Замещенные спироандростен-17, 6'[1,3,4]тиадиазины, обладающие противовирусной активностью Российский патент 2021 года по МПК C07J33/00 A61K31/58 A61P31/22 

Изобретение относится к новым неописанным биологически активным соединениям, конкретно, к замещенным спироандростен-17,6'[1,3,4]тиадиазинам общей формулы:

где R=Η или F.

Предлагаемые соединения обладают противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса и могут найти применение в медицине, ветеринарии и в биотехнологиях.

Ранее в литературе были описаны соединения, изомерные по структуре к заявляемым [Komendantova A.S., Scherbakov А.М., Komkov Α.V., Chertkova V.V., Gudovanniy Α.Ο., Chemoburova Ε.I., Sorokin D.V., Dzichenka Y.U., Shirinian V.Z., Volkova Υ.Α., Zavarzin I.V. Novel steroidal 1,3,4-thiadiazines: Synthesis and biological evaluation in androgen receptor-positive prostate cancer 22Rv1 cells // Bioorganic Chemistry. - 2019. - T. 91. - C. 103142] общей формулы:

где R=Η или F.

Однако эти изомерные соединения при испытании не проявили противоопухолевую активность, а противовирусная активность для них не известна.

Предлагаемые соединения являются новыми, неописанными соединения и отличаются от известных соединений стереохимией ОН-группы при атоме C16 стероидного фрагмента.

Известно, что в стероидах среди многочисленных изомеров биологическую активность часто проявляет только один из изомеров, тогда как остальные изомеры малоактивны или не активны вовсе, как и в случае соединений 2. Вирусные заболевания и вызываемые вирусами опухоли представляют одну из наиболее серьезных проблем современной медицины. Для лечения вирусных заболеваний применяют комбинации нескольких препаратов (часто используют одновременно 3-5 различных препаратов). Это необходимо а) для повышения эффективности лечения и б) для предупреждения появления новых лекарственно устойчивых патогенных вирусов, которые легко появляются при использовании монопрепаратов.

В связи с этим актуальной задачей является расширение арсенала противовирусных средств. Эта задача особенно актуальна и потому, что для лечения далеко не всех видов вирусных заболеваний существуют даже единичные препараты. В частности, вирус Эпштейна-Барра (ВЭБ), один из основных вирусов герпеса человека, был открыт более 50 лет назад как первый опухолевый вирус человека. Однако до сих пор не существует эффективной вакцины против ВЭБ, а его лечение ограничено использованием таких малоэффективных препаратов, как ацикловир.

Для лечения заболеваний, вызванных вирусами герпеса, в частности, вирусом Эпштейна-Барра, в настоящее время не существует эффективных терапевтических методик ввиду отсутствия комплекса противовирусных препаратов. Преодолеть этот недостаток возможно только путем создания новых антивирусных средств для комплексной терапии герпесвирусных инфекций одновременно несколькими противовирусными препаратами. Наиболее близким к заявленным соединениям по свойствам в ряду стероидных структур является стероидный диуретик спиронолактон структурной формулы:

противовирусная активность которого была обнаружена недавно. Известно, что спиронолактон снижает выработку вируса Эпштейна-Барра in vitro [Verma D., Thompson J., Swaminathan S. Spironolactone blocks Epstein-Barr virus production by inhibiting EBV SM protein function // Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). - 2016. - T. 113, №13. - C. 3609-3614], а также он активен в отношении альфа-герпесвирусов лошадей [Thieulent С., Hue Ε.S., Sutton G., Fortier C., Dallemagne P., Zientara S., Munier-Lehmann H., Hans Α., Paillot R.., Vidalain P.-O., Pronost S. Identification of antiviral compounds against equid herpesvirus-1 using real-time cell assay screening: Efficacy of decitabine and valganciclovir alone or in combination // Antiviral Research. - 2020. -T. 183.-C. 104931].

Технической задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса.

Поставленная техническая задача достигается новыми 2'-(N-замещенными) производными 5'-метил-3β,16β-дигидроксиспироандрост-5-ен-17,6'[1,3,4]тиадиазинов общей формулы:

где R=Η или F, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса.

По результатам скрининга биологической активности предлагаемые соединения общей формулы 1 продемонстрировали антивирусную активность - ингибирование высвобождения вируса герпеса при минимальной цитотоксичности.

Предлагаемые соединения общей формулы 1 получают взаимодействием 16β,17β-эпокси-17-изопрегн-5-ен-3β-ол-20-она с тиогидразидами оксаминовой кислоты под действием n-толуолсульфокислоты при 40°С в течение 10 часов. Процесс протекает по следующей схеме:

где R=H (1a), F(1b).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.

Пример 1. К раствору 330 мг 16β,17β-эпокси-17-изопрегн-5-ен-3β-ол-20-она (2) и 235 мг 2-гидразинил-N-фенил-2-тиоксоацетамида (R=Н) в сухом диоксане (15 мл) прибавили n-толуолсульфокислоту (20 мкл, 30 мол.%) при комнатной температуре. Реакционную смесь далее нагревали при 40°С в течение 10 часов и затем охлаждали до комнатной температуры. По окончании реакции органический слой обрабатывали 5% водным раствором Na₂CO₃ (20 мл) и экстрагировали хлороформом (3×40 мл). Объединенные органические слои сушили над Na₂SO₄. Полученный продукт (1а) очищали колоночной хроматографией: элюент - смесь петролейный эфир/этилацетат (3:1). Выход (3S,8R,9S,10R,13S,14S,16R,17R)-5'-метил-[2'-(N-фенилкарбамоил)]-3,16-дигидроксиспироандрост-5-ен-17,6'[1,3,4]-тиадиазина (1a) составил 305 мг (60%), чистота 98% (по ЯМР). Т.пл. 188-190°С.¹H NMR (600 МГц, ДМСО-d₆): δ 0.78 (ддд, J=4.8, 12.3, 15.5 Гц, 1Н, 9-СН), 0.85 (с, 3Н, 18-СН₃), 0.87 (с, 3Н, 19-СН₃), 0.86-0.98 (м, 2Н, 1-СН₂, 12-СН₂), 1.03-1.10 (м, 1H, 12-СН₂), 1.17-1.40 (м, 4Н, 2-СН₂, 8-СН, 11-СН₂), 1.47-1.70 (м, 4Н, 1-СН₂, 2-СН₂, 7-СН₂, 15-СН₂), 1.78 (ддд, J=2.2, 10.4, 11.1 Гц, 1Н, 14-СН), 1.83-1.96 (м, 2Н, 7-СН₂, 15-СН₂), 2.04 (дд, J=8.7, 13.1 Гц, 1Н, 4-СН₂), 2.12 (дд, J=5.0, 13.1 Гц, 1Н, 4-СН₂), 2.47 (с, 3Н, СН₃), 3.18-3.22 (м, 1Н, 3-СН), 4.55 (д, J=4.2 Гц, 1Н, 3-ОН), 5.22-5.26 (м, 2Н, 6-СН, 16-СН), 5.66 (д, J=4.8 Гц, 1Н, 16-ОН), 7.12 (т, J=7.8 Гц, 1Н, Ph), 7.34 (т, J=7.8 Гц, 2Н, Ph), 7.85 (д, J=7.8 Гц, 2Н, Ph), 10.5 (уш.с, 1Н, NH). ¹³С NMR (150.9 МГц, ДМСО-d₆): δ 14.8 (18-СН₃), 19.0 (19-СН₃), 19.9 (11-СН₂), 23.5 (СН₃), 31.2 (8-СН), 31.2 (7-СН₂), 31.3 (2-СН₂), 33.7 (15-СН₂), 34.6 (12-СН₂), 35.9 (10-С), 36.6 (1-СН₂), 42.0 (4-СН₂), 46.0 (14-СН), 48.8 (9-СН), 51.2 (13-С), 62.2 (17-С), 69.9 (3-СН), 72.5 (16-СН), 119.9 (6-СН), 120.3 (2СН, Ph), 124.1 (СН, Ph), 128.6 (2СН, Ph), 137.9 (С, Ph), 141.2 (5-С), 152.9 (2'-С), 153.9 (5'-С), 160.0 (СО).

Спектр HRMS (ESI) для C₂₉H₃₈N₃O₃S ([M+H]⁺): вычислено 508.2628, найдено 508.2626.

Изомерная структура полученного соединения установлена с помощью 2D ЯМР спектров NOESY, HSQC и НМВС. Ниже приведена структурная формула соединения 1а, на которой показана корреляция протонов в 2D ЯМР спектрах для доказательства изомерной структуры.

Структурная формула соединения 1а:

Пример 2. Аналогично из 330 мг 16β,17β-эпокси-17-изопрегн-5-ен-3β-ол-20-она (2) и 255 мг N-(4-фторфенил)-2-гидразинил-2-тиоксоацетамида (R=F) получено 355 мг (выход 65%) (3S,8R,9S,10R,13S,14S,16R,17R)-5'-метил-[2'-(N-(4-фторфенил)карбамоил)]-3,16-дигидроксиспироандрост-5-ен-17,6'[1,3,4]тиадиазина (1b), чистота 98% (по ЯМР). Т.пл. 188-190°С. ¹H NMR (600 МГц, ДМСО-d₆): δ 0.78 (ддд, J=4.9, 12.4, 15.4 Гц, 1Н, 9-СН), 0.85 (с, 3Н, 18-СН₃), 0.87 (с, 3Н, 19-СН₃), 0.86-0.98 (м, 2Н, 1-СН₂, 12-СН₂), 1.03-1.10 (м, 1Н, 12-СН₂), 1.17-1.40 (м, 4Н, 2-СН₂, 8-СН, 11-СН₂), 1.47-1.70 (м, 4Н, 1-СН₂, 2-СН₂, 7-СН₂, 15-СН₂), 1.79 (ддд, J=2.3, 10.4, 11.2 Гц, 1Н, 14-СН), 1.84-1.97 (м, 2Н, 7-СН₂, 15-СН₂), 2.04 (дд, J=8.7, 13.3 Гц, 1H, 4-СН₂), 2.13 (дд, J=4.9, 13.3 Гц, 1Н, 4-СН₂), 2.47 (с, 3Н, 21-СН₃), 3.19-3.22 (м, 1Н, 3-СН), 4.50 (уш.с, 1Н, 3-ОН), 5.22-5.28 (м, 2Н, 6-СН, 16-СН), 5.67 (уш.с, 1H, 16-ОН), 7.18 (дд, J=8.4, 9.0 Гц, 2Н, Аг), 7.89 (dd, J=4.8, 8.4 Гц, 2Н, Ar), 10.6 (уш.с, 1Н, NH). ¹³С NMR (150.9 МГц, ДМСО-d₆): δ 14.8 (18-СН₃), 19.0 (19-CH₃), 20.0 (11-CH₂)_, 23.5 (СН₃), 31.1 (8-СН), 31.2 (7-CH₂), 31.3 (2-CH₂), 33.7 (15-CH₂), 34.6 (12-CH₂), 35.9 (10-С), 36.6 (1-СН₂), 42.1 (4-СН₂), 46.0 (14-СН), 48.8 (9-СН), 51.2 (13-С), 62.2 (17-С), 69.9 (3-СН), 72.5 (16-СН), 115.1 (д, J_C-F=23.0 Гц, 2СН, Ar), 120.0 (6-СН), 122.3 (д, J_C-F=6.9 Гц, 2СН, Ar), 134.4 (С, Ar), 141.2 (5-С), 152.8 (2'-С), 154.0 (5'-С), 158.5 (д, J_C-F.=240.9 Гц, С, Ar), 160.0 (СО). Изомерная структура полученного соединения установлена аналогично примеру 1 с помощью 2D ЯМР спектров ROESY, HSQC и НМВС. Спектр HRMS (ESI) для C₂₉H₃₆FN₃O₃SNa ([M+Na]⁺): вычислено 548.2354, найдено 548.2345.

Испытания предлагаемых соединений на противовирусную активности.

Пример 3. Испытания противовирусной активности в отношении вируса Эпштейна-Барра.

Испытания противовирусной активности проводили непосредственно на клетках обезьяны (Saguinus oedipus) В95-8, продуцирующих вирус Эпштейна-Барра. Высвобождение вируса оценивали количественно путем измерения внеклеточной вирусной ДНК в среде для культивирования клеток методом ПНР. В таблице 1 представлены результаты испытаний через 14 дней после обработки культуры клеток предлагаемыми соединениями 1a (R=Н) и 1b (R=F), а также спиронолактоном в концентрации 25 мкМ по сравнению с контрольным опытом (культура клеток без добавления дополнительных веществ).

Таким образом, фторзамещенный 1b показал наибольшую эффективность ингибирования, которая на 14 день оказалась примерно на 50% выше по сравнению со спиронолактоном.

Пример 4. Испытания противовирусной активности в отношении вируса герпеса лошадей EHV-1.

Испытания противовирусной активности проводили непосредственно на клетках Vero с использованием вируса EHV-1 (Kentucky D). Культуры клеток обрабатывали соединениями 1а,b в концентрации 25 мкМ. Высвобождение вируса оценивали путем измерения внеклеточной ДНК в среде для культивирования клеток методом ПЦР. В таблице 2 представлены результаты испытаний через 7 дней после обработки культуры клеток предлагаемыми соединениями 1a (R=Н) и 1b (R=F) в концентрации 25 мкМ по сравнению с контрольным опытом. По результатам испытаний фторзамещенный 1b также оказался наиболее эффективным.

Пример 5. Испытания цитотоксичности.

Соединения 1а,b были протестированы на цитотоксичность на клетках В95-8 при концентрации 25 мкМ в течение 14 дней. Скорость роста клеток была одинаковой для протестированных соединений и контрольного опыта. Таким образом, соединения 1а,b не обладают клеточной токсичностью. Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение новых химических соединений общей формулы 1, обладающих противовирусным действием в отношении вирусов герпеса, патогенных для человека (пример 3) и животных (пример 4) при низкой клеточной токсичности и высокой степени (эффективности) ингибирования, примерно на 50% выше по сравнению со спиронолактоном для соединеия 1b.

Изобретение относится к замещённым спироандростен-17,6'[1,3,4]тиадиазинам общей формулы (1), в которой R=Η или F. Технический результат: получены новые соединения формулы (1), обладающие противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса, с низкой клеточной токсичностью. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

1. Замещенные спироандростен-17,6'[1,3,4]тиадиазины общей формулы:

где R=Η или F.

2. Соединения общей формулы по п. 1, обладающие противовирусной активностью в отношении вирусов герпеса.