КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА (ADC) И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ПРОЛЕКАРСТВА (APDC), СОДЕРЖАЩИЕ ФЕРМЕНТАТИВНО РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ ГРУППЫ Российский патент 2021 года по МПК A61K47/68 A61P35/00 C07D207/335 

Введение и уровень техники

Изобретение относится к новым конъюгатам связующего и пролекарства (APDC), в которых связующее конъюгировано с неактивными соединениями - предшественниками ингибиторов белка кинезина веретена, и к конъюгатам связующего и лекарственного средства (ADC), к активным метаболитам этих конъюгатов связующего и пролекарства и конъюгатов связующего и лекарственного средства, к способам получения этих APDC и ADC, к применению этих конъюгатов для лечения и/или профилактики заболеваний и к применению этих конъюгатов для приготовления лекарственных средств для лечения и/или предотвращения заболеваний, в частности гиперпролиферативных и/или ангиогенных нарушений, таких как, например, злокачественные заболевания. Такие лечения можно осуществлять в виде монотерапии или также в комбинации с другими лекарственными средствами, или дополнительными терапевтическими мерами. В соответствии с изобретением, связующее предпочтительно означает антитело.

Злокачественные заболевания являются следствием неконтролируемого роста клеток самых разнообразных тканей. Во многих случаях новые клетки пенетрируют в существующую ткань (инвазивный рост), или они метастазируют в удаленные органы. Злокачественные заболевания возникают в большом разнообразии различных органов и часто имеют тканеспецифическое течение. Термин "злокачественное новообразование" в качестве общего термина описывает большую группу определенных заболеваний различных типов органов, тканей и клеток.

Некоторые опухоли на ранних стадиях могут быть удалены хирургически и с помощью лучевой терапии. Метастазированные опухоли, как правило, можно только лечить паллиативно с помощью химиотерапевтических средств. В данном случае, задача состоит в достижении оптимальной комбинации улучшения качества жизни и пролонгирования жизни.

Конъюгаты связующих белков с одной или несколькими молекулами лекарственного средства известны, в частности, в форме конъюгатов антитела и лекарственного средства (ADC), в которых интернализирующееся антитело, нацеленное на связанный с опухолью антиген, ковалентно присоединено через линкер к цитотоксическому средству. После введения ADC в опухолевую клетку и последующего диссоциации конъюгата, либо само цитотоксическое средство, либо цитотоксический метаболит, образованный из него, высвобождается в опухолевой клетке и может проявлять свое действие в ней непосредственно и селективно. Таким путем, в отличие от общепринятой химиотерапии, повреждение нормальной ткани находится в существенно низких пределах [см., например, J.М. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A.M. Wu и P.D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005); P.D. Senter, Curr. Opin. 13, 235-244 (2009); L. Ducry и В. Stump, Bioconjugate Chem. Таким образом, WO 2012/171020 описывает ADC, в которых множество токсофорных молекул присоединены через полимерный линкер к антителу. В качестве возможных токсофоров, WO 2012/171020 упоминаются, среди других, вещества SB 743921, SB 715992 (испинесиб), MK-0371, AZD8477, AZ3146 и ARRY-520.

Вещества, упомянутые последними, представляют собой ингибиторы белка кинезина веретена. Белок кинезина веретена (KSP, также известен как Eg5, HsEg5, KNSL1 или KIF11) представляет собой кинезиноподобный двигательный белок, который является важным для функционирования биполярного митотического веретена. Ингибирование KSP приводит к блокировке митоза и, в течение относительно долгого периода времени, к апоптозу (Тао и др., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). После открытия первого проникающего в клетку KSP ингибитора, монастрола, KSP ингибиторы сами были квалифицированы в качестве класса новых химиотерапевтических средств (Mayer и др., Science 286: 971-974, 1999), и они являются объектами различных патентных заявок (например, WO 2006/044825; WO 2006/002236; WO 2005/051922; WO 2006/060737; WO 03/060064; WO 03/040979; и WO 03/049527). Тем не менее, поскольку KSP активны только в течение относительно короткого периода времени во время фазы митоза, KSP ингибиторы должны присутствовать в достаточно высокой концентрации во время этой фазы. WO 2014/151030 раскрывает ADC, включая определенные ингибиторы KSP.

Легумаин представляет собой связанную с опухолью аспарагинил-эндопептидазу (S. Ishii, Methods Enzymol. 1994, 244, 604; J.M. Chen и др. J. Biol. Chem. 1997, 272, 8090) и был использован для процессинга пролекарственных препаратов малых цитотоксических молекул, например, среди других, производных доксорубицина и этопозида (W. Wu и др. Cancer Res. 2006, 66, 970; L. Stern и др. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 500; K.M. Bajjuri и др. ChemMedChem 2011, 6, 54).

Другими лизосомальными ферментами являются, например, катепсин или гликозидазы, например, β-глюкуронидазы, которые также использовались для высвобождения активных ингредиентов путем ферментативного расщепления пролекарственных препаратов. Группы, расщепляемые ферментативно in vivo, представляют собой, в особенности, 2-8-олигопептидные группы или гликозиды. Сайты расщепления пептидов раскрыты в Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 и Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346, а также Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. Они включают, например, валин-аланин, валин-лизин, валин-цитруллин, аланин-лизин и фенилаланин-лизин (необязательно с дополнительной амидной группой).

Краткое изложение сущности изобретения

Для дальнейшего улучшения опухолевой селективности ADC и их метаболитов, были обеспечены конъюгаты связующего с пептидными производными, которые могут высвобождаться с помощью связанных с опухолью ферментов, таких как легумаин или катепсин. Таким образом, опухолевая селективность определяется не только выбором антитела, но, дополнительно, ферментативным отщеплением пептидного производного, например, с помощью связанного с опухолью фермента легумаина.

В соответствии с изобретением, пептидное производное может присутствовать в линкере, который соединяет связующее с KSP ингибитором. Такие соединения являются конъюгатами связующего и лекарственного средства (ADC) в соответствии с изобретением.

Ингибиторы белка кинезина веретена, применяемые в соответствии с изобретением, содержат аминогруппу, которая имеет важное значение для обеспечения их действия. С помощью модификации этой аминогруппы пептидными производными, действие в отношении белка кинезина веретена блокируется и, следовательно, развитие цитотоксического эффекта также ингибируется. Однако, если такой пептидный остаток может быть высвобожден связанными с опухолью ферментами, такими как легумаин, действие в опухолевой ткани может быть восстановлено контролируемым образом. Модификация аминогруппы в данном случае не затрагивает часть линкера. Таким образом, настоящее изобретение относится к конъюгатам связующего, содержащим молекулы неактивных предшественников ингибиторов белка кинезина веретена, которые процессируются только в опухоли с помощью связанной с опухолью лизосомальной эндопептидазы легумаина с получением активных метаболитов, чтобы, таким образом, иметь возможность снова проявлять свою цитотоксическую активность контролируемым образом в опухоли. Конъюгаты связующего с ингибиторами KSP, где их свободная аминогруппа соответствующим образом блокируется, также называются в соответствии с изобретением как APDC. APDC являются особенно предпочтительными.

Таким образом, изобретение обеспечивает конъюгаты связующего или его производного с одной или несколькими молекулами лекарственного средства или его одного или нескольких про лекарств, которые имеют следующую формулу I:

где СВЯЗУЮЩЕЕ представляет собой связующее или его производное (предпочтительно антитело), L представляет собой линкер, n представляет собой число от 1 до 50, предпочтительно от 1.2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 8, и KSP представляет собой ингибитор белка кинезина веретена или его пролекарство, где L-KSP имеет следующую формулу (IIa):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y², или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z'), или -CH(CH₂W)Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH;

где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -L-#1, Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой Н или -(СН₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -L-#1, -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

или R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

или R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где R¹⁰ представляет собой Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH, галоген (в особенности, F или Cl), C_1-4-алкил, С_1-4-галогеналкил, С_1-4-алкокси, гидроксил-замещенный C_1-4-алкил, СОО(С_1-4-алкил), -ОН и где атом водорода вторичной аминогруппы в пирролидиновом кольце может быть заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=N-NH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно -L-#1 или С_1-10алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -O-С(=O)-алкильных групп, 1-3 -O-С(=O)-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-С(=O)-алкильных групп, 1-3 -NH-С(=O)-NH-алкильных групп, 1-3 -S(=O)_n-алкильных групп, 1-3 -S(=O)₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHC(=O)CH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z', или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН,

(где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -CO₂H, -NH₂ или -L-#1;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴ и R⁸ представляет собой или (в случае R⁸) содержит -L-#1,

-L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой Н, галоген или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную гидрокарбильную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y-, (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHC(=O)NH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-(CH=N-NH₂), сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, С₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, и

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

где выполняется одно или несколько следующих условий (i) - (iii):

(i) -L-#1 включает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-СН(СН₂СОХ)-СО-,

где X представляет собой -NH₂ или -СООН, предпочтительно -NH₂; Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(ii) R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

(iii) R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где вторичный атом водорода вторичной аминогруппы пирролидинового кольца заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

и их соли, сольваты, соли сольватов и эпимеры.

В ADC в соответствии с изобретением, -L-#1 - включает или означает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3) _(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-. Особое предпочтение отдают тем группам формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, которые, как было установлено, способны расщепляться в исследовании с легумаином, описанном в Экспериментальном разделе. Более предпочтительно, один из заместителей R¹, R³ или R⁴ является -L-#1. Когда R⁴ представляет собой -L-#1, карбонильная группа аспарагина или аспарагиновой кислоты присоединена непосредственно к атому азота, который присоединен к R⁴ в вышеприведенной формуле.

В APDC в соответствии с изобретением, R⁴ означает R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-, или атом водорода NH в пирролидиновом кольце заменен на R²¹-CO-P3_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-SIG-.

R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO- и R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-SIG- группы расщепляются in vivo, вероятно, ферментом легумаином. Эти группы поэтому также называются в дальнейшем как "расщепляемые легумаином группы". Расщепляемая легумаином группа имеет формулу -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONX)-CO-. В APDC в соответствии с изобретением, группа предпочтительно имеет формулу R21-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO-#, означающую, что расщепляемая легумаином группа содержит группу R²¹ на одном конце, а на другом конце (-#) она присоединена к аминогруппе, соответствующей положению R⁴ в формуле IIa.

В данном случае, NH-CH(CH₂COX)-CO- (то есть аспарагин или аспарагиновая кислота) присутствует в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают тем группам, которые, как было установлено, способны расщепляться в исследовании с легумаином, описанном в Экспериментальном разделе. APDC в соответствии с изобретением могут, в дополнение к отщепляемой легумаином или катепсином группе R⁴, содержать линкер -L-#1, содержащий расщепляемую легумаином или катепсином группу.

-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- в расщепляемой легумаином группе означает аспарагин; -NH-CH(CH₂COOH)-CO- в расщепляемой легумаином группе означает аспарагиновую кислоту. Аспарагин и аспарагиновая кислота присутствуют здесь в виде L(-)-аспарагина и L-аспарагиновой кислоты, соответственно. Расщепляемая легумаином группа содержит, наряду с аспарагином или аспарагиновой кислотой, от 1 до 3 дополнительных аминокислот (т.е., в случае аспарагина, -P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-; -Р3-Р2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO; -(P3)₍₂₎-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-), и является, таким образом, ди-, три- или тетрапептидом или его производным (дипептид: -P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-; трипептид: -P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO; тетрапептид: -(P3)₂-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- (где две аминокислоты Р3 могут быть различными).

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно выбранной из Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Ser, Thr, цитруллина и Asn. P2 обычно находится в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают L-Ala.

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина, или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот. Р3 предпочтительно выбирают из His, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Gly, Ser, Phe, цитруллина и Gln. Р3 обычно находится в природной L конфигурации. Особое предпочтение отдают L-Ala. Когда присутствует более чем одна аминокислота Р3, эти аминокислоты могут различаться в рамках вышеуказанного определения.

Более предпочтительно, расщепляемая легумаином группа означает -L-Ala-L-Ala-L-Asn- (т.е., в случае APDC, R²¹-L-Ala-L-Ala-L-Asn-#).

R²¹ предпочтительно представляет собой -Н, C_1-5-алкил-, C_5-10-аралкил-, C_1-5-алкокси-, С_6-10-арилокси группу, C_5-10-гетероалкильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_5-10-гетероалкокси или C_5-10-гетероциклоалкокси группу, каждая из которых может быть замещена с помощью - -СООН, СООалкила, COONH₂, NH₂ или N(алкила)₂, или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² означает -Н, -алкил -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂). "Алкил" в данном случае относится к алкильной группе, содержащей вплоть до 20 атомов углерода, предпочтительно C1-12-алкилу.

Расщепляемая катепсином группа имеет формулу -(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-. В APDC в соответствии с изобретением, группа имеет формулу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-#, означающую, что расщепляемая катепсином группа содержит группу R²¹ на одном конце, а на другом конце (-#) она присоединена к аминогруппе, соответствующей положению R⁴ в формуле IIa. В данном случае, R21, Р2 и Р3 являются такими, как определено для расщепляемой легумаином группы. Является ли группа формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2--# расщепляемой катепсином, может быть определено на основании исследования с катепсином, описанного в Экспериментальном разделе. Особенно предпочтительными расщепляемыми катепсином группами являются те, в которых Р2 выбирают из аланина, лизина и цитруллина, и Р3 выбирают из валина, аланина и фенилаланина, в особенности, группы формулы R²¹-(CO)(_0-1)-P3-P2-.

Описание фигур

Фигура 1: Выравнивание TWEAKR обогащенного цистеином домена (аминокислоты 34 - 68) различных видов. (Нумерация указывает положение аминокислоты в полноразмерных конструкциях, включая сигнальные последовательности; SEQ ID NO: 169).

Фигура 2: А - Схематическая диаграмма структуры TWEAKR (SEQ ID NO: 169). На диаграмме показан внеклеточный домен (аминокислоты 28-80) (SEQ ID NO: 168), включая обогащенный цистеином домен (36-67), трансмембранный домен - ТМ (81-101) и внутриклеточный домен (102-129). ТРР-2202 - полный эктодомен (28-80), с которым слит Fc домен hIgG1. ТРР-2203 - внеклеточный домен с N- и С-концевым усечением (34-68), слитый с Fc доменом hIgG1. Дисульфидные мостики Cys36-Cys49, Cys52-Cys67 и Cys55-Cys64 указаны черными полосами. Для обеспечения надлежащей укладки, ТРР-2203 содержит на две аминокислоты больше на N-конце и на одну аминокислоту больше на С-конце, по сравнению с чистым обогащенным цистеином доменом. ТРР-1984 - внеклеточный домен с С-концевым усечением (28-68), слитым с HIS6 меткой. Все эти три конструкции проявляют сопоставимое связывание с антителами в соответствии с изобретением и PDL-192 (ТРР-1104). Р4А8 (ТРР-1324) связывается только с полноразмерным внеклеточным доменом (ТРР-2202).

В - Аминокислотная последовательность внеклеточного домена: Было опубликовано, что аминокислота 64 является существенной для связывания TWEAK лиганда, и аминокислота 47 является существенной для связывания антител в соответствии с изобретением, как определено в настоящей заявке.

Фигура 3: Схематическая диаграмма катализируемой трансглутаминазой конъюгационный сайт-специфической функционализации негликозилированных антител.

Фигура 4: Диаграмма последовательных ферментативных стадий высвобождения лекарственного средства с помощью гистондеацетилазы и катепсина L в соответствии с Nat. Commun., 2013, 4, 2735.

Подробное описание изобретения

Изобретение обеспечивает конъюгаты связующего или его производного с одной или несколькими молекулами лекарственного средства или его пролекарств, причем молекула лекарственного средства является ингибитором белка кинезина веретена (KSP ингибитор).

Далее следует описание связующих, пригодных в соответствии с изобретением, ингибиторов KSP, пригодных в соответствии с изобретением или их пролекарств, и линкеров, пригодных в соответствии с изобретением, которые можно применяться в комбинации без ограничений. Более конкретно, можно применять связующие, описанные в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных в комбинации с KSP ингибиторами или пролекарствами, описанными в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных, необязательно в комбинации с линкерами, описанными в каждом случае в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных.

Ингибиторы KSP и их конъюгаты со связующими

В соответствии с изобретением, KSP-L в формуле I имеет следующую формулу (IIa):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, NH₂, SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -L-#1, -Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -L-#1, Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

или R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С₁-₁₀-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_ν-R²² группу (где x представляет собой 0 или 1 и ν представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

или R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где R¹⁰ представляет собой Н, NH₂, SO₃H, СООН, SH, галоген (в особенности, F или Cl), C_1-4-алкил, С_1-4-галогеналкил, C_1-4-алкокси, гидроксил-замещенный C_1-4-алкил, COO(С_1-4-алкил), ОН или R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=N-NH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно -L-#1 или С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или С_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-СО-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, F, Cl, Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -СО₂Н, -NH₂ или -L-#1;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴ и R⁸ представляет собой или (в случае R⁸) содержит -L-#1,

-L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(Gl)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -O-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью NHC(=O)NH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -С(=O)-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂), сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

где выполняется одно или несколько следующих условий (i) - (iii):

(i) -L-#1 включает группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-СН(СН₂СОХ)-СО-,

где X представляет собой -NH₂ или -СООН, предпочтительно -NH₂;

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(ii) R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

(iii) R² и R⁴ вместе представляют собой (с образованием пирролидинового кольца) -CH₂-CHR¹⁰- или -CHR¹⁰-CH₂-, где вторичный атом водорода вторичной аминогруппы пирролидинового кольца заменен на R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-SIG-, где SIG представляет собой саморасщепляющуюся группу, которая после расщепления CO-SIG связи высвобождает вторичный амин;

и включает его соли, сольваты, соли сольватов и эпимеры.

Определения

Термин "замещенный" означает, что один или несколько атомов водорода на указанном атоме или указанной группе заменен(-ы) заместителем, выбранным из оговоренной группы, при условии, что нормальная валентность указанного атома не превышена при рассматриваемых обстоятельствах. Допустимы комбинации заместителей и/или переменных.

Термин "необязательно замещенный" означает, что число заместителей может быть равным нулю или отличаться от нуля. Если не указано иначе, необязательно замещенные группы могут быть замещены таким числом необязательных заместителей, которое можно достичь путем замены каждого атома водорода на заместитель, не являющийся водородом, на любом доступном атоме углерода или азота или серы. Обычно число необязательных заместителей (если присутствует) может равняться 1, 2, 3, 4 или 5, в особенности, 1, 2 или 3.

В контексте настоящего изобретения, выражение "моно- или поли-", например, в определении заместителей соединений общих формул настоящего изобретения, означает "1, 2, 3, 4 или 5, предпочтительно 1, 2, 3 или 4, более предпочтительно 1, 2 или 3, наиболее предпочтительно 1 или 2".

Если радикалы в соединениях в соответствии с изобретением замещенными, такие радикалы, если не указано иначе, могут быть моно- или полизамещенными. В рамках объема настоящего изобретения, определения всех радикалов, которые встречаются более одного раза, независимы друг от друга. Замещение одним, двумя или тремя одинаковыми или разными заместителями является предпочтительным. Особенно предпочтительным является замещение одним заместителем.

Алкил

Алкил означает линейный или разветвленный насыщенный одновалентный углеводородный радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода (C₁-С₁₀-алкил), обычно от 1 до 6 (C₁-С₆-алкил), предпочтительно от 1 до 4 (С₁-С₄-алкил) и более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода (C₁-С₃-алкил).

Предпочтительные примеры включают:

метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, 2-метилбутил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, 1,2-диметилпропил, неопентил, 1,1-диметилпропил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 2-этилбутил, 1-этилбутил, 3,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,1-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, и 1,2-диметилбутил.

Особое предпочтение отдают метильному, этильному, пропильному, изопропильному или трет-бутильному радикалу.

Гетероалкил

Гетероалкил означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR^y-, -NR^yC(=O)-, -C(=O)-NR^y-, -NR^yNR^y-, -S(=O)₂-NR^yNR^y-, -C(=O)-NR^yNR^y-, -CR^x=N-O-, причем углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^y в каждом случае означает заместитель -Н, фенил, С₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, который, в свою очередь, может быть замещен в каждом случае с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^x означает -Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

Алкенил

Алкенил означает прямоцепочечную или разветвленную одновалентную углеводородную цепь, содержащую одну или две двойные связи и 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (С₂-С₁₀-алкенил), в особенности, 2 или 3 атома углерода (С₂-С₃-алкенил), где, как очевидно, когда алкенильная группа содержит более чем одну двойную связь, двойные связи могут быть изолированными друг от друга или сопряжены друг с другом. Алкенильная группа, например, означает такие группы, как этенил (или винил), проп-2-ен-1-ил (или "аллил"), проп-1-ен-1-ил, бут-3-енил, бут-2-енил, бут-1-енил, пент-4-енил, пент-3-енил, пент-2-енил, пент-1-енил, гекс-5-енил, гекс-4-енил, гекс-3-енил, гекс-2-енил, гекс-1-енил, проп-1-ен-2-ил (или "изопропенил"), 2-метилпроп-2-енил, 1-метилпроп-2-енил, 2-метилпроп-1-енил, 1-метилпроп-1-енил, 3-метилбут-3-енил, 2-метилбут-3-енил, 1-метилбут-3-енил, 3-метилбут-2-енил, 2-метилбут-2-енил, 1 -метилбут-2-енил, 3-метилбут-1-енил, 2-метилбут-1-енил, 1-метилбут-1-енил, 1,1-диметилпроп-2-енил, 1-этилпроп-1-енил, 1-пропилвинил, 1-изопропилвинил, 4-метилпент-4-енил, 3-метилпент-4-енил, 2-метилпент-4-енил, 1-метилпент-4-енил, 4-метилпент-3-енил, 3-метилпент-3-енил, 2-метилпент-3-енил, 1-метилпент-3-енил, 4-метилпент-2-енил, 3-метилпент-2-енил, 2-метилпент-2-енил, 1-метилпент-2-енил, 4-метилпент-1-енил, 3-метилпент-1-енил, 2-метилпент-1-енил, 1-метилпент-1-енил, 3-этилбут-3-енил, 2-этилбут-3-енил, 1-этилбут-3-енил, 3-этилбут-2-енил, 2-этилбут-2-енил, 1-этилбут-2-енил, 3-этилбут-1-енил, 2-этилбут-1-енил, 1-этилбут-1-енил, 2-пропилпроп-2-енил, 1-пропилпроп-2-енил, 2-изопропилпроп-2-енил, 1-изопропилпроп-2-енил, 2-пропилпроп-1-енил, 1-пропилпроп-1-енил, 2-изопропилпроп-1-енил, 1-изопропилпроп-1-енил, 3,3-диметилпроп-1-енил, 1-(1,1-диметилэтил)этенил, бута-1,3-диенил, пента-1,4-диенил или гекса-1,5-диенил. Более конкретно, данная группа означает винил или аллил.

Алкинил

Алкинил означает прямоцепочечную или разветвленную одновалентную углеводородную цепь, содержащую одну тройную связь и 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода (С₂-С₁₀-алкинил), в особенности, 2 или 3 атома углерода (С₂-С₃-алкинил). С₂-С₆-Алкинильная группа, например, означает такие группы, как этинил, проп-1-инил, проп-2-инил (или пропаргил), бут-1-инил, бут-2-инил, бут-3-инил, пент-1-инил, пент-2-инил, пент-3-инил, пент-4-инил, гекс-1-инил, гекс-2-инил, гекс-3-инил, гекс-4-инил, гекс-5-инил, 1-метилпроп-2-инил, 2-метилбут-3-инил, 1-метилбут-3-инил, 1-метилбут-2-инил, 3-метилбут-1-инил, 1-этилпроп-2-инил, 3-метилпент-4-инил, 2-метилпент-4-инил, 1-метилпент-4-инил, 2-метилпент-3-инил, 1-метилпент-3-инил, 4-метилпент-2-инил, 1-метилпент-2-инил, 4-метилпент-1-инил, 3-метилпент-1-инил, 2-этилбут-3-инил, 1-этилбут-3-инил, 1-этилбут-2-инил, 1-пропилпроп-2-инил, 1-изопропилпроп-2-инил, 2,2-диметилбут-3-инил, 1,1-диметилбут-3-инил, 1,1-диметилбут-2-инил или 3,3-диметилбут-1-инил. Более конкретно, алкинильная группа означает этинил, проп-1-инил или проп-2-инил.

Циклоалкил

Циклоалкил означает насыщенный одновалентный моно- или бициклический гидрокарбильный радикал, содержащий 3-12 атомов углерода (С₃-С₁₂-циклоалкил).

В данном контексте, моноциклический гидрокарбильный радикал означает одновалентный гидрокарбильный радикал, содержащий обычно от 3 до 10 (С₃-С₁₀-циклоалкил), предпочтительно от 3 до 8 (С₃-С₈-циклоалкил) и более предпочтительно от 3 до 7 (С₃-С₇-циклоалкил) атомов углерода.

Предпочтительные примеры моноциклических гидрокарбильных радикалов включают:

циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил.

Особое предпочтение отдают циклопропилу, циклобутилу, циклопентилу, циклогексилу и циклогептилу.

В данном контексте, бициклический гидрокарбильный радикал означает гидрокарбильный радикал, содержащий обычно от 3 до 12 атомов углерода (С₃-С₁₂-циклоалкил), который следует понимать в данном описании в значении конденсации двух насыщенных кольцевых систем, которые вместе делят два расположенных непосредственно рядом атома. Предпочтительные примеры бициклических гидрокарбильных радикалов включают: бицикло[2.2.0]гексил, бицикло[3.3.0]октил, бицикло[4.4.0]децил, бицикло[5.4.0]ундецил, бицикло[3.2.0]гептил, бицикло[4.2.0]октил, бицикло[5.2.0]нонил, бицикло[6.2.0]децил, бицикло[4.3.0]нонил, бицикло[5.3.0]децил и бицикло[6.3.0]ундецил.

Гетероциклоалкил

Гетероциклоалкил означает неароматическую моно- или бициклическую кольцевую систему, содержащую один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными. Гетероатомы могут представлять собой атомы азота, атомы кислорода или атомы серы.

Моноциклическая кольцевая система в соответствии с настоящим изобретением может содержать от 3 до 8, предпочтительно от 4 до 7 и более предпочтительно 5 или 6 кольцевых атомов.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 3 кольцевых атома, включают:

азиридинил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 4 кольцевых атома, включают:

азетидинил, оксетанил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 5 кольцевых атомов, включают:

пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, пирролинил, диоксоланил и тетрагидрофуранил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 6 кольцевых атомов, включают:

пиперидинил, пиперазинил, морфолинил, диоксанил, тетрагидропиранил и тиоморфолинил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 7 кольцевых атомов, включают:

азепанил, оксепанил, 1,3-диазепанил, 1,4-диазепанил.

Предпочтительные примеры гетероциклоалкила, содержащего 8 кольцевых атомов, включают:

оксоканил, азоканил.

Среди моноциклических гетероциклоалкильных радикалов, предпочтение отдают 4- 7-членным насыщенным гетероциклильным радикалам, содержащим вплоть до двух гетероатомов из группы, включающей О, N и S.

Особое предпочтение отдают морфолинилу, пиперидинилу, пирролидинилу и тетрагидрофуранилу.

Бициклическая кольцевая система, содержащая один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными, в соответствии с настоящим изобретением может содержать от 6 до 12 и предпочтительно от 6 до 10 кольцевых атомов, где один, два, три или четыре атома углерода могут быть заменены на одинаковые или различные гетероатомы из группы, включающей О, N и S.

Примеры включают: азабицикло[3.3.0]октил, азабицикло[4.3.0]нонил, диазабицикло[4.3.0]нонил, оксаазабицикло[4.3.0]нонил, тиазабицикло[4.3.0]нонил или азабицикло[4.4.0]децил, и радикалы, полученные из дальнейших возможных комбинаций согласно определению.

Особое предпочтение отдают пергидроциклопента[с]пирролилу, пергидрофуро[3,2-с]пиридинилу, пергидропирроло[1,2-а]пиразинилу, пергидропирроло[3,4-с]пирролилу и 3,4-метилендиоксифенилу.

Арил

Арил означает одновалентную моно- или бициклическую ароматическую кольцевую систему, состоящую из атомов углерода. Примерами являются нафтил и фенил; предпочтение отдают фенилу, или фенильному радикалу.

C₆-C₁₀-Аралкил

С_6-10-Аралкил в контексте изобретения означает моноциклический ароматический арил, в качестве примера фенил, к которому присоединена С₁-С₄-алкильная группа.

Иллюстративная С_6-10-аралкильная группа означает бензил.

Гетероарил

Гетероарил означает одновалентную моноциклическую, бициклическую или трициклическую ароматическую кольцевую систему, которая содержит 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 кольцевых атомов ("5-14-членная гетероарильная" группа), в особенности, 5, 6, 9 или 10 кольцевых атомов, и содержит по меньшей мере один кольцевой гетероатом и необязательно один, два или три дополнительных кольцевых гетероатомов из группы, состоящей из N, О и S, и присоединена через кольцевой атом углерода или необязательно (когда позволяет валентность) через кольцевой атом азота.

Гетероарильная группа может представлять собой 5-членную гетероарильную группу, например, тиенил, фурил, пирролил, оксазолил, тиазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, оксадиазолил, триазолил, тиадиазолил или тетразолил; или 6-членную гетероарильную группу, например, пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил или триазинил; или трициклическую гетероарильную группу, например, карбазолил, акридинил или феназинил; или 9-членную гетероарильную группу, например, бензофуранил, бензотиенил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензимидазолил, бензотиазолил, бензотриазолил, индазолил, индолил, изоиндолил, индолизинил или пуринил; или 10-членную гетероарильную группу, например, хинолинил, хиназолинил, изохинолинил, циннолинил, фталазинил, хиноксалинил или птеридинил.

В общем, и если не указано иначе, гетероарильные радикалы включают все возможные свои изомерные формы, например, таутомеры и позиционные изомеры в отношении места присоединения к остальной части молекулы. Таким образом, в качестве иллюстративного, неисключительного примера, термин пиридинил включает пиридин-2-ил, пиридин-3-ил и пиридин-4-ил; или термин тиенил включает тиен-2-ил и тиен-3-ил.

С₅-С₁₀-Гетероарил

С_5-10-Гетероарил в контексте изобретения означает моно- или бициклическую ароматическую кольцевую систему, содержащую один, два, три или четыре гетероатома, которые могут быть одинаковыми или различными. Гетероатомами, которые могут встречаться в данном случае, являются: N, О, S, S(=O) и/или S(=O)₂. Связывающая валентность может находиться на любом ароматическом атоме углерода или на атоме азота.

Моноциклический гетероарильный радикал в соответствии с настоящим изобретением содержит 5 или 6 кольцевых атомов.

Предпочтение отдают гетероарильным радикалам, содержащим один или два гетероатома. Особое предпочтение отдают в данном случае одному или двум атомам азота.

Гетероарильные радикалы, содержащие 5 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

тиенил, тиазолил, фурил, пирролил, оксазолил, имидазолил, пиразолил, изоксазолил, изотиазолил, оксадиазолил, триазолил, тетразолил и тиадиазолил.

Гетероарильные радикалы, содержащие 6 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

пиридинил, пиридазинил, пиримидинил, пиразинил и триазинил.

Бициклический гетероарильный радикал в соответствии с настоящим изобретением содержит 9 или 10 кольцевых атомов.

Гетероарильные радикалы, содержащие 9 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

фталидил, тиофталидил, индолил, изоиндолил, индазолил, бензотиазолил, бензофурил, бензотиенил, бензимидазолил, бензоксазолил, азоцинил, индолизинил, пуринил, индолинил.

Гетероарильные радикалы, содержащие 10 кольцевых атомов, включают, например, следующие кольца:

изохинолинил, хинолинил, хинолизинил, хиназолинил, хиноксалинил, циннолинил, фталазинил, 1,7- и 1,8-нафтиридинил, птеридинил, хроманил.

Гетероалкокси

Гетероалкокси означает прямоцепочечную и/или разветвленную гидрокарбильную цепь, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и присоединена к остальной части молекулы через -О- и дополнительно может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами -О-, -S-, -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -NR_y-, -NR^yC(=O)-, -C(=O)-NR^y-, -NR^yNR^y-, -S(=O)₂-NR^yNR^y-, -C(=O)-NR^yNR^y-, -CR^x=N-O-, и где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^y в каждом случае означает -Н, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, который, в свою очередь, может быть замещен в каждом случае с помощью -NH-C(=O)-NH₂, -С(=O)-ОН, -ОН, -NH₂, -NH-C(=NNH₂)-, сульфонамида, сульфона, сульфоксида, или сульфоновой кислоты.

В данном контексте, R^x означает -Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

Галоген или атом галогена в контексте изобретения означает фтор (-F), хлор (-Cl), бром (-Br), или йод (-I).

Фторалкил, фторалкенил и фторалкинил означает, что алкил, алкенил и алкинил может быть моно- или полизамещен фтором.

Пролекарства ингибитора белка кинезина веретена предпочтительно имеют следующую формулу (III):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой -Н, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -MOD, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHC(=O)NH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COOH)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -MOD, или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или С_5-10-гетероциклоалкильную группу,

которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомов галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-СО-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)г групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(СН₂)_0-3Z групп, где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, n представляет собой 0, 1 или 2, Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z' -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -H, -SO₃H, -NH₂ или -СООН,

(где "алкил" предпочтительно представляет собой С_1-10алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, F, Cl, Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -H, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, (необязательно фторированный) С_4-10-циклоалкил или -(СН₂)_0-2-(HZ²), где HZ² представляет собой 4-7-членный гетероцикл, содержащий вплоть до двух гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, где каждая из этих групп может быть замещена с помощью -ОН, -CO₂H или -NH₂;

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или С₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHC(=O)-, -C(=O)NH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, и

G3 представляет собой Н или СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

и включают их соли, сольваты и соли сольватов.

Путем замещения атома водорода в R¹, R², R³, R⁴, R⁵ или R⁸ или в пирролидиновом кольце (R¹⁰), образованном R² и R⁴, способом, известным среднему специалисту в данной области техники, соединение формулы (III) можно присоединить к линкеру. Это дает конъюгаты формулы (IIa), где один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁸ или R¹⁰ представляет собой -L-#1, L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному. Если ингибитор KSP (или KSP-L) в соответствии с формулой (IIa) конъюгирован со связующим, то один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R^5, R⁸ или R¹⁰ таким образом представляет собой -L-#1, где L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному. Другими словами, в случае конъюгатов, один из заместителей R¹, R², R³, R⁴, R^5, R⁸ и R¹⁰ представляет собой -L-#1, где -L-#1 присоединен к связующему, например, антителу. Особенно предпочтительно, один из заместителей R¹, R³ или R⁴ представляет собой -L-#1. Связующее предпочтительно представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-EGFR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-HER2 антитело. Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителам ТРР-2090 и ТРР-2658, или анти-EGFR антителам цетуксимабу или нимотузумабу или HER-2 антителу трастузумабу.

Также возможно, чтобы в соединении формулы IIa взамен -L-#1 присутствовала группа -L-#3, где L представляет собой линкер и #3 представляет собой реакционно-способную группу для присоединения к связующему или его производному. Соединения, включающие -L-#3, представляют собой реакционноспособные соединения, которые реагируют со связующим или его производным. #3 предпочтительно означает группу, которая реагирует с амино или тиольной группой с образованием ковалентной связи, предпочтительно с остатком цистеина в белке. Остаток цистеина в белке может иметь природное происхождение, может быть введен биохимическими методами или, предпочтительно, может быть образован путем предварительного восстановления дисульфидных фрагментов связующего.

Когда R¹ не означает Н, атом углерода, к которому присоединяется R¹, является стереоцентром, который может находиться в L и/или D конфигурации, предпочтительно в L конфигурации.

Когда R² не означает Н, атом углерода, к которому присоединяется R², является стереоцентром, который может находиться в L и/или D конфигурации.

Соединения формулы (IIa), в которой один из заместителей R¹, R³, и R⁴ представляет собой -L-#1, и в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

являются особенно предпочтительными,

в особенности предпочтительными являются те, в которых

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N. Особое предпочтение отдают соединениям, в которых X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N.

Для А предпочтение отдают СО (карбонил).

Предпочтительными для R¹ являются -L-#1, -MOD, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или -NH₂. Если R⁴ представляет собой -L-#1, R¹ предпочтительно означает -MOD (в особенности, если R³ не представляют собой -MOD).

Предпочтительным для R² является -Н.

Предпочтительными для R⁴ являются -Н, -L-#1 или расщепляемая легумаином группа формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-. Как описано выше, в данном случае, -L-#1 содержит группу формулы -(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂COX)-CO*-, где карбонильная группа (L-)аспарагина или (L-)аспарагиновой кислоты (обозначенная с помощью *) присоединена непосредственно к атому азота, который присоединен к R⁴ в вышеприведенной формуле. Если R⁴ представляет собой -L-#1, R¹ или R³ предпочтительно означает -MOD.

Предпочтительными для R³ являются -L-#1, -MOD или С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-С(=O)-NH-алкила, NH-С(=O)-алкила, NH-C(=O)-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил). Если R⁴ представляет собой -L-#1, R³ предпочтительно означает -MOD (в особенности, если R¹ не представляют собой -MOD).

Предпочтительным для R⁵ являются -Н или -F.

Предпочтительными для R⁶ и R⁷, независимо друг от друга, являются -Н, (необязательно фторированный) С_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген.

Предпочтительными для R⁸ являются разветвленная C_1-5-алкильная группа, в частности группа формулы -С(СН₃)₂-(СН₂)_0-2-R_y, где R_y представляет собой -Н, -ОН, -CO₂H или -NH₂. Особое предпочтение отдают группе формулы -С(СН₃)₂-(СН₂) -R_y, где R_y представляет собой -Н.

Предпочтительными для R⁹ являются -Н или -F.

Предпочтительным для -MOD является HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-СО-, где x представляет собой число от 2 до 6, X представляет собой -Н, -NH₂ или -СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO- (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-).

В особенности, предпочтительными являются соединения формулы (IIa), в которой один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А представляет собой -С=(O)-;

R¹ представляет собой -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или NH₂;

R² представляет собой -Н;

R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

R³ представляет собой фенильную группу, которая может быть моно- или полизамещена галогеном (в частности, F) или необязательно фторированным C_1-3-алкилом, или представляет собой необязательно фторированную С_1-10-алкильную группу, которая необязательно может быть замещена с помощью -OY⁴, -SY⁴, -O-CO-Y⁴, -O-CO-NH-Y⁴, NH-CO-Y⁴, -NH-CO-NH-Y⁴, S(O)_n-Y⁴ (где n представляет собой 0, 1 или 2), -SO₂-NH-Y⁴, NH-Y⁴ или N(Y⁴)₂, где Y⁴ представляет собой Н, фенил (необязательно моно- или полизамещенный галогеном (в частности, F) или необязательно фторированным C_1-3-алкилом), или алкил (где алкильная группа может быть замещена с помощью -ОН, -СООН, и/или -NHCO-C_1-3-алкила и где алкил предпочтительно представляет собой С_1-3-алкил);

где особенно предпочтительно R³ может быть замещена с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-CO-NH-алкила, -NH-CO-алкила, -NH-CO-NH-алкила, -S(O)_n-алкила, -SO₂-NH-алкила, -NH-алкила, -N(алкила)₂ или -NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2 (где алкил предпочтительно означает C_1-3-алкил),

R⁵ означает -H или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ представляет собой -Н или -F.

В особенности, предпочтительными являются также соединения формулы (IIa), в которой заместитель R⁴ представляет собой -L-#1, и

в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и X₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и X₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А представляет собой СО (карбонил);

R¹ представляет собой -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂, -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -H или -NH₂, или HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-CO-, где X означает число от 2 до 6, X представляет собой -Н, -NH₂ или -СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO-, (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; НООС-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-).

R² представляет собой -Н;

R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными) или HOOC-(CHX)_x-AM-CH₂-CH₂-NH-CO-, где X означает число от 2 до 6, X представляет собой Н, NH₂ или СООН, и AM представляет собой -CO-NH- или -NH-CO-, (особое предпочтение отдают HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; НООС-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-) или -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ означает -Н или -СОСН₃;

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ представляет собой -Н или -F.

Кроме того, является предпочтительным, когда (отдельно или в комбинации)

• R¹ представляет собой -L-#1, -СООН, НООС-СН₂-СН₂-СН(СООН)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO- или -Н,

• R² представляет собой -Н,

• R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

• А представляет собой -С(=O)-,

• R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными), HOOC-CH₂-CH₂-CH(COOH)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-), -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ означает -Н или -СОСН₃, или представляет собой -L-#1;

• R⁵ представляет собой -Н,

• R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, С_1-3-алкил или галоген; в частности, R⁶ и R⁷ представляют собой -F;

• R⁸ представляет собой С_1-4-алкил (предпочтительно трет-бутил); и/или

• R⁹ представляет собой -Н,

• где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1.

Дополнительно, в соответствии с изобретением является предпочтительным, когда

• R¹ представляет собой -L-#1, -СООН, НООС-СН₂-СН₂-СН(СООН)-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-CH₂-CH₂-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-CO-; HOOC-CH(NH₂)-(CH₂)₄-NH-CO-CH₂-CH₂-NH-CO- или -Н,

• R² представляет собой -Н,

• R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-)

• А представляет собой -С(=O),

R³ представляет собой -(СН₂)ОН, -СН(СН₃)ОН, -CH₂SCH₂CH(COOH)NHCOCH₃, -СН(СН₃)ОСН₃, фенильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 атомов галогена, 1-3 аминогрупп или 1-3 алкильных групп (которые необязательно могут быть галогенированными), или представляет собой -L-#1,

• R⁵ представляет собой -Н,

• R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, C_1-3-алкил или галоген; в частности, R⁶ и R⁷ представляют собой -F;

• R⁸ представляет собой С_1-4-алкил (предпочтительно трет-бутил); и

• R⁹ представляет собой -Н,

• где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1.

Кроме того, предпочтение отдают в соответствии с изобретением следующим ADC или APDC:

Формула (IIb):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), R¹, R², R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), А представляет собой -С(=O)-, В представляет собой одинарную связь, -О-СН₂- или -СН₂-О- и R²⁰ представляет собой NH₂, F, CF₃ или CH₃ и n представляет собой 0, 1 или 2.

Формула (IIc):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIIa) или (III) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), A, R¹, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), где А предпочтительно представляет собой -С(=O)- и R³ представляет собой -СН₂ОН, -СН₂ОСН₃, -СН(СН₃)ОН или -СН(CH₃)OCH₃, и LEG представляет собой расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, где R²¹, Р2 и Р3 имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa).

Формула (IId):

где X₁, Х₂, Х₃ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa) (где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N), A, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa), где А предпочтительно означает -С(=O)- и R³ означает -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -COCH₃, и LEG представляет собой расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-, где R²¹, Р2 и Р3 имеют такие же значения, как указано для формулы (IIa).

Формула (IIe):

где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N, A, R³, R⁶, R⁷, R⁸ и R⁹ имеют такие же значения, как указано для формулы (IIIa) или (III) и R¹ представляет собой -L-#.

Кроме того, является предпочтительным, когда в соединениях формул (IIa), (IIb), (IIc), (IId) и (IIe) (отдельно или в комбинации):

• Z представляет собой -Cl или -Br;

• R¹ представляет собой -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -СО-NY¹Y², где Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' и Y¹ представляет собой -Н, -NH₂ или -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z';

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -СООН;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один из радикалов Y⁴ представляет собой изопропил, а другой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один из радикалов Y⁴ представляет собой -СН₃, а другой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂;

• по меньшей мере один типичный представитель Y⁴ выбирают из изопропила и -СН₃;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -CONHCHY⁴COOH и Y⁴ представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

• Y⁴ представляет собой аминобензил;

• R² представляет собой -(CH₂)_0-3Z и Z представляет собой -SY³;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой Н;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -СО-CHY⁶-NH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂.

Кроме того, является предпочтительным, когда R¹, R² или R³ в формуле (IIa) представляет собой -MOD, в частности, когда R⁴ представляет собой -L-#1 (в частности, когда -L означает расщепляемый линкер, который расщепляется непосредственно по -N-R⁴ или -N-L-#1, так что R⁴ или L заменяется на Н).

Особенно предпочтительно, R³ представляет собой -MOD и R¹ или R⁴ представляет собой -L-#1 или -L-СВЯЗУЮЩЕЕ,

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -O-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -С(=O)-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН; и

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН.

Особенно предпочтительно, группа -MOD содержит (предпочтительно концевую) -СООН группу, например, в бетаиновой группе. Предпочтительно, группа -MOD имеет формулу -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y6 представляет собой -Н или -СОСН₃.

Кроме того, является предпочтительным, когда (отдельно или в комбинации) в формуле (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe):

• Z представляет собой -Cl или -Br;

• R¹ представляет собой -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -CONY¹Y², где Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)_0-3-(СН₂)_0-3Z' и Y¹ представляет собой -Н, -NH₂ или -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z';

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -(CH₂CH₂O)₃-CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -СООН;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z' и Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один типичный представитель Y⁴ представляет собой изопропил, а другой представляет собой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -(CONHCHY⁴)₂COOH и один типичный представитель Y⁴ представляет собой -CH₃, а другой представляет собой -(CH₂)₃-NHCONH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂;

• по меньшей мере один типичный представитель Y⁴ выбирают из группы, состоящей из изопропила и -СН₃.

• Y¹ представляет собой -Н, Y² представляет собой -CH₂CH₂Z', Z' представляет собой -CONHCHY⁴COOH и Y⁴ представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

• Y⁴ представляет собой аминобензил;

• R² представляет собой -(CH₂)_0-3Z и Z представляет собой -SY³;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -Н;

• R⁴ представляет собой -CO-CHY⁴-NHY⁵ и Y⁵ представляет собой -СО-CHY⁶-NH₂;

• Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный С_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂.

Кроме того, предпочтение отдают соединениям формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe), где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, NH₂, -SO₃H, -COOH, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH,

где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный С_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

А представляет собой -С(=O)-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых имеет 1-3 атома галогена), 1-3 О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH((CH₂CH₂O)1-20H) групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где n представляет собой 0, 1 или 2, Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(СН₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно означает С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -MOD, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, циано, (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил, гидрокси, -NO₂, NH₂, -СООН или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-10-алкинил или (необязательно фторированный) С4-10-циклоалкил;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет или ни один из них не представляет собой -L-#1,

L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-G3, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или то R¹⁰ не означает -NH₂);

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-C₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

G3 представляет собой -Н или -СООН;

где -MOD группа предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

и их солям, сольватам и солям сольватов.

Кроме того, предпочтение отдают соединениям формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId) или (IIIe), в которой

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N; или

X₁ представляет собой NH, Х₂г представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН или CF, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

(где предпочтительно X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N);

R¹ представляет собой Н, -L-#1, -MOD или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -NHY³, -OY³, -SY³, галоген, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂, -(CH₂CH₂O)_0-3-(CH₂)_0-3Z' (например, -(CH₂)_0-3Z') или -CH(CH₂W)Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z' где Z' представляет собой -Н, -NH₂, -SO₃H, -СООН, -NH-CO-CH₂-CH₂-CH(NH₂)COOH или -(CO-NH-CHY⁴)_1-3COOH, где W представляет собой -Н или -ОН,

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂;

R² представляет собой -Н, -CO-CHY⁴-NHY⁵ или -(CH₂)_0-3Z,

где Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

где Y⁴ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил, который необязательно замещен с помощью -NHCONH₂, или представляет собой арил или бензил, которые необязательно замещены с помощью -NH₂, и Y⁵ представляет собой -Н или -CO-CHY⁶-NH₂, где Y⁶ представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C_1-6-алкил;

R⁴ представляет собой -Н или расщепляемую легумаином группу R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-,

А представляет собой -С(=O), -S(=O), -S(=O)₂-, -S(=O)₂NH- или -C(=NNH₂)-;

R³ представляет собой -L-#1, -MOD или необязательно замещенную алкильную, циклоалкильную, арильную, гетероарильную, гетероалкильную, гетероциклоалкильную группу, предпочтительно С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную или C_5-10-гетероциклоалкильную группу, которая может быть замещена с помощью 1-3 -ОН групп, 1-3 атомов галогена, 1-3 галогенированных алкильных групп (каждая из которых содержит 1-3 атомами галогена), 1-3 -О-алкильных групп, 1-3 -SH групп, 1-3 -S-алкильных групп, 1-3 -О-СО-алкильных групп, 1-3 -O-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-алкильных групп, 1-3 -NH-CO-NH-алкильных групп, 1-3 -S(O)_n-алкильных групп, 1-3 -SO₂-NH-алкильных групп, 1-3 -NH-алкильных групп, 1-3 -N(алкильных)₂ групп, 1-3 -NH((CH₂CH₂O)1-20H) групп, 1-3 -NH₂ групп или 1-3 -(CH₂)_0-3Z групп, где n представляет собой 0, 1, или 2, Z представляет собой -Н, галоген, -OY³, -SY³, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³, где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой Н, NH₂ или -(CH₂)_0-3Z' и Y³ представляет собой Н, -(СН₂)_0-3-CH(NHCOCH₃)Z', -(CH₂)_0-3-CH(NH₂)Z' или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой Н, SO₃H, NH₂ или СООН (где "алкил" предпочтительно означает С_1-10-алкил);

R⁵ представляет собой -Н, -MOD, -NH₂, -NO₂, галоген (в частности, -F, -Cl, -Br), -CN, -CF₃, -OCF₃, -CH₂F, -CH₂F, -SH или -(CH₂)_0-3Z, где Z представляет собой -Н, -OY³, -SY³, галоген, -NHY³, -CO-NY¹Y² или -CO-OY³,

где Y¹ и Y² независимо друг от друга представляют собой -Н, -NH₂ или -(CH₂)_0-3Z', и Y³ представляет собой -Н или -(CH₂)_0-3Z', где Z' представляет собой -Н, -SO₃H, -NH₂ или -СООН;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н или галоген (в частности, -F, -Cl, -Br),

R⁸ представляет собой (необязательно фторированный) С_1-10-алкил;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет или ни один из них не представляет собой -L-#1,

L представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к связующему или его производному,

R⁹ представляет собой -Н, -F, -СН₃, -CF₃, -CH₂F или -CHF₂;

где -MOD представляет собой -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -СОСН₃,

и его солям, сольватам, солям сольватов и эпимерам.

Особое предпочтение в соответствии с изобретением отдают следующим соединениям формул V, VI и VII, где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ имеют значения, упомянутые выше (как упомянуто, например, для формулы (IIa)):

Особое предпочтение отдают соединениям формул V, VI, VII, где R¹ и R⁵ представляют собой Н или -L-#1; R² представляет собой Н; R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-, где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His; P3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1. В особенности, предпочтительными являются соответствующие соединения формулы VI.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC) в соответствии с изобретением предпочтительно имеют следующую формулу VIII:

где

m означает число от 0 до 2;

n представляет собой 0 или 1;

X означает -CONH₂ или -СООН;

L_a представляет собой саморасщепляющийся линкер;

L_c представляет собой линкер;

A₁ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

A₂ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

D1 означает соединение формулы III;

R представляет собой Z₁-(CO)_q-, где q представляет собой 0 или 1 и Z₁ представляет собой С_1-10-алкильную, C_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_5-10-гетероарилалкокси, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, -NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R¹ представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂), и АВ представляет собой антитело, и s означает число от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 8, более предпочтительно от 3 до 5, например, 4.

Конъюгаты антитело-пролекарство (APDC) в соответствии с изобретением предпочтительно имеют следующую формулу IX:

где

m означает число от 0 до 2;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1;

X означает -CONH₂ или -СООН;

L_a представляет собой саморасщепляющийся линкер;

L_b представляет собой линкер;

A₁ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

A₂ означает радикал, который является производным из одной из аминокислот - Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот (когда присутствует более одного Р3, Р3 могут иметь различные значения);

D1 означает соединение формулы III;

R представляет собой Z₁-(CO)_q-, где q представляет собой 0 или 1 и Z₁ представляет собой С_1-10алкильную, С_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, C_5-10-гетероарилалкокси, С_1-10алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью -NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, -NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R¹ группу (где x представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R¹ представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂), и АВ представляет собой антитело, и s означает число от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 8, более предпочтительно от 3 до 5, например, 4.

Линкеры

В литературе раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул со связующими, такими как, например, антитела (см., например, K. Lang и J.W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, М. Rashidian и др. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Предпочтение в соответствии с изобретением отдают конъюгированию KSP ингибиторов или пролекарства к антителу через один или несколько атомов серы остатков цистеина антитела, которые либо уже присутствуют в виде свободных тиолов, либо образуются путем восстановления дисульфидных мостиков, и/или через один или несколько групп NH остатков лизина антитела. Тем не менее, также можно присоединить KSP ингибитор или пролекарство к антителу через остатки тирозина, через остатки глутамина, через остатки аминокислот не природного происхождения, через свободные карбоксильые группы или через остатки сахаров антитела.

В соответствии с изобретением также возможно конъюгировать молекулы лекарственных средств со специфическими конъюгационными сайтами связующего, что улучшает гомогенность продукта. В литературе описаны различные методы конъюгационный сайт-специфического конъюгирования (Agarwal и др., Bioconjug. Chem. 26, 176-192 (2015); Cal и др., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 10585-10587 (2014); Behrens и др., MAbsA, 46-53 (2014); Panowski и др., MAbs 6, 34-45 (2014)). Эти методы также включают, в частности, методы ферментативного конъюгирования, в которых применяют, например, трансглутаминазы (TGазы), гликозилтрансферазы или формилглицин-генерирующий фермент ((Sochaj и др., Biotechnology Advances 33, 775-784, (2015)).

В соответствии с изобретением, можно обеспечить конъюгаты конъюгационный сайт-специфических связующих с ингибиторами белка кинезина веретена, в которых ингибиторы белка кинезина веретена конъюгированы с глутаминовыми боковыми цепями связующих.

Когда связующее представляет собой антитело, оно содержит акцепторный глутамин, предпочтительно в константном участке. Такие акцепторные глутамины могут быть введены с помощью мутаций подходящих положений в глутамин (например, мутация N297Q тяжелой цепи, EU нумерация Кэббота) или путем создания дегликозилированных или негликозилированных антител (например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297X тяжелой цепи, EU нумерация Кэббота (X в данном случае может быть любой аминокислотой за исключением N)). В последнем случае дегликозилированного или негликозилированного антитела, остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи становится акцепторным глутамином. Особое предпочтение отдают антителу, содержащему N297A или N297Q мутацию (EU нумерация Кэббота). Следовательно, все антитела, описанные в данном изобретении, также включают негликозилированные варианты этих антител, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (EU нумерация Кэббота) (система нумерации антител Кебота, см. Kabat и др., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд. (1991)) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту, за исключением N. Кроме того, все антитела, описанные в настоящей заявке, также содержат варианты описанных антител, которые благодаря конструированию содержат один или несколько акцепторных остатков глутамина для реакций, катализируемых трансглутаминазой.

Один из способов такого конъюгационный сайт-специфического конъюгирования представляет собой подходы, описанные в литературе, которые касаются конъюгационный сайт-специфического конъюгирования связующих с помощью трансглутаминазы. Трансглутаминазы (ТГазы), которые также включают бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13), представляют собой семейство ферментов, которые катализируют образование ковалентной связи между γ-карбониламидной группой глутаминов и первичной аминогруппой лизинов. Поскольку такие трансглутаминазы также акцептируют субстраты, отличающиеся от лизина в качестве донора амина, то их можно применять для модификации белков, включая антитела, на подходящих акцепторных глутаминах (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010); Josten и др., J. Immunol. Methods 240, 47-54 (2000); Mindt и др., Bioconjugate Chem. 19, 271-278 (2008); Dennler и др., в Antibody Drug Conjuagtes (Ducry, L., ред.), cc. 205-215, Humana Press. (2013)). С одной стороны, трансглутаминазы были применены для конъюгирования лекарственных препаратов с антителами, содержащими искусственные глутаминовые метки, которые являются акцепторными остатками глутамина, которые были введены в антитело с помощью генетической инженерии (Strop и др., Chem. Biol. 20, 161-167 (2013)). С другой стороны, было заявлено, что консервативный остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) константного участка тяжелой цепи антител представляет собой только γ-карбониламидный донор для бактериальной трансглутаминазы (ЕС 2.3.2.13) в пределах каркаса негликозилированных IgG1 молекул, и является, таким образом, акцепторным глутамином, тогда как акцепторный глутамин отсутствует в пределах каркаса IgG1, когда антитело гликозилировано в положении N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)). В заключение, бактериальную трансглутаминазу можно применять для конъюгирования аминодонорного субстрата, например, конструкта лекарственное средство-линкер, по остатку акцепторного глутамина антитела. Такие акцепторные глутамины могут быть введены путем конструирования антитела с помощью мутаций или путем создания негликозилированных антител. Такие негликозилированные антитела могут быть введены путем дегликозилирования с использованием N-гликозидазы F (ПНГаза F) или путем мутации N297 сайта гликозилирования тяжелой цепи (EU нумерация Кэббота) на любую другую аминокислоту, исключением N. Ферментативное конъюгирование таких негликозилированных антител с применением бактериальной трансглутаминазы было описано для негликозилированных вариантов антител, содержащих мутации N297D, N297Q (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) или N297S (см. патентные заявки WO 2013092998 A1 и WO 2013092983 A2). Ферментативное конъюгирование таких негликозилированных антител с помощью трансглутаминазы обычно обеспечивает ADC, имеющие DAR 2, в которых обе тяжелые цепи специфически функционализированы в положении Q295 (EU нумерация Кэббота). Только мутация N297Q тяжелой цепи обеспечивает дополнительный сайт конъюгирования на тяжелой цепи. Конъюгирование таких вариантов приводит к ADC, имеющим DAR 4, в которых обе тяжелые цепи специфически функционализированы в положениях Q295 и Q297.

Варианты антител, в которых тяжелые цепи несут мутации Q295N и N297Q, содержат только один остаток акцепторного глутамина в положении Q297 (номенклатура Кэбота) на тяжелую цепь (Simone Jeger, Site specific conjugation of tumour targeting antibodies using transglutaminase, Thesis at ETH Zurich (2009)). В литературе представлено несколько примеров, которые описывают конъюгационный сайт-специфическое конъюгирование негликозилированных антител с применением бактериальной трансглутаминазы (например, Dennler и др., Bioconjugate Chemistry 19, 569-578 (2014); Lhospice и др., Molecular Pharmaceutics 12, 1863-1871 (2015)). Стратегия катализируемой трансглутаминазой конъюгационный сайт-специфической функционализации негликозилированных антител обобщена на Фигуре 3.

Сочетание - как конъюгационный сайт-специфическим, так и конъюгационный сайт-неспецифическом образом - осуществляют с применением так называемых линкеров. Линкеры могут быть классифицированы на группу линкеров, которые могут быть расщеплены in vivo, и группу линкеров, которые являются стабильными in vivo (см. L. Ducry и В. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)). Линкеры, которые могут быть расщеплены in vivo, имеют группу, которая может быть расщеплена in vivo, где, в свою очередь, различие можно провести между группами, которые расщепляются in vivo химически и группами, которые расщепляются in vivo ферментативно. "Химически расщепляемые in vivo" и "ферментативно расщепляемые in vivo" означает, что линкеры или группы стабильны в системе кровообращения и расщепляются только на или в целевой клетке посредством химически или ферментативно отличной окружающей среды в этом месте (сниженное рН; повышенная концентрация глутатиона; присутствие лизосомальных ферментов, таких как легумаин, катепсин или плазмин, или гликозидазы, такие как, например, β-глюкуронидазы), таким образом высвобождая низкомолекулярный KSP ингибитор или его производное. Группами, которые могут быть расщеплены химически in vivo, являются, в частности, дисульфид, гидразон, ацеталь и аминаль; группами, которые могут быть расщеплены ферментативно in vivo, являются, в частности 2-8-олигопептидная группа, в особенности, дипептидная группа или гликозид. Сайты расщепления пептидов раскрыты в Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869 и Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346, а также Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. Они включают, например, аланин-аланин-аспарагин, валин-аланин, валин-лизин, валин-цитруллин, аланин-лизин и фенилаланин-лизин (необязательно с дополнительной амидной группой).

Для того чтобы обеспечить эффективное высвобождение свободного лекарственного средства, необязательно также можно включить так называемые саморасщепляющиеся линкерные элементы (SIG, например, в вышеприведенной формуле IIa или La, в вышеприведенных формулах VIII и IX) между ферментативным сайтом расщепления и лекарственным средством (Anticancer Agents in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 618-637). Лекарственное средство может быть высвобождено различными механизмами, например, после первоначального ферментативного высвобождения нуклеофильной группы, путем последующей элиминации с помощью электронного каскада (Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1597; J. Med. Chem., 2002, 45, 937; Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 71) или путем циклизации соответствующего линкерного элемента (Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 2277; Bioorg. Med. Chem., 2007, 15, 4973; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007, 17, 2241) или с помощью комбинации таких двух механизмов (Angew. Chem. Inter. Ed., 2005, 44, 4378). Примеры таких линкерных элементов показаны на фигуре:

Примеры последовательных ферментативных стадий высвобождения лекарственного средства, например, с помощью гистондеацетилазы и катепсина L, описаны в Nat. Commun., 2013, 4, 2735 (см. Фигуру 4).

Линкеры, которые являются стабильными in vivo, отличаются высокой стабильностью (меньше, чем 5% метаболитов через 48 часа в плазме) и не имеют химически или ферментативно in vivo расщепляемых групп, указанных выше.

Линкер -L- (подобный Lc в формуле VIII и также Lb в формуле IX) предпочтительно имеет одну из следующих основных структур (i)-(iv):

(i) -(C=O)_m-SG1-L1-L2-

(ii) -(C=O)_m-L1-SG-L1-L2-

(iii) -(C=O)_m-L1-L2-

(iv) -(C=O)_m-L1-SG-L2

где m представляет собой 0 или 1; SG означает (химически или ферментативно) in vivo расщепляемую группу (в частности, дисульфид, гидразон, ацеталь и аминаль; или 2-8-олигопептидную группу, которая может быть расщеплена с помощью легумаина, катепсина или плазмина), SG1 означает олигопептидную группу или предпочтительно дипептидную группу, L1 представляют собой in vivo стабильные органические группы, и L2 представляет собой соединяющую группу со связующим или одинарную связь. В данном случае сочетание имеет место предпочтительно с остатком цистеина или остатком лизина антитела. Альтернативно, сочетание может имеет место к остатку тирозина, остатку глутамина или к неприродной аминокислоте антитела. Неприродные аминокислоты могут содержать, например, альдегидные или кетонные группы (как, например, формилглицин) или азидные или алкиновые группы (см. Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806).

Особое предпочтение в соответствии с изобретением отдают основной линкерной структуре (iii). Посредством метаболизации, введение конъюгата в соответствии с изобретением, имеющего основную линкерную структуру (iii) и сочетание линкера с остатком цистеина или лизина антитела, приводит к производным цистеина или лизина следующих формул:

где L1 в каждом случае присоединен к низкомолекулярному KSP ингибитору, например, соединению формулы (III) или (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), или (IV), где -L-#1 представляет собой один из двух радикалов выше, которые являются производными лизина и цистеина соответственно.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают основным линкерным структурам (ii) и (iv), в частности, когда присоединение осуществлено в положении R¹, в частности, когда группа L1 имеет одну из следующих структур:

(a) -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-Y⁷, где Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -COCH₃, и Y⁷ представляет собой одинарную связь или -NH -(СН₂)_0-4 -CHNH₂-CO-, таким образом, что после расщепления соответствующей структуры получают -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-COOH или -NH-(CH₂)_0-4-(CHCH₃)_0-4-CHY⁵-CO-NH-(CH₂)_0-4-CHNH₂-COOH.

(b) -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-CO-, где X означает 0 или 1, и Y⁵ представляет собой -Н или -NHY⁶, где Y⁶ представляет собой -Н или -СОСН₃, таким образом, что после расщепления соответствующей структуры получают -CH₂-S_x-(CH₂)_0-4-CHY⁵-COOH.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают основной линкерной структуре (i), при присоединении к положению R⁴, в частности, если m=0.

Если линкер присоединен к цистеиновой боковой цепи или остатку цистеина, группа L2 предпочтительно представляет собой производное из группы, которая реагирует с сульфгидрильной группой цистеина. Такие группы включают галогенацетилы, малеимиды, азиридины, акрилоилы, арилирующие соединения, винилсульфоны, пиридилдисульфиды, TNB тиолы и дисульфид-восстановители. Эти группы обычно реагируют электрофильным путем с сульфгидрильной связью, образуя сульфидный (например, простой тиоэфирный) или дисульфидный мостик. Предпочтение отдают стабильным сульфидным мостикам. L2 предпочтительно означает

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹, и

R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONHR, -CONR₂ (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

Особенно предпочтительным для L2 является:

или

где #¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела, #² обозначает место присоединения к лекарственному средству, x представляет собой 1 или 2, и R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONR₂, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН. Является предпочтительным, когда х=1 и R²² представляет собой -СООН.

В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина антитела присутствуют в степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к антителу), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы A3 или А4. В данном случае структуры формулы A3 или А4 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к антителу. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

В соответствии с изобретением, L1 предпочтительно представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (R¹⁰ предпочтительно не означает NH₂, если G1 представляет собой -NHCO- или

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 100 атомов углерода из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, -C(NH)NR^y-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y- (где R^y представляет собой -H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил) и/или 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 5-10-членным ароматическим или неароматическим гетероциклом, содержащим вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

G2 предпочтительно представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил) и 3-10-членного, например, 5-10-членного, ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂) -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

Дополнительными прерывающими группами в G2 предпочтительно являются

где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил.

В данном случае #1 означает связь к KSP ингибитору или пролекарству и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2).

Прямоцепочечная или разветвленная углеводородная цепь ариленовых групп и/или прямоцепочечные и/или разветвленные и/или циклические алкиленовые группы обычно включает α,ω-двухвалентный алкильный радикал, содержащий соответствующее указанное число атомов углерода. Предпочтительные примеры включают: метилен, этан-1,2-диил (1,2-этилен), пропан-1,3-диил (1,3-пропилен), бутан-1,4-диил (1,4-бутилен), пентан-1,5-диил (1,5-пентилен), гексан-1,6-диил (1,6-гексилен), гептан-1,7-диил (1,7-гексилен), октан-1,8-диил (1,8-октилен), нонан-1,9-диил (1,9-нонилен), декан-1,10-диил (1,10-децилен). Тем не менее, алкиленовые группы в углеводородной цепи также могут быть разветвленными, то есть один или несколько атомов водорода прямоцепочечных алкиленовых групп, указанных выше, необязательно могут быть замещены C1-10-алкильными группами, таким образом образуя боковые цепи. Углеводородная цепь может дополнительно содержать циклические алкиленовые группы (циклоалкандиил), например, 1,4-циклогександиил или 1,3-циклопентандиил. Эти циклические группы могут быть ненасыщенными. В частности, ароматические группы (ариленовые группы), например, фенилен, могут присутствовать в углеводородной группе. В свою очередь, в циклических алкиленовых группах и также ариленовых группах, один или несколько атомов водорода необязательно могут быть замещены С1-10-алкильными группами. Таким путем, образуется необязательно разветвленная углеводородная цепь. Эта углеводородная цепь содержит в общей сложности от 0 до 100 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 50, особенно предпочтительно от 2 до 25 атомов углерода.

Боковые цепи, если присутствуют, могут быть моно- или полизамещены одинаково или по-разному с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, -NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

Углеводородная цепь может быть прервана один раз или более одного раза одинаково или по-разному с помощью -О-, -S-, -SO-, -SO₂-, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 5-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно

Дополнительными прерывающими группами в G2 предпочтительно являются

Предпочтительно, линкер соответствует приведенной ниже формуле:

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства и

§§ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку, и

L1 и L2 имеют значения, приведенные выше.

Особенно предпочтительно, L1 имеет формулу -NR¹¹B-, где

R¹¹ представляет собой -Н или -NH₂;

В представляет собой -[(CH₂)_x-(X⁴)_y]_w-(CH₂)_z-,

w = от 0 до 20;

х = от 0 до 5;

х = от 0 до 5;

у = 0 или 1;

z = от 0 до 5; и

X⁴ представляет собой -О-, -CONH-, -NHCO- или

Линкеры L, которые являются предпочтительными в соответствии с изобретением, имеют приведенную ниже формулу:

где

#₃ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства,

#₄ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку,

R¹¹ представляет собой -Н или -NH₂;

В представляет собой -[(CH₂)_x-(X⁴)_y]_w-(CH₂)_z-,

w = от 0 до 20;

х = от 0 до 5;

у = 0 или 1;

z = от 1 до 5; и

X⁴ представляет собой -О-, -CONH-, -NHCO- или

Предпочтение также отдают линкерам, где линкер L₁ представляет собой одну из следующих групп:

§-NH-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₆-§§;

§-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₄-§§

§-NH-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-O-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₃-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(CH₃)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-(CH₂)₄-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(C₂H₄COOH)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₃-(CH₂)₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-S(=O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₃-NH-C(=O)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH(CH₂COOH)-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH(C₂H₄COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH(CH₂OH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂COOH]-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₃-NH-C(=O)-NH₂]-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-CH(CH₃)-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-NH-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₄-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₃-NH-C(=O)-NH₂]-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₅-C(=O)-NH-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(-O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-CH(COOH)-CH₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(NH₂)-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄ -(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₅-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₂-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-(CH₂)₂-C(=O)-NH-CH(C₂H₄COOH)-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-CH₃]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH₃)-NH-C(=O)-CH(изоC₃H₇)-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-(CH₂)₂-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[NH-C(=O)-(CH₂)₂-COOH]-C(=O)-NH-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH[C(=O)-NH-(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§;

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH₂)₂CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-CH₂-§§

или

§-CH₂-S-CH₂CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH₂)₂-COOH]-NH-C(=O)-((CH₂)₂-O)₄-(CH₂)₂-NH-C(=O)-(CH₂)₂-§§, где

§ представляет собой связь к молекуле активного компонента

§§ представляет собой связь к антителу и

изоС₃Н₇ представляет собой изопропильный радикал.

Упомянутые выше линкеры являются, в особенности, предпочтительными в конъюгатах формулы (IIa), в которых линкер присоединен путем замещения атома водорода в R¹ или, в случае комбинации с расщепляемым линкером SG1, в R4, то есть R1 представляет собой -L-#1 или R4 представляет собой -SG1-L-#1, где #1 представляет собой связь к антителу.

Предпочтение в соответствии с изобретением также отдают приведенным ниже линкерам: В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина антитела присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к антителу), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А5 или А6:

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹, и

R²² представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONR₂, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

В данном случае структуры формулы А5 или А6 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к антителу. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

Другие линкеры -L-, присоединенные к цистеиновой боковой цепи или остатку цистеина, имеют следующую формулу:

где

§ представляет собой связь к молекуле лекарственного средства или пролекарства и

§§ представляет собой связь к связывающему пептиду или белку,

m представляет собой 0, 1, 2 или 3;

n представляет собой 0, 1 или 2;

p представляет собой 0 to 20; и

L3 представляет собой

где

о представляет собой 0 или 1;

и

G3 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, которая содержит от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или циклических алкиленовых групп и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного (предпочтительно 5-10-членного) ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или SO₂ (предпочтительно где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

В приведенной выше формуле, предпочтительно

m означает 1;

p означает 0;

n означает 0;

и L3 представляет собой

где

о представляет собой 0 или 1; и

G3 представляет собой -(CH₂CH₂O)_s(CH₂)_t(CONH)_u CH₂CH₂O)_v(CH₂)_w-, где

s, t, v и w каждый независимо друг от друга означают число от 0 до 20, и u представляет собой 0 или 1.

Предпочтительные группы L1 в приведенной выше формуле §-(CO)_m-L1-L2-§§ представляют собой те группы, приведенные ниже, где r представляет собой число от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 15, особенно предпочтительно от 1 до 20, в особенности, предпочтительно от 2 до 10:

Дополнительные примеры L1 приведены в Таблице С, в которой эта группа выделена обведением линией.

Примеры остатка линкера L1 приведены в Таблицах А и А' ниже. Кроме того, в таблице также указано, с какой группой L2 предпочтительно объединяют эти примеры L1, а также предпочтительное место присоединения (R¹ или R³ или R⁴) и предпочтительное значение для т, то есть, присутствует ли карбонильная группа перед L1, или нет (см. §-(CO)_m-L1-L2-§§). Эти линкеры предпочтительно соединены с остатком цистеина. Если L2 означает сукцинимид или получен из него, этот имид может также полностью или частично находиться в форме гидролизованного сукцинамида с открытой цепью, как описано выше. В зависимости от L1, этот гидролиз до сукцинамидов с открытой цепью может быть более или менее выраженным или не наблюдаться вообще.

** Особенно предпочтительно, приведенные в этих строках линкеры L1 присоединены к линкеру L2, выбранному из:

и/или

где #¹ обозначает место присоединения к атому серы связующего, #2 обозначает место присоединения к группе L¹, R₂₂ предпочтительно представляет собой СООН. В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к остатку цистеина связующего присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к связующему), особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А7 или А8. В данном случае структуры формулы А7 или А8 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к связующему. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

**: См. примечание** для Таблицы А.

***: Когда присутствует данная структура L2, одновременно может существовать структура L2 формулы ниже:

Примеры конъюгатов, содержащих соответствующие линкеры, имеют следующие структуры, где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N и L1 имеет значение, приведенное выше, L2 и L3 имеют такие же значения, что и L1, AK1 представляет собой антитело, присоединенное через остаток цистеина и n означает число от 1 до 10. Более предпочтительно, AK1 предпочтительно означает человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело. Особое предпочтение отдают негликозилированному анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

Когда линкер присоединен к лизиновой боковой цепи или остатку лизина, можно применять такие же линкеры, как описано выше для сочетания с цистеиновой боковой цепи, за исключением того, что L2 предпочтительно означает карбонильную группу (сочетание осуществляется, например, через соответствующую активированную карбоновую кислоту).

Примеры конъюгатов, имеющих основную структуру (i), имеют одну из следующих структур, где X1 представляет собой СН, Х2 представляет собой С и Х3 представляет собой N, L4 имеет такое же значение, что и L1, AK1 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток цистеина, и n означает число от 1 до 10, и атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в -NH₂ группе) заменен на расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-CO-P3-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-:

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН: Р2 означает одинарную связь или аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His;

Р3 означает одинарную связь или аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His.

Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности, негликозилированному анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

В случае конъюгатирования, катализируемого трансглутаминазой, в литературе раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул со связующими, например, антителами, конъюгационный сайт-специфическим образом (см., например, Sochaj и др., Biotechnology Advances, 33. 775-784, (2015), Panowski и др., MAbs 6, 34-45 (2014)). В соответствии с изобретением предпочтение отдают конъюгированию KSP ингибиторов или пролекарств с антителом с помощью акцепторных остатков глутамина антитела, используя трансглутаминазу. Такие акцепторные остатки глутамина могут быть образованы путем конструирования антитела или с помощью мутаций, которые создают негликозилированные антитела. Количество таких акцепторных глутаминов в антителе предпочтительно составляет 2 или 4. Для сочетания (конъюгирования) используют подходящие линкеры. Подходящими структурами линкеров являются те, которые обладают свободной аминодонорной функциональностью, которая представляет собой подходящий субстрат для трансглутаминазы. Линкер может быть присоединен к антителу различными путями.

Предпочтительно, в случае конъюгирования, катализируемого трансглутаминазой, линкер имеет одну из вышеуказанных основных структур (i) - (iv), где L1, SG, SG1 и m имеют значения, указанные выше, но L2 предпочтительно означает одну из следующих групп:

где Ry означает -Н, NHCOaлкил, -NH₂

или

где

Ry означает -СОNНалкил, -CONH₂, где

#¹ представляет собой место присоединения к L¹,

#² представляет собой место присоединения к остатку глутамина связующего.

Предпочтительно, Ry означает Н или -NHCOMe.

Примеры соответствующих конъюгатов имеют следующие структуры, где X₁, Х₂, Х₃, Ry и L1 имеют такие же значения, что и указанные выше, AK представляет собой связующее, предпочтительно антитело, где n предпочтительно означает 2 или 4:

Особенно предпочтительные конъюгаты KSP ингибитора

Особое предпочтение отдают в соответствии с изобретением конъюгатам KSP ингибитора, приведенным ниже, где AK (AK₁; AK₂; AK₃) представляют собой связующее или их производные (предпочтительно антитело), и n означает число от 1 до 50, предпочтительно от 1.2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 8. AK1 предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток цистеина; AK₂ предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток лизина; AK₃ предпочтительно означает антитело, присоединенное к ингибитору KSP через остаток глутамина. Связующие или антитела, использованные в данном случае, предпочтительно представляют собой связующие и антитела, описанные в качестве предпочтительных в описании.

Промежуточные соединения KSP ингибитор-линкер или промежуточные соединения пролекарство-линкер и получение конъюгатов

Конъюгаты в соответствии с изобретением получают, обеспечивая сначала низкомолекулярный KSP ингибитор или его пролекарство с линкером. Полученное таким путем промежуточное соединение затем подвергают реакции со связующим (предпочтительно антителом).

Предпочтительно, для сочетания с остатком цистеина, одно из соединений, указанных ниже, подвергают реакции с содержащим цистеин связующим, таким как антитело, которое необязательно частично восстанавливают для этой цели:

где R представляет собой -Н или -СООН,

где K представляет собой прямоцепочечный или разветвленный C₁-С₆алкил, который необязательно замещен с помощью C₁-С₆-алкокси или -ОН, и

где X₁ представляет собой СН, X₂ представляет собой С и X₃ представляет собой N, SG₁, L₁, L₂, L₃ и L₄ имеют такие же значения, как описано выше.

В вышеописанных формулах, также как и в схемах реакций и структурных формулах, следующих далее, атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в -NH₂ группе) может быть заменен на группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)_(1-2)-P2-

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина, и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН.

В каждом из вышеуказанных соединений и в соединениях, приведенных ниже, трет-бутильная группа может быть заменена на циклогексил.

Соединение можно использовать, например, в форме его соли с трифторуксусной кислотой. Для реакции со связующим, таким как, например, антитело, соединение предпочтительно применяют в 2-12-кратном молярном избытке относительно связующего.

Предпочтительно, для сочетания с остатком лизина, одно из соединений ниже подвергают реакции с содержащим лизин связующим, таким как антитело:

где X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N и L₄ имеет такое же значение, что и L₁, и L₁ имеет такое же значение, как и описано выше.

В случае сочетания промежуточного соединения с остатком цистеина, реакции можно проиллюстрировать следующим образом:

Другие промежуточные соединения и другие антитела может подвергать реакции соответственно.

В случае сочетания промежуточного соединения с остатком лизина, реакцию можно проиллюстрировать следующим образом:

В зависимости от линкера, сукцинимид-присоединенные ADC, после конъюгирования, могут быть превращены в сукцинамиды с открытой цепью, которые имеют выгодный профиль стабильности.

Эту реакцию (раскрытия кольца) можно проводить при рН 7.5-9, предпочтительно при рН 8, при температуре от 25°С до 37°С, например, путем перемешивания. Предпочтительное время перемешивания составляет от 8 до 30 часов.

В вышеприведенных формулах, X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N, SG₁ и L₁ имеют такие же значения, как описано выше и L₂, L₃ и L₄ имеют такие же значения, что и L1; и R и K имеют такие же значения, как описано выше. AK1 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток цистеина, и AK2 означает негликозилированное анти-TWEAKR антитело, присоединенное через остаток лизина. Более предпочтительно, AK1 и AK2 означают негликозилированное анти-TWEAKR антитело, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности негликозилированное анти-TWEAKR антитело ТРР-2658.

Дальнейшие определения

Выражение "трансглутаминаза", также используемая взаимозаменяемо с "ТГазой" или "TG", следует онимать в значении фермента, обладающего способностью сшивать белки путем реакции переноса ацила между γ-карбоксамидной группой связанного с пептидом глутамина и ε-аминогруппой лизина или структурно родственного первичного амина, например, аминопентильной группой или, например, связанного с пептидом лизина, что приводит к образованию 8-(γ-глутамил)-лизин изопептидной связи. ТГазы включают бактериальную трансглутаминазу (BTG), например, фермент, имеющий ЕС ссылка номер 2.3.2.13 (белок-глутамин γ-глутамилтрансфераза).

Выражение "акцепторный глутамин" обозначает, когда относится к аминокислотному остатку антитела, остаток глутамина, который, в подходящих условиях, распознается трансглутаминазой и может быть связан при катализе трансглутаминазой по реакции между этим специфическим глутамином и лизином или структурно родственным первичным амином, например, аминопентильной группой. Акцепторный глутамин представляет собой расположенный на поверхности глутамин.

"Аминокислотная модификация" или "мутация" в настоящей заявке означает аминокислотную замену, инсерцию и/или делецию в полипептидной последовательности. Предпочтительная аминокислота модификация в настоящей заявке представляет собой замену. "Аминокислотная замена" или "замена" в настоящей заявке означает замену аминокислоты в данном положении в белковой последовательности на другую аминокислоту. Например, замена Y50W описывает вариант родительского полипептида, в котором тирозин в положении 50 заменен на триптофан. "Вариант" полипептида описывает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по существу идентична сравнительному полипептиду, типично нативному или "родительскому" полипептиду. Полипептидный вариант может обладать одной или несколькими аминокислотными заменами, делециями и/или инсерциями в определенных положениях в нативной аминокислотной последовательности.

Выражение "конъюгационный сайт-специфический конъюгат" описывает конъюгат связующего, предпочтительно антитела, и остатка, предпочтительно остатка линкер-лекарственное средство, где связующее функционализировано в одном или нескольких определенных положениях, предпочтительно глутаминовых остатках. Трансглутаминазы (ТГазы), включая бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13), демонстрируют строгую специфичность в распознавании субстратов глутамин-белок и могут катализировать "конъюгационный сайт-специфическое конъюгирование".

Выражение "гомогенный конъюгат" или "гомогенный ADC" описывает смесь конъюгационный сайт-специфических конъюгатов, где по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% связующих имеют идентичное число конъюгированных остатков на связующее. В случае антитела, такое число должно быть четным числом, предпочтительно 2 или 4.

Связующие

В самом широком смысле, термин "связующее" следует понимать в значении молекулы, которая связывается с целевой молекулой, присутствующей в определенной целевой популяции клеток, на которую нацелен конъюгат связующего и лекарственного средства. Термин связующее следует понимать в его самом широком значении, а также включает, например, лектины, белки, способные связываться с определенными цепями сахаров, и белки, связывающие фосфолипиды. Такие связующие включают, например, высокомолекулярные белки (связывающие белки), полипептиды или пептиды (связывающие пептиды), непептидные связующие (например, аптамеры (US 5,270,163) обзор Keefe AD., и др., Nat. Rev. Drug Discov. 2010; 9:537-550), или витамины) и все другие молекулы или субстанции, связывающие клетки. Связывающие белки представляют собой, например, антитела и фрагменты антител или антитела-миметики, такие как, например, аффитела, аднектины, антикалины, дарпины, авимеры, нанотела (обзор Gebauer М. и др., Curr. Opinion in Chem. Biol. 2009; 13:245-255; Nuttall S.D. и др., Curr. Opinion in Pharmacology 2008; 8:608-617). Связывающие пептиды представляют собой, например, лиганды пары лиганд/рецептор, такие как, например, VEGF пары лиганд/рецептор VEGF/KDR, такие как трансферрин пары лиганд/рецептор трансферрин/рецептор трансферрина или цитокин/ рецептор цитокина, такой как TNFальфа пары лиганд/рецептор TNFальфа/ рецептор TNFальфа.

"Связующее" может содержать остаток акцепторного глутамина, который может быть функционализирован трансглутаминазой (ТГаза), включая бактериальную трансглутаминазу (BTG) (ЕС 2.3.2.13). Этот акцепторный глутамин может либо присутствовать в природной форме в связующем, либо его вводят специально. Акцепторный глутамин может быть образован посредством инсерции остатка глутамина в подходящем положении (например, с помощью слияния с меткой, содержащей акцепторный глутамин, или путем мутации подходящего положения с получением остатка глутамина), или акцепторный глутамин образуют путем мутации любой аминокислоты, которая приводит к превращению конкретного остатка глутамина, который ранее не распознавался трансглутаминазой, в акцепторный глутамин, или акцепторный глутамин образуют путем модификации по типу пост-трансляционной модификация (например, гликозилирования), где это изменение имеет такой эффект, что встречающийся в природе глутамин, который ранее не распознавался трансглутаминазой, становится акцепторным глутамином. Когда связующее представляет собой антитело, то оно содержит акцепторный глутамин, предпочтительно в константном участке. Такие акцепторные глутамины могут быть образованы с помощью мутаций подходящих положений в глутамин (например, мутация N297Q, EU нумерация Кэббота) или путем создания дегликозилированных или негликозилированных антител (например, путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297X, EU нумерация Кэббота). В последнем случае дегликозилированного или негликозилированного антитела, остаток глутамина Q295 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи становится акцепторным глутамином. Особое предпочтение отдают антителу, содержащему N297A или N297Q мутацию (EU нумерация Кэббота).

Термин "негликозилированный антитело" или "дегликозилированное антитело" используют в данном случае для определения антитела или производного антитела, содержащего FC участок, с отсутствием гликанов, присоединенных к консервативному сайту L-гликозилирования в СН2 домене. Негликозилированные антитела можно получить, например, путем мутации сайта гликозилирования N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи или путем экспрессии антител в экспрессирующих системах с отсутствием гликозилирующей способности. Способы дегликозилирования антител широко известны в данной области техники (например, Winkelhake & Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4):1074-80)). Дегликозилированные антитела могут быть созданы, например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F. В одном варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить путем экспрессии в прокариотических хозяевах. Подходящие прокариотические хозяева включают, но не ограничиваясь только ими, Е. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и некоторые виды из родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить с использованием экспрессионных систем с клетками млекопитающих вместе с ингибитором гликозилирования туникамицином (Nose & Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). В данном случае модификация состоит в предотвращении гликозилирования по консервативном сайту N-гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи в СН2 домене Fc участка антитела.

В литературе также раскрыты различные опции для конъюгационного сайт-специфического ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул с антителами. Особого внимания в отношении настоящего изобретения заслуживает конъюгирование токсофоров с антителами через два или четыре акцепторных глутаминовых остатках антитела.

В литературе также раскрыты различные опции для ковалентного сочетания (конъюгирования) органических молекул с антителами. Предпочтение в соответствии с изобретением отдают конъюгированию токсофоров с антителом через один или несколько атомов серы остатков цистеина антитела и/или через одну или несколько NH групп остатков лизина антитела. Тем не менее, также можно присоединить токсофор к антителу через свободные карбоксильные группы или через остатки сахаров антитела.

Под "целевой молекулой" в самом широком смысле понимают молекулу, которая присутствует в популяции целевых клеток и которая может представлять собой белок (например, рецептор фактора роста) или непептидную молекулу (например, сахар или фосфолипид). Она предпочтительно представляет собой рецептор или антиген.

Термин "внеклеточная" целевая молекула описывает целевую молекулу, присоединенную к клетке, которая локализована на внешней поверхности клетки, или часть целевой молекулой, которая локализована на внешней поверхности клетки, то есть связующее может связываться на интактной клетке с его внеклеточной целевой молекулой. Внеклеточная целевая молекула может быть заякорена в клеточную мембрану или являться компонентом клеточной мембраны. Специалисту в данной области техники известны методы идентификации внеклеточных целевых молекул. Для белков, это может осуществлять путем определения трансмембранного(-ых) домена(-ов) и ориентации белка на мембране. Эти данные обычно задепонированы в белковых базах данных (например, SwissProt).

Термин "раковая целевая молекула" описывает целевую молекулу, которая в количестве присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани. Предпочтительно, раковая целевая молекула селективно присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани, где селективность описывает по меньшей мере двукратное обогащение в раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани ("селективная раковая целевая молекула"). Применение раковых целевых молекул предоставляет возможность селективной терапии раковых клеток с применением конъюгатов в соответствии с изобретением.

Связующее может быть присоединено к линкеру с помощью связи. Присоединение связующего может осуществляться через гетероатом связующего. В соответствии с изобретением, гетероатомы связующего, которые могут быть использованы для присоединения, представляют собой серу (в одном варианте присоединение осуществляется через сульфгидрильную группу связующего), кислород (в соответствии с изобретением присоединение осуществляется с помощью карбоксильной или гидроксильной группы связующего) и азот (в одном варианте осуществления присоединение осуществляется через первичную или вторичную аминогруппу или амидную группу связующего). Эти гетероатомы могут присутствовать в природном связующем или вводятся химическими методами или методами молекулярной биологии. В соответствии с изобретением, присоединение связующего к токсофору оказывает только незначительное влияние на связывающую активность связующего по отношению к целевой молекуле. В предпочтительном варианте осуществления, присоединение не оказывает влияния на связывающую активность связующего по отношению к целевой молекуле.

В соответствии с настоящим изобретением, термин "антитело" следует понимать в его самом широком значении и включает молекулы иммуноглобулинов, например, интактные или модифицированные моноклональные антитела, поликлональные антитела или мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела). Молекула иммуноглобулина предпочтительно включает молекулу, содержащую четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (Н цепи) и две легкие цепи (L цепи), которые типично связаны с помощью дисульфидных мостиков. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный домен тяжелой цепи (сокращенно VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может, например, содержать три домена CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельный домен (сокращенно VL) и константный домен. Константный домен легкой цепи включает один домен (сокращенно CL). VH и VL домены дополнительно могут быть разделены на участки, имеющие гипервариабельность, также называемые участками, определяющими комплементальность (сокращенно CDR), и участки, имеющие последовательность с низкой вариабельностью (каркасный участок, сокращенно FR). Типично, каждый VH и VL участок состоит из трех CDR и вплоть до четырех FR. Например, начиная с аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитело можно получить из любых доступных видов, как, например, кролик, лама, верблюд, мышь или крыса. В одном варианте осуществления, антитело имеет человеческое или мышиное происхождение. Антитело может быть, например, человеческим, гуманизированным или химерным.

Термин "моноклональное" антитело относится к антителам, полученным из популяции по существу гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела в популяции являются идентичными за исключением встречающихся в природе мутаций, которых может быть небольшое количество. Моноклональные антитела распознают единичный антигенный связывающий сайт с высокой специфичностью. Термин моноклональное антитело не относится к конкретному способу получения.

Термин "интактное" антитело относится к антителам, содержащим как антигенсвязывающий домен, так и константный домен легкой и тяжелой цепи. Константный домен может представлять собой встречающийся в природе домен или его вариант, имеющий некоторое количество модифицированных аминокислотных положений, и также может быть негликозилированным.

Термин "модифицированное интактное" антитело относится к интактным антителам, слитым через их амино-концевой участок или карбокси-концевой участок с помощью ковалентной связи (например, пептидной связи) с другим полипептидом или белком, не имеющим происхождения из антитела. Кроме того, антитела могут быть модифицированы таким образом, что, в определенных положениях, введены реакционно-способные цистеины для облегчения связывания с токсофором (см. Junutula и др. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Термин "человеческое" антитело относится к антителам, которые могут быть получены из человека или которые представляют собой синтетические антитела человека. "Синтетическое" антитело человека представляет собой антитело, которое частично или полностью можно получить in silico из синтетических последовательностей на основании анализа последовательностей антитела человека. Антитело человека может кодироваться, например, нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения. Пример такого антитела можно найти в и др., Nature Biotech. 2000, 18:853-856. Такие "человеческие" и "синтетические" антитела также включают негликозилированные варианты, которые были продуцированы либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту.

Термин "гуманизированное" или "химерное" антитело описывает антитела, состоящие из нечеловеческой и человеческой части последовательности. В этих антителах, часть последовательностей человеческого иммуноглобулина (реципиент) заменена частями последовательности нечеловеческого иммуноглобулина (донор). Во многих случаях, донор представляет собой мышиный иммуноглобулин. В случае гуманизированных антител, аминокислоты CDR реципиента заменены на аминокислоты донора. В некоторых случаях, аминокислоты каркасного участка, также заменены на соответствующие аминокислоты донора. В некоторых случаях гуманизированное антитело содержит аминокислоты, которые отсутствуют как в реципиенте, так и в доноре, и которые введены во время оптимизации антитела. В случае химерных антител, вариабельные домены донорного иммуноглобулина слиты с константными участками человеческого антитела. Такие "гуманизированные" и "химерные" антитела также включают негликозилированные варианты, которые были продуцированы либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую другую аминокислоту.

Термин гипервариабельный участок (CDR), как используется в настоящей заявке, относится к тем аминокислотам вариабельного домена антитела, которые необходимы для связывания с антигеном. Типично, каждый вариабельный участок имеет три CDR участка, которые обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждый CDR участок может включать аминокислоты в соответствии с определением Кэбота и/или аминокислоты гиперварибельной петли, определяемые в соответствии с Хотиа. Определение в соответствии с Кэботом включает, например, участок от приблизительно положения аминокислоты 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) вариабельной легкой цепи и 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Мэриленд. (1991)). Определение в соответствии с Хотиа включает, например, участок от приблизительно положения аминокислоты 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 91-96 (CDR3) вариабельной легкой цепи и 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) и 96-101 (CDR3) вариабельной тяжелой цепи (Chothia и Lesk; J Mol Biol 196). В некоторых случаях, CDR может включать аминокислоты из CDR участка, определенного в соответствии с Кэботом и Хотиа.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелой цепи, антитела могут быть разделены на различные классы. Существует пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть разделены на дополнительные подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам, обозначаются как [альфа/α], [дельта/δ], [эпсилон/ε], [гамма/γ] и [мю/μ]. Известны как трехмерные структуры, так и субъединичные структуры антител.

Термин "функциональный фрагмент" или "антигенсвязывающий фрагмент антитела" антитела/иммуноглобулина определяют как фрагмент антитела/иммуноглобулина (например, вариабельные домены IgG), которые все еще содержат антигенсвязывающие домены антитела/иммуноглобулина. "Антигенсвязывающий домен" антитела типично включает один или несколько гипервариабельных участков антитела, например, CDR, CDR2 и/или CDR3 участок. Тем не менее, "каркасный" или "скелетный" участок антитела также может играть роль во время связывания антитела с антигеном. Каркасный участок образует скелет CDR. Предпочтительно, антигенсвязывающий домен включает по меньшей мере аминокислоты 4-103 вариабельной легкой цепи и аминокислоты 5-109 вариабельной тяжелой цепи, более предпочтительно аминокислоты 3-107 вариабельной легкой цепи и 4-111 вариабельной тяжелой цепи, особенно предпочтительно полных вариабельных легких и тяжелых цепей, то есть аминокислоты 1-109 из VL и 1-113 из VH (нумерация в соответствии с WO 97/08320).

"Функциональные фрагменты" или "антигенсвязывающие фрагменты антител" согласно изобретению охватывают, неокончательно, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, антитела с единичным доменом (DAb), линейные антитела, индивидуальные цепи антител (одноцепочечное Fv, сокращенно scFv); и мультиспецифические антитела, такие как би- и три-специфические антитела, например, образованные из фрагментов антител С.А. K Borrebaeck, редактор (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, редакторы (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag. Антитела, отличающиеся от "мультиспецифических" или "мультифункциональных" антител, представляют собой те антитела, которые имеют идентичные связывающие сайты. Мультиспецифические антитела могут быть специфичными к различным эпитопам антигена или могут быть специфичными к эпитопам более чем одного антигена (см., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, и др., 1991, J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; или Kostelny и др., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). F(ab')₂ или Fab молекула может быть сконструирована таким образом, что некоторое количество внутримолекулярных дисульфидных взаимодействий, встречающихся между Ch1 и CL доменами, может быть уменьшено или даже полностью предотвращено.

"Эпитопы" относятся к белковым детерминантам, способным связываться специфически с иммуноглобулином или рецепторами Т-клеток. Эпитопные детерминантны обычно состоят из химических активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров или их комбинаций, и обычно имеют специфические 3-х мерные структурные свойства, а также специфические свойства заряда.

"Функциональные фрагменты" или "антигенсвязывающие фрагменты антител" могут быть слиты с другим полипептидом или белком, не имеющим происхождения из антитела, через их амино-конец или карбоксильный конец, с помощью ковалентной связи (например, пептидной связи). Кроме того, антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут быть модифицированы путем интродукции реакционно-способных цистеинов в различные локализации, для облегчения связывания с токсофором (см. Junutula и др. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Поликлональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники. Моноклональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники ( и Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Человеческое и гуманизированное моноклональные антитела можно получить с помощью методов, известных среднему специалисту в данной области техники (Olsson и др., Meth Enzymol. 92, 3-16 или Cabilly и др. US 4,816,567 или Boss и др. US 4,816,397).

Средний специалист в данной области техники знаком с различными способами получения человеческих антител и их фрагментов, такими как, например, с помощью трансгенных мышей (N Lonberg и D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(1):65-93) или Phage Display Technologien (Clackson и др., Nature. 1991 Aug 15; 352(6336):624-8). Антитела согласно изобретению можно получить из библиотеки рекомбинантных антител, например, состоящей из аминокислотных последовательностей ряда антител, компилированных от большого количества здоровых добровольцев. Антитела также можно получить с помощью известных технологий рекомбинантных ДНК. Последовательность нуклеиновых кислот антител может быть получена с помощью обычного секвенирования или доступна из общедоступных баз данных.

"Выделенное" антитело или связующее было очищено для удаления других компонентов клетки. Загрязняющие компоненты клетки, которые могут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению представляют собой, например, ферменты, гормоны, или другие пептидные или непептидные компоненты клетки. Предпочтительное антитело или связующее представляет собой такое, которое было очищено до степени, более чем 95% по массе, относительно антитела или связующего (определенной, например, с помощью метода Лоури, УФ-Вид спектроскопии или путем SDS капиллярного гель-электрофореза). Кроме того, подразумевается антитело, которое было очищено до такой степени, что возможно определить по меньшей мере 15 аминокислот аминоконцевой области или внутренней аминокислотной последовательности, или которое было очищено до гомогенности, где гомогенность определяют с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях (определение можно осуществить с помощью окрашивания кумасси голубым или предпочтительно с помощью окрашивания серебром). Тем не менее, антитело обычно получают с помощью одной или нескольких стадий очистки.

Термин "специфическое связывание" или "связывается специфически" относится к антителу или связующему, которое связывается с заранее определенным антигеном/целевой молекулой. Специфическое связывание антитела или связующего типично описывает антитело или связующее, имеющее аффинность по меньшей мере 10^-7 М (в виде Kd значения; то есть предпочтительно те, у которых значения Kd меньше, чем 10^-7 М). с антителом или связующим, имеющим по меньшей мере в два раза более высокую аффинность для заранее определенного антигена/целевой молекулы, чем для неспецифического антигена/целевой молекулы (например, бычий сывороточный альбумин, или казеин), которое не представляет собой заранее определенный антиген/целевую молекулу или близкородственный антиген/целевую молекулу. Антитела предпочтительно имеют аффинность по меньшей мере 10^-7 М (в виде Kd значения; другими словами предпочтительно те, значения Kd которых меньше, чем 10^-7 М), предпочтительно по меньшей мере 10^-8 М, более предпочтительно в диапазоне от 10^-9 М до 10^-11 М. Kd значения можно определить, например, с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии.

Конъюгаты антитело-лекарственное средство согласно изобретению также проявляют аффинности в этих диапазонах. На аффинность предпочтительно не оказывает существенного влияния конъюгирование лекарственных препаратов (в целом, аффинность уменьшается меньше, чем на один порядок величин, другими словами, например, не более чем от 10^-8 М до 10^-7 М).

Антитела, применяемые в соответствии с изобретением, также являются заметно предпочтительными благодаря высокой селективности. Высокая селективность проявляется, если антитело согласно изобретению проявляет аффинность к целевому белку, которая больше чем, по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно в 5 раз или более предпочтительно в 10 раз, чем к независимому другому антигену, например, сывороточному альбумину человека (аффинность можно определить, например, с помощью поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии).

Кроме того, применяемые антитела согласно изобретению предпочтительно реагирует перекрестно. Для облегчения и лучшей интерпретации доклинических исследований, например, токсикологических исследований или исследований активности (например, на ксенотрансплантированных мышах), является предпочтительным, если антитело, применяемое в соответствии с изобретением, не только связывается с целевым белком человека, но также связывается с видовым целевым белком в видах, используемых для исследований. В одном варианте осуществления антитело, применяемое в соответствии с изобретением, дополнительно к целевому белку человека, перекрестно реагирует с целевым белком по меньшей мере одного дополнительного вида. Для токсикологических исследований и исследований активности является предпочтительным использовать виды семейств грызунов, собак и примат, отличающихся от человека. Предпочтительными видами грызунов являются мыши и крысы. Предпочтительными приматами, отличающимися от человека, являются макака-резус, шимпанзе и длиннохвостый макак.

В одном варианте осуществления антитело, применяемое в соответствии с изобретением, дополнительно к целевому белку человека, перекрестно реагирует с целевым белком по меньшей мере одного дополнительного вида, выбранного из группы видов, состоящей из мыши, крысы и длиннохвостого макака (Масаса fascicularis). В особенности, предпочтительными являются антитела, применяемые в соответствии с изобретением, которые дополнительно к целевому белку человека по меньшей мере перекрестно реагирует с мышиным целевым белком. Предпочтение отдают перекрестно-реагирующим антителам, аффинность которых к целевому белку других видов, отличающихся от человека, отличается не более, чем в 50 раз, более конкретно не более чем в 10 раз, от аффинности к целевому белку человека.

Антитела, нацеленные на раковую целевую молекулу

Целевая молекула, на которую нацелено связующее, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предпочтительно означает раковую целевую молекулу. Термин "раковая целевая молекула" описывает целевую молекулу, которая в большем количестве присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток, по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани. Предпочтительно, раковая целевая молекула селективно присутствует в одном или нескольких видах раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани, где селективность описывает по меньшей мере двукратное обогащение в раковых клетках по сравнению с нераковыми клетками такого же типа ткани ("селективная раковая целевая молекула"). Применение раковых целевых молекул предоставляет возможность селективной терапии раковых клеток с применением конъюгатов в соответствии с изобретением.

Антитела, которые специфичны к антигену, например, антигену раковых клеток, могут быть получены средним специалистом в данной области техники с помощью методов, которые ему известны (таких как, например, рекомбинантная экспрессия) или могут быть приобретены коммерчески (как, например, от Merck KGaA, Германия). Примерами известных коммерчески доступных антител для противораковой терапии являются Эрбитукс® (цетуксимаб, Merck KGaA), Avastin® (бевацизумаб, Roche) и Герцептин® (трастузумаб, Genentech). Трастузумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело IgG1 каппа типа, которое в исследовании на клетках (Kd=5 нМ) связывает внеклеточные домены рецептора эпидермального фактора роста человека с высокой аффинностью. Антитело получают рекомбинантно в СНО клетках. Все эти антитела также могут быть получены в виде негликозилированных вариантов этих антител, либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту.

В предпочтительном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой селективную раковую целевую молекулу.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой белок.

В одном варианте осуществления, целевая молекула представляет собой внеклеточную целевую молекулу. В предпочтительном варианте осуществления, внеклеточная целевая молекула представляет собой белок.

Раковые целевые молекулы известны специалистам в данной области. Их примеры представлены ниже.

Примерами раковых целевых молекул являются:

(1) EGF рецептор (NCBI эталонная последовательность NP_005219.2), SEQ ID NO: 213 (1210 аминокислот):

Внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(2) мезотелин (SwissProt ссылка Q13421-3), SEQ ID NO: 214 (622 аминокислот):

где мезотелин кодируется аминокислотами 296-598. Аминокислоты 37-286 кодируют мегакариоцит-потенциирующий фактор. Мезотелин заякорен в клеточную мембрану с помощью GPI якоря и локализирован внеклеточно.

(3) карбоангидраза IX (SwissProt ссылка Q16790), SEQ ID NO: 215 (459 аминокислот):

Внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(4) С4.4а (NCBI эталонная последовательность NP_055215.2; синоним LYPD3), SEQ ID NO: 216 (346 аминокислот):

Зрелый внеклеточный домен обозначен подчеркиванием.

(5) CD52 (NCBI эталонная последовательность NP_001794.2), SEQ ID NO: 217

(6) Her2 (NCBI эталонная последовательность NP_004439.2), SEQ ID NO: 218

(7) CD20 (NCBI эталонная последовательность NP_068769.2), SEQ ID NO: 219

(8) антиген активации лимфоцитов CD30 (SwissProt ID Р28908), SEQ ID NO: 220

(9) CD22 молекула адгезии лимфоцитов (SwissProt ID P20273), SEQ ID NO: 221

(10) поверхностный антиген CD33 миелоидных клеток (SwissProt ID P20138), SEQ ID NO: 222

(11) трансмембранный гликобелок NMB (SwissProt ID Q14956), SEQ ID NO: 223

(12) молекула адгезии CD56 (SwissProt ID P13591), SEQ ID NO: 224

(13) поверхностная молекула CD70 (SwissProt ID Р32970), SEQ ID NO: 225

(14) поверхностная молекула CD74 (SwissProt ID P04233), SEQ ID NO: 226

(15) антиген CD19 В-лимфоцитов (SwissProt ID P15391), SEQ ID NO: 227

(16) поверхностный белок муцин-1 (SwissProt ID P15941), SEQ ID NO: 228

(17) поверхностный белок CD 138 (SwissProt ID PI8827), SEQ ID NO: 229

(18) интегрин альфаV ((№ доступа Genbank: NP_002201.1), SEQ ID NO: 230

(19) фактор роста 1, имеющий происхождение из тератокарциномы, белок TDGF1 (№ доступа Genbank: NP_003203.1), SEQ ID NO: 231

(20) простато-специфический мембранный антиген PSMA (Swiss Prot ID: Q04609), SEQ ID NO: 232

(21) тирозинпротеин киназа ЕРНА2 (Swiss Prot ID: P29317), SEQ ID NO: 233

(22) поверхностный белок SLC44A4 (№ доступа Genbank: NP_001171515), SEQ ID NO: 234

(23) поверхностный белок BMPR1B (SwissProt: 000238)

(24) транспортный белок SLC7A5 (SwissProt: Q01650)

(25) эпителиальный простатический антиген STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8)

(26) антиген карциномы яичников MUC16 (SwissProt: Q8WXI7)

(27) транспортный белок SLC34A2 (SwissProt: 095436)

(28) поверхностный белок SEMA5b (SwissProt: Q9P283)

(29) поверхностный белок LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)

(30) рецептор эндотелина типа В EDNRB (SwissProt: Р24530)

(31) белок безымянного пальца RNF43 (SwissProt: Q68DV7)

(32) белок, ассоциированный с карциномой простаты STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)

(33) катионный канал TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)

(34) рецептор комплемента CD21 (SwissProt: Р20023)

(35) белок, ассоциированный с комплексом антиген-распознающего В-клеточного рецептора CD79b (SwissProt: Р40259)

(36) антиген клеточной адгезии СЕАСАМ6 (SwissProt: Р40199)

(37) дипептидаза DPEP1 (SwissProt: P16444)

(38) рецептор интерлейкина IL20Ralpha (SwissProt: Q9UHF4)

(39) протеогликан BCAN (SwissProt: Q96GW7)

(40) рецептор эфрина ЕРНВ2 (SwissProt: Р29323)

(41) белок, ассоциированный со стволовыми клетками простаты PSCA (№ доступа Genbank: NP_005663.2)

(42) поверхностный белок LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)

(43) рецепторный белок TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)

(44) белок, ассоциированный с комплексом антиген-распознающего В-клеточного рецептора CD79a (SwissProt: P11912)

(45) рецепторный белок CXCR5 (SwissProt: Р32302)

(46) ионный канал Р2Х5 (SwissProt: Q93086)

(47) антиген лимфоцитов CD180 (SwissProt: Q99467)

(48) рецепторный белок FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)

(49) рецепторный белок FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)

(50) антиген молекулы Ia класса II МНС HLA-DOB (№ доступа Genbank: NP_002111.1)

(51) белок Т-клеток VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)

(52) TWEAKR (SEQ ID NO: 169 (белок); SEQ ID NO: 170 (ДНК).

(53) антиген лимфоцитов CD37 (Swiss Prot: P11049)

(54) FGF рецептор 2; FGFR2 (Gene ID: 2263; Официальное обозначение: FGFR2), FGFR2 рецептор встречается в различных варианты сплайсинга (альфа, бета, IIIb, IIIc). Все варианты сплайсинга могут действовать в качестве целевой молекулы.

(55) трансмембранный гликобелок В7Н3 (CD276; Gene ID: 80381)

(56) рецептор В клеток BAFFR (CD268; Gene ID: 115650)

(57) рецепторный белок ROR 1 (Gene ID: 4919)

(58) поверхностный рецептор IL3RA (CD123; Gene ID: 3561)

(59) рецептор СХС хемокина CXCR5 (CD185; Gene ID 643)

(60) рецепторный белок синцитин (Gene ID 30816)

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, раковую целевую молекулу выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52).

В дальнейшем особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, связующее связывается с внеклеточной раковой целевой молекулой, которую выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52).

В дальнейшем особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, связующее специфически связывается с внеклеточной раковой целевой молекулой, которую выбирают из группы, состоящей из раковых целевых молекул (1)-(60), в частности (1), (6) и (52). В предпочтительном варианте осуществления связующее, после связывания с его внеклеточной целевой молекулой на целевой клетке, интернализируется целевой клеткой в результате связывания. Это вызывает поглощение целевой клеткой конъюгата связующего и лекарственного средства, который может представлять собой иммуноконъюгат или ADC. Связующее затем процессируется, предпочтительно внутриклеточно, преимущественно лизосомально.

В одном варианте осуществления связующее представляет собой связывающий белок. В предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело, негликозилированное антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, мультиспецифическое антитело или миметик антитела.

Предпочтительные миметики антител представляют собой аффитела, аднектины, антикалины, дарпины, авимеры или нанотела. Предпочтительные мультиспецифические антитела представляют собой биспецифические и триспецифические антитела.

В предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, более предпочтительно выделенное антитело или выделенный антигенсвязывающий фрагмент антитела.

Предпочтительные антигенсвязывающие фрагменты антител представляют собой Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты, диатела, DAb, линейные антитела и scFv. Особенно предпочтительными являются Fab, диатела и scFv.

В особенно предпочтительном варианте осуществления связующее представляет собой антитело. Особенно предпочтительными являются моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Дальнейшими особенно предпочтительными являются человеческое, гуманизированное или химерное антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

Антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают раковые целевые молекулы, могут быть получены средним специалистом в данной области техники с использованием известных процессов, таких как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Связующие для раковых целевые молекул могут быть приобретены коммерчески или могут быть получены средним специалистом в данной области техники с использованием известных процессов, таких как, например, химический синтез или рекомбинантная экспрессия. Другие способы получения антител или антигенсвязывающих фрагментов антител описаны в WO 2007/070538 (см. стр. 22 "Антитела"). Для специалиста в данной области техники известно, какие процессы, такие как библиотеки фагового дисплея (например, Morphosys HuCAL Gold) могут быть компилированы и использоваться для открытия антител или антигенсвязывающих фрагментов антитела (см. WO 2007/070538, стр. 24 и далее, и AK Пример 1 на стр. 70, AK Пример 2 на стр. 72). Другие способы получения антител, в которых используют библиотеки ДНК из В-клеток, описаны, например, на стр. 26 (WO 2007/070538). Способы гуманизации антител описаны на стр. 30-32 WO 2007070538 и более подробно в Queen, и др., Pros. Natl. Acad. Sci. USA 8610029-10033,1989 или в WO 90/0786. Кроме того, способы для рекомбинантной экспрессии белков в целом и антител в частности известны специалисту в данной области техники (см., например, в Berger и Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, т. A Laboratory Manual, (второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) т. 1-3); Current Protocols in Molecular Biology, (F.M. Ausabel и др. [Ред.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow и др., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988, Paul [Ред.]); Fundamental Immunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); и Harlow, и др., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Для специалиста в данной области техники известны соответствующие векторы, промоторы и сигнальные пептиды, которые необходимы для экспрессии белка/антитела. Рутинные способы также описаны в WO 2007/070538 на страницах 41-45. Способы получения IgG1 антитела описаны, например, в WO 2007/070538 в Примере 6 на стр. 74 и далее. Способы, которые предоставляют возможность определения интернализации антитела после связывания с его антигеном, известны специалисту в данной области техники и описаны например, в WO 2007/070538 на стр. 80. Для получения антител с другой специфичностью целевой молекулы специалист в данной области техники по аналогии может использовать способы, описанные в WO 2007/070538, которые применяют для получения антитела карбоангидразы IX (Mn).

анти-EGFR антитела

Примерами антител, которые связывают раковые целевые молекулы EGFR, являются цетуксимаб (INN номер 7906), панитумумаб (INN номер 8499) и нимотузумаб (INN номер 8545). Цетуксимаб (Номер доступа Drug Bank DB00002) представляет собой химерное анти-EGFR1 антитело, которое продуцируют в клетках SP2/0 миеломы мыши и продают ImClone Systems Inc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co. Цетуксимаб предназначен для лечения метастазирующей, EGFR экспрессирующей, колоректальной карциномы с диким типом гена K-Ras. Он имеет аффинность 10^-10 М.

Последовательность:

Цетуксимаб Легкая цепь (каппа), SEQ ID NO: 235:

Цетуксимаб Тяжелая цепь, SEQ ID NO: 236:

Панитумумаб (INN номер 8499) (Номер доступа Drug Bank DB01269) представляет собой рекомбинантное моноклональное IgG2 антитело человека, которое специфически связывается с EGF рецептором 1 человека и продается Abgenix/Amgen. Панитумумаб получают при иммунизации трансгенных мышей (XenoMouse). Эти мыши способны продуцировать человеческий иммуноглобулин (легкие и тяжелые цепи). Отбирают специфический клон В-клеток, который продуцирует антитела к EGFR, и этот клон иммортализуют с СНО клетками (клетки яичника китайского хомячка). Эти клетки в настоящее время используют для получения 100% антител человека. Панитумумаб предназначен для лечения EGFR-экспрессирующей, метастазирующей колоректальной карциномы, которая резистентна к химиотерапевтическому лечению с применением фторпиримидина, оксалиплатина и иринотекана. Он имеет аффинность 10^-11 М.

Последовательность:

Панитумумаб Легкая цепь (каппа), SEQ ID NO: 237:

Панитумумаб Тяжелая цепь, SEQ ID NO: 238:

Нимотузумаб (INN номер 8545) (ЕР 00586002, ЕР 00712863) представляет собой гуманизированное моноклональное IgG1 антитело, которое специфически связывается с EGF рецептором 1 человека и продается YM BioScienecs Inc. (Mississauga Canada). Оно продуцируется в несекретирующих NSO клетках (клеточная линия млекопитающих). Нимотузумаб одобрен для лечения опухолей головы и шеи, чрезвычайно злокачественной астроцитомы и многоформной глиобластомы (не в EU и US) и карциномы поджелудочной железы (Орфанное лекарственное средство, ЕМА). Он имеет аффинность 10^-8 М.

Нимотузумаб легкая цепь (SEQ ID NO: 239):

Нимотузумаб тяжелая цепь (SEQ ID NO: 240):

Другие варианты осуществления EGFR антител являются следующими:

• залутумумаб / 2F8 / HuMax-EGFr, от Genmab A/S (WO 02/100348, WO 2004/056847, INN номер 8605)

• нецитумумаб / 11F8, ImClone / IMC-11F8, от ImClone Systems Inc. [Eli Lilly & Co] (WO 2005/090407 (ЕР 01735348-A1, US 2007/0264253-A1, US 7,598,350, WO 2005/090407-A1), INN номер 9083)

• матузумаб / анти-EGFR MAb, Merck KGaA / анти-EGFR MAb, Takeda / EMD 72000 / EMD-6200 / EMD-72000 и EMD-55900 / MAb 425 / моноклональное антитело 425, от Merck KGaA / Takeda (WO 92/15683, INN номер 8103 (Матузумаб))

• RG-7160 / GA-201 / GA201 / R-7160 / R7160 / RG7160 / RO-4858696 / RO-5083945 / RO4858696 / RO5083945, от Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO 2010/112413-A1, WO 2010/115554)

• GT-MAB 5.2-GEX / CetuGEX, от Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (ЕР 01900750-A1, ЕР 01911766-A1, ЕР 02073842-A2, US 2010/0028947-A1)

• ISU-101, от Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd) / Scancell (WO 2008/004834-A1)

• ABT-806 / mAb-806 / ch-806 / анти-EGFR моноклональное антитело 806, от Ludwig Institute for Cancer Research / Abbott / Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771, WO 2005/081854 и WO 2009/023265)

• SYM-004 (состоит из двух химерных IgG1 антител (992 и 1024)), от Symphogen A/S (WO 2010/022736-А2)

• MR1-1 /MR1-1KDEL, от IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd) (Duke University), (патент: WO 2001/062931-A2)

• Антитело к делеционному мутанту, EGFRvIII, от Amgen/Abgenix (WO 2005/010151, US 7,628,986)

• SC-100, от Scancell Ltd (WO 01/088138-A1)

• MDX-447 / EMD 82633 / BAB-447 / H 447 / MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA, от Bristol-Myers Squibb (US) / Merck KGaA (DE) / Takeda (JP), (WO 91/05871, WO 92/15683)

• анти-EGFR-Mab, от Xencor (WO 2005/056606)

• DXL-1218 / анти-EGFR моноклональное антитело (рак), InNexus, от InNexus Biotechnology Inc, Pharmaprojects PH048638

В предпочтительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба, панитумумаба, нимотузумаба, залутумумаба, нецитумумаба, матузумаба, RG-716, GT-MAB 5.2-GEX, ISU-101, АВТ-806, SYM-004, MR1-1, SC-100, MDX-447 и DXL-1218.

В особенно предпочтительном варианте осуществления анти-EGFR антитела выбирают из группы, состоящей из цетуксимаба, панитумумаба, нимотузумаба, залутумумаба, нецитумумаба и матузумаба.

Для специалиста в данной области техники известны способы, которые можно использовать для получения других антител, из CDR участков вышеуказанных антител с помощью вариаций последовательностей, эти дальнейшие антитела имеют сходную или лучшую аффинность и/или специфичность к целевой молекуле.

В дополнительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из

антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, содержащих три CDR участка легкой цепи и три CDR участка тяжелой цепи одного из следующих антител: цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб, залутумумаб, нецитумумаб, матузумаб, RG-716, GT-MAB 5.2-GEX, ISU-101, АВТ-806, SYM-004, MR1-1, SC-100, MDX-447 и DXL-1218.

В дополнительном варианте осуществления, анти-EGFR антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из

антител или антигенсвязывающих фрагментов антител, содержащих три CDR участка легкой цепи и три CDR участка тяжелой цепи одного из следующих антител: цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб, залутумумаб, нецитумумаб, матузумаб. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к карбоангидразе IX

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу карбоангидразы IX описаны в WO 2007/070538-А2 (например, пункты 1-16).

В предпочтительном варианте осуществления антитела к карбоангидразе IX или антигенсвязывающие фрагменты антител выбирают из группы, состоящей из антител к карбоангидразе IX или антигенсвязывающих фрагментов антител 3ее9 (пункт 4 (а) в WO 2007/070538-А2), 3ef2 (пункт 4 (b) в WO 2007/070538-A2), 1е4 (пункт 4 (с) в WO 2007/070538-А2), 3а4 (пункт 4 (d) в WO 2007/070538-А2), 3ab4 (пункт 4 (е) в WO 2007/070538-А2), 3ah10 (пункт 4 (f) в WO 2007/070538-А2), 3bb2 (пункт 4 (g) в WO 2007/070538-A2), 1aa1 (пункт 4 (h) в WO 2007/070538-A2), 5a6 (пункт 4 (i) в WO 2007/070538-A2) и 5аа3 (пункт 4 (j) в WO 2007/070538-А2).

Анти-С4.4а антитела:

В соответствии с изобретением, можно применять С4.4а антитела.

Примеры С4.4а антител и антигенсвязывающих фрагментов описаны в WO 2012/143499 А2. В качестве ссылки, все антитела WO 2012/143499 А2 таким образом включены в описание настоящего изобретения, и они могут применяться в настоящем изобретении. Последовательности антител приведены в Таблице 1 WO 2012/143499 А2, где в каждой строчке показаны соответствующие CDR аминокислотные последовательности вариабельной легкой цепи, или вариабельная тяжелая цепь антитела представлена в колонке 1.

В одном варианте осуществления, анти-С4.4а антитела или их антигенсвязывающие фрагменты после связывания с клеткой, экспрессирующей С4.4а, интернализируются клеткой.

В дополнительном варианте осуществления, анти-С4.4а антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител содержат по меньшей мере одну, две или три CDR аминокислотные последовательности антитела, представленные в Таблице 1 WO 2012/143499 А2 или Таблице 2 WO 2012/143499 А2. Предпочтительные варианты осуществления таких антител также представлены в WO 2012/143499 А2 и включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Анти-HER2 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой Her2 является трастузумаб (Genentech). Трастузумаб представляет собой гуманизированное антитело, применяемое среди прочего для лечения рака молочной железы.

Дополнительными примерами антител, которые связываются с HER2, являются, дополнительно к трастузумабу (INN 7637, CAS №: RN: 180288-69-1) и пертузумабу (CAS №: 380610-27-5), антитела, раскрытые в WO 2009/123894-А2, WO 200/8140603-А2 или в WO 2011/044368-А2. Примером анти-HER2 конъюгата является трастузумаб-эмтанзин (INN-№9295). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения. Кроме того, можно применять негликозилированные варианты трастузумаба, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F, либо путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту. Кроме того, также можно применять варианты антител которые были сконструированы таким образом, чтобы они содержали один или несколько акцепторных глутаминов для опосредованных трансглутаминазой реакций.

Анти-CD20 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой CD20, является ритуксимаб (Genentech). Ритуксимаб (CAS номер: 174722-31-7) представляет собой химерное антитело, применяемое для лечения неходжкинской лимфомы. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD52 антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой CD52, является алемтузумаб (Genzyme). Алемтузумаб (CAS номер: 216503-57-0) представляет собой гуманизированное антитело, применяемое для лечения хронического лимфолейкоза. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к мезотелину:

Примеры антител к мезотелину описаны, например, в WO 2009/068204. В качестве ссылки, все антитела, описанные в WO 2009/068204, таким образом включены в настоящее описание, так, что эти антитела можно использовать в контексте изобретения, раскрытого в настоящей заявке.

Антитела к мезотелину, применяемые в соответствии с изобретением, также являются заметно предпочтительными для инвариантного связывания с мезотелином. Инвариантное связывание характеризуется тем, что, например, антитело, применяемое в соответствии с изобретением, связывается с эпитопом мезотелина, который не может быть замаскирован другим внеклеточным белком. Такой другой внеклеточный белок представляет собой, например, белковый антиген рака яичника 125 (СА125). Антитела, которые применяют с предпочтением, характеризуются тем, что их связывание с мезотелином не блокируется СА125.

Анти-CD30 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD30, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, ходжкинской лимфомы, являются брентуксимаб, иратумумаб и антитела, раскрытые в WO 2008/092117, WO 2008/036688 или WO 2006/089232. Примером анти-CD30 конъюгата является брентуксимаб ведотин (INN №9144). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD22 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD22, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, лимфомы, являются инотузумаб и эпратузумаб. Примерами анти-CD22 конъюгатов являются инотузумаб озогамицин (INN №8574) или анти-CD22-ММАЕ и анти-CD22-МС-ММАЕ (CAS RN: 139504-50-0 и 474645-27-7, соответственно). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD33 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD33, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, лейкоза, являются гемтузумаб и линтузумаб (INN 7580). Примером анти-CD33 конъюгата является гемтузумаб-озагамицин. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-NMB антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу NMB, и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, меланомы или рака молочной железы, является глембатумумаб (INN 9199). Примером анти-NMB конъюгата является глембатумумаб ведотин (CAS RN: 474645-27-7). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD56 антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD56, и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, мелкоклеточного рака легких, МСС или карциномы яичников, является лорвотузумаб. Примером анти-CD57 конъюгата является лорвотузумаб метранзин (CAS RN: 139504-50-0). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD70 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD70, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы или почечно-клеточного рака, раскрыты в WO 2007/038637-А2 и WO 2008/070593-А2. Примером анти-CD70 конъюгата является SGN-75 (CD70 MMAF). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD74 антитела

Примером антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD74 и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, является милатузумаб. Примером анти-CD74 конъюгата является милатузумаб-доксорубицин (CAS RN: 23214-92-8). В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD19 антитела

Пример антитела, которое связывает раковую целевую молекулу CD19 и может применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы, раскрыт в WO 2008/031056-А2. Другие антитела и примеры анти-CD19 конъюгата (SAR3419) раскрыты в WO 2008/047242-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к муцину

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу муцин-1 и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы, являются кливатузумаб и антитела, раскрытые в WO 2003/106495-А2, WO 2008/028686-А2. Примеры конъюгатов к муцину раскрыты в WO 2005/009369-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-CD138 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу CD138, и их конъюгатов, которые могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, множественной миеломы, раскрыты в WO 2009/080829-А1, WO 2009/080830-А1. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Антитела к интегрин альфаV

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу интегрин альфаV, и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, меланомы, саркомы или карциномы, являются интетумумаб (CAS RN: 725735-28-4), абциксимаб (CAS RN: 143653-53-6), этарацизумаб (CAS RN: 892553-42-3) и антитела, раскрытые в US 7,465,449, ЕР 719859-А1, WO 2002/012501-А1 и WO 2006/062779-A2. Примерами конъюгатов к интегрин альфаV являются интетумумаб-DM4 и другие ADC, раскрытые в WO 2007/024536-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-TDGF1 антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу TDGF1 и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, являются антитела, раскрытые в WO 02/077033-А1, US 7,318,924, WO 2003/083041-А2 и WO 2002/088170-А2. Примеры анти-TDGF1 конъюгатов раскрыты в WO 2002/088170-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-PSMA антитела

Примерами антител, которые связывают раковую целевую молекулу PSMA и могут применяться для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы предстательной железы, являются антитела, раскрытые в WO 97/35616-А1, WO 99/47554-А1, WO 01/009192-А1 и WO2003/034903. Примеры анти-PSMA конъюгатов раскрыты в WO 2009/026274-А1 и WO 2007/002222. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-ЕРНА2 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу ЕРНА2 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, раскрыты в WO 2004/091375-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-SLC44A4 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу SLC44A4 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы поджелудочной железы или предстательной железы, раскрыты в WO 2009/033094-A2 и US 2009/0175796-A1. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-HLA-DOB антитела

Примером антитела, которое связывается с раковой целевой молекулой HLA-DOB, является антитело Lym-1 (CAS RN: 301344-99-0), которое можно применять для лечения злокачественного новообразования, например, неходжкинской лимфомы. Примеры анти-HLA-DOB конъюгатов раскрыты, например, в WO 2005/081711-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-VTCN1 антитела

Примеры антител, которые связывают раковую целевую молекулу VTCN1 и можно применять для получения конъюгата и для лечения злокачественного новообразования, например, карциномы яичников, рака поджелудочной железы, легких или молочной железы, раскрыты в WO 2006/074418-А2. В качестве ссылки, эти антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включены в настоящую заявку, и они могут использоваться в контексте настоящего изобретения.

Анти-FGFR2 антитела

В соответствии с изобретением, можно применять анти-FGFR2 антитела.

Примеры анти-FGFR2 антител и антигенсвязывающих фрагментов описаны в WO 2013076186. В качестве ссылки, все антитела WO 2013076186 таким образом включены в описание настоящего изобретения, и они могут применяться в настоящем изобретении. Последовательности антител представлены в Таблица 9 и Таблице 10 WO 2013076186. Предпочтение отдают антителам, антигенсвязывающим фрагментам и вариантам антител, производным антител, которые обозначены как M048-D01 и M047-D08. Предпочтительные анти-FGFR2 связываются с различными вариантами сплайсинга, известными для FGFR2.

В одном варианте осуществления, анти-FGFR2 антитела или их антигенсвязывающие фрагменты после связывания с клеткой, экспрессирующей FGFR2, интернализируются клеткой.

В дополнительном варианте осуществления, анти-FGFR2 антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител содержат по меньшей мере одну, две или три CDR аминокислотные последовательности антитела, представленные в Таблице 9 или Таблице 10 WO 2013076186. Предпочтительные варианты осуществления таких антител также представлены в WO 2013076186 и включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Анти-TWEAKR антитела

В предпочтительном варианте осуществления, когда анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент применяют в способах в соответствии с настоящим изобретением, это антитело или фрагмент выбирают из структур, описанных ниже (также опубликованы в WO 2014/199817 (А1)). Кроме того, антитела, которые связываются с TWEAKR, известны специалисту в данной области техники, см., например, WO 2009/020933 (A2) или WO 2009140177 (А2). Кроме того, можно применять негликозилированные варианты описанных анти-TWEAKR антител, которые получают либо путем дегликозилирования с помощью ПНГазы F или путем мутации N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи на любую аминокислоту. Кроме того, также можно применять варианты антител, которые были сконструированы таким образом, чтобы они содержали один или несколько акцепторных глутаминов для опосредованных трансглутаминазой реакций.

Изобретение относится, в частности, к конъюгатам с антителами или их антигенсвязывающими фрагментами или их вариантами, которые приводят к сильной активации TWEAKR (SEQ ID NO: 169 (белок); SEQ ID NO: 170 (ДНК)), что приводит к сильной индукции апоптоза в различных раковых клетках, сверхэкспрессирующих TWEAKR.

Агонистическая активность TWEAKR по отношению к индукции апоптоза и ингибированию пролиферации уже описанных анти-TWEAKR антител (например, PDL-192) ограничена и не достигает эффективности эндогенного лиганда TWEAK. Это отсутствие достаточной агонистической активности не основывается на уменьшенной аффинности, поскольку эти антитела, связывающиеся с TWEAKR с аффинностями, которые сопоставимы с эндогенным лигандом TWEAK, находятся в сходном диапазоне (Michaelson JS и др., MAbs. 2011 Jul-Aug; 3(4):362-75; Culp РА и др., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15; 16(2):497-508), и даже антитела, имеющие более высокую связывающую аффинность, не обязательно проявляют более эффективную активность передачи сигналов (Culp РА, и др., Clin Cancer Res. 2010 Jan 15; 16(2):497-508). Кроме того, было показано, что противоопухолевая активность уже описанных антител зависит от Fc эффекторной функции, и было показано, что ADCC играет важную роль для эффективности in-vivo на мышиных моделях.

Создание анти-TWEAKR антитела

Полную фаговую библиотеку антител человека (Hoet RM и др., Nat Biotechnol 2005; 23(3):344-8) использовали для выделения TWEAKR-специфических человеческих моноклональных антител настоящего изобретения путем пэннинга белка (Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005; 23(3):1105-16), используя димерные Fc-слитые внеклеточные домены человеческого и мышиного TWEAKR в качестве иммобилизованной мишени. Идентифицировали 11 различных Fab фагов, и соответствующие антитела клонировали в EgG экспрессионном векторе млекопитающих, который обеспечивает отсутствие СН2-СН3 доменов в растворимом FAb. После идентификации предпочтительных антител, их экспрессировали в виде полноразмерных IgG. Негликозилированные варианты описанных антител создавали путем введения мутаций N297A или N297Q в тяжелой цепи соответствующего антитела. Эти конструкции экспрессировали, например, транзиентно в клетках млекопитающих, как описано Tom и др., глава 12 в Methods Express: Expression Systems, под редакцией Micheal R. Dyson и Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 (см. AK-Пример 1). Антитела очищали с помощью хроматографии на белке-А и дополнительно характеризовали с помощью их связывающей аффинности к растворимому мономерному TWEAKR, используя ELISA и BIAcore анализ, как описано в AK-Примере 2. Для определения характеристик клеточного связывания анти-TWEAKR антител, связывание исследовали с помощью проточной цитометрии на ряде клеточных линий (НТ29, HS68, HS578). Проводили исследования NFκB репортерного гена для определения агонистической активности всех идентифицированных 11 антител (IgG1 человека). Антитело, имеющее наивысшую активность in vitro (ТРР-883) отбирали для дальнейшего созревания активности и аффинности (см. AK-Пример 1 для более подробной информации). Детектировали вариант с одной заменой, имеющий улучшенную агонистическую активность: G102T из CDR-H3. В конечном итоге, отбирали 7 вариантов на основании повышенной аффинности по сравнению с наилучшим вариантом с одной заменой G102T. Их соответствующую ДНК клонировали в IgG экспрессионном векторе млекопитающих и исследовали для определения функциональной активности в исследовании NF-каппаВ репортерного гена, упомянутом выше. В конечном итоге, полученные последовательности сравнивали с последовательностями зародышевой линии человека, и адаптировали отклонения без какого-либо существенного влияния на аффинность и эффективность. Получали следующие антитела путем скрининга библиотек антител и путем созревания аффинности и/или активности: "ТРР-2090", "ТРР-2149", "ТРР-2093", "ТРР-2148", "ТРР-2084", "ТРР-2077", "ТРР-1538", "ТРР-883", "ТРР-1854", "ТРР-1853", "ТРР-1857", и "ТРР-1858".

Кроме того, антитела согласно изобретению можно получить с помощью методов, известных в данной области техники, таких как скрининг фагового дисплея антител (см., например, Hoet RM и др., Nat Biotechnol 2005; 23(3):344-8), хорошо разработанной гибридомная технология (см., например, и Milstein Nature. 1975 Aug 7; 256(5517):495-7) или иммунизация мыши, среди прочего иммунизация мыши hMAb (например, VelocImmune mouse®).

Конкретные варианты осуществления анти-TWEAKR антител

Одним вариантом согласно изобретению является обеспечение антител или их антигенсвязывающих фрагментов или их вариантов, проявляющих сильную индукцию каспазы 3/7 в одной или нескольких клеточных линиях, экспрессирующих TWEAKR. В предпочтительном варианте осуществления, одна или несколько клеточных линий, экспрессирующих TWEAKR, представлена/представлены в группе, состоящей из WiDr, А253, NCI-H322, НТ29 и 786-O. "Индукция каспазы 3/7" может быть измерена с помощью общепринятых методов, известных в данной области техники, включая описанные в настоящей заявке. В одном варианте осуществления, "индукцию каспазы 3/7" определяют в соответствии с настоящим изобретением, используя определение активности с раствором каспазы 3/7 (Promega, #G8093) и считывания люминесценцию на VICTOR V (Perkin Elmer). После окончания времени инкубирования, определяли активность каспазы 3/7 и определяли фактор индукции каспазы 3/7 по сравнению с необработанными клетками. Считают, что антитело проявляет "сильную индукцию" каспазы 3/7, если фактор индукции больше, чем 1.2, предпочтительно больше, чем 1.5, еще более предпочтительно больше, чем 1.8, еще более предпочтительно больше, чем 2.1, еще более предпочтительно больше, чем 2.5. Обеспечиваются анти-TWEAKR антитела, приводящие к более сильной индукции каспазы 3/7 в НТ29 клетках по сравнению с уже описанными агонистичными антителами [например, PDL-192(ТРР-1104), Р4А8(ТРР-1324), 136.1(ТРР-2194)] и также по сравнению с 300 нг/мл рекомбинантного человеческого TWEAK. Эту сильную активность индуцирования каспазы 3/7 в раковых клетках также наблюдали в WiDr, А253, NIC-H322 и 786-O клетках, где в большинстве экспериментов исследуемые антитела согласно изобретению индуцировали больше факторов изменения по сравнению со сравнительными антителами [PDL-192(TPP-1104), Р4А8(ТРР-1324)] и с 300 нг/мл TWEAK. Некоторые антитела согласно изобретению связываются с TWEAKR только с умеренной аффинностью (>10 нМ), которая значительно ниже, чем аффинность эндогенного лиганда TWEAK, а также ниже по сравнению с другими известными агонистическими антителами. Это свойство обеспечивает дальнейшие возможные преимущества, такие как, например, потенциально более глубокое проникновение в опухоль.

В этой связи, одним вариантом согласно изобретению является обеспечение антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются специфически с TWEAKR в новом эпитопе, характеризующихся селективным связыванием с аспартатом (D) в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169; см. также Фигуру 1). Эти зависимости, идентифицированные для определенных TWEAKR аминокислот для взаимодействия антител, коррелируют с агонистической активностью, определенной для этих антител. Нативный лиганд TWEAK проявляет эффективную активацию TWEAKR и связывается в зависимости от лейцина 46 в обогащенном цистеином домене TWEAKR (Pellegrini и др., FEBS 280:1818-1829). Р4А8 проявляет чрезвычайно низкую агонистическую активность и взаимодействует по меньшей мере частично с доменами, за пределами обогащенного цистеином домена TWEAKR. PDL-192 проявляет умеренную агонистическую активность и связывается в зависимости от R56 с обогащенным цистеином доменом, но противоположно сайту TWEAK лиганда. Антитела согласно настоящему изобретению (например, ТРР-2090) связываются в зависимости от D47, и TWEAK связывается в зависимости от L46. Таким образом, TWEAK связывается со сходным, но другим связывающим сайтом (Фигура 7). Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению проявляют сильную агонистическую активность связывания с новым эпитопом (D47-зависимым) для антител, связанных с чрезвычайно высокой агонистической активностью.

Аминокислота в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169 считается решающей для связывания антител в соответствии с изобретением, что означает, что антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 20%, альтернативно более чем 30%, альтернативно более чем 40%, альтернативно более чем 50%, альтернативно более чем 60%, альтернативно более чем 70%, альтернативно более чем 80%, альтернативно более чем 90%, альтернативно 100% его ELISA сигнала путем модификации этого остатка на аланин, как описано в AK-Примере 2 и на Фигуре 6. Альтернативно, антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 20%, альтернативно более чем 30%, альтернативно более чем 40%, альтернативно более чем 50%, альтернативно более чем 60%, альтернативно более чем 70%, альтернативно более чем 80%, альтернативно более чем 90%, альтернативно 100% его ELISA сигнала для ТРР-2614 по сравнению с ТРР-2203. Предпочтительно, антитело специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), когда антитело теряет более чем 80% его ELISA сигнала для ТРР-2614 по сравнению с ТРР-2203.

В настоящей заявке представлены ссылки на следующие предпочтительные антитела согласно изобретению, как показано в таблице ниже: "ТРР-2090", "ТРР-2149", "ТРР-2093", "ТРР-2148", "ТРР-2084", "ТРР-2077", "ТРР-1538", "ТРР-883", "ТРР-1854", "ТРР-1853", "ТРР-1857", "ТРР-1858; ТРР-2658".

ТРР-2090 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 2, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-2658 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 241, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-5442 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 242, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-8825: представляет собой антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 243, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 1.

ТРР-2149 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 12, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 11.

ТРР-2093 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 22, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 21.

ТРР-2148 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 32, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 31.

ТРР-2084 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 42, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 41.

ТРР-2077 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 52, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 51.

ТРР-1538 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 62, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 61.

ТРР-883 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 72, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 71.

ТРР-1854 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 82, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 81.

ТРР-1853 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 92, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 91.

ТРР-1857 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 102, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 101.

ТРР-1858 представляет собой: антитело, которое содержит участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 112, и участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 111.

ТРР-2090 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-2658 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-5442 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-8825 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 10, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 9.

ТРР-2149 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 20, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 19.

ТРР-2093 представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 30, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 29.

ТРР-2148: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 40, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 39.

ТРР-2084: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 50, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 49.

ТРР-2077: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 60, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 59.

ТРР-1538: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 70, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 69.

ТРР-883: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 80, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 79.

ТРР-1854: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 90, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 89.

ТРР-1853: представляет собой: антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 100, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 99.

ТРР-1857: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 110, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 109.

ТРР-1858: представляет собой антитело, которое содержит вариабельный участок тяжелой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 120, и вариабельный участок легкой цепи, соответствующий SEQ ID NO: 119.

Предпочтительные варианты осуществления анти-TWEAKR антитела приведены ниже:

Негликозилированное анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(-ый) специфически связывается с D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1, где антитело представляет собой агонистическое антитело.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с вариантом осуществления 1 или 2, которое(-ый) содержит:

вариабельную тяжелую цепь, содержащую:

CDR1 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу PYPMX (SEQ ID NO: 171), где X означает I или М;

CDR2 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу YISPSGGXTHYADSVKG (SEQ ID NO: 172), где X означает S или K; и

CDR3 тяжелой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу GGDTYFDYFDY (SEQ ID NO: 173);

и вариабельную легкую цепь, содержащую:

CDR1 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу RASQSISXYLN (SEQ ID NO: 174), где X означает G или S;

CDR2 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу XASSLQS (SEQ ID NO: 175), где X означает Q, А или N; и

CDR3 легкой цепи, кодируемый аминокислотной последовательностью, содержащей формулу QQSYXXPXIT (SEQ ID NO: 176), где X в положении 5 означает Т или S, X в положении 6 означает Т или S и X в положении 8 означает G или F.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее(-ий):

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7, и вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 8, и

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 3, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 4, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 5 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 13, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 14, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 15 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 26, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 27, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 28, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 23, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 24, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 25 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 36, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 37, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 38, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 33, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 34, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 35 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 46, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 47, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 48, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 43, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 44, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 45 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 56, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 57, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 58, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 53, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 54, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 55 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 66, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 67, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 68, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 63, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 64, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 65 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 76, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 77, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 78, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 73, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 74, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 75 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 86, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 87, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 88, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 83, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 84, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 85 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 96, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 97, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 98, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 93, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 94, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 95 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 106, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 107, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 108, и также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 103, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 104, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 105 или

вариабельную тяжелую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 116, вариабельную CDR2 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 117, вариабельную CDR3 последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 118, а также

вариабельную легкую цепь, содержащую вариабельную CDR1 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 113, вариабельную CDR2 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 114, и вариабельную CDR3 последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO: 115.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее(-ий):

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 10, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 9, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 20, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 19, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 30, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 29, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 40, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 39, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 50, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 49, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 60, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 59, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 70, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 69, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 80, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 79, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 90, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 89, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 100, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 99, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 110, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 109, или

вариабельную последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 120, а также вариабельную последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 119.

Антитело в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое представляет собой IgG антитело.

Антитело в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, содержащее:

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 2, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 12, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 11, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 21, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 32, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 31, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 42, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 41, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 52, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 51, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 62, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 61, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 72, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 71, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 82, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 81, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 92, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 91, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 102, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 101, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 112, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 111, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 241, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 242, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1, или

последовательность тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 243, а также последовательность легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 1.

Антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления или антигенсвязывающий фрагмент антитела в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, который представляет собой scFv, Fab, Fab' фрагмент или F(ab')2 фрагмент.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое(-ый) представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с любым из предшествующих вариантов осуществления, которое(-ый) представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело или антигенсвязывающий фрагмент.

Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу ТРР-2658.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечиваются антитела, которые являются подходящими для опосредованного трансглутаминазой конъюгирования ингибитора белка кинезина веретена.

Полноразмерные антитела дикого типа изотипа человека обладают консервативным акцепторным глутамином в положении 295 (EU нумерация Кэббота) в тяжелой цепи, который доступный и реакционноспособный в присутствии трансглутаминазы, которая приводит к образованию конъюгата антитела и подходящего соединения, когда антитело находится в негликозилированной форме. Такие негликозилированные антитела или дегликозилированные антитела испытывают отсутствие гликанов, присоединенных к консервативному сайту гликозилирования N297 в СН2 домене Fc участка. Негликозилированные антитела можно получить, например, путем мутации сайта гликозилирования N297 (EU нумерация Кэббота) тяжелой цепи или путем экспрессии антител в экспрессирующих системах с отсутствием гликозилирующей способности. Способы дегликозилирования антител широко известны в данной области техники (например, Winkelhake & Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4): 1074-80)). Дегликозилированные антитела могут быть созданы, например, путем ферментативного дегликозилирования с помощью ПНГазы F. В одном варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить путем экспрессии в прокариотических хозяевах. Подходящие прокариотические хозяева включают, но не ограничиваясь только ими, Е. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и некоторые виды из родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus. В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела можно получить с использованием экспрессионных систем с клетками млекопитающих вместе с ингибитором гликозилирования туникамицином (Nose & Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). В данном случае модификация состоит в предотвращении гликозилирования по консервативном сайту N-гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) тяжелой цепи в СН2 домене Fc участка антитела.

В другом варианте осуществления изобретения, негликозилированные антитела получают путем мутации сайта гликозилирования N297 (номенклатура Кэбота) в тяжелой цепи. Ферментативное конъюгирование таких сконструированных негликозилированных антител было описано для вариантов антител, содержащих мутации N297D, N297Q (Jeger и др., Angewandte Chemie Int. Ed. Engl 49, 9995-9997 (2010)) или N297S (см. патентные заявки WO 2013092998 A1 и WO 2013092983 A2). Кроме того, в настоящем изобретении было показано, что трансглутаминаза может эффективно катализировать конъюгирование вариантов негликозилированных антител, несущих мутацию N297A (EU нумерация Кэббота).

Дополнительные или альтернативные реакционноспособные остатки в присутствии трансглутаминазы могут быть созданы путем конструирования антител. Соединения в соответствии с изобретением включают глутаминовые сконструированные антитела, в которых одна или несколько аминокислот дикого типа или родительского антитела заменяют на глутамины, или в которых глутаминовый остаток, необязательно вместе с другой аминокислотой (например, меткой, содержащей акцепторный глутамин), интродуцируют родительскую молекулу или молекулу дикого типа.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на остаток, отличающийся от глутамина. Предпочтение отдают N297D, N297Q, N297S или N297A, еще большее предпочтение отдают N297A. Антитело, имеющее N297X замену и глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота) следовательно, имеет один акцепторный глутамин на тяжелую цепь. Полная форма IgG, следовательно, имеет два сайта конъюгирования на антитело.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на глутамин. Антитело следовательно, имеет N297Q замену. Антитело, имеющее N297Q замену и глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота) следовательно, имеет два акцепторных глутамина и, следовательно, два сайта конъюгирования на тяжелую цепь. Полная форма IgG следовательно, имеет четыре сайта конъюгирования на антитело.

Глутаминовые остатки антитела, которые являются реакционноспособными в присутствии трансглутаминазы, локализованы в тяжелой цепи, типично в константном домене. В одном варианте осуществления, аспарагин в положении N297 (номенклатура Кэбота) заменен на глутамин и в положении 295 заменен глутамин. Антитело следовательно, имеет N297Q и Q295X замену. Предпочтение отдают Q295N замене. Антитело, имеющее N297Q замену и не содержащее глутамин в положении 295 (номенклатура Кэбота), следовательно, имеет один акцепторный глутамин и следовательно, один сайт конъюгирования на тяжелую цепь. Полная форма IgG, следовательно, имеет два сайта конъюгирования на антитело.

Предпочтительные антитела, пригодные для опосредованного трансглутаминазой конъюгирования, таким образом включают:

i. N297X замену, где X означает любую аминокислоту за исключением аспарагина; более предпочтительными являются N297D, N297Q, N297S или N297A, еще более предпочтительными являются N297A и N297Q.

ii. N297Q замену и Q295X замену, где X означает любую аминокислоту за исключением глутамина, предпочтение отдают Q295N.

Изотопы, соли, сольваты, изотопные варианты

Настоящее изобретение также охватывает все приемлемые изотопные варианты соединений в соответствии с изобретением. Под изотопным вариантом соединения в соответствии с изобретением в данной заявке понимают соединение, в котором, по крайней мере, один атом в соединении в соответствии с изобретением был заменен на другой атом с тем же атомным номером, но с другой атомной массой, чем атомная масса, которая, обычно или преимущественно встречается в природе. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения в соответствии с изобретением, представляют собой такие водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, хлора, брома и йода, такие как ²Н (дейтерий), ³Н (тритий), ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O, ³²Р, ³³Р, ³³S, ³⁴S, ³⁵S, ³⁶S, ¹⁸F, ³⁶Cl, ⁸²Br, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹²⁹I и ¹³¹I. Конкретные варианты изотопных соединений в соответствии с изобретением, в частности, те, в которые были включены один или несколько радиоактивных изотопов, могут быть полезными, например, для изучения механизма действия лекарственного средства или его распределения в организме; благодаря возможности сравнительно легкого получения и способности к обнаружению, в частности, соединения, меченные с помощью ³Н или ¹⁴С изотопов, являются приемлемыми для этой цели. Кроме того, включение изотопов, например, дейтерия, может привести к конкретным терапевтическим преимуществам, вследствие более высокой метаболической стабильности соединения, например, увеличению периода полураспада в организме или снижению необходимой дозы активного соединения; такие модификации соединений в соответствии с изобретением могут, таким образом, в некоторых случаях также представлять собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Изотопные варианты соединений в соответствии с данным изобретением могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники, например, способами, описанными ниже, и в соответствии с методиками, описанными в рабочих примерах, при использовании соответствующих изотопных модификаций соответствующих реагентов и/или исходных соединений.

Предпочтительные соли в контексте настоящего изобретения представляют собой физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с изобретением. Сюда также включены все соли, которые не являются сами по себе пригодными для фармацевтического применения, но могут быть использованы, например, для выделения или очистки соединений в соответствии с изобретением.

Физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с изобретением включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например, соли хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.

Физиологически приемлемые соли соединения в соответствии с изобретением также включают соли обычных оснований, в качестве примера и с предпочтением соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочноземельных металлов (например, соли кальция и магния) и соли аммония, полученные из аммиака или органических аминов, имеющих от 1 до 16 атомов углерода, в качестве примера и с предпочтением соли этиламина, диэтиламина, триэтиламина, этилдиизопропиламина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, дициклогексиламина, диметиламиноэтанола, прокаина, дибензиламина, N-метилпиперидина, N-метилморфолина, аргинина, лизина, этилендиамина и 1,2-этилендиамина.

Формы соединений в соответствии с изобретением, в контексте изобретения называемые сольватами. представляют собой формы, которые в твердом или жидком состоянии образуют комплекс путем координации с молекулами растворителя. Гидраты представляют собой особую форму сольватов, в которых осуществляется координация с водой. Предпочтительные сольваты в контексте настоящего изобретения представляют собой гидраты.

Настоящее изобретение дополнительно также охватывает пролекарства соединений в соответствии с изобретением. Термин "пролекарство" в данном контексте относится к соединениям, которые сами могут быть биологически активными или неактивными, но превращаются (например, метаболически или гидролитически) в соединения в соответствии с изобретением в течение периода пребывания их в организме.

Конкретные варианты осуществления

Следующие варианты осуществления являются особенно предпочтительными:

Вариант осуществления А:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) или следующей формулы (IIf), связующее означает человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (предпочтительно анти-HER2 антитело, анти-EGFR антитело или анти-TWEAKR антитело, более предпочтительно анти-TWEAKR антитело, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в особенности, анти-TWEAKR антитело ТРР-2658), и n означает число от 1 до 10:

Формула (IIf):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает -С(=O)-(карбонил);

R¹ представляет собой -L-#l, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ''(CH₂)_1-3 NH₂ и -CONZ''CH₂COOH, где Z'' представляет собой -Н или -NH₂;

R² означает -H;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)_(0-1)-(P3)(_0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, C_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группа (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ представляет собой -L-#1 или C1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, О-алкила, SH, S-алкила, О-СО-алкила, О-CO-NH-алкила, NH-CO-алкила, NH-CO-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил);

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную С_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

-L - представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Линкер предпочтительно означает линкер

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного ароматический или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты.

В данном случае #1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к связующему (например, L2).

Вариант осуществления В:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf) или следующей формулы (IIg), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIg):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

Х₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает СО (карбонил);

R¹ означает -L-#1, -Н, -СООН, -CONHNH₂, -(CH₂)_1-3NH₂, -CONZ"(CH₂)_1-3NH₂ и -CONZ"CH₂COOH, где Z" представляет собой -Н или -NH₂;

R² означает -Н;

R⁴ представляет собой расщепляемую легумаином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)(_0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_5-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ представляет собой -L-#1 или С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, О-алкила, SH, S-алкила, О-СО-алкила, О-CO-NH-алкила, NH-CO-алкила, NH-CO-NH-алкила, S(O)_n-алкила, SO₂-NH-алкила, NH-алкила, N(алкила)₂ или NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает C_1-3-алкил);

R⁵ означает -Н или -F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой -Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где один из заместителей R¹ и R³ представляет собой -L-#1, и

-L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу.

-L- предпочтительно представлен формулой

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH- и 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, или -SO- (предпочтительно ), где боковые цепи, если присутствуют, могут быть замещены с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Альтернативно, линкер может быть присоединен к лизиновой боковой цепи или остатку лизина.

Вариант осуществления С:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение следующей формулы (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe), (IIf), (IIg) или следующей формулы (IIh), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIh):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает -С(=O)-(карбонил);

R¹ означает -L-#1;

R² означает-Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(1-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, С_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, C_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, -N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ означает С_1-10-алкил-, который необязательно может быть замещен с помощью -ОН, -О-алкила, -SH, -S-алкила, -О-СО-алкила, -O-CO-NH-алкила, -NH-CO-алкила, -NH-CO-NH-алкила, -S(O)_n-алкила, -SO₂-NH-алкила, -NH-алкила, N(алкила)₂ или -NH₂, n представляет собой 0, 1 или 2, (где алкил предпочтительно означает С_1-3-алкил), или -MOD;

где -MOD представляет собой -(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-H, где

R¹⁰ представляет собой -Н или C₁-С₃-алкил;

G1 представляет собой -NHCO-, -CONH- или (где, если G1 представляет собой -NHCO- или , то R¹⁰ не означает NH₂);

n представляет собой 0 или 1; о представляет собой 0 или 1; и

G2 означает прямоцепочечную и/или разветвленную углеводородную группу, которая содержит от 1 до 10 атомов углерода и которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NR^y-, -NR^yCO-, CONR^y-, -NR^yNR^y-, -SO₂NR^yNR^y-, -CONR^yNR^y - (где R^y представляет собой H, фенил, C₁-С₁₀-алкил, С₂-С₁₀-алкенил или С₂-С₁₀-алкинил, каждый из которых может быть замещен с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты), -СО-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, C₁-С₃-алкил или фенил), где углеводородная цепь, включая любые боковые цепи, может быть замещена с помощью NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты, где группа -MOD предпочтительно содержит по меньшей мере одну группу -СООН;

R⁵ означает H или F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н, (необязательно фторированный) C_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную С_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает Н или F,

где -L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

где -L- представлен формулой

§-(CO)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 означает

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O- (где R^x представляет собой Н, С1-С3-алкил или фенил) и 3-10-членного ароматического или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#¹ означает связь к KSP ингибитору и #² означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Вариант осуществления D:

Конъюгат антитела, имеющий формулу

,

где

R2 и R5 представляют собой -Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С₅₁₀-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, -N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R3 представляет собой -СН₂ОН;

R1 представляет собой -L1-L2-СВЯЗУЮЩЕЕ, где

L1 представляет собой

где #2 представляет собой место присоединения к L2 и #1 представляет собой место присоединения к L1;

и L2 представляет собой одну или обе структуры формул А5 и А6, указанных ниже:

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы связующего,

#² обозначает место присоединения к группе L, и

R₂₂ представляет собой -СООН, -COOR, -COR, -CONHR (где R в каждом случае представляет собой C1-3-алкил), -CONH₂, предпочтительно -СООН.

В конъюгате в соответствии с изобретением или в смеси конъюгатов в соответствии с изобретением, связи к цистеиновому остатку связующего присутствуют до степени предпочтительно более чем 80%, особенно предпочтительно более чем 90% (в каждом случае в пересчете на общее число связей линкера к связующему) особенно предпочтительно в форме одной из двух структур формулы А5 или А6.

В данном случае структуры формулы А5 или А6 обычно присутствуют вместе, предпочтительно в соотношении от 60:40 до 40:60, в пересчете на число связей к связующему. Оставшиеся связи в таком случае присутствуют в форме структуры

Связующее предпочтительно означает связующий белок или пептид, особенно предпочтительно человеческое, гуманизированное или химерное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в частности анти-TWEAKR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или анти-EGFR антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Особое предпочтение отдают анти-TWEAKR антителу, которое специфически связывается с аминокислотой D в положении 47 (D47) TWEAKR (SEQ ID NO: 169), в частности анти-TWEAKR антителу ТРР-2658, или анти-EGFR антителу цетуксимабу или нимотузумабу. В качестве альтернативы связующему, также может присутствовать остаток цистеина.

Вариант осуществления Е:

APDC формулы

,

где KSP-L- означает соединение следующей формулы (IIa), (IIb), (IIe), (IId), (IIe), (IIf), (IIg), (IIh) или следующей формулы (IIi), связующее представляет собой антитело и n означает число от 1 до 10:

формула (IIi):

где

X₁ представляет собой N, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой N;

X₁ представляет собой NH, Х₂ представляет собой С и Х₃ представляет собой С; или

X₁ представляет собой СН, Х₂ представляет собой N и Х₃ представляет собой С;

А означает СО (карбонил);

R¹ означает -Н или -СООН,

R² означает -Н;

R⁴ представляет собой группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO- или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, C₅-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, гетероарильную, гетероарилалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, С_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -NH-алкила, N(алкила)₂, NH-CO-алкила, N(алкил)-СОалкила, -SO₃H, -SO₂NH₂, -SO₂-N(алкила)₂, -СООН, -CONH₂, -CON(алкила)₂, или -ОН, -Н или -O_x-(CH₂CH₂O)_v-R²² группу (где х представляет собой 0 или 1 и v представляет собой число от 1 до 20, и R²² представляет собой -Н, -алкил (предпочтительно C1-12-алкил), -СН₂-СООН, -СН₂-СН₂-СООН, или -CH₂-CH₂-NH₂);

Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His или одной из соответствующих N-алкил аминокислот, предпочтительно N-метил аминокислот;

R³ означает -L-#1;

R⁵ означает Н или F;

R⁶ и R⁷ независимо друг от друга представляют собой Н, (необязательно фторированный) С_1-3-алкил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкенил, (необязательно фторированный) С_2-4-алкинил, гидрокси или галоген;

R⁸ означает разветвленную C_1-5-алкильную группу; и

R⁹ означает -Н или -F,

где -L- представляет собой линкер и #1 представляет собой связь к антителу,

где -L- представлен формулой

§-(C=O)_m-L1-L2-§§,

где

m представляет собой 0 или 1;

§ представляет собой связь к KSP и

§§ представляет собой связь к антителу, и

L2 представляет собой

или

где

#¹ обозначает место присоединения к атому серы или атому азота антитела,

#² обозначает место присоединения к группе L¹,

и L1 представлен формулой

#¹-(NR¹⁰)_n-(G1)_o-G2-#²,

где

R¹⁰ представляет собой -Н, -NH₂ или С1-С3-алкил;

G1 представляет собой -NHCO- или ;

n представляет собой 0 или 1;

о представляет собой 0 или 1; и

G2 представляет собой прямоцепочечную или разветвленную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 100 атомов углерода, из ариленовых групп и/или прямоцепочечных и/или разветвленных и/или циклических алкиленовых групп, которая может быть прервана один раз или более одного раза одной или несколькими группами, выбранными из -О-, -S-, -SO-, SO₂, -NH-, -СО-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO₂NHNH-, -CONHNH-, -CR^x=N-O-(где R^x представляет собой Н, С1-С3-алкил или фенил) и 3-10-членного ароматический или неароматического гетероцикла, содержащего вплоть до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О и S, -SO- или -SO₂- (предпочтительно ), где углеводородная цепь, включая боковые цепи, если присутствуют, может быть замещена с помощью -NHCONH₂, -СООН, -ОН, -NH₂, NH-CNNH₂, сульфонамида, сульфона, сульфоксида или сульфоновой кислоты,

#1 означает связь к KSP ингибитору и #2 означает связь к связующей группе, к антителу (например, L2),

и соли, сольваты и соли сольватов APDC.

Терапевтическое применение

Гиперпролиферативные заболевания, для лечения которых могут применяться соединения в соответствии с изобретением, включают, в частности, группу раковых и опухолевых заболеваний. В контексте настоящего изобретения, подразумеваются, в особенности, следующие заболевания, но не ограничиваясь каким-либо образом только ими: карциномы млекопитающих и опухоли млекопитающих (карциномы млекопитающих, включая протоковые и дольковые формы, также in situ), опухоли респираторного тракта (мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома, бронхиальная карцинома), опухоли головного мозга (например, ствола мозга и гипоталамуса, астроцитома, эпендимома, глиобластома, глиома, медуллобластома, менингиома и нейроэктодермальные опухоли и опухоли шишковидной железы), опухоли пищеварительных органов (карциномы пищевода, желудка, желчного пузыря, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки и анальная карцинома), опухоли печени (среди прочего печеночно-клеточная карцинома, холангиокарцинома и смешанная печеночно-клеточная холангиокарцинома), опухоли головы и шеи (карциномы глотки, гортаноглотки, носоглотки, ротоглотки, губ и ротовой полости, оральные меланомы), опухоли кожи (базалиомы, спиналиомы, плоскоклеточные карциномы, саркома Капоши, злокачественная меланома, немеланомный рак кожи, рак кожи из клеток Меркеля, опухоли тучных клеток), опухоли мягких тканей (среди прочего саркомы мягких тканей, остеосаркомы, злокачественные фиброзные гистиоцитомы, хондросаркомы, фибросркомы, гемангиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, лимфосаркомы и рабдомиосаркомы), опухоли глаз (среди прочего внутриглазная меланома и ретинобластома), опухоли эндокринных и экзокринных желез (например, карциномы, аденокарциномы щитовидной и паращитовидной желез, поджелудочной железы и слюнных желез), опухоли мочевыводящих путей (опухоли мочевого пузыря, полового члена, почек, почечной лоханки и уретры) и опухоли репродуктивных органов (карциномы эндометрия, шейки матки, яичников, влагалища, вульвы и матки у женщин и карциномы предстательной железы и яичек у мужчин). Они также включают пролиферативные болезни крови, лимфатической системы и спинного мозга, в солидной форме и в виде циркулирующих клеток, таких как лейкозы, лимфомы и миелопролиферативные заболевания, например, острый миелоидный, острый лимфобластный, хронический лимфоцитарный, хронический миелогенный лейкоз и волосатоклеточный лейкоз, и AIDS-коррелирующие лимфомы, ходжкинские лимфомы, неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, лимфомы Беркита и лимфомы в центральной нервной системе.

Эти хорошо описанные заболевания у людей также могут встречаться со сравнимой этиологией у других млекопитающих и, следовательно, могут подвергаться лечению соединениями настоящего изобретения.

Лечение злокачественных заболеваний, указанных выше, соединениями в соответствии с изобретением включает как лечение солидных опухолей, так и лечение их местастазирующих или циркулирующих форм.

В контексте настоящего изобретения, термин "лечение" или "лечить" используется в общепринятом понимании и обозначает уход, заботу и помощь пациенту с целью борьбы, уменьшения, ослабления или облегчения заболевания или аномального состояния здоровья, и улучшения условий жизни, нарушенных этим заболеванием, как, например, в случае злокачественного новообразования.

Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением для лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением для изготовления лекарственного средства для лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений в соответствии с изобретением в способе лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения и/или предотвращения нарушений, в особенности, указанных выше нарушений, с применением эффективного количества по меньшей мере одного из соединений в соответствии с изобретением.

Соединения в соответствии с изобретением можно применять отдельно или, при необходимости, в комбинации с одним или несколькими другими фармакологически активными веществами, при условии, что эта комбинация не приводит к нежелательным и неприемлемым побочным действиям. Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает лекарственные средства, содержащие по меньшей мере одно из соединений в соответствии с изобретением и одно или несколько других лекарственных препаратов, в особенности, для лечения и/или предотвращения указанных выше нарушений.

Например, соединения настоящего изобретения можно комбинировать с известными анти-гипер-пролиферативными, цитостатическими или цитотоксическими веществами для лечения злокачественных заболеваний. Примеры подходящих комбинаций лекарственных препаратов включают:

131I-chTNT, абареликс, абиратерон, акларубицин, адо-трастузумаб эмтанзин, афатиниб, афлиберцепт, альдеслейкин, алемтузумаб, алендроновая кислота, алитретиноин, альтретамин, амифостин, аминоглютетимид, гексил 5-аминолевулинат, амрубицин, амсакрин, анастрозол, анцестим, анетол дитиолетион, ангиотензин II, антитромбин III, апрепитант, арцитумомаб, арглабин, триоксид мышьяка, аспарагиназа, акситиниб, азацитидин, белотекан, бендамустин, белиностат, бевацизумаб, бексаротен, бикалутамид, бизантрен, блеомицин, бортезомиб, бусерелин, бозутиниб, брентуксимаб ведотин, бусульфан, кабазитаксел, кабозантиниб, фолинат кальция, левофлинат кальция, капецитабин, капромаб, карбоплатин, карфилзомиб, кармофур, кармустин, катумаксомаб, целекоксиб, целмолейкин, церитиниб, цетуксимаб, хлорамбуцил, хлормадинон, хлорметин, цидофовир, цинакальцет, цисплатин, кладрибин, клодроновая кислота, клофарабин, копанлисиб, крисантаспаза, кризотиниб, циклофосфамид, ципротерон, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, дабрафениб, дазатиниб, даунорубицин, децитабин, дегареликс, денилейкин-дифтитокс, деносумаб, депреотид, деслорелин, дексразоксан, диброспидий хлорид, диангидрогалактитол, диклофенак, доцетаксел, доласетрон, доксифлуридин, доксорубицин, доксорубицин + эстрон, дронабинол, эдреколомаб, элиптиний ацетат, эндостатин, эноцитабин, энзалутамид, эпирубицин, эпитиостанол, эпоэтин-альфа, эпоэтин-бета, эпоэтин-дзета, эптаплатин, эрибулин, эрлотиниб, эзомепразол, эстрамустин, этопозид, эверолимус, эксеместан, фадрозол, фентанил, флуоксиместерон, флоксуридин, флударабин, фторурацил, флутамид, фолиевая кислота, форместан, фосапрепитант, фотемустин, фулвестрант, гадобутрол, гадотеридол, меглуминовая соль гадотеровой кислоты, гадоверсетамид, динатриевая соль гадоксетовой кислоты (gd-EOB-DTPA динатриевая соль), нитрат галия, ганиреликс, гефитиниб, гемцитабин, гемтузумаб, глюкарпидаза, глутоксим, гозерелин, гранисетрон, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), дигидрохлорид гистамина, гистрелин, гидроксикарбамид, зерна I-125, ибандроновая кислота, ибритумомаб тиуксетан, идарубицин, ифосфамид, иматиниб, имиквимод, импросульфан, индисетрон, инкадроновая кислота, ингенол мебутат, интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, йобитридол, йобенгуан (123I), йомепрол, ипилимумаб, иринотекан, итраконазол, иксабепилон, ланреотид, лансопразол, лапатиниб, лазохолин, леналидомид, лентинан, летрозол, лейпрорелин, левамизол, левоноргестрел, левотироксин натрий, липегфилграстим, лизурид, лобаплатин, ломустин, лонидамин, мазопрокол, медроксипрогестерон, мегестрол, меларсопрол, мелфалан, мепитиостан, меркаптопурин, месна, метадон, метотрексат, метоксален, метиламинолевулинат, метилпреднизолон, метилтестостерон, метирозин, мифамуртид, милтефозин, мириплатин, митобронитол, митогуазон, митолактол, митомицин, митотан, митоксантрон, могамулизумаб, молграмостим, мопидамол, гидрохлорид морфина, сульфат морфина, набилон, набиксимолс, нафарелин, налоксон + пентазоцин, налтрексон, нартограстим, недаплатин, неларабин, неридроновая кислота, ниволумаб пентетреотид, нилотиниб, нилутамид, ниморазол, нимотузумаб, нимустин, нитракрин, ниволумаб, обинутузумаб, октреотид, офатумумаб, мепесукцинат омацетаксина, омепразол, ондансетрон, орготеин, орилотимод, оксалиплатин, оксикодон, оксиметолон, озогамицин, р53 генная терапия, паклитаксел, зерна палладия-103, палоносетрон, памидроновая кислота, панитумумаб, пантопразол, пазопаниб, пегаспаргаза, пембролизумаб, ПЭГ-интерферон альфа-2b, пеметрексед, пентостатин, пепломицин, перфлубутан, перфосфамид, пертузумаб, пицибанил, пилокарпин, пирарубицин, пиксантрон, плериксафор, пликамицин, полиглусам, полиэстрадиол фосфат, поливинилпирролидон + гиалуронат натрия, полисахарид-K, помалидомид, понатиниб, порфимер натрия, пралатрексат, преднимустин, преднизон, прокарбазин, прокодазол, пропанолол, квинаголид, рабепразол, ракотумомаб, хлорид радия-223, радотиниб, ралоксифен, ралтитрексед, рамосетрон, рамуцирумаб, ранимустин, расбуриказа, разоксан, рефаметиниб, регорафениб, ризедроновая кислота, этидронат рения-186, ритуксимаб, ромидепсин, ромуртид, ронициклиб, самарий (153Sm) лексидронам, сатумомаб, секретин, сипулейцел-Т, сизофиран, собузоксан, натрия глицидидазол, сорафениб, станозолол, стрептозоцин, сунитиниб, талапорфин, тамибаротен, тамоксифен, тапентадол, тазонермин, тецелейкин, технеция (99mTc) нофетумомаб мерпентан, 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-октреотид, тегафур, тегафур + гимерацил + отерацил, темопорфин, темозоломид, темсиролимус, тенипозид, тестостерон, тетрофосмин, талидомид, тиотепа, тималфазин, тиротропин альфа, тиогуанин, тоцилизумаб, топотекан, торемифен, тозитумомаб, трабектедин, трамадол, трастузумаб, треосульфан, третиноин, трифлуридин + типирацил, траметиниб, трилостан, трипторелин, трофосфамид, тромбопоетин, убенимекс, валрубицин, вандетаниб, вапреотид, ваталаниб, вемурафениб, винбластин, винкристин, виндезин, винфлунин, винорелбин, висмодегиб, вориностат, стеклянные микросферы иттрия-90, циностатин, циностатин стималамер, золедроновая кислота, зорубицин.

Кроме того, антитела могут быть выбраны из класса ингибиторов MPS1 или антител против мишеней ОХ-40, CD137 / 4-1ВВ, DR3, IDO1 / IDO2, LAG-3 и CD40.

Кроме того, соединения в соответствии с изобретением быть можно применять в комбинации с лучевой терапией и/или хирургическим вмешательством.

В целом, следующие задачи могут быть решены с помощью комбинаций соединений настоящего изобретения с другими цитостатически или цитотоксически активными средствами:

• улучшенная эффективность замедления роста опухоли, уменьшение ее размера или даже полная ее элиминация, по сравнению с лечением индивидуальным активным компонентом;

• возможность применения химиотерапевтических средств, используемых в более низкой дозировке, по сравнению с таковой в случае монотерапии;

• возможность более переносимой терапии с меньшими побочными эффектами по сравнению с индивидуальным введением;

• возможность лечения более широкого спектра опухолей;

• достижение большей ответной реакции на терапию;

• более длительное время выживания пациента по сравнению с существующей в настоящее время стандартной терапией.

Кроме того, соединения в соответствии с изобретением быть можно применять в комбинации с лучевой терапией и/или хирургическим вмешательством.

Настоящее изобретение также обеспечивает лекарственные средства, которые содержат по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением, типично вместе с одним или несколькими инертными, нетоксичными, фармацевтически приемлемыми наполнителями, и их применение для вышеуказанных целей.

Соединения в соответствии с изобретением могут действовать системно и/или местно. Для этой цели, они могут вводиться подходящим образом, например, парентерально, возможно ингаляционно или в виде имплантов или стентов.

Соединения в соответствии с изобретением можно вводить в лекарственных формах, подходящих для этих путей введения.

Парентеральное введение может обходиться без стадии абсорбции (например, внутривенное, внутриартериальное, интракардиальное, интраспинальное или интралюмбальное) или включать поглощение (например, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, чрескожное или внутрибрюшинное). Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают препараты для инъекций и инфузии в виде растворов, суспензий, эмульсий или лиофилизатов. Предпочтение отдают парентеральному введению, в особенности, внутривенному введению.

В общем, было обнаружено, что благоприятным в случае парентерального введения является введение количеств от приблизительно 0.001 до 1 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 0.01 до 0.5 мг/кг, массы тела для достижения эффективных результатов.

Тем не менее, в некоторых случаях может быть необходимым отклоняться от указанных количеств, специфически в зависимости от массы тела, пути введения, индивидуального ответа на лекарственное средство, природы препарата и времени или интервала, в течение которого осуществляется введение. Таким образом, в некоторых случаях, может быть достаточно меньше вышеуказанного минимального количества, в то время как в других случаях верхний указанный предел следует превысить. В случае введения больших количеств, может быть желательным разделять их на несколько индивидуальных доз в течение суток.

Примеры

Примеры, которые представлены далее, иллюстрируют изобретение. Изобретение не ограничивается примерами.

Если не указано иначе, процентные значения в тестах и примерах, которые представлены далее, представляют собой процентные значения по массе; части представляют собой массовые части. Соотношения растворителей, степени разведения и данные концентрации для растворов жидкость/жидкость в каждом случае пересчитаны на объем.

Пути синтеза:

В качестве примера "рабочих примеров", следующие схемы показывают иллюстративные пути синтеза, приводящие к рабочим примерам: В этих схемах атом водорода в положении R⁴ формулы IIa (т.е. в группе -NH₂) может быть заменен на группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-NH-CH(CH₂CONH₂)-CO-или расщепляемую катепсином группу формулы R²¹-(CO)(_0-1)-(P3)_(0-2)-P2-,

где Р2 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

Р3 означает аминокислоту, выбранную из Gly, Pro, Ala, Val, Nva, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, цитруллина и His;

где R²¹ представляет собой С_1-10-алкильную, С_6-10-арильную или С_6-10-аралкильную, C_5-10-гетероалкильную, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арильную, С_5-10-гетероциклоалкильную, С_1-10-алкокси, С_6-10-арилокси или С_6-10-аралкокси, С_5-10-гетероалкокси, С_1-10-алкил-О-С_6-10-арилокси, C_5-10-гетероциклоалкокси группу, которая может быть моно- или полизамещена с помощью - NH₂, -SO₃H, -СООН, -SH или -ОН.

Схема 1: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 2: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 3: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 4: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 5: Синтез лизин-присоединенных ADC

а) трифосген, ТГФ, в атмосфере аргона

Схема 6: Синтез лизин-присоединенных ADC

Схема 7: Синтез молекул-предшественников ADC

[a): EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, КТ; b) этанол, пиперидин, метиламин, вода, КТ; с) HATU, диизопропилэтиламин, КТ; d) ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 8: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; b) например, ДХМ/ТФУ 20:1, КТ; с) например, HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 9: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, тетрафторборат 2-бром-1-этилпиридиния, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ; b) например, 2М раствор LiOH, ТГФ, вода, КТ, ВЭЖХ разделение региоизомеров; с) например, EDCI, НОВТ, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 10: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Н₂, Pd-C, EtOH, КТ; b) например, n-нитробензил бромид, K₂CO₃, ДМФА; с) например, этанол, раствор 40% концентрации метиламина в воде, 50°С; d) например, дитионит динатрия, ТГФ, вода, 50°С; е) например, HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; f) например, пиперидин, раствор 40% концентрации метиламина в воде, этанол, 50°С; g) например, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; h) например, пиперидин, ДМФА, КТ; i) ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 11: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Et₃N, ДМФА, КТ; b) например, Н₂, Pd-C, EtOH/этилацетат/ТГФ (1:1:1), КТ; с) например, 4-метилморфолин, ДМФА, КТ; d) например, HATU, HOAt, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; е) например, ТФУ, КТ]

Схема 12: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; b) например, хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, Cs₂CO₃, ДМФА, 50°С; d) например, гидрохлорид 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1), T3P^(R), диизопропилэтиламин, MeCN, КТ; е) например, ТФУ, КТ]

Схема 13: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, метансульфонил хлорид, NEt₃, дихлорметан, 0°С; b) например, NaN₃, ДМФА, 40°С; с) например, Н₂, Pd-C, EtOH/этилацетат (1:1), КТ; d) например, TBAF, ТГФ, КТ; е) например, 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дион, NEt₃, CaCO₃, 1,4-диоксан, КТ; f) например, N-хлорсукцинимид, TEMPO, хлорид тетра-н-бутиламмония, хлороформ, 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1); g) например, NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; h) например, хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; i) например, TBAF, ТГФ, вода, КТ; j) например, 4-метилморфолин, ДМФА, КТ; k) например, ТФУ, КТ]

Схема 14: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, формальдегид, Na₂CO₃, вода, КТ; b) например, Ас₂О, пиридин, ТГФ, КТ; с) например, ди-трет-бутил малонат, KOtBu, ТГФ, КТ; d) например, LiBH₄, ТГФ, КТ; е) например, TBDMSCl, имидазол, ДХМ, КТ; f) например, периодинан Десса-Мартина, ДХМ; g) например, триацетоксиборогидрид натрия, АсОН, ДХМ, КТ; h) например, nBu₄NF, ТГФ, КТ; i) например, SOCl₂, ТГФ, КТ; j) например, AcSK, nBu₄NI, ДМФА, 90°С; k) например, NaOH, МеОН, ТГФ, КТ; 1) например, ТСЕР, диоксан, КТ; m) например, разделение эпимеров; n) например, 6 н. хлористоводородная кислота, ТГФ, КТ; о) например, Mal-dPEG(3)-Mal, PBS буфер, ACN, КТ]

Схема 15: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, Mal-dPEG(3)-Mal, PBS буфер, ACN, КТ]

Схема 16: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, BF₃OEt₂, ТГФ, 0°С; b): например, изоамилнитрит, -10°С, 0.5 ч; с): например, метил 2-хлор-3-оксобутаноат, пиридин, вода, -5°С; d): например, NEt₃, толуол, KT; е): например, Et₃SiH, ТФУ, КТ; f): например, LiBH₄, ТГФ, 60°С; g): например, периодинан Десса-Мартина, ДХМ, КТ; h): например, (R)-(+)-метил-2-пропансульфинамид, изопропилат титана(IV), ТГФ, КТ; i): например, трет-BuLi, пентан, ТГФ, -78°С; j): например, HCl в диоксане, ТГФ, МеОН, КТ; k): например, 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналь, NaB(OAc)₃H, АсОН, ДХМ, КТ; l): например, 2-хлор-2-оксоэтилацетат, NEt₃, ДХМ, КТ; m): например, метиламин, вода, EtOH, 50°С]

Схема 17: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): например, трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-5-оксо-b-норвалинат, NaB(OAc)₃H, АсОН, ДХМ, КТ; b): например, 2-хлор-2-оксоэтилацетат, NEt₃, ДХМ, КТ; с): например, метиламин, вода, EtOH, 60°С; d): например, ТГФ, ДХМ, 50°С; е): например, Boc₂O, NEt₃, ДХМ, КТ; f): например, трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1), HATU, диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ; f): например, ТФУ, ДХМ, КТ]

Схема 18: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 19: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 20: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 21: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 22: Синтез промежуточных соединений

[а): например, триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) например, ацетоксиацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, LiOH, ТГФ/вода, КТ; d) например, Н₂, Pd-C, EtOH, КТ; е) например, Teoc-OSu, NEt₃, диоксан, КТ; f) например, Fmoc-Cl, диизопропилэтиламин, диоксан/вода 2:1, КТ]

Схема 23: Синтез промежуточных соединений

[а): например, триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) например, ацетоксиацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) например, LiOH, метанол, КТ; d) например, ТФУ, ДХМ, КТ; е) например, Boc₂O, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ]

Схема 24: Синтез промежуточных соединений

[а): например, бензил бромид, Cs₂CO₃, ДМФА, КТ; b) например, Pd(dppf)₂Cl₂, ДМФА, Na₂CO₃, 85°С; с) например, LiAlH₄, ТГФ, 0°С; MnO₂, ДХМ, КТ; d) например, Ti(iOPr)₄, ТГФ, КТ; е) например, tBuLi, ТГФ, -78°С; МеОН, NH₄Cl; f) например, HCl/1,4-диоксан]

Схема 25: Синтез цистеин-присоединенных ADC

Схема 26: Синтез цистеин-присоединенных ADC через гидролизованные сукцинамиды

Этот способ использовали, в частности, для ADC, где L1=СН₂, для превращения этих ADC в связующую форму с открытой цепью.

Схема 27: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) ацетоксиацетил хлорид, диизопропилэтиламин, ДХМ, КТ; с) LiOH, МеОН, КТ;

d) трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 28: Синтез молекул-предшественников ADC

[a): HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; b) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 29: Синтез молекул-предшественников ADC

[а): триацетоксиборогидрид натрия, уксусная кислота, ДХМ, КТ; b) ацетоксиацетил хлорид, триэтиламин, ДХМ, КТ; с) LiOH, МеОН, КТ; d) трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С, EDTA]

Схема 30: Общий способ синтеза промежуточных соединений и предшественников ADC

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) R²¹-COOH, EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²¹-COOH, HATU, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ или R²¹-COOSu, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Схема 31: Синтез молекул-предшественников ADC, содержащих расщепляемые легумаином линкеры

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Схема 32: Синтез молекул-предшественников ADC, содержащих расщепляемые легумаином линкеры

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ или EDCI, НОВТ, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ b) Н₂, 10% Pd-C, МеОН, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, КТ]

Кроме того, другие промежуточные соединения в соответствии со Схемами 32, 33 и 34 могут быть превращены в расщепляемые легумаином ADC и APDC предшественники.

В качестве альтернативы бензилоксикарбонильной группе, показанной на Схемах 32-34, можно использовать другие защитные группы, широко известные в химии пептидов, и присоединять их соответствующими способами, которые также известны. Выбор стратегии применения защитных групп осуществляют в соответствии с требованиями, известными специалистам в данной области касающимися совместимости с другими структурными элементами, которые встречаются в молекуле. Если они все еще присутствуют, дальнейшие защитные группы в молекуле могут быть удалены на последней стадии.

Что касается их последовательности проведения, синтезы необязательно также можно проводить в ином порядке.

Схема 33: Синтез цистеин-присоединенных ADC с отщепляемой легумаином концевой группой

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ; b) 2-5 экв. ТСЕР, PBS рН 7.2, перемешивание при КТ в течение 30 мин; с) перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 90 мин, затем повторная буферизация до рН 8 с помощью PD 10 колонок (Sephadex® G-25, GE Healthcare) и перемешивание в атмосфере аргона при КТ в течение ночи и последующее концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и доведение до желаемой концентрации с помощью PBS при рН 7.2)]

Схема 34: Синтез лизин-присоединенных ADC с расщепляемым легумаином линкером

[a): HATU, ДМФА, N,N-диизопропилэтиламин, КТ; b) Н₂, 10% Pd-C, метанол 1.5 ч, КТ; с) 1,1'-[(1,5-диоксопентан-1,5-диил)бис(окси)]дипирролидин-2,5-дион, N,N-диизопропилэтиламин, ДМФА, перемешивание при КТ в течение ночи; d) АК2 в PBS, добавление 5 экв. активного сложного эфира, растворенного в ДМСО, перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 60 мин, добавление еще 5 экв. активного сложного эфира, растворенного в ДМСО, перемешивание при КТ в атмосфере аргона в течение 60 мин, затем очистка с помощью PD 10 колонок, уравновешенных PBS буфером (рН 7.2) (Sephadex® G-25, GE Healthcare) и последующее концентрирование с помощью ультрацентрифугирования и доведение до желаемой концентрации с помощью PBS буфера (рН 7.2)]

Схема 35: Синтез ADC предшественников с отщепляемой легумаином концевой группой

[a): NaBH(OAc)₃, НОАс, дихлорметан, КТ; b) хлорацетил хлорид, NEt₃, ДХМ, КТ; с) L-цистеин, NaHCO₃, DBU, изопропанол/вода, 50°С; d) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ; е) хлорид цинка, трифторэтанол, 50°С; f) d) HATU, ДМФА, диизопропилэтиламин, КТ]

Схема 36: Синтез ADC через сочетание с помощью трансглутаминазы

[а: 5 мг AK3 в DPBS рН 7.4 (с~10 мг/мл), 6 эквивалентов токсофорлинкерного предшественника (например, Промежуточного соединения Q31-Q34), добавление 50 мкл раствора 12.5 мкл (1.25 Ед) раствора рекомбинантной бактериальной трансглутаминазы в воде (100 Ед/мл) и 37.5 мкл DPBS рН 7.4, инкубация при 37°С в течение 24 ч].

А. Примеры

Аббревиатуры и сокращения:

Сокращения аминокислот

Ala = аланин

Arg = аргинин

Asn = аспарагин

Asp = аспарагиновая кислота

Cys = цистеин

Glu = глутаминовая кислота

Gln = глутамин

Gly = глицин

His = гистидин

Ile = изолейцин

Leu = лейцин

Lys = лизин

Met = метионин

Nva = норвалин

Phe = фенилаланин

Pro = пролин

Ser = серии

Thr = треонин

Trp = триптофан

Tyr = тирозин

Val = валин

Методы ВЭЖХ и ЖХ-МС:

Метод 1 (ЖХ-МС):

Прибор: Waters ACQUITY SQD UPLC system; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 90% А→1.2 мин 5% А→2.0 мин 5% А; печь: 50°С; скорость потока: 0.40 мл/мин; УФ детектирование: 208-400 нм.

Метод 2 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, ВЕН300, 2.1×150 мм, С18 1.7 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→1.5 мин 2% В→8.5 мин 95% В→10.0 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 0.50 мл/мин; УФ детектирование: 220 нм.

Метод 3 (ЖХ-МС):

МС прибор: Waters (Micromass) QM; ВЭЖХ прибор: Agilent 1100 series; колонка: Agilent ZORBAX Extend-C18 3.0×50 мм 3.5 микрон; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01 моль карбоната аммония, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила; градиент: 0.0 мин 98% А→0.2 мин 98% А→3.0 мин 5% А→4.5 мин 5% А; печь: 40°С; скорость потока: 1.75 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 4 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, HSST3, 2.1×50 мм, С18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 10% В→0.3 мин 10% В→1.7 мин 95% В→2.5 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 5 (ЖХ-МС):

Прибор: Waters ACQUITY SQD UPLC system; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 95% А→6.0 мин 5% А→7.5 мин 5% А; печь: 50°С; скорость потока: 0.35 мл/мин; УФ детектирование: 210-400 нм.

Метод 6 (ЖХ-МС):

Прибор: Micromass Quattro Premier с Waters UPLC Acquity; колонка: Thermo Hypersil GOLD 1.9 мк 50×1 мм; подвижная фаза A: 1 л воды + 0.5 мл муравьиной кислоты 50% концентрации; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.5 мл муравьиной кислоты 50% концентрации; градиент: 0.0 мин 97% А→0.5 мин 97% А→3.2 мин 5% А→4.0 мин 5% А печь: 50°С; скорость потока: 0.3 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 7 (ЖХ-МС):

Прибор: Agilent МС Quad 6150; ВЭЖХ: Agilent 1290; колонка: Waters Acquity UPLC HSS Т3 1.8 мк 50×2.1 мм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл муравьиной кислоты 99% концентрации; градиент: 0.0 мин 90% А→0.3 мин 90% А→1.7 мин 5% А→3.0 мин 5% А печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 205-305 нм.

Метод 8 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Waters Synapt G2S; тип СВЭЖХ прибора: Waters Acquity I-CLASS; колонка: Waters, HSST3, 2.1×50 мм, С18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→2.0 мин 2% В→13.0 мин 90% В→15.0 мин 90% В; печь: 50°С; скорость потока: 1.20 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Метод 9: ЖХ-МС-Преп. метод очистки для примеров 181-191 (Метод LIND-ЖХ-МС-Преп.)

МС прибор: Waters; ВЭЖХ прибор: Waters (колонка Waters X-Bridge С18, 19 мм х 50 мм, 5 мкм, подвижная фаза А: вода + 0.05% аммиака, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) с градиентом; скорость потока: 40 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210 - 400 нм).

или

МС прибор: Waters; ВЭЖХ прибор: Waters (колонка Phenomenex Luna 5 мк С 18(2) 100А, AXIA Tech. 50×21.2 мм, подвижная фаза А: вода + 0.05% муравьиной кислоты, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) с градиентом; скорость потока: 40 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210-400 нм).

Метод 10: ЖХ-МС аналитический метод для примеров 181-191 (LIND_SQD_SB_AQ)

МС прибор: Waters SQD; ВЭЖХ прибор: Waters UPLC; колонка: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 мм × 2.1 мм, 1.8 мкм; подвижная фаза А: вода + 0.025% муравьиной кислоты, подвижная фаза В: ацетонитрил (ULC) + 0,025% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 98%А - 0.9 мин 25%А - 1.0 мин 5%А - 1.4 мин 5% А - 1.41 мин 98% А - 1.5 мин 98% А; печь: 40°С; скорость потока: 0.600 мл/мин; УФ детектирование: DAD; 210 нм.

Метод 11 (ВЭЖХ):

Прибор: НР1100 Series;

колонка: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4.6 мм, № кат. 1.51450.0001, предварительная колонка Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4.6 мм, № кат. 1.51470.0001;

Длина волны: 210 нм.

Метод 12 (ЖХ-МС):

Тип МС прибора: Thermo Scientific FT-MS; тип прибора УВЭЖХ+: Thermo Scientific UltiMate 3000; колонка: Waters, HSST3, 2.1×75 мм, C18 1.8 мкм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 10% В→2.5 мин 95% В→3.5 мин 95% В; печь: 50°С; скорость потока: 0.90 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм / Optimum Integration Path 210-300 нм.

Метод 13: (ЖХ-МС):

МС прибор: Waters (Micromass) Quattro Micro; прибор Waters UPLC Acquity; колонка: Waters ВЕН C18 1.7 мкм 50×2.1 мм; подвижная фаза А: 1 л воды + 0.01 моль формиата аммония, подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила; градиент: 0.0 мин 95% А→0.1 мин 95% А→2.0 мин 15% А→2.5 мин 15% А→2.51 мин 10% А→3.0 мин 10% А; печь: 40°С; скорость потока: 0.5 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Все реагирующие вещества или реагенты, получение которых не описано в явной форме далее в настоящей заявке, приобретали коммерчески из обычно доступных источников. Для всех реагирующих веществ или реагентов, приготовление которых не описано в явной форме далее в настоящей заявке и которые не получают коммерчески или получают из источников, которые не общедоступны, приведена ссылка на опубликованную литературу, в которой описано их получение.

Метод 14: (ЖХ-МС) (MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10 мин)

Тип МС прибора: ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL; тип ВЭЖХ прибора: Agilent 1200SL; колонка: Agilent, POROSHELL 120, 3×150 мм, SB - С18 2.7 мкм; элюент А: 1 л воды + 0.1% трифторуксусной кислоты; подвижная фаза В: 1 л ацетонитрила + 0.1% трифторуксусной кислоты; градиент: 0.0 мин 2% В→0.3 мин 2% В→5.0 мин 95% В→10.0 мин 95% В; печь: 40°С; скорость потока: 0.75 мл/мин; УФ детектирование: 210 нм.

Исходные и промежуточные соединения:

Промежуточное соединение С1

Трифторуксусная кислота - (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали, как описано в WO 2006/002326.

Промежуточное соединение С2

трет-Бутил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноат

4.22 г (14.5 ммоль) трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-гомосерината растворяли в 180 мл дихлорметана, и затем добавляли 3.5 мл пиридина и 9.2 г (21.7 ммоль) 1,1,1-триацетокси-1лямбда5,2-бензйодоксол-3(1Н)-она. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем разбавляли 500 мл дихлорметана и два раза экстрагировали раствором тиосульфата натрия 10% концентрации, и затем последовательно экстрагировали два раза раствором лимонной кислоты 5% концентрации и два раза раствором бикарбоната натрия 10% концентрации. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом магния и затем сушили при пониженном давлении. Остаток вносили в диэтиловый эфир и добавляли HCl (раствор в диэтиловом эфире). Осадок отфильтровывали и фильтрат затем концентрировали и лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 3.7 г (93%) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата, который использовали без дополнительной очистки на следующей стадии. (R_f: 0.5 (ДХМ/метанол 95/5).

3.5 г (9.85 ммоль) Промежуточного соединения С1 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 3.13 г (14.77 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 0.7 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 30 мин. Растворитель затем упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода. Выпавшее в осадок твердое вещество отфильтровывали и сушили, получая 5.46 г (84%) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z = 613 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С3

(2S)-4-[(Ацетоксиацетил){1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

5.46 г (8.24 ммоль) Промежуточного соединения С2 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 4.8 мл триэтиламина и 2.2 мл (20.6 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на Biotage/Isolera (SNAP 340g), используя подвижную фазу циклогексан/этилацетат 2:1. Это приводило к получению 4.57 г (75%) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 713 (М+Н)⁺.

1 г (1.36 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 20 мл ДХМ и добавляли 20 мл ТФУ. После 5 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток растирали два раза с н-пентаном. В каждом случае н-пентан декантировали и твердое вещество, которое осталось, сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.1 г соединения (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-аминобутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1). ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z = 557 (М+Н)⁺.

0.91 г (1.57 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 70 мл ДХМ и добавляли 3.43 г (15.7 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и 4.1 мл N,N-диизопропилэтиламина. После 30 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь разбавляли ДХМ и экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток растирали два раза с н-пентаном и в каждом случае н-пентан декантировали. Твердое вещество, которое осталось, лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1, получая 1.11 г указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.55 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.3 мин; МС (ESI положит.): m/z = 657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С4

(2S)-2-Амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

5.46 г (8.24 ммоль) Промежуточного соединения С2 растворяли в 160 мл ДХМ и добавляли 4.8 мл триэтиламина и 2.2 мл (20.6 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью колоночной хроматографии на Biotage/Isolera (SNAP 340g), используя подвижную фазу циклогексан/этилацетат 2:1. Это приводило к получению 4.57 г (75%) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 713 (М+Н)⁺.

1.5 г (2.035 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 50 мл этанола и добавляли 5.8 мл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч и затем концентрировали. Остаток вносили в ДХМ и два раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и затем концентрировали. Остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.235 мг этого промежуточного соединения, которое подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

1.235 мг (1.5 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 15 мл ДХМ и добавляли 15 мл ТФУ. После 4 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из ацетонитрила. Это приводило к получению 1.04 г (колич.) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z = 515 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С5

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

0.9 г (1.24 ммоль) Промежуточного соединения С4 растворяли в 60 мл ДХМ и добавляли 2.7 г (12.5 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и 3.3 мл N,N-диизопропилэтиламина. После 45 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали и остаток вносили в диэтиловый эфир, и до тех пор, пока смесь не начинала становиться мутной, добавляли н-пентан. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и затем декантировали. Снова к остатку добавляли н-пентан и смесь декантировали. Твердое вещество, которое осталось, лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1, получая 0.95 г (колич.) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 615 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С6

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-гидразино-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

150 мг (0.16 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 21 мл ДМФА, и затем добавляли 37.2 мг (0.19 ммоль) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), 37 мг (0.243 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, 85 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение 45 мг (0.18 ммоль) коммерчески доступного 9Н-флуорен-9-илметил гидразинкарбоксилата. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 60 мг (41% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.9 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (ESI положит.): m/z = 893 (М+Н)⁺.

60 мг (0.067 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 19 мл этанола и добавляли 681 мкл пиперидина и 386 мкл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 18 ч и затем концентрировали. Остаток вносили в смесь ацетонитрил/вода 2:1 и доводили до рН 2 с помощью ТФУ. Затем смесь концентрировали снова и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 25 мг (51% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 629 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С7

1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}гидразино)уксусная кислота / трифторуксусная кислота (1:1)

0.2 г (0.305 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 80 мл ДХМ, добавляли 0.125 г (0.46 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния (ВЕР), 94 мг (0.61 ммоль) коммерчески доступного гидрохлорида этилгидразиноацетата и 159 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и смесь затем перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем к реакционной смеси добавляли этилацетат и воду, и фазы разделяли. Органическую фазу экстрагировали насыщенным раствором хлорида натрия и затем сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток сушили при пониженном давлении и подвергали дальнейшей реакции без очистки. Для этой цели, его вносили в 20 мл тетрагидрофурана и добавляли 10 мл воды и 3.2 мл 2 н. раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем доводили до рН 7, используя ТФУ. Реакционную смесь затем концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Таким путем указанное в заголовке соединение отделяли от его ранее элюирующегося региоизомера. Объединение соответствующих фракций, лиофилизация и сушка давали 19.7 г (8% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения в виде бесцветной пены.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z = 687 (М+Н)⁺.

Установление структуры региоизомеров осуществляли с помощью ЯМР спектроскопии в отдельном эксперименте после разделения региоизомеров на стадии защищенного промежуточного соединения. Защищенное этил (1-{(2S)-4-[(ацетоксиацетил) {(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}гидразино)ацетатное промежуточное соединение указанного в заголовке соединения имело следующий 1Н ЯМР спектр:

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=7.8 (m, 2Н), 7.4-7.2 (m, 6Н), 7.08 (m, 1Н), 6.73 (d, 1Н), 5.6 (s, 1Н), 5.25 и 4,89 (2d, 2Н), 4.89 и 4.77 (2d, 2Н), 4.62 (t, 1Н), 4.32 и 3.78 (2d, 2Н), 4.1 (t, 2Н), 3.62-3.47 (m), 2.13 (s, 3Н), 1.41 и 0.72 (2m, 2Н), 1.3 (s, 9Н), 1.18 (t, 3Н), 0.92 (s, 9Н).

Промежуточное соединение С8

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}-бета-аланин

293 мг (0.41 ммоль) Промежуточного соединения С3 растворяли в 25 мл ДМФА, и затем добавляли 144 мг (0.75 ммоль) гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), 128 мг (0.83 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, 218 мкл N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение 70 мг (0.5 ммоль) коммерчески доступного хлорида 3-метокси-3-оксопропан-1-аминия. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 4 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 177 мг (53% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.6 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z = 742 (М+Н)⁺.

177 мг (0.22 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 20 мл метанола и добавляли 2.8 мл 2 н. раствора гидроксида лития. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 18 ч. Смесь затем концентрировали, остаток вносили в воду и раствор доводили до рН 5, используя раствор лимонной кислоты 5% концентрации. Смесь затем два раза экстрагировали ДХМ и органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток в заключение лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода, получая 133 мг (81% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.3 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=7.4 мин; МС (ESI положит.): m/z = 686 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С9

(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил} (гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-4,7-диоксо-3,11,14,17-тетраокса-5,8-диазаэйкозан-20-овая кислота

На первой стадии 70 мг (0.114 ммоль) Промежуточного соединения С5 сочетали с 32 мг (0.114 ммоль) трет-бутил 3-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}пропаноата в 15 мл ДМФА в присутствии 44 мг (0.228 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 35 мг (0.228 ммоль) 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и 60 мкл N,N-диизопропилэтиламина.

Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 33 мг (33% от теории) защищенного промежуточного соединения. Его перемешивали с 1.1 мл трифторуксусной кислоты в 11 мл дихлорметана в течение 1 ч с получением после обработки 26 мг (98%) соединения с полностью снятой защитой.

В заключение, промежуточное соединение вносили в 2 мл ДХМ и вводили трет-бутоксикарбонильную защитную группу путем добавления, в каждом случае по два раза, 10 мг ди-трет-бутил дикарбоната и 79 мкл N,N-диизопропилэтиламина при перемешивании при КТ в течение 3 дней. Очистка продукта с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 16.4 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.3 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z = 818 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение СЮ

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-(3-аминобензил)-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}карбамат

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С1 за 6 стадий: На первой стадии 1 г (2.77 ммоль) Промежуточного соединения С1 и 0.864 г (5 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата объединяли в 100 мл метанола и добавляли 400 мл уксусной кислоты и 1.288 г (13.9 ммоль) комплекса боран-пиридин. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 дней. Смесь затем концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/этилацетат 9:1 ->дихлорметан/метанол 95:5). Осуществление концентрирования соответствующих фракций и сушки в высоком вакууме приводило к получению 1.255 г (80% от теории) N-алкилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.0 мин; МС (ESI положит.): m/z = 513 (М+Н)⁺.

1.255 г (2.2 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 50 мл ДХМ, и затем добавляли 1.2 мл триэтиламина и 0.52 мл (4.85 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и три раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Это приводило к получению 593 мг (41% от теории) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.4 мин; МС (ESI положит.): m/z = 613 (М+Н)⁺.

993 мг (0.91 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 100 мл этанола и, после добавления 60 мг 10% палладия на активированном угле, гидрировали при стандартном давлении водорода при КТ в течение 3 мин. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Это приводило к получению 494 мг (91% от теории) дебензилированного имидазольного производного в виде практически бесцветного масла. ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (ESI положит.): m/z = 523 (М+Н)⁺.

150 мг (0.25 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 15 мл ДМФА и добавляли 69.2 мг (0.5 ммоль) карбоната калия. После 15 мин перемешивания при КТ, добавляли 60 мг (0.28 ммоль) n-нитробензилбромида и смесь перемешивали в течение ночи. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении, и остаток вносили в этилацетат и экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия, концентрировали на роторном испарителе и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции концентрировали на роторном испарителе и остаток лиофилизировали из 1,4-диоксана. Это приводило к получению 169 мг (колич.) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z = 658 (М+Н)⁺.

165 мг (0.251 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 30 мл этанола и добавляли 0.35 мл водного раствора метанамина 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 5 ч, и такое же количество раствора метиламина затем добавляли еще раз. После 10 ч перемешивания, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Дистиллят повторно перегоняли два раза с диэтиловым эфиром и остаток затем лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 148 мг (89% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.97 мин; МС (ESI положит.): m/z = 616 (М+Н)⁺.

98 мг (0.15 ммоль) предшественника растворяли в 15 мл ТГФ, и затем добавляли раствор 569 мг (3.27 ммоль) дитионита натрия в 6 мл воды при КТ. После 8 ч перемешивания при 50°С, такое же количество дитионита - растворенного в 1 мл Н₂О - добавляли снова. После дополнительных 16 часов перемешивания при 50°С, реакционную смесь охлаждали до КТ и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация остатка из 1,4-диоксана приводила к получению 44.5 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z = 586 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С11

R/S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-гомоцистеин / трифторацетат (1:1)

990.0 мг (2.79 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина сначала загружали в 15.0 мл дихлорметана и добавляли 828.8 мг (3.91 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 129.9 мг (3.21 ммоль) уксусной кислоты, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 698.1 мг (3.21 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата (Промежуточное соединение L58), растворенного в 15.0 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол 100:2). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.25 г (73% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z = 556 (М+Н)⁺.

151.4 мг (1.5 ммоль) триэтиламина и 161.6 мг (1.43 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к 400.0 мг (0.65 ммоль) 2-(триметилсилил)этил[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу три раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 254.4 мг (57% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI отрицат.): m/z = 676 (М+НСОО^-)^-.

117.4 мг (0.19 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата растворяли в 10.0 мл изопропанола и добавляли 928.4 мкл 1М NaOH и 50.2 мг (0.37 ммоль) DL-гомоцистеина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 75.3 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z = 731 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.03 (s, 9Н), 0.40 (m, 1Н), 0.75-0.91 (m, 1Н), 1.30 (m, 1Н), 1.99-2.23 (m, 2Н), 2.63-2.88 (m, 4Н), 3.18-3.61 (m, 5Н), 3.79-4.10 (m, 3Н), 4.89 (d, 1Н), 4.89 (d, 1Н), 5.16 (d, 1Н), 5.56 (s, 1Н), 6.82 (m, 1Н), 6.91 (m, 1Н), 6.97 (m, 1Н), 7.13-7.38 (m, 6Н), 7.49 (s, 1Н), 7.63 (m, 1Н), 8.26 (s, 3Н).

Промежуточное соединение С12

R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-карбокси-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил]гомоцистеин

Синтез проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения С11, используя метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат (Промежуточное соединение L57) и Промежуточное соединение С52 в качестве исходных веществ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.18 мин; МС (ESI положит.): m/z = 775 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С13

9-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3-окса-12-тиа-5,9-диазаоктадекан-18-овая кислота

90.0 мг (0.15 ммоль) Промежуточного соединения С16 и 43.6 мг (0.23 ммоль) 6-(ацетилсульфанил)гексановой кислоты растворяли в 9.0 мл метанола и добавляли каплю воды и 73.9 мг (0.54 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч и затем разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали водой/насыщенным раствором NaCl и насыщенным раствором NaCl и потом сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:2). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению указанного в заголовке соединения с выходом 83% от теории.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z = 701 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С14

R/S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}амино)-2-оксоэтил]гомоцистеин

100.0 мг (0.17 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил} (хлорацетил)амино] пропил } карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 4.0 мл изопропанола и добавляли 276.5 мг (0.85 ммоль) 1 М раствора NaOH и 45.9 мг (0.34 ммоль) D/L-гомоцистеина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом. Органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Реакционную смесь сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме.

Это приводило к получению 92.6 мг (66% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z = 688 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С15

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

750.0 мг (2.11 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) растворяли в 15.0 мл дихлорметана и добавляли 626.0 мг (2.95 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 139 мкл (2.43 ммоль) НОАс, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Затем добавляли 420.3 мг (2.43 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата (синтез в соответствии с литературной методикой J. Med. Chem. 2003, 46, 3536), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли этилацетат и реакционную смесь два раза экстрагировали насыщенным раствором карбоната натрия. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 4:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 881.0 мг (82% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z = 513 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С16

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил} карбамат

373.4 мг (0.73 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (Промежуточное соединение С15) сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана и добавляли 169.5 мг (1.68 ммоль) триэтиламина и 181.0 мг (1.60 ммоль) хлорацетилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, затем добавляли этилацетат и смесь несколько раз экстрагировали водой. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:0.5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 336.0 мг (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z = 589 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С17

9-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овая кислота

50.0 мг (0.09 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 69.1 мг (0.21 ммоль) карбоната цезия и 28.8 мг (0.10 ммоль) 1-сульфанил-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты. Смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Добавляли воду и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 25.1 мг (35% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z = 835 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С18

трет-Бутил [22-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-4,21-диоксо-7,10,13,16-тетраокса-19-тиа-3,22-диазапентакозан-25-ил]карбамат

21.0 мг (0.03 ммоль) 9-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-4,10-диоксо-3,15,18,21,24-пентаокса-12-тиа-5,9-диазагептакозан-27-овой кислоты (Промежуточное соединение С17) и 5.8 мг (0.0.3 ммоль) гидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) сначала загружали в 1.0 мл ацетонитрила и добавляли 26.1 мг (0.20 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 20.9 мг (0.03 ммоль) Т3Р (50% в этилацетате). Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.7 мг (79% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z = 835 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С19

трет-Бутил (13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-10-тиа-7,13-диаза-2-силагексадекан-16-ил)карбамат

58.5 мг (0.10 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С16) сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 44.0 мг (0.20 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (2-сульфанилэтил)карбамата (Промежуточное соединение L39) и 64.7 мг (0.20 ммоль) карбоната цезия. Смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Реакцию повторяли с 46.6 мг (0.079 ммоль) Промежуточного соединения С16. Две реакционные смеси объединяли и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 98.0 мг (71% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.62 мин; МС (ESI положит.): m/z = 774 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С20

Трифторуксусная кислота / трет-бутил [3-({[(2-аминоэтил)сульфанил]ацетил}{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

98.0 мг (0.13 ммоль) трет-бутил (13-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-10-тиа-7,13-диаза-2-силагексадекан-16-ил)карбамата (Промежуточное соединение С19) сначала загружали в 2.0 мл смеси ДМФА/трет-бутанол (9:1) и добавляли 96.2 мг (0.63 ммоль) CsF. Смесь перемешивали при 90°С в течение 16 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 57.1 мг (61% от теории) указанного в заголовке соединения. Соединение также включает соответствующий сульфоксид.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z = 630 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С21

трет-Бутил [38-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,31,37-триоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-35-тиа-4,32,38-триазагентетраконтан-41-ил]карбамат

57.1 мг (0.08 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил [3-({[(2-аминоэтил)сульфанил]ацетил}{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат (Промежуточное соединение С20) сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 53.0 мг (0.08 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 15.5 мг (0.15 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 49.7 мг (49% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z = 1204 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С22

трет-Бутил [38-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-35-оксидо-3,31,37-триоксо-7,10,13,16,19,22,25,28-октаокса-35лямбда4-тиа-4,32,38-триазагентетраконтан-41-ил]карбамат

Указанное в заголовке соединение образовалось в качестве побочного продукта в синтезе Промежуточного соединения С21. Это приводило к получению 15.5 мг (15% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.25 мин; МС (ESI положит.): m/z = 1220 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С23

трет-Бутил 3-амино-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат

Смесь стереоизомеров

411.2 мг (1.15 ммоль) трет-бутил 3-формил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L28) и 339.7 мг (0.96 ммоль) М-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 6.0 мл дихлорметана, добавляли 68.9 мг (1.15 ммоль) НОАс и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли 405.2 мг (1.91 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и к остатку добавляли этилацетат и воду. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 40 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 541.5 мг (81% от теории) соединения трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 и 1.29 мин; МС (ESI положит.): m/z = 698 [М+Н]⁺.

541.5 мг (0.78 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 13.0 мл дихлорметана и добавляли 180.6 мг (1.78 ммоль) триэтиламина. Реакционный раствор охлаждали до 0°С, добавляли 233.1 мг (1.71 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 180.6 мг (1.78 ммоль) триэтиламина и 233.1 мг (1.71 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение еще 80 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 40 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 529.2 мг (86% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 и 1.56 мин; МС (ESI положит.): m/z = 798 [М+Н]⁺.

529.2 мг (0.66 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 10.0 мл смеси ДМФА/трет-бутанол (9:1) и добавляли 503.7 мг (3.32 ммоль) CsF. Реакционную смесь перемешивали при 90°С в течение 16 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 25 мл/мин, дихлорметан/метанол). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 172.4 мг (40% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-аминопирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 и 1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z = 654 [М+Н]⁺.

172.4 мг (0.26 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-аминопирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.5 мл смеси метанол/вода (2:1), добавляли 80.2 мг (0.58 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 116.0 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин и 1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z = 612 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С24

Трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-(аминометил)-4-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат (1:1)

26.8 мг N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) растворяли в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 5.2 мг (0.09 ммоль) НОАс и 22.4 мг (0.11 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 62.4 мг (0.09 ммоль) трет-бутил 3-формил-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L29) и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 57.6 мг (91% от теории) соединения трифторуксусная кислота / трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.25 и 1.27 мин; МС (ESI положит.): m/z = 712 [М+Н]⁺.

77.0 мг (0.11 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 21.9 мг (0.22 ммоль) триэтиламина. Затем при 0°С добавляли 29.5 мг (0.22 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток вносили в этилацетат. Органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении. Реакцию повторяли с 77.0 мг (0.11 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата. Объединенные остатки очищали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 2:1). Это приводило к получению 171.1 мг (85% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.56 и 1.57 мин; МС (ESI положит.): m/z = 812 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.04 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 0.5 мл раствора TBAF (1М в ТГФ). Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 25.0 мг (92% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z = 626 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С25

4-{[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-1-{трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-карбоновая кислота

171.4 мг (0.48 ммоль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 248.5 мг (0.72 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-формилпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение L30) и 34.8 мг (0.58 ммоль) НОАс. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли 204.4 мг (0.97 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 60 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, скорость потока 25 мл/мин, смесь петролейный эфир/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 267.0 мг (77% от теории) соединения трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z = 683 [М+Н]⁺.

267.0 мг (0.39 ммоль) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 5.0 мл дихлорметана, добавляли 91.0 мг (0.90 ммоль) триэтиламина и смесь охлаждали до 0°С. Добавляли 117.4 мг (0.86 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 593.4 мг (5.87 ммоль) триэтиламина и 427.0 мг (3.13 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение еще 10 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 216.3 мг (71% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.70 и 1.72 мин; МС (ESI положит.): m/z = 783 [М+Н]⁺.

216.3 мг (0.28 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.0 мл ТГФ и добавляли 16.6 мг (0.28 ммоль) НОАс и раствор 361.1 мг (1.38 ммоль) TBAF (1М в ТГФ). Реакционный раствор перемешивали при КТ в течение 4 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 94.0 мг (51% от теории) соединения трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=669 [М+Н]⁺.

52.0 мг (0.08 ммоль) трет-бутил 3-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 4.0 мл смеси буфер PBS/ацетонитрил (9:1) и добавляли 1.2 мг (0.01 ммоль) TEMPO. Затем одновременно добавляли 14.1 мг (0.16 ммоль) хлорита натрия в 1.0 мл воды и 115.8 мкл (0.16 ммоль) раствора гипохлорита натрия 10% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь выливали в раствор сульфита натрия 10% концентрации и добавляли этилацетат. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z = 683 [М+Н]⁺.

103.0 мг (0.15 ммоль) 4-{[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]метил}-1-{трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-карбоновой кислоты сначала загружали в 4.5 мл смеси метанол/вода (2:1), добавляли 45.9 мг (0.33 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом. Водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и указанное в заголовке соединение использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.35 мин; МС (ESI положит.): m/z = 641 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С26

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил]карбамат

590 мг (1.69 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 155 мкл (2.70 ммоль, 162 мг) уксусной кислоты сначала загружали в 30 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем по каплям добавляли 600 мг (1.687 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (полученного из соединения трифторуксусная кислота / (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1) путем экстрагирования 1 н. водным раствором гидроксида натрия) и 750 мг (2.362 ммоль) трет-бутил (3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-формилпропил)карбамата, растворенных в 40 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Затем добавляли этилацетат, смесь промывали насыщенным раствором карбоната натрия и органическую фазу концентрировали. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 510 мг (46% от теории) целевого соединения в виде смеси диастереомеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин (51%); МС (EI положит.): m/z = 657 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин (49%); МС (EI положит.): m/z = 657 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С27

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетат

510 мг (0,776 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил]карбамата сначала загружали в 30 мл дихлорметана и добавляли 181 мг (249 мкл, 1.786 ммоль) триэтиламина и 219 мг (1.553 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и затем промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 290 мг (49% от теории) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.70 мин; МС (EI положит.): m/z = 757 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.72 мин; МС (EI положит.): m/z = 757 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С28

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-(гидроксиметил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетат

285 мг (0.376 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетата растворяли в 5 мл ТГФ. Добавляли 452 мкл (0.452 ммоль) 1 М раствора фторида тетра-н-бутиламмония в ТГФ, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 214 мг (81% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=92%) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (EI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.40 мин; МС (EI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С29

2-([3-(Ацетилсульфанил)-2-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}пропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтилацетат

210 мг (0.301 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-(гидроксиметил)пропил}амино)-2-оксоэтилацетата сначала загружали в 8 мл абсолютного ТГФ, при КТ по каплям добавляли 178 мг (1.503 ммоль, 109 мкл) тионилхлорида, растворенного в 8 мл абсолютного ТГФ, и смесь перемешивали при КТ в течение 40 мин. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 16 мл абсолютного ДМФА, добавляли 172 мг (1.503 ммоль) тиоацетата калия и 133 мг (0.361 ммоль) йодида тетра-н-бутиламмония и смесь перемешивали при 90°С в течение 2 ч. После охлаждения добавляли воду и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент) и лиофилизировали. Это приводило к получению 155 мг (69% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=94%) целевого соединения в виде смеси эпимеров.

Изомер 1:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.50 мин; МС (EI положит.): m/z=701 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (EI положит.): m/z=701 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С30

Ди-трет-бутил [дисульфандиилбис(2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропан-3,1-диил)]бискарбамат

1.220 г (1.010 ммоль, чистота в соответствии с ЖХ/МС=58%) 2-([3-(ацетилсульфанил)-2-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}пропил]{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-оксоэтилацетата сначала загружали в 30 мл ТГФ и 30 мл метанола, добавляли 10 мл 1 н. водного раствора гидроксида натрия и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Добавляли воду и реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 390 мг (54% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=86%) целевого соединения в виде смеси диастереомеров.

Изомеры:

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.81 мин; МС (EI положит.): m/z=1232 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С31

трет-Бутил 3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамат

390 мг (0.272 ммоль, чистота в соответствии с ЖХ/МС=86%) ди-трет-бутил [дисульфандиилбис(2-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}пропан-3,1-диил)]бискарбамата вносили в 20 мл 1,4-диоксана и 10 мл буфера PBS и добавляли 234 мг (0.817 ммоль) гидрохлорида 3,3',3''-фосфантриилтрипропановой кислоты (1:1). Смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь затем концентрировали на роторном испарителе и растирали с дихлорметаном, и фильтрат концентрировали и сушили в высоком вакууме. Остаток растворяли в 8 мл изопропанола и очищали с помощью хиральной хроматографии (колонка: 250×30 мм, наполненная Daicel Chiralpak AZ-H, подвижная фаза: изогексан/изопропанол = 90:10). Это приводило к получению двух фракций целевого соединения. Фракция 1 содержала 181.2 мг (50% от теории) Изомера 1 и фракция 2 давала 90.2 мг (25% от теории) Изомера 2.

Изомер 1:

Хиральная ВЭЖХ (колонка: 250×4.6 мм, наполненная Diacel Chiralpak AZ-Н, подвижная фаза: изогексан/этанол 90:10): R_t=6.98 мин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=617 [М+Н]⁺.

Изомер 2:

Хиральная ВЭЖХ (колонка: 250×4.6 мм, наполненная Diacel Chiralpak AZ-Н, подвижная фаза: изогексан/этанол 90:10): R_t=9.39 мин.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=617 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С32

Гидрохлорид N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 1)

123 мг (199.42 мкмоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамата (Изомер 1) растворяли в 2 мл ТГФ и перемешивали с 10 мл полуконцентрированной хлористоводородной кислоты при КТ в течение 1 ч. Реакционный раствор дегазировали в атмосфере аргона и затем лиофилизировали. Это приводило к получению 108 мг (98% от теории) целевого соединения.

Изомер 1

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (EI положит.): m/z=517 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С33

Гидрохлорид N-[3-амино-2-(сульфанилметил)пропил]-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (1:1) (Изомер 2)

123 мг (199.42 мкмоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-(сульфанилметил)пропил}карбамата (Изомер 2) растворяли в 2 мл ТГФ и перемешивали с 10 мл полуконцентрированной хлористоводородной кислоты при КТ в течение 1 ч. Реакционный раствор дегазировали в атмосфере аргона и затем лиофилизировали. Это приводило к получению 58 мг (63% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=91%) целевого соединения.

Изомер 2

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (EI положит.): m/z=517 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С34

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

3.790 г (10.02 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (полученного из соединения трифторуксусная кислота / (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин (1:1) путем экстрагирования 1 н. водным раствором гидроксида натрия), 3.186 г (15.04 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 690 мкл (12.03 ммоль, 722 мг) уксусной кислоты сначала загружали в 100 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Затем добавляли 4.687 г (27.06 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток очищали с помощью хроматографии на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/этилацетат, градиент = 4:1→1:1). Это приводило к получению 2.57 г (48% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.00 мин; МС (EI положит.): m/z=513 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С35

трет-Бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамат

200 мг (0.38 ммоль) трет-бутил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата сначала загружали в 9 мл абсолютного дихлорметана, и при КТ добавляли 120 мкл (0.86 ммоль, 87 мг) триэтиламина. При КТ по каплям добавляли 83 мг (0.45 ммоль) 4-нитробензоилхлорида, растворенного в 1 мл абсолютного дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли воду, и смесь концентрировали на роторном испарителе. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент) и сушили. Это приводило к получению 181 мг (73% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.47 мин; МС (EI положит.): m/z=662 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С36

трет-Бутил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамат

170 мг (0.26 ммоль) трет-бутил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(4-нитробензоил)амино]пропил}карбамата сначала загружали в 10 мл уксусной кислоты. Добавляли 143 мг (2.57 ммоль) порошка железа, и смесь перемешивали при 50°С в течение 16 ч. После охлаждения добавляли воду, и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе. Остаток сушили в ВВ. Это приводило к получению 154 мг (77% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=82%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.73 мин; МС (EI положит.): m/z=632 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С37

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N-[4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]пропил}карбамоил)фенил]-L-аланинамид

38.6 мг (0.05 ммоль, ЖХ/МС чистота = 82%) трет-бутил {3-[(4-аминобензоил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]пропил}карбамата растворяли в абсолютном ДМФА и добавляли 24.8 мг (0.06 ммоль) HATU и 13.0 мг (0.10 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин, добавляли 63 мг (0.06 ммоль) N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланина и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли 7.5 мг (0.06 ммоль) 3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ола (HOAt), и смесь перемешивали в течение 16 ч. Добавляли 19.1 мг (0.05 ммоль) HATU, и смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. После охлаждения реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 6.5 мг (9% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=83%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 2): R_t=7.89 мин; МС (EI положит.): m/z=1200.6 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С38

2-[3-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-дион

300.0 мг (0.84 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона (Промежуточное соединение С1) сначала загружали в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 58.3 мг (0.97 ммоль) НОАс и 250.4 мг (1.18 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 197.2 мг (0.97 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором карбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: этилацетат/циклогексан 1:5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 333.3 мг (70%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 мин; МС (ESI положит.): m/z=543 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С39

2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетат

332.3 мг (0.61 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона (Промежуточное соединение С38) сначала загружали в 8.0 мл дихлорметана и добавляли 142.5 мг (1.35 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 184.0 мг (1.35 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: этилацетат/циклогексан 1:3). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 367.1 мг (63%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С40

N-(3-Аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамид

583.1 мг (0.91 ммоль) 2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетата (Промежуточное соединение С39) сначала загружали в 15.0 мл этанола и добавляли 1.41 г (18.15 ммоль) метанамина (40% в воде). Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с толуолом. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:5). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 324.9 мг (73%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=471 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С41

Трифторуксусная кислота / L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1)

50.0 мг (0.11 моль) N-(3-аминопропил)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-гидроксиацетамида (Промежуточное соединение С40) и 30.4 мг (0.11 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланината сначала загружали в 2.0 мл ДМФА и добавляли 32.2 мг (0.32 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 19.1 мг (0.32 ммоль) НОАс, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 38.0 мг (56%) соединения трет-бутил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=642 [М+Н]⁺.

33.6 мг (0.05 ммоль) трет-бутил [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}амино)-1-оксопропан-2-ил]карбамата сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана. Добавляли 119.4 мг (1.05 ммоль) ТФУ и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 32.8 мг (96%) соединения трифторуксусная кислота / N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.93 мин; МС (ESI положит.): m/z=542 [М+Н]⁺.

29.5 мг (0.05 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамид (1:1) и 14.1 мг (0.05 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валината сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли 18.2 мг (0.18 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 23.1 мг (69%) соединения N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.30 мин; МС (ESI положит.): m/z=741 [М+Н]⁺.

19.4 мг (0.03 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валил-N-{3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]пропил}-L-аланинамида растворяли в 1.5 мл дихлорметана и добавляли 59.7 мг (0.52 ммоль) ТФУ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 119.4 мг (1.04 ммоль) ТФУ, и смесь снова перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.2 мг (97%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=641 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С42

Тетрафторборат 2,5-дифторбензолдиазония

Сначала загружали 3.00 г (21.16 ммоль, 2.68 мл) комплекса трифторид бора-диэтиловый эфир, и при 0°С медленно по каплям добавляли 1.37 г (10.58 ммоль) 2,5-дифторанилина, растворенного в 27 мл абсолютного ТГФ. При -10°С по каплям добавляли раствор 1.61 г (13.75 ммоль, 1.85 мл) изоамилнитрита, растворенного в 3 мл абсолютного ТГФ, и перемешивание продолжали при той же температуре в течение 30 мин. Добавляли 15 мл диэтилового эфира и выпавшую в осадок соль диазония отфильтровывали, промывали небольшим количеством диэтилового эфира и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.27 г целевого соединения (94% от теории).

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=0.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=141 [М]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 8.11-8.17 (m, 1Н), 8.36-8.43 (m, 1Н), 8.69-8.73 (m, 1Н).

Промежуточное соединение С43

Метил хлор[2-(2,5-дифторфенил)гидразинилиден]ацетат

В атмосфере аргона 3.63 г (24.13 ммоль) метил 2-хлор-3-оксобутаноата сначала загружали в 100 мл воды, и при -5°С добавляли 48.90 г (618.19 ммоль, 50.00 мл) пиридина и смесь перемешивали при этой температуре в течение 10 мин. Затем при -5°С добавляли 5.00 г (21.94 ммоль) тетрафторбората 2,5-дифторбензолдиазония, что приводило к образованию оранжевой суспензии. Смесь перемешивали при этой температуре в течение 30 мин и реакционную смесь разбавляли водой и три раза экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 5.52 г целевого соединения (97% от теории, чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=249 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.85 (s, 3Н), 6.88-6.94 (m, 1Н), 7.16-7.21 (m, 1Н), 7.31-7.37 (m, 1Н), 10.00 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С44

Метил 4-бензоил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилат

3.50 г (13.52 ммоль) метил хлор[2-(2,5-дифторфенил)гидразинилиден]ацетата (чистота в соответствии с ЖХ/МС 96%) растворяли в 9 мл абсолютного толуола, добавляли 2.61 г (14.87 ммоль) (2Е)-3-(диметиламино)-1-фенилпроп-2-ен-1-она и 3.01 г (29.73 ммоль, 4.14 мл) триэтиламина и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода с 0.1% муравьиной кислоты, градиент). Это приводило к получению 1.79 г (39% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=343 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.86 (s, 3Н), 7.44-7.50 (m, 1Н), 7.55-7.72 (m, 4Н), 7.81-7.87 (m, 3Н), 8.80 (d, 1Н).

Промежуточное соединение С45

[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]метанол

3.18 г (8.92 ммоль) метил 4-бензоил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбоксилата (чистота в соответствии с ЖХ/МС=96%) сначала загружали в 50 мл трифторуксусной кислоты, по каплям добавляли 8.74 г (75.13 ммоль, 12 мл) триэтилсилана и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Полученный остаток вносили в 120 мл абсолютного ТГФ, и при 0°С по каплям добавляли 2.89 г (33.63 ммоль, 33.63 мл) комплекса боран-тетрагидрофуран. Смесь перемешивали в течение ночи. По причине низкой степени превращения, добавляли еще 12.33 мл (12.33 ммоль) 1М раствора борогидрида лития в ТГФ. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, при 60°С в течение 30 мин и при 80°С в течение 2 ч. При 0°С реакцию осторожно гасили 60 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Смесь два раза экстрагировали, в каждом случае 100 мл этилацетата, объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.67 г (76% от теории, чистота = 96%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=2.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=329 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 3.91 (s, 2Н), 4.45 (d, 2Н), 6.51 (s, 1Н), 7.18-7.23 (m, 2Н), 7.27-7.32 (m, 4Н), 7.46-7.53 (m, 1Н), 7.60-7.65 (m, 1Н), 7.95 (d, 1Н).

Промежуточное соединение С46

4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбальдегид

2.66 г (8.50 ммоль) [4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]метанола (чистота 96%) растворяли в 150 мл дихлорметана, и небольшими порциями добавляли 4.33 г (10.20 ммоль) периодинана Десса-Мартина. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляли 100 мл полуконцентрированного раствора бикарбоната натрия и 100 мл раствора тиосульфата натрия 10% концентрации, и смесь перемешивали в течение 20 мин. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в высоком вакууме. Это приводило к получению 2.35 г (88% от теории, чистота = 95%) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=299 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 4.12 (s, 2Н), 7.17-7.21 (m, 1Н), 7.27-7.31 (m, 4Н), 7.37-7.42 (m, 1Н), 7.57-7.62 (m, 1Н), 7.75-7.78 (m, 1Н), 8.22 (d, 1Н), 10.06 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С47

(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин

2.35 г (7.56 ммоль) 4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-карбальдегида растворяли в 25 мл абсолютного ТГФ и добавляли 1.10 г (9.08 ммоль) (R)-(+)-2-метил-2-пропансульфинамида и 4.73 г (16.64 ммоль) изопропилата титана(IV). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и добавляли 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 30 мл этилацетата. Затем добавляли приблизительно 3 г кизельгура, и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Смесь фильтровали и органическую фазу отделяли от фильтрата. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки.

В атмосфере аргона остаток растворяли в 60 мл абсолютного ТГФ, охлаждали до -78°С и по каплям добавляли 14.5 мл (23.24 ммоль) раствора трет-бутиллития в пентане (с=1.6 моль/л). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 3 ч и затем гасили 5 мл метанола и 15 мл насыщенного раствора хлорида аммония. При перемешивании реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры (приблизительно 30 мин.). Смесь экстрагировали этилацетатом и органическую фазу экстрагировали насыщенным раствором хлорида натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки.

Остаток вносили в 30 мл ТГФ и 6 мл метанола, добавляли 6 мл (24.00 ммоль) 4 н. раствора хлороводорода в диоксане и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляли 15 мл насыщенного раствора карбоната натрия, и смесь экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу отделяли, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток разделяли с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению двух фракций целевого соединения. Первая фракция давала 1.31 г (72% от теории, ЖХ/МС чистота = 97%) и вторая - 0.37 г (17% от теории, ЖХ/МС чистота = 83%) продукта.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=356 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.91 (s, 9Н), 1.71 (s, 2Н), 3.59 (s, 1Н), 3.87 (s, 2Н), 7.17-7.32 (m, 6Н), 7.45-7.51 (m, 1Н), 7.61-7.65 (m, 1Н), 7.84 (s br, 1Н).

Промежуточное соединение С48

трет-Бутил (2S)-4-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноат

1.28 г (3.35 ммоль, ЖХ/МС чистота 93%) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина растворяли в 100 мл абсолютного дихлорметана, и при комнатной температуре добавляли 261 мг (4.35 ммоль, 250 мкл) уксусной кислоты и 1.14 г (4.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия с последующим добавлением после 5 мин перемешивания 1.19 г (4.35 ммоль) трет-бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноата. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, концентрировали на роторном испарителе, вносили в ацетонитрил и воду и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 1.64 г (80% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=613 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 1.01 (s, 9Н), 1.32 (s, 9Н), 1.35 (s, 9Н), 1.80-1.89 (m, 1Н), 2.01-2.11 (m, 1Н), 2.54-2.71 (m, 2Н), 3.75-3.81 (m, 1H), 3.90 (s, 2Н), 4.18 (d, 1Н), 7.13 (d, 1Н), 7.20-7.24 (m, 1Н), 7.28-7.34 (m, 5Н), 7.52-7.58 (m, 1Н), 7.76-7.80 (m, 1Н), 8.10 (s br, 1Н), 8.23 (s br, 1H).

Промежуточное соединение C49

(2S)-4-[{(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановая кислота

225 мг (0.37 ммоль) трет-бутил (2S)-4-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноата растворяли в 10 мл абсолютного дихлорметана и добавляли 156 мг (1.54 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 125 мг (0.92 ммоль) ацетоксиацетилхлорида, и смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч. Добавляли еще 251 мг (1.84 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и 186 мг (1.84 ммоль) триэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли небольшое количество дихлорметана и смесь промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 10 мл этанола, добавляли 0.91 мл (12.67 ммоль) водного раствора метиламина 40% концентрации и смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе, остаток вносили в дихлорметан и органическую фазу два раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 2 мл дихлорметана, добавляли 2 мл (25.96 ммоль) трифторуксусной кислоты и смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 10 мл абсолютного дихлорметана, добавляли 298 мг (2.95 ммоль) триэтиламина и 429 мг (1.97 ммоль) ди-трет-бутил дикарбоната и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода, градиент). Это приводило к получению 62 мг (27% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=615 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.91 (s, 9Н), 1.32 (s, 9Н), 2.64-2.72 (m, 4Н), 3.50-3.58 (m, 1Н), 3.72 (dd, 2Н), 4.07-4.22 (m, 2Н), 4.47-4.54 (m, 1Н), 5.75 (s, 1Н), 6.84-6.89 (m, 1Н), 7.15-7.30 (m, 6Н), 7.47-7.53 (m, 1Н), 7.70-7.75 (m, 1Н), 8.09-8.13 (m, 1Н), 11.66 (s br, 1Н).

Промежуточное соединение С50

трет-Бутил [(2S)-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]карбамат

60 мг (0.1 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты растворяли в 10 мл абсолютного ДМФА и добавляли 74 мг (0.20 ммоль) HATU. Отдельно в 2 мл абсолютного ДМФА растворяли 74 мг (0.29 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1), добавляли 38 мг (0.29 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и полученную смесь по каплям добавляли к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 д. Смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 9.3 мг (13% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=737 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С51

N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутаноил}-бета-аланин

Прежде всего Промежуточное соединение С47 подвергали восстановительному алкилированию бензил N-{(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноил}-бета-аланинатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Получали 23 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.24 мин; МС (ESI положит.): m/z=686 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С52

(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амин

10.00 г (49.01 ммоль) метил 4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в 100.0 мл ДМФА и добавляли 20.76 г (63.72 ммоль) карбоната цезия и 9.22 г (53.91 ммоль) бензилбромида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь распределяли между водой и этилацетатом и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Реакцию повторяли с 90.0 г метил 4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

Две объединенные реакционные смеси очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Daiso 300×100; 10 мк, скорость потока: 250 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 125.15 г (87% от теории) соединения метил 1-бензил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.18 мин; МС (ESI положит.): m/z=295 [М+Н]⁺.

В атмосфере аргона 4.80 г (16.32 ммоль) метил 1-бензил-4-бром-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в ДМФА и добавляли 3.61 г (22.85 ммоль) (2,5-дифторфенил)бороновой кислоты, 19.20 мл насыщенного раствора карбоната натрия и 1.33 г (1.63 ммоль) соединения [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]-дихлорпалладий(II):дихлорметан. Реакционную смесь перемешивали при 85°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и остаток на фильтре промывали этилацетатом. Органическую фазу экстрагировали водой и затем промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 100:3). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 3.60 г (67% от теории) соединения метил 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.59 мин; МС (ESI положит.): m/z=328 [М+Н]⁺.

3.60 г (11.00 ммоль) метил 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбоксилата сначала загружали в 90.0 мл ТГФ, и при 0°С добавляли 1.04 г (27.50 ммоль) алюмогидрида лития (2.4 М в ТГФ). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 минут. При 0°С добавляли насыщенный раствор тартрата калия-натрия, и к реакционной смеси добавляли этилацетат. Органическую фазу три раза экстрагировали насыщенным раствором тартрата калия-натрия. Органическую фазу один раз промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в 30.0 мл дихлорметана. Добавляли 3.38 г (32.99 ммоль) оксида марганца(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч. Добавляли еще 2.20 г (21.47 ммоль) оксида марганца(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали через целит и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток, 2.80 г (1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида), использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=298 [М+Н]⁺.

28.21 г (94.88 ммоль) 1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида вместе с 23.00 г (189.77 ммоль) (R)-2-метилпропан-2-сульфинамида сначала загружали в 403.0 мл абсолютного ТГФ, добавляли 67.42 г (237.21 ммоль) изопропилата титана(IV), и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 500.0 мл насыщенного раствора NaCl и 1000.0 мл этилацетата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь фильтровали через кизельгур и фильтрат два раза промывали насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 1500+340 г SNAP, скорость потока 200 мл/мин, этилацетат/циклогексан 1:10).

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=1.63 мин; МС (ESI положит.): m/z=401 [М+Н]⁺.

25.00 г (62.42 ммоль) (R)-N-{(Е/Z)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]метилен}-2-метилпропан-2-сульфинамида в атмосфере аргона сначала загружали в абсолютный ТГФ и охлаждали до -78°С. Затем при -78°С добавляли 12.00 г (187.27 ммоль) трет-бутиллития (1.7 М раствор в пентане), и смесь перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. Затем при -78°С добавляли последовательно 71.4 мл метанола и 214.3 мл насыщенного раствора хлорида аммония, и реакционной смеси давали нагреться до КТ и перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток, (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамид, использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=459 [М+Н]⁺.

28.00 г (61.05 ммоль) (R)-N-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2-метилпропан-2-сульфинамида сначала загружали в 186.7 мл 1,4-диоксана, и затем добавляли 45.8 мл раствора HCl в 1,4-диоксане (4.0 М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: (колонка: Kinetix 100×30; скорость потока: 60 мл/мин, смесь MeCN/вода). Ацетонитрил упаривали при пониженном давлении и к водному остатку добавляли дихлорметан. Органическую фазу промывали раствором бикарбоната натрия и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 16.2 г (75% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=338 [M-NH₂]⁺, 709 [2М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.87 (s, 9Н), 1.53 (s, 2Н), 3.59 (s, 1Н), 5.24 (d, 2Н), 6.56 (s, 1Н), 6.94 (m, 1Н), 7.10 (d, 2Н), 7.20 (m, 1Н), 7.26 (m, 2Н), 7.34 (m, 2Н), 7.46 (m, 1Н).

Промежуточное соединение С53

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Прежде всего промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Полученное таким путем промежуточное соединение растворяли в этаноле, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=734 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С54

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутаноил]-бета-аланин

Прежде всего Промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил N-[(2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноил]-бета-аланинатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27. Полученное таким путем промежуточное соединение растворяли в метаноле, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Сложноэфирную группу затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина. Получали 48 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=807 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С55

2-[3-({(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-дион

340 мг (0.96 ммоль) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина растворяли в 7 мл абсолютного ДХМ, и при КТ добавляли 69 мг (1.15 ммоль, 60 мкл) уксусной кислоты и 284 мг (1.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия. Смесь перемешивали в течение 15 мин, и затем добавляли 233 мг (1.15 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя. Смесь перемешивали при КТ в течение 4.5 ч. Добавляли еще 233 мг (1.15 ммоль) 3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропаналя, 69 мг (1.15 ммоль, 60 мкл) уксусной кислоты и 284 мг (1.34 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при КТ в течение 7 ч. Добавляли этилацетат и реакционную смесь промывали насыщенным раствором карбоната натрия. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали два раза с помощью препаративной ВЭЖХ [1.) подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент; 2.) подвижная фаза: ACN/вода + 1% ТФУ + 1.0% NEt₃)]. Это приводило к получению 108 мг (21% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=543 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С56

2-({(1R)-1-[4-Бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}[3-(1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пропил]амино)-2-оксоэтилацетат

102 мг (0.19 ммоль) 2-[3-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-диона сначала загружали в 2 мл абсолютного ДХМ, и при КТ добавляли 44 мг (0.43 ммоль) триэтиламина. При 0°С добавляли 31 мг (0.23 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата, растворенного в 1 мл абсолютного ДХМ. Смесь перемешивали при КТ в течение 40 мин. Добавляли еще 26 мг 2-хлор-2-оксоэтилацетата, растворенного в 0.5 мл абсолютного ДХМ, и 19 мг (0.19 ммоль) триэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение 60 мин.

Добавляли воду, смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент). Это приводило к получению 106 мг (88% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=643 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С57

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии со стандартными методами путем сочетания Промежуточного соединения С49 с 9Н-флуорен-9-илметил (2-аминоэтил)карбаматом в присутствии HATU и последующего удаления Fmoc защитной группы пиперидином. Это приводило к получению 14 мг указанного в заголовке соединения (40% от теории за 2 стадии).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С58

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановая кислота

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 8.99 г (24.5 ммоль) Промежуточного соединения L57, растворенного в 175 мл ДХМ, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 300 мл ДХМ и два раза промывали 100 мл раствора бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток затем очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex С18). После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 4.6 г (61% от теории) метил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

2.06 г (3.36 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 76 мл ДХМ и ацилировали 0.81 мл (7.17 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата в присутствии 2.1 мл триэтиламина. После 20 ч перемешивания при КТ, добавляли 0.36 мл 2-хлор-2-оксоэтилацетата и 0.94 мл триэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 15 мин. Смесь затем разбавляли 500 мл этилацетата и последовательно два раза экстрагировали 300 мл раствора лимонной кислоты 5% концентрации, два раза - 300 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и один раз - 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия, и затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 2.17 г (79% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

2.17 мг (2.64 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 54 мл ТГФ и 27 мл воды и добавляли 26 мл 2-молярного раствора гидроксида лития. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин и затем доводили до рН между 3 и 4, используя 1.4 мл ТФУ. Смесь концентрировали при пониженном давлении. Когда большая часть ТГФ была отогнана, водный раствор два раза экстрагировали ДХМ и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (колонка: Chromatorex С18). После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 1.1 г (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=656 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.] = 0.03 (s, 9Н), 0.58 (m, 1H), 0.74-0.92 (m, 11Н), 1.40 (m, 1Н), 3.3 (m, 2Н), 3.7 (m, 1Н), 3.8-4.0 (m, 2Н), 4.15 (q, 2Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 5.61 (s, 1Н), 6.94 (m, 2Н), 7.13-7.38 (m, 7Н), 7.48 (s, 1Н), 7.60 (m, 1Н), 12.35 (s, 1Н).

Промежуточное соединение С59

(2S)-4-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-метоксипропаноил]амино)-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Сначала вторичную аминогруппу бензил (2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}бутаноата ацилировали (2S)-2-метоксипропаноил хлоридом (промежуточное соединение Промежуточного соединения С53) в присутствии триэтиламина, как описано для Промежуточного соединения С53. Полученное промежуточное соединение вносили в этанол, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Соединение со снятой защитой вносили в смесь диоксан/вода 2:1 и на последней стадии вводили Fmoc защитную группу, используя 9Н-флуорен-9-илметил хлоркарбонат в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=764 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С60

(2S)-4-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}[(2S)-2-метоксипропаноил]амино)-2-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Синтез проводили аналогично Промежуточному соединению С53.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=750 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С61

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-бета-аланин

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 60 мг (0.091 ммоль) Промежуточного соединения С58 с метил β-аланинатом, с последующим расщеплением сложного эфира 2М раствором гидроксида лития. Это приводило к получению 67 мг (61% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.29 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С62

N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-D-аланин

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению С61 из Промежуточного соединения С58 и метил D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С63

Трифторуксусная кислота / трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Синтез этого промежуточного соединения начинали на первой стадии с сочетания 50 мг (0.075 ммоль) Промежуточного соединения С3 с 26.2 мг (0.082 ммоль) гидрохлорида 9Н-флуорен-9-илметил (2-аминоэтил)карбамата (1:1) в присутствии 28.7 мг (0.15 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 22.9 мг (0.15 ммоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 39 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 18 ч перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 45 мг (65% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.51 мин; МС (ESI положит.): m/z=921 (М+Н)⁺.

45 мг (0.049 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 10 мл этанола и добавляли 176 мкл раствора метанамина в воде 40% концентрации. Реакционную смесь перемешивали при 50°С с добавлением такого же количества раствора метанамина спустя 6 ч и спустя 9 ч. После перемешивания в течение еще 14 ч при 50°С, добавляли еще 700 мкл раствора метанамина, и после дополнительных 20 ч перемешивания смесь в заключение концентрировали. Остаток вносили в ДХМ и промывали водой. Органическую фазу концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 32 мг (99% от теории) трет-бутил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-имидазол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=657 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С64

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил {(2S)-1-[(2-аминоэтил)амино]-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С58 аналогично Промежуточному соединению С63.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=2.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.01 мин; МС (ESI положит.): m/z=700 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С65

(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-(гликолоил)амино]этил}-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-овая кислота

215 мг (0.59 ммоль) Промежуточного соединения L66 сначала загружали в 25 мл дихлорметана и добавляли 377 мг (0.89 ммоль) периодинана Десса-Мартина и 144 мкл (1.78 ммоль) пиридина. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 300 мл дихлорметана и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации, раствором лимонной кислоты 10% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Это приводило к получению 305 мг альдегида, который подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

175 мг (0.49 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 50 мл дихлорметана и добавляли 147 мг (0.69 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 32.5 мкл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 214 мг (0.593 ммоль) альдегида, описанного выше, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. В данном случае, вместо ожидаемого продукта, образовывался 2-(триметилсилил)этил [(2S)-4-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)-1-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)бутан-2-ил]карбамат. Поскольку этот имид также можно превратить в указанное в заголовке соединение, реакционную смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После объединения соответствующих имидсодержащих фракций, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 195 мг (58%) вышеуказанного имида.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=667 (М+Н)⁺.

65 мг (97.5 мкмоль) этого имида вносили в 15 мл дихлорметана и добавляли 367 мкл (3.4 ммоль) ацетоксиацетилхлорида и 595 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 30 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали без нагревания при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли с получением после упаривания растворителей и сушки в высоком вакууме 28 мг (37% от теории) (8S)-11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-8-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил ацетата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.44 мин; МС (ESI положит.): m/z=767 (М+Н)⁺.

28 мг (37 мкмоль) этого промежуточного соединения растворяли в 3 мл метанола и добавляли 548 мкл 2М раствора гидроксида лития. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь доводили до рН 4 с помощью трифторуксусной кислоты и затем концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли, растворитель упаривали и остаток сушили в высоком вакууме, получая 26 мг (96% от теории) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=743 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С66

2-(Триметилсилил)этил [(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-{[2-(глициламино)этил]амино}-1-оксобутан-2-ил]карбамат

Прежде всего из N-[(бензилокси)карбонил]глицина и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата получали соединение трифторуксусная кислота / бензил {2-[(2-аминоэтил)амино]-2-оксоэтил}карбамат (1:1) в соответствии с классическими методами химии пептидов (HATU сочетание и удаление Boc).

13 мг (0.036 ммоль) этого промежуточного соединения и 25 мг (0.033 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 3 мл ДМФА и добавляли 19 мг (0.05 ммоль) HATU и 17 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После 10 мин перемешивания при КТ, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 17.8 мг (60% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=891 (М+Н)⁺.

17 мг (0.019 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 10 мл этанола, добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывали, растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 9 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI положит.): m/z=757 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С67

9Н-Флуорен-9-илметил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

605.3 мг (1.71 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (Промежуточное соединение С52) сначала загружали в 10.0 мл дихлорметана, добавляли 506.7 мг (2.39 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 117.9 мг (1.96 ммоль) уксусной кислоты и смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Добавляли 580.0 мг (1.96 ммоль) 9Н-флуорен-9-илметил (3-оксопропил)карбамата (Промежуточное соединение L70), растворенного в 10.0 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 514.7 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.10 мин; МС (ESI положит.): m/z=634 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С68

трет-Бутил [3-({(1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамат

Синтез проводили аналогично синтезу Промежуточного соединения С67.

1000.0 мг (2.81 ммоль) (1R)-1-[4-бензил-1-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиразол-3-ил]-2,2-диметилпропан-1 -амина (Промежуточное соединение С47),

835.0 мг (3.94 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия,

194.0 мг (3.24 ммоль) уксусной кислоты,

560.0 мг (3.24 ммоль) трет-бутил (3-оксопропил)карбамата.

Это приводило к получению 695.8 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=513 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С69

11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овая кислота

117.0 мг (0.19 ммоль) (2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70) и 21.6 мг (0.20 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты сначала загружали в 3.0 мл метанола, добавляли 89.5 мг (0.65 ммоль) карбоната калия и смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза. Это приводило к получению 106.1 мг (73% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.42 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=700 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С70

(2-(Триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамат

908.1 мг (1.63 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (см. синтез Промежуточного соединения С11) и 545.6 мг (5.39 ммоль) триэтиламина сначала загружали в 10.0 мл дихлорметана, и смесь охлаждали до 0°С. При этой температуре добавляли 590.5 мг (5.23 ммоль) хлорацетилхлорида и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае три раза, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 673.8 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=676 (М+НСОО^-)^-.

Промежуточное соединение С71

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

536.6 мг (4.43 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.5 мл воды вместе с 531.5 мг (6.33 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 400.0 мг (0.63 ммоль) 2-(триметилсилил)этил {3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]пропил}карбамата (Промежуточное соединение С70), растворенного в 25.0 мл изопропанола, и 1.16 г (7.59 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 449.5 мг (86% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.20 мин; МС (ESI положит.): m/z=717 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С72

(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]метил}-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-овая кислота

90 мг (0.212 ммоль) Промежуточного соединения L72 сначала загружали в 6 мл дихлорметана и добавляли 86 мкл (1.06 ммоль) пиридина и 135 мг (0.318 ммоль) периодинана Десса-Мартина. Смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин. Затем реакционную смесь разбавляли 30 мл дихлорметана и органическую фазу два раза промывали раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации и один раз - раствором лимонной кислоты 5% концентрации. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученный таким путем альдегид подвергали дальнейшей реакции без дополнительной очистки.

63 мг (0.177 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 15 мл дихлорметана и добавляли 52.4 мг (0.247 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 20.2 мкл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 89.6 мг (0.212 ммоль) альдегида, описанного выше, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 20 мин. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После объединения соответствующих фракций растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 71 мг (53% от теории за 2 стадии) бензил (9R)-9-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=761 (М+Н)⁺.

70 мг (92 мкмоль) этого промежуточного соединения вносили в 15 мл дихлорметана, смесь охлаждали до 10°С и добавляли 54 мкл триэтиламина и 25.5 мкл (0.23 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Такие же количества хлорангидрида кислоты и триэтиламина добавляли после 1 ч перемешивания при КТ и еще раз после дополнительного часа перемешивания при КТ. Реакционную смесь затем перемешивали при КТ в течение дополнительных 30 мин и затем концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли с получением после упаривания растворителей и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода 46.5 мг (59% от теории) ацилированного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=861 (М+Н)⁺.

46 мг (53 мкмоль) этого промежуточного соединения растворяли в 5 мл метанола и добавляли 2.7 мл 2М раствора гидроксида лития. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь доводили до рН 3-4 с помощью уксусной кислоты и затем разбавляли 15 мл воды. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода с получением после сушки остатка в высоком вакууме 37 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=729 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С73

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[3-(триметилсилил)пропаноил]-L-цистеин

619 мг (0.86 ммоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) сначала загружали в 8.8 мл дихлорметана и добавляли 87 мг (0.86 ммоль) триэтиламина и 224 мг (0.86 ммоль) N-[2-(триметилсилил)этоксикарбонилокси]пирролидин-2,5-диона. Спустя 1 час добавляли 45 мг (0.17 ммоль) N-[2-(триметилсилил)этоксикарбонилокси]пирролидин-2,5-диона. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Смесь концентрировали при пониженном давлении, остаток вносили в дихлорметан и органическую фазу затем два раза промывали водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 602 мг (71%, чистота 87%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=861 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С74

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноил]-D-аланинат (1:1)

75 мг (0.114 ммоль) Промежуточного соединения С58 вносили в 12.5 мл ДМФА и сочетали с 78 мг (0.171 ммоль) Промежуточного соединения L75 в присутствии 65 мг (0.11 ммоль) HATU и 79 мкл N,N-диизопропилэтиламина. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ, промежуточное соединение вносили в 20 мл этанола и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода 1:1 приводила к получению 63 мг (64% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.16 мин; МС (EI положит.): m/z=844 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С75

Метил (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата (полученного из (3S)-3-амино-4-метокси-4-оксобутановой кислоты классическими методами), растворенного в 175 мл ДХМ, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Смесь затем разбавляли ДХМ и два раза экстрагировали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций, концентрирования и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 4.6 г (61% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614.32 (М+Н)⁺.

200 мг (0.33 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 10 мл ДХМ, и затем добавляли 105 мкл триэтиламина и 77 мкл (0.717 ммоль) ацетоксиацетилхлорида. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток вносили в этилацетат и два раза экстрагировали насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и затем концентрировали. Это приводило к получению 213 мг (75%) указанного в заголовке соединения в виде бежевой пены.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С76

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-карбоксипропил}-L-аланинамид

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения С75 в соответствии с классическими методами химии пептидов (удаление Теос защитной группы хлоридом цинка, ацилирование N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и расщепление сложного эфира гидроксидом лития в смеси ТГФ/вода).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.23 мин; МС (ESI положит.): m/z=818 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С77

S-(11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутаноил)-L-цистеин

4-трет-Бутокси-4-оксобутановую кислоту (8.39 мг, 48.1 мкмоль) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли 7.37 мг (48.1 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата, 15.5 мг ((48.1 мкмоль) фторбората (бензотриазол-1-илокси)бисдиметиламинометилия и 8.60 мкл (48.1 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Также вначале 40.0 мг (0.048 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин (1:1) (Промежуточное соединение С71) загружали в 1.0 мл ДМФА, добавляли 25.4 мкл (141.9 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина, и полученную смесь добавляли к реакционной смеси, которую перемешивали при КТ в течение 4 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 35.0 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.76 мин; МС (ESI положит.): m/z=873 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С78

11-{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-овая кислота

197 мг (0.354 ммоль) 2-(триметилсилил)этил [3-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)пропил]карбамата (см. синтез Промежуточного соединения С11) сначала загружали в 5.0 мл дихлорметана, и смесь нагревали до 40°С. При этой температуре добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Затем добавляли 240 мкл (3.0 ммоль) пиридина и 220 мкл (1.8 ммоль) метил 4-хлор-4-оксобутаноата, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу экстрагировали, в каждом случае три раза, раствором KHSO₄ 5% концентрации. Органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 74.1 мг (31% от теории) метил 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.49 мин; МС (ESI положит.): m/z=670 [М+Н]⁺.

78.3 мг (117 мкмоль) метил 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силапентадекан-15-оата сначала загружали в 4.0 мл ТГФ и добавляли 800 мкл метанола, 160 мкл воды и 230 мкл (230 мкмоль) водного раствора LiOH (1М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 64.8 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.61 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=654 [М-Н]^-

Промежуточное соединение С79

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-амино-N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-D-аланинат (1:1)

57.4 мг (81.8 мкмоль) 11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С69) сначала загружали в 5.7 мл ДМФА, добавляли 74.0 мг (164 мкмоль) соединения трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1) (Промежуточное соединение L75), 43 мкл (250 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и 62.2 мг (164 мкмоль) HATU, и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч, гасили уксусной кислотой и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 52.4 мг (63% от теории) соединения 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=1022 [М]⁺

В атмосфере аргона 6.23 мг (27.7 мкмоль) ацетата палладия (II) сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана, добавляли 12 мкл (83 мкмоль) триэтиламина и 89 мкл (550 мкмоль) триэтилсилана и смесь перемешивали в течение 5 минут. Затем добавляли 56.7 мг (55.5 мкмоль) 2-(триметилсилил)этил N-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12,17-триоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-ил)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланината в 3.0 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь концентрировали почти досуха, добавляли смесь ацетонитрил/вода, и реакционную смесь фильтровали и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 37.4 мг (67% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12):): R_t=2.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=888 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С80

S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-(глициламино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1)

В атмосфере аргона 43.4 мг (95.1 мкмоль) 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овой кислоты (Промежуточное соединение L90) сначала загружали в 2.5 мл ДМФА, добавляли 14.6 мг (95.1 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата, 30.5 мг (95.1 мкмоль) фторбората (бензотриазол-1-илокси)бисдиметиламинометилия и 16.5 мкл (95.1 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали в течение 10 мин. 79.0 мг (95.1 мкмоль) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-L-цистеин / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение С71) растворяли в 2.5 мл ДМФА, добавляли 49.5 мкл (285.3 мкмоль) N,N-диизопропилэтиламина и полученную смесь добавляли к реакционной смеси. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 44.2 мг (40% от теории) соединения S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=1156 [М+Н]⁺.

60.2 мг (52.1 мкмоль) S-(11-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил)-N-[15-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил]-L-цистеина суспендировали в 3.0 мл этанола, добавляли 6.0 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Дважды добавляли еще по 6.0 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывали и реакционную смесь освобождали от растворителя при пониженном давлении и сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 29.4 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=3.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=1021 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С81

(R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-циклогексилметанамин

В атмосфере аргона и при -78°С 18.7 мл (37.45 ммоль) хлорида циклогексилмагния в диэтиловом эфире (2М) добавляли к раствору 3.12 мл (6.24 ммоль) диметилцинка в толуоле (2.0 М), и смесь перемешивали при -78°С в течение 30 минут. Затем при -78°С добавляли раствор 5.0 г (12.48 ммоль) (R)-N-{(Е/Z)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]метилен}-2-метилпропан-2-сульфинамида в ТГФ, и реакционную смесь перемешивали при этой температуре в течение 1 ч и затем при КТ в течение 4 ч. Затем при -78°С добавляли мл насыщенного раствора хлорида аммония и реакционной смеси давали нагреться до КТ. Смесь разбавляли этилацетатом и промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, этилацетат/циклогексан 25:75). Это приводило к получению 1.59 г (26% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.76 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=483 [М-Н]^-

В атмосфере аргона 264.0 мг (0.54 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 0.5 мл 1,4-диоксана, и затем добавляли раствор 1.36 мл HCl в 1,4-диоксане (4.0 М). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли дихлорметан, и реакционную смесь промывали 1М водным раствором гидроксида натрия. Органическую фазу сушили сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, метанол/дихлорметан 98:2). Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в дихлорметане, промывали раствором бикарбоната натрия и сушили над сульфатом натрия. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 148 мг (72% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 13): R_t=2.07 мин; МС (ESI положит.): m/z=364 [M-NH₂]⁺

Промежуточное соединение С82

2-(Триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]амино}пропил)карбамат

В атмосфере аргона 392.2 мг (1.85 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 91.29 мг (1.52 ммоль) уксусной кислоты добавляли к раствору 503.0 мг (1.32 ммоль) 1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-1-циклогексилметанамина (Промежуточное соединение С81) в 1.4 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 574.6 (2.38 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата в дихлорметане, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. После добавления 143 мг (0.66 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамата смесь перемешивали в течение дополнительных 2 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 488 г (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=582 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С83

2-(Триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамат

280.0 мг (2.77 ммоль) триэтиламина и 397.8 мг (3.52 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к раствору 487.9 мг (0.84 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С82) в 8.40 мл дихлорметана с 4 молекулярным ситом, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 6 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 470 мг (85% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=680 (M+Na)⁺.

Промежуточное соединение С84

S-{11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-L-цистеин

322.1 мг (2.66 ммоль) L-цистеина суспендировали в 0.19 мл воды вместе с 319.0 мг (3.80 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 250.0 мг (0.38 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С83), растворенного в 1.90 мл изо-пропанола, и 693.8 г (4.56 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 276 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=744 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С85

S-{11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин

34.8 мг (0.27 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 100 мг (0.13 ммоль) S-{11-[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-7,11-диаза-2-силатридекан-13-ил}-L-цистеина (Промежуточное соединение С84) и 41.5 мг (0.13 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона (1:1) в 4.0 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 88 мг (70% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=936 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С86

11-[(R)-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овая кислота

161.65 мг (1.17 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 220.0 мг (0.33 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-{[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил](хлорацетил)амино}пропил)карбамата (Промежуточное соединение С83) и 39.02 мг (0.37 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 7.45 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 201 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=2.72 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=726 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С87

2-(Триметилсилил)этил {13-[R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2,7,12-триоксо-10-тиа-3,6,13-триазагексадекан-16-ил}карбамат

54.18 мг (0.28 ммоль) N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамида (Промежуточное соединение L1), 71.01 мг (0.50 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, 104.46 мг (0.27 ммоль) HATU и 0.23 мл (0.14 ммоль) 0.5 М 1-гидрокси-7-азабензотриазола в ДМФА добавляли к раствору 100 мг (0.14 ммоль) 11-[(R)-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил](циклогексил)метил]-2,2-диметил-6,12-диоксо-5-окса-14-тиа-7,11-диаза-2-силагептадекан-17-овой кислоты (Промежуточное соединение С86) в 1.37 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 ч. Без дополнительной обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 41 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t = 2.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С88

трет-Бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат / трифторуксусная кислота (1:1)

Смесь стереоизомеров

1.71 г (8.05 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 0.40 г (6.61 ммоль) уксусной кислоты добавляли к раствору 2.04 мг (5.75 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина (Промежуточное соединение С52) в 51 мл дихлорметана, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 минут. Затем добавляли раствор 1.32 г (6.61 ммоль) трет-бутил 3-формилпирролидин-1-карбоксилата в 20 мл дихлорметана, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом и органическую фазу промывали, в каждом случае два раза, насыщенным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 1.86 г (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=538 (М+Н-CF₃CO₂H)⁺.

Промежуточное соединение С89

трет-Бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилат

1.36 г (13.42 ммоль) триэтиламина и 2.13 г (18.87 ммоль) хлорацетилхлорида добавляли к раствору 2.89 г (4.19 ммоль, чистота 80%) трет-бутил 3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С88) в 42 мл дихлорметана с 4 молекулярным ситом. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 ч. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 449 мг (17% от теории) Изомера 1 и 442 мг (17% от теории) Изомера 2 указанного в заголовке соединения.

Изомер 1 ЖХ-МС (Метод 1): R_t=2.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

Изомер 2 ЖХ-МС (Метод 1): R_t=2.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=614 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С90

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин (Изомер 1)

357.3 мг (0.58 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.3 мл воды вместе с 488.7 мг (4.07 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 357.0 мг (0.58 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Изомер 1) (Промежуточное соединение С89, Изомер 1), растворенного в 23.0 мл изопропанола, и 1.06 г (6.98 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 255.0 мг (62% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=699 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С91

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин (Изомер 2)

453.5 мг (3.74 ммоль) L-цистеина суспендировали в 2.1 мл воды вместе с 449.2 мг (5.35 ммоль) бикарбоната натрия. Добавляли 3287.4 мг (0.54 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 2), растворенного в 21.1 мл изопропанола, и 0.98 г (6.42 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщ. раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без очистки. Это приводило к получению 221.0 мг (59% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.12 мин; МС (ESI положит.): m/z=699 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С92

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин (Изомер 1)

18.49 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С90) и 22.06 мг (0.07 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.3 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 45 минут. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 65 мг (100% от теории, чистота 71%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=892 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С93

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-цистеин (Изомер 2)

18.49 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50.0 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С91) и 22.06 мг (0.07 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.0 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 90 минут. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 63 мг (98% от теории, чистота 73%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=892 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С94

S-[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-цистеин (Изомер 1)

18.5 мг (0.14 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли к смеси 50.0 мг (0.07 ммоль) S-[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[-1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеина (Промежуточное соединение С90) и 18.0 мг (0.07 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона в 3.3 мл ДМФА, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором NH₄Cl и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 57 мг (81% от теории, чистота 85%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=836 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С95

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота (Изомер 1)

302.5 мг (2.19 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 384.0 мг (0.62 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 1) и 73.0 мг (0.69 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 14 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 358.0 мг (84% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.33 мин; МС (ESI положит.): m/z=684 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С96

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота (Изомер 2)

226.0 мг (1.64 ммоль) карбоната калия добавляли к смеси 287.0 мг (0.45 ммоль) трет-бутил 3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}пирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С89, Изомер 2) и 54.6 мг (0.51 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 14 мл метанола и нескольких каплях воды. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 318.7 мг (88% от теории, чистота 88%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=684 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С97

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-14-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазатетрадец-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 22.75 мг (0.07 ммоль) соединения N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L1) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 26 мг (84% от теории) указанного в заголовке соединения. ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=863 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С98

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-18-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,13-триоксо-5-тиа-2,9,12-триазаоктадец-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 37.30 мг (0.07 ммоль) соединения N-(2-аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 22 мг (63% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 5): R_t=4.54 мин; МС (ESI положит.): m/z=919 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С99

трет-Бутил 3-[2-{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}-24-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-3,8,19-триоксо-12,15-диокса-5-тиа-2,9,18-триазатетракоз-1-ил]пирролидин-1-карбоксилат (Изомер 2)

В атмосфере аргона 14.17 мг (0.11 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 27.80 мг (0.07 ммоль) HATU добавляли к раствору 25.0 мг (0.04 ммоль) 3-{[2-({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[1-(трет-бутоксикарбонил)пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановой кислоты (Промежуточное соединение С96) в 2.81 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 10 минут. Затем добавляли раствор 35.05 мг (0.07 ммоль) соединения N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид-этан / трифторуксусная кислота (1:1) (Промежуточное соединение L82) в 1.4 мл ДМФА и 5 мг (0.04 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина, и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли воду и смесь экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 25 мг (60% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=4.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=1007 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С100

2-(Триметилсилил)этил {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}карбамат

22.2 мг (0.068 ммоль) соединения (2R)-N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропанамид / трифторуксусная кислота (1:1) добавляли к раствору 45 мг (0.068 ммоль) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты (Промежуточное соединение С58) в 5.8 мл ДМФА. После 30 минут перемешивания при КТ к смеси добавляли 39 мг (0.10 ммоль) HATU и 36 мг (0.27 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Без обработки смесь очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 7 мг (12% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.41 мин; МС (ESI положит.): m/z 851 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С101

Трифторуксусная кислота / метил (2S)-4-[(ацетоксиацетил){(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино]-2-аминобутаноат (1:1)

4.3 г (12.2 ммоль) Промежуточного соединения С52 растворяли в 525 мл ДХМ и добавляли 3.63 г (17.12 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия и 8.4 мл уксусной кислоты. После 5 мин перемешивания при КТ, добавляли 3.23 г (11.85 ммоль) метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноата (полученного из (3S)-3-амино-4-метокси-4-оксобутановой кислоты классическими методами), растворенного в 175 мл ДХМ, и смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 45 мин. Смесь затем разбавляли ДХМ и два раза экстрагировали 100 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление объединения соответствующих фракций, концентрирования и сушки остатка в высоком вакууме приводило к получению 4.6 г (61% от теории) промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=614.32 (М+Н)⁺.

2.06 г (3.36 ммоль) этого промежуточного соединения сначала загружали в 76 мл ДХМ и ацилировали 0.81 мл (7.17 ммоль) 2-хлор-2-оксоэтилацетата в присутствии 2.1 мл триэтиламина. После 20 ч перемешивания при КТ, добавляли 0.36 мл 2-хлор-2-оксоэтилацетата и 0.94 мл триэтиламина и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение дополнительных 15 мин. Смесь затем разбавляли 500 мл этилацетата и последовательно экстрагировали два раза 300 мл раствора лимонной кислоты 5% концентрации, два раза 300 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и один раз 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия, и затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 2.17 г (79% от теории) защищенного промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=714 (М+Н)⁺.

321 мг (0.342 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 7 мл 2,2,2-трифторэтанола. Добавляли 279.5 мг (2.05 ммоль) хлорида цинка, и реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Затем добавляли 599 мг (2.05 ммоль) этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты и 2 мл водного раствора трифторуксусной кислоты концентрации 0.1% в воде, и смесь затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Осуществление концентрирования соответствующих фракций и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода приводило к получению 60 мг (26% от теории) указанного в заголовке соединения, которое все еще содержало часть деацетилированного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.91 мин и 0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=528 и 570 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С102

(2S)-4-[{(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}бутановая кислота

Прежде всего промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом аналогично Промежуточному соединению С2. Вторичную аминогруппу затем ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, и две сложноэфирные группы затем гидролизовали 2М раствором гидроксида лития в метаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=646 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С103

2-(Триметилсилил)этил N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-N2-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-глутаминат

Сначала получали указанное в заголовке соединение путем сочетания 151 мг (0.23 ммоль) Промежуточного соединения С102 с 128 г (0.234 ммоль) Промежуточного соединения L98 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, защитную группу Z удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 30 минут, получая указанное в заголовке соединение.

Выход: 30% от теории за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.14 мин; МС (ESI положит.): m/z=929 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С104

2-(Триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилат

К раствору 2.24 г (6.31 ммоль) (1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропан-1-амина в 56.0 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом добавляли 1.87 г (8.84 ммоль) триацетоксиборогидрида натрия, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем добавляли 2.20 г (7.58 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4S)-3-фтор-4-формилпирролидин-1-карбоксилата (см. WO 2014/151030 А1), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3.5 ч. Смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и водой. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 1.39 г (24% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=600 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С105

2-(Триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилат

К раствору 692.8 мг (0.88 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}амино)метил]-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С104) в 8.7 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом добавляли 295.0 мг (2.91 ммоль) триэтиламина и 418.9 мг (3.71 ммоль) хлорацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2.5 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток снова растворяли в 8.7 мл дихлорметана вместе с 4 молекулярным ситом и добавляли 295.0 мг (2.91 ммоль) триэтиламина и 418.9 мг (3.71 ммоль) хлорацетилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, концентрировали и использовали далее без очистки. Это приводило к получению 691 мг (74% от теории, чистота 64%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=676 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С106

3-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]сульфанил}пропановая кислота

К смеси 691.0 мг (0.65 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение С105) и 76.3 мг (0.72 ммоль) 3-сульфанилпропановой кислоты в 15 мл метанола и нескольких каплях воды добавляли 316 мг (2.29 ммоль) карбоната калия. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 1.5 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали далее без обработки. Это приводило к получению 502 мг (67% от теории, чистота 65%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.48 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=744 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение С107

S-{[2-({(1R)-1-[1-Бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}{[(3R,4R)-фтор-1-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}пирролидин-3-ил]метил}амино)-2-оксоэтил]-L-цистеин

203.6 мг (1.68 ммоль) L-цистеина суспендировали в 0.95 мл воды вместе с 201.7 мг (2.40 ммоль) бикарбоната натрия. К суспензии добавляли 170.0 мг (0.24 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(хлорацетил)амино]метил}-4-фторпирролидин-1-карбоксилата (Промежуточное соединение 105), растворенного в 9.5 мл изо-пропанола, и 438.5 г (2.40 ммоль) 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. К реакционной смеси добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз - насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 152 мг (83% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=762 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С108

2-(Триметилсилил)этил N⁶-(N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил)-N²-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизинат

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания 103 мг (0.16 ммоль) Промежуточного соединения С102 с 110 мг (0.175 ммоль) 2-(триметилсилил)этил N⁶-бета-аланил-N²-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизината в ДМФА в присутствии EDCI, НОВТ и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, Z защитную группу удаляли с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси дихлорметан/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа, получая указанное в заголовке соединение с получением 113 мг (75% от теории за 2 стадии).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=957 (М+Н)⁺.

Использованное в данном случае промежуточное соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина и 2-(триметилсилил)этил N²-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината в присутствии HATU, гидрогенолитического отщепления защитной группы Z, введения триметилсилилэтилоксикарбонильной (Теос) защитной группы с помощью 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и заключительного мягкого отщепления Boc защитной группы путем перемешивания в 7.5% растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане в течение 45 минут.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.83 мин; МС (ESI положит.): m/z=462 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С109

Ди-трет-бутил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-глутамат

Прежде всего, дипептидное производное ди-трет-бутил бета-аланил-L-глутамат получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-бета-аланина и гидрохлорида ди-трет-бутил L-глутамата (1:1) в присутствии HATU и последующего гидрогенолитического отщепления защитной группы Z. Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания этого промежуточного соединения с Промежуточным соединением С102 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 45 минут.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С110

Дибензил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-L-глутамат

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания дибензил L-глутамата, который был высвобожден заранее из его соли с n-толуолсульфоновой кислотой с помощью распределения между этилацетатом и 5% раствором гидрокарбоната натрия, с Промежуточным соединением С61 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления Теос защитной группы хлоридом цинка в трифторэтаноле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=894 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С111

Ди-трет-бутил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-бета-аланил-D-глутамат

Указанное в заголовке соединение синтезировали аналогично Промежуточному соединению С109.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.06 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С112

N²-Ацетил-N-[2-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)этил]-N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали путем HATU сочетания Промежуточного соединения С102 и Промежуточного соединения L108 в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле при нормальном давлении.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=826 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение С113

Трифторуксусная кислота / бензил N-{(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1)

Прежде всего, соединение трифторуксусная кислота / бензил-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1) получали исходя из коммерчески доступного 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланина путем этерификации бензиловым спиртом в присутствии EDC/DMAP с последующей элиминацией Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты. Эту аминокислотную единицу затем сочетали с Промежуточным соединением С58 в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина в ДМФА. На последней стадии путем перемешивания при 50°С в трифторэтаноле с 6 эквивалентами хлорида цинка в течение 2 часов и очистки с помощью препаративной ВЭЖХ получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.05 мин; МС (ESI положит.): m/z=824 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С114

Трифторуксусная кислота / трет-бутил 4-({(2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]бутаноил}амино)бутаноат (1:1)

Прежде всего, Промежуточное соединение С102 сочетали с гидрохлоридом трет-бутил 4-аминобутаноата (1:1) в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Затем, путем гидрирования над 10% палладием на активированном угле в смеси ДХМ/метанол 1:1 при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 часа получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.0 мин; МС (ESI положит.): m/z=655 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение С115

Трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-метилбутанамид (1:1)

Прежде всего, Промежуточное соединение С52 подвергали восстановительному алкилированию бензил (2S)-2-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутаноатом по аналогии с Промежуточным соединением С2. Затем, вторичную аминогруппу ацилировали 2-хлор-2-оксоэтилацетатом, как описано для Промежуточного соединения С27.

190 мг (0.244 ммоль) этого промежуточного соединения вносили в 7.5 мл этанола и добавляли 0.35 мл 40% раствора метанамина в воде. Смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч и затем такое же количество метанамина добавляли снова. После перемешивания при 50°С в течение еще 5 ч, смесь концентрировали и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Получали 78 мг (48% от теории) этого промежуточного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.32 мин; МС (EI положит.): m/z=661 [М+Н]⁺.

78 мг (0.118 ммоль) этого промежуточного соединения растворяли в 8 мл этанола и, после добавления 15 мг 10% палладия на активированном угле, гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 3 ч. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении и продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. После лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода получали 33 мг (44% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=527 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆): δ=8.1 (m, 1Н), 8.0 (m, 3Н), 7.9 (m, 1Н), 7.65 (m, 1Н), 7.5 (s, 1Н), 7.15-7.35 (m, 5Н) 7.0 (m, 1Н), 6.85 (m, 1Н), 5.6 (s, 1Н), 4.9 и 5.2 (2d, 2Н), 4.02 и 4.22 (2d, 2Н), 3.2-3.5 (m, 6Н), 0.7 и 1.46 (2 m, 2Н), 0.8 (s, 9Н).

Промежуточное соединение С116

Трифторуксусная кислота / N¹-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}-L-аспартамид (1:1)

Соединение трифторуксусная кислота / (2S)-2-амино-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-N-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)бутанамид (1:1) (81.0 мг, 100 мкмоль) (Промежуточное соединение F104) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил N²-(трет-бутоксикарбонил)-L-аспарагинат (43.0 мг, 131 мкмоль) растворяли в 5.0 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали с N,N-диизопропилэтиламином (61 мкл, 350 мкмоль) при КТ в течение 1 ч, и затем незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали. Это приводило к получению 84 мг (88% от теории) соединения трет-бутил [(2S)-4-амино-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}амино)-1,4-диоксобутан-2-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=907 [М+Н]⁺.

трет-Бутил [(2S)-4-амино-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-бензил-4-(2,5-дифторфенил)-1Н-пиррол-2-ил]-2,2-диметилпропил}(гликолоил)амино]-1-[(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)амино]-1-оксобутан-2-ил}амино)-1,4-диоксобутан-2-ил]карбамат (83.0 мг, 91.5 мкмоль) растворяли в 5.0 мл трифторэтанола. К реакционной смеси добавляли хлорид цинка (74.8 мг, 549 мкмоль) и перемешивали при 50°С в течение дополнительных 15 мин. К смеси добавляли этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту (160 мг, 549 мкмоль) и разбавляли 5.0 мл смеси ацетонитрил/вода, добавляли ТФУ (20 мкл) и смесь перемешивали в течение 10 мин. Смесь фильтровали через шприцевой фильтр и очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Chromatorex 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 50 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=807 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L1

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=198 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L2

Трифторуксусная кислота / rel-(1R,2S)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.214 ммоль) коммерчески доступной цис-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-циклопентанкарбоновой кислоты и 60 мг (0.235 ммоль) также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 36 мг (38% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L3

Трифторуксусная кислота / (1S,2R)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.214 ммоль) коммерчески доступной (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и 72 мг (0.283 ммоль) также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 13 мг (16% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.2 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L4

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)циклогексанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-[(4-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}циклогексил)метил]-1Н-пиррол-2,5-диона и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.26 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=280 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L5

Трифторуксусная кислота N{-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-бета-аланинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона и N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.22 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.22 мин; МС (ESI положит.): m/z=260 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L6

Трифторуксусная кислота / трет-бутил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали сперва путем сочетания в присутствии EDC/HOBT коммерчески доступной 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты с частично защищенным пептидом трет-бутил-L-валил-L-аланил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинатом, полученным классическими методами химии пептидов. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ, что приводило к получению указанного в заголовке соединения с выходом 37%.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.29 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.62 мин; МС (ESI положит.): m/z=566 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L7

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N2-(трет-бутоксикарбонил)-N5-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валинатом, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 32 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.31 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.47 мин; МС (ESI положит.): m/z=516 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L8

Трифторуксусная кислота / L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 171 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.23 мин;

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=0.3 мин; МС (ESI положит.): m/z=417 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L9

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L7 из коммерчески доступного метил (4-аминофенил)ацетата. Получали 320 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.48 мин; МС (ESI положит.): m/z=493 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L10

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-rel-N⁶-{[(1R,2S)-2-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизин трифторуксусная кислота (1:2)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения L6 путем сочетания с цис-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-1-циклопентанкарбоновой кислотой с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 12 мг (52% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L11

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1S,2R)-2-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизин / трифторуксусная кислота (1:2)

Указанное в заголовке соединение получали из Промежуточного соединения L6 путем сочетания с (1S,2R)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислотой с помощью EDC/HOBT и последующего снятия защиты с помощью ТФУ. Это приводило к получению 11 мг (39% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.45 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L12

Трифторуксусная кислота / 1-[2-(2-аминоэтокси)этил]-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

381 мг (2.46 ммоль) метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-карбоксилата добавляли к 228 мг (1.12 ммоль) трет-бутил [2-(2-аминоэтокси)этил]карбамата, растворенного в 7 мл смеси диоксан/вода 1:1. Затем добавляли 1.2 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия и реакционную смесь перемешивали при КТ. После перемешивания в общей сложности в течение 5 дней и 2-х дополнительных добавлений таких же количеств раствора бикарбоната натрия, реакционную смесь обрабатывали посредством подкисления трифторуксусной кислотой, концентрирования на роторном испарителе и очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли, растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1.

Остаток вносили в 3 мл дихлорметана и добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты. После 15 мин перемешивания при КТ, растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1. Это приводило к получению 70 мг (67% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения в виде смолистого остатка.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.18 мин; МС (ESI положит.): m/z=185 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L13

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N2-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты с гидрохлоридом трет-бутил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизината (1:1) в присутствии EDC/HOBT и последующего мягкого удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы аналогично Промежуточному соединению L6.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.42 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=340 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L14

Трифторуксусная кислота / 1-[2-(4-аминопиперазин-1-ил)-2-оксоэтил]-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L2 за 2 стадии из трет-бутил пиперазин-1-илкарбамата и (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=239 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L15

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропанамид (1:1)

2.93 г (10.58 ммоль) трет-бутил 3-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси}пропаноата растворяли в 100 мл смеси диоксан/вода 1:1 и добавляли 3.28 г (21.15 ммоль) метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-карбоксилата и насыщенного раствора бикарбоната натрия до достижения значения рН 6-7. Раствор перемешивали при КТ в течение 30 мин и 1,4-диоксан затем упаривали при пониженном давлении. Затем добавляли 200 мл воды, и смесь три раза экстрагировали этилацетатом, в каждом случае порциями по 300 мл. Органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом магния и фильтровали. Концентрирование приводило к получению трет-бутил 3-(2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этокси)пропаноата в виде коричневого масла, которое затем сушили в высоком вакууме.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=375 (M+NH₄)⁺.

Это промежуточное соединение превращали стандартными методами (снятие защиты с помощью ТФУ, сочетание с трет-бутил (2-аминоэтил)карбаматом и еще одно снятие защиты с помощью ТФУ) в указанное в заголовке соединение.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=344 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L16

N-[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитин

535 мг (1.73 ммоль) коммерчески доступного 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона и 930 мл N,N-диизопропилэтиламина добавляли к раствору 266 мг (1.33 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина в 24 мл ДМФА. Реакционную смесь обрабатывали в ультразвуковой бане в течение 24 ч и затем концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ и получали, после концентрирования соответствующих фракций и сушки остатка в высоком вакууме, 337 мг (50% от теории) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=468 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L17

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали сперва путем сочетания 172 мг (0.37 ммоль) Промежуточного соединения L16 и 125 мг (0.37 ммоль) гидрохлорида трет-бутил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизината (1:1) в присутствии EDC/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 2 ч в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 194 мг (49% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.1 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=652 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L18

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-аланил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из метил (4-аминофенил)ацетата аналогично Промежуточному соединению L7 в соответствии с классическими методами химии пептидов путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 330 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.29 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=465 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L19

Трифторуксусная кислота / L-аланил-N5-карбамоил-N-(4-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}фенил)-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 1,4-фенилендиамина в соответствии с классическими методами химии пептидов. На первой стадии 942 мг (8.72 ммоль) 1,4-фенилендиамина моноацилировали 0.8 г (2.9 ммоль) N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитина в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На второй стадии, аналогичным образом, вторую анилиновую аминогруппу ацилировали (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Выполнение снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ затем давало, за 3 дополнительные стадии синтеза, указанное в заголовке соединение, причем этим путем получали 148 мг данного соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.21 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=0.2 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L20

Трифторуксусная кислота / L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов аналогично Промежуточному соединению L8 из коммерчески доступного 1-(4-аминофенил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем последовательного сочетания с N²-(трет-бутоксикарбонил)-N⁵-карбамоил-L-орнитином в присутствии HATU, снятия защиты с помощью ТФУ, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-валинатом и еще одного снятия защиты с помощью ТФУ. Получали 171 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.28 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.39 мин; МС (ESI положит.): m/z=445 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L21

L-Валил-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-N-[4-(2-метокси-2-оксоэтил)фенил]-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного 0.42 г (2.56 ммоль) метил (4-аминофенил)ацетата путем последовательного сочетания с N6-(трет-бутоксикарбонил)-N2-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, снятия защиты пиперидином, сочетания с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валинатом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и следующего гидрогенолитического удаления бензилоксикарбонильной защитной группы над 10% палладием на активированном угле. Получали 360 мг (32% от теории за 4 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.5 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=493 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L22

Трифторуксусная кислота / N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N-{4-[(2S)-2-амино-3-метокси-3-оксопропил]фенил}-N⁵-карбамоил-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из N-(трет-бутоксикарбонил)-4-нитро-L-фенилаланина в соответствии с классическими методами химии пептидов. 2.5 г (8.06 ммоль) этого исходного вещества на первой стадии сначала превращали в соль цезия и затем с помощью йодметана в ДМФА в сложный метиловый эфир.

Затем гидрогенолитически в метаноле над 10% палладием на активированном угле нитрогруппу превращали в аминогруппу.

Образованную таким путем аминогруппу затем ацилировали N5-карбамоил-N2-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-орнитином в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. На следующей стадии Fmoc группу удаляли с помощью пиперидина в ДМФА.

Затем проводили сочетание в ДМФА с N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валином в присутствии гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, 1-гидрокси-1H-бензотриазолгидрата и N-диизопропилэтиламина, и в заключение удаление трет-бутоксикарбонильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.6 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L23

Трифторуксусная кислота / N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]-бета-аланинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланином в присутствии EDCI/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин.

Промежуточное соединение L24

Трифторуксусная кислота / 1-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил] циклопропанкарбоксамид (1:1)

114 мг (0.67 ммоль) коммерчески доступной 1-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопропанкарбоновой кислоты растворяли в 25 мл ДХМ, добавляли 110 мг (0.623 ммоль) коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) и 395 мкл N,N-диизопропилэтиламина и смесь охлаждали до -10°C. Затем добавляли 217 мг (0.793 ммоль) тетрафторбората 2-бром-1-этилпиридиния, и смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Смесь затем разбавляли этилацетатом и последовательно экстрагировали лимонной кислотой 10% концентрации, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором хлорида натрия, затем сушили над сульфатом магния и концентрировали. Сушка в высоком вакууме приводила к получению 152 мг защищенного промежуточного соединения.

Затем его вносили в 10 мл ДХМ и защиту удаляли с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 158 мг (71% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=224 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L25

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-L-аланин

31.4 мг (0.17 ммоль) валил-L-аланина растворяли в 3.0 мл ДМФА и добавляли 115.0 мг (0.17 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 33.7 мг (0.33 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 74.1 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=763 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L26

L-Валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600.0 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина суспендировали в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), добавляли палладий на угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывали и растворители упаривали при пониженном давлении. Полученное соединение использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Затем добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционный раствор незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина сначала загружали в 20.0 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1) и добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле. Смесь гидрировали водородом при КТ и нормальном давлении в течение 5 ч. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Указанное в заголовке соединение (182 мг, 72% от теории) использовали на следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L27

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

30 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина (Промежуточное соединение L26) и 46.1 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида сначала загружали в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционный раствор перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 55.6 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=920 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L28

трет-Бутил 3-формил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1-карбоксилат

461.7 мг (1.15 ммоль) 1-трет-бутил 3-этил-4-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)пирролидин-1,3-дикарбоксилата (это соединение получали в соответствии с литературной методикой WO 2006/066896) сначала загружали в 5.0 мл абсолютного дихлорметана и смесь охлаждали до -78°С. Затем медленно по каплям добавляли 326.2 мг (2.29 ммоль) раствора гидрида диизобутилалюминия (1 М в ТГФ) и смесь перемешивали при -78°С в течение 2 ч (контроль осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (петролейный эфир/этилацетат = 3:1). По каплям добавляли 1.3 г (4.59 ммоль) тартрата калия-натрия, растворенного в 60 мл воды, и реакционной смеси давали нагреться до КТ. К реакционной смеси добавляли этилацетат и водную фазу три раза экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали один раз насыщ. раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 629.0 мг указанного в заголовке соединения в виде сырого продукта, который немедленно использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L29

трет-Бутил 3-формил-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилат

Смесь диастереомеров.

807.1 мг (2.34 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (полученного в соответствии с литературной методикой WO 2006/100036) сначала загружали в 8.0 мл дихлорметана и добавляли 236.4 мг (2.34 ммоль) триэтиламина. При 0°С по каплям добавляли 267.6 мг (2.34 ммоль) метансульфонилхлорида, и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли еще 133.8 мг (1.17 ммоль) метансульфонилхлорида и 118.2 мг (1.17 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, насыщенным раствором бикарбоната натрия, раствором гидросульфата калия 5% концентрации и насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на Biotage Isolera (силикагель, колонка 50 г SNAP, скорость потока 66 мл/мин, циклогексан/этилацетат). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 402.0 мг (41% от теории) соединения трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-{[(метилсульфонил)окси]метил}пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.38 мин; МС (ESI положит.): m/z=424 [М+Н]⁺.

400.0 мг (0.94 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-{[(метилсульфонил)окси]метил}пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 5.0 мл ДМФА и добавляли 98.2 мг (1.51 ммоль) азида натрия. Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 10 ч. Затем добавляли еще 30.7 мг (0.47 ммоль) азида натрия, и смесь перемешивали при 40°С в течение дополнительных 10 ч. Добавляли этилацетат и органическую фазу несколько раз промывали водой. После сушки органической фазы над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 309.5 мг (89% от теории) соединения трет-бутил 3-(азидометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.50 мин; МС (ESI положит.): m/z=371 [М+Н]⁺.

250 мг (0.68 ммоль) трет-бутил 3-(азидометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 10.0 мл смеси этилацетат/этанол (1:1) и добавляли 25.0 мг палладия на активированном угле (10%). Смесь гидрировали водородом при КТ и нормальном давлении в течение 8 ч. Реакционную смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали этилацетатом. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 226.2 мг (82% от теории) соединения трет-бутил 3-(аминометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=345 [М+Н]⁺.

715.0 мг (2.08 ммоль) трет-бутил 3-(аминометил)-4-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)пирролидин-1-карбоксилата растворяли в 15.0 мл ТГФ и добавляли 2.28 мл (2.28 ммоль) раствора TBAF (1M в ТГФ). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток (1.54 г) использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.41 мин; МС (ESI положит.): m/z=231 [М+Н]⁺.

1.54 г (4.88 ммоль) трет-бутил 3-(аминометил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 1,4-диоксан и добавляли 541.8 мг (4.88 ммоль) хлорида кальция (безводного) и 488.6 мг (4.88 ммоль) карбоната кальция и смесь энергично перемешивали. Затем добавляли 592.8 мг (5.86 ммоль) триэтиламина и 1.52 г (5.86 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 644.9 мг (10.7 ммоль) НОАс и этилацетат. Органическую фазу два раза промывали водой и один раз - насыщенным раствором NaCl. После сушки над сульфатом магния растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток очищали на силикагеле (подвижная фаза: дихлорметан/метанол = 100:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 346.9 мг (19% от теории) соединения трет-бутил 3-(гидроксиметил)-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.08 мин; МС (ESI положит.): m/z=375 [М+Н]⁺.

804.0 мг (2.15 ммоль) трет-бутил 3-(гидроксиметил)-4-[({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)метил]пирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 20.0 мл хлороформа и 20.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 59.7 мг (0.22 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 429.9 мг (3.22 ммоль) N-хлорсукцинимида и 33.5 мг (0.22 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Органическую фазу отделяли и освобождали от растворителя при пониженном давлении. Остаток хроматографировали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат = 3:1). Это приводило к получению 517.0 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.13 мин; МС (ESI положит.): m/z=373 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L30

трет-Бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-формилпирролидин-1-карбоксилат

Смесь стереоизомеров

250.0 мг (0.72 ммоль) трет-бутил 3-({[трет-бутил(диметил)силил]окси}метил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (соединение получали в соответствии с литературной методикой WO 2006/100036) сначала загружали в 12.5 мл смеси дихлорметан/ДМСО (4:1) и добавляли 219.6 мг (2.17 ммоль) триэтиламина. При 2°С небольшими порциями добавляли 345.5 мг (2.17 ммоль) комплекса триоксид серы-пиридин и смесь перемешивали при 2°С в течение 3 ч. Небольшими порциями добавляли еще 345.5 мг (2.17 ммоль) комплекса триоксид серы-пиридин и смесь перемешивали при КТ в течение 17 ч. Реакционную смесь распределяли между дихлорметаном и водой. Водную фазу три раза экстрагировали дихлорметаном и объединенные органические фазы промывали один раз водой и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза (тонкослойная хроматография: петролейный эфир/этилацетат 7:3).

Промежуточное соединение L31

Ди-трет-бутил {[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил }малонат

57.2 г (488.27 ммоль) трет-бутил карбамата, 51.2 мл (683.57 ммоль) раствора 37% концентрации формальдегида в воде и 25.9 г (244.13 ммоль) карбоната натрия добавляли к 600 мл воды. Смесь нагревали до тех пор, пока не образовывался раствор, и затем перемешивали при КТ в течение 16 ч. Образовавшуюся суспензию экстрагировали 500 мл дихлорметана и органическую фазу отделяли, промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом натрия. Смесь концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме, получая кристаллическое твердое вещество. Остаток вносили в 1000 мл абсолютного ТГФ, и по каплям добавляли смесь 322 мл (3.414 моль) ангидрида уксусной кислоты и 138 мл (1.707 моль) пиридина при КТ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и затем концентрировали на роторном испарителе с водяной баней при комнатной температуре. Остаток вносили в диэтиловый эфир и три раза промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия и один раз насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме в течение 2 дней. Остаток вносили в 2000 мл абсолютного ТГФ и добавляли 456 мл (456.52 ммоль) 1 М раствора трет-бутилата калия в ТГФ при охлаждении льдом. Смесь перемешивали при 0°С в течение 20 мин, и затем по каплям добавляли 100.8 г (456.52 ммоль) ди-трет-бутил малоната, растворенного в 200 мл абсолютного ТГФ. Смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч, и затем добавляли воду. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и вносили в 500 мл этилацетата. Смесь промывали 500 мл воды и 100 мл насыщенного раствора хлорида натрия и органическую фазу сушили над сульфатом натрия. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Остаток очищали с помощью фильтрования через силикагель (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат, градиент = 30:1→5:1). Это приводило к получению 37.07 г (22% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L32

трет-Бутил [3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамат

37.0 г (107.11 ммоль) ди-трет-бутил (ацетоксиметил)малоната растворяли в 1000 мл абсолютного ТГФ, и при охлаждении льдом по каплям добавляли 535.5 мл (1071.10 ммоль) 2 М раствора борогидрида лития в ТГФ. По каплям добавляли 19.3 мл (1071.10 ммоль) воды и смесь перемешивали при КТ в течение 4.5 ч. Реакционную смесь концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Остаток вносили в 1500 мл этилацетата, добавляли 100 мл воды и смесь перемешивали при охлаждении водой (слегка экзотермическая реакция) в течение 30 мин. Органическую фазу отделяли и водную фазу два раза экстрагировали 500 мл этилацетата. Органическую фазу концентрировали на роторном испарителе и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 20.7 г (94% от теории) целевого соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=1.49 мин; МС (EI положит.): m/z=106 [M-C₅H₈O₂]⁺.

Промежуточное соединение L33

трет-Бутил [3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(гидроксиметил)пропил]карбамат

20.00 г (97.44 ммоль) трет-бутил [3-гидрокси-2-(гидроксиметил)пропил]карбамата растворяли в 1000 мл абсолютного дихлорметана и добавляли 6.63 г (97.44 ммоль) имидазола и 16.16 г (107.18 ммоль) трет-бутил(хлор)диметилсилана при КТ. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 16 ч и промывали полуконцентрированным раствором хлорида натрия. Водную фазу экстрагировали этилацетатом и объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 28.50 г (92% от теории) целевого соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, скрыт)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H).

Промежуточное соединение L34

трет-Бутил (3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-формилпропил)карбамат

12.65 г (39.591 ммоль) трет-бутил [3-{[трет-бутил(диметил)силил]окси}-2-(гидроксиметил)пропил]карбамата растворяли в 200 мл дихлорметана, и при КТ по каплям добавляли 19.31 г (45.53 ммоль) периодинана Десса-Мартина, растворенного в 150 мл дихлорметана. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем добавляли 250 мл полуконцентрированного раствора бикарбоната натрия и 250 мл раствора тиосульфата натрия 10% концентрации и смесь перемешивали в течение 20 мин. Органическую фазу отделяли и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические фазы промывали 300 мл воды, сушили над сульфатом натрия, концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 11.35 г (90% от теории) целевого соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.02 (s, 6H), 0.84 (s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, (1H, скрыт)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81-3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, 1H).

Промежуточное соединение L35

трет-Бутил (3-оксопропил)карбамат

Указанное в заголовке соединение получали в соответствии с методом, известным из литературы (например, Jean Bastide и др. J. Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545).

Промежуточное соединение L36

N-(Бензилокси)карбонил-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

100 мг (0.57 ммоль) N5-карбамоил-L-орнитина вносили в 4.0 мл ДМФА и добавляли 0.08 мл (0.57 ммоль) триэтиламина. Затем добавляли 199.0 мг (0.57 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валина и 0.08 мл (0.57 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 48 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода с 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 75.7 мг (33% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.69 мин; МС (ESI положит.): m/z=409 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L37

L-Валил-N5-карбамоил-L-орнитин

75.7 мг (0.19 ммоль) Промежуточного соединения L36 суспендировали в 25 мл смеси воды/этанол/ТГФ, добавляли 7.5 мг палладия на активированном угле (10%) и смесь гидрировали при КТ и стандартном давлении водорода в течение 4.5 ч. Катализатор отфильтровывали и реакционную смесь освобождали от растворителя при пониженном давлении и сушили в высоком вакууме. Остаток использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Это приводило к получению 64.9 мг (93% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=275 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L38

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

38.3 мг (0.14 ммоль) Промежуточного соединения L37 сначала загружали в 3.0 мл ДМФА и добавляли 96.4 мг (0.14 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида и 39.0 мкл (0.28 ммоль) триэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Затем добавляли 16.0 мкл (0.28 ммоль) НОАс, и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 58.9 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.61 мин; МС (ESI положит.): m/z=849 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение L39

2-(Триметилсилил)этил (2-сульфанилэтил)карбамат

300 мг (2.64 ммоль) гидрохлорида 2-аминоэтантиола (1:1) сначала загружали в 3.0 мл дихлорметана и добавляли 668.0 мг (6.60 ммоль) триэтиламина и 719.1 мг (2.77 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона. Смесь перемешивали при КТ в течение 2 дней (контроль осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии: дихлорметан/метанол = 100:1.5). Добавляли этилацетат и реакционную смесь три раза промывали водой. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором NaCl и сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Соединение использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L40

N-[31-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-29-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25-октаокса-28-азагентриаконтан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина гидрировали водородом в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), используя палладий на угле (10%) при КТ и нормальном давлении. Соединение N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180.0 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-( трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 20 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1), добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле и смесь гидрировали водородом при нормальном давлении и при КТ. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 182.0 мг (72% от теории) соединения L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина и 46.1 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{27-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-27-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакоз-1-ил}пропанамида растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 55.6 мг (90% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.77 мин; МС (ESI положит.): m/z=920 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L41

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин

600 мг (1.58 ммоль) N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина гидрировали водородом в 25.0 мл смеси вода/этанол/ТГФ (1:1:0.5), используя палладий на угле (10%) при КТ и нормальном давлении. Соединение N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизин использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.99 мин; МС (ESI положит.): m/z=247 [М+Н]⁺.

180.0 мг (0.73 ммоль) N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 5.0 мл ДМФА и добавляли 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Добавляли 254.6 мг (0.73 ммоль) 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината и 74.0 мг (0.73 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3.5 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 294.1 мг (76% от теории) соединения N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.97 мин; МС (ESI положит.): m/z=480 [М+Н]⁺.

272.2 мг (0.57 ммоль) N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина растворяли в 20.0 мл смеси этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1), добавляли 27.2 мг палладия на активированном угле и смесь гидрировали водородом при нормальном давлении и при КТ. Смесь фильтровали через целит^(R) и остаток на фильтре тщательно промывали смесью этилацетат/этанол/ТГФ (1:1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 182.0 мг (72% от теории) соединения L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.53 мин; МС (ESI положит.): m/z=346 [М+Н]⁺.

30.0 мг (0.07 ммоль) L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина и 34.3 мг (0.07 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида растворяли в 1.5 мл ДМФА и добавляли 6.8 мг (0.07 ммоль) 4-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 40.6 мг (82% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=744 [M+H]⁺.

Промежуточное соединение L42

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

50.0 мг (0.18 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L37) сначала загружали в ДМФА и добавляли 93.6 мг (0.18 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида и 36.9 мг (0.37 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 21.9 мг (0.37 ммоль) НОАс и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 20.6 мг (14% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.55 мин; МС (ESI положит.): m/z=673 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L43

N-[67-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-65-оксо-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-икосаокса-64-азагептагексаконтан-1-оил]-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитин

11.3 мг (0.04 ммоль) L-валил-N5-карбамоил-L-орнитина (Промежуточное соединение L37) сначала загружали в ДМФА и добавляли 50.0 мг (0.04 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{63-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-63-оксо-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-икосаоксатригексаконт-1-ил}пропанамида и 8.3 мг (0.08 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 4.9 мг (0.08 ммоль) НОАс и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 15.8 мг (20% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 4): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=1377 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L44

N-[19-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]-L-валил-L-аланин

73.3 мг (0.39 ммоль) L-валил-L-аланина растворяли в 7.0 мл ДМФА и добавляли 200.0 мг (0.39 ммоль) 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-N-{15-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-15-оксо-3,6,9,12-тетраоксапентадец-1-ил}пропанамида и 78.8 мг (0.78 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 103.3 мг (45% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.58 мин; МС (ESI положит.): m/z=587 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L45

трет-Бутил (2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутаноат

2.00 г (7.26 ммоль) трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-гомосерината растворяли в 90 мл дихлорметана и 1.76 мл пиридина и затем добавляли 4.62 г (10.90 ммоль) 1,1,1-триацетокси-1лямбда⁵,2-бензйодоксол-3(1Н)-она (периодинан Десса-Мартина). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч и затем разбавляли 200 мл дихлорметана и два раза экстрагировали раствором тиосульфата натрия 10% концентрации и затем последовательно два раза раствором лимонной кислоты 5% концентрации и два раза насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу отделяли, сушили над сульфатом натрия и затем концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли 100 мл диэтилового эфира и циклогексан (об./об. = 1:1), что приводило к образованию белого осадка. Осадок отфильтровывали с отсасыванием. Фильтрат концентрировали на роторном испарителе и сушили в высоком вакууме, получая 1.74 г (88% от теории) целевого соединения в виде светло-желтого масла.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.85 мин; МС (ESI положит.): m/z=274 [М+Н]⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H).

Промежуточное соединение L46

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]-L-глутаминат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания 200 мг (0.79 ммоль) соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) с 263 мг (0.87 ммоль) соединения (4S)-5-трет-бутокси-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановая кислота / трифторуксусная кислота (1:1) в присутствии EDC/HOBT и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 1 ч в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ. Лиофилизация из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 85 мг (20% от теории) указанного в заголовке соединения за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.37 мин; МС (ESI положит.): m/z=326 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L47

Трифторуксусная кислота / бета-аланил-L-аланил-N5-карбамоил-N-[4-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)фенил]-L-орнитинамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания Промежуточного соединения L8 с 2,5-диоксопирролидин-1-ил N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланинатом и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.36 мин; МС (ESI положит.): m/z=488 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L48

Трифторуксусная кислота / (1R,2S)-2-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты аналогично Промежуточному соединению L2.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.22 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L49

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N-(бромацетил)-L-валил-L-аланил-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания коммерчески доступного ангидрида бромуксусной кислоты с частично защищенным пептидом трет-бутил L-валил-L-аланил-N⁶-трет-бутоксикарбонил)-L-лизинатом, полученным в соответствии с классическими методами химии пептидов, в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в дихлорметане. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в трифторуксусной кислоте 10% концентрации в ДХМ при КТ, получая указанное в заголовке соединение с выходом 49% за 2 стадии.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.09 мин; МС (ESI положит.): m/z=593 и 595 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L50

Трифторуксусная кислота / (1S,3R)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1S,3R)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.2 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L51

Трифторуксусная кислота / (1R,3R)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,3R)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.98 мин; МС (ESI положит.): m/z=250 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L52

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-бромацетамид (1:1)

420 мг (2.62 ммоль) трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата вносили в 50 мл дихлорметана и добавляли 817 мг (3.15 ммоль) ангидрида бромуксусной кислоты и 913 мкл (5.24 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ.

Это приводило к получению 577 мг защищенного промежуточного соединения, которое затем вносили в 50 мл дихлорметана и добавляли 10 мл трифторуксусной кислоты. После 1 ч перемешивания при КТ, реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода. Это приводило к получению 705 мг (65% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=181 и 183 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L53

Трифторуксусная кислота / (1S,3S)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1S,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=0.19 мин;

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.88 мин; МС (ESI положит.): m/z=250 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L54

Трифторуксусная кислота / (1R,3S)-3-амино-N-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил]циклопентанкарбоксамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (1R,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислоты и также коммерчески доступного соединения трифторуксусная кислота / 1-(2-аминоэтил)-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1) путем сочетания с помощью HATU в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=252 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L55

Трифторуксусная кислота / трет-бутил N⁶-D-аланил-N²-{N-[6-2,5-оксо-(2,5-диоксо-1Н-пиррол-1-ил)-гексаноил]-L-валил-L-аланил}-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания Промежуточного соединения L6 с N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланином в присутствии HATU, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 90 минут в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.35 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.67 мин; МС (ESI положит.): m/z=637 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L56

Трифторуксусная кислота / трет-бутил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланил-N⁶-{[(1R,3S)-3-аминоциклопентил]карбонил}-L-лизинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали с помощью сначала сочетания Промежуточного соединения L6 с (1R,3S)-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]циклопентанкарбоновой кислотой в присутствии HATU, и затем снятия защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 15 минут в трифторуксусной кислоте 25% концентрации в ДХМ при КТ.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.4 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.7 мин; МС (ESI положит.): m/z=677 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L57

Метил (2S)-4-оксо-2-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутаноат

500.0 мг (2.72 ммоль) гидрохлорида метил L-аспарагината и 706.3 мг (2.72 ммоль) 2-(триметилсилил)этил 2,5-диоксопирролидин-1-карбоксилата сначала загружали в 5.0 мл 1,4-диоксана и добавляли 826.8 мг (8.17 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода, 0.1% ТФУ). Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 583.9 мг (74% от теории) соединения (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=290 (М-Н)^-.

592.9 мг (3S)-4-метокси-4-оксо-3-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}амино)бутановой кислоты сначала загружали в 10.0 мл 1,2-диметоксиэтана, смесь охлаждали до -15°С и добавляли 205.8 мг (2.04 ммоль) 4-метилморфолина и 277.9 мг (2.04 ммоль) изобутил хлорформиата. Спустя 15 мин осадок отфильтровывали с отсасыванием, и два раза с 1,2-диметоксиэтаном, в каждом случае с порциями по 10.0 мл. Фильтрат охлаждали до -10°С, и при энергичном перемешивании добавляли 115.5 мг (3.05 ммоль) борогидрида натрия, растворенного в 10 мл воды. Фазы разделяли и органическую фазу промывали, в каждом случае один раз, насыщенным раствором бикарбоната натрия и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 515.9 мг (91% от теории) соединения метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосерината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=278 (М+Н)⁺.

554.9 мг (2.00 ммоль) метил N-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-гомосерината сначала загружали в 30.0 мл дихлорметана и добавляли 1.27 г (3.0 ммоль) периодинана Десса-Мартина и 474.7 мг (6.00 ммоль) пиридина. Смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Спустя 4 ч реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали, в каждом случае три раза, раствором Na₂S₂O₃ 10% концентрации, раствором лимонной кислоты 10% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Это приводило к получению 565.7 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1H).

Промежуточное соединение L58

2-(Триметилсилил)этил (3-оксопропил)карбамат

434.4 мг (5.78 ммоль) 3-амино-1-пропанола и 1.50 г (5.78 ммоль) 2-(триметилсилил)этил 2,5-диоксопирролидин-1-карбоксилата растворяли в 10.0 мл дихлорметана, добавляли 585.3 мг (5.78 ммоль) триэтиламина и смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором бикарбоната натрия и затем сушили над сульфатом магния. Растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток - 2-(триметилсилил)этил (3-гидроксипропил)карбамат (996.4 мг, 79% от теории) сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

807.0 мг (3.68 ммоль) 2-(триметилсилил)этил (3-гидроксипропил)карбамата сначала загружали в 15.0 мл хлороформа и 15.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 102.2 мг (0.37 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 736.9 мг (5.52 ммоль) N-хлорсукцинимида и 57.5 мг (0.37 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза (890.3 мг).

Промежуточное соединение L59

Трифторуксусная кислота / 1-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-1Н-пиррол-2,5-дион (1:1)

300.0 мг (0.91 ммоль) трет-бутил (2-{2-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этокси]этокси}этил)карбамата сначала загружали в дихлорметан, добавляли 4.2 г (36.54 ммоль) ТФУ и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч (контроль осуществляли с помощью ТСХ: дихлорметан/метанол 10:1). Летучие компоненты упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли четыре раза совместно с дихлорметаном. Остаток сушили в высоком вакууме и использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.19 мин; МС (ESI положит.): m/z=229 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L60

6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил хлорид

200.0 мг (0.95 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты растворяли в 4.0 мл дихлорметана и добавляли 338.0 мг (2.84 ммоль) тионилхлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч, и затем добавляли 1 каплю ДМФА. Смесь перемешивали в течение еще 1 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток перегоняли три раза совместно с дихлорметаном. Сырой продукт использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L61

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-аланил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего трипептидное производное 2-(триметилсилил)этил L-валил-L-аланил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолиз, сочетание с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и еще один гидрогенолиз). Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого частично защищенного пептидного производного с коммерчески доступной 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Вслед за этим выполняли снятие защиты с аминогруппы в мягких условиях путем перемешивания в течение 2.5 часов в трифторуксусной кислоте 5% концентрации в ДХМ при КТ с сохранением сложноэфирной защитной группы. Обработка реакционной смеси и очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 438 мг указанного в заголовке соединения.

ВЭЖХ (Метод 11): R_t=1.69 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=610 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L62

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-карбамоил-L-орнитил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего 2-(триметилсилил)этил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов. 148 мг (0.43 ммоль) этого промежуточного соединения затем сочетали в присутствии 195 мг (0.51 ммоль) HATU и 149 мкл N,N-диизопропилэтиламина с 200 мг (0.43 ммоль) Промежуточного соединения L16. После концентрирования и очистки остатка с помощью препаративной ВЭЖХ, защищенное промежуточное соединение вносили в 20 мл ДХМ и трет-бутоксикарбонильную защитную группу удаляли путем добавления 2 мл трифторуксусной кислоты и 1 ч перемешивания при КТ. Концентрирование и лиофилизация остатка из смеси ацетонитрил/вода приводила к получению 254 мг (63% от теории за 2 стадии) продукта.

ВЭЖХ (Метод 11):R_t=1.51 мин;

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.68 мин; МС (ESI положит.): m/z=696 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L63

(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановая кислота

Прежде всего трипептидное производное (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-амино-3-метилбутаноил]амино}пропаноил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановую кислоту получали из (2S)-5-(бензилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты, сочетание с N-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланином в присутствии HATU и гидрогенолиз в метаноле над 10% палладием на активированном угле). Указанное в заголовке соединение получали путем сочетания этого частично защищенного пептидного производного с коммерчески доступным 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-дионом. Обработка реакционной смеси и очистка с помощью препаративной ВЭЖХ приводила к получению 601 мг указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.96 мин; МС (ESI положит.): m/z=611 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L64

(4S)-4-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}-5-оксо-5-[2-(триметилсилил)этокси]пентановая кислота

Указанное в заголовке соединение получали из (2S)-5-(бензилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилилэтанолом с использованием EDCI/DMAP, удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты, гидрогенолитическое расщепление сложного бензилового эфира в метаноле над 10% палладием на активированном угле и сочетание с 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в присутствии N,N-диизопропилэтиламином).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=385 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L65

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-L-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты. Это приводило к получению 373 мг (79% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.72 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L66

Метил (8S)-8-(2-гидроксиэтил)-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетрадекан-14-оат

1000 мг (2.84 ммоль) (3S)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты сначала загружали в 10.0 мл 1,2-диметоксиэтана и добавляли 344.4 мг (3.4 ммоль) 4-метилморфолина и 504 мг (3.69 ммоль) изобутил хлорформиата. После 10 мин перемешивания при КТ, реакционную смесь охлаждали до 5°С и при энергичном перемешивании небольшими порциями добавляли 161 мг (4.26 ммоль) борогидрида натрия, растворенного в 3 мл воды. Спустя 1 час такое же количество борогидрида натрия добавляли снова и реакционную смесь затем медленно нагревали до КТ. Добавляли 170 мл воды и реакционную смесь затем четыре раза экстрагировали этилацетатом, в каждом случае порциями по 200 мл. Фазы разделяли и органическую фазу один раз промывали лимонной кислотой и затем насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 760 мг (78% от теории) соединения бензил трет-бутил [(2S)-4-гидроксибутан-1,2-диил]бискарбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.84 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

760 мг (2.16 ммоль) этого промежуточного соединения, растворенного в 13 мл хлороводорода в диоксане, перемешивали при КТ в течение 20 мин. Реакционную смесь затем концентрировали до 5 мл и добавляли диэтиловый эфир. Осадок отфильтровывали и лиофилизировали из смеси ацетонитрил/вода 1:1.

Полученный таким путем продукт растворяли в 132 мл ДМФА и добавляли 345.5 мг (2.35 ммоль) 4-метокси-4-оксобутановой кислоты, 970 мг (2.55 ммоль) HATU и 1025 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Смесь перемешивали при КТ в течение 5 мин. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Соответствующие фракции объединяли и ацетонитрил упаривали при пониженном давлении. Водную фазу, которая осталась, два раза экстрагировали этилацетатом, и органическую фазу затем концентрировали и сушили в высоком вакууме.

Полученное таким путем промежуточное соединение вносили в метанол и гидрировали над 10% палладием на активированном угле при КТ и стандартном давлении водорода в течение 1 ч. Затем катализатор отфильтровывали и растворитель удаляли при пониженном давлении.

247 мг этого соединение со снятой защитой вносили в 20 мл ДМФА и добавляли 352 мг (1.36 ммоль) 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-диона и 592 мкл N,N-диизопропилэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и затем концентрировали, и остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Растворители затем упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению, в ходе этих 5 стадий синтеза, 218 мг указанного в заголовке соединения с общим выходом 21%.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=363 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L67

Трифторуксусная кислота / 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)этил-бета-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 50 мг (0.354 ммоль) коммерчески доступного 1-(2-гидроксиэтил)-1Н-пиррол-2,5-диона путем сочетания с 134 мг (0.71 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина в 10 мл дихлорметана в присутствии 1.5 эквивалентов EDCI и 0.1 эквивалента 4-N,N-диметиламинопиридина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

Выход: 56 мг (48% от теории за 2 стадии)

ЖХ-МС (Метод 3): R_t=1.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=213 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L68

Трифторуксусная кислота / N-(2-аминоэтил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропанамид (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали аналогично Промежуточному соединению L1 в соответствии с классическими методами химии пептидов из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)пропановой кислоты и трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=212 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L69

Трифторуксусная кислота / 1-[(бензилокси)карбонил]пиперидин-4-ил-L-валил-N5-карбамоил-L-орнитинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали классическими методами химии пептидов из коммерчески доступного бензил 4-гидроксипиперидин-1-карбоксилата путем этерификации N2-(трет-бутоксикарбонил)-N5-карбамоил-L-орнитином с использованием EDCI/DMAP, последующего удаления Boc с помощью ТФУ, следующего за этим сочетания с N-[(трет-бутокси)карбонил]-L-валином в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение еще одного удаления Вое с помощью ТФУ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.62 мин; МС (ESI положит.): m/z=492 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L70

9Н-Флуорен-9-илметил (3-оксопропил)карбамат

1000.0 мг (3.36 ммоль) 9Н-флуорен-9-илметил (3-гидроксипропил)карбамата сначала загружали в 15.0 мл хлороформа и 15.0 мл смеси 0.05 н. раствор карбоната калия/0.05 н. раствор бикарбоната натрия (1:1). Затем добавляли 93.5 мг (0.34 ммоль) хлорида тетра-н-бутиламмония, 673.6 мг (5.04 ммоль) N-хлорсукцинимида и 52.5 мг (0.34 ммоль) TEMPO и реакционную смесь энергично перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и органическую фазу промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток сушили в высоком вакууме и очищали на силикагеле (подвижная фаза: циклогексан/этилацетат 3:1-1:1). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 589.4 мг (58% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 6): R_t=2.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=296 (М-Н)⁺.

Промежуточное соединение L71

трет-Бутил [4-(хлоркарбонил)фенил]карбамат

100.0 мг (0.42 ммоль) 4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бензойной кислоты сначала загружали в 2.0 мл дихлорметана и добавляли 64.2 мг (0.51 ммоль) оксалилдихлорида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 мин (контроль осуществляли с помощью ТСХ: дихлорметан/метанол). Затем добавляли еще 192.6 мг (1.53 ммоль) оксалилдихлорида и 1 каплю ДМФА и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток несколько раз перегоняли совместно с дихлорметаном. Остаток использовали без дополнительной очистки на следующей стадии синтеза.

Промежуточное соединение L72

Бензил (9S)-9-(гидроксиметил)-2,2-диметил-6,11-диоксо-5-окса-7,10-диаза-2-силатетоадекан-14-оат

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного бензил трет-бутил [(2S)-3-гидроксипропан-1,2-диил]бискарбамата в соответствии с классическими методами химии пептидов путем гидрогенолитического удаления защитной группы Z, последующего сочетания с 4-(бензилокси)-4-оксобутановой кислотой в присутствии EDCI/HOBT, следующего за этим удаления Boc защитной группы с помощью ТФУ, и в заключение реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в присутствии триэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.94 мин; МС (ESI положит.): m/z=425 [М+Н]⁺.

Промежуточное соединение L73

N-(2-Аминоэтил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид

395.5 мг (1.87 ммоль) 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексановой кислоты, 1.21 г (9.36 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина и 854.3 мг (2.25 ммоль) HATU добавляли к раствору 300 мг (1.87 ммоль) трет-бутил (2-аминоэтил)карбамата в 20 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 5 минут. После концентрирования смеси, остаток вносили в ДХМ и промывали водой. Органическую фазу промывали солевым раствором, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Это приводило к получению 408 мг (33%, чистота 53%) указанного в заголовке соединения, которое использовали без дополнительной очистки.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=354 (М+Н)⁺.

1 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил (2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этил)карбамата (408 мг, 0.365 ммоль) в 7 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 0.5 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток перегоняли два раза совместно с дихлорметаном. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 384 мг (94%, чистота 57%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.26 мин; МС (ESI положит.): m/z=254 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L74

3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-Диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропановая кислота

107 мг (0.335 ммоль) трет-бутил 3-[2-[2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этокси]этокси]пропаноата и 93 мг (0.369 ммоль) (2,5-диоксопирролидин-1-ил) 2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетата растворяли в 5 мл диметилформамида и добавляли 0.074 мл (0.671 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 133 мг (86%, чистота 100%) трет-бутил 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=459 (М+Н)⁺.

0.5 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-диоксопиррол-1-ил)ацетил]амино]этокси]этокси]этокси]этокси]пропаноата (130 мг, 0.284 ммоль) в 5 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 102 мг (90%, чистота 100%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.52 мин; МС (ESI положит.): m/z=402 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L75

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-D-аланинат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланина в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и удаление Boc защитной группы с помощью трифторуксусной кислоты). Это приводило к получению 405 мг (58% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1); R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L76

(2S)-2-Бром-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановая кислота

Прежде всего соответствующим образом защищенное производное аспарагиновой кислоты получали из (3S)-4-(бензилокси)-3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-4-оксобутановой кислоты в соответствии с классическими методами химии пептидов (этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP и гидрогенолитическое удаление защитной группы Z и расщепление сложного бензилового эфира).

470 мг (1.8 ммоль) полученной таким путем (2S)-2-амино-4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановой кислоты суспендировали в 10 мл воды и добавляли 1.8 мл 1 молярной хлористоводородной кислоты и 0.5 мл концентрированной серной кислоты, с последующим добавлением 863 мг (7.25 ммоль) бромида калия. Затем при 10°С по каплям добавляли раствор 150 мг (2.175 ммоль) нитрита натрия в 1 мл воды в течение периода 30 мин, и смесь перемешивали при 10-15°С в течение 2 ч. Смесь затем экстрагировали 50 мл этилацетата. Органическую фазу промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния. Осуществление упаривания растворителя и очистки продукта с помощью препаративной ВЭЖХ приводило к получению 260 мг (48% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=1.03 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=295 и 297 (М-Н)^-.

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃): δ [м.д.]=0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 и 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).

Промежуточное соединение L77

Трифторуксусная кислота / N-[2-(2-аминоэтокси)этил]-2-бромацетамид (1:1)

418 мг (2.05 ммоль) трет-бутил [2-(2-аминоэтокси)этил]карбамата сначала подвергали реакции с 638 мг (2.46 ммоль) ангидрида бромуксусной кислоты и Boc защитную группу затем удаляли трифторуксусной кислотой. Это приводило к получению 551 мг (63% от теории за 2 стадии) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод): R_t=0.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=227 и 225 (M+H)⁺.

Промежуточное соединение L78

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-бета-аланин

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты путем сочетания с гидрохлоридом трет-бутил бета-аланината (1:1) в присутствии EDCI/HOBt и N,N-диизопропилэтиламина и последующего снятия защиты с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.32 мин; МС (ESI положит.): m/z=227 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L79

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланин

64.8 мг (0.357 ммоль) гидрохлорида трет-бутил бета-аланината (1:1) и 100 мг (0.324 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4 мл диметилформамида и добавляли 65.6 мг (0.649 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 84.5 мг (77%, чистота 100%) трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланината.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=339 (М+Н)⁺.

1.62 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-бета-аланината (82.8 мг, 0.244 ммоль) в 8 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 62.7 мг (87%, чистота 95%) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.75 мин; МС (ESI положит.): m/z=283 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L80

2-(Триметилсилил)этил 3-[(15-амино-4,7,10,13-тетраоксапентадекан-1-оил)амино]-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланинат

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступного соединения 3-{[(бензилокси)карбонил]амино}-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланин / N-циклогексилциклогексанамин (1:1) в соответствии с классическими методами химии пептидов (высвобождение из соли и этерификация 2-(триметилсилил)этанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолитическое удаление защитной группы Z, сочетание с коммерчески доступной 3-оксо-1-фенил-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19-овой кислотой в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и еще одно гидрогенолитическое удаление защитной группы Z).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.70 мин; МС (ESI положит.): m/z=552 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L81

Трифторуксусная кислота / бензил {2-[(2-аминоэтил)сульфонил]этил}карбамат (1:1)

250 мг (1.11 ммоль) 2,2'-сульфонилдиэтанамина сочетали с 92.3 мг (0.37 ммоль) 1-{[(бензилокси)карбонил]окси}пирролидин-2,5-диона в присутствии N,N-диизопропилэтиламина в ДМФА. Последующая очистка с помощью ВЭЖХ приводила к получению 70 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=0.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=257.11 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L82

Трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

88.6 мг (0.357 ммоль) N-Вос-2,2'-(этилендиокси)диэтиламина и 100 мг (0.324 ммоль) N-сукцинимидил 6-малеимидогексаноата растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.071 мл (0.650 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.048 мл (0.838 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 75 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 127 мг (81% от теории) трет-бутил {2-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.78 мин; МС (ESI положит.): m/z=442 (М+Н)⁺.

2.0 мл ТФУ добавляли к раствору 123 мг (225 мкмоль) трет-бутил {2-[2-(2-{[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата в 7.5 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 111 мг (100% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.31 мин; МС (ESI положит.): m/z=342 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.17 (m, 2Н), 1.47 (m, 4Н), 2.04 (m, 2Н), 2.98 (m, 2Н), 3.19 (m, 2Н), 3.39 (m, 4Н), 3,56 (m, 6Н), 7.01 (s, 2Н), 7.72 (bs, 3Н), 7.80 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L83

Трифторуксусная кислота / N-{2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

200 мг (0.805 ммоль) трет-бутил {2-[2-(2-аминоэтокси)этокси]этил}карбамата, 150 мг (0.966 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и 560 мкл (3.2 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина растворяли в 10 мл диметилформамида и добавляли 459 мг (1.21 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в дихлорметане. Органическую фазу два раза промывали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, дихлорметан : метанол 98:2). Это приводило к получению 276 мг (89% от теории) трет-бутил (2-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.67 мин; МС (ESI положит.): m/z=386 (М+Н)⁺.

4 мл ТФУ добавляли к раствору трет-бутил {2-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]этил}карбамата (275 мг, 714 мкмоль) в 15 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 30 минут. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 281 мг (99% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=286 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L84

Трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексанамид (1:1)

200 мг (0.594 ммоль) трет-бутил (14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)карбамата и 202 мг (0.654 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.130 мл (1.2 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Добавляли 0.085 мл (1.5 ммоль) уксусной кислоты и реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 275 мг (73% от теории) трет-бутил [21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагеникоз-1-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.81 мин; МС (ESI положит.): m/z=530 (М+Н)⁺.

780 мкл (10 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил [21-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагеникоз-1-ил]карбамата (268 мг, 505 мкмоль) в 5.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 266 мг (97% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.46 мин; МС (ESI положит.): m/z=430 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.17 (m, 2Н), 1.47 (m, 4Н), 2.03 (m, 2Н), 2.99 (m, 2Н), 3.18 (m, 2Н), 3.38 (m, 4Н), 3,52 (m, 8Н), 3,58 (m, 6Н), 7.01 (s, 2Н), 7.73 (bs, 3Н), 7.80 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L85

Трифторуксусная кислота / N-(14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)-2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетамид (1:1)

200 мг (0.594 ммоль) трет-бутил (14-амино-3,6,9,12-тетраоксатетрадец-1-ил)карбамата, 111 мг (0.713 ммоль) (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты и 410 мкл (2.4 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина растворяли в 6 мл диметилформамида и добавляли 339 мг (0.892 ммоль) HATU. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч и незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 130 мг (43% от теории) трет-бутил [17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагептадец-1-ил]карбамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=474 (М+Н)⁺.

410 мкл (5.3 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил [17-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-16-оксо-3,6,9,12-тетраокса-15-азагептадец-1-ил]карбамата (126 мг, 267 мкмоль) в 4.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 124 мг (95% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 13): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=374 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=2.99 (m, 2Н), 3.22 (m, 2Н), 3.41 (m, 2Н), 3,53 (m, 8Н), 3,58 (m, 6Н), 4.02 (s, 2Н), 7.09 (s, 2Н), 7.73 (bs, 3Н), 8.21 (m, 1Н).

Промежуточное соединение L86

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланин

100 мг (0.531 ммоль) L-валил-L-аланина и 134 мг (0.531 ммоль) 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 3 мл диметилформамида и добавляли 0.150 мл (1.1 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 8 ч. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 71.5 мг (41% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.42 мин; МС (ESI положит.): m/z=326 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L87

3-[2-(2-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропановая кислота

250 мг (1.07 ммоль) трет-бутил 3-[2-(2-аминоэтокси)этокси]пропаноата, 151 мг (0.974 ммоль) 2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислоты, 224 мг (1.46 ммоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 224 мг (1.17 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида растворяли в 5.0 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли этилацетат и смесь два раза экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния, и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×40; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 267 мг (64% от теории) трет-бутил 3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.73 мин; МС (ESI положит.): m/z=371 (М+Н)⁺.

1.1 мл (14 ммоль) ТФУ добавляли к раствору трет-бутил 3-[2-(2-{[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этокси)этокси]пропаноата (263 мг, 710 мкмоль) в 10 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 240 мг (94% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=0.57 мин; МС (ESI положит.): m/z=315 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L88

2,5-Диоксопирролидин-1-ил N[-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланинат

150 мг (0.797 ммоль) L-валил-L-аланина и 246 мг (0.797 ммоль) 1-{6-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-6-оксогексил}-1Н-пиррол-2,5-диона растворяли в 4.0 мл диметилформамида и добавляли 0.220 мл (1.6 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь незамедлительно очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 250×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 302 мг (97% от теории) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланина.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.02 мин; МС (ESI положит.): m/z=382 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=0.82 (dd, 6Н), 1.17 (m, 2Н), 1.27 (d, 3Н), 1.48 (m, 4Н), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2Н), 3.38 (t, 2Н), 4.17 (m, 2Н), 7.00 (s, 2Н), 7.75 (d, 1Н), 8.19 (d, 1Н).

130 мг (0.531 ммоль) N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-L-аланина растворяли в 6.5 мл дихлорметана и добавляли 58.8 мг (0.511 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона и 78.4 мг (0.409 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида. Добавляли еще 58.8 мг (0.511 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона и 78.4 мг (0.409 ммоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида. Добавляли дихлорметан и смесь три раза промывали водой. Органическую фазу сушили над сульфатом магния, растворитель упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 172 мг (87% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.28 мин; МС (ESI положит.): m/z=479 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L89

Гидрохлорид 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-L-глутамата (1:1)

1.00 г (2.96 ммоль) (4S)-5-(бензилокси)-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановой кислоты сначала загружали в 13.0 мл ТГФ и добавляли 510 мкл (3.6 ммоль) 2-(триметилсилил)этанола и 109 мг (889 мкмоль) 4-диметиламинопиридина. Реакционную смесь охлаждали до 0°С и добавляли 682 мг (3.56 ммоль) гидрохлорида N-этил-N'-3-(диметиламинопропил)карбодиимида. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток растворяли в этилацетате. Органическую фазу два раза промывали 0.1 н. раствором HCl и насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали, используя Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, циклогексан : этилацетат 80:20). Это приводило к получению 649 мг (50% от теории) соединения 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=4.6 мин; МС (ESI положит.): m/z=438 (М+Н)⁺.

649 мг (1.48 ммоль) 1-бензил-5-[2-(триметилсилил)этил]-N-(трет-бутоксикарбонил)-L-глутамата растворяли в 7.0 мл диоксана и, при охлаждении на бане со льдом, добавляли 14 мл (59 ммоль) 4 н. HCl в диоксане. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме и очищали с помощью Biotage Isolera (силикагель, колонка 25 г SNAP, дихлорметан : метанол 90:10). Это приводило к получению 320 мг (57% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=338 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L90

1-({N-[(Бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-овая кислота

118 мг (566 мкмоль) N-[(бензилокси)карбонил]глицина сначала загружали в 5.0 мл ДМФА, добавляли 200 мг (622 мкмоль) трет-бутил 1-амино-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата, 130 мг (849 мкмоль) 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрата и 130 мг (679 мкмоль) гидрохлорида 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида и смесь перемешивали при КТ в течение 1 ч. Добавляли этилацетат и смесь два раза экстрагировали раствором лимонной кислоты 5% концентрации и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу два раза промывали насыщенным раствором хлорида натрия и сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 274 мг (95% от теории) трет-бутил 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата.

ЖХ-МС (Метод 12): Rt=1.69 мин; МС (ESI положит.): m/z=513 (М+Н)⁺.

820 мкл (11 ммоль) ТФУ добавляли к раствору 274 мг (535 мкмоль) трет-бутил 1-({N-[(бензилокси)карбонил]глицил}амино)-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оата в 5.0 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Это приводило к получению 262 мг (100% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.12 мин; МС (ESI положит.): m/z=457 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L91

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил 1-{[3-амино-N-(трет-бутоксикарбонил)-D-аланил]амино}-3,6,9,12-тетраоксапентадекан-15-оат (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали из коммерчески доступной 3-оксо-1-фенил-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19-овой кислоты классическими методами химии пептидов (этерификация 2-триметилсилилэтанолом с использованием EDCI/DMAP, гидрогенолитическое удаление защитной группы Z, сочетание с коммерчески доступным N-(трет-бутоксикарбонил)-3-{[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]амино}-D-аланином и удаление Fmoc защитной группы).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.74 мин; МС (ESI положит.): m/z=552 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L92

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом и последующего снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.5 мин; МС (ESI положит.): m/z=409 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L93

N-Ацетил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом, последующего снятия защиты - защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол над 10% палладием на активированном угле, и последующего ацилирования уксусной кислотой в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и в заключение снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.16 мин; МС (ESI положит.): m/z=317 (М+Н)⁺.

¹Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=1.19 (2d, 6Н), 1.82 (s, 3Н), 2.5 (m, 2Н), 4.26 (m, 2Н), 4.48 (q, 1Н), 6.9 (s, 1Н), 7.36 (s, 1Н), 8.0 (m, 3Н), 12.54 (s, 1Н).

Промежуточное соединение L94

N-{4-Оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутаноил}-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Прежде всего, 4-оксо-4-[2-(триметилсилил)этокси]бутановую кислоту получали по реакции 4-(бензилокси)-4-оксобутановой кислоты с 2-(триметилсилил)этанолом в присутствии EDCI/DMAP в ДХМ с последующим гидрогенолитическим расщеплением сложного бензилового эфира.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.89 мин; МС (ESI положит.): m/z=217 (М-Н)^-.

Кроме того, соединение трифторуксусная кислота / 4-нитробензил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагинат (1:1) получали путем сочетания N-(трет-бутоксикарбонил)-L-аланил-L-аланина с гидробромидом 4-нитробензил L-аспарагината (1:1) в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина, и затем снятия защиты с аминогруппы с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=410 (М+Н)⁺.

Указанное в заголовке соединение затем получали путем сочетания этих двух промежуточных соединений в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и затем снятия защиты - расщепления сложного n-нитробензилового эфира путем гидрирования в смеси ДХМ-метанол 1:9 над 10% палладием на активированном угле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.79 мин; МС (ESI положит.): m/z=475 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L95

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланин

Это промежуточное соединение получали исходя из N-[(бензилокси)карбонил]-L-валина и гидрохлорида трет-бутил L-аланината (1:1) общепринятыми методами химии пептидов.

ЖХ-МС (Метод 12): R_t=1.34 мин; МС (ESI положит.): m/z=323.16 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L96

N-Ацетил-L-валил-N⁵-карбамоил-L-орнитинамид

Это промежуточное соединение получали общепринятыми методами химии пептидов, начиная с сочетания 2,5-диоксопирролидин-1-ил-N-[(бензилокси)карбонил]-L-валината с N⁵-карбамоил-L-орнитином с последующим гидрогенолитическим отщеплением защитной группы Z над 10% палладием на активированном угле в этаноле и в заключение реакцией полученного дипептида с 1-ацетоксипирролидин-2,5-дионом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.25 мин; МС (ESI положит.): m/z=317 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L97

1-(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-овая кислота

трет-Бутил 1-амино-3,6,9,12,15,18,21,24-октаоксагептакозан-27-оат (100 мг, 201 мкмоль) сначала загружали в 1.0 мл ДМФА и добавляли (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусную кислоту (46.8 мг, 301 мкмоль), 1-гидрокси-1Н-бензотриазолгидрат (76.9 мг, 502 мкмоль) и гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (77.0 мг, 402 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение ночи, и затем добавляли этилацетат. Органическую фазу два раза промывали 5% раствором лимонной кислоты, насыщенным раствором гидрокарбоната натрия и один раз насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушили над сульфатом магния. Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ (колонка: Reprosil 125×30; 10 мк, скорость потока: 50 мл/мин, смесь MeCN/вода/0.1% ТФУ). Растворители упаривали при пониженном давлении и остаток сушили в высоком вакууме. Это приводило к получению 19.1 мг (13% от теории) трет-бутил 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-оата.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=635 [М+Н]⁺.

К раствору трет-бутил 1-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)-2-оксо-6,9,12,15,18,21,24,27-октаокса-3-азатриаконтан-30-оата (19.1 мг, 30.1 мкмоль) в 1.0 мл ДХМ добавляли ТФУ (62 мкл, 600 мкмоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток вносили в воду и лиофилизировали. Остаток использовали далее без дополнительной очистки. Это приводило к получению 10.8 мг (46% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.55 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=577 [М-Н]^-.

Промежуточное соединение L98

2,2-Диметилпропановая кислота / 2-(триметилсилил)этил N-(2-аминоэтил)-N²-{[2-(триметилсилил) этокси]карбонил}-L-глутаминат (1:1)

Прежде всего (4S)-5-трет-бутокси-4-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-5-оксопентановую кислоту сочетали в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с бензил (2-аминоэтил)карбаматом. Затем, с помощью трифторуксусной кислоты в ДХМ отщепляли Вое защитную группу и расщепляли сложный трет-бутиловый эфир. Затем, первую аминогруппу повторно защищали по реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, и затем карбоксильную группу - по реакции с 2-(триметилсилил)этанолом в ДХМ в присутствии EDCI/DMAP. На последней стадии снимали защиту с концевой аминогруппы с помощью гидрогенолиза над 10% палладием на активированном угле в этаноле при нормальном давлении. После удаления катализатора путем фильтрования, концентрирования, очистки с помощью препаративной ВЭЖХ и лиофилизации остатка из смеси ацетонитрил/вода получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.82 мин; МС (ESI положит.): m/z=434 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L99

Трифторуксусная кислота / 2-(триметилсилил)этил N-[(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-валил-L-аланил-бета-аланил-L-лизинат (1:1)

Прежде всего, 2-(триметилсилил)этил N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинат получали из N2-[(бензилокси)карбонил]-N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина в соответствии с классическими методами химии пептидов. Это промежуточное соединение затем сочетали в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с трипептидной единицей N[-[(бензилокси)карбонил]-L-валил-L-аланил-бета-аланином, полученным с помощью стандартных методов. Защитную группу Z затем удаляли с помощью гидрогенолиза в метаноле и полученное промежуточное соединение сочетали с (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)уксусной кислотой в присутствии HATU и N,N диизопропилэтиламина. На последней стадии с аминогруппы боковой цепи снимали защиту в мягких условиях путем перемешивания в 10% трифторуксусной кислоте в ДМФА при КТ в течение 1 ч. После концентрирования и лиофилизации из смеси ацетонитрил/вода получали указанное в заголовке соединение.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.64 мин; МС (ESI положит.): m/z=625 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L100

3-[5-(2-{[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]амино}этил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановая кислота

К раствору метил 3-цианопропаноата (4 г, 35.4 ммоль) в 120 мл этанола добавляли 3.69 г (53 ммоль) гидрохлорида гидроксиламина и 15 мл (110 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Смесь концентрировали и остаток растворяли в этилацетате и затем промывали водой и солевым раствором. Органическую фазу сушили над сульфатом магния и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 5 г (97% от теории) метил (4Z)-4-амино-4-(гидроксиимино)бутаноата.

К раствору метил (4Z)-4-амино-4-(гидроксиимино)бутаноата (4.85 г, 33.19 ммоль) в 120.0 мл диоксана добавляли 6.91 г (36.50 ммоль) N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланина и 8.22 г (39.82 ммоль) 1,3-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь концентрировали и остаток растворяли в воде и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью флэш-хроматографии. Это приводило к получению 6.0 г (57% от теории) метил (4E)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата.

Раствор метил (4Е)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата (6.0 г, 18.9 ммоль) в 100 мл ДМФА перемешивали при 120°С в течение 5 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 4 г (71% от теории) метил 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропаноата.

К раствору метил (4Е)-4-{[N-(трет-бутоксикарбонил)-бета-аланил]амино}-4-(гидроксиимино)бутаноата (4.00 г, 13.4 ммоль) в 60 мл ТГФ добавляли раствор LiOH (1.60 г, 66.8 ммоль) в 10 мл воды. Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. К смеси примешивали воду и экстрагировали этилацетатом. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 3.60 г (87% от теории) 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропановой кислоты.

К раствору 3-(5-{2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этил}-1,2,4-оксадиазол-3-ил)пропановой кислоты (2.0 г, 7.01 ммоль) в 30 мл дихлорметана добавляли 2.0 мл (26 ммоль) трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток использовали без дополнительной очистки. Это приводило к получению 1.50 г (72% от теории) соединения 3-[5-(2-аминоэтил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановая кислота/трифторуксусная кислота (1:1).

К раствору 3-[5-(2-аминоэтил)-1,2,4-оксадиазол-3-ил]пропановой кислоты (1.5 г, 5.01 ммоль) в 25 мл ДМФА добавляли 1.30 г (5.52 ммоль) 1-[2-(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2-оксоэтил]-1Н-пиррол-2,5-диона и 1.52 г (15.04 ммоль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. К смеси примешивали воду и экстрагировали дихлорметаном. Органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Остаток очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Это приводило к получению 774 мг (47% от теории) указанного в заголовке соединения.

¹Н-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆): δ [м.д.]=2.67 (t, 2Н), 2.91 (t, 2Н), 3.03 (t, 2Н), 3.46 (q, 2Н), 4.28 (s, 2Н), 7.01 (s, 2Н), 8.37 (t, 1Н), 12.28 (bs, 1Н).

Промежуточное соединение L101

трет-Бутил L-аланил-L-аланил-L-аспарагинат

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания в присутствии N,N-диизопропилэтиламина коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с гидрохлоридом трет-бутил L-аспарагината с последующим гидрогенолитическим отщеплением защитной группы Z над 10% палладием на активированном угле в метаноле.

ЖХ-МС (Метод 7): R_t=0.23 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=329 (М-Н)^-.

Промежуточное соединение L102

N-(38-Оксо-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-ил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

215 мг 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксаоктатриаконтан-38-овой кислоты (365 мкмоль) и 133 мг Промежуточного соединения L101 (402 мкмоль) сначала загружали в 1.4 мл ДМФА, добавляли 146 мг HATU (384 мкмоль) и 160 мкл N,N-диизопропилэтиламина (910 мкмоль) и смесь перемешивали при КТ в течение 3 ч. Добавляли воду (1.5 мл) и ACN (0.5 мл). Реакционный раствор очищали с помощью препаративной ВЭЖХ (подвижная фаза: ACN/вода + 0.1% ТФУ, градиент = 1:9→3:2) с последующим отщеплением бутоксикарбонильной защитной группы с помощью 2 мл ТФУ в 2 мл ДХМ (путем перемешивания при КТ в течение 3 ч).

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.56 мин; МС (ESI отрицат.): m/z=844.5 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L103

Трифторацетат N-(пиридин-4-илацетил)-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов начиная с сочетания 4-пиридинуксусной кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина с последующим снятием защиты с помощью трифторуксусной кислоты, сочетанием с трет-бутил L-аспарагинатом и последующим снятием защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.15 мин; МС (ESI положит.): m/z=394 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L104

Трифторацетат N-изоникотиноил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагина (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали по аналогии с промежуточным соединением L103, начиная с сочетания изоникотиновой кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=380 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L105

Трифторацетат трет-бутил N-{[2-(2-метоксиэтокси)этокси]ацетил}-L-аланил-L-аланил-L-аспарагината (1:1)

Указанное в заголовке соединение получали по аналогии с промежуточным соединением L103, начиная с сочетания [2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусной кислоты с коммерчески доступным трет-бутил L-аланил-L-аланинатом.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.17 мин; МС (ESI положит.): m/z=380 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L106

N-[(Бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с 1-трет-бутил 4-[2-(триметилсилил)этил]-L-аспартатом в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Эту аминокислотную единицу получали из (3S)-4-трет-бутокси-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутановой кислоты путем этерификации 2-(триметилсилил)этанолом в присутствии EDCI и DMAP и последующего мягкого удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы с помощью 5% трифторуксусной кислоты в ДХМ. Затем, 745 мг (1.317 ммоль) полностью защищенного промежуточного соединения растворяли в 43.5 мл ДХМ и сложный трет-бутиловый эфир мягко гидролизовали путем добавления 3.5 мл трифторуксусной кислоты и перемешивания при КТ в течение 5 часов. Из полученной смеси продуктов после очистки с помощью препаративной ВЭЖХ выделяли 168 мг (25% от теории) указанного в заголовке соединения.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.95 мин; МС (ESI положит.): m/z=510 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L107

N-[(2,5-Диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)ацетил]-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания коммерчески доступного N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина с трет-бутил L-аспарагинатом в присутствии N,N-диизопропилэтиламина, последующего снятия защиты - защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол над 10% палладием на активированном угле, и последующего ацилирования 1-{2-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-2-оксоэтил}-1Н-пиррол-2,5-дионом в ДМФА в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и в заключение снятия защиты карбоксильной группы с помощью трифторуксусной кислоты.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.35 мин; МС (ESI положит.): m/z=412 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L108

N²-Ацетил-N-(2-аминоэтил)-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизинамид

Указанное в заголовке соединение получали общепринятыми методами химии пептидов путем HATU сочетания коммерчески доступного N²-ацетил-N⁶-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизина с гидрохлоридом бензил (2-аминоэтил)карбамата (1:1) в присутствии N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z путем гидрирования в смеси ДХМ/метанол 1:1 над 10% палладием на активированном угле.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.43 мин; МС (ESI положит.): m/z=331 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L109

N²-Ацетил-N⁶-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизин

Это промежуточное соединение получали по реакции коммерчески доступного N²-ацетил-L-лизина с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода 1:1 в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.87 мин; МС (ESI положит.): m/z=333 (М+Н)⁺.

Промежуточное соединение L110

N²-Ацетил-N⁶-{[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}-L-лизил-L-аланил-L-аланил-L-аспарагин

Синтез указанного в заголовке соединения начинали с сочетания N-[(бензилокси)карбонил]-L-аланил-L-аланина и трет-бутил L-аспарагината в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина и последующего отщепления защитной группы Z с помощью гидрирования над 10% палладием на активированном угле в метаноле при нормальном давлении. Затем, промежуточное соединение со снятой защитой сочетали с Промежуточным соединением L109 в ДМФА в присутствии HATU и N,N-диизопропилэтиламина. Вслед за этим выполняли полное снятие защиты путем перемешивания в 7.5% растворе трифторуксусной кислоты в ДХМ в течение 1 ч. На последней стадии указанное в заголовке соединение получали путем повторной защиты свободной аминогруппы по реакции с 1-({[2-(триметилсилил)этокси]карбонил}окси)пирролидин-2,5-дионом в смеси ДМФА/вода 1:1 в присутствии N,N-диизопропилэтиламина.

ЖХ-МС (Метод 1): R_t=0.71 мин; МС (ESI положит.): m/z=589 (М+Н)⁺.