Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата Российский патент 2021 года по МПК C07K14/495 C07K19/00 C07K1/22 C12P21/02 A61K38/18 A61P21/00 

Группа изобретений относится к генной инженерии, биотехнологии и ветеринарии, а конкретно к рекомбинантному дифференцировочный фактор роста 11, способу его получения, иммуногенной композиции, содержащей в качестве антигена GDF11, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также метод использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы животных.

Уровень техники

Белок GDF11, дифференцировочный фактор роста 11 (growth differentiation factor-11), относится к суперсемейству TGF-β трансформирующего фактора роста β (transforming growth factor-β). GDF11 представляет собой белок гомологичный миостатину, который действует как ингибитор роста различных тканей. GDF11 может связываться с теми же рецепторами суперсемейства TGF-бета типа I ACVR1B (ALK4), TGFBR1 (ALK5) и ACVR1C (ALK7) что и миостатин, но преимущественно использует ALK4 и ALK5 для передачи сигнала (Andersson O, Reissmann E, Ibáñez CF 2006 EMBO Reports. 7 (8): 831-7).

Из уровня техники известен патент США № 6096506, в котором раскрыто антитело, которое специфически реагирует с полипептидом миостатина. Также известен способ увеличения мышечной массы у животного путем введения моноклонального антитела против миотатина и блокирования его активности (патент США № 6468535) и способ получения слитого белка с последовательностью миостатина, способного в составе иммуногенной композиции индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину, блокировать его действие и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани (патент РФ № 2613420).

GDF11 тесно связан с миостатином, негативным регулятором роста мышц (McPherron AC, Lee SJ 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94(23):12457-61). Миостатин и GDF11 участвуют в регуляции пролиферации кардиомиоцитов. Сходство между GDF11 и миостатином подразумевают вероятность того, что используются одни и те же регулирующие механизмы, которые задействованы для регуляции размера ткани как мышечной, так костной и хрящевой. (Egerman MA et al. Cell Metab. 2015 22(1):164-74; Zimmers TA et al. 2017 Basic Res Cardiol. 112(4):48). Следовательно, блокирование активности GDF11 должно приводит к значительному увеличению мышечной массы организма.

Авторы настоящего изобретения получили неожиданный и воспроизводимый результат, демонстрирующий что слитный рекомбинантный белок с GDF11, иммуногенная композиции с этим белком и вакцинация может быть использована для увеличения мышечной массы организма.

Сущность изобретения

Техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного GDF11-содержащего белка, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении GDF11 как антигена, который может быть использован для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики и т.д.) и птицы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к GDF11, блокировании его действия и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани. Другая техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в разработке препарата на основе указанного белка и в создании способа использования этого препарата, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы при условии несистематического применения препарата. Следует отметить, что аминокислотная последовательность GDF11 идентична у всех млекопитающих животных и птиц. Вследствие этого разработанный препарат является универсальным средством для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

Технический результат, достигаемый при реализации заявляемой группы изобретений, заключается в расширении арсенала средств и методов, обеспечивающих повышение продуктивности скота и птицы.

Указанный технический результат достигается за счет рекомбинантного белка с молекулярной массой 35,9 кДа, включающего фрагмент белка фактора роста и дифференцировки 11 (GDF11) с последовательностью SEQ ID NO:1, Гли-Сер спейсер с последовательностью SEQ ID NO: 2, альфа-глюкансвязывающий домен (GBD) гена из Streptococcus mutans с последовательностью SEQ ID NO: 3 и последовательность нуклеотидов гена GDF11-GBD SEQ ID NO: 4.

Технический результат также достигается в способе получения рекомбинантного белка GDF11 (GDF11-GBD) на глюкане, который включает:

- выращивание клеток штамма E. сoli, экспрессирующих ген GDF11-GBD;

- связывание белка GDF11-GBD в составе клеточных экстрактов штамма E. coli BL21 [pGDF11-GBD] с глюкансодержащим (альфа-глюкансодержащем) сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;

- последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.

В качестве глюкансодержащего сорбента (глюкана, альфа-глюкана) могут использоваться: пуллулан, гликоген, декстран, крахмал.

Рекомбинантный белок GDF11-GBD включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена, определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на глюкане (альфа-глюкане, глюкансодержащем сорбенте). Иммобилизация на глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке глюкансвязывающего домена из альфа-глюкансвязывающего домена гена из Streptococcus mutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам и обеспечивает необратимое связывание с глюкансодержащим сорбентом в широком диапазоне значений pH 6,0 - 9,0 и концентраций соли 0 - 3 М NaCl.

Поскольку в клетках E. coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках E. coli рекомбинантный белок GDF11-GBD, является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа-глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на глюкансодержащем сорбенте.

Технический результат достигается также за счет инъекционного препарата для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, который содержит рекомбинантный белок GDF11-GBD, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из глюкансодержащего (альфа-глюкансодержащего) сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком адьюванте (носителе), а также за счет реализации метода повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы, который включает проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде из глюкансодержащего (альфа-глюканового) сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе, в дозе 0,5 - 50 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.

Таким образом, создан бифункциональный рекомбинантный белок GDF11-GBD, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к GDF11 при введении животным и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.

Получение рекомбинантного слитного белка GDF11 (GDF11-GBD)

На первом этапе осуществляют получение гена GDF11 с последующим его клонированием.

Ген GDF11 получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, оптимизированный для экспрессии в E.coli. Затем осуществляли получение плазмиды pGDF11-GBD, содержащей последовательности, кодирующие GDF11, cпейсер и глюкансвязывающий домен (GBD).

Получение штамма E. coli-продуцента рекомбинантного антигена GDF-11, соединенного с глюкансвязыващим доменом

Для получения штамма E. coli-продуцента рекомбинантного белка GDF11-GBD клетки E. coli BL21 трансформировали плазмидой pGDF11-GBD. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма E. coli BL21 [pGDF11-GBD] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка GDF11-GBD массе в 35,9 кДа. Уровень синтеза белков в E. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок GDF11-GBD синтезируется в клетках E.coli в нерастворимой форме в виде телец-включения.

Получение иммобилизованного на альфа-глюкане рекомбинантного белка (GDF11) GDF11-GBD

Для получения рекомбинантного белка клеточную культуру штамма E.coli BL21 [pGDF11-GBD] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500g в течение 15 минут.

Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000g нерастворимый белок GDF11-GBD оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8М мочевине, центрифугировали при 12000g 30 минут и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка GDF11-GBD на глюкансодержащем сорбенте супернатант разводили физиологическим фосфатным буфером с нейтральным рН в четыре раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана (пуллулана или гликогена или декстрана или крахмала), инкубировали при 25°C в течение 2 часов. Центрифугировали при частоте оборотов, равной 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза. Иммобилизованный на альфа-глюкане антиген GDF11-GBD представлял собой суспензию сорбента с адсорбированными на нем белком. Степень чистоты препарата составляла не менее 90 %. Консервацию препарата проводили добавляя бензиловый спирт до концентрации 0,1 %.

Биологическое действие рекомбинантного белков GDF11-GBD

В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит раствор рекомбинантного белка GDF-11-GBD в буфере с нейтральным рН, суспендированный в адъювантах: смеси раствора глюкана и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% на 50% по массе); MONTANIDE ISA 70 VG (30% на 70% по массе), 2, 3 или 6%-ной суспензии гидроокиси алюминия (от 5 до 30 % от общего объёма), либо в других коммерческих адъювантах, в соответствии с инструкцией производителя по их применению, и используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата однократно или дважды с межинъекционным интервалом 20 - 30 суток в дозе 0,5-150 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы. Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного GDF11 с помощью аутоантител.

Эффективность применения препарата для повышения мышечной массы тела у сельскохозяйственных животных иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела поросят

В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам породы крупная белая в возрасте 90-120 суток с массой тела 20 - 25 кг был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-глюкана (50% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% по массе) двукратно с интервалом 21 суток из расчета 0,10-150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Удельная доза реком-бинантно-го белка, мкг/кг Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг % привеса к контрольной группе через 30 суток Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг % привеса к контрольной группе через 90 суток 0,1 19,7 39,9 -0,3 92,9 -0,3 0,3 20,5 41,1 2,8 96,3 3,3 0,5 20,2 42,2 5,5 105,7 13,4 5,0 21,0 44,3 10,8 114,3 22,6 50 20,5 46,9 17,3 120 28,8 100 20,7 47,1 17,8 119,9 28,6 110 20,5 47,3 18,3 119,8 28,5 130 21,0 47,4 18,5 120,1 28,9 150 20,2 47,3 18,3 119,9 28,6 Контроль 21,0 40 - 93,2 -

Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 21 сутки) введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела поросят через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 13,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 28,8%; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 28,6%. Таким образом, при введении препарата в дозах, лежащих в диапазоне от 0,5 до 150 мкг/кг наблюдался значимый прирост массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.

Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела поросят.

Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.

В таблице 2 представлены уровни аутоантител к миостатину в сыворотках поросят после иммунизации препаратом, содержащим рекомбинантный белок GDF11-GBD (метод ИФА).

Таблица 2.

Результаты определения в ИФА уровня аутоантител к GDF11 в образцах сывороток поросят иммунизированных препаратом, содержащим рекомбинантный белок GDF11-GBD

2-кратная иммунизация с 21-суточным интервалом между иммунизациями Доза рекомбинантного белка GDF11-GBD на1кг
массы тела № поросенка Результаты ИФА сывороток поросят, полученных через n недель после иммунизации, ед/мл n = 1 n = 3 n = 7 0,3 мкг 1 4 000 73 000 95 000 2 4 000 76 000 93 000 3 5 000 73000 94 000 4 4 000 72 000 96 000 5 4 000 69 000 94 000 6 3 000 77000 96 000 Ср. значение 4 000 73 333 94 666 0,5 мкг 1 4 000 95 000 139 000 2 3 000 109 000 135 000 3 5 000 102 000 146 000 4 4 000 98 000 133 000 5 3 000 101 000 142 000 6 4 000 104 000 139 000 Ср. значение 3 833 101 500 139 000 5,0 мкг 1 4 000 185 000 257 000 2 3 000 207 000 304 000 3 5 000 169 000 256 000 4 4 000 178 000 267 000 5 3 000 196 000 289 000 6 4 000 201 000 273 000 Ср. значение 3 833 189 333 274 333 50 мкг 1 4 000 309 000 443 000 2 5 000 344 000 437 000 3 5 000 303 000 396 000 4 4 000 301 700 417 000 5 4 000 329 000 448 000 6 5000 333 000 407 000 Ср. значение 4 500 319 950 424 667 100 мкг 1 6 000 339 000 412 000 2 5 000 314 000 417 000 3 5 000 323 000 406 000 4 5 000 354 000 438 000 5 5 000 337 000 451 000 6 5 000 341 000 427 000 Ср. значение 5 167 334 667 425 167 150 мкг 1 3 000 329 000 423 000 2 5 000 327 000 414 000 3 4 000 331 000 413 000 4 5 000 348 000 429 000 5 5 000 347 000 448 000 6 4 000 339 000 437 000 Ср. значение 4 333 336 833 427 333

Из данных таблицы 1 и 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 0,5-150 мг/кг массы тела животного.

Пример 2. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела быков холмогорской породы

В условиях откормочного комплекса бычкам холмогорской породы в возрасте 3-х месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 206 VG (50% по массе) двукратно с интервалом 25 сутки из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно в область нижней трети шеи. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Удельная доза рекомбинан-тного белка, мкг/кг Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг % привеса к контроль-ной группе через 30 суток Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг % привеса к контрольной группе через 90 суток 0,1 91,8 114,1 0,8 176,4 0,1 0,3 91,1 115,9 2,4 182,5 3,6 0,5 90,9 119,5 5,6 187,5 6,4 5 90,3 120,5 6,4 201,1 14,1 50 91,4 122,1 7,9 214,7 21,9 100 91,2 122,4 8,1 215,1 22,1 110 90,9 122,9 8,6 214,9 22,0 130 91,5 123,1 8,7 215 22,0 150 90,2 123,2 8,8 215,1 22,1 Контроль 91,7 113,2 - 176,2 -

Из представленных данных видно, что двукратное (с интервалом 25 суток) введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела бычков через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 6,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 14,1%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 10,8%, при увеличении дозы в двое до 100 или 150 мкг/кг привесы увеличиваются на 22,1%.

Таким образом, при введении препарата в дозах, лежащих в диапазоне от 0,5 до 150 мкг/кг наблюдался значимый прирост массы тела поросят относительно величины прироста в контрольной группе.

Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела бычков.

Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела бычков относительно величины прироста в контрольной группе.

Пример 3. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела ягнят

Ягнятам романовской породы в возрасте 2 - 3 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и суспензии 3%-ной гидроокиси алюминия (15% по объему), двукратно с интервалом 30 суток из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Удельная доза реком-бинантно-го белка, мкг/кг Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 30 суток Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 90 суток 0,1 18,0 24,6 -0,8 37,1 1,1 0,3 18,2 25,1 1,2 38,2 4,1 0,5 18,1 26,3 6,0 40,9 11,4 5 17,8 27,9 12,5 42,8 16,6 50 17,9 29,2 17,7 45,1 22,9 100 18,2 28,9 16,5 45,2 23,2 110 17,9 29,1 17,3 45,0 22,6 130 18,0 29 16,9 45,1 22,9 150 17,6 29,3 18,1 45,3 23,4 Контроль 17,7 24,8 - 36,7 -

Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 30 суток) введение ягнятам романовской породы препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 11,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 16,6%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 22,9%; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 23,2%; при применении препарата в дозе 150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 23,4%.

Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела ягнят.

Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела ягнят относительно величины прироста в контрольной группе.

Пример 4. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела кроликов

Кроликам породы Белый великан в возрасте 2 - 3 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (50% по массе) и суспензии 3%-ной гидроокиси алюминия (10% по объему), двукратно с интервалом 28 суток из расчета 0,1 - 150 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Животным контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Удельная доза реком-бинантн-ого белка, мкг/кг Средняя масса тела животных, при первой инъекции препарата, кг Средняя масса тела животных через 30 суток после первой инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 30 суток Средняя масса тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 90 суток 0,1 1,66 2,49 0,4 3,44 0,3 0,3 1,70 2,51 1,2 3,49 1,7 0,5 1,59 2,56 3,2 3,63 5,8 5 1,71 2,74 10,5 3,79 10,5 50 1,68 2,83 14,1 3,95 15,2 100 1,70 2,84 14,5 3,95 15,2 110 1,72 2,83 14,1 3,96 15,5 130 1,71 2,84 14,5 3,95 15,2 150 1,65 2,84 14,5 3,96 15,5 Контроль 1,67 2,48 - 3,43 -

Двукратное (с интервалом 28 суток) введение кроликам породы Белый великан препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 5,8% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 10,5%; при применении препарата в дозе 50-150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 15,2%.

Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела кроликов.

Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела кроликов относительно величины прироста в контрольной группе.

Пример 5. Влияние препарата с рекомбинантным белком GDF11-GBD на увеличение массы тела индеек

Препарат, содержащий рекомбинантный белок, был применен на индейках (самцах) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 50 - 60 суток. Препарат применяли в дозе 0,1; 0,3; 0,5; 5; 50; 100; 110; 130; 150 мкг/кг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела индюков, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (30% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 70 VG (70% по массе), двукратно с интервалом 21 сутки. Препарат вводили внутримышечно. В каждой опытной и контрольной группе было по 10 животных. Птице контрольной группы препарат не вводился. Результаты представлены в табл. 6.

Таблица 6

Удельная доза рекомбинан-тного белка, мкг/кг Средняя масса тела индюков при первой инъекции препарата, кг Средняя масса тела индюков через 30 суток после первой инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 30 суток Средняя масса тела индюков через 90 суток после второй инъекции препарата, кг % к контрольной группе через 90 суток 0,1 1,66 10,09 0,1 14,58 1,7 0,3 1,70 10,45 3,7 14,97 4,4 0,5 1,59 10,76 6,7 15,54 8,4 5 1,71 11,03 9,4 15,97 11,4 50 1,68 11,34 12,5 17,37 21,1 100 1,70 11,35 12,6 17,41 21,4 110 1,72 11,34 12,5 17,42 21,5 130 1,71 11,37 12,8 17,43 21,5 150 1,65 11,38 12,9 17,44 21,6 Контроль 5,07 10,08 - 14,34 -

Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 21 суток) введение индюкам препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, суспендированный в среде адъюванта: смеси из альфа-гликана (30% по массе) и водно-масляной суспензии MONTANIDE ISA 70 VG (70% по массе), привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 0,5 мкг/кг рекомбинантного белка на 8,4% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 5 мкг/кг рекомбинантного белка - на 11,4%; при применении препарата в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка - на 21.1%; при применении препарата в дозе 150 мкг/кг рекомбинантного белка - на 21.6%.

Кроме того, также было обнаружено, что даже однократное введение препарата, содержащего рекомбинантный белок GDF11-GBD, обеспечивает значительный прирост массы тела индюков.

Важно отметить, что при введении препарата в дозах, лежащих вне диапазона доз 0,5-150 мкг/кг наблюдался существенный спад прироста массы тела индюков относительно величины прироста в контрольной группе.

Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими. Возможные иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.

--->

Перечень последовательностей

<110> Limited Liability Company "SCIENTIFIC AND PRODUCTION CORPORATION IN-VET"

<120> Growth Differentiation Factor 11 (GDF11), Injectable Preparation for Muscle Mass Increase in Mammals and Poultry, a Method for the Production Thereof, and a Method for the Application Thereof

Последовательности аминокислот GDF11

<160> SEQ ID NO 1

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 1

Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr 1 5 10 15

Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala

20 25 30

Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met

35 40 45

Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro

50 55 60

Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile

65 70 75 80

Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile

85 90 95

Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100 105

Последовательность аминокислот спейсера

<160> SEQ ID NO 2

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 2

Gly Ser Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala

1 5 10 15

Последовательность аминокислот альфа-глюкансвязывающего домена из Streptococcus mutans

<160> SEQ ID NO 3

<210> 3

<211> 180

<212> PRT

<213> Streptococcus mutans

<400> 3

Glu Leu Asn Arg Lys Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr

1 5 10 15

Glu Asn Leu Leu Arg Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln

20 25 30

Thr Phe Thr Ala Asn Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile

35 40 45

Asn Gly Asp Gln Val Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg

50 55 60

Thr Ile Gln Leu Leu Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn

65 70 75 80

Glu Asp Gly Tyr Glu Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu

85 90 95

Leu Val Thr Tyr Pro Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg

100 105 110

Ile Ala Lys Gln Val Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser

115 120 125

Ser Met Ile Ser Leu Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp

130 135 140

Pro Val Leu Tyr Ile Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile 145 150 155 160

Tyr Ile Asn Glu Thr Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln

165 170 175

Pro Gln His Pro

180

Последовательность нуклеотидов гена GDF11-GBD

<160> SEQ ID NO 4

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artifical Sequence

<400> 4

CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT AATAGATTCA 60

ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGAA TTCATTAAAG AGGAGAAATT AACT 114

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC CCG GGT TCT GGC 162

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Gly Ser Gly

1 5 10 15

TCC GGC TCT GGT TCC GGT TCT GGC GCC AGA TCC GAA CTG AAC CGC AAA 210

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Arg Lys

20 25 30

AAC TAT CAT TAT CAG CAG TTT ATT ACC GCG TAT GAA AAC CTG CTG CGC 258

Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Arg

35 40 45

GAC AAA GTG GAA AAC GAT AGC GCG GAA CCG CAG ACC TTT ACC GCG AAC 306

Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln Thr Phe Thr Ala Asn

50 55 60

GGC CGC CAG CTG AGC CAG GAT GCT CTG GGC ATT AAC GGC GAT CAG GTG 354

Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile Asn Gly Asp Gln Val

65 70 75 80

TGG ACC TAC GCT AAA AAA GGC AAC GAT TTT CGC ACC ATT CAG CTG CTG 402

Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg Thr Ile Gln Leu Leu

85 90 95

AAC CTG ATG GGC ATT ACC AGC GAC TGG AAA AAC GAA GAT GGC TAT GAA 450

Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn Glu Asp Gly Tyr Glu

100 105 110

AAC AAC AAA ACT CCA GAT GAA CAG ACC AAC CTG CTG GTG ACC TAC CCG 498

Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu Leu Val Thr Tyr Pro

115 120 125

CTG ACC GGT GTT TCT ATG GCT GAA GCT GAT CGC ATT GCG AAA CAG GTG 546

Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Ala Lys Gln Val

130 135 140

TAT CTG ACC AGC CCG GAT GAT TGG CTG CAG AGC AGC ATG ATT AGC CTG 594

Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser Ser Met Ile Ser Leu

145 150 155 160

GCG ACC CAG GTG AAA ACC AAC GAA AAC GGC GAT CCG GTG CTG TAT ATT 642

Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp Pro Val Leu Tyr Ile

165 170 175

CAG GTG CCG CGC CTG ACC CTG TGG GAT ATG ATT TAT ATT AAC GAA ACC 690

Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile Tyr Ile Asn Glu Thr

180 185 190

ATT AAA CCG GAA ACC CCG AAA GTG CCG GAA CAG CCG CAG CAT CCG AGA 738

Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln Pro Gln His Pro Arg

195 200 205

TCC GGC TCT GGT TCT GGT CTG GAC TGC GAC GAA CAC TCT ACC GAA TCT 786

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser

210 215 220

CGT TGC TGC CGT TAC CCG CTG ACC GTT GAC TTC GAA GCG TTC GGT TGG 834

Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp

225 230 235 240

GAC TGG ATC ATC GCT CCG AAA CGT TAC AAA GCT AAC TAC TGC TCT GGA 882

Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly

245 250 255

CAG TGC GAA TAC ATG TTC ATG CAG AAA TAC CCG CAC ACC CAC CTG GTT 930

Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val

260 265 270

CAG CAG GCT AAC CCG CGT GGT TCT GCT GGT CCG TGC TGC ACC CCG ACC 978

Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr

275 280 285

AAA ATG TCT CCG ATC AAC ATG CTG TAC TTC AAC GAC AAA CAG CAG ATC 1026

Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile

290 295 300

ATC TAC GGT AAA ATC CCG GGT ATG GTT GTT GAC CGC TGC GGT TGC TCT 1074

Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

305 310 315 320

TAA CCG 1080

<210> 5
<211> 320
<212> PRT

<213> Artifical Sequence

<400> 5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Pro Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Arg Lys

20 25 30

Asn Tyr His Tyr Gln Gln Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Arg

35 40 45

Asp Lys Val Glu Asn Asp Ser Ala Glu Pro Gln Thr Phe Thr Ala Asn

50 55 60

Gly Arg Gln Leu Ser Gln Asp Ala Leu Gly Ile Asn Gly Asp Gln Val

65 70 75 80

Trp Thr Tyr Ala Lys Lys Gly Asn Asp Phe Arg Thr Ile Gln Leu Leu

85 90 95

Asn Leu Met Gly Ile Thr Ser Asp Trp Lys Asn Glu Asp Gly Tyr Glu

100 105 110

Asn Asn Lys Thr Pro Asp Glu Gln Thr Asn Leu Leu Val Thr Tyr Pro

115 120 125

Leu Thr Gly Val Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Ala Lys Gln Val

130 135 140

Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Asp Trp Leu Gln Ser Ser Met Ile Ser Leu

145 150 155 160

Ala Thr Gln Val Lys Thr Asn Glu Asn Gly Asp Pro Val Leu Tyr Ile

165 170 175

Gln Val Pro Arg Leu Thr Leu Trp Asp Met Ile Tyr Ile Asn Glu Thr

180 185 190

Ile Lys Pro Glu Thr Pro Lys Val Pro Glu Gln Pro Gln His Pro Arg

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser

210 215 220

Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp

225 230 235 240

Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly

245 250 255

Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val

260 265 270

Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr

275 280 285

Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile

290 295 300

Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

305 310 315 320

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантного иммунологически активного белка фактора роста и дифференцировки 11 (GDF11), который может быть использован для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных и увеличения их мышечной массы за счет индукции синтеза специфических аутоантител к GDF11, блокирования его действия и, как следствие, стимуляции роста мыщечной ткани. Получают рекомбинантный белок, включающий GDF11 и глюкансвязывающий домен. Разработан способ получения целевого белка на глюкане, который включает в себя связывание белка с глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия, последующую отмывку от несвязавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта. Также получен инъекционный препарат на основе указанного белка и предложен способ повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата. Изобретение обеспечивает получение рекомбинантного белка GDF11, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении GDF11. 4 н.п. ф-лы, 6 табл., 5 пр.

1. Рекомбинантный белок GDF11-GBD, обладающий способностью связываться с глюкансодержащим сорбентом и индуцировать синтез специфических аутоантител к GDF11, с последовательностью аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 4.

2. Способ получения рекомбинантного белка GDF11-GBD на глюкане, включающий: выращивание клеток E. сoli, экспрессирующих белок GDF11-GBD по п. 1, связывание указанного белка GDF11-GBD в составе клеточных экстрактов указанных клеток E. сoli с альфа-глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации, последующую отмывку от не связавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.

3. Инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, содержащий рекомбинантный белок GDF11-GBD по п. 1, суспендированный в среде альфа-глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком адъюванте.

4. Способ повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, включающий проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата по п. 3 в дозе 0,5 – 150 мкг указанного белка GDF11-GBD на один килограмм массы тела животного.