НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕОСФЕРИДА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ЭТИХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2021 года по МПК C07D491/52 A61K31/407 A61K31/4523 A61K31/5377 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики. А именно к новым производным феосферида – биологически активным веществам, которые обладают противоопухолевой активностью, а также способу получения и применению новых производных феосферида.

Рак – серьезное и опасное заболевание, которое является медико-социальной проблемой во всем мире. По данным статистики, онкология является одной из основных причин смерти в мире: процент смертности от рака составляет 20%.

По прогнозам ВОЗ (Всемирной Организации Здравоохранения), за 20 лет показатели смертности и заболеваемости от рака увеличатся в 2 раза: число новых случаев заболевания вырастет с 10 млн. до 20 млн., а летальность с 6 млн. до 12 млн. Ежегодно в мире регистрируется более 10 миллионов новых случаев заболевания раком и более 6 миллионов случаев смертности от раковых заболеваний.

Классическими средствами для лечения рака являются цитостатические химиотерапевтические препараты, мишенями которых являются нуклеиновые кислоты и сигнальные пути, регулирующие клеточную пролиферацию. Эффективность традиционных методов лечения (хирургического, химио- и лучевой терапии) в последние годы не увеличивается, что обуславливает поиск новых подходов.

Приоритетным направлением является поиск таргетных средств лечения рака. Объединяемые общим принципом молекулярно-нацеленного воздействия, таргетные препараты имеют основными мишенями тканеспецифические гормоны и их рецепторы, факторы роста сосудов, белки сигнальной трансдукции, регуляторы клеточного цикла, различные киназы.

Таким образом, существует острая необходимость в создании новых средств лечения онкологических заболеваний, в том числе, обладающих высокой противоопухолевой активностью, но в то же время, характеризующихся низкой степенью токсичности.

Также в практику лечения опухолевых заболеваний уже давно вошли препараты растительного и природного происхождения. Указанные препараты имеют различную химическую структуру, сходные механизмы действия, но различаются спектром противоопухолевой активности и особенно побочными эффектами. Некоторые подобные препараты имеют уникальный механизм действия, отличный от известных цитотоксических растительных алкалоидов. Как правило, данная группа соединений проявляет сравнительно низкую токсичность.

Известно, что некоторые метаболиты природных грибов проявляют противораковую активность. Так, например, многие микромицеты способны продуцировать соединения с противоопухолевой активностью (научные публикации Tsuruo et al., 1985 ; Strobel, 2003; Rai et al., 2009; Kharwar et al., 2011; Evidente et al., 2013; Kornienko et al., 2015).

Одно из них - феосферид А (англ. Phaeosphaeride A) – соединение, обладающее противоопухолевой активностью, селективно ингибируя активность одного из транскрипционных факторов – белка STAT3. (Phaeosphaeride A, an Inhibitor of STAT3-Dependent Signaling Isolated from an Endophytic Fungus, Katherine N. Maloney, Wenshan Hao, Jun Xu, Jay Gibbons, John Hucul, Deborah Roll, Sean F. Brady, Frank C. Schroeder, and Jon Clardy, 2006).

Структура природного феосферида А

Феосферид А - природное вещество бициклического строения, рассматривается как платформа для создания новых противоопухолевых препаратов (1. M. K. Maloney, W. Hao, J. Xu, J. Gibbons, J. Hucul, D. Roll, S. F. Brady, F. C. Schroeder, J. Clardy, Org. Lett., 2006; 2. V. V. Abzianidze, D. S. Prokofieva, L. A. Chisty, K. P. Bolshakova, A. O. Berestetskiy, T. L. Panikorovskii, A. S. Bogachenkov and A. A. Holder, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015).

Природный феосферид А, обладающий гербицидной и противоопухолевой активностью, был впервые выделен в 2006 году из экстрактов эндофитного гриба Phaeosphaeria avenaria 39 [Maloney, et al., 2006].

Феосферид А был выделен также из эндофитного гриба cf Paraphoma sp №19 научной группой А.О. Берестецкого (ВИЗР, Санкт-Петербург). Патент № 2596928 ШТАММ Paraphoma sp. – ПРОДУЦЕНТ ФЕОСФЕРИДА (Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений", авторы: Берестецкий Александр Олегович, Полуэктова Екатерина Викторовна, Сокорнова Софья Валерьевна, Токарев Юрий Сергеевич, заявка № 2015140209/10, 21.09.2015).

Также, данное соединение было получено синтетически (Synthesis of the proposed structure of phaeosphaeride A, Kenichi Kobayashi, Iwao Okamoto, Nobuyoshi Morita, Tamiko Kiyotani and Osamu Tamura, 2011).

В 2015 году с помощью метода рентгеновской кристаллографии была установлена молекулярная структура природного феосферида А (Crystal structure of natural phaeosphaerideA (Victoria V. Abzianidze, Ekaterina V. Poluektova, Ksenia P. Bolshakova, Taras L. Panikorovskii, Alexander S. Bogachenkov and Alexander O. Berestetskiy, 2015), что позволило значительно ускорить изучение активности данного соединения и открыть путь к его дальнейшей дериватизации.

Феосферид A обладает бициклической структурой с тремя смежными стереоцентрами в своем дигидропирановом кольце. Известен также стереоизомер феосферида A – соединение феосферид В. Но, по данным (1. M. K. Maloney, W. Hao, J. Xu, J. Gibbons, J. Hucul, D. Roll, S. F. Brady, F. C. Schroeder, J. Clardy, Org. Lett., 2006, 2. Establishment of Relative and Absolute Configurations of Phaeosphaeride A: Total Synthesis of ent-Phaeosphaeride A, Kenichi Kobayashi, Yukiko Kobayashi, Misato Nakamura, Osamu Tamura, and Hiroshi Kogen), он не проявляет свойства биологически активного соединения.

STAT3 - сигнальный белок и активатор транскрипции из семейства белков STAT, вносит свой вклад в онкогенез, поэтому он привлекает большой интерес в качестве мишени для противораковых препаратов. Регулирует пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток. Не активированный STAT3 обычно локализуется в цитоплазме. После фосфорилирования Янус-киназой (JAK), STAT3 димеризуется, транслируется в ядро, далее, с участием других белковых факторов индуцирует транскрипцию тех генов, которые должны индуцироваться данным цитокином. Нетипичная активация STAT3 часто встречается в различных типах опухолевых клеток, что приводит к резистентности к апоптозу и пролиферации опухолевых клеток посредством повышенной экспрессии генов, кодирующих белки, такие как Bcl-2, Bcl-xL и cyclin D1.

Исследования показывают, что различные ингибиторы STAT3, включая синтетические малые молекулы и натуральные продукты, оцениваются, как перспективные противоопухолевые химиотерапевтические агенты.

В работе (Phaeosphaeride A, an Inhibitor of STAT3-Dependent Signaling Isolated from an Endophytic Fungus, Katherine N. Maloney, Wenshan Hao, Jun Xu, Jay Gibbons, John Hucul, Deborah Roll, Sean F. Brady, Frank C. Schroeder, and Jon Clardy, 2006) было показано, что феосферид А обладает противоопухолевой активностью, селективно ингибируя активность белка STAT3 в концентрации IC₅₀ = 6,1×10^-4 М.

Многообещающая биологическая активность phaeosphaeride A, а также уникальная молекулярная структура привлекают большое внимание со стороны синтетического сообщества. Кроме того, исследования структуры-активности (SAR), ингибирующей активности STAT3 имеют важное значение для потенциальной противораковой терапии.

Дальнейшее исследование и изучение вещества – природного феосферида А показало, что наиболее перспективной может быть дериватизация данного соединения с получением новых веществ, обладающих более выраженной противоопухолевой, противораковой активностью, и более низкой токсичностью (Synthesis of natural phaeosphaeride A and semi-natural phaeosphaeride B derivatives, Victoria V. Abzianidze; Ksenia P. Efimova; Ekaterina V. Poluektova; Yuri G. Trishin; Victor A. Kuznetsov, 2017).

Таким образом, существует потребность в исследованиях метаболитов грибов и синтезе новых веществ на их основе, а также, разработке новых фармацевтических препаратов данных веществ с противоопухолевыми свойствами.

Поставленная задача решается получением новых соединений – производных феосферида с выраженными противоопухолевыми свойствами.

Новые производные феосферида, общей формулы I:

где R = R₁-N–R₂, где R_1, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой группу (СН₂)_n, где n=1-6_, в которой один или несколько атомов водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы:

С_1-6 алкил, гидрокси, гидроксиалкил, бензил, винил, аллил, морфолино, пиперидино, пирролидино, гидроксипиперидино, диметиламино, диэтиламино,

или R = О-R_2, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой группу (СН₂)_n, где n=1-6_, в которой один или несколько атомов водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: С_1-6 алкил, гидрокси, гидроксиалкил, бензил, винил, аллил, морфолино, пиперидино, пирролидино, гидроксипиперидино, диметиламино, диэтиламино

или R = S-R_2, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой группу (СН₂)_n, где n=1-6_, в которой один или несколько атомов водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: С_1-6 алкил, гидрокси, гидроксиалкил, бензил, винил, аллил, морфолино, пиперидино, пирролидино, гидроксипиперидино, диметиламино, диэтиламино

или R - представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: морфолин, пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, а также любой из этих аминов, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен алкильной группой, гидроксиалканом, пирролидином, морфолином, пипередином, гидроксипиперидином.

Изобретение также относится к способу получения производных феосферида А.

Ранее были предприняты попытки получить производные соединения феосферида А путем взаимодействия феосферида А с хлорацетоксипроизводным (Synthesis of natural phaeosphaeride A and semi-natural phaeosphaeride B derivatives, Victoria V. Abzianidze; Ksenia P. Efimova; Ekaterina V. Poluektova; Yuri G. Trishin; Victor A. Kuznetsov, 2017). Недостатком указанного способа является очень низкий выход соединений.

Производные феосферида А по изобретению получают путем взаимодействия феосферида А или феосферида В в присутствии сульфохлоридов с соединениями, выбранными из группы: первичные амины, вторичные амины, циклические амины, спирты, тиолы.

Указанные сульфохлориды в способе по изобретению представляют собой соединения общей формулы R₃SO₂Cl, где R₃ – метил, бензил, толил, трифлил группы. В частности, могут представлять собой следующие соединения: метансульфохлорид, трифторметансульфохлорид, бензолсульфохлрид, толуолсульфохлорид.

Первичные амины, вторичные амины, циклические амины, спирты, тиолы в способе по изобретению представляют собой соединения общей формулы R₁-N-R₂, R₁-О-R_{2 ,} R₁-S-R_{2 ,} где где R_1, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой группу (СН₂)_n, где n=1-6_, в которой один или несколько атомов водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: С_1-6 алкил, гидрокси, гидроксиалкил, бензил, винил, аллил, морфолино, пиперидино, пирролидино, гидроксипиперидино, диметиламино, диэтиламино, а циклический амин представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: морфолин, пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, а также любой из этих аминов, в структуре которого один из атомов водорода может быть замещен алкильной группой, гидроксиалканом, пирролидином, морфолином, пиперидином, гидроксипиперидином.

Процесс получения новых производных феосферида А происходит с образованием промежуточного сульфопроизводного феосферида А или феосферида В, формулы II и III соответственно:

с последующим их взаимодействием с соединениями, представляющие собой первичные амины, вторичные амины, циклические амины, спирты, тиолы.

Процесс получения новых соединений по изобретению может быть проведен в присутствии органических растворителей и/или катализаторов. В качестве органических растворителей могут быть использованы дихлорметан, тетрагидрофуран, ацетонитрил, толуол, бензол, диметилформамид или их смеси. В качестве катализаторов - триэтиламин, триметиламин, диизопропилэтиламин, карбонат калия, карбонат натрия, карбонат цезия. Процесс проводят при комнатной, пониженной или повышенной температуре от 0°С до 80°С.

После окончания реакции выделение конечного продукта из реакционной смеси может быть осуществлено с помощью традиционных методов органического синтеза, выбираемых в зависимости от состава смеси - отгонкой растворителя, перекристаллизацией, переосаждением, хроматографией и т.п. Также могут применятся промывка, сушка, упаривание и т.п.

В ходе фармакобиологических исследований было показано, что новые производные феосферида А обладают выраженным цитотоксическим эффектом, что свидетельствует о перспективности применения данных соединений в качестве противоопухолевых средств, в частности в противораковой терапии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Получение (2S,3S,4S)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-5-оксо-2-пентил-2,3,4,5,6,7-гексагидропирано[2,3-c]пиррол-4-ил метансульфоната (сульфопроизводное феосферида A, А)

РРА (0.084 ммоль, 1 экв) растворяли в хлористом метилене (2 мл). Смесь охлаждали на ледяной бане, перемешивали 25 минут. Затем добавляли по каплям триэтиламин (0.294 ммоль, 3.5 экв) и метансульфонилхлорид (0.21 ммоль, 2.5 экв) по каплям. Реакционную массу перемешивали в течение часа. Остаток растворяли в хлористом метилене (20 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (20 мл) и насыщенным раствором NaCl (20 мл). Органический слой сушили над Mg₂SO₄ и упаривали на роторном испарителе при 32°С. С помощью масс – хроматографии фиксировали молекулярный ион [M+H]⁺ c массой 375.95, который соответствует мезилпроизводному феосферида А с молекулярной формулой С₁₆H₂₅NO₇S₂. Получали желтое масло, 31 мг (98%).

Пример 2.

Получение(2S,3R,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-4-(метиламино)-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 1)

Метиламин гидрохлорид (0.37 ммоль, 2 eq) и триэтиламин (0.37 ммоль, 2 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.18 ммоль, 1 eq) в ацетонитриле (5 мл) с добавлением 3 каплей воды, и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре 48 часов. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-60), получали желтое масло, 9 мг (17%). Ms [M+H⁺]: 311.02.

Пример 3.

Получение (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-[(2-гидроксиэтил)амино]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 2)

2-Аминоэтанол (0.19 ммоль, 2 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.094 ммоль,1 eq) в сухом ацетонитриле (5 мл) и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре 48 часов. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-40), получали желтое масло, 8 мг (25%). Ms [M+H⁺]: 341.01.

Пример 4.

Получение (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-[(4-гидроксибутил)амино]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 3)

4-Амино-1-бутанол (0.27 ммоль, 2 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.13 ммоль,1 eq) в сухом ацетонитриле (5 мл)и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре 48 часов. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-30), получали желтое масло, 10 мг (20%). Ms [M+H⁺]: 369.05.

Пример 5.

Получение (2S,3R,4R)-4-(аллиламино)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 4)

Аллиламин (0.34 ммоль, 2 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.17 ммоль,1 eq) в сухом ацетонитриле (5 мл)и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре 48 часов. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-60), получали желтое масло, 8 мг (14%). Ms [M+H⁺]: 337.03.

Пример 6.

Получение (2S,3R,4R)-4-(бензиламино)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 5)

Бензиламин (0.36 ммоль, 2 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.17 ммоль,1 eq) в сухом ацетонитриле (5 мл)и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре 24 часа. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-60), получали желтое масло, 11 мг (17%). Ms [M+H⁺]: 387.01.

Пример 7.

Получение (2S,3R,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 6)

4-(1-Пирролидинил)пиперидин (0.39 ммоль, 2eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.20 ммоль, 1 eq) в абсолютном ацетонитриле (5 мл) и реакционная смесь перемешилась при комнатной температуре 24 часа. К смеси добавляли 20 мл насыщенного раствора NaHCO₃. Полученную смесь три раза экстрагировали EtOAc (20 мл). Органические экстракты сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-10), получали желтое масло, 9 мг (11%). Ms [M+H⁺]: 434.12.

Пример 8.

Получение (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 7)

4-Гидроксипиперидин (0.25 ммоль, 1.5 eq) и триэтиламин (0.51 ммоль, 3 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.17 ммоль, 1 eq) в абсолютном ацетонитриле (5 мл) и реакционная смесь перемешилась при комнатной температуре 48 часов. К смеси добавляли 20 мл насыщенного раствора NaHCO₃. Полученную смесь три раза экстрагировали EtOAc (20 мл). Органические экстракты сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-50), получали желтое масло, 10 мг (16%). Ms [M+H⁺]: 381.05.

Пример 9.

Получение (2S,3R,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-пирролидин-1-ил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 8)

Пирролидин (0.12 ммоль, 1.5 eq) и триэтиламин (0.25 ммоль, 3 eq) добавили к раствору сульфопроизводного РРА (0.084 ммоль, 1 eq) в абсолютном ацетонитриле (5 мл) и реакционная смесь перемешилась при комнатной температуре 48 часов. К смеси добавляли 20 мл насыщенного раствора NaHCO₃. Полученную смесь три раза экстрагировали EtOAc (20 мл). Органические экстракты сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-60), получали желтое масло, 8 мг (27%). Ms [M+H⁺]: 351.04.

Пример 10.

Получение (2S,3S,4R)-3-гидрокси-4-[(2-гидроксиэтил)тио]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 9)

К суспензии 2-меркаптоэтанола (0.11 ммоль, 1.1 eq) и K₂CO₃ (0.20 ммоль, 2 eq) в ацетонитриле (2 мл) при 0°С добавляли по каплям раствор сульфопроизводного РРА (0.10 ммоль, 1 eq) в ацетонитриле (1 мл). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 72 ч. Затем смесь гидролизовали ледяной водой (20 мл) и экстрагировали диэтиловым эфиром (2×30 мл). Объединенные экстракты сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-50), получали желтое масло, 7.2 мг (20%). Ms [M+H⁺]: 357.95.

Пример 11.

Получение (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-4-(2-морфолин-4-илэтокси)-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 10)

К суспензии сульфопроизводного РРА (0.18 ммоль, 1 eq) в безводном тетрагидрофуране (2 мл) добавляли 2-морфолиноэтанол (0.90 ммоль, 5 eq) и смесь перемешивали в закрытой колбе при 70°С в течение 48 ч. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (15 мл), насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-10), получали желтое масло, 10 мг (14%). Ms [M+H⁺]: 411.16.

Пример 12.

Получение (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(3-пиперидин-1-илпропокси)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 11)

К суспензии сульфопроизводного РРА (0.18 ммоль, 1 eq) в безводном тетрагидрофуране (2 мл) добавляли 3-пиперидино-1-пропанол (0.90 ммоль, 5 eq) и смесь перемешивали в закрытой колбе при 70°С в течение 48 ч. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (15 мл), насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-10), получали желтое масло, 12 мг (16%). Ms [M+H+]: 423.20.

Пример 13.

Получение (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(3-пирролидин-1-илпропокси)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-она (соединение 12)

К суспензии сульфопроизводного РРА (0.18 ммоль, 1 eq) в безводном тетрагидрофуране (2 мл) добавляли 3-пирролидино-1-пропанол (0.90 ммоль, 5 eq) и смесь перемешивали в закрытой колбе при 70°С в течение 48 ч. Смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в EtOAc (20 мл), промывали насыщенным раствором NaHCO₃ (15 мл), насыщенным раствором NaCl (15 мл). Органический экстракт сушили над MgSO₄ и затем концентрировали в вакууме. Очищали колоночной хроматографией (элюирование смесью метанол/дихлорметан 1-10), получали желтое масло, 10 мг (14%). Ms [M+H+]: 409.22.

Пример 14.

Изучение цитотоксичности соединений 1-8.

Цитотоксичность продуктов была изучена на клеточных линиях MCF-7 (рак молочной железы), PC-3 (аденокарцинома простаты), HCT-116 (рак толстой кишки), A549 (рак легких), K562 (хронический миелолейкоз), THP -1 (острый моноцитарный лейкоз), NCI-H929 и RPMI8226 (множественная миелома) Jurkat (Т-клеточный лимфобластный лейкоз). В качестве контроля использовали эмбриональные фибробласты человека (ФЭЧ).

Культивирование осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для клеток MCF-7, А594 и ФЭЧ использовали среду DMEM, остальные клетки культивировали в среде RPMI 1640 в присутствии 10% эмбриональной бычьей сыворотки и гентамицина в концентрации 40 мг/мл.

Цитотоксический эффект оценивали с использованием стандартного МТТ-теста, рассчитывая долю жизнеспособных клеток по результатам колориметрического определения продукта восстановления МТТ (формазана).

Концентрацию исследуемого продукта, обеспечивающую 50%-ный цитотоксический эффект относительно контроля (IC50) вычисляли с использованием «Программы для расчета IC50 химиотерапевтических веществ» по результатам анализа жизнеспособности клеток в присутствии исследуемых веществ в 10 концентрациях (от 2*10^-7 до 1*10^-4М). Каждая концентрация анализировалась в 3-4 повторах.

В процессе исследования цитотоксичности соединений общей формулы I и веществом сравнения (этопозид) были получены результаты, приведенные в таблице.

Таблица 1

Соединение Адгезивные культуры клеток, IC50(мкМ) HCT-116 PC3 MCF-7 A549 ФЭЧ РРА 44 32 20 41 19 1 4,0 4,8 4,6 13 22 2 4,6 4,5 3,9 15 16 3 4,9 5,6 5,3 11 15 4 8,4 6,3 4,1 13 5 5 13 25 36 38 53 6 4,3 3,2 2,3 12 22 7 2,6 4,3 3,5 9,4 6,7 8 0,47 0,2 4,8 10 4 Этопозид 22 2,7 9,6 >100 >100

Соединение Суспензионные культуры клеток, IC50(мкМ) К562 NCI-Н929 Jurkat THP-1 RPMI8226 РРА 20 6,5 10 19 9,6 1 1,9 0,56 1,9 2,4 3,2 2 17 2,3 17 1,9 2,8 3 3,8 2,1 1,9 2,2, 2,5 4 10 2,3 3,2 3,3 6,0 5 14 7,7 10 15 16 6 6,4 3,2 1 4,9 10 7 3,2 1,9 1,8 1,9 1,6 8 0,54 0,2 0,75 2,2 0,25 Этопозид 4,5 0,9 1,4 1,0 4,8

Из таблицы видно, что производные PPA обладают сравнимым с этопозидом, а в ряде случаев более выраженным цитотоксическим эффектом. Так, для вещества 8 IC50 в отношении клеточных линий множественной миеломы (RPMI8226 и NCI-H929) в несколько раз ниже, чем для этопозида.

Пример 15.

Исследование острой токсичности при внутрибрюшинном введении 8 выполнено на белых беспородных мышах массой 16-20 г. В каждую группу исследования включали по 10 животных. Стоковый раствор 8 готовили с использованием ДМСО, затем разбавляли забуференным фосфатом физиологическим раствором до концентрации, обеспечивающей введение требуемой дозы препарата в объеме, не превышающем 0,1 мл. Конечная концентрация ДМСО в растворе для введения - 5%. Диапазон доз, использованный в исследовании составил от 8,25 до 200 мг/кг. Выживаемость и проявления токсических эффектов регистрировали в течение 14 суток после однократного внутрибрюшинного введения препарата. Животные в контрольной группе получали растворитель, содержащий 5% ДМСО. По результатам исследования показано, что значение LD50 превышает 200 мг/кг. Для внутрибрюшинного введения - полученное значение соответствует 3-му классу опасности (умеренно опасные вещества). Острая токсичность 8 сравнима с токсичностью этопозида (LD50 для этопозида (RTECS # KC0190000) при внутрибрюшинном введении равна 64 мг/кг).

Изобретение относится к производным феосферида, общей формулы I, где R = NR₁R₂, где R₁, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой метил, этил, бутил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: гидрокси, фенил, винил, или R = О-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, пропил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: морфолино, пиперидино, пирролидино, или R = S-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, в котором один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из гидрокси, или R – представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: гидроксипиперидин, а также пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен пирролидином. Изобретение также относится к способу получения производных формулы I. Технический результат – получены новые соединения, которые могут найти применение в медицине в качестве противоопухолевых средств. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 15 пр.

I

1. Производные феосферида, общей формулы I

где R = NR₁R₂, где R₁, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой метил, этил, бутил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: гидрокси, фенил, винил, или

R = О-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, пропил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: морфолино, пиперидино, пирролидино, или

R = S-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, в котором один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из гидрокси, или

R - представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: гидроксипиперидин, а также пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен пирролидином.

2. Соединения по п. 1, которые, в частности, являются:

- (2S,3R,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-4-(метиламино)-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-[(2-гидроксиэтил)амино]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-[(4-гидроксибутил)амино]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-4-(аллиламино)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-4-(бензиламино)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3R,4R)-3-гидрокси-4-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3S,4R)-3-гидрокси-4-[(2-гидроксиэтил)тио]-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-4-(2-морфолин-4-илэтокси)-2-пентил-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(3-пиперидин-1-илпропокси)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном;

- (2S,3S,4R)-3-гидрокси-6-метокси-3-метил-7-метилен-2-пентил-4-(3-пирролидин-1-илпропокси)-3,4,6,7-тетрагидропирано[2,3-c]пиррол-5(2H)-оном.

3. Способ получения производных феосферида общей формулы I

,

где R = NR₁R₂, где R₁, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой метил, этил, бутил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: гидрокси, фенил, винил, или

R = О-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, пропил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: морфолино, пиперидино, пирролидино, или R = S-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, в которой один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из гидрокси, или

R - представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: пирролидин, гидроксипиперидин, а также пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен пирролидином, путем взаимодействия феосферида А или феосферида В в присутствии по меньшей мере одного сульфохлорида общей формулы R₃SO₂Cl, где R₃ – метил, бензил, толил, трифторметил группы с соединениями, выбранными из группы: первичные амины, вторичные амины, циклические амины, спирты, тиолы, которые представляют собой соответственно соединения общей формулы R₁-N-R₂, R₁-О-R₂ , R₁-S-R₂ , где R₁, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой метил, этил, бутил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: гидрокси, фенил, винил, или AlK представляет собой этил, пропил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: морфолино, пиперидино, пирролидино, или AlK представляет собой этил, в которой один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из гидрокси, а циклический амин представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: пирролидин, гидроксипиперидин, а также пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен пирролидином, в присутствии по меньшей мере одного катализатора, выбранного из группы: триэтиламин, триметиламин, диизопропилэтиламин, карбонат калия, карбонат натрия, карбонат цезия, в присутствии по меньшей мере одного органического растворителя, выбранного из группы: дихлорметан, тетрагидрофуран, ацетонитрил, толуол, бензол, диметилформамид, и температуре от 0°С до 80°С.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при взаимодействии феосферида А или феосферида В в присутствии сульфохлорида происходит образование промежуточного сульфопроизводного феосферида А или феосферида В, с последующим его взаимодействием с соединениями, выбранными из группы: первичные амины, вторичные амины, циклические амины, спирты, тиолы, которые представляют собой соответственно соединения, как указано в п. 3.

5. Способ по пп. 3, 4, где в качестве сульфохлоридов выбирают следующие соединения: метансульфохлорид, трифторметансульфохлорид, бензолсульфохлорид, толуолсульфохлорид.

6. Применение производных феосферида общей формулы I

где R = NR₁R₂, где R₁, R₂ либо одинаковые, либо независимо выбраны из группы: водород, AlK, где AlK представляет собой метил, этил, бутил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: гидрокси, фенил, винил, или

R = О-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, пропил, в которых один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из группы: морфолино, пиперидино, пирролидино, или

R = S-R₂, где R₂ представляет собой AlK, где AlK представляет собой этил, в которой один атом водорода необязательно может быть замещен радикалом, выбранным из гидрокси, или

R - представляет собой циклический насыщенный амин, выбранный из группы: пирролидин, гидроксипиперидин, а также пиперидин, пирролидин, гидроксипиперидин, в структуре которого, по меньшей мере, один из атомов водорода замещен пирролидином, в качестве противоопухолевых средств.