный дисульфидный мостик между легкой и тяжелой цепями представлен в виде обычной черной линии. (b) SDS-ПААГ анализ активации BoNT/TAB. Невосстановленный (NR) и восстановленный (R) неактивированный BoNT/TAB (слева) и активированный фактором Xa BoNT/TAB (справа), соответственно. Представляющие интерес фрагменты аннотированы; «М» обозначает маркеры молекулярной массы.

Фигура 10: Расширенное применение H_C/TAB. (a) Схематическое представление потенциальных функциональных производных BoNT, связанных с H_C/TAB. Конструкции будут состоять из функциональных доменов BoNT из любых серотипов или подтипов («n»). Сайт активации протеазы (пунктирная черная линия) также должен быть включен. (b) Схематическое изображение потенциальной конструкции, в которой применяют H_C/TAB для транспорта карго-белка к поверхности нейрональных клеток.

Фигура 11: Очистка H_C/TAB. (a) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки аффинной хроматографией с применением 5 мл колонки HisTrap FF. (b) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки гель-фильтрационной хроматографией с применением колонки Superdex 200. Выделены этапы процесса очистки и фракции с H_C/TAB.

Фигура 12: Кристаллы H_C/TAB в комплексе с SV2C, hSyt1 и GD1a. (a) Кристалл выращивают в 20%-ном (объем/ объем) полиэтиленгликоле 6000, 0,1 М цитрате, рН 5,0. (b) Кристалл, установленный на крио-петле для сбора данных на станции Diamond I04-1. (c) Дифракционная рентгенограмма кристалла.

Фигура 13: Очистка BoNT/TAB. (a) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки аффинной хроматографией с применением 5 мл колонки HisTrap FF. (b) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки гель-фильтрационной хроматографией с применением колонки Superdex200. Выделены этапы процесса очистки и фракции с BoNT/TAB.

Фигура 14: Рентгеновская кристаллическая структура домена связывания H_C/TAB в комплексе с SV2C, синаптотагмином 1 человека и GD1a. (a) и (b) Анализ температурного фактора кристаллических структур H_C/TAB (a) и H_C/TAB2.1 (b) – представление Putty radius, где радиус пропорционален B-факторам. Указана петля «360», а позиции 360 и 362 выделены черным. (c) Рентгеновская кристаллическая структура комплекса H_C/TAB2.1 с SV2C, hSyt1 и GD1a (представлен в виде палочек). (d) То же, что (c) с помеченной липидсвязывающей петлей и гидрофобными остатками, показанными в виде палочек.

Фигура 15: Очистка HC/TAB2.1. (a) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки аффинной хроматографией с применением 5 мл колонки HisTrap FF. (б) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) очистки гель-фильтрационной хроматографией с применением колонки Superdex 200. Указаны фракции с H_C/TAB2.1. (c) и (d) Характеристика H_C/TAB2.1. SDS-ПААГ анализ фракций из очищенного H_C/TAB2.1, после аффинной хроматографии в (c) и гель-фильтрационной хроматографии (d); первые полосы слева показывают маркеры молекулярной массы. Указана полоса, соответствующая H_C/TAB2.1.

Фигура 16: Очистка HC/TAB2.1.1 и HC/TAB2.1.3. (a) и (b) Хроматограммы (регистрация при А₂₈₀) очистки аффинной хроматографией и гель-фильтрационной хроматографией H_C/TAB2.1.1, соответственно. Указаны фракции с H_C/TAB2.1.1. (c) и (d) Хроматограммы (регистрация при А₂₈₀) очистки аффинной хроматографией и гель-фильтрационной хроматографией H_C/TAB2.1.3, соответственно. Указаны фракции с H_C/TAB2.1.3. (d) Характеристика H_C/TAB2.1.1 и H_C/TAB2.1.3. SDS-ПААГ анализ очищенных образцов; первая дорожка слева показывает маркеры молекулярной массы. Указаны полосы, соответствующие H_C/TAB2.1.1 и H_C/TAB2.1.3.

Фигура 17: Фигура X4: Очистка BoNT/TAB2.1.3. (a) и (b) ДНС-ПААГ анализ фракций после очистки BoNT/TAB2.1.3. Фракции после аффинной хроматографии (а) и гель-фильтрации (б); первые дорожки слева показывают маркеры молекулярной массы. Указана полоса, соответствующая BoNT/TAB2.1.3. (c) SDS-ПААГ анализ очищенного образца BoNT/TAB2.1.3. На дорожке 1: образец до активации тромбином, на дорожке 2: конечный активированный образец (после обработки тромбином). Указаны полосы, соответствующие полной длине (одноцепочечные), HC и LC. Дорожка справа показывает маркеры молекулярной массы. (d) Хроматограмма (регистрация при А₂₈₀) после окончательной гель-фильтрации (после расщепления тромбином) с применением колонки Superdex 200. Указаны фракции с BoNT/TAB2.1.3.

Определения

Как применен в настоящем документе, термин «ботулинический нейротоксин» «BoNT» охватывает любой полипептид или фрагмент ботулинического нейротоксина. Термин BoNT может относиться к полноразмерному BoNT. Термин BoNT может относиться к фрагменту BoNT, который способен осуществлять полный клеточный механизм, посредством которого BoNT входит в нейрон, и ингибирует высвобождение нейротрансмиттера. Термин BoNT может просто относиться к фрагменту BoNT, без предъявления требований к какой-либо конкретной функции или активности фрагмента.

Как применен в настоящем документе, термин «домен транслокации» или «H_N» означает домен BoNT, который может осуществлять стадию транслокации в процессе интоксикации, обеспечивая транслокацию легкой цепи BoNT. Таким образом, H_N облегчает продвижение легкой цепи BoNT через мембрану в цитоплазму клетки.

Как применен в настоящем документе, термин «связывающий домен» представляет собой синоним термина «домен H_C» и означает любой встречающийся в природе домен, связывающийся с рецептором BoNT, который может осуществлять стадию связывания клеток в процессе интоксикации, включая, например, связывание BoNT со BoNT-специфической рецепторной системой, расположенной на поверхности плазматической мембраны клетки-мишени.

В настоящем раскрытии термины «нуклеиновая кислота» и «ген» применяют взаимозаменяемо для описания нуклеотидной последовательности или полинуклеотида, кодирующего полипептид.

Осуществление изобретения

Как указано выше в разделе «Уровень техники», BoNT включает легкую цепь (LC), связанную одним дисульфидным мостиком с тяжелой цепью (HC). Тяжелая цепь (HC) несет два функциональных домена с N-концевым доменом транслокации (H_N) и C-терминальным доменом связывания (H_C), в то время как LC отвечает за внутриклеточную каталитическую активность. Таким образом, H_C содержит домены связывания с рецептором, которые способны специфически и необратимо связываться со специфическими рецепторами, экспрессируемыми на восприимчивых нейронах, тогда как H_N образует канал, который позволяет присоединенному LC транслоцироваться из эндосомоподобных мембранных везикул в цитозоль. Различные серотипы BoNT имеют разные наборы сайтов связывания рецептора на H_C, обычно два сайта связывания рецептора. Авторы изобретения применили эти знания при разработке нового связывающего домена BoNT H_C (H_C/TAB), включающего сайты связывания для трех различных рецепторов.

Авторы изобретения достигли этого путем конструирования домена H_C/TAB, включающего:

a) сайт связывания рецептора синаптотагмина (Syt), и

b) сайт связывания рецептора синаптических везикул 2 (SV2), и

c) сайт связывания ганглиозидного (Gang) рецептора.

Структура сконструированного домена H_C/TAB позволяет H_C/TAB синергически связываться с рецептором синаптотагмина (Syt), рецептором синаптических везикул 2 (SV2) и ганглиозидным (Gang) рецептором. Таким образом, достигается синергетическое связывание с тремя рецепторами на нейрональной клетке, в результате чего новый домен H_C/TAB обладает повышенной аффинностью по сравнению с другими доменами BoNT H_C. Таким образом, общее связывание с нейронами улучшается, и, следовательно, эффективность токсина улучшается.

H_C дополнительно включает N-концевую область (H_CN) и C-концевую область (H_CC). Структура H_CC-конца H_C/TAB, где рецептор-связывающие домены локализованы в BoNT, представляет собой ключевую особенность настоящего изобретения.

В воплощении для H_C/TAB, концевую область H_CC составляют взаимозаменяемо из последовательностей серотипа A из BoNT (BoNT/A) и серотипа B из BoNT (BoNT/B). Создав эту взаимозаменяемую структуру, авторы изобретения смогли оптимизировать синергетическое связывание со всеми тремя рецепторами.

В дополнительном воплощении изобретения, концевую область H_CC составляют в соответствии с последовательностью A₁B₁A₂B₂A₃, где A обозначает последовательность из BoNT/A, а B обозначает последовательность из BoNT/B, смотри фиг. 2. Это дополнительно оптимизирует структуру H_C/TAB, позволяя трем рецептор-связывающим доменам, по меньшей мере, синергически связываться со всеми тремя указанными рецепторами, возможно, даже одновременно. Авторы изобретения показали, что in vitro происходит одновременное связывание всех трех рецепторов с данной последовательностью A₁B₁A₂B₂A₃. Сконструированная последовательность A₁B₁A₂B₂A₃ в соответствии с данным конкретным воплощением описана в SEQ ID № 1.

Для дальнейшей оптимизации H_C/TAB в соответствии с вышеизложенным были введены мутации и делеции для создания стабильных внутримолекулярных поверхностей контакта, смотри фиг. 2. В SEQ ID № 1 замены были сделаны в положениях 306, 360 и 362, и делеции были сделаны, по сравнению с исходной последовательностью, между позициями 265/266 и 360/361. Однако специалист поймет, что мутации и/или делеции для аминокислоты в положении +1, +2, +3, +4, +5 или -1, -2, -3, -4 или -5 от указанных выше положений могут иметь тот же эффект. Таким образом, любая такая модификация в положении +/- 5 аминокислот от указанных аминокислотных положений попадает в объем настоящего изобретения.

В соответствии с приведенными выше конкретными воплощениями, и во всех приведенных ниже примерах сайт связывания ганглиозидного рецептора происходит от BoNT/B, но вполне возможно, что он может происходить от любого связывающего Gang-рецептор серотипа BoNT и их подтипов, таких как серотипы BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G или X или их подтипы, поскольку все серотипы имеют сайт связывания с ганглиозидным рецептором.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, последовательности, формирующие сайт связывания Gang-рецепторов локализованы в B₂.

Домен, связывающий рецептор SV2, обычно может происходить из любого связывающего рецептор SV2 серотипа BoNT и их подтипов, и, в частности, от серотипов BoNT A, D, E и F. В приведенных выше конкретных воплощениях и во всех приведенных ниже примерах домен, связывающий рецептор SV2, происходит из BoNT/A, но, как будет понятно специалисту, любой серотип, включающий домен, связывающий рецептор SV2, может быть применен в качестве источника для указанного домена в соответствии с целью и предполагаемым применением H_C/TAB в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Часть связывающего домена рецептора SV2 присутствует в концевой области H_CN. Таким образом, как следствие, последовательность HCN может происходить от любого из связывающих SV2-рецептор серотипов BoNT и их подтипов. В приведенных выше конкретных воплощениях и во всех приведенных ниже примерах концевая область H_CN происходит от BoNT/A. Однако, как будет понятно специалисту, до тех пор, пока домен, связывающий рецептор SV2, сохраняет функциональность, последовательность H_CN также может происходить от любого из серотипов BoNT C, D, E, F или G.

Кроме того, в соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, последовательности, формирующие сайт связывания рецептора SV2, локализованы в H_CN и в A₁ и A₃ в H_CC.

Сайт связывания рецептора Syt может происходить от любого из связывающих Syt-рецептор серотипов BoNT и их подтипов. В частности , сайт связывания рецептора Syt может происходить из серотипов BoNT B, химеры DC или G. В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, локализованы в B₁ и B₂.

Настоящее изобретение также обеспечивает полипептид, включающий H_C/TAB в соответствии с вышеизложенным. Таким образом, полипептид может включать любой другой белок, полипептид, аминокислотную последовательность или флуоресцентный зонд, связанный с H_C/TAB либо напрямую, либо через линкер. Ниже в настоящем документе белок, полипептид или аминокислотную последовательность, которые должны быть связаны с H_C/TAB, называют «белком».

Согласно одному из предпочтительных воплощений, полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид BoNT (BoNT/TAB), дополнительно включающий H_N и LC, а также сайт экзопротеазы, расположенный в полипептидной последовательности между LC и H_N.

Сайт экзопротеазы позволяет одноцепочечному полипептиду расщепляться на двухцепочечную молекулу, в результате чего молекула становится активным токсином. В соответствии с воплощением изобретения сайт экзопротеазы представляет собой сайт фактора Ха, хотя это не представляет собой ограничивающий признак полипептида по изобретению.

В соответствии с одним из воплощений, BoNT/TAB в его активной форме соответствует SEQ ID № 5. В соответствии с другим воплощением BoNT/TAB в его активной форме соответствует любой из последовательностей SEQ ID № 6, 8, 10 или 12. Предпочтительно, BoNT/TAB в его активной форме соответствует SEQ ID № 12.

Как H_N, так и LC могут, соответственно и независимо, происходить от любого из серотипов BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G или X и их подтипов, а также от BoNT-подобных полипептидов. Появляются новые белки, напоминающие BoNT, то есть с аналогичной архитектурой доменов и различной степенью идентичности последовательностей, но продуцируемые другими организмами, помимо C. botulinum. Таким образом, специалист сможет выбрать H_N и/или LC из любого из серотипов BoNT, их подтипов или BoNT-подобных полипептидов.

Мутации и делеции, которые вводят в H_C/TAB, как указано выше, дополнительно гарантируют, что сконструированный BoNT/TAB может быть получен в виде растворимого белка с правильной структурой и требуемой активностью.

Полипептид в соответствии с вышеизложенным предпочтительно получают рекомбинантным способом, поскольку H_C/TAB должен быть получен рекомбинантно.

Таким образом, настоящее раскрытие также предусматривает изолированные и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из H_C/TAB или полипептидов в соответствии с вышеизложенным. Нуклеиновые кислоты, кодирующие H_C/TAB или полипептиды по настоящему раскрытию, могут представлять собой ДНК или РНК и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В определенных аспектах рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие изолированные полипептидные фрагменты, также понимают как включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, которые представляет собой варианты любого из H_C/TAB или полипептидов, описанных в настоящем документе. Вариантные нуклеотидные последовательности включают последовательности, которые отличаются одной или несколькими нуклеотидными заменами, добавлениями или делециями, такими как аллельные варианты.

Настоящее изобретение также обеспечивает вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую H_C/TAB в соответствии с вышеизложенным. Вектор может дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой другой белок или зонд, который необходимо рекомбинантно продуцировать вместе с H_C/TAB, чтобы получить указанный белок или зонд, связанный с H_C/TAB в одном полипептиде. Вектор предпочтительно представляет собой вектор экспрессии. Вектор может включать промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой. Для экспрессии полипептидов, описанных в настоящем документе, могут быть применены разнообразные и известные специалисту в данной области техники промоторы.

Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту, может быть перенесен в клетку-хозяина традиционными способами (например, электропорацией, липосомальной трансфекцией и осаждением фосфатом кальция), и затем трансфицированные клетки культивируют традиционными способами для получения полипептидов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления экспрессия описанных в настоящем документе полипептидов регулируется конститутивным, индуцибельным или тканеспецифичным промотором.

Полипептиды можно продуцировать в любых клетках, эукариотических или прокариотических, или в дрожжах. Кроме того, полипептиды по изобретению могут быть получены в бесклеточной системе. Специалист сможет легко применить систему экспрессии с учетом своего выбора. Система экспрессии, применяемая для получения полипептидов, не ограничивает объем изобретения.

Очистка и модификация рекомбинантных белков хорошо известны в данной области техники, так что конструкция предшественника полипротеина может включать ряд воплощений, которые легко могут быть поняты специалистом.

Белок, который должен быть включен в полипептид, может представлять собой любой представляющий интерес белок, который необходимо транспортировать в нейрональную клетку и/или интернализовать в нейрональную клетку.

Может быть выгодно включать H_N в соответствии с вышеизложенным в полипептид вместе с H_C/TAB и заменять LC на представляющий интерес белок, если желательна интернализация белка, так как H_N затем обеспечит канал, позволяющий белку перемещаться в нейрональную клетку. Может быть выгодно связать представляющий интерес белок непосредственно с H_C/TAB, если поверхность нейрональных клеток представляет собой мишень для белка. Таким образом, в зависимости от намеченной доставки могут быть получены следующие комбинации:

i) Белок - H_C/TAB,

ii) Белок - H_{N -} H_C/TAB,

iii) Белок – LC - H_{N -} H_C/TAB.

В результате связывания карго-белка с H_C/TAB, согласно приведенному выше пункту i), карго-белок можно нацелить на поверхность нейрона. Возможно, произойдет некоторая интернализация через регулярные процессы рециркуляции клеточной поверхности, но нейрональная поверхность будет основной целью такого подхода.

При связывании карго-белка с HN, связанным с H_C/TAB согласно приведенному выше пункту ii), или с BoNT/TAB согласно приведенному выше пункту iii), указанные карго-белки могут более эффективно транспортироваться внутрь нейронов с помощью системы транслокации токсина. После того как произойдет интернализация токсина BoNT в везикулах в нейрональную клетку, как описано в разделе «Уровень техники», кислое эндосомальное окружение в везикуле вызовет конформационное изменение, которое позволит произойти транслокации LC из везикулы в цитозоль клетки. Таким образом, указанная система транслокации токсина, представляющая собой механизм перемещения LC BoNT из интернализованного пузырька в цитозоль, может быть применена для перемещения вышеуказанного карго-белка в цитозоль нейрональной клетки с применением BoNT/TAB. Карго-белок может быть связан с H_N вместо LC, с сайтом экзопротеазы, расположенным между грузовым белком и H_N, как раскрыто выше, или карго-белок может быть связан с LC. Оба варианта позволят транспортировать карго-белок в цитозоль нейрональной клетки.

Таким образом, как H_C/TAB, так и BoNT/TAB можно применять в качестве транспортных средств для транспортировки любого белка к нейрону и/или в нейрон. Это также обеспечивает возможность применения H_C/TAB и/или BoNT/TAB в фармакологическом тесте для исследования роли белка, например, в синаптическом процессе.

Карго-белок может представлять собой, например, любую белковую метку, такую как аффинные или флуоресцентные метки или зонды. Таким образом, любая нуклеиновая кислота, соответствующая такой белковой метке, может быть включена в вектор, раскрытый выше. Специалист в данной области техники сможет применить стандартные методы клонирования для включения любого интересующего гена в вектор, а также стандартные протоколы для экспрессии белка.

Связывающий домен BoNT и карго-белок могут быть экспрессированы по отдельности с помощью системы сортазы, которая обеспечивает их рекомбинацию посттрансляционно. Таким образом, транспептидазная активность сортазы может быть применена в качестве инструмента для получения слитых белков in vitro, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Вкратце, мотив распознавания (LPXTG) добавляют к C-концу интересующего белка, тогда как мотив олигоглицина добавляют к N-концу второго подлежащего лигированию белка. При добавлении сортазы к белковой смеси два пептида ковалентно связываются через нативную пептидную связь. Этот способ может быть применен для получения полипептида в соответствии с настоящим изобретением. В данном случае, это будет означать, что мотив узнавания добавляют к C-концу интересующего белка, а олигоглициновый мотив добавляют к N-концу H_C/TAB или BoNT/TAB.

Кроме того, H_C/TAB и/или BoNT/TAB может быть применен в терапевтическом или косметическом способе. Как правило, применение H_C/TAB и/или BoNT/TAB может быть очень похожим на применения продуктов BoNT/A и/или BoNT/B. Они включают способы и лечения, в которых цель способа и лечения представляет собой ослабление и/или инактивация мышц.

H_C/TAB в соответствии с изобретением позволяет вводить BoNT/TAB, имеющий более высокое сродство к клетке и, следовательно, более высокую эффективность. Таким образом, требуются сниженные дозы и возможна большая продолжительность действия. Следовательно, меньшее количество BoNT/TAB по сравнению с BoNT/A или BoNT/B может быть введено для достижения того же эффекта, что уменьшает неблагоприятные эффекты, так как меньшее количество BoNT/TAB будет распространяться из места инъекции. При более высокой эффективности, более сильном и более эффективном связывании и сниженной требуемой дозой, возникает меньше избыточных BoNT/TAB, доступных для распространения за пределы места инъекции. Кроме того, BoNT можно вводить реже с продолжительным эффектом, что, как следствие, также минимизирует риск иммунного ответа и побочных реакций.

Типичные медицинские состояния, которые можно лечить и/или предотвращать с помощью H_C/TAB и/или BoNT/TAB в соответствии с вышеизложенным, представляют собой расстройства, выбранные из группы, включающей нервно-мышечные расстройства, состояния, включающие высвобождение ацетилхолина, и спастические мышечные расстройства. Более конкретно, это может относиться к расстройствам, выбранным из группы, включающей спазматическую дисфонию, спазматическую кривошею, дистонию гортани, оромандибулярную дисфонию, лингвальную дистонию, цевикальную дистонию, фокальную дистонию кисти, блефароспазм, косоглазие, гемифациальный спазм, расстройство движения век, церебральный паралич, очаговую спастичность и другие нарушения голоса, спазматический колит, нейрогенный мочевой пузырь, анизмус, спастичность конечностей, тики, тремор, бруксизм, анальная трещина, ахалазию, дисфагию и другие расстройства мышечного тонуса и другие расстройства, характеризующиеся непроизвольными движениями мышечных групп, слезоточивость, повышенное потоотделение, чрезмерное слюноотделение, чрезмерное выделение из желудочно-кишечного тракта, секреторные нарушения, боль от мышечных спазмов, головную боль, спортивные травмы и депрессию.

Что касается косметических способов, то H_C/TAB и/или BoNT/TAB предпочтительно можно применять для предотвращения и/или лечения морщин, межбровных складок или нежелательных линий для уменьшения указанных морщин, складок и линий.

H_C/TAB и/или BoNT/TAB в соответствии с вышеизложенным могут быть получены в виде любой подходящей фармацевтической или косметической композиции. Фармацевтическая композиция, включающая H_C/TAB и/или BoNT/TAB, может дополнительно включать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, носители или другие добавки. Косметическая композиция, включающая H_C/TAB и/или BoNT/TAB, может дополнительно включать косметически приемлемые вспомогательные вещества, носители или другие добавки.

Введение фармацевтической или косметической композиции можно осуществлять посредством инъекции, при которой инъекцию вводят в участок тела, в котором присутствует нежелательная активность нейронов. Как правило, композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция также может включать солюбилизирующее средство и местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции.

Кроме того, фармацевтическая или косметическая композиция может быть включена в набор с инструкциями для терапевтического введения композиции. В таком наборе ингредиенты композиции могут поставляться либо по отдельности, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытой емкости, такой как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Композицию можно вводить инфузией, и в этом случае ее можно распределить по флаконам для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композицию вводят с помощью инъекции, то может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекций или стерильным физиологическим раствором, так чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением. Композиция для системного введения может представлять собой жидкость, например, стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор Хенкса. Кроме того, композиция может находиться в твердой форме и может быть повторно растворена или суспендирована непосредственно перед применением. Лиофилизированные формы также рассматриваются. Композиция может содержаться в липидной частице или везикуле, такой как липосома или микрокристалл, которые также подходят для парентерального введения.

Таким образом, авторы изобретения разработали сконструированный биогибрид BoNT, адаптированный для одновременного связывания со всеми тремя рецепторами: SV2C, рецептором синаптотагмина и рецептором ганглиозида. Таким образом, обеспечен биогибрид BoNT, который обладает более высокой активностью, эффективностью и продолжительностью действия, чем полипептиды BoNT предшествующего уровня техники. Таким образом, применение настоящего биогибрида позволяет вводить более низкие дозы токсина, чем в соответствии с предшествующим уровнем техники, при сохранении того же эффекта. Кроме того, применение настоящего биогибрида позволяет проводить введения реже, чем для применявшегося ранее BoNT. Таким образом, лечение пациента биогибридом BoNT настоящего изобретения будет более комфортным, поскольку введение не будут производить так часто, как в предшествующем уровне техники.

Экспериментальная секция

Материал и Методы

Конструкции. кДНК, кодирующая H_C и полноразмерный (неактивный) TriRecABTox (H_C/TAB и BoNT/TAB, соответственно) были оптимизированы по кодонам для экспрессии в E.coli (см. дополнительную информацию о последовательности ДНК), синтезированы и клонированы в pET-28a(+) вектор с N-концевым 6 х His-tag («GenScript», Нью-Джерси, США). Конструкция TriRecABTox, применяемая в нашем исследовании, имеет три мутации в каталитическом сайте для предотвращения любых проблем с безопасностью (E224Q/R363A/Y366F) (Rossetto et al, 2001; Binz et al, 2002). Ген BoNT/TAB кодирует 1311 аминокислот, а ген H_C/TAB соответствует остаткам [875-1311].

Экспрессия и очистка белка. Плазмиды, несущие представляющий интерес ген, трансформировали в клетки E. coli BL21 (DE3) («New England BioLabs», США). Аналогичный протокол применяли для обоих белков. Экспрессии осуществляли путем выращивания клеток в среде Terrific Broth с 50 мкг/мл канамицина при 37°С в течение приблизительно 3-х часов, а затем индуцировали IPTG в конечной концентрации 1 мМ и оставляли на ночь при 18°С в системе LEX («Epyphite3», Канада). Клетки собирали и хранили при -80°С. Клеточный лизис для экстракции белка проводили с помощью Emulsiflex-C3 («Avestin», Германия) при 20 тыс. фунтов на квадратный дюйм в 25 мМ HEPES, pH 7,2 с 200 мМ NaCl, 25 мМ имидазолом и 5% (объем/объем) глицерином. Клеточный дебрис осаждали ультрацентрифугированием при 4°С, 267000 g в течение 45 минут. Сначала белок очищали аффинной хроматографией: супернатант наносили на 5 мл колонку HisTrap FF («GE Healthcare», Швеция), промывали 25 мМ HEPES, рН 7,2, с 200 мМ NaCl, 25 мМ имидазолом и 5% (объем/объем) глицерином, и белок элюировали 25 мМ HEPES, рН 7,2, с 200 мМ NaCl, 250 мМ имидазолом и 5% (объем/объем) глицерином. Затем образец подвергали диализу против 25 мМ HEPES pH 7,2, с 200 мМ NaCl и 5% (объем/объем) глицерином в течение ночи перед конечной стадией очистки гель-хроматографией с применением колонки Superdex 200 в аналогичном буфере («GE Healthcare», Швеция). H_C/TAB хранили в концентрации 4,5 мг/мл, а BoNT/TAB – 7,3 мг/мл в 25 мМ HEPES, рН 7,2 с 200 мМ NaCl, 0,025 мМ TCEP и 5% глицерином.

Характеристика белка. Пробы белка анализировали гель-электрофорезом с применением NuPAGE 4-12% бис-трис-гелей и вестерн-блоттингом, выполненным на PVDF-мембранах («ThermoFisher», Швеция). Первичные антитела против H_C/A и H_C/B были приготовлены собственными силами (индуцированы у кролика), их детектировали антителами против конъюгированных с пероксидазой IgG кролика (№ по каталогу SAB3700852, «Sigma», Швеция). Полигистидиновую метку исследовали с помощью конъюгированного с HRP моноклонального антитела (AD1.1.10, № по каталогу MA1-80218, «ThermoFisher», Швеция). Для детекции применяли подложку TMB («Promega», Швеция). Внутренние контроли, очищенные аналогично H_C/TAB и состоящие из His-меченых H_C/A и H_C/B, были включены для сравнения.

Активация BoNT/TAB. Полноразмерный (неактивный) TriRecABTox был разработан с сайтом расщепления фактором Ха (IEGR) между легкой и тяжелой цепями для активации в форме двуцепочечной. Активацию проводили путем инкубации 100 мкг BoNT/TAB с 2 мкг фактора Ха («New England BioLabs», США) в течение ночи при 4°C. Результаты активации анализировали гель-электрофорезом (как указано выше).

Клонирование, экспрессия и очистка SV2C-L4. Взаимодействующая часть четвертого люминального домена гликопротеина 2C синаптических везикул (SV2C-L4, остатки 474-567 по Uniprot ID Q496J9) была амплифицирована из кДНК и клонирована в вектор pNIC28-Bsa4 (N-концевой His6 tag с сайтом TEV) с помощью клонирования LIC. SV2CL4 экспрессировали в E.coli BL21 (DE3) («New England BioLabs», США) с применением протокола, аналогичного описанному выше. SV2C-L4, меченный His, очищали аффинной хроматографией на колонке HisTrap HP объемом 2 мл («GE Healthcare», Швеция), промывали 20 мМ HEPES, pH 7,5, с 500 мМ NaCl, 10% (объем/объем) глицерином, 50 мМ имидазолом и 0,5 мМ ТСЕР. Белок элюировали с помощью 20 мМ HEPES, pH 7,5, с 500 мМ NaCl, 10% (объем/объем) глицерином, 500 мМ имидазолом и 0,5 мМ TCEP. Затем SV2CL4 дополнительно очищали гель-хроматографией с применением колонки Superdex 75 HiLoad 16/60 («GE Healthcare», Швеция) в 20 мМ HEPES, pH 7,5, с 300 мМ NaCl, 10% (объем/объем) глицерином и 0,5 мМ TCEP.

Рентгеноструктурная кристаллография. Образцы для кристаллизации готовили путем предварительной инкубации в течение 15-ти мин при комнатной температуре H_C/TAB при 3,6 мг/мл с SV2C-L4 в концентрации 1 мг/мл (рекомбинантная внеклеточная петля 4 SV2C человека [остатки 475-565], 1 мМ пептид hSytI (GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, синтезированный компанией «GenScript», США) и 4 мМ олигосахарид GD1a («Elicityl», Франция).

Кристаллы выращивали с 200 нл образца, смешанного с 100 нл раствора резервуара, состоящего из 20% (объем/объем) полиэтиленгликоля 6000, 0,1 М цитрата, рН 5,0 (JCSG-plus screen B9, «Molecular Dimensions», Великобритания), с применением установки «сидячая капля» и инкубировали при 21°С. Кристаллы появились в течение 2-х недель, их переносили в крио-петлю и замораживали в жидком азоте.

Данные дифракции собирали на станции I04-1 алмазного источника света («Didcot», Великобритания), оснащенного детектором PILATUS-6M («Dectris», Швейцария). Полный набор данных до 1,5 Å был собран из монокристалла при 100°K. Изображения необработанных данных обрабатывали и масштабировали с помощью DIALS (Gildea et al, 2014) и AIMLESS (Evans, 2006) с применением CCP4 пакет 7.0 (CCP4, 1994).

Молекулярную замену проводили с помощью модели, подготовленной из координат H_C/A в комплексе с SV2C-L4 (код PDB 4JRA) и H_C/B в комплексе с крысиными SytII и GD1a (код PDB 4KBB) для определения начальных фаз для структурного решения в PHASER (McCoy et al., 2007). Рабочие модели были уточнены с применением REFMAC5 (Murshudov et al, 2011) и вручную скорректированы с помощью COOT (Emsley et al., 2010). Молекулы воды добавляли в положениях, где пики электронной плотности Fo-Fc превышали 3σ, и могли образовываться потенциальные водородные связи. Подтверждение проводили с помощью MOLPROBITY (Chen et al., 2010). Статистика Рамачандрана показывает, что 97,0% всех остатков находятся в наиболее предпочтительном регионе, с одним выбросом в запрещенном регионе. Кристаллографические статистические данные приведены в таблице 1. Рисунки были сделаны с помощью PyMOL (Schrödinger, LLC, США).

Результаты

Разработка TriRecABTox: сконструированный ботулинический токсин с сайтами связывания с тремя рецепторами

Для осуществления концепции трехрецепторного токсина, авторы изобретения сначала проанализировали доступную информацию о структуре в отношении молекулярных взаимодействий BoNT/A и /B со своими рецепторами. В недавней работах, Yao et al. (2016) и Benoit et al. (2014), были обеспечены рентгенокристаллические структуры рецептор-связывающего домена BoNT/A в комплексе с SV2C с (PDB 5JLV) и без посттрансляционной модификации (PDB 4JRA), соответственно. Люминальный домен SV2C (петля 4) образует четырехугольную β-спираль, которая ассоциируется с H_C/A главным образом посредством взаимодействий остов-к-остову с открытой β-цепью на границе раздела двух субдоменов, тогда как N-гликан SV2C простирается в сторону HCN (фигура 1). Вместе эти структуры демонстрируют общую модель связывания с двумя формами SV2, которая также должна распространяться на гликозилированные SV2A и SV2B (Yao et al., 2016). Эти исследования выявили ключевые остатки и множественные сайты, вовлеченные во взаимодействие токсина с SV2, которые, таким образом, должны быть сохранены в дизайне TriRecABTox (фигура 1). Они включают сегменты [949-953], [1062-1066], [1138-1157] и [1287-1296] BoNT/A. Номера остатков основаны на последовательности BoNT/A1 (Uniprot-P10845).

Несколько кристаллических структур BoNT/B также были описаны в комплексе с синаптотагмином, они помогли определить взаимодействие токсина с его рецептором (Chai et al., 2006; Jin et al., 2006; Berntsson et al., 2013) (фигура 1). При связывании пептид Syt приобретает короткую спиральную структуру, которая связывается вдоль бороздки на дистальном конце С-концевого субдомена, непосредственно затрагивая сегменты [1113-1118] и [1183-1205] BoNT/B. Номера остатков основаны на последовательности BoNT/B1 (Uniprot-P10844). По этой причине сочли необходимым включить эти регионы в конструкцию TriRecABTox.

Кроме того, кристаллические структуры BoNT/A и /B в комплексе с их ганглиозидным рецептором (Stenmark et al., 2008; Hamark et al., 2017; Berntsson et al., 2013) обеспечивают подробное описание сайта связывания углеводов для каждого серотипа. Сайт высоко консервативен по всему семейству ботулинических нейротоксинов и состоит из неглубокого кармана на субдомене H_CC (фигура 1), состоящего из центрального мотива SxWY (1264-1267 в /A; 1260-1263 в /B) и окружающих участков петли. Примечательно, что этот карман находится рядом с сайтом связывания рецептора Syt в BoNT/B, отделенного петлей [1244-1253], однако не сообщали об аллостерическом эффекте при одновременном связывании двух рецепторов (Bertnsson et al., 2013). В целях сведения к минимуму любого структурного изменения сайта связывания с рецептором Syt сочли более подходящим включать в конструкцию TriRecABTox сайт связывания ганглиозидного рецептора BoNT/B, а не BoNT/A.

После идентификации компонентов из двух серотипов, которые необходимы для связывания с тремя различными рецепторами, был проведен дополнительный структурный анализ для объединения их в одну молекулу. Для этого первичные последовательности BoNT/A (Uniprot P10845) и BoNT/B (Uniprot P10844) были выровнены с помощью ClustalO (Sievers et al., 2011), и трехмерные структуры их связывающего домена были совмещены (фигура 1). Два серотипа имеют общую идентичность последовательности, равную 40%, однако сходство падает до 34% для C-концевого субдомена H_C, основной области, ответственной за распознавание рецептора. Внутренняя складка связывающего домена сохраняется у всех клостридиальных нейротоксинов (Swaminathan, 2011; Rummel et al., 2011), но с заметным изменением длины соединительных петель. Поэтому также было важно учитывать вторичные структуры (фигура 1), чтобы сохранить основную архитектуру домена без изменений. Шаблон для вновь разработанной молекулы, следовательно, имеет вид многократных чередований элементов BoNT/A и /B, для создания новых неприродных внутримолекулярных поверхностей контакта, которые могут быть несовместимы. Проверка наложенных кристаллических структур H_C/A и H_C/B позволила изобретателям оптимизировать конструкцию коррекцией потенциальных столкновений, либо путем одиночных аминокислотных замен, либо путем удалений в ключевых местах (фигура 2). В особенности, была проанализирована боковая цепь каждого остатка в конфликтующих областях, что привело к трем заменам в BoNT/B на эквивалентную аминокислоту из BoNT/A: N1180, G1234, N1236 (SEQ ID № 3). Кроме того, удалили несколько аминокислот (фигура 2) для соответствия элементам вторичной структуры и компенсации изменения длины между BoNT/A и /B в участках петли переходных интерфейсов. Были выполнены делеции между L1139 и G1140, а также между G1234 и T1235 (отсылка к SEQ ID № 3), по сравнению с последовательностями BoNT/A и BoNT/B (фиг. 2)

Получившаяся молекула, названная TriRecABTox, должна быть способна связываться с тремя рецепторами: SV2, синаптотагмина и ганглиозидов. Ее белковая последовательность представлена в SEQ ID № 3 (неактивная форма) и SEQ ID № 5 (активная форма).

Получение и характеристика связывающего домена TriRecABTox

Первым шагом к характеристике TriRecABTox было рекомбинантное получение связывающего домена (H_C/TAB) для анализа его биохимических свойств. Для этой цели белковая последовательность была оптимизирована по кодонам для экспрессии в E.coli. Полученный ген был клонирован в вектор pET-28a(+) для включения N-концевой полигистидиновой метки и облегчения процесса очистки белка, подробности представлены в разделе Методы. Авторы изобретения показали, что H_C/TAB можно экспрессировать и частично очищать (фигура 3) с применением методик аффинной хроматографии и гель-хроматографии (фигура 11). Исходный образец содержал некоторые низкомолекулярные примеси, которые, вероятно, соответствуют остаточным белкам клетки-хозяина. Дополнительные этапы очистки с помощью таких способов, как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия, могут помочь в получении образца более высокой чистоты. Наличие H_C/TAB с His-tag было подтверждено вестерн-блоттингом, в котором наблюдали одну полосу с ожидаемым размером (приблизительно 53 кДа) (фигура 3).

Кристаллическая структура связывающего домена TriRecABTox в комплексе с тремя его рецепторами

Для оценки способности H_C/TAB связываться с тремя его рецепторами, были проведены испытания по совместной кристаллизации, которые включали H_C/TAB с люминальным доменом SV2C человека [остатки 475-565], человеческим пептидом Syt1 [остатки 34 -53] и углеводом GD1a. Были получены кристаллы, которые дифрагировали до высокого разрешения (1,5 Å) (фигура 12), что позволило собрать полный набор данных (таблица 1). Структура была решена путем молекулярной замены с применением входной модели со всеми потенциальными компонентами. Это решение подтвердило, что кристаллическая структура содержала все четыре элемента: H_C/TAB связывался со своими тремя рецепторами одновременно (обозначен как H_C/TAB-3R) (фигура 4). Этот результат обеспечивает первое экспериментальное доказательство того, что TriRecABTox может достигать своей цели in vitro, а также позволяет провести полный анализ механизма связывания рецептора на атомном уровне. Применяя недавно установленную информацию о структуре, мы смогли напрямую сравнить взаимодействие между H_C/TAB, H_C/A, H_C/B и их соответствующими рецепторами.

Таблица 1. Рентгеноструктурная кристаллография: сбор данных и уточненная статистика

Комплекс
H_C/TAB – SV2C – hSytI – GD1a Сбор данных Пространственная группа P2₁2₁2₁ Размеры ячейки a, b, c (Å) 43,7, 115,9, 141,4 a, b, g (°) 90,0, 90,0, 90,0 Разрешение (Å) 1,5-60,4 (1,51-1,53)* Число всего/уникальные отражения 3,583,212/113,806 R_{слияния} 0,119 (1,926)* R_pim 0,021 (0,501)* CC_1/2 1,00 (0,839)* I/sI 13,0 (1,1)* Полнота (%) 99,9 (97,2)* Избыточность 31,5 (15,1)* Уточнение R_{рабочий}/R_{свободный}(%) 17,4/22,1 Число атомов H_C/TAB 3,682 SV2C 761 hSytI 143 GD1a 56 Вода 446 B-факторы H_C/TAB 27,4 SV2C 44,4 hSytI 35,8 GD1a 36,8 Вода 40,2 Среднеквадратичные отклонения Длины связи (Å) 0,009 Уголы связи (°) 1,37

* Значения в скобках указаны для оболочки с самым высоким разрешением.

Во-первых, связывающий домен нового сконструированного BoNT/TAB представляет собой ожидаемое сворачивание с двумя субдоменами: лектиноподобным H_CN и β-трилистником H_CC (фигура 4). Созданные многочисленные новые внутримолекулярные интерфейсы не влияли на общую структуру, о чем свидетельствуют среднеквадратичные отклонения с низким среднеквадратичным отклонением, равным 0,69 Å (более 364 Cα) при наложении H_C/A, и 0,81Å (более 370 Cα ) – с H_C/B. Был смоделирован полный H_C/TAB [876-1311], за исключением N-концевой полигистидиновой метки и петли [1169-1173], которые были разупорядочены. Отсутствие электронной плотности для этих частей может быть объяснено тем фактом, что эти области не участвуют ни в каком взаимодействии и расположены в доступных для растворителя областях кристалла.

Структуру H_C/TAB-3R сравнивали со структурой H_C/A в комплексе с SV2C. Структура люминального домена SV2C была идентична в обоих комплексах, среднеквадратичное значение было равно 0,483Å (более 88 Cα). Две структуры были выровнены в трех измерениях на основе доменов H_C, выравнивание показало, что SV2C находится в том же месте, как и следовало ожидать от дизайна авторов изобретения (фигура 5). В частности, области из H_C/A, которые были обозначены как необходимые для связывания с рецептором SV2 и были включены в H_C/TAB, были полностью сохранены. Поверхность контакта между H_C/A и SV2C была проанализирована с помощью PISA (Kissinel, 2015), и показано, что она соответствует площади, равной 540A², включающей в основном электростатические взаимодействия, где открытые цепи обоих белков образуют комплементарную структуру β-складки (Benoit et al., 2014). Соответствующий анализ с H_C/TAB показывает площадь поверхности с SV2C, равную 630Ų и подтверждает механизм связывания с сопоставимым числом водородных связей. Кроме того, авторы изобретения также рассмотрели потенциальное связывание с гликозилированным SV2 путем сравнения H_C/TAB-3R с комплексом H_C/A-gSV2C (фигура 5). Недавно было показано, что N-гликозилирование N559 существенно для распознавания рецепторов и консервативно для изоформ SV2 (Yao et al., 2016). Следует отметить, что межбелковое взаимодействие между H_C/A и SV2C очень сходно с гликозилированием или без него. Углеводная цепь простирается в направлении субдомена H_CN. Анализ остатков H_C/A, участвующих во взаимодействии белок-гликан, показывает, что их положение полностью сохраняется в H_C/TAB-3R, поэтому H_C/TAB должен быть способен распознавать N-гликозилированные изоформы SV2.

Затем авторы изобретения сравнили структуру H_C/TAB-3R со структурой H_C/B в комплексе с rSyt2. Ожидалось, что BoNT/B будет связываться с синаптотагмином человека аналогично его гомологам с грызунами, хотя и с различной аффинностью (Tao et al., 2017). В представленной в настоящем документе кристаллической структуре hSyt1 также принимает α-спиральное расположение, которое находится в той же канавке связывания, что и rSyt2 в H_C/B (фигура 6). Наложение hSyt1 с rSyt2, связанных с их соответствующими доменами H_C, подтверждает конфигурацию консервативного пептида со среднеквадратичным значением 0,560 Å (более 13 Cα). Кроме того, связывающий рецептор карман полностью сохраняется в H_C/TAB, причем все остатки, участвующие в связывании, демонстрируют одинаковую конфигурацию в обеих структурах (фигура 6). Это было подтверждено анализом PISA, в котором была рассчитана поверхность контакта, равная 861Ų, для взаимодействия H_C/TAB: hSyt1, которая также включает в себя одиннадцать электростатических связей, и которая сопоставима с поверхностью контакта, равной 712Ų, для HC/B: rSyt2 (PDB 4KBB) с семью электростатическими связями. Механизм распознавания главным образом основан на сильных белок-белковых гидрофобных взаимодействиях. Небольшая разница в площади контактной поверхности и количестве электростатических взаимодействий может быть объяснена изменением последовательности между hSyt1 и rSyt2, в особенности, по направлению к С-концевой половине пептида.

Третий рецептор, содержащийся в структуре H_C/TAB-3R, соответствует углеводу GD1a, для которого наблюдали четкую электронную плотность от Gal2 до Sia5 (фигура 4). Электронная плотность не была видна для Glc1 и Sia6, как можно ожидать от невзаимодействующих гибких углеводных групп. Сайт связывания рецептора ганглиозида детально изучен, и кристаллическая структура H_C/B в комплексе с GD1a подтвердила предпочтение этого серотипа для терминальной группировки Sia (α2-3)Gal (Bertnsson et al., 2013; Rummel, 2016). TriRecABTox был разработан для интеграции связывающего кармана H_C/B, и сравнение двух структур (фигура 7) показало, что ключевые остатки связывающего кармана (S1260, W1262, Y1263) полностью консервативны и взаимодействуют с GD1a как в нативном токсине. Большая часть сайта связывания остается неизменной по сравнению со связанным с GD1a H_C/B, за немногими заметными исключениями. В H_C/TAB-3R боковая цепь N1122 обращена в сторону от лиганда, тогда как N1105 в его эквиваленте H_C/B образует прямую водородную связь с Sia5. Это несколько компенсируется положением I1257, которое показывает более сильное гидрофобное взаимодействие (на расстоянии 4,3 Å) с Sia5 в H_C/TAB-3R по сравнению с I1240 в структуре H_C/B:GD1a (где они находятся на расстоянии 7 Å).

В целом результаты, полученные на кристаллической структуре H_C/TAB-3R, подтверждают, что одна молекула TriRecABTox способна одновременно связываться с рецептором SV2, рецептором синаптотагмина и его ганглиозидными рецепторами, таким образом, который повторяет механизмы связывания родительского BoNT/A и /B.

Получение и характеристика полноразмерного неактивного TriRecABTox

Установив связывающую способность H_C/TAB, авторы изобретения продолжили тем, что экспрессировали и очистили полноразмерный каталитически неактивный TriRecABTox (BoNT/TAB; SEQ ID № 3). Для этой цели авторы изобретения разработали синтетический ген, кодирующий 1311 аминокислот и содержащий три функциональных домена BoNT, причем LC и HN соответствуют доменам BoNT/A, связанным с H_C/TAB. В целях безопасности были включены три мутации в каталитическом сайте (E224Q/R363A/Y366F) (Rossetto et al, 2001; Binz et al, 2002). В соответствии с описанной выше конструкцией H_C/TAB, белковая последовательность была оптимизирована по кодонам для экспрессии в E.coli и клонирована в pET-28a(+) с N-концевой полигистидиновой меткой. Подробности представлены в разделе «Методы». Авторы изобретения показали, что BoNT/TAB можно экспрессировать в виде растворимого белка, размером приблизительно в 152 кДа. Первоначальный метод, примененный для очистки, давал ограниченное количество неоднородного материала (фигура 8; фигура 13), но дальнейшая очистка с применением таких способов, как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия, может помочь получить более чистый материал и устранить остаточные белки клетки-хозяина, видимые на гель-электрофорезе. Такой способ был недавно применен для получения рекомбинантной конструкции BoNT/B с чистотой более 80% (Elliot et al., 2017).

Была проведена дополнительная характеристика и было подтверждено присутствие гистидиновой метки, и хотя реакция с зондирующим антителом была очень слабой по сравнению с контролем (фигура 8B), слабая полоса была различима при правильном размере. Анализ также показал перекрестную реакцию с приблизительно 70 кДа загрязнением. Кроме того, BoNT/TAB окончательно прореагировал с собственными антисыворотками против H_C/A (фигура 8C) и H_C/B (фигура 8C), как и ожидалось, поскольку он должен содержать эпитопы из обоих связывающих доменов.

Контролируемая активация TriRecABTox

BoNT/TAB был разработан с сайтом расщепления фактором Ха, IEGR [442-445], между легкой и тяжелой цепями (фигура 9А), так как активация в двухцепочечную форму необходима для получения полностью активного токсина. Описанный выше образец BoNT/TAB полной длины (SEQ ID № 5), применили для проведения анализа активации. Несмотря на гетерогенность образца, полная активация была достигнута после инкубации BoNT/TAB с фактором Xa при соотношении 1 мкг протеазы к 50 мкг токсина в течение ночи при 4°C (фигура 9B). Гель-электрофорез показал разделение BoNT/TAB на два фрагмента приблизительно 100 и 50 кДа при разделении в присутствии восстановителя, наиболее вероятно, относящихся к HC и LC, соответственно. Эти две цепи удерживаются вместе дисульфидным мостиком между C430 и C458, что объясняет единственную полосу приблизительно при 150 кДа в невосстанавливающих условиях. Полосы, соответствующие HC и LC, также были видны в невосстанавливающем образце и могли быть вызваны некоторым уровнем восстановления дисульфидного мостика во время приготовления образца, однако эти полосы были явно не видны в неактивированном контроле.

В целом, активационный анализ, во-первых, предоставил доказательства того, что полученный белок соответствует сконструированному BoNT/TAB, и, во-вторых, что стадия активации в двухцепочечную молекулу может быть успешно проведена. Поэтому такой шаг может быть включен в получение активного полноразмерного TriRecABTox.

Оптимизация BoNT/TAB

Материал и методы

Конструкции. кДНК, кодирующая H_C/TAB и его варианты, клонировали в компании «GenScript» (Нью-Джерси, США) в векторе pET28(a), как было описано ранее. BNT/TAB2.1.3 клонировали в векторе pET29(a) в компании «Toxogen GmbH» (Ганновер, Германия).

Экспрессия и очистка белка. Как было описано ранее для вариантов H_C/TAB. BoNT/TAB2.1.3 был получен в компании «Toxogen GmbH» (Ганновер, Германия) по протоколу, аналогичному протоколу, используемому для H_C/TAB (аффинная хроматография и гель-фильтрация). Кроме того, активацию и удаление метки BoNT/TAB2.1.3 проводили с тромбином в концентрации 0,05 Е/мкг, а BoNT/TAB2.1.3 дополнительно очищали гель-фильтрацией. Образцы хранили в 25 мМ HEPES, pH 7,2, с 200 мМ NaCl и 5% глицерином.

Характеристика белка. Как описано ранее (гель-электрофорез с применением NuPAGE 4-12% бис-трис-гелей).

Рентгеноструктурная кристаллография. Образцы для кристаллизации готовили путем предварительной инкубации H_C/TAB2.1, при 6,5 мг/мл в течение 15-ти мин при комнатной температуре, с SV2C-L4 в концентрации 1 мг/мл (рекомбинантная внеклеточная петля 4 SV2C человека [остатки 475-565], 1 мМ пептидом hSytI (GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, синтезированным в компании «GenScript», США) и 4 мМ GD1a-олигосахаридом («Elicityl», Франция). Кристаллы выращивали в резервуаре с 200 нл образца, смешанного с 100 нл раствора, состоящего из 20%-ного (объем/объем) полиэтиленгликоля 3350, 0,2 М цитрата калия (экран B12 от JCSG-plus, «Molecular Dimensions», Великобритания) с применением установки в виде сидячей капли и инкубации при 21°C. Кристаллы появлялись в течение 1-ой недели, их переносили в крио-петлю и замораживали в жидком азоте. Данные дифракции собирали на станции I04 алмазного источника света («Didcot», Великобритания), оборудованного детектором PILATUS-6M («Dectris», Швейцария). Полный набор данных до 1,4 Å собирали из монокристалла при 100°K. Изображения необработанных данных обрабатывали и масштабировали с помощью DIALS (Gildea et al, 2014) и AIMLESS (Evans, 2006) с применением компьютерной программы CCP4 suite 7.0 (CCP4, 1994).

Молекулярную замену проводили со структурой H_C/TAB, определенной ранее в PHASER (McCoy et al., 2007). Рабочие модели уточняли с применением REFMAC5 (Murshudov et al, 2011) и корректировали вручную с помощью COOT (Emsley et al., 2010). Молекулы воды добавляли в положениях, где пики электронной плотности Fo-Fc превышали 3σ, и могли образовываться потенциальные водородные связи. Проверку достоверности проводили с помощью MOLPROBITY (Chen et al., 2010). Статистика Рамачандрана показывает, что 97,0% всех остатков находятся в наиболее предпочтительном регионе, с одним выбросом в запрещенном регионе. Кристаллографические статистические данные приведены в таблице X1.

Получение оптимизированных H_C/TAB, H_C/TAB2.1

Кристаллическую структуру H_C/TAB, связанную с тремя его рецепторами, анализировали с целью выявления потенциальных сайтов, которые можно было бы изменить, чтобы улучшить стабильность и функцию молекулы.

В частности, анализ локальных температурных факторов (B-фактор) в кристаллической структуре может быть интерпретирован как показатель локальной стабильности белка, а высокий B-фактор свидетельствует о беспорядочной области. В результате этого анализа, для оптимизации была рассмотрена петля на границе раздела между двумя субдоменами H_C/TAB, обозначенная как «петля 360», состоящая из остатков от D357 до N362 (SEQ ID: № 6) (смотри рис. 14). Остатки G360 и N362 (SEQ ID No.1) модифицировали до их эквивалентных остатков в BoNT/B и мутировали соответственно в P360 и Y362 для включения в последовательность новой конструкции, обозначенной H_C/TAB2.1 (SEQ ID № 6).

Плазмиду для этой новой конструкции получали сайт-направленным мутагенезом («GenScript», США) и применяли для рекомбинантной экспрессии H_C/TAB2.1 в E.coli. Примененный протокол был таким же, как и для производства H_C/TAB (смотри исходный раздел «Методы» для информации об экспрессии и очистке). Мы показали, что H_C/TAB2.1 можно экспрессировать и частично очистить с применением методик аффинной и гель-фильтрационная хроматографии (фигура 15). Образец содержал некоторые низкомолекулярные примеси, которые, вероятно, соответствуют остаточным белкам клетки-хозяина. Дополнительные этапы очистки с применением таких способов, как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия, должны помочь получить образец более высокой чистоты.

Очищенный H_C/TAB2.1 (SEQ ID № 6) применили в опытах по совместной кристаллизации с люминальным доменом SV2C человека [остатки 475-565], пептидом Syt1 человека [остатки 34-53] и углеводом GD1a. Были получены кристаллы, которые дифрагировали до высокого разрешения (1,4 Å), и можно было собрать полный набор данных (таблица 2). Структура была решена путем молекулярного замещения с применением кристаллической структуры H_C/TAB, связанной с ним тремя рецепторами (H_C/TAB-3R). Новая структура продемонстрировала все элементы, уже видимые в H_C/TAB-3R, и обеспечила экспериментальные доказательства того, что H_C/TAB2.1 может связываться с тремя рецепторами одновременно, как в случае H_C/TAB. Анализ B-фактора показал улучшенную стабильность для цикла «360» (от D357 до Y362; фигура 14). В целом поведение H_C/TAB2.1 было сходным с поведением H_C/TAB, причем обе конструкции демонстрировали сопоставимые профили с точки зрения выхода и чистоты.

Таблица X1. Рентгеноструктурная кристаллография: сбор данных и уточненная статистика

Комплекс H_C/TAB2.1 – SV2C – hSytI – GD1a Сбор данных Пространственная группа P2₁2₁2₁ Размеры ячейки a, b, c (Å) 43,8, 117,5, 141,5 α, β, γ (°) 90,0, 90,0, 90,0 Разрешение (Å) 1,4-60,6 (1,40-1,56)* Число всего/уникальные отражения 1,055,932/79,953 R_{слияния} 0,084 (1,070)* R_pim 0,024 (0,364)* CC_1/2 0,99 (0,716)* I/σI 16,0 (1,8)* Полнота (%) 95,1 (70,1)* Избыточность 13,2 (9,3)* Уточнение R_{рабочий}/R_{свободный}(%) 17,7/20,4 Среднеквадратичные отклонения Длины связи (Å) 0,118 Уголы связи (°) 1,60

* Значения в скобках указаны для оболочки с самым высоким разрешением.

Получение более растворимого варианта, H_C/TAB2.1.3

Для подготовки к будущему функциональному анализу вариантов H_C/TAB, H_C/TAB2.1 адаптировали для совместимости с описанным недавно экспериментом по лигированию с сортазой (Zhang et al, 2017). Этот эксперимент позволяет безопасно и контролируемо реконструировать активный BoNT полной длины, который можно применять для проверки активности. Эта конструкция соответствовала усеченному на N-конце H_C/TAB2.1 с расщепляемым N-концевой гистидиновой меткой и была помечена как H_C/TAB2.1.1 (SEQ ID № 8). Был подготовлен клон для H_C/TAB2.1.1 («GenScript»), примененный для экспрессии и очистки, как описано ранее (фигура 16). Мы показали, что H_C/TAB2.1.1 может быть экспрессирован и частично очищен с применением способов аффинной и гель-фильтрационная хроматографии. Образец содержал некоторые низкомолекулярные примеси, которые, вероятно, соответствуют остаточным белкам клетки-хозяина. Дополнительные этапы очистки с применением таких способов, как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия, должны помочь получить образец более высокой чистоты.

Дальнейший анализ структурных особенностей H_C/TAB2.1 выявил наличие гидрофобной петли с открытой поверхностью, которая выступает из остальной части белка (остатки 389-393, SEQ ID: № 6; фигура 14d). Кроме того, эта петля была недавно идентифицирована как липид-связывающий элемент в BoNT/B и других серотипах (Stern et al, 2018). Мы предположили, что эта гидрофобная область может препятствовать растворимости H_C/TAB, поэтому мы разработали новую конструкцию, в которой эта петля была усечена и заменена двойным аспарагиновым мотивом для повышения растворимости. Эта конструкция была обозначена H_C/TAB2.1.3 (SEQ.ID. № 10). Был подготовлен клон для H_C/TAB2.1.3 («GenScript»), примененный для экспрессии и очистки, как описано ранее (фигура 16). Мы показали, что H_C/TAB2.1.3 можно экспрессировать и частично очищать с применением способов аффинной и гель-фильтрационная хроматографии. Образец содержал некоторые низкомолекулярные примеси, которые, вероятно, соответствуют остаточным белкам клетки-хозяина. Дополнительные этапы очистки с применением таких способов, как ионообменная хроматография или хроматография гидрофобного взаимодействия, должны помочь получить образец более высокой чистоты. Примечательно, что H_C/TAB2.1.3 показал лучший выход экспрессии и растворимость по сравнению с H_C/TAB2.1.1 (фигура 16).

Получение полноразмерного, активного BoNT/TAB2.1.3

Для подготовки к дальнейшему функциональному анализу BoNT/TAB, был создан полноразмерный активный вариант на основе конструкции HC/TAB2.1.3, обозначенный как BoNT/TAB2.1.3 (SEQ ID № 12). Все этапы получения осуществляли на лицензированном предприятии по контрактному соглашению в компании «Toxogen GmbH» (Ганновер, Германия). BoNT/TAB2.1.3 клонировали в векторе pET29(a) и включали расщепляемые С-концевые стрептовидиновые и полигистидиновые метки, а также сконструированный сайт расщепления тромбина между доменами HC и LC (SEQ ID № 13), для активации продукта, как описано ранее. BoNT/TAB2.1.3 может быть экспрессирован в виде растворимого белка, очищенного и активированного тромбином (фигура 17). Способ, примененный для очистки, включал аффинную хроматографию и гель-фильтрацию и приводил к получению продукта BoNT/TAB2.1.3 с >90% чистотой.

Дальнейшие эксперименты

Анализы связывания с рецепторами

Анализы будут проведены в случае, где рецептор-связывающие свойства BoNT/TAB сравнивают с BoNT/A и/или BoNT/B.

Например, будут проведены анализы связывания ганглиозидных рецепторов, которые адаптированы из ранее описанных способов. Вкратце, в этом анализе ELISA представляющий интерес ганглиозидный рецептор (GT1b, GD1b, GD1a или GM1a) иммобилизуют на 96-луночном микропланшете (Chen et al., 2008; Willjes et al., 2013), затем наносят токсины (или их связывающий домен), и связанный материал анализируют моноклональным конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP) антителом против полигистидина. Этот качественный подход должен предоставить достаточно информации для подтверждения того, что характеристики связывания ганглиозидных рецепторов BoNT/TAB аналогичны характеристикам BoNT/B.

Анализ ELISA для связывания с ганглиозидными рецепторами. Ганглиозиды GT1b, GD1b, GD1a и GM1a приобретали у компании «Carbosynth» (Комптон, Великобритания). Ганглиозиды разбавляли в метаноле до конечной концентрации 2,5 мкг/мл; по 100 мкл (0,25 мкг) наносили в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа ПВХ. После выпаривания растворителя при 21°C (в течение ночи) лунки промывали (3 раза) 200 мкл PBS/0,1% (масс./объем) БСА. Сайты неспецифического связывания блокировали инкубацией в течение 2-х ч при 21°C в 200 мкл PBS/2% (масс./объем) БСА. Анализы связывания проводили в 100 мкл PBS/0,1% (масс./объем) БСА на лунку в течение 2-х ч при 4°C, содержавшей образцы (серийное 3-кратное разведение в диапазоне от 6 мкМ до 0,003 мкМ). После инкубации лунки трижды промывали PBS/0,1% (масс./объем) БСА и затем инкубировали с HRP-анти-His-антителом («ThermoFisher», #MA1-80218) в разведении 1:2000 (100 мкл/лунку) в течение 1-го час при 4°С. Наконец, после трех стадий промывания PBS/0,1% (масс./объем) БСА, связанные образцы детектировали с применением Ultra TMB (100 мкл/лунку). Реакцию останавливали после инкубации в течение 5-ти минут при 21°С добавлением 100 мкл 1 М серной кислоты. Поглощение при 450 нм измеряли с помощью Tecan Infinite 200 (Männedorf, Швейцария). Результаты анализировали с помощью программы Prism (GraphPad, La Jolla, CA, USA) с применением нелинейного приближения для связывания.

Для оценки свойств связывания с рецептором синаптотагмина, будет проведена калориметрия изотермического титрования (ITC), аналогично анализу, описанному Berntsson et al. (2013). Будет измерено связывание пептидов hSyt с токсинами, которое должно обеспечить значения аффинности (Kd), подтверждающие, что BoNT/TAB может связываться с рецептором, аналогично BoNT/B.

Калориметрия изотермического титрования. Образцы готовили с помощью дополнительной гель-хроматографии (Superdex200, «GE Healthcare», Швеция) в 20 мМ фосфате калия, рН 7,0, 0,15 М NaCl. Ассоциацию Syt-пептидов с BoNT или с их связывающими доменами измеряли на ITC200 («GE Healthcare», Швеция) при 25 ° C и 750 об/мин. В ячейку клетку добавляли по 200 мкл раствора белка (при 20 мкМ). Связывание измеряли при добавлении пептида («GenScript», США) с помощью 16 ступенчатых инъекций по 2,5 мкл каждая, в концентрации 200 мкМ. Первое титрование было установлено на 0,5 мкл, а затем удалено при анализе данных. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Origin, предоставленного производителем.

Связывание с SV2C будут оценивать с применением анализа раскрывающегося типа, такого как описан в работе Benoit et al. (2014). Вкратце, меченый токсин и немеченый рецептор (или наоборот) будут инкубировать вместе и загружать в Ni-сефарозу, затем промывать и элюировать. Результаты будут визуализированы с помощью SDS-PAGE.

Анализ на степень отведения пальца (DAS)

Эффективность препарата BoNT может быть оценена анализом степени отведения пальца мышью (DAS) (Broide et al., 2013). Этот анализ измеряет in vivo локальную эффективность токсина по ослаблению мышцы после внутримышечной инъекции в скелетную мышцу задней конечности мыши или крысы. Токсин вызывает измеримое дозозависимое снижение способности животного производить характерный ответ задних конечностей на испуг. Этот нелетальный способ регулярно используют для оценки фармакологических свойств различных серотипов BoNT или его производных, таких как недавно описанные рекомбинантные молекулы BoNT/B (Elliot et al., 2017). Аналогичная методология будет применена для оценки эффективности и продолжительности действия BoNT/TAB по сравнению с BoNT/A или /B.

Обсуждение

В этом исследовании авторы изобретения описали, как структурные и молекулярные детали механизма связывания BoNT/A и /B были применены для создания новой молекулы TriRecABTox, которая обладает повышенной способностью распознавания клеток. Строгое многомерное сравнение структур BoNT/A и /B позволило авторам изобретения идентифицировать ключевые элементы, необходимые для сохранения интактного каркаса токсина, на котором можно было интегрировать сайты связывания рецептора для SV2, синаптотагмина и ганглиозида в одной молекуле. Вновь созданный дизайн, состоящий из чередования элементов BoNT/A и /B, был оптимизирован путем включения адаптивных мутаций или делеций для компенсации вновь созданных неприродных внутримолекулярных интерфейсов. Такие модификации были сочтены необходимыми для обеспечения того, чтобы сконструированный токсин, BoNT/TAB, мог продуцироваться в виде растворимого белка с правильной структурой и требуемой активностью.

Авторы изобретения сначала оценили стабильность конструкции, создав собственный связывающий домен, H_C/TAB, который поддерживает функцию распознавания модифицированных рецепторов, посредством рекомбинантной экспрессии в E.coli. H_C/TAB экспрессировали с помощью N-концевой полигистидиновой метки в виде растворимого белка, который можно частично очистить, таким образом, продемонстрировав жизнеспособность созданной конструкции. На втором этапе авторы изобретения приступили к получению конструкции полноразмерного BoNT/TAB в каталитически неактивной форме. Авторы изобретения снова показали, что он может быть экспрессирован в виде растворимого белка 153 кДа и частично очищен стандартными методами жидкостной хроматографии. Присутствие полигистидиновой метки как на H_C/TAB, так и на BoNT/TAB позволило очистить их с помощью аффинной хроматографии на Ni-сефарозной матрице. Могут быть применены другие способы на основе аффинности, включая аффинную метку, которая должна быть предпочтительно расположена на N-терминальном конце белка, чтобы предотвратить вмешательство в связывание рецептора. Хотя первоначальный препарат показал неоднородную чистоту образца, оптимизация процесса очистки должна привести к получению продукта, соответствующего фармацевтическим стандартам. Следует добавить, что активная форма BoNT/TAB будет иметь сходную общую структуру и свойства связывания с неактивной молекулой, примененной в настоящем исследовании. Авторы изобретения заключили контракт с компанией «Toxogen GmbH» (Ганновер, Германия) на производство активной версии BoNT/TAB (BoNT/TAB2.1.3), которая была успешно очищена с помощью удаляемой С-концевой метки, для того чтобы не мешать связыванию с рецептором.

Кроме того, посттрансляционное расщепление одноцепочечного BoNT в двухцепочечную молекулу представляет собой важную стадию для проявления активности токсина (DasGupta and Sathyamoorthy, 1985; Shone et al, 1985). Хотя нативный токсин обычно активируется протеазой хозяина, любой рекомбинантный продукт BoNT необходимо обрабатывать экзопептидазой. Ранние исследования токсина показали, что трипсин может неспецифически расщеплять BoNT/A до активной двухцепочечной формы (Shone et al., 1985), однако это может привести к нежелательной дополнительной деградации токсина. Совсем недавно рекомбинантные технологии позволили создавать специфические мотивы распознавания протеаз в интересующем белке, таким образом, обеспечивая лучший контроль над стратегией активации BoNT (Sutton et al, 2005). В настоящем документе авторы изобретения включили сайт фактора Ха между LC и HC и наблюдали полную активацию токсина, таким образом демонстрируя эффективность этого фермента. Будущее производство BoNT/TAB должно включать стадию очистки, которая позволяет активировать токсин с последующим удалением экзопротеазы из конечного продукта. Хотя фактор Ха представляется адекватным, другие ферменты могут быть испытаны и могут оказаться успешными в достижении приемлемого выхода активации. Авторы изобретения заключили контракт с компанией «Toxogen GmbH» (Ганновер, Германия) на производство активной версии BoNT/TAB (BoNT/TAB2.1.3), которая была успешно активирована экзопротеазой тромбином и очищена до гомогенности.

В качестве средства для проверки структурной целостности H_C/TAB и подтверждения его расширенной функциональности авторы изобретения осуществили совместную кристаллизацию очищенного образца в комплексе с человеческим SV2C, человеческим Syt1 и углеводом GD1a. Рентгеновская кристаллическая структура комплекса была получена с высоким разрешением (1,5 Å) и представила убедительные экспериментальные доказательства того, что одна молекула H_C/TAB может связываться со всеми тремя рецепторами одновременно. Кроме того, сравнение известных структур H_C/A и H_C/B с их соответствующими рецепторами показало, что H_C/TAB следует практически идентичному механизму связывания.

Хотя кристаллическая структура продемонстрировала, что H_C/TAB может выполнять свое назначение, по крайней мере, in vitro, необходимо провести дополнительные биохимические эксперименты для полной характеристики его свойств связывания с рецептором. Они будут включать в себя анализ с соосаждением и ITC- анализ с белковыми рецепторами и ELISA-анализ связывания с ганглиозидными рецепторами. Ожидается, что BoNT/TAB будет действовать аналогично BoNT/A для связывания с рецептором SV2 и аналогично BoNT/B в отношении связывания с ганглиозидным рецептором и рецептором синаптотагмина. Кроме того, эксперименты in vivo обеспечат основные указания на истинный потенциал BoNT/TAB как терапевтического средства. DAS-анализ на мышах, классически применяемый для оценки препаратов BoNT (Broide et al., 2013), должен позволить авторам изобретения определить эффективность и продолжительность действия нашей молекулы по сравнению с доступными в настоящее время продуктами.

Кроме того, дизайн BoNT/TAB может быть дополнительно оптимизирован путем модификации некоторых элементов последовательности для улучшения его биохимических свойств и стабильности. Такие изменения могут включать делеции или мутации, которые приводят к тому, что растворимый BoNT все еще способен одновременно связываться с тремя рецепторами. Авторы изобретения успешно создали более стабильный вариант (H_C/TAB2.1) и более растворимый вариант с более высоким выходом продукции (H_C/TAB2.1.3).

Следует добавить, что с точки зрения безопасности, BoNT/TAB не представляют новую угрозу, поскольку он происходит от двух существующих серотипов. Ожидается, что он будет распознаваться доступными в настоящее время антитоксинами, такими как противоботулинический семивалентный антитоксин, BAT, или другими одобренными антидотами для BoNT/A и /B.

Серотипы A и B представляют собой единственные одобренные доступные на рынке BoNT. Хотя BoNT/A представляет собой основной токсин, применяемый в терапевтических целях, молекулы со сниженной иммуногенностью и высокой эффективностью обеспечат более безопасные альтернативы (Naumann et al., 2013). Предпринимались многочисленные попытки улучшить свойства BoNT с целью повышения их фармакологического потенциала (Masuyer et al., 2014). Недавний успешный пример включает исследование Tao et al. (2017), где мутации, спроектированные в ключевых положениях BoNT/B (E1191M/S1199Y), давали более высокое сродство токсина к человеческому рецептору синаптотагмина 2 и показали примерно в 11 раз более высокую эффективность в блокировании нейротрансмиссии по сравнению с диким типом. Другой подход к повышению эффективности BoNT был предпринят в работе Elliott et al. (2017), в которой авторы проанализировали влияние одной мутации (S201P), известной как увеличивающей каталитические активности BoNT/B в отношении его субстрата. В этом случае мутант BoNT/B не давал никаких преимуществ по сравнению с диким типом во множественных клеточных анализах и in vivo. В целом эти два исследования на BoNT/B предполагают, что первоначальное распознавание нейронов, а не последующая внутриклеточная активность представляет собой лимитирующую стадию в эффективности токсина.

Более ранние исследования, направленные на объединение свойств связывания одного серотипа с каталитической активностью другого, привели к созданию химерных молекул, в которых меняли целые домены (Wang et al., 2008, 2012; Rummel et al., 2011). В частности, Rummel et al. (2011) и Wang et al. (2012) разработали и протестировали аналогичные молекулы, состоящие из домена H_C/B, связанного с доменами H_N+LC BoNT/A. Сообщалось, что эти рекомбинантные токсины проявляют повышенную активность и вызывают более продолжительный эффект у мышей по сравнению с BoNT/A дикого типа (Kutschenko et al., 2017). Аналогичные наблюдения были получены при оценке конструкции, состоящей из C-концевого субдомена (H_Cc) BoNT/B в сочетании с комплементарными доменами серотипа A (то есть LC+H_N+H_Cn), и которые показали в четыре раза более высокую активность по сравнению с диким типом (Rummel et al., 2011). Все молекулы, описанные выше, имели такое общее свойство, что они распознавали только два рецептора BoNT/B, синаптотагмин и ганглиозид. Эти результаты позволяют предположить, что пролонгированный эффект и более высокая эффективность могут быть достигнуты благодаря большему потреблению LC/A, допускаемому более высокой распространенностью рецепторов BoNT/B на нейронах. Кроме того, для этих химерных молекул не принимали во внимание возможные междоменные внутримолекулярные столкновения, которые могли возникать в результате объединения доменов из разных серотипов и которые могли повлиять на потенциал этих продуктов.

Принимая во внимание результаты последних исследований в области инженерии BoNT, становится ясно, что изменение первоначального распознавания клеток представляет собой один из наиболее эффективных способов улучшения фармакологических свойств терапевтического продукта. Следовательно, BoNT/TAB, единственный продукт, успешно разработанный для распознавания рецептора SV2 вместе с рецепторами BoNT/B, синаптотагминома и ганглиозидов, демонстрирует большой потенциал и, кроме того, может быть более эффективным, чем BoNT/A и /B дикого типа.

Конструкция связывающего домена, обеспечивающего множественные рецепторные взаимодействия, представляет собой основное нововведение в BoNT/TAB. Современные данные указывают на то, что ассоциация H_C/TAB с транслокационными и каталитическими доменами BoNT/A должна обеспечить молекулу с наибольшей эффективностью (как разработано в BoNT/TAB). Однако H_C/TAB может по-прежнему представлять интерес в сочетании с функциональными доменами других серотипов (фигура 10a). Кроме того, H_C/TAB также может быть связан с другими представляющими интерес белками (фигура 10b) для применения в качестве фармакологического инструмента для исследования синаптических процессов. Анализы in vivo, проводимые с применением BoNT/TAB, должны прояснить его полезность для этой цели.

Ссылки

Benoit RM, Frey D, Hilbert M, Kevenaar JT, Wieser MM, Stirnimann CU, McMillan D, Ceska T, Lebon F, Jaussi R, Steinmetz MO, Schertler GF, Hoogenraad CC, Capitani G, Kammerer RA. 2014. Structural basis for recognition of synaptic vesicle protein 2C by botulinum neurotoxin A. Nature. 505:108-111.

Bentivoglio AR, Del Grande A, Petracca M, Ialongo T, Ricciardi L. 2015. Clinical differences between botulinum neurotoxin type A and B. Toxicon. 107:77-84.

Berntsson RP, Peng L, Dong M, Stenmark P. 2013. Structure of dual receptor binding to botulinum neurotoxin B. Nat Commun. 4:2058.

Binz T, Bade S, Rummel A, Kollewe A, Alves J. 2002. Arg(362) and Tyr(365) of the botulinum neurotoxin type a light chain are involved in transition state stabilization. Biochemistry 41:1717–1723.

Binz T, Rummel A. 2009. Cell entry strategy of clostridial neurotoxins. J Neurochem. 109:1584-1595.

Broide RS, Rubino J, Nicholson GS, Ardila MC, Brown MS, Aoki KR, Francis J. 2013. The rat Digit Abduction Score (DAS) assay: a physiological model for assessing botulinum neurotoxin-induced skeletal muscle paralysis. Toxicon. 71:18-24.

Chai Q, Arndt JW, Dong M, Tepp WH, Johnson EA, Chapman ER, Stevens RC. 2006. Structural basis of cell surface receptor recognition by botulinum neurotoxin B. Nature. 444:1096-1100.

Chen C, Baldwin MR, Barbieri JT. 2008. Molecular basis for tetanus toxin coreceptor interactions. Biochemistry. 47:7179-7186.

Chen S. 2012. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins (Basel). 4:913-39.

Chen VB, Arendall WB, Headd JJ, Keedy DA, Immormino RM, Kapral GJ, Murray LW, Richardson JS, Richardson DC. 2010. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. ActaCrystallogr D66:12–21.

Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. ActaCrystallogr D50:760–763.

DasGupta BR, Sathyamoorthy VS. 1985. Separation, purification, partial characterization and comparison of the heavy and light chains of botulinum neurotoxin types A, B, and E. J BiolChem 260:10461–10466.

Dong M, Richards DA, Goodnough MC, Tepp WH, Johnson EA, Chapman ER. 2003. Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J. Cell Biol. 162:1293–303.

Dong M, Yeh F, Tepp WH, Dean C, Johnson EA, Janz R, Chapman ER. 2006. SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A. Science. 312:592-596.

Dressler D, Bigalke H. 2005. Botulinum toxin type B de novo therapy of cervical dystonia: frequency of antibody induced therapy failure. J Neurol. 252:904-907.

Elliott M, Maignel J, Liu SM, Favre-Guilmard C, Mir I, Farrow P, Hornby F, Marlin S, Palan S, Beard M, Krupp J. 2017. Augmentation of VAMP-catalytic activity of botulinum neurotoxin serotype B does not result in increased potency in physiological systems. PLoS One. 12:e0185628.

Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, Cowtan K. 2010. Features and development of Coot. ActaCrystallogr D66:486–501.

Evans P. 2006. Scaling and assessment of data quality. ActaCrystallogr D62:72-82.

Gildea RJ, Waterman DG, Parkhurst JM, Axford D, Sutton G, Stuart DI, Sauter NK, Evans G, Winter G. 2014. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. ActaCrystallogr. D70:2652–2666.

Hamark C, Berntsson RP, Masuyer G, Henriksson LM, Gustafsson R, Stenmark P, Widmalm G. 2017. Glycans Confer Specificity to the Recognition of Ganglioside Receptors by Botulinum Neurotoxin A. J Am Chem Soc. 139:218-230.

Hatheway CL. 1990. Toxigenic clostridia. Clin. Microbiol. Rev. 3:66–98.

Jin R, Rummel A, Binz T, Brunger AT. 2006. Botulinum neurotoxin B recognizes its protein receptor with high affinity and specificity. Nature. 444:1092-1095.

Krissinel E. 2015. Stock-based detection of protein oligomeric states in jsPISA, Nucl. Acids Res. 43:W314-9.

Kutschenko A, Reinert MC, Krez N, Liebetanz D, Rummel A. 2017. BoNT/AB hybrid maintains similar duration of paresis as BoNT/A wild-type in murine running wheel assay. Neurotoxicology. 59:1-8.

Lacy DB, Stevens RC. 1999. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J Mol Biol. 291:1091-104.

Lange O, Bigalke H, Dengler R, Wegner F, deGroot M, Wohlfarth K. 2009. Neutralizing antibodies and secondary therapy failure after treatment with botulinum toxin type A: much ado about nothing? Clin. Neuropharmacol. 32:213–218.

Masuyer G, Chaddock JA, Foster KA, Acharya KR. 2014. Engineered botulinum neurotoxins as new therapeutics. Annu Rev PharmacolToxicol. 54:27-51.

Mahrhold S, Rummel A, Bigalke H, Davletov B, Binz T. 2006. The synaptic vesicle protein 2C mediates the uptake of botulinum neurotoxin A into phrenic nerves. FEBS Lett. 580:2011-2014.

McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, Winn MD, Storoni LC, Read RJ. 2007. Phaser crystallographic software. J ApplCrystallogr 40:658–674.

Montal M. 2010. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu Rev Biochem. 79:591-617.

Murshudov GN, Skubák P, Lebedev AA, Pannu NS, Steiner RA, Nicholls RA, Winn MD, Long F, Vagin AA. 2011. Refmac5 for the refinement of macromolecular crystal structures. ActaCrystallogr D67:355–367.

Naumann M, Boo LM, Ackerman AH, Gallagher CJ. 2013. Immunogenicity of botulinum toxins. J Neural. Transm (Vienna). 120:275-290.

Nishiki T, Kamata Y, Nemoto Y, Omori A, Ito T, Takahashi M, Kozaki S. 1994. Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes. J. Biol. Chem. 269:10498–10503.

Nishiki T, Tokuyama Y, Kamata Y, Nemoto Y, Yoshida A, Sato K, Sekiguchi M, Takahashi M, Kozaki S. 1996. The high-affinity binding of Clostridium botulinum type B neurotoxin to synaptotagmin II associated with gangliosides GT1b/GD1a. FEBS Lett. 378:253–257.

Robert X, Gouet, P. 2014. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucl. Acids Res. 42, W320-W324.

Rossetto O, Caccin P, Rigoni M, Tonello F, Bortoletto N, Stevens RC, Montecucco C. 2001. Active-site mutagenesis of tetanus neurotoxin implicates TYR-375 and GLU-271 in metalloproteolytic activity. Toxicon 39: 1151–1159.

Rossetto O, Pirazzini M, Montecucco C. 2014. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nat Rev Microbiol. 2014; 12:535-549.

Rummel A, Mahrhold S, Bigalke H, Binz T. 2011. Exchange of the H(CC) domain mediating double receptor recognition improves the pharmacodynamic properties of botulinum neurotoxin. FEBS J. 278:4506-4515.

Rummel A. 2013. Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity. Curr Top MicrobiolImmunol. 364:61-90.

Rummel A. 2016. Two Feet on the Membrane: Uptake of Clostridial Neurotoxins. Curr Top MicrobiolImmunol. Springer, Berlin, Heidelberg.

Schengrund C. L., DasGupta B. R. and Ringler N. J. 1991. Binding of botulinum and tetanus neurotoxins to ganglioside GT1b and derivatives thereof. J. Neurochem. 57, 1024–1032.

Schiavo G, Matteoli M, Montecucco C. 2000. Neurotoxins affecting exocytosis. Physiol. Rev. 80:717–766.

Shone CC, Hambleton P, Melling J. 1985. Inactivation of Clostridium botulinum type A neurotoxin by trypsin and purification of two tryptic fragments. Proteolytic action near the COOH-terminus of the heavy subunit destroys toxin-binding activity. Eur J Biochem 151, 75–82.

Sievers F, Wilm A, Dineen DG, Gibson TJ, Karplus K, Li W, Lopez R, McWilliam H, Remmert M, Söding J, Thompson JD, Higgins DG. 2011. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology 7:539.

Stenmark P, Dupuy J, Imamura A, Kiso M, Stevens RC. 2008. Crystal structure of botulinum neurotoxin type A in complex with the cell surface co-receptor GT1b-insight into the toxin-neuron interaction. PLoSPathog. 4:e1000129.

Strotmeier, J., Willjes, G., Binz, T. &Rummel, A. 2012. Human synaptotagmin-II is not a high affinity receptor for botulinum neurotoxin B and G: increased therapeutic dosage and immunogenicity. FEBS Lett. 586, 310–313.

Sudhof TC, Rothman JE. 2009. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science 323, 474–477.

Sutton JM, Wayne J, Scott-Tucker A, O’ Brien SM,Marks PM, Alexander FC, Shone CC &Chaddock JA. 2005. Preparation of specifically activatable endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxins type A, B, and C and their applications. Protein Expr Purif 40, 31–41.

Swaminathan S. 2011. Molecular structures and functional relationships in clostridial neurotoxins. FEBS J. 278:4467-4485.

Takamizawa K., Iwamori M., Kozaki S., Sakaguchi G., Tanaka R., Takayama H. and Nagai Y. 1986. TLC immunostaining characterization of Clostridium botulinum type A neurotoxin binding to gangliosides and free fatty acids. FEBS Lett. 201:229–232.

Takamori S, Holt M, Stenius K, Lemke EA, Grønborg M, Riedel D, Urlaub H, Schenck S, Brügger B, Ringler P, Müller SA, Rammner B, Gräter F, Hub JS, De Groot BL, Mieskes G, Moriyama Y, Klingauf J, Grubmüller H, Heuser J, Wieland F, Jahn R. 2006. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell 127:831–846.

Tao L, Peng L, Berntsson RP, Liu SM, Park S, Yu F, Boone C, Palan S, Beard M, Chabrier PE, Stenmark P, Krupp J, Dong M. 2017. Engineered botulinum neurotoxin B with improved efficacy for targeting human receptors. Nat Commun. 8:53.

Wang J, Meng J, Lawrence GW, Zurawski TH, Sasse A, Bodeker MO, Gilmore MA, Fernández-Salas E, Francis J, Steward LE, Aoki KR, Dolly JO. 2008. Novel chimeras of botulinum neurotoxins A and E unveil contributions from the binding, translocation, and protease domains to their functional characteristics. J Biol Chem. 283:16993-17002.

Wang J, Zurawski TH, Bodeker MO, Meng J, Boddul S, Aoki KR, Dolly JO. 2012. Longer-acting and highly potent chimaeric inhibitors of excessive exocytosis created with domains from botulinum neurotoxin A and B. Biochem J. 444:59-67.

Wilhelm BG, Mandad S, Truckenbrodt S, Kröhnert K, Schäfer C, Rammner B, Koo SJ, Claßen GA, Krauss M, Haucke V, Urlaub H, Rizzoli SO. 2014. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science 344:1023–1028.

Willjes G, Mahrhold S, Strotmeier J, Eichner T, Rummel A, Binz T. 2013. Botulinum neurotoxin G binds synaptotagmin-II in a mode similar to that of serotype B: tyrosine 1186 and lysine 1191 cause its lower affinity. Biochemistry. 2013 52:3930-3938.

Yao G, Zhang S, Mahrhold S, Lam KH, Stern D, Bagramyan K, Perry K, Kalkum M, Rummel A, Dong M, Jin R. 2016. N-linked glycosylation of SV2 is required for binding and uptake of botulinum neurotoxin A. Nat StructMol Biol. 23:656-662.

Zhang S, Masuyer G, Zhang J, Shen Y, Lundin D, Henriksson L, Miyashita SI, Martínez-Carranza M, Dong M, Stenmark P. 2017. Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin. Nat Commun. 8:14130.

Stern D, Weisemann J, Le Blanc A, von Berg L, Mahrhold S, Piesker J, Laue M, Luppa PB, Dorner MB, Dorner BG, Rummel A. 2018. A lipid-binding loop of botulinum neurotoxin serotypes B, DC and G is an essential feature to confer their exquisite potency. PLoSPathog. 14(5):e1007048.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Stenmark, Pеl

<120> TricepTox

<130> P41705056PCT00

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TriRecABTox

<400> 1

Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn

1 5 10 15

His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser

20 25 30

Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn

35 40 45

Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr

50 55 60

Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro

65 70 75 80

Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu

100 105 110

Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val

115 120 125

Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp

130 135 140

Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr

145 150 155 160

Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn

165 170 175

Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp

180 185 190

Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu

195 200 205

Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser

210 215 220

Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro

225 230 235 240

Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

245 250 255

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met

260 265 270

Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe

275 280 285

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val

290 295 300

Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu

305 310 315 320

Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu

325 330 335

Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

340 345 350

Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe

355 360 365

Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His

370 375 380

Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

385 390 395 400

Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn

405 410 415

Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp

420 425 430

Gly Glu Arg Pro Leu

435

<210> 2

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TriRecABTox codon optimised sequence for expression in E.

coli

<400> 2

aagaacatta tcaacaccag catcctgaac ctgcgctacg agagcaacca cctgatcgac

60

ctgagccgct acgcgagcaa gattaacatc ggtagcaagg tgaactttga cccgattgat

120

aaaaaccaga tccaactgtt caacctggaa agcagcaaga tcgaagtgat tctgaaaaac

180

gcgattgttt ataacagcat gtacgaaaac ttcagcacca gcttttggat ccgtattccg

240

aagtatttta acagcatcag cctgaacaac gaatacacca tcattaactg catggagaac

300

aacagcggtt ggaaagtgag cctgaactac ggcgaaatca tttggaccct gcaggacacc

360

caagagatca agcagcgtgt ggttttcaag tacagccaaa tgatcaacat cagcgattac

420

atcaaccgtt ggattttcgt taccatcacc aacaaccgtc tgaacaacag caagatctac

480

attaacggtc gtctgattga ccagaaaccg atcagcaacc tgggcaacat tcacgcgagc

540

aacaacatca tgttcaagct ggacggttgc cgtgataccc accgttatat ctggattaag

600

tacttcaacc tgtttgataa agagctgaac gaaaaggaga ttaaagacct gtatgataac

660

cagagcaaca gcggtatcct gaaggacttt tggggcgatt atctgcaata cgacaaaccg

720

tactatatgt tcaacgcggg taacaagaac agctacatta aactgaagaa agatagcccg

780

gtgggtgaaa tcctgggtcc gcgtggcagc gttatgacca ccaacatcta tctgaacagc

840

agcctgtacc gtggcgagaa gttcatcatt cgtcgtaaaa gcaacagcca gagcattaac

900

gacgatatcg tgcgtaacga agactacatt tatctggatt tctttaacct gaaccaagag

960

tggcgtgttt acacctacaa gtacttcaag aaagaggaag agaagctgtt cctggcgccg

1020

atcagcgaca gcgatgaatt ctacaacacc atccaaatca aggaatacga cgagcagggt

1080

accaacagct gccaactgct gttcaagaaa gacgaagaga gcaccgatga aatcggtctg

1140

atcggcattc accgtttcta cgagagcggc atcgtgttcg aagagtacaa ggattacttc

1200

tgcatcagca agtggtatct gaaagaggtt aagcgtaaac cgtacaacct gaaactgggc

1260

tgcaactggc aatttattcc ggtggatgat ggctggggtg aacgtccgct gtaa

1314

<210> 3

<211> 1311

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full-length inactive TriRecABTox with engineered activation

site

<400> 3

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Gln

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Ala Lys Thr Phe Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly Arg Asp Lys

435 440 445

Gly Tyr Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp

450 455 460

Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn

465 470 475 480

Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu

485 490 495

Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe

500 505 510

Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile

515 520 525

Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly

530 535 540

Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala

545 550 555 560

Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val

565 570 575

Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser

580 585 590

Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu

595 600 605

Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu

610 615 620

Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr

625 630 635 640

Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe

645 650 655

Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile

660 665 670

Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr

675 680 685

Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser

690 695 700

Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn

705 710 715 720

Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met

725 730 735

Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn

740 745 750

Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe

755 760 765

Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala

770 775 780

Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu

785 790 795 800

Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp

805 810 815

Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly

820 825 830

Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr

835 840 845

Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln

850 855 860

Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr

865 870 875 880

Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser

885 890 895

Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro

900 905 910

Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile

915 920 925

Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn

930 935 940

Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile

945 950 955 960

Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser

965 970 975

Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln

980 985 990

Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met

995 1000 1005

Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile

1010 1015 1020

Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg

1025 1030 1035

Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala

1040 1045 1050

Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His

1055 1060 1065

Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu

1070 1075 1080

Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser

1085 1090 1095

Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys

1100 1105 1110

Pro Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys

1115 1120 1125

Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly

1130 1135 1140

Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg

1145 1150 1155

Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile

1160 1165 1170

Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe

1175 1180 1185

Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe

1190 1195 1200

Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser

1205 1210 1215

Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln

1220 1225 1230

Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser

1250 1255 1260

Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys

1265 1270 1275

Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu

1280 1285 1290

Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1295 1300 1305

Arg Pro Leu

1310

<210> 4

<211> 3936

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full-length inactive TriRecABTox w engineered activation site,

codon opimised sequence for expression in E. coli

<400> 4

atgccgttcg tgaataagca gttcaactac aaagatccgg ttaatggcgt ggacatcgcg

60

tacatcaaaa tcccgaatgc gggtcagatg cagccggtga aggcgttcaa aatccacaac

120

aaaatttggg ttatcccgga gcgtgacacc tttaccaacc cggaggaagg tgatctgaac

180

ccgccgccgg aagcgaaaca agtgccggtt agctactatg acagcaccta tctgagcacc

240

gacaacgaga aggataacta cctgaagggc gtgaccaaac tgttcgaacg tatctacagc

300

accgatctgg gtcgtatgct gctgaccagc attgttcgtg gcatcccgtt ttggggtggc

360

agcaccatcg acaccgaact gaaagtgatt gataccaact gcattaacgt tatccagccg

420

gatggtagct accgtagcga ggaactgaac ctggtgatca ttggcccgag cgcggacatc

480

attcagtttg agtgcaagag cttcggtcac gaagttctga acctgacccg taacggttac

540

ggcagcaccc aatatatccg tttcagcccg gatttcacct ttggcttcga ggaaagcctg

600

gaagtggaca ccaacccgct gctgggtgcg ggcaagtttg cgaccgaccc ggcggttacc

660

ctggcgcacc agctgatcca tgcgggtcac cgtctgtacg gcattgcgat caacccgaac

720

cgtgtgttca aagttaacac caacgcgtac tatgagatga gcggtctgga agtgagcttt

780

gaggaactgc gtaccttcgg tggccacgac gcgaagttta tcgatagcct gcaggagaac

840

gaattccgtc tgtactacta caacaagttc aaggacatcg cgagcaccct gaacaaggcg

900

aaaagcattg tgggtaccac cgcgagcctg caatacatga agaacgtttt caaggagaag

960

tacctgctga gcgaagatac cagcggcaag tttagcgtgg acaagctgaa attcgataag

1020

ctgtataaaa tgctgaccga gatctacacc gaagataact tcgtgaagtt ctttaaagtt

1080

ctgaacgcga aaacctttct gaacttcgac aaggcggttt ttaaaattaa catcgtgccg

1140

aaggttaact acaccatcta tgatggtttc aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac

1200

tttaacggcc agaacaccga gattaacaac atgaacttta ccaagctgaa aaacttcacc

1260

ggtctgtttg aattctataa actgctgtgc gtgcgtggca tcattaccag caagaccaaa

1320

agcctgatcg aaggtcgtga caagggctac aacaaagcgc tgaacgatct gtgcattaaa

1380

gttaacaact gggacctgtt ctttagcccg agcgaggaca acttcaccaa cgatctgaac

1440

aagggcgagg aaatcaccag cgacaccaac attgaagcgg cggaggaaaa catcagcctg

1500

gatctgattc agcaatatta cctgaccttt aacttcgaca acgagccgga aaacattagc

1560

atcgagaacc tgagcagcga catcattggt cagctggagc tgatgccgaa catcgaacgt

1620

ttcccgaacg gcaagaaata cgaactggat aaatatacca tgttccacta cctgcgtgcg

1680

caagagtttg aacacggcaa gagccgtatt gcgctgacca acagcgtgaa cgaggcgctg

1740

ctgaacccga gccgtgttta taccttcttt agcagcgact acgtgaagaa agttaacaaa

1800

gcgaccgagg cggcgatgtt cctgggttgg gtggaacagc tggtttacga ctttaccgat

1860

gaaaccagcg aggtgagcac caccgacaaa attgcggata tcaccatcat tatcccgtat

1920

atcggtccgg cgctgaacat tggcaacatg ctgtacaagg acgattttgt gggtgcgctg

1980

atcttcagcg gcgcggttat cctgctggag ttcattccgg aaattgcgat cccggtgctg

2040

ggtacctttg cgctggttag ctacatcgcg aacaaggtgc tgaccgttca aaccattgat

2100

aacgcgctga gcaagcgtaa cgagaaatgg gacgaagtgt ataaatacat cgttaccaac

2160

tggctggcga aggttaacac ccagattgac ctgatccgta agaaaatgaa agaggcgctg

2220

gaaaaccaag cggaggcgac caaggcgatt atcaactatc agtacaacca atacaccgag

2280

gaagagaaaa acaacattaa cttcaacatc gacgatctga gcagcaagct gaacgaaagc

2340

atcaacaaag cgatgattaa catcaacaag tttctgaacc agtgcagcgt gagctatctg

2400

atgaacagca tgattccgta cggtgttaag cgtctggagg acttcgatgc gagcctgaag

2460

gacgcgctgc tgaaatatat ctacgataac cgtggtaccc tgattggcca agtggaccgt

2520

ctgaaggata aagttaacaa caccctgagc accgatatcc cgttccagct gagcaaatat

2580

gtggacaacc aacgtctgct gagcaccttt accgagtaca tcaagaacat tatcaacacc

2640

agcattctga acctgcgtta tgaaagcaac cacctgatcg acctgagccg ttacgcgagc

2700

aagattaaca tcggtagcaa agttaacttc gacccgatcg ataaaaacca gattcaactg

2760

tttaacctgg agagcagcaa gattgaagtg atcctgaaaa acgcgatcgt ttacaacagc

2820

atgtatgaga actttagcac cagcttctgg attcgtatcc cgaaatattt caacagcatt

2880

agcctgaaca acgagtacac cattatcaac tgcatggaaa acaacagcgg ttggaaggtg

2940

agcctgaact acggcgagat tatctggacc ctgcaggaca cccaagaaat caagcagcgt

3000

gtggttttca agtacagcca aatgatcaac atcagcgatt acattaaccg ttggatcttt

3060

gttaccatta ccaacaaccg tctgaacaac agcaaaattt acatcaacgg tcgtctgatc

3120

gaccagaagc cgattagcaa cctgggcaac atccacgcga gcaacaacat tatgttcaag

3180

ctggacggtt gccgtgatac ccaccgttat atttggatca agtacttcaa cctgttcgat

3240

aaggagctga acgagaagga aatcaaagac ctgtatgata accagagcaa cagcggtatt

3300

ctgaaagact tctggggcga ttacctgcaa tatgacaagc cgtattacat gtttaacgcg

3360

ggtaacaaga acagctacat caaactgaag aaagatagcc cggtgggtga aattctgggt

3420

ccgcgtggca gcgttatgac caccaacatc tatctgaaca gcagcctgta ccgtggcgaa

3480

aagttcatta tccgtcgtaa aagcaacagc cagagcatca acgacgatat tgtgcgtaac

3540

gaggactata tctacctgga tttctttaac ctgaaccaag aatggcgtgt ttacacctac

3600

aagtacttca agaaagaaga ggaaaagctg tttctggcgc cgattagcga cagcgatgaa

3660

ttctataaca ccattcagat caaagagtac gacgaacagg gtaccaacag ctgccaactg

3720

ctgtttaaga aagacgagga aagcaccgat gagatcggtc tgattggcat ccaccgtttt

3780

tacgaaagcg gcatcgtgtt cgaggaatac aaggattact tctgcatcag caagtggtat

3840

ctgaaagagg ttaagcgtaa accgtacaac ctgaaactgg gctgcaactg gcaatttatt

3900

ccggtggatg atggctgggg tgaacgtccg ctgtaa

3936

<210> 5

<211> 1311

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Full-length active TreRecABTox with engineered activation site

<400> 5

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Ile Glu Gly Arg Asp Lys

435 440 445

Gly Tyr Asn Lys Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp

450 455 460

Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn

465 470 475 480

Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu

485 490 495

Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe

500 505 510

Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile

515 520 525

Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly

530 535 540

Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala

545 550 555 560

Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val

565 570 575

Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser

580 585 590

Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu

595 600 605

Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu

610 615 620

Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr

625 630 635 640

Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe

645 650 655

Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile

660 665 670

Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr

675 680 685

Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser

690 695 700

Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn

705 710 715 720

Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met

725 730 735

Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn

740 745 750

Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe

755 760 765

Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala

770 775 780

Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu

785 790 795 800

Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp

805 810 815

Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly

820 825 830

Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr

835 840 845

Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln

850 855 860

Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr

865 870 875 880

Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser

885 890 895

Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro

900 905 910

Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile

915 920 925

Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn

930 935 940

Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile

945 950 955 960

Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser

965 970 975

Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln

980 985 990

Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln Met

995 1000 1005

Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile

1010 1015 1020

Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg

1025 1030 1035

Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala

1040 1045 1050

Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His

1055 1060 1065

Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu

1070 1075 1080

Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser

1085 1090 1095

Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys

1100 1105 1110

Pro Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys

1115 1120 1125

Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly

1130 1135 1140

Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg

1145 1150 1155

Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile

1160 1165 1170

Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe

1175 1180 1185

Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe

1190 1195 1200

Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser

1205 1210 1215

Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln

1220 1225 1230

Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser

1235 1240 1245

Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser

1250 1255 1260

Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys

1265 1270 1275

Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu

1280 1285 1290

Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu

1295 1300 1305

Arg Pro Leu

1310

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1, optimised loop 360

<400> 6

Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn

1 5 10 15

His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser

20 25 30

Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn

35 40 45

Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr

50 55 60

Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro

65 70 75 80

Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu

100 105 110

Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val

115 120 125

Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp

130 135 140

Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr

145 150 155 160

Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn

165 170 175

Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp

180 185 190

Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu

195 200 205

Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser

210 215 220

Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro

225 230 235 240

Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys

245 250 255

Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met

260 265 270

Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe

275 280 285

Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val

290 295 300

Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu

305 310 315 320

Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu

325 330 335

Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln

340 345 350

Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe

355 360 365

Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His

370 375 380

Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe

385 390 395 400

Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn

405 410 415

Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp

420 425 430

Gly Glu Arg Pro Leu

435

<210> 7

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1, codon optimised for expression in E. coli

<400> 7

aagaacatta tcaacaccag catcctgaac ctgcgctacg agagcaacca cctgatcgac

60

ctgagccgct acgcgagcaa gattaacatc ggtagcaagg tgaactttga cccgattgat

120

aaaaaccaga tccaactgtt caacctggaa agcagcaaga tcgaagtgat tctgaaaaac

180

gcgattgttt ataacagcat gtacgaaaac ttcagcacca gcttttggat ccgtattccg

240

aagtatttta acagcatcag cctgaacaac gaatacacca tcattaactg catggagaac

300

aacagcggtt ggaaagtgag cctgaactac ggcgaaatca tttggaccct gcaggacacc

360

caagagatca agcagcgtgt ggttttcaag tacagccaaa tgatcaacat cagcgattac

420

atcaaccgtt ggattttcgt taccatcacc aacaaccgtc tgaacaacag caagatctac

480

attaacggtc gtctgattga ccagaaaccg atcagcaacc tgggcaacat tcacgcgagc

540

aacaacatca tgttcaagct ggacggttgc cgtgataccc accgttatat ctggattaag

600

tacttcaacc tgtttgataa agagctgaac gaaaaggaga ttaaagacct gtatgataac

660

cagagcaaca gcggtatcct gaaggacttt tggggcgatt atctgcaata cgacaaaccg

720

tactatatgt tcaacgcggg taacaagaac agctacatta aactgaagaa agatagcccg

780

gtgggtgaaa tcctgggtcc gcgtggcagc gttatgacca ccaacatcta tctgaacagc

840

agcctgtacc gtggcgagaa gttcatcatt cgtcgtaaaa gcaacagcca gagcattaac

900

gacgatatcg tgcgtaacga agactacatt tatctggatt tctttaacct gaaccaagag

960

tggcgtgttt acacctacaa gtacttcaag aaagaggaag agaagctgtt cctggcgccg

1020

atcagcgaca gcgatgaatt ctacaacacc atccaaatca aggaatacga cgagcagccg

1080

acctatagct gccaactgct gttcaagaaa gacgaagaga gcaccgatga aatcggtctg

1140

atcggcattc accgtttcta cgagagcggc atcgtgttcg aagagtacaa ggattacttc

1200

tgcatcagca agtggtatct gaaagaggtt aagcgtaaac cgtacaacct gaaactgggc

1260

tgcaactggc aatttattcc ggtggatgat ggctggggtg aacgtccgct gtaa

1314

<210> 8

<211> 432

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1.1

<400> 8

Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp

20 25 30

Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys

35 40 45

Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu

50 55 60

Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn

85 90 95

Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu

100 105 110

Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln

115 120 125

Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile

130 135 140

Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu

145 150 155 160

Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn

165 170 175

Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile

180 185 190

Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

195 200 205

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp

210 215 220

Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn

225 230 235 240

Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val

245 250 255

Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr

260 265 270

Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys

275 280 285

Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr

290 295 300

Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr

305 310 315 320

Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile

325 330 335

Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp

340 345 350

Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu

355 360 365

Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser

370 375 380

Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp

385 390 395 400

Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys

405 410 415

Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu

420 425 430

<210> 9

<211> 1299

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1.1, codon optimised for expression in E. coli

<400> 9

accagcatcc tgaacctgcg ctacgagagc aaccacctga tcgacctgag ccgctacgcg

60

agcaagatta acatcggtag caaggtgaac tttgacccga ttgataaaaa ccagatccaa

120

ctgttcaacc tggaaagcag caagatcgaa gtgattctga aaaacgcgat tgtttataac

180

agcatgtacg aaaacttcag caccagcttt tggatccgta ttccgaagta ttttaacagc

240

atcagcctga acaacgaata caccatcatt aactgcatgg agaacaacag cggttggaaa

300

gtgagcctga actacggcga aatcatttgg accctgcagg acacccaaga gatcaagcag

360

cgtgtggttt tcaagtacag ccaaatgatc aacatcagcg attacatcaa ccgttggatt

420

ttcgttacca tcaccaacaa ccgtctgaac aacagcaaga tctacattaa cggtcgtctg

480

attgaccaga aaccgatcag caacctgggc aacattcacg cgagcaacaa catcatgttc

540

aagctggacg gttgccgtga tacccaccgt tatatctgga ttaagtactt caacctgttt

600

gataaagagc tgaacgaaaa ggagattaaa gacctgtatg ataaccagag caacagcggt

660

atcctgaagg acttttgggg cgattatctg caatacgaca aaccgtacta tatgttcaac

720

gcgggtaaca agaacagcta cattaaactg aagaaagata gcccggtggg tgaaatcctg

780

ggtccgcgtg gcagcgttat gaccaccaac atctatctga acagcagcct gtaccgtggc

840

gagaagttca tcattcgtcg taaaagcaac agccagagca ttaacgacga tatcgtgcgt

900

aacgaagact acatttatct ggatttcttt aacctgaacc aagagtggcg tgtttacacc

960

tacaagtact tcaagaaaga ggaagagaag ctgttcctgg cgccgatcag cgacagcgat

1020

gaattctaca acaccatcca aatcaaggaa tacgacgagc agccgaccta tagctgccaa

1080

ctgctgttca agaaagacga agagagcacc gatgaaatcg gtctgatcgg cattcaccgt

1140

ttctacgaga gcggcatcgt gttcgaagag tacaaggatt acttctgcat cagcaagtgg

1200

tatctgaaag aggttaagcg taaaccgtac aacctgaaac tgggctgcaa ctggcaattt

1260

attccggtgg atgatggctg gggtgaacgt ccgctgtaa

1299

<210> 10

<211> 424

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1.3, increased solubility

<400> 10

Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp

20 25 30

Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys

35 40 45

Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu

50 55 60

Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn

85 90 95

Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu

100 105 110

Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln

115 120 125

Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile

130 135 140

Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu

145 150 155 160

Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn

165 170 175

Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile

180 185 190

Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu

195 200 205

Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp

210 215 220

Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn

225 230 235 240

Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val

245 250 255

Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr

260 265 270

Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys

275 280 285

Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr

290 295 300

Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr

305 310 315 320

Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile

325 330 335

Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp

340 345 350

Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu

355 360 365

Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Asn Asn Lys

370 375 380

Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys

385 390 395 400

Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp

405 410 415

Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu

420

<210> 11

<211> 1275

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hc/TAB2.1.3, codon optimised for expression in E. coli

<400> 11

accagcatcc tgaacctgcg ctacgagagc aaccacctga tcgacctgag ccgctacgcg

60

agcaagatta acatcggtag caaggtgaac tttgacccga ttgataaaaa ccagatccaa

120

ctgttcaacc tggaaagcag caagatcgaa gtgattctga aaaacgcgat tgtttataac

180

agcatgtacg aaaacttcag caccagcttt tggatccgta ttccgaagta ttttaacagc

240

atcagcctga acaacgaata caccatcatt aactgcatgg agaacaacag cggttggaaa

300

gtgagcctga actacggcga aatcatttgg accctgcagg acacccaaga gatcaagcag

360

cgtgtggttt tcaagtacag ccaaatgatc aacatcagcg attacatcaa ccgttggatt

420

ttcgttacca tcaccaacaa ccgtctgaac aacagcaaga tctacattaa cggtcgtctg

480

attgaccaga aaccgatcag caacctgggc aacattcacg cgagcaacaa catcatgttc

540

aagctggacg gttgccgtga tacccaccgt tatatctgga ttaagtactt caacctgttt

600

gataaagagc tgaacgaaaa ggagattaaa gacctgtatg ataaccagag caacagcggt

660

atcctgaagg acttttgggg cgattatctg caatacgaca aaccgtacta tatgttcaac

720

gcgggtaaca agaacagcta cattaaactg aagaaagata gcccggtggg tgaaatcctg

780

ggtccgcgtg gcagcgttat gaccaccaac atctatctga acagcagcct gtaccgtggc

840

gagaagttca tcattcgtcg taaaagcaac agccagagca ttaacgacga tatcgtgcgt

900

aacgaagact acatttatct ggatttcttt aacctgaacc aagagtggcg tgtttacacc

960

tacaagtact tcaagaaaga ggaagagaag ctgttcctgg cgccgatcag cgacagcgat

1020

gaattctaca acaccatcca aatcaaggaa tacgacgagc agccgaccta tagctgccaa

1080

ctgctgttca agaaagacga agagagcacc gatgaaatcg gtctgatcgg cattcaccgt

1140

ttcaacaaca aggattactt ctgcatcagc aagtggtatc tgaaagaggt taagcgtaaa

1200

ccgtacaacc tgaaactggg ctgcaactgg caatttattc cggtggatga tggctggggt

1260

gaacgtccgc tgtaa

1275

<210> 12

<211> 1343

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoNT/TAB2.1.3, full-length active protein

<400> 12

Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly

1 5 10 15

Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro

20 25 30

Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg

35 40 45

Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu

50 55 60

Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr

65 70 75 80

Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu

85 90 95

Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys

115 120 125

Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr

130 135 140

Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile

145 150 155 160

Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe

180 185 190

Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu

195 200 205

Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Ala

210 215 220

Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn

225 230 235 240

Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu

245 250 255

Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys

260 265 270

Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn

275 280 285

Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val

290 295 300

Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu

325 330 335

Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp

340 345 350

Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Ala Lys Thr Phe Leu Asn

355 360 365

Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr

370 375 380

Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn

385 390 395 400

Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu

405 410 415

Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg

420 425 430

Gly Ile Ile Thr Ser Lys Ala Gly Ala Gly Lys Ser Leu Val Pro Arg

435 440 445

Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn

450 455 460

Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp

465 470 475 480

Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala

485 490 495

Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe

500 505 510

Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser

515 520 525

Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro

530 535 540

Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu

545 550 555 560

Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn

565 570 575

Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe

580 585 590

Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met

595 600 605

Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr

610 615 620

Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile

625 630 635 640

Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp

645 650 655

Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu

660 665 670

Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val

675 680 685

Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala

690 695 700

Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val

705 710 715 720

Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys

725 730 735

Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile

740 745 750

Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile

755 760 765

Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn

770 775 780

Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser

785 790 795 800

Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp

805 810 815

Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn

820 825 830

Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn

835 840 845

Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp

850 855 860

Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile

865 870 875 880

Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp

885 890 895

Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe

900 905 910

Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser

915 920 925

Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr

930 935 940

Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn

945 950 955 960

Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn

965 970 975

Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr

980 985 990

Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser

995 1000 1005

Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val

1010 1015 1020

Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn

1025 1030 1035

Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile

1040 1045 1050

His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp

1055 1060 1065

Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys

1070 1075 1080

Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser

1085 1090 1095

Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr

1100 1105 1110

Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr

1115 1120 1125

Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro

1130 1135 1140

Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu

1145 1150 1155

Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln

1160 1165 1170

Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu

1175 1180 1185

Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys

1190 1195 1200

Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser

1205 1210 1215

Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp

1220 1225 1230

Glu Gln Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu

1235 1240 1245

Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr

1250 1255 1260

Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile

1265 1270 1275

Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu

1280 1285 1290

Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp

1295 1300 1305

Gly Glu Arg Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Asn Ser Ser Ser

1310 1315 1320

Val Asp Lys Leu Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Leu Glu His

1325 1330 1335

His His His His His

1340

<210> 13

<211> 4032

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BoNT/TAB2.1.3, sequence included in pEt29(a) vector for

expression in E. coli

<400> 13

atgccatttg tgaacaagca gtttaactat aaggacccgg tgaacggtgt ggatatcgcg

60

tatatcaaaa tcccgaatgc gggccagatg caaccagtca aggcgttcaa gattcataac

120

aagatttggg ttattccgga acgtgatacc ttcaccaatc cggaagaagg cgacttaaac

180

ccgccgccag aagccaaaca agtgccggtg agctactatg atagcacgta tcttagcacc

240

gataatgaaa aagacaatta cctgaagggc gtgaccaagt tgttcgagcg catctacagt

300

accgacttag gccgcatgtt gttgacgagc atcgttcgcg gtatcccgtt ctggggcggc

360

tcgaccattg ataccgagtt gaaagtcatt gacacgaact gtatcaatgt tatccaaccg

420

gacggcagtt atcgcagcga ggagttaaat ttggtcatca tcggtccaag cgcagatatt

480

attcagttcg aatgcaagag cttcggccat gaggtcttga atttgacgcg caacggttac

540

ggcagcaccc aatacatccg ctttagcccg gatttcacct ttggcttcga ggagagcttg

600

gaggtggaca ccaacccgct gttaggtgcc ggcaaattcg caaccgaccc ggcagtgacg

660

ttggcgcacg cgttgattca tgcgggtcac cgcttatacg gtatcgcgat caatccgaat

720

cgcgtcttta aagtcaatac caacgcgtac tacgaaatga gcggcttaga ggttagcttt

780

gaagaattac gcaccttcgg tggccacgac gccaagttca tcgacagcct gcaggaaaat

840

gagttccgct tgtactatta caataaattc aaggacatcg cgagcacctt aaataaagca

900

aagagcattg tgggcaccac cgcaagcttg cagtacatga agaacgtatt taaggaaaaa

960

tatttgttgt cggaggatac cagcgggaaa ttcagcgtcg ataagctgaa attcgacaaa

1020

ttgtataaaa tgctgaccga gatttacacc gaggataact tcgtcaagtt ttttaaggtg

1080

ttaaatgcga agaccttttt aaactttgat aaagcggtgt ttaaaattaa tatcgtgccg

1140

aaggtgaatt acaccatcta cgatggtttc aatttacgca acacgaatct ggcggcgaat

1200

tttaatggcc aaaacaccga aattaacaac atgaacttta cgaagttaaa gaatttcacg

1260

ggcttattcg aattctacaa gttattatgc gtgcgcggca tcattaccag caaggcaggt

1320

gcgggcaagt ccttggttcc gcgtggcagc gccggcgccg gcgcgctcaa tgatctgtgt

1380

attaaagtca ataactggga cctgttcttc agcccgagcg aggataactt taccaacgac

1440

ttaaacaaag gcgaggagat cacgagcgat acgaacatcg aggcggcgga ggaaaatatt

1500

agcctggacc tcattcagca gtactatctg acgttcaatt ttgacaatga gccggagaac

1560

atcagcattg aaaatctcag cagcgacatc atcggtcagt tggaactgat gccgaacatt

1620

gaacgctttc cgaacggcaa aaaatatgaa ctggacaagt ataccatgtt ccattactta

1680

cgcgcacagg aatttgagca cggcaagagc cgcattgcgc tgaccaatag cgttaacgag

1740

gccttgttaa atccgagccg tgtctacacg ttcttcagca gcgattatgt caaaaaagtg

1800

aacaaggcga ccgaagccgc gatgtttttg ggctgggtcg agcaattggt ttacgatttt

1860

accgacgaaa ccagcgaggt gagcacgacc gacaaaattg cagatatcac catcatcatt

1920

ccgtacatcg gtccggcgct caatatcggc aatatgttat acaaggacga ctttgtgggc

1980

gcgctgatct ttagcggcgc ggttatctta ttagaattca tcccggagat cgcaatcccg

2040

gtcttgggca cctttgcgtt ggtgagctat atcgcgaata aagtgctcac ggtccaaacc

2100

atcgataacg cgctcagcaa gcgtaatgag aaatgggacg aggtttataa gtatatcgtg

2160

accaactggt tagcaaaagt caatacgcag atcgatctca tccgcaaaaa aatgaaagaa

2220

gccttggaaa atcaagcgga ggcaaccaaa gccatcatta attaccagta taaccaatat

2280

accgaagaag aaaaaaacaa tatcaacttc aatatcgatg atttgagcag caaactgaac

2340

gagagcatta acaaagcgat gattaacatc aacaagttct tgaatcaatg cagcgtgagc

2400

tatctcatga acagcatgat cccgtatggc gtcaaacgct tggaagattt tgacgccagc

2460

ctgaaagatg cgctcctcaa gtatatttat gacaaccgcg gcaccctcat tggccaggtg

2520

gaccgcttga aggataaagt gaacaatacg ctcagcacgg atatcccgtt ccagctgagc

2580

aagtacgtcg acaaccagcg cttactgagc acctttaccg agtatatcaa gaacatcatt

2640

aataccagca tcctcaactt gcgctatgag agcaatcacc tgatcgacct cagccgctac

2700

gccagcaaga tcaacatcgg cagcaaggtc aatttcgacc cgatcgataa gaatcagatc

2760

caattgttta acctggaaag cagcaagatc gaggttatct tgaagaacgc gattgtgtac

2820

aacagcatgt atgagaactt tagcaccagc ttctggattc gtatcccgaa atatttcaac

2880

agcattagcc tgaacaacga gtacaccatt atcaactgca tggaaaacaa cagcggttgg

2940

aaggtgagcc tgaactacgg cgagattatc tggaccctgc aggacaccca agaaatcaag

3000

cagcgtgtgg ttttcaagta cagccaaatg atcaacatca gcgattacat taaccgttgg

3060

atctttgtta ccattaccaa caaccgtctg aacaacagca aaatttacat caacggtcgt

3120

ctgatcgacc agaagccgat tagcaacctg ggcaacatcc acgcgagcaa caacattatg

3180

ttcaagctgg acggttgccg tgatacccac cgttatattt ggatcaagta cttcaacctg

3240

ttcgataagg agctgaacga gaaggaaatc aaagacctgt atgataacca gagcaacagc

3300

ggtattctga aagacttctg gggcgattac ctgcaatatg acaagccgta ttacatgttt

3360

aacgcgggta acaagaacag ctacatcaaa ctgaagaaag atagcccggt gggtgaaatt

3420

ctgggtccgc gtggcagcgt tatgaccacc aacatctatc tgaacagcag cctgtaccgt

3480

ggcgaaaagt tcattatccg tcgtaaaagc aacagccaga gcatcaacga cgatattgtg

3540

cgtaacgagg actatatcta cctggatttc tttaacctga accaagaatg gcgtgtttac

3600

acctacaagt acttcaagaa agaagaggaa aagctgtttc tggcgccgat tagcgacagc

3660

gatgaattct ataacaccat tcagatcaaa gagtacgacg aacagggtac caacagctgc

3720

caactgctgt ttaagaaaga cgaggaaagc accgatgaga tcggtctgat tggcatccac

3780

cgtttttacg aaagcggcat cgtgttcgag gaatacaagg attacttctg catcagcaag

3840

tggtatctga aagaggttaa gcgtaaaccg tacaacctga aactgggctg caactggcaa

3900

tttattccgg tggatgatgg ctggggtgaa cgtccactag tgccacgcgg ttccgcgaat

3960

tcgagctccg tcgacaagct ttggagccac ccgcagttcg aaaaactcga gcaccaccac

4020

caccaccact ga

4032

<210> 14

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> hSytI peptide

<400> 14

Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met

1 5 10 15

Asn Glu Leu His Lys

20

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым пептидам ботулинического нейротоксина (BoNT) и может быть использовано в медицине и косметологии. Изобретение раскрывает химерный связывающий домен тяжелой цепи (H_C/TAB) BoNT, который был адаптирован для обеспечения синергетического связывания рецептора SV2C, рецептора синаптотагмина и рецептора ганглиозида, а также обладает улучшенными продолжительностью действия и эффективностью в сравнении с нативным аналогом. Изобретение может быть использовано в конструировании полипептидов и иных гибридных молекул с целью их последующего применения в качестве местного мышечного релаксанта при терапии заболеваний, ассоциированных с нежелательной активностью нейронов, а также вызванных гипертонусом мыщц или спазмами. 7 н. и 25 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл.

1. Связывающий домен тяжелой цепи (H_C/TAB) ботулинического нейротоксина (BoNT), имеющий N-концевую область (H_CN) и С-концевую область (H_CC), в котором H_C/TAB включает:

a) сайт связывания рецептора синаптотагмина (Syt), и

b) сайт связывания рецептора синаптических везикул 2 (SV2), и

c) сайт связывания ганглиозидного (Gang) рецептора,

где H_C/TAB содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO:1,

и где указанный H_C/TAB синергетически связывается с рецептором синаптотагмина (Syt), рецептором синаптических везикул 2 (SV2) и ганглиозидным (Gang) рецептором.

2. H_C/TAB по п. 1, в котором последовательности, формирующие сайт связывания Gang-рецепторов, происходят из любого связывающего рецептор Gang серотипа BoNT и их подтипов.

3. H_C/TAB по любому из пп. 1 или 2, в котором последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, происходят из любого связывающего рецептор Syt серотипа BoNT и их подтипов.

4. H_C/TAB по любому из пп. 1-3, в котором последовательности, формирующие сайт, связывающий рецептор SV2, происходят из любого связывающего рецептор SV2 серотипа BoNT и их подтипов.

5. H_C/TAB по любому из пп. 1-4, в котором последовательность H_CN происходит из любого связывающего рецептор SV2 серотипа BoNT и их подтипов.

6. H_C/TAB по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что домен H_CC состоит взаимозаменяемо из последовательностей из серотипа A BoNT (BoNT/A) и серотипа B BoNT (BoNT/B).

7. H_C/TAB по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная концевая область H_CC составлена в соответствии с последовательностью A₁B₁A₂B₂A₃, в которой A обозначает последовательность из BoNT/A, а B обозначает последовательность из BoNT/B.

8. H_C/TAB по п. 7, в котором последовательности B₁, A₂ и B₂ включают мутации и/или делеции для создания стабильных внутримолекулярных поверхностей контакта для всего H_C/TAB.

9. H_C/TAB по любому из пп. 1-8, в котором последовательности, формирующие сайт связывания Gang-рецептора, происходят из BoNT/B.

10. H_C/TAB по любому из пп. 7 или 8, в котором последовательности, формирующие сайт связывания Gang-рецептора, локализованы в B₂.

11. H_C/TAB по любому из пп. 1-10, в котором последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, происходят из BoNT B, DC или G.

12. H_C/TAB по любому из пп. 7, 8 или 10, в котором последовательности, формирующие сайт связывания рецептора Syt, локализованы в B₁ и B₂.

13. H_C/TAB по любому из пп. 1-12, в котором последовательность H_CN происходит из BoNT/A.

14. H_C/TAB по любому из пп. 7, 8, 10 или 12, в котором последовательности, формирующие сайт связывания рецептора SV2, локализованы в H_CN и в A₁ и A₃ в H_CC.

15. H_C/TAB по любому из пп. 1-14, имеющий аминокислотную последовательность, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1.

16. Полипептид для использования в лечении для ослабления и/или инактивации мышц, включающий H_C/TAB по любому из пп. 1-15, связанный с любым одним или несколькими другими белками, полипептидами, аминокислотными последовательностями или флуоресцентным зондом, непосредственно или через линкер, где указанный флуоресцентный зонд представляет собой белковую метку.

17. Полипептид по п. 16, в котором указанный полипептид представляет собой полипептид BoNT (BoNT/TAB), отличающийся тем, что указанный BoNT/TAB в дополнение к H_C/TAB включает домен транслокации тяжелой цепи (H_N), легкую цепь (LC) и сайт расщепления протеазой, расположенный между LC и H_N в последовательности полипептида, в котором H_N и LC соответственно и независимо друг от друга происходят из любого из серотипов BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G или X и их подтипов.

18. Полипептид по п. 17, дополнительно включающий любой другой белок, полипептид, аминокислотную последовательность или флуоресцентный зонд, связанный с ним напрямую или через линкер.

19. Полипептид по любому из пп. 17 или 18, в котором сайт расщепления протеазой представляет собой сайт расщепления экзопротеазой.

20. Полипептид по любому из пп. 16-19, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична любой последовательности из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.

21. Вектор экспрессии, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую H_C/TAB по любому из пп. 1-14 или полипептид по любому из пп. 16-20.

22. Вектор экспрессии по п. 21, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична любой последовательности из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.

23. H_C/TAB по любому из пп. 1-15, подходящий для использования в терапевтическом способе или в косметическом способе.

24. H_C/TAB или полипептид по п. 23, в котором терапевтический способ или косметический способ представляет собой лечение для ослабления и/или инактивации мышц.

25. H_C/TAB по п. 23 или 24 или полипептид по любому из пп. 16-20, предназначенные для лечения и/или профилактики расстройства, выбранного из группы, включающей нервно-мышечные расстройства и спастические мышечные расстройства.

26. H_C/TAB или полипептид по любому из пп. 23-25, предназначенные для лечения расстройства, где расстройство выбирают из группы, включающей спастическую дисфонию, спастическую кривошею, дистонию гортани, оромандибулярную дистонию, лингвальную дистонию, цервикальную дистонию, фокальную дистонию кистей, блефароспазм, косоглазие, гемифациальный спазм, расстройство движения век, церебральный паралич, фокальную спастичность, спастический колит, нейрогенный мочевой пузырь, анизмус, спастичность конечностей, тики, тремор, бруксизм, анальную трещину, ахалазию, дисфагию и другие расстройства мышечного тонуса, и другие расстройства, характеризующиеся непроизвольными движениями мышечных групп, слезоточивость, повышенное потоотделение, чрезмерное слюноотделение, боли от мышечных спазмов, головную боль.

27. Полипептид, содержащий H_C/TAB по любому из пп. 1-15, связанный с любым одним или несколькими другими белками, полипептидами, аминокислотными последовательностями или флуоресцентным зондом, непосредственно или через линкер, где указанный флуоресцентный зонд представляет собой белковую метку, где указанный полипептид подходит для использования в фармакологическом тесте для исследования роли указанных белков, полипептидов, аминокислотных последовательностей или флуоресцентного зонда в синаптическом процессе.

28. H_C/TAB по любому из пп. 1-15, который представляет собой носитель для эффективной транспортировки к поверхности нейрона любого связанного с ним белка, полипептида, аминокислотной последовательности или флуоресцентного зонда.

29. BoNT/TAB по любому из пп. 17-20, который представляет собой носитель для эффективной транспортировки любого белка, полипептида, аминокислотной последовательности или флуоресцентного зонда в цитозоль нейрона с помощью системы транслокации токсина.

30. Фармацевтическая или косметическая композиция, подходящая для применения в синергетическом связывании рецептора синаптотагмина (Syt), рецептора синаптических везикул 2 (SV2) и ганглиозидного (Gang) рецептора, включающая:

(a) H_C/TAB по любому из пп. 1-15 или полипептид по любому из пп. 16-20, а также

(b) фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, носители или другие добавки.

31. Набор компонентов для терапевтического введения фармацевтической композиции по п. 30, включающий указанную композицию и инструкции по терапевтическому введению композиции.

32. Способ лечения состояния, связанного с нежелательной нейрональной активностью, включающий введение терапевтически эффективного количества H_C/TAB по любому из пп. 1-14.