КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА К B7-H4 И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K47/68 A61K39/00 A61P35/00 C07K16/18 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области биомедицины. В частности, настоящее изобретение относится к конъюгату антитела к В7-Н4 и лекарственного средства и его медицинское применение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунотерапия опухолей представляет собой многолетнюю проблемную точку исследований и разработок в области терапии опухолей, и иммунотерапия опухолей Т-клетками занимает центральное место. Уклонение опухоли от иммунологического ответа представляет собой огромное препятствие для иммунотерапии опухолей. Большинство опухолей экспрессируют антигены, в разной степени распознающиеся иммунной системой хозяина. Однако во многих случаях неэффективная активация эффекторных Т-клеток запускает недостаточный иммунный ответ, и, таким образом, опухолевые клетки способствуют росту опухоли за счет своего ингибирующего воздействия на иммунную систему. Иммунотерапия опухолей заключается в применении в полном объеме и мобилизации киллерных Т-клеток и/или других иммунных клеток у пациентов с опухолью для уничтожения опухоли.

Исследования рецептора CD28 и его лигандов привели к характеристике молекул, названных суперсемейством В7. Члены семейства В7 представляют собой класс иммуноглобулинов с иммуноглобулин-подобными V-доменами (IgV) и иммуноглобулин-подобными С-доменами (IgC). В его состав входят костимулирующие факторы В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86), лиганд индуцибельного костимулирующего фактора (ICOS-L/B7-Н2), лиганд программируемой смерти-1 (PD-L1/B7-H1), лиганд программируемой смерти-2 (PD-L2/B7-DC), В7-Н3 и В7-Н4 и т.п.

Человеческий В7-Н4 представляет собой трансмембранный белок типа I, состоящий из 282 аминокислот. Его кодирующий ген расположен в области p11.1 хромосомы 1 (Choi IH et al., J Immunol. 2003 Nov 1; 171 (9): 4650-4). B7-H4 оказывает негативное регулирующее действие на иммунный ответ Т-клеток. В7-Н4 играет большую ингибирующую роль в дифференцировке и развитии, прогрессировании клеточного цикла и продукции цитокинов CD4+ и CD8+ Т-клеток (Sica GL et al., Immunity. 2003 Jun; 18(6): 849-61). У мышей с нокаутом В7-Н4 не обнаружено нарушений иммунных клеток или аутоиммунных явлений (Zhu G et al., Blood. 2009 Feb 19; 113(8): 1759-67; Suh WK et al., Blood. Mol Cell Biol. 2006 Sep; 26(17): 6403-11). В настоящее время рецептор В7-Н4 и путь его сигнальной трансдукции все еще неясен.

Недавние исследования показали, что белок В7-Н4 обильно экспрессируется в различных опухолевых тканях, что позволяет опухолевым клеткам уклоняться от атаки иммунной системой организма. Применение молекулы В7-Н4 в качестве мишени для терапии опухолей обеспечивает новый способ иммунотерапии опухолей.

В настоящее время известно, что человеческий В7-Н4 экспрессируется на раковых клетках, таких как рак молочной железы, рак яичников, рак легких, рак шейки матки, рак почки, рак мочевого пузыря и рак печени. Экспрессия мРНК В7-Н4 обнаружена в селезенке, легких, тимусе, печени, скелетных мышцах, почках, поджелудочной железе, семенниках и яичниках. На уровне белка низкий уровень экспрессии В7-Н4 обнаружен в таких тканях, как молочная железа (проток и долька), эпителий маточных труб и железы эндометрия. Связанные исследования также показали, что В7-Н4 сверхэкспрессируется в опухолево-ассоциированных макрофагах (ТАМ) (Kryczek, I. et al., J. Exp.Med. 2006, 203 (4): 871-881), а макрофаги составляют важный компонент микроокружения опухоли и могут составлять до 50% массы опухоли.

Одна из стратегий лечения рака заключается в применении антител в качестве носителей для доставки цитотоксических молекул в раковые клетки с последующим уничтожением раковых клеток диссоциированными небольшими молекулами. Лекарственные средства, применяемые в такой стратегии, называются конъюгатами антитела и лекарственного средства. Адцетрис (Adcetris) и Кадцила (Kadcyla) в настоящее время представляют собой реализуемые на рынке конъюгаты антитела и лекарственного средства. В настоящее время многие транснациональные фармацевтические компании разрабатывают моноклональные антитела против В7-Н4 и/или их конъюгаты с лекарственными средствами для улучшения реакции собственной иммунной системы пациента на опухоли и достижения цели прямого уничтожения опухолевых клеток. Родственные патенты представляют собой, например, WO 2013025779, US 20140322129 и т.п. Моноклональные антитела к В7-Н4 от Medimmune, FivePrime и других компаний в настоящее время все еще находятся на стадии доклинической разработки; конъюгаты антитела к В7-Н4 и лекарственного средства Genentech также находятся на стадии доклинической разработки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгата антитела к В7-Н4 и лекарственного средства, имеющего высокую аффинность, высокую селективность, высокую эндоцитарную эффективность, высокую противораковую активность, высокую стабильность, высокую безопасность и низкую токсичность и возникновение побочных эффектов, достигаемое за счет следующих технических решений:

Конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват,

где:

D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство,

L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число от 1 до 20,

Ab представляет собой В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область легкой цепи антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела,

причем вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит по меньшей мере одну HCDR (область тяжелой цепи, определяющая комплементарность), как показано в последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,

вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну LCDR (область легкой цепи, определяющая комплементарность), как показано в последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,

SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариабельная область тяжелой цепи антитела может также содержать по меньшей мере одну HCDR, как показано в последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, или

вариабельная область тяжелой цепи антитела также может содержать по меньшей мере одну HCDR, как показано в последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45,

вариабельная область легкой цепи антитела содержит по меньшей мере одну LCDR, как показано в последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8,

SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,

SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит:

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5,

или

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит:

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 23, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 24, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25,

или

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 30, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит:

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 43, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 44, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25,

или

HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 45, и

HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела Ab содержит CDR любой выбранный из группы, состоящей из следующих с (1) по (4):

(1) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5,

(2) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11,

(3) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 23, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 24, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25, или

(4) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 30, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31.

Вариабельная область тяжелой цепи антитела Ab может также содержать CDR, выбранные из группы, состоящей из следующих с (5) по (6):

(5) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 43, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 44, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25,

или

(6) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 45, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи антитела, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит:

LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно,

или LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи антитела, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит:

LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, соответственно, или

LCDR1, LCDR2 и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 34, соответственно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела Ab содержит CDR любой выбранный из группы, состоящей из следующих с (1) по (4):

(1) LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 6, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 7, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 8,

(2) LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14,

(3) LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 26, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 27, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 28, или

(4) LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 32, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 33, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(1) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5, соответственно, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 6, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 7, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 8, или

(2) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11, соответственно, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(3) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 23, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 24, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 26, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 27, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 28, или

(4) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 30, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 32, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 33, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат:

(5) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 43, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 44, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25, соответственно, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 26, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 27, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 28, или

(6) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 45, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31, соответственно, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 32, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 33, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела и вариабельная область легкой цепи антитела Ab содержат CDR любой выбранный из группы, состоящей из следующих с (1) по (4):

(1) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 6, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 7, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 8,

(2) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14,

(3) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 23, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 24, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 26, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 27, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 28, или

(4) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 30, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 32, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 33, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 34.

Вариабельная область тяжелой цепи антитела и вариабельная область легкой цепи антитела Ab могут также содержать CDR, выбранные из группы, состоящей из следующих (5) или (6):

(5) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 43, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 44, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 25, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 26, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 27, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 28,

(6) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 29, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 45, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 31, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 32, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 33, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 34.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab представляет собой мышиное антитело или его фрагмент, химерное антитело или его фрагмент, человеческое антитело или его фрагмент и гуманизированное антитело или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab дополнительно содержит последовательности каркасной области легкой цепи и каркасной области тяжелой цепи, которые, соответственно, происходят от последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи зародышевой линии человека или их мутантной(ых) последовательности(ей).

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab дополнительно содержит константную(ые) область(и) тяжелой цепи, где константная(ые) область(и) тяжелой цепи включают те, которые происходят от человеческого IgG1 или его варианта, IgG2 или его варианта, IgG3 или его варианта или IgG4 или его варианта, предпочтительно те, которые происходят от человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, более предпочтительно константную область тяжелой цепи IgG1 с повышенной токсичностью ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после аминокислотной мутации, наиболее предпочтительно константную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 54.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую от человеческой к-цепи, λ-цепи или их варианта, предпочтительно происходящую от человеческой к-цепи, более предпочтительно константную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 55.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит вариабельную область легкой цепи со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 18.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит вариабельную область легкой цепи со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, или вариабельные области легкой цепи с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% гомологией последовательностям SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит вариабельную область тяжелой цепи со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит вариабельную область тяжелой цепи со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, или вариабельные области тяжелой цепи с по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% гомологией последовательностям SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи Ab представляют собой любую, выбранную из группы, состоящей из следующих:

(1) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 15, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16,

(2) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи Ab представляют собой любую, выбранную из группы, состоящей из следующих:

(1) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 15, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16,

(2) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18,

(3) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 35, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 36, или

(4) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 37, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 38.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит легкую цепь со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 22.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит легкую цепь со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, или полноразмерную легкую цепь с по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% гомологией последовательностям SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват как описано выше, где Ab содержит тяжелую цепь со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит тяжелую цепь со следующими последовательностями: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, или полноразмерную тяжелую цепь с по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% гомологией последовательностям SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит:

(1) легкую цепь SEQ ID NO: 20 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 19 или

(2) легкую цепь SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 21.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где Ab содержит:

(1) легкую цепь SEQ ID NO: 20 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 19, или

(2) легкую цепь SEQ ID NO: 22 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 21, или

(3) легкую цепь SEQ ID NO: 40 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 39, или

(4) легкую цепь SEQ ID NO: 42 и тяжелую цепь SEQ ID NO: 41.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где антигенсвязывающий фрагмент антитела к В7-Н4 выбран из группы, состоящей из Fab, Fab' F(ab')₂, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатело), V-области, стабилизированной дисульфидной связью (dsFv), и антигенсвязывающих фрагментов пептида, содержащего CDR.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где цитотоксическое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из токсина, химиотерапевтического средства, антибиотика, радиоизотопа и нуклеолитического фермента, предпочтительно ингибитора тубулина или ингибитора топоизомеразы ДНК, который ингибирует деление клеток, более предпочтительно DM1, DM3, DM4, SN-38, MMAF или ММАЕ, более предпочтительно ингибитора тубулина SN-38, ММАЕ или MMAF. Где структура MMAF и SN-38 является такой, как показано в следующей формуле:

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где цитотоксическое лекарственное средство выбрано из производных камптотецина, предпочтительно Экзатекана,

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой соединение общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват,

где:

L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число, выбранное от 1 до 8, предпочтительно число, выбранное от 2 до 4,

Ab представляет собой антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (II) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число, выбранное от 1 до 8, предпочтительно число, выбранное от 2 до 4,

Ab представляет собой антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (III) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват,

где:

L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число, выбранное от 1 до 10, предпочтительно число, выбранное от 2 до 8, более предпочтительно число, выбранное от 4 до 8,

или у предпочтительно представляет собой число, выбранное от 2 до 10, еще более предпочтительно число, выбранное от 6 до 10, более предпочтительно число от 7 до 9 и наиболее предпочтительно целое число 7, 8, 9,

Ab представляет собой антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено выше.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где L₁ является таким, как показано в следующей общей формуле (В):

где:

M₁ представляет собой -CR₁R²-,

R₁ и R² одинаковые или различные и независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, алкила, галогена, гидроксила и амино,

n представляет собой целое число от 0 до 5, предпочтительно 1, 2 или 3. В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где L₂ является таким, как показано в следующей общей формуле (С):

где:

М₂ представляет собой -CR⁴R⁵-,

R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, гидроксила, амино, алкила, алкоксила и циклоалкила,

R⁴ и R⁵ одинаковые или различные и независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, алкила, галогена, гидроксила и амино,

m представляет собой целое число от 0 до 5, предпочтительно 1, 2 или 3.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где L₂ является таким, как показано в следующей общей формуле (D):

где:

K¹ представляет собой s представляет собой целое число от 2 до 8, более предпочтительно целое число от 4 до 8, более предпочтительно целое число от 4 до 6,

K² представляет собой -NR¹(CH₂CH₂O)_pCH₂CH₂C(O)-, -NR¹(CH₂CH₂O)_pCH₂C(O)-, -S(CH₂)_pC(O)- или одинарную связь, р представляет собой целое число от 1 до 20, предпочтительно 1 до 6,

R₁ выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, гидроксила, амино, алкила, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила,

K³ представляет собой тетрапептидный остаток, предпочтительно тетрапептидный остаток представляет собой пептидный остаток, образованный аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из двух или более из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутамата и аспартата, более предпочтительно тетрапептидный остаток GGFG,

K⁴ представляет собой -NR²(CR³R⁴)t-, где R², R³ или R⁴ каждый независимо представляет собой водород, дейтерий, гидроксил, амино, алкил, галоген, галогеналкил, дейтерированный алкил и гидроксиалкил, и t равно 1 или 2, предпочтительно, как для L₂,

K¹ представляет собой s равно 5,

K² представляет собой связь,

K³ представляет собой тетрапептидный остаток GGFG,

K⁴ представляет собой -NR²(CR³R⁴)t-, R², R³ или R⁴ каждый независимо представляет собой водород, дейтерий, гидроксил, амино, C_1-6 алкил, галоген, С_1-6 галогеналкил, C_1-6 дейтерированный алкил и C_1-6 гидроксиалкил, и t равно 1 или 2.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где K¹-конец линкерного звена -L₂- связан с Ab, и K⁴-конец связан с L₄.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где L₁ представляет собой -O-(CR^aR^b)_m-CR⁵R⁶-C(O)-, -O-CR⁵R⁶-(CR^aR^b)_m-, -O-CR⁵R⁶-, -NH-(CR^aR^b)_m-CR⁵R⁶-C(O)- или -S-(CR^aR^b)_m-CR⁵R⁶-C(O)-,

R^a и R^b каждый независимо выбран из группы, состоящей из водорода, дейтерия, галогена и алкила,

R⁵ представляет собой галогеналкил или циклоалкил,

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и циклоалкила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют циклоалкил,

m равно 0, 1, 2, 3 или 4.

Предпочтительно О-конец L₁ связан с линкерным звеном L₂.

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где L₁ является таким, как показано в следующей общей формуле (Е):

R⁵ представляет собой галогеналкил или циклоалкил,

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и циклоалкила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют циклоалкил,

предпочтительно

R⁵ выбран из группы, состоящей из С_1-6 галогеналкила и С_3-6 циклоалкила,

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-6 галогеналкила и циклоалкила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют С_3-6 циклоалкил,

m представляет собой целое число от 0 до 4,

более предпочтительно общая формула (Е) выбрана из группы, состоящей из следующих заместителей:

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, где -L₂-L₁- имеет следующую структуру:

K² представляет собой связь,

K³ представляет собой тетрапептидный остаток GGFG,

R⁵ представляет собой галогеналкил или С_3-6 циклоалкил,

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, галогеналкила и С_3-6 циклоалкила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют С_3-6 циклоалкил,

R², R³ или R⁴ каждый независимо представляет собой водород или алкил,

s представляет собой целое число от 2 до 8, предпочтительно s равно 4, 5 или 6,

m представляет собой целое число от 0 до 4,

предпочтительно -L₂-L₁- выбран из группы, состоящей из следующих структур:

В предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (IV) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где:

W выбран из группы, состоящей из C_1-8 алкила, C_1-8 алкилциклоалкила или линейного гетероалкила, содержащего от 1 до 8 атомов, где гетероалкил содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, О или S, где C_1-8 алкил, циклоалкил или линейный гетероалкил каждый независимо необязательно дополнительно замещен одним или более заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкоксила и циклоалкила,

2 1

K² выбран из группы, состоящей из -NR¹(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(О)-, NR¹(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-, -S(CH₂)_p1C(O)- или связи, R¹ выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила, a p₁ представляет собой целое число от 1 до 20,

K³ представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот, причем аминокислоты могут быть замещенными или незамещенными. Если аминокислота замещенная, заместители могут быть замещены в любой доступной точке присоединения, и заместители представляют собой один или более заместителей, независимо выбранных из группы, состоящей из галогена, гидроксила, циано, амино, алкила, хлоралкила, дейтерированного алкила, алкоксила и циклоалкила,

R² независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила,

R³ и R⁴ каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, алкила, галогеналкила, дейтерированного алкила и гидроксиалкила,

R⁵ выбран из группы, состоящей из галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила,

R⁶ выбран из группы, состоящей из атома водорода, галогена, галогеналкила, дейтерированного алкила, циклоалкила, гетероциклила, арила и гетероарила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют циклоалкил или гетеро циклил,

m представляет собой целое число от 0 до 4,

у равно от 1 до 10, и у представляет собой десятичное или целое число, предпочтительно у представляет собой число от 2 до 10, более предпочтительно у представляет собой число от 4 до 10, еще более предпочтительно число от 6 до 9 и наиболее предпочтительно целое число 7, 8 или 9,

Ab представляет собой антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (I-A) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

у равно от 1 до 10, причем у представляет собой десятичное или целое число.

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (I-B) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

у равно от 1 до 10, причем у представляет собой десятичное или целое число.

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (II-А) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (II-В) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

В более предпочтительном варианте осуществления предложен конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, представляющий собой конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (IV-А) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват:

где s представляет собой целое число от 2 до 8, R²-R⁶, m и у являются такими, как показано в приведенной выше общей формуле (IV),

предпочтительно s представляет собой целое число 4, 5 или 6, у представляет собой число от 4 до 10, предпочтительно число от 6 до 9 и более предпочтительно 7 или 8.

В более предпочтительном варианте осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, выбран из группы, состоящей из следующих соединений:

В наиболее предпочтительном варианте осуществления конъюгат антитела и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, как описано выше, выбран из группы, состоящей из следующих соединений:

где у представляет собой число, выбранное от 1 до 10, предпочтительно число, выбранное от 2 до 10, дополнительно число, выбранное от 6 до 10, более предпочтительно число от 7 до 9 и наиболее предпочтительно целое число 7, 8, 9, или у представляет собой число, выбранное от 2 до 10, предпочтительно число от 4 до 8, более предпочтительно число от 6 до 8, еще более предпочтительно число от 7 до 8 и наиболее предпочтительно 8.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата антитела и лекарственного средства общей формулы (IV) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающему следующие стадии:

после восстановления Ab его подвергают реакции сочетания с соединением общей формулы (F) с получением соединения общей формулы (IV), где:

Ab представляет собой антитело к В7Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент,

W, K², K³, R²-R⁶, m и у являются такими, как показано в общей формуле (IV).

В предпочтительном варианте осуществления соединение общей формулы (F) представляет собой соединение общей формулы (F-1):

или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или их фармацевтически приемлемую соль,

где

K², K³, R²-R⁶, s и m являются такими, как показано в приведенном выше -L₂-L₁-.

В предпочтительном варианте соединение общей формулы (F) или общей формулы (F-1) выбрано из группы, состоящей из:

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитела и лекарственного средства по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемую соль или сольват и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов, разбавителей или носителей.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению конъюгата антитела и лекарственного средства общей формулы (А), или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, или его фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с человеческим В7-Н4, предпочтительно лекарственного средства для лечения рака с высокой экспрессией В7-Н4.

В более предпочтительном варианте осуществления рак выбран из группы, состоящей из астробластомы головного мозга человека, фарингеального рака человека, опухоли надпочечников, рака, связанного со СПИДом, альвеолярной мягкотканной саркомы, астроцитомы, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухоли каротидного тельца, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, пролиферативной соединительнотканной мелко круглоклеточной опухоли, эпендимомы, саркомы Юинга, внекостной мукоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза кости, фиброзной дисплазии кости, карциномы желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, инсулиномы, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярного рака щитовидной железы, аденомы паращитовидной железы, детского рака, периферической невриномы, феоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, задней увеальной меланомы, метастатического рака почки, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной карциномы, синовиальной саркомы, рака яичек, рака тимуса, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1: Эффективность in vivo конъюгатов антитела и лекарственного средства: hu2G6-MC-MMAF и hu2F7-MC-MMAF показали ингибирующее и уничтожающее действие в отношении ксенотрансплантатных опухолей МХ-1 в дозах 1,5 мг/кг и 3 мг/кг.

Фигура 2: Спектры ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) hu2F7-MC-MMAF с нагрузкой лекарственным средством 2 и 4, соответственно.

Фигура 3. Противоопухолевая эффективность in vivo hu2F7-MC-MMAF с нагрузкой лекарственным средством 2 и 4, соответственно.

Фигура 4: Противоопухолевая эффективность in vivo hu2F7-MC-MMAF с нагрузкой лекарственным средством 2 и 4, соответственно. На фигуре показаны опухоли мышей в каждой группе на 21 день.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Определения

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже конкретно определены некоторые технические и научные термины. Технические и научные термины в контексте настоящего документа, если специально не указано иное, имеют свое обычное значение, понятное специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Трехбуквенные коды и однобуквенные коды аминокислот, применяемые в настоящем изобретении, описаны в J. Biol. Chem, 243, р3558 (1968).

Термин "антитело", в контексте настоящего изобретения, относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру тетрапептидной цепи, состоящей из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, связанных межцепочечными дисульфидными связями. Состав и порядок аминокислот в константной(ых) области(ях) тяжелой цепи иммуноглобулина различны, поэтому их антигенность также различна. В соответствии с этим иммуноглобулины можно разделить на пять типов, также известных как изотипы иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и их соответствующие тяжелые цепи представляют собой μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь, соответственно. Один и тот же тип Ig можно разделить на разные подклассы в соответствии с различием в их аминокислотном составе шарнирной области и количеством и положением дисульфидных связей тяжелой цепи. Например, IgG можно разделить на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкую цепь подразделяют на κ-цепь или λ-цепь в соответствии с различием в константной области. Каждый из пяти типов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В настоящем изобретении вариабельная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область легкой цепи, которая содержит человеческие или мышиные κ, λ-цепи или их вариант.

В настоящем изобретении вариабельная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, которая содержит человеческие или мышиные IgG1, 2, 3, 4 или их вариант.

Последовательность из примерно 110 аминокислот около N-конца тяжелой и легкой цепей антитела сильно различается и представляет собой вариабельную область (V-область), оставшаяся аминокислотная последовательность около С-конца относительно стабильна и представляет собой константную область (С-область). Вариабельная область содержит 3 гипервариабельных области (HVR) и 4 каркасных области (FR) с относительно консервативными последовательностями. 3 гипервариабельные области определяют специфичность антитела и так же известны как области, определяющие комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (VL) и вариабельная область тяжелой цепи (VH) состоит из 3 областей CDR и 4 областей FR, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 3 области CDR легкой цепи обозначают как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, 3 области CDR тяжелой цепи обозначают как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и положение аминокислотных остатков CDR области VL и области VH антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению соответствуют известным критериям нумерации по Кабату или Чотиа и критериям определения по Кабату или AbM (http://bioinf.org.uk/abs/).

Термин "антигенпрезентирующая клетка" или "АПК" обозначает клетку, презентирующую чужеродный антиген в комплексе с МНС на своей поверхности. Т-клетки используют Т-клеточные рецепторы (TCR) для распознавания таких комплексов. Примеры АПК включают, но не ограничиваются, дендритные клетки (ДК), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), моноциты, В-лимфобласты и дендритные клетки (ДК), происходящие из моноцитов. Термин "презентация антигена" относится к процессу, с помощью которого АПК захватывают антигены и представляют их для распознавания Т-клетками, например, как компонент конъюгата MHC-I/MHC-II.

Термин "В7-Н4" относится к члену семейства белков В7 человека, также известному как CD276, который представляет собой трансмембранный белок типа I с четырьмя Ig-подобными внеклеточными доменами. В7-Н4 представляет собой один из белков иммунных контрольных точек, экспрессируемых на поверхности антигенпрезентирующих клеток или раковых клеток, и оказывает ингибирующее действие на функциональную активацию Т-клеток. Термин "В7-Н4" включает любой вариант или изоформу В7-Н4, которая естественным образом экспрессируется клетками. Антитела по настоящему изобретению могут перекрестно реагировать с В7-Н4, происходящим от видов, не относящихся к человеку. В качестве другого варианта антитела также могут быть специфичными для человеческого В7-Н4 и могут не проявлять перекрестной реактивности с другими видами. В7-Н4 или его любой вариант или изоформа могут быть выделены из клеток или тканей, естественным образом экспрессирующих его, или получены рекомбинантными способами с применением способов, обычно применяемых в данной области техники, и способов, описанных в настоящем документе. Предпочтительно антитело к В7-Н4 нацелено на человеческий В7-Н4 с нормальным паттерном гликозилирования.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело" включает человеческие антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными способами, и применяемые способы и технические решения хорошо известны в данной области техники, например (1) антитела, выделенные из трансгенных или трансхромосомных животных (например, мышей), экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, или полученных из них гибридом, (2) антитела, выделенные из клеток-хозяин, трансформированных для экспрессии антител, таких как трансфектомы, (3) антитела, выделенные из библиотек рекомбинантных комбинаторных антител человека, а также (4) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные путем сплайсинга последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК и другими способами. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные области и константные области, которые используют специфические последовательности иммуноглобулинов зародышевой линии человека, кодируемые генами зародышевой линии, но также содержат последующие перестройки и мутации, такие как те, которые происходят во время созревания антител.

Термин "мышиное антитело" в настоящем изобретении означает моноклональное антитело к человеческому В7-Н4, полученное согласно знаниям и навыкам в данной области техники. Во время получения испытуемому субъекту вводят антиген В7-Н4, а затем выделяют гибридомы, экспрессирующие антитела с желаемыми последовательностями или функциональными свойствами. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мышиное В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать константную область легкой цепи мышиной κ-, λ-цепи или их вариант или дополнительно содержать константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их вариант.

Термин "человеческое антитело" включает антитела с вариабельной и константной областью(ями) последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодирующиеся последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo). Однако термин "человеческое антитело" не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих (например, мыши), были привиты к человеческим каркасным последовательностям (а именно "гуманизированные антитела").

Термин "гуманизированное антитело", также известное как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному путем трансплантации последовательностей CDR мыши в каркас вариабельных областей человеческого антитела. Оно может преодолеть сильные реакции иммунного ответа, вызванные химерными антителами, несущими большое количество компонентов мышиного белка. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, вариабельные области человеческого антитела можно подвергать минимальной обратной мутации для поддержания активности.

Термин "химерное антитело" означает антитело, образованное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, что может облегчить иммунный ответ, индуцированный мышиным антителом. Создание химерного антитела требует сначала создания гибридомы, которая секретирует мышиное специфическое моноклональное антитело, затем клонирования гена вариабельной области из клеток мышиной гибридомы, а затем клонирования гена константной области человеческого антитела, если необходимо, связывания мышиного гена вариабельной области с человеческим геном константной области с образованием химерного гена, вставляемого в вектор экспрессии человека, и, наконец, экспрессии молекулы химерного антитела в эукариотической производственной системе или прокариотической производственной системе. Константная(ые) область(и) человеческого антитела может быть выбрана из константной(ых) области(ей) тяжелой цепи человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или их варианта, предпочтительно содержащих константную(ые) область(и) тяжелой цепи человеческого IgG2 или IgG4, или с применением IgG1 с повышенной токсичностью ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после аминокислотных мутаций.

Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к антигенсвязывающим фрагментам и аналогам антитела, которые обычно содержат по меньшей мере часть антигенсвязывающей области или вариабельных областей (например, одной или более CDR) родительского антитела. Фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере часть специфичности связывания родительского антитела. Обычно, когда активность представлена на молярной основе, фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 10% родительской активности связывания. Предпочтительно фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или более аффинности связывания родительского антитела с мишенью. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают, но не ограничиваются: Fab, Fab', F(ab')2, фрагмент Fv, линейное антитело, одноцепочечное антитело, нанотело, доменное антитело и мультиспецифическое антитело. Сконструированные варианты антител описаны в публикации Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.

"Fab-фрагмент" состоит из CH1 и вариабельных областей одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидные связи с другой молекулой тяжелой цепи.

Область "Fc" содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащие домены СН1 и СН2 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и за счет гидрофобного взаимодействия домена СН3.

"Фрагмент Fab'" содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, которая содержит домен VH, домен СН1 и область между доменами СН1 и СН2, так что межцепочечные дисульфидные связи могут быть образованы между двумя тяжелыми цепями двух фрагментов Fab' с образованием молекулы F(ab')2.

"Фрагмент F(ab')2" содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, составляющие часть константной области между доменами СН1 и СН2, тем самым образуя межцепочечные дисульфидные связи между двумя тяжелыми цепями. Следовательно, фрагмент F(ab')2 состоит из двух фрагментов Fab', удерживаемых вместе дисульфидными связями между двумя тяжелыми цепями.

"Область Fv" содержит вариабельные области как тяжелой цепи, так и легкой цепи, но не имеет константной(ых) области(ей).

Термин "мультиспецифическое антитело" используется в самом широком смысле, который охватывает антитела с полиэпитопной специфичностью. Такие мультиспецифические антитела включают, но не ограничиваются: антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где звено VH-VL имеет мультиэпитопную специфичность, антитела с двумя или более областями VL и VH, где каждое звено VH-VL связывается с разными мишенями или разными эпитопами одной и той же мишени, антитела с двумя или более одиночными вариабельными областями, где каждая одиночная вариабельная область связывается с разными мишенями или разными эпитопами одной и той же мишени, полноразмерные антитела, фрагменты антител, диатела, биспецифические диатела и триатела, фрагменты антител, которые ковалентно или нековалентно связаны друг с другом, и тому подобное.

Термин "одноцепочечное антитело" означает одноцепочечный рекомбинантный белок, образованный путем связывания вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) антитела через линкерный пептид. Это наименьший фрагмент антитела с полным сайтом связывания антигена.

Термин "фрагмент доменного антитела" означает фрагмент иммуноглобулина с иммунологическими функциями, который содержит только вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи. В некоторых случаях две или более области VH ковалентно связаны с линкерным пептидом с образованием фрагмента двухвалентного доменного антитела. Две области VH фрагмента двухвалентного доменного антитела могут нацеливаться на один и тот же или разные антигены.

Термин "связывание с В7-Н4" в настоящем изобретении относится к способности взаимодействовать с человеческим В7-Н4. Термин "антигенсвязывающий сайт" по настоящему изобретению относится к трехмерному сайту, распределенному по антигену и распознающемуся антителом или антигенсвязывающий фрагментом по настоящему изобретению.

Термины "специфически связывает" и "селективно связывает", применяемые в настоящем изобретении, относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Обычно, когда в качестве аналита применяют рекомбинантный человеческий В7-Н4, а в качестве лиганда применяют антитело, при измерении с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в приборе антитело связывается с заранее определенным антигеном при равновесной константе диссоциации (KD) примерно менее 10^-7 моль/л или даже менее, а его аффинность связывания с заранее определенным антигеном по меньшей мере вдвое превышает его аффинность связывания с неспецифическими антигенами (отличных от заранее определенного антигена или близкородственных антигенов, таких как BSA и т.п.). Термин "антитело, которое распознает … антиген" можно использовать в настоящем документе взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с …".

Термин "перекрестная реактивность" относится к способности антител по настоящему изобретению связываться с В7-Н4 из разных видов. Например, антитело по настоящему изобретению, которое связывается с человеческим В7-Н4, может также связываться с В7-Н4 другого вида. Перекрестную реактивность измеряют путем определения специфической реактивности с очищенными антигенами в анализах связывания (например, SPR и ELISA) или путем связывания или функционального взаимодействия с клетками, которые физиологически экспрессируют В7-Н4. Способы определения перекрестной реактивности включают стандартные анализы связывания, как описано в настоящем документе, например, анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или проточную цитометрию.

Термины "ингибирование" или "блокирование" можно использовать взаимозаменяемо, и они охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование лиганда предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, которые присутствуют, когда связывание лиганда происходит без ингибирования или блокирования. Подразумевается, что ингибирование и блокирование также включают любое измеримое снижение аффинности связывания лиганда при контакте с антителом к В7-Н4 по сравнению с аффинностью связывания лиганда, не контактирующего с антителом к В7-Н4.

Термин "ингибирование роста" (например, когда речь идет о клетках) предназначен для включения любого измеримого снижения роста клеток.

Термины "индуцированный иммунный ответ" и "усиленный иммунный ответ" можно использовать взаимозаменяемо, и они относятся к иммунному ответу на стимуляцию специфическим антигеном (т.е. пассивному или адаптивному). Термин "индуцировать" в выражении "индуцирование CDC или ADCC", относится к стимуляции конкретного механизма прямого уничтожения клеток.

"ADCC" в настоящем изобретении, т.е. антителозависимая клеточная цитотоксичность, означает, что клетки, экспрессирующие рецепторы Fc, непосредственно уничтожают клетки-мишени, покрытые антителами, путем распознавания сегмента Fc антител. Функция антител, влияющая на ADCC, может быть усилена, уменьшена или устранена путем модификации сегмента Fc IgG. Модификация относится к мутациям в константной области тяжелой цепи антитела.

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны и могут быть найдены в предшествующем уровне техники, например, в публикации Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, chapters 5-8 and 15. Например, мышей можно иммунизировать человеческим В7-Н4 или его фрагментом, и полученные антитела можно ренатурировать и очистить, а аминокислотное секвенирование можно проводить с применением обычных способов.

Антигенсвязывающие фрагменты также можно получить с применением обычных способов. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению генетически сконструировано для введения одной или более областей FR человека в области CDR, не являющиеся человеческими. Последовательности зародышевой линии FR человека можно получить через сайт в сети Интернет ImmunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr или через The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.

Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно получить и очистить обычными способами. Последовательности кДНК соответствующих антител можно клонировать и рекомбинировать в векторы экспрессии GS. Векторы экспрессии рекомбинантных иммуноглобулинов могут стабильно трансфицировать клетки СНО. В качестве более рекомендуемых из уровня техники, системы экспрессии млекопитающих могут приводить к гликозилированию антител, особенно на высококонсервативном N-конце области Fc. Стабильные клоны получают путем экспрессии антител, которые специфически связываются с человеческими антигенами. Положительные клоны размножаются в бессывороточной среде биореакторов для получения антител. Культуральная среда, в которую секретируются антитела, может быть очищена и собрана обычными способами. Антитела можно фильтровать и концентрировать обычными способами. Растворимые смеси и мультимеры также можно удалить обычными способами, например, молекулярными ситами и ионным обменом. Полученный продукт необходимо немедленно заморозить, например, при минус 70°С, или лиофилизировать.

Антитело по настоящему изобретению относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело (mAb) по настоящему изобретению относится к антителу, полученному из одного клонированного клеточного штамма, при этом клеточный штамм не ограничен эукариотическим, прокариотическим или фаговым клонированным клеточным штаммом. Моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены путем рекомбинации с применением, например, гибридомной технологии, технологии рекомбинации, технологии фагового дисплея, технологии синтеза (такой как прививка CDR) или других известных способов.

Термины "введение" и "обработка" применительно к животным, людям, экспериментальным субъектам, клеткам, тканям, органам или биологическим жидкостям относятся к приведению экзогенного лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или композиции в контакт с животными, людьми, субъектами, клетками, тканями, органами или биологическими жидкостями. "Введение" и "обработка" могут относиться, например, к лечению, фармакокинетике, диагностике, исследованиям и экспериментальным способам. Обработка клеток включает приведение реагентов в контакт с клетками и приведение реагентов в контакт с жидкостями, при этом жидкости находятся в контакте с клетками. "Введение" и "обработка" также означают обработку, например, клеток реагентами, средствами диагностики, связывающими композициями или другим типом клеток in vitro и ex vivo. "Обработка" применительно к людям, животным или объектам исследования относится к терапевтическому лечению, предупреждающим или профилактическим мерам, исследованиям и диагностическим применениям.

"Лечение" относится к введению внутреннего или внешнего терапевтического агента, например, композиции, содержащей любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, пациенту с одним или более симптомами заболевания, на которые терапевтический агент, как известно, оказывает терапевтическое действие. Обычно терапевтический агент вводится в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у подвергающегося лечению субъекта или популяции, либо для индукции регресса таких симптомов, либо для подавления развития таких симптомов в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, которое эффективно для облегчения симптомов любого конкретного заболевания (также называемое "терапевтически эффективное количество"), может варьироваться в зависимости от множества факторов, например, болезненного состояния пациента, возраста и массы тела, а также способности лекарственного средства обеспечивать желаемый терапевтический эффект у пациента. Облегчение симптомов заболевания можно оценить с помощью любых способов клинического тестирования, обычно применяемых врачами или другими специалистами в области здравоохранения для оценки степени тяжести или прогрессирования симптомов. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способы лечения или продукты) могут быть неэффективными в облегчении каждого интересующего симптома заболевания, но они должны уменьшить интересующий симптом заболевания у статистически значимого числа пациентов, как определено любыми способами статистического тестирования, известными в данной области техники, такими как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Краскела-Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

Термин "по существу состоящий из…" или его вариант, в контексте настоящего описания и формулы изобретения, означает, что он включает все описанные элементы или группы элементов и, необязательно, включает другие элементы, аналогичные или отличающиеся по природе от описанных элементов, что действительно существенно не изменяет основные или новые свойства данного режима дозирования, способа или композиции. В качестве неограничивающего примера связывающее соединение, по существу состоящее из упомянутой аминокислотной последовательности, также может содержать одну или более аминокислот, которые не оказывают значительного влияния на свойства связывающего соединения.

Термин "встречающийся в природе", применяемый к определенному объекту в настоящем изобретении, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная последовательность или полинуклеотидная последовательность считается встречающейся в природе, если она существует в организмах (включая вирус) и может быть выделена из природных источников, и не была намеренно искусственно модифицирована в лаборатории.

"Эффективное количество" включает количество, достаточное для облегчения или предотвращения симптома или состояния медицинского состояния. Эффективное количество также относится к количеству, достаточному для обеспечения или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или животного может варьироваться в зависимости от следующих факторов: таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, способ, путь и доза введения лекарственного средства, а также тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может быть максимальной дозой или режимом дозирования, позволяющим избежать значительных побочных или токсических эффектов.

"Экзогенный" относится к веществам, производимым вне организмов, клеток или человеческого тела в зависимости от происхождения. "Эндогенный" относится к веществам, вырабатываемым внутри клеток, организмов или человеческих тел в зависимости от происхождения.

"Гомология" относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или между двумя полипептидами. Когда положения в двух выровненных последовательностях заняты одним и тем же основанием или мономерной субъединицей аминокислоты, например, если каждое положение двух молекул ДНК занято аденином, то молекулы считаются гомологичными в данном положении. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленное на количество выровненных положений × 100%. Например, при оптимальном выравнивании последовательностей, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или гомологичны, то две последовательности гомологичны на 60%. Обычно выравнивание проводят, когда две последовательности выравнивают для получения максимального процента гомологии.

Выражения "клетка", "клеточная линия" и "культура клеток", в контексте настоящего описания, можно применять взаимозаменяемо, и все такие названия включают их потомство. Следовательно, термины "трансформант" и "трансформированная клетка" включают первичные тестируемые клетки и полученные из них культуры, независимо от количества пассажей. Также следует понимать, что из-за преднамеренных или непреднамеренных мутаций все потомки не могут быть абсолютно одинаковыми с точки зрения содержания ДНК. Включено мутантное потомство с той же функцией или биологической активностью, что и те, которые подвергались скринингу в исходных трансформированных клетках. Это очевидно из контекста, при упоминании разных наименований.

"Необязательный" или "необязательно" означает, что событие или обстоятельство, которое следует за формулировкой "необязательный" или "необязательно", могло, но не должно, произойти, и описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит. Например, "необязательно содержащий от 1 до 3 вариабельных областей тяжелой цепи антитела" означает, что вариабельные области тяжелой цепи антитела с конкретными последовательностями могут, но не должны, присутствовать.

"Фармацевтическая композиция" означает смесь, содержащую одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или его физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, и другие химические компоненты, а также другие компоненты, такие как физиологические/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Цель фармацевтической композиции состоит в том, чтобы способствовать введению лекарственного средства в организм, облегчить абсорбцию активного ингредиента и тем самым проявить биологическую активность. Получение обычных фармацевтических композиций описано в Китайской фармакопее.

"Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли конъюгата антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению, которая безопасна и эффективна для применения у млекопитающих и обладает желаемой биологической активностью. Конъюгат антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну аминогруппу, таким образом, он может образовывать соль с кислотой. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых солей включают: гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, гидросульфат, цитрат, ацетат, сукцинат, аскорбат, оксалат, нитрат, сорбат, гидрофосфат, дигидрофосфат, салицилат, гидроцитрат, тартрат, малеат, фумарат, формиат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат и п-толуолсульфонат.

"Сольват" относится к фармацевтически приемлемому сольвату, образованному соединением конъюгата антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению и одной или более молекулами растворителя. Неограничивающие примеры молекул растворителя включают: воду, этанол, ацетонитрил, изопропанол и этилацетат.

"Цитотоксическое лекарственное средство" в контексте настоящего изобретения относится к веществу, которое подавляет функцию клеток и/или вызывает уничтожение или разрушение клеток.

"Ингибитор тубулина" относится к классу соединений, которые мешают процессу митоза клеток, ингибируя полимеризацию тубулина или способствуя агрегации тубулина, тем самым оказывая противоопухолевый эффект. Их неограничивающие примеры включают: майтанзиноиды, калихеамицин, таксаны, винкристин, колхицин, доластатин/ауристатин/монометилауристатин Е (ММАЕ)/монометилауристатин F (MMAF).

"Линкер" относится к химическому фрагменту, с помощью которого антитело ковалентно присоединяется к ковалентной связи или атомной цепи лекарственного средства. Неограничивающие примеры линкеров включают: арилен, гетероарилен, ПЭГ (полиэтиленгликоль), полиметиленокси, сукцинат, сукцинамид, дигликолят, малонат и капроамид.

"Нагрузка лекарственным средством" (DAR) представлена у, который представляет собой среднее количество цитотоксических лекарственных средств на одно антитело в формуле (А). Диапазон нагрузки лекарственным средством в настоящем изобретении может составлять от 1 до 20 цитотоксических лекарственных средств (D) на одно антитело. Конъюгат антитела и лекарственного средства общей формулы (А) представляет собой набор антител, конъюгированных с определенным количеством (от 1 до 20) цитотоксических лекарственных средств. Нагрузку лекарственным средством (DAR) в конъюгате антитела и лекарственного средства в результате реакции сочетания можно охарактеризовать обычными способами, например, масс-спектрометрией, ВЭЖХ и ELISA. С помощью указанных способов можно определить количественное распределение конъюгата антитела и лекарственного средства по значению у.

2. Сокращения.

МС = 6-малеимидогексаноил

VC = валин-цитруллин

РАВ = п-аминобензилоксикарбонил

ММАЕ = монометилауристатин Е (молекулярная масса 718)

MMAF = вариант монометилауристатина Е, имеющий фенилаланин на С-конце молекулы (молекулярная масса 731,5)

Примеры ниже иллюстрируют дальнейшее описание настоящего изобретения, но указанные примеры не ограничивают объем настоящего изобретения. Экспериментальные способы с неопределенными условиями в примерах настоящего изобретения обычно следуют обычным условиям, таким как представлены в Антитела: Лабораторное руководство и Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, Колд-Спринг-Харбор (Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных материалов или товаров. Реагенты с неопределенными источниками представляют собой обычные реагенты, приобретенные на рынке.

Пример 1: Получение антигена и создание стабильной клеточной линии

Последовательность, кодирующую человеческий В7-Н4 с меткой his (huB7-H4-His), и последовательность, кодирующую человеческий В7-Н4 с меткой Fc (huB7-H4-Fc), получали с помощью интегрированной технологии ДНК (IDT) CRO (все матричные последовательности вышеупомянутых рекомбинантных белков В7-Н4 получали в соответствии с настоящим изобретением) и соответственно клонировали в векторы рТТ5 (Biovector). После того, как рекомбинантные белки В7-Н4 экспрессировали в клетках 293Т, их очищали следующими экспериментальными способами, и очищенные белки можно было использовать в следующих экспериментах примеров.

Последовательность huB7-H4-His:

Последовательность huB7-H4-Fc:

Этапы очистки huB7-H4-His:

Образец супернатанта экспрессии клеток HEK293 центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей. Буфер заменяли на PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и добавляли имидазол до конечной концентрации 5 ммоль/л. Колонку с никелем уравновешивали раствором PBS, содержащим 5 ммоль/л имидазола, и промывали от 2 до 5 объемами колонки. Образец супернатанта, полученный после замены, загружали в колонку. Колонку промывали раствором PBS, содержащим 5 ммоль/л имидазола, до тех пор, пока показание А280 не падало до исходного уровня. Затем хроматографическую колонку промывали PBS + 10 ммоль/л имидазола для удаления неспецифически связанных белковых примесей, и эффлюент собирали. Целевой белок элюировали раствором PBS, содержащим 300 ммоль/л имидазола, и собирали пик элюирования. Собранный элюат дополнительно очищали ионным обменом (колонка SP). Получение раствора А: 0,01 моль/л РВ, рН 8,0. Получение раствора В: раствор А + 1 моль/л NaCl. Сначала раствор имидазола в PBS с элюированным целевым белком заменяли раствором А, колонку SP уравновешивали с помощью раствора А и загружали образец. Градиент концентрации раствора В составлял от 0 до 100%. Образец элюировали 10-кратным объемом колонки и собирали каждый пик элюирования. Полученный белок идентифицировали как правильный с помощью электрофореза, пептидной карты и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), а затем разделяли на аликвоты для применения.

Этапы очистки huB7-H4-Fc:

Образец супернатанта экспрессии клеток HEK293 центрифугировали на высокой скорости для удаления примесей. Буфер заменяли на PBS. Аффинную колонку с протеином А уравновешивали 10 ммоль/л буфером PBS и промывали от 2 до 5 объемами колонки. Образец супернатанта, полученный после замены, загружали в колонку. Колонку промывали буфером 25-кратным объемом колонки, до тех пор, пока показание А280 не падало до исходного уровня. Целевой белок элюировали 0,8% ацетатным буфером с рН 3,5, и собирали пики элюирования. После разделения на аликвоты сразу же добавляли 1 моль/л буфер Трис-Cl с рН 8,0 для нейтрализации. Затем раствор заменяли на PBS, рН 6,9, применяя фильтровальную колонку Millipore Amico-15. Полученный белок идентифицировали электрофорезом, пептидной картой и жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией (ЖХ-МС), а затем разделяли на аликвоты для применения.

Получение стабильного пула клеток CHO-S:

Полноразмерные последовательности, кодирующие белок В7-Н4 человека или яванского макака (huB7-Н4 или суВ7-Н4), получали с помощью интегрированной технологии ДНК (IDT) (все матричные последовательности вышеупомянутых рекомбинантных белков В7-Н4 получали в соответствии с настоящим изобретением) и соответственно клонировали в модифицированный вектор pcDNA3.1, pcDNA3.1/puro (Invitrogen #V79020). Клетки CHO-S (АТСС) культивировали в среде CD-CHO (Life Technologies, #10743029) до 0,5×10⁶ клеток/мл. 10 мкг вектора, кодирующего ген huB7-Н4 или суВ7-Н4, смешивали с 50 мкл LF-LTX (Life Technologies, #А12621) в 1 мл среды Opti-МЕМ (Life Technologies, #31985088). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут и добавляли в культуральную среду клеток СНО. Клетки помещали в инкубатор с диоксидом углерода для культивирования. Через 24 часа культуральную среду заменяли новой средой и добавляли 10 мкг/мл пуромицина. После этого культуральную среду заменяли новой средой каждые 2-3 дня, и стабильный пул клеток CHO-S получали через 10-12 дней отбора.

Пример 2: Получение гибридомы мыши и последовательностей антител.

Всего 5 самок мышей Balb/c и 5 самок мышей А/J в возрасте 10 недель иммунизировали человеческим антигеном huB7-H4-Fc. Применяли полный адъювант Фрейнда (CFA) Sigma и неполный адъювант Фрейнда (IFA) Sigma. Иммуноген и иммунный адъювант полностью смешивали и эмульгировали в соотношении 1:1 для получения стабильной жидкости типа "вода в масле". Доза инъекции составляла 25 мкг/200 мкл/мышь.

День 01: первая иммунизация, полный адъювант Фрейнда.

День 21: Вторая иммунизация, неполный адъювант Фрейнда.

День 35: Третья иммунизация, неполный адъювант Фрейнда.

День 42: Забор крови и определение титра сыворотки (кровь после 3 иммунизации).

День 49: Четвертая иммунизация, неполный адъювант Фрейнда.

День 56: Забор крови и определение титра сыворотки (кровь после 4 иммунизации).

Непрямой способ ELISA применяли для определения аффинности антитела или сыворотки: белок huB7-H4-His разбавляли до концентрации 1 мкг/мл с помощью PBS при значении рН 7,4 и добавляли в концентрации 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет высокоаффинной ELISA и хранили в холоде при 4°С для инкубации в течение ночи (от 16 до 20 часов). Планшет промывали 4 раза PBST (PBS при значении рН 7,4, содержащий 0,05% Tween-20). Добавляли блокирующий раствор 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), разбавленный PBST, в количестве 150 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа для блокирования. После завершения блокирования блокирующий раствор удаляли, и планшет промывали 4 раза буфером PBST. Антитело или сыворотку, подлежащие тестированию, разбавляли PBST, содержащим 3% BSA, для получения градиента из 10 доз (10-кратное разведение), начиная с 1 мкмоль/л, и добавляли в микротитровальный планшет в количестве 100 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения инкубации планшет промывали 4 раза PBST, добавляли меченное HRP (пероксидаза хрена) вторичное антитело козы против человека (Abcam, номер по каталогу ab97225), разбавленное PBST, содержащим 3% BSA, в количестве 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет промывали 4 раза PBST, затем добавляли хромогенный субстрат ТМВ (тетраметилбензидиновый) (Cell Signaling Technology, номер по каталогу 7004S) в количестве 100 мкл/лунку и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 1 минуты. Стоп-раствор (Cell Signaling Technology, номер по каталогу 7002S) добавляли в количестве 100 мкл/лунку для прекращения реакции. Величину поглощения считывали при 450 нм с помощью микропланшетного считывающего устройства (BioTek, модель Synergy H1). Данные анализировали для определения аффинности связывания антитела или сыворотки с человеческим антигеном В7-Н4.

Титр сыворотки и способность иммунизированной мышиной сыворотки связываться с антигенами клеточной поверхности оценивали с помощью непрямого способа ELISA. Слияние клеток выполняли в соответствии с результатами определения титра (более чем 100000-кратное разведение). Иммунизированных мышей с высоким титром сыворотки, аффинностью и связыванием FACS отбирали для одной последней иммунизации и затем умерщвляли. Клетки селезенки и клетки миеломы SP2/0 сливали и высевали для получения гибридом. Целевые гибридомы подвергали скринингу с помощью непрямого анализа ELISA, а штаммы моноклональных клеток определяли способом ограниченного разведения. Среди полученных положительных штаммов антител штаммы гибридом, экспрессирующие неспецифические связывающие антитела, дополнительно исключали путем сравнения клеток CHO-S, стабильно экспрессирующих huB7-Н4 и суВ7-Н4, с пустыми клетками CHO-S. Целевые гибридомы подвергали скринингу с применением способов, аналогичных способам эксперимента по связыванию клеток in vitro в Примере 5, и определяли их как штаммы моноклональных клеток способом ограниченного разведения. Собирали гибридомные клетки в логарифмической фазе роста. РНК экстрагировали тризолом (Invitrogen, 15596-018) и проводили обратную транскрипцию (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara #2680A). кДНК, полученную обратной транскрипцией, амплифицировали с помощью ПЦР с набором мышиных Ig-праймеров (Novagen, ТВ326 Rev.B 0503) и секвенировали. Наконец, последовательности 4 штаммов мышиных антител получали для гуманизации и создания конъюгатов антитела и лекарственного средства.

Последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2G6 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2G6 содержат следующие последовательности CDR:

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2F7 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2F7 содержат следующие последовательности CDR:

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2F8 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 2F8 содержат следующие последовательности CDR:

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 1С9 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 1С9 содержат следующие последовательности CDR:

Пример 3: Эксперимент по гуманизации мышиных антител

Гуманизацию мышиных моноклональных антител к В7-Н4 человека проводили с применением способов, известных из многих публикаций в данной области техники. Кратко, родительские константные домены (мышиные антитела) заменяли константными доменами человека. В настоящем изобретении последовательности антител зародышевой линии человека выбирали в соответствии с гомологией между антителами мыши и антителами человека, и мышиные антитела 2G6, 2F7, 2F8 и 1С9 гуманизировали. Области CDR мышиных антител 2G6 и 2F7 были привиты к выбранным соответствующим гуманизированным матрицам для замены гуманизированных вариабельных областей, а затем рекомбинированы с константной(ыми) областью(ями) IgG (предпочтительно, IgG1 для тяжелой цепи и к для легкой цепи). Затем, на основе трехмерной структуры мышиных антител, внедренные остатки, остатки, непосредственно взаимодействующие с областями CDR, и остатки, оказывающие значительное влияние на конформацию VL и VH, подвергали обратной мутации, и химически нестабильные аминокислотные остатки областей CDR оптимизировали, причем HCDR1 мышиного моноклонального антитела 2F8 оптимизировали до GYTFTSSWMN (SEQ ID NO: 43), HCDR2 оптимизировали до GIYPNRGNIEY NEKFKG (SEQ ID NO: 44), HCDR2 мышиного моноклонального антитела 1C9 оптимизировали до YLNRGS (SEQ ID NO: 45), и получали сконструированные гуманизированные антитела, содержащие следующую комбинацию последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела hu2G6 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела hu2F7 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела hu2F8 представлены далее:

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела hu1C9 представлены далее:

Вариабельные области рекомбинировали с константной(ыми) областью(ями) IgG (предпочтительно, IgG1 для тяжелой цепи и к для легкой цепи). Иллюстративные последовательности константных областей тяжелой и легкой цепи показаны ниже.

После связывания получали гуманизированные антитела, состоящие из следующих иллюстративных последовательностей легкой и тяжелой цепей:

Пример 4: Экспрессия гуманизированных антител к В7-Н4

Рекомбинантный вектор сконструировали в соответствии с последовательностями гуманизированных антител. Вектор тяжелой цепи сконструировали следующим образом: сигнальный пептид плюс гуманизированная тяжелая цепь. Вектор легкой цепи сконструировали следующим образом: сигнальный пептид плюс гуманизированная легкая цепь.

Вышеуказанные последовательности были вставлены в вектор рСЕР4 (ThermoFisher #V04450). Вектор экспрессии синтезировали в соответствии с описанной выше схемой. Векторную плазмиду получали и экстрагировали в большом количестве и секвенировали для проверки. Отвечающую условиям плазмиду транс фи пировали в клетки 293F человека (ThermoFisher #R79007) с помощью PEI (ThermoFisher #BMS1003-A). Клетки 293F непрерывно культивировали в бессывороточной среде (Shanghai ОРМ Biosciences, ОРМ-293 CD03) до логарифмической фазы роста и применяли для трансфекции клеток. 21,4 мкг плазмиды легкой цепи гуманизированного антитела и 23,6 мкг плазмиды тяжелой цепи гуманизированного антитела растворяли в 10 мл Opti-MEM® I восстановленной сывороточной среды (GIBCO, 31985-070) и хорошо перемешивали, затем добавляли 200 мкг PEI и хорошо перемешивали, инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин. Затем добавляли 50 мл клеток. Условия культивирования клеток: 5% СО₂, 37°С, 125 об/мин. Во время культивирования добавляли добавки в день 1 и день 3 до тех пор, пока жизнеспособность клеток не достигала менее 70%. Супернатант клеток собирали, центрифугировали и фильтровали. Центрифугированную и профильтрованную среду для культивирования клеток загружали в аффинную колонку для очистки антител. Колонку промывали фосфатным буфером. Образец элюировали глицингидрохлоридным буфером (рН 2,7, 0,1 моль/л Gly-HCl), нейтрализовали 1 моль/л трис гидрохлоридом, рН 9,0, и подвергали диализу против фосфатного буфера, чтобы наконец получить очищенное гуманизированное антитело, которое можно применять в экспериментах каждого примера.

Примеры 5: Определение связывающей способности гуманизированных антител in vitro

Сконструированные гуманизированные антитела протестировали в экспериментах in vitro следующим образом:

1. Эксперимент по связыванию клеток in vitro:

Культивированные клетки МХ-1, экспрессирующие человеческий В7-Н4 (CLS Cell Lines Service GmbH #300296), собирали, плотность клеток доводили с помощью PBS при рН 7,4, и клетки высевали на 96-луночный планшет с V-образным дном при плотности 1×10⁵ клеток на лунку. Планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут и супернатант удаляли. 100 мкл градиентно разведенного раствора гуманизированного антитела (разбавленного PBS, содержащим 0,5% BSA, начиная с 1 мкмоль/л, 3-кратный градиент из 10 доз) добавляли в каждую лунку, хорошо перемешивали и инкубировали при 4°С на шейкере в течение 1 часа. Планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут и супернатант удаляли. Клетки дважды промывали PBS. 100 мкл меченного FITC козьего вторичного антитела против человека (Abeam, номер по каталогу ab97224), разведенного 0,5% BSA в PBS, добавляли в каждую лунку, хорошо перемешивали и инкубировали в течение 30 минут при 4°С на шейкере. Планшет центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут и супернатант удаляли. Клетки дважды промывали PBS и затем ресуспендировали в PBS. Сигнал детектировали с помощью проточного цитометра (BECKMAN COULTER, модель DxFLEX) и строили кривую концентрации для анализа результатов. Результаты представлены в таблице 1. Оба гуманизированных антитела hu2G6 и hu2F7 положительно связываются с клетками МХ-1 с высокой экспрессией В7-Н4.

2. Эксперимент по аффинности и кинетике:

Способ Biacore представляет собой общепризнанный способ объективного определения аффинности и кинетики между белками. Аффинность и кинетику связывания антител, подлежащих тестированию, по настоящему изобретению анализировали с помощью Biacore Т200 (GE). Антитела к В7-Н4, подлежащие тестированию, по настоящему изобретению ковалентно связывали с чипами СМ5 (GE) с применением набора, предоставленного Biacore, и стандартного способа амино-сочетания NHS. Затем вводили инъекцией 50 нмоль/л человеческого белка huB7-H4-His, разведенного в том же буфере, при скорости потока 10 мкл/мин. После инъекции все образцы регенерировали с помощью регенерирующего реагента из набора. Кинетику связывания антиген-антитело отслеживали в течение 3 минут, а кинетику диссоциации отслеживали в течение 10 минут. Полученные данные анализировали с применением модели связывания 1:1 (Langmuir-Ленгмюр) с применением программного обеспечения BIAevaluation от GE. Данные кинетики и аффинности гуманизированных антител, рассчитанные указанным способом, представлены в таблице 2. Все гуманизированные антитела hu2G6, hu2F7, hu2F8 и hu1C9 демонстрируют высокую аффинность к белку антигена В7-Н4 человека.

Пример 6: Эндоцитоз антител к В7-Н4

Чтобы проверить, могут ли антитела по настоящему изобретению подвергаться эндоцитозу вместе с человеческим В7-Н4 после связывания с В7-Н4, для оценки применяли клетки МХ-1. Клетки МХ-1 обрабатывали трипсином (сначала промывали PBS один раз при 37°С в течение примерно 2 мин), собирали и ресуспендировали в предварительно охлажденном буфере FACS. Концентрацию клеток доводили до 1×10⁶ клеток/мл. 1 мл клеточной суспензии добавляли в пробирку типа Эппендорф, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут и удаляли супернатант. Для ресуспендирования клеток добавляли 1 мл полученного антитела, подлежащего тестированию, и конечная концентрация антитела составляла 20 мкг/мл. Клетки инкубировали на шейкере при 4°С в течение 1 часа, центрифугировали и супернатант отбрасывали (4°С, 1500 об/мин × 5 мин). Клетки дважды промывали буфером FACS и супернатант удаляли. В каждую пробирку добавляли 100 мкл рабочего раствора флуоресцентных вторичных антител для ресуспендирования клеток. Клетки инкубировали на шейкере при 4°С в течение 30 мин, центрифугировали и супернатант отбрасывали (4°С, 1500 об/мин × 5 мин). Клетки дважды промывали буфером FACS и супернатант удаляли. 1,0 мл предварительно нагретой полной среды для клеток МХ-1 добавляли в каждую пробирку для ресуспендирования клеток и перемешивали. Суспензию клеток разделяли на аликвоты на 4 пробирки по 200 мкл на пробирку, которые представляли собой соответственно группу 0 минут, контрольную группу, группу 30 минут и группу 2 часа. Группы 0 минут и контрольную группу помещали на лед, в то время как другие группы помещали в инкубатор при 37°С для эндоцитоза на 30 минут и 2 часа соответственно. В соответствующий момент времени пробирку типа Эппендорф извлекали и помещали на лед для предварительного охлаждения на 5 мин. Все группы обработки центрифугировали, и супернатант отбрасывали (4°С, 1500 об/мин × 5 мин). Клетки один раз промывали буфером FACS и супернатант удаляли. 250 мкл стрип-буфера добавляли в пробирки типа Эппендорф всех групп обработки, кроме группы 0 минут, и инкубировали в течение 8 мин при комнатной температуре. Клетки центрифугировали и супернатант удаляли (4°С, 1500 об/мин × 5 мин). Клетки дважды промывали буфером FACS и супернатант удаляли. Во все группы обработки добавляли 100 мкл фиксатора для иммуноокрашивания, помещали при 4°С более чем на 30 мин и оценивали проточным цитометром DxFlex. Процент эндоцитоза В7-Н4 антитела (%) = (среднее значение интенсивности флуоресценции в каждый момент времени - среднее значение интенсивности флуоресценции контрольной группы)/(среднее значение интенсивности флуоресценции в нулевой точке - среднее значение интенсивности флуоресценции контрольной группы)×100%. Данные представлены в таблице 3:

Пример 7: Конъюгация антител с MC-MMAF

Антитела по настоящему изобретению обладают активностью аффинности к клеткам и активностью эндоцитоза, что делает их пригодными для сочетания с лекарственными средствами с образованием конъюгатов антитела и лекарственного средства для лечения заболеваний, опосредованных В7-Н4. Процесс сочетания показан в следующем уравнении, где Ab представляет собой hu2G6 или hu2F7:

На первом этапе S-(3-гидроксипропил)тиоацетат (0,7 мг, 5,3 моль) растворяли в 0,9 мл ацетонитрила с образованием раствора для последующего применения. Вышеуказанный заранее полученный раствор S-(3-гидроксипропил)тиоацетата в ацетонитриле добавляли к антителу в буфере ацетат/ацетат натрия при значении рН 4,3 (10,35 мг/мл, 9,0 мл, 0,97 моль). Затем к реакционной смеси по каплям добавляли 1,0 мл водного раствора цианоборгидрида натрия (14,1 мг, 224 моль), и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 2 часов. После завершения реакции реакционную смесь обессоливали и очищали с применением гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) с получением раствора продукта 1f. Раствор концентрировали до 10 мг/мл и непосредственно применяли в следующей реакции.

На втором этапе к раствору 1f (11,0 мл) добавляли 0,35 мл 2,0 моль/л раствора гидрохлорида карбоксиамина и проводили реакцию при встряхивании при 25°С в течение 30 минут. Затем реакционный раствор обессоливали и очищали с применением гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) с получением раствора продукта 2f (концентрация 6,17 мг/мл, 14,7 мл).

На третьем этапе соединение MC-MMAF (1,1 мг, 1,2 моль, полученное способом, описанным в патенте РСТ WO 2005081711) растворяли в 0,3 мл ацетонитрила, добавляли в раствор 2f (концентрация 6,17 мг/мл, 3,0 мл) и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 4 часов. Затем реакционный раствор обессоливали и очищали гелевой колонкой Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях с фильтром для получения продукта конъюгата Ab-MC-MMAF - антитела и лекарственного средства в буфере PBS (3,7 мг/мл, 4,7 мл), который охлаждали при 4°С. Среднее значение у продукта hu2G6-MC-MMAF, определенное с помощью HIC (хроматографии гидрофобного взаимодействия)-ВЭЖХ, составляло 3,8, и образцы hu2G6-MC-MMAF (у=4) были получены с помощью очистки HIC-ВЭЖХ. Среднее значение у продукта hu2F7-MC-MMAF, определенное с помощью HIC-ВЭЖХ, составляло 3,2, и образцы hu2F7-MC-MMAF (у=2) и hu2F7-MC-MMAF (у=4) были получены с помощью очистки HIC-ВЭЖХ.

Пример 8: Конъюгация антител с SN-38

Лекарственные средства, конъюгированные с антителами, получали с помощью следующего способа сочетания, где Ab представляет собой hu2F7:

На первом этапе S-(3-гидроксипропил)тиоацетат (0,7 мг, 5,3 моль) растворяли в 0,9 мл ацетонитрила с образованием раствора для последующего применения. Вышеуказанный заранее полученный раствор S-(3-гидроксипропил)тиоацетата в ацетонитриле добавляли к антителу в буфере ацетат/ацетат натрия при значении рН 4,3 (10,35 мг/мл, 9,0 мл, 0,97 моль). Затем к реакционной смеси по каплям добавляли 1,0 мл водного раствора цианоборгидрида натрия (14,1 мг, 224 моль), и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 2 часов. После завершения реакции реакционную смесь обессоливали и очищали с применением гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) с получением раствора продукта 1h. Раствор концентрировали до 10 мг/мл и непосредственно применяли в следующей реакции.

На втором этапе к раствору 1h (11,0 мл) добавляли 0,35 мл 2,0 моль/л раствора гидрохлорида карбоксиамина и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 30 минут. Затем реакционный раствор обессоливали и очищали с применением гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) с получением раствора продукта 2h (концентрация 6,2 мг/мл, 15,0 мл). Раствор 2h концентрировали до примерно 10 мг/мл и применяли в следующей реакции.

На третьем этапе соединение MC-VC-PAB-SN-38 (1,3 мг, 1,2 моль) растворяли в 0,3 мл ацетонитрила, добавляли в раствор 2h (концентрация 6,2 мг/мл, 3,0 мл) и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 4 часов. Затем реакционный раствор обессоливали и очищали гелевой колонкой Sephadex G25 (фаза элюирования: 0,05 моль/л раствор PBS при значении рН 6,5) и фильтровали в стерильных условиях с фильтром для получения продукта конъюгата антитела и лекарственного средства hu2F7-SN-38 в буфере PBS (3,7 мг/мл, 4,7 мл), который охлаждали при 4°С. Среднее значение у определяли ультрафиолетовым способом. Кюветы, заполненные сукцинатным буфером, помещали в контрольную абсорбционную ячейку и в абсорбционную ячейку для определения образца, соответственно, и после вычета контрольного растворителя, кюветы, заполненные исследуемым раствором, помещали в абсорбционную ячейку для определения образца. Измеряли оптическую плотность при 280 нм и 370 нм.

Обработка данных:

Содержание антител C_mab определяли путем построения стандартной кривой и измерения поглощения (абсорбции) при длине волны 280 нм. Содержание малых молекул C_Drug определяли путем измерения поглощения на длине волны 370 нм.

Средняя нагрузка лекарственным средством у=C_Drug/C_mab

Среднее значение у=3,7 продукта hu2F7-SN-38 определяли описанным выше способом. Образцы hu2F7-SN-38 (у=4) получали с помощью очистки УФ-ВЭЖХ.

Пример 9: Конъюгация антител с Экзатеканом

На первом этапе 2а (2 г, 17,2 ммоль) растворяли в 75 мл ацетонитрила и последовательно добавляли карбонат калия (9,27 г, 67,2 ммоль), бензилбромид (20 мл, 167,2 ммоль) и йодид тетрабутиламмония (620 мг, 1,68 ммоль). Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов и фильтровали через диатомовую землю. Осадок на фильтре промывали этилацетатом (20 мл). Фильтрат объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле с проявляющей системой растворителей С с получением продукта 5а (3,2 г, выход: 90,1%).

На втором этапе 5а (181,3 мг, 0,879 ммоль) и 4b (270 мг, 0,733 ммоль) добавляли в реакционную колбу, добавляли 6 мл тетрагидрофурана и трижды заменяли аргоном. Реакционную смесь охлаждали до температуры от 0 до 5°С на ледяной бане и добавляли трет-бутоксид калия (164 мг, 1,46 ммоль), затем нагревали до комнатной температуры, удаляя ледяную баню, и перемешивали в течение 40 минут. К реакционной смеси добавляли 15 мл ледяной воды и экстрагировали этилацетатом (40 мл × 2) и хлороформом (20 мл × 5). Органические фазы объединяли и концентрировали. Полученные остатки растворяли в 6 мл диоксана, добавляли 3 мл воды, бикарбонат натрия (73,8 мг, 0,879 ммоль) и 9-флуоренметилхлорформиат (190 мг, 0,734 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. К реакционному раствору добавляли 30 мл воды и экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3). Органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл), сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученные остатки очищали колоночной хроматографией на силикагеле с проявляющей системой растворителей С с получением продукта 5b бензил 10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундец-11-ат (73 мг, выход: 19,4%).

MC m/z (ESI): 515,0 [М+1].

На третьем этапе 5b (30 мг, 0,058 ммоль) растворяли в 6,75 мл смешанного растворителя тетрагидрофурана и этилацетата (об.:об.=2:1) с добавлением палладия на угле (18 мг, содержание 10%, сухая основа), трижды заменяли водородом и реакцию проводили при перемешивании при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор фильтровали с диатомовой землей. Осадок на фильтре промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали с получением неочищенного продукта 5 с 10-циклопропил-1-(9Н-флуорен-9-ил)-3,6-диоксо-2,9-диокса-4,7-диазаундец-11-кислоты (20 мг), который непосредственно применяли в следующей реакции без очистки.

МС m/z (ESI): 424,9 [М+1].

На четвертом этапе 1b (15 мг, 28,2 мкмоль) добавляли в реакционную колбу, добавляли 1,5 мл N,N-диметилформамида и трижды заменяли аргоном. Реакционную смесь охлаждали до температуры от 0 до 5°С на ледяной бане, добавляли каплю триэтиламина, добавляли неочищенный продукт 5 с (20 мг, 47,1 мкмоль), добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилхлорморфолин (25,4 мг, 86,2 мкмоль) и реакцию проводили при перемешивании на ледяной бане в течение 40 минут. К реакционной смеси добавляли 15 мл воды и экстрагировали этилацетатом (20 мл × 3). Органические фазы объединяли. Органические фазы промывали насыщенным раствором хлорида натрия (20 мл × 2), сушили с применением безводного сульфата натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученные остатки очищали тонкослойной хроматографией с системой проявляющих растворителей В с получением указанного в заголовке продукта 5d (9Н-флуорен-9-ил)метил(2-(((1-циклопропил-2-(((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолозино[1,2-b]хинолин-1-ил)амино)-2-оксоэтокси)метил)амино)-2-оксоэтил)карбамата (23,7 мг, выход: 78,9%).

MC m/z (ESI): 842,1 [М+1].

На пятом этапе 5d (30 мг, 35,7 мкмоль) растворяли в 3 мл дихлорметана, добавляли 1,5 мл диэтиламина и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, добавляли 1,5 мл толуола и концентрировали при пониженном давлении, повторяя дважды. К остаткам добавляли 4,5 мл н-гексана и измельчали. После выдерживания супернатант сливали, а твердое вещество оставляли. Твердые остатки концентрировали при пониженном давлении и сушили насосом с получением неочищенного продукта 5е 2-((2-аминоацетамидо)метокси)-2-циклопропил-N-((1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1Н,12Н-бензо[де]пирано[3',4':6,7]индолозино[1,2-b]хинолин-1-ил)ацетамида (23 мг), который непосредственно применяли в следующей реакции без очистки.

МС m/z (ESI): 638,0 [М+18].

На шестом этапе неочищенный продукт 5е (20 мг, 32,3 мкмоль) растворяли в 1 мл N,N-диметилформамида и трижды заменяли аргоном. Реакционную смесь охлаждали до температуры от 0 до 5°С на ледяной бане, добавляли 0,5 мл раствора N,N-диметилформамида 4g (31,8 мг, 67,3 мкмоль), добавляли 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилхлорморфолин (27,8 мг, 94,3 мкмоль) и реакцию проводили при перемешивании на ледяной бане в течение 10 минут. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, удаляя ледяную баню, и реакцию проводили при перемешивании в течение 1 часа с получением соединения 5. Реакционный раствор очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией (условия разделения: колонка: XBridge Prep С18 OBD 5 мкм 19 × 250 мм, подвижная фаза: А-вода (10 ммоль NH₄OAC): В-ацетонитрил, градиентное элюирование, скорость потока: 18 мл/мин). Соответствующие компоненты собирали и концентрировали при пониженном давлении с получением продуктов 5-А и 5-В (3,6 мг, 2,6 мг).

МС m/z (ESI): 1074,4 [М+1].

Соединение одиночной конфигурации 5-А (более короткое время удерживания) Анализ ультраэффективной жидкостной хроматографии (УЭЖХ): время удерживания 1,14 минуты, чистота: 85% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,60 (t, 1Н), 8,51-8,49 (d, 1Н), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,96 (m, 1H), 7,82-7,75 (m, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,26-7,15 (m, 4Н), 6,99 (s, 1H), 6,55-6,48 (m, 1H), 5,65-5,54 (m, 1H), 5,41 (s, 2Н), 5,35-5,15 (m, 3Н), 4,74-4,62 (m, 2Н), 4,54-4,40 (m, 2Н), 3,76-3,64 (m, 4Н), 3,62-3,48 (m, 2Н), 3,20-3,07 (m, 2Н), 3,04-2,94 (m, 2Н), 2,80-2,62 (m, 2Н), 2,45-2,30 (m, 3Н), 2,25-2,15 (m, 2Н), 2,15-2,04 (m, 2Н), 1,93-1,78 (m, 2Н), 1,52-1,39 (m, 3Н), 1,34-1,12 (m, 5Н), 0,87 (t, 3Н), 0,64-0,38 (m, 4Н).

Соединение одиночной конфигурации 5-В (более длительное время удерживания):

Анализ ультраэффективной жидкостной хроматографии (УЭЖХ): время удерживания 1,16 минуты, чистота: 89% (колонка: ACQUITY UPLC ВЕНС18 1,7 мкм 2,1 × 50 мм, подвижная фаза: А-вода (5 ммоль NH₄OAC), В-ацетонитрил).

¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆): δ 8,68-8,60 (m, 1Н), 8,58-8,50 (m, 1Н), 8,32-8,24 (m, 1Н), 8,13-8,02 (m, 2Н), 8,02-7,94 (m, 1Н), 7,82-7,75 (m, 1Н), 7,31 (s, 1Н), 7,26-7,13 (m, 4Н), 6,99 (s, 1Н), 6,55-6,48 (m, 1Н), 5,60-5,50 (m, 1Н), 5,41 (s, 2Н), 5,35-5,15 (m, 3Н), 4,78-4,68 (m, 1Н), 4,60-4,40 (m, 2Н), 3,76-3,58 (m, 4Н), 3,58-3,48 (m, 1Н), 3,20-3,10 (m, 2Н), 3,08-2,97 (m, 2Н), 2,80-2,72 (m, 2Н), 2,45-2,30 (m, 3Н), 2,25-2,13 (m, 2Н), 2,13-2,04 (m, 2Н), 2,03-1,94 (m, 2Н), 1,91-1,78 (m, 2Н), 1,52-1,39 (m, 3Н), 1,34-1,12 (m, 5Н), 0,91-0,79 (m, 3Н), 0,53-0,34 (m, 4Н).

Способы получения других промежуточных продуктов связаны со способами получения промежуточного соединения 5.

Забуференный PBS водный раствор антитела hu2F7 (0,05 моль/л, забуференный PBS водный раствор при значении рН 6,5, 7,3 мл, 13,8 мг/мл, 0,681 мкмоль) добавляли к полученному водному раствору трис(2-карбоксиэтил)фосфина (10 ммоль/л, 0,347 мл, 3,47 мкмоль) при 37°С. Реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней и реакцию проводили при встряхивании при 37°С в течение 3 часов. Реакцию прекращали, и реакционный раствор охлаждали до 25°С на водяной бане, разбавляли до 14,0 мл и отбирали 3,3 мл раствора для следующей реакции.

Соединение 5-А (3,0 мг, 3,72 мкмоль) растворяли в 0,15 мл ДМСО (диметилсульфоксид) и добавляли к 3,3 мл вышеуказанного раствора. Реакционную смесь помещали в шейкер с водяной баней и реакцию проводили при встряхивании при 25°С в течение 3 часов. Реакцию останавливали. Реакционный раствор обессоливали и очищали с применением гелевой колонки Sephadex G25 (фаза элюирования: водный раствор, забуференный 0,05 моль/л PBS, рН 6,5, содержащий 0,001 моль/л ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)), чтобы получить иллюстративный продукт Ab-Экзатекан, hu2F7-Экзатекан (соединение 34) в буфере PBS (1,35 мг/мл, 13 мл), который хранили при 4°С. Среднее значение у определяли ультрафиолетовым способом. Кюветы, заполненные сукцинатным буфером, помещали соответственно в контрольную абсорбционную ячейку и в абсорбционную ячейку для определения образца, и после вычета контрольного растворителя, кюветы, заполненные исследуемым раствором, помещали в абсорбционную ячейку для определения образца. Измеряли оптическую плотность при 280 нм и 370 нм.

Обработка данных:

Содержание антител C_mab определяли путем построения стандартной кривой и измерения поглощения при длине волны 280 нм. Содержание малых молекул C_Drug определяли путем измерения поглощения на длине волны 370 нм.

Средняя нагрузка лекарственным средством у=C_Drug/C_mab

В отношении иллюстративного продукта hu2F7-Экзатекан (соединение 34), у определяли как 7,6 с помощью вышеуказанного способа. Образцы hu2F7-Экзатекан (у=8) получали с помощью очистки УФ-ВЭЖХ.

Способы получения конъюгатов других антител связаны со способом получения соединения 34.

Пример 10: активность конъюгатов антитела и лекарственного средства в отношении уничтожения опухолевых клеток.

Чтобы проверить эффект уничтожения опухолевых клеток у конъюгатов антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению, для оценки применяли клетки рака молочной железы МХ-1. Клетки МХ-1 собирали, центрифугировали и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 0,44×10⁶ клеток/мл с полной средой, и клетки помещали в 60 лунок белого 96-луночного планшета по 90 мкл на лунку с количеством клеток 40 000. В остальные периферические лунки добавляли 100 мкл PBS. Планшет с клетками помещали в инкубатор при температуре 37°С, 5% СО₂ и культивировали в течение ночи. На второй день эксперимента раствор конъюгата антитела и лекарственного средства получали, добавляя PBS, в 96-луночном планшете с V-образным дном, начиная с концентрации 1000 нМ (3-кратное разведение и 9 концентраций). После завершения получения раствор добавляли в белый 96-луночный планшет по 10 мкл на лунку в двух экземплярах. Планшет с клетками помещали в инкубатор при температуре 37°С, 5% CO₂ и культивировали в течение 72 часов. На пятый день эксперимента планшет детектировали и прочитывали. Планшет с культурой клеток извлекали. Делали две контрольные лунки. В каждую лунку добавляли 100 мкл среды, содержащей 40000 клеток, и после уравновешивания до комнатной температуры в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора CTG (Promega G7573). Смесь встряхивали и перемешивали, помещали в темноту и оставляли на 10 минут, а затем детектировали с помощью программы люминесценции считывающего устройства для микропланшетов. Максимальная степень уничтожения = (1 - значение флуоресценции 1000 нмоль/л лунки / значение флуоресценции контрольной лунки)%. Результаты экспериментов показаны в таблице 4:

Пример 11: Ингибирующее действие конъюгатов антитела и лекарственного средства на рост опухолевых клеток.

Клетки рака молочной железы SK-BR-3 (АТСС #НТВ30) применяли для проверки эффекта уничтожения опухолевых клеток конъюгатами антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению. Клетки SK-BR-3 собирали, центрифугировали и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 0,44×10⁶ клеток/мл с полной средой, и клетки помещали в 60 лунок белого 96-луночного планшета по 90 мкл на лунку с количеством клеток 40000. В остальные периферические лунки добавляли 100 мкл PBS. Планшет с клетками помещали в инкубатор при 37°С, 5% СО₂ и культивировали в течение ночи. На второй день эксперимента раствор конъюгата антитела и лекарственного средства получали, добавляя PBS, в 96-луночном планшете с V-образным дном, начиная с концентрации 1000 нМ (3-кратное разведение и 9 концентраций). После завершения получения раствор добавляли в белый 96-луночный планшет по 10 мкл на лунку в двух экземплярах. Делали две другие контрольные лунки, и в каждую лунку добавляли 10 мкл PBS. Планшет с клетками помещали в инкубатор при температуре 37°С, 5% CO₂, и культивировали в течение 72 часов. На пятый день эксперимента планшет детектировали и прочитывали. Планшет с культурой клеток извлекали. После уравновешивания до комнатной температуры в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора CTG (Promega G7573). Смесь встряхивали и перемешивали, помещали в темноту и оставляли на 10 минут, а затем детектировали с помощью программы люминесценции считывающего устройства для микропланшетов. Максимальная степень ингибирования = (1 - значение флуоресценции лунки 1000 нмоль/л / значение флуоресценции контрольной лунки)%. Результаты экспериментов показаны в Таблице 5:

Пример 12: Оценка in vivo эффективности конъюгатов антитела и лекарственного средства, конъюгированных с MMAF

После образования трансплантированных опухолей с клетками МХ-1 у мышей оценивали противоопухолевый эффект конъюгатов антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению. 5×10⁶ клеток МХ-1 вводили подкожно иммунодефицитным голым мышам (BALB/c Nude). Через 2 недели проводили внутривенную инъекцию конъюгатов антитела и лекарственного средства hu2G6-MC-MMAF и hu2F7-MC-MMAF с частотой один раз в неделю и в дозе 1,5 мг/кг или 3 мг/кг. В качестве контроля применяли белок IgG1 человека в дозе 3 мг/кг. В каждой группе контрольной группы или группы введения было по 5 мышей. Степень ингибирования опухоли рассчитывали путем измерения объема опухоли. Степень ингибирования опухоли = 100% - (объем опухоли в группе введения на 21 день - объем опухоли в группе введения в день 0)/(объем опухоли контрольной группы на 21 день - объем опухоли контрольной группы в день 0). Результаты экспериментов показаны на фиг. 1 и в таблице 6. Как hu2G6-MC-MMAF, так и hu2F7-MC-MMAF проявляют дозозависимый противоопухолевый эффект. Как hu2G6-MC-MMAF, так и hu2F7-MC-MMAF демонстрируют степень ингибирования опухоли более 100% при дозе 3 мг/кг, что означает, что конъюгаты антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению могут не только подавлять рост опухоли, но и также оказывают уничтожающее действие на уже образовавшуюся опухоль.

Пример 13: Оценка эффективности конъюгатов антитела и лекарственного средства in vivo при различных нагрузках лекарственным средством.

Для дальнейшего изучения конъюгатов антитела и лекарственного средства с различными нагрузками лекарственным средством конъюгаты антитела и лекарственного средства получали способом из примера 7 и очищали с помощью ВЭЖХ для получения hu2F7-MC-MMAF (у=2) и hu2F7-MC-MMAF (у=4) (фиг. 2). После образования трансплантированных опухолей с МХ-1 у мышей оценивали противоопухолевый эффект конъюгатов антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению. 5×10⁶ клеток МХ-1 вводили подкожно иммунодефицитным голым мышам. Через 2 недели проводили внутривенную инъекцию конъюгатов антитела и лекарственного средства hu2F7-MC-MMAF (у=2) и hu2F7-MC-MMAF (у=4) с частотой один раз в неделю и в дозе 3 мг/кг. В качестве контроля применяли белок IgG1 человека в дозе 3 мг/кг. В каждой группе контрольной группы или группы введения было по 5 мышей. Степень ингибирования опухоли рассчитывали путем измерения объема опухоли. Степень ингибирования опухоли = 100% - (объем опухоли в группе введения на 21 день - объем опухоли в группе введения в день 0)/(объем опухоли контрольной группы на 21 день - объем опухоли контрольной группы в день 0). Результаты экспериментов показаны на фиг. 3 и в таблице 7. Как hu2F7-MC-MMAF (у=2), так и hu2F7-MC-MMAF (у=4) проявляли противоопухолевый эффект. hu2F7-MC-MMAF (у=4) имеет более сильный противоопухолевый эффект, чем hu2F7-MC-MMAF (у=2) в дозе 3 мг/кг, показывая степень ингибирования опухоли более 100%, что означает, что hu2F7-MC-MMAF (у=4) может не только подавлять рост опухоли, но также оказывать уничтожающее действие на уже образовавшуюся опухоль (фиг. 4).

Пример 14: Оценка эффективности in vivo конъюгатов антитела и лекарственного средства, конъюгированных с Экзатеканом.

Для изучения конъюгатов антитела и лекарственного средства, конъюгированных с Экзатеканом, конъюгаты антитела и лекарственного средства получали способом из примера 9 и очищали с помощью ВЭЖХ с получением hu2F7-Экзатекан (соединение 34, у=8). После образования трансплантированных опухолей с МХ-1 у мышей оценивали противоопухолевый эффект конъюгатов антитела и лекарственного средства по настоящему изобретению. 5×10⁶ клеток МХ-1 вводили подкожно иммунодефицитным голым мышам. Через 2 недели проводили внутривенную инъекцию конъюгата антитела и лекарственного средства hu2F7-Экзатекан (у=8) с частотой один раз в неделю и в дозах 5 и 10 мг/кг. Белок IgG1 человека применяли в качестве контроля в дозе 5 мг/кг. В каждой группе контрольной группы или группы введения было по 5 мышей. Степень ингибирования опухоли рассчитывали путем измерения объема опухоли. Степень ингибирования опухоли = 100% - (объем опухоли в группе введения на 18 день - объем опухоли в группе введения в день 0)/(объем опухоли контрольной группы на 18 день - объем опухоли контрольной группы в день 0). Результаты экспериментов показаны в Таблице 8. hu2F7-Экзатекан показывает степень ингибирования опухоли более 100% при дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг, что означает, что hu2F7-Экзатекан (у=8) может не только подавлять рост опухоли, но и оказывает уничтожающее действие на уже образовавшуюся опухоль.

Пример 15: Изучение активности в отношении неспецифического цитолиза конъюгатов антитела и лекарственного средства, конъюгированных с Экзатеканом.

Чтобы изучить влияние конъюгатов антитела и лекарственного средства, конъюгированных с Экзатеканом, по настоящему изобретению, в отношении уничтожения В7-Н4-отрицательных клеток посредством неспецифического цитолиза, активность конъюгатов антитела и лекарственного средства в отношении уничтожения линии миеломных клеток с отрицательной экспрессией В7-Н4, определяли с помощью набора для определения люциферазы ONE-Glo™. Клетки МХ-1 собирали, центрифугировали, подсчитывали, доводили до клеточной суспензии 7,5×10⁶ клеток/мл с полной средой и высевали на белый 96-луночный планшет. 33 мкл суспензии клеток МХ-1 добавляли в каждую лунку в "смешанной группе клеток", и 33 мкл PBS добавляли в каждую лунку в "группе одиночных клеток". Собирали опухолевые клетки NCI-H929-LUC с отрицательной экспрессией В7-Н4 (номер по каталогу Cobioer CBP30061L). Плотность клеток доводили до 1,5×10⁶ клеток/мл. 33 мкл клеточной суспензии NCI-H929-LUC добавляли в каждую лунку в "смешанной группе клеток" и "группе одиночных клеток". Планшет с клетками помещали в инкубатор при температуре 37°С, 5% СО₂ для культивирования в течение ночи. На второй день эксперимента наивысшую концентрацию конъюгата антитела и лекарственного средства hu2F7-Экзатекан (соединение 34, у=8), подлежащего тестированию, равномерно доводили до 3000 нмоль/л и разбавляли для получения 5-кратного градиента 9 доз. 33,3 мкл разбавленного рабочего раствора конъюгата антитела и лекарственного средства добавляли в каждую лунку экспериментального планшета и осторожно перемешивали. Планшет с клетками помещали в инкубатор при температуре 37°С, 5% CO₂ и инкубировали в течение 48 часов. Планшет для культивирования клеток вынимали и уравновешивали до комнатной температуры. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл люциферазного реагента ONE-Glo™ (Promega Е6120). Клетки встряхивали и лизировали при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут. Лизат клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 1 минуты, а затем переносили в 96-луночный планшет с прозрачным дном по 180 мкл на лунку. Планшет считывали при длине волны 490 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. Данные анализировали с применением программного обеспечения Graphpad Prism, и экспериментальные результаты показаны в Таблице 9. Люциферазный реагент ONE-Glo™ может специфически определять жизнеспособность клеток NCI-H929-LUC. hu2F7-экзатекан эффективно уничтожает клетки NCI-H929-LUC в "смешанной группе клеток", указывая на то, что в присутствии В7-Н4-положительных клеток hu2F7-Экзатекан имеет активность в отношении неспецифического цитолиза, и может не только уничтожать В7-Н4-положительные клетки, но может также уничтожать нечувствительные В7-Н4-отрицательные клетки (в "группе одиночных клеток").

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SHANGHAI HANSOH BIOMEDICAL CO., LTD.

JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO., LTD.

<120> КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛА К B7-H4 И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 702041CPCT

<150> 201910498993.2

<151> 2019-06-06

<150> 202010215322.3

<151> 2020-03-24

<160> 55

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> huB7-H4-His

<400> 1

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser

20 25 30

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

50 55 60

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val

65 70 75 80

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met

85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

115 120 125

Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

180 185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met

195 200 205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val

225 230 235 240

Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Lys Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser His His His His

260 265 270

His His His His

275

<210> 2

<211> 463

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ПЕПТИД

<223> huB7-H4-Fc

<400> 2

Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser

1 5 10 15

Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro

20 25 30

Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val

35 40 45

Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu

50 55 60

Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val

65 70 75 80

Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp

85 90 95

Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn

100 105 110

Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn

115 120 125

Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg

130 135 140

Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly

145 150 155 160

Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu

165 170 175

Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn

180 185 190

Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly

195 200 205

Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln

210 215 220

Leu Leu Asn Ser Lys Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His

225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR1

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Gly Met Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR2

<400> 4

Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 5

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR3

<400> 5

Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR1

<400> 6

His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2

<400> 7

His Gly Thr Asn Leu Glu Asp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR3

<400> 8

Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR1

<400> 9

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR2

<400> 10

Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR3

<400> 11

Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR1

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2

<400> 13

Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR3

<400> 14

Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu Thr

1 5

<210> 15

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2G6 HCVR

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2G6 LCVR

<400> 16

Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2F7 HCVR

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2F7 LCVR

<400> 18

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2G6 HC

<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2G6 LC

<400> 20

Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 21

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2F7 HC

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 22

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2F7 LC

<400> 22

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 23

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR1

<400> 23

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn

1 5 10

<210> 24

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR2

<400> 24

Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR3

<400> 25

Asp Ser Arg Phe Ser Tyr

1 5

<210> 26

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR1

<400> 26

Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 27

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2

<400> 27

Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR3

<400> 28

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR1

<400> 29

Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR2

<400> 30

Tyr Leu Asn Ser Gly Ser

1 5

<210> 31

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> HCDR3

<400> 31

Asp Ser Arg Phe Ser Tyr

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR1

<400> 32

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR2

<400> 33

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> LCDR3

<400> 34

Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 35

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2F8 HCVR

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu2F8 LCVR

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu1C9 HCVR

<400> 37

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> hu1C9 LCVR

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2F8 HC

<400> 39

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 40

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu2F8 LC

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 41

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu1C9HC

<400> 41

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Arg Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 42

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ЦЕПЬ

<223> hu1C9 LC

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 43

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Оптимизированная HCDR1

<400> 43

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Trp Met Asn

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Оптимизированная HCDR2

<400> 44

Gly Ile Tyr Pro Asn Arg Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Оптимизированная HCDR2

<400> 45

Tyr Leu Asn Arg Gly Ser

1 5

<210> 46

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2G6 HCVR

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Asn Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ser Gln Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2G6 LCVR

<400> 47

Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Phe Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2F7 HCVR

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Glu Ser Tyr Ser Gln Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 49

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2F7 LCVR

<400> 49

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Ser Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 50

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2F8 HCVR

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Ala Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Ile Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 51

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 2F8 LCVR

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ile Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 52

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 1C9 HCVR

<400> 52

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Tyr Leu Asn Ser Gly Ser Ser Glu Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ser Arg Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210> 53

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> 1C9 LCVR

<400> 53

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Leu Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 54

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> IgG1 C

<400> 54

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 55

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> ДОМЕН

<223> Ig kappa C

<400> 55

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства для переноса цитотоксического лекарственного средства в раковые клетки, способ получения коньюгата антитела, фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с человеческим В7-Н4, применение конъюгата антитела к В7-Н4 или фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с человеческим В7-Н4. В одном из вариантов реализации коньюгат представлен общей формулой

где D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения заболеваний, связанных с человеческим В7-Н4. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 9 табл., 15 пр.

1. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства, представленный общей формулой (А), или его фармацевтически приемлемая соль или сольват,

где D представляет собой цитотоксическое лекарственное средство,

L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число от 1 до 8,

Ab представляет собой В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область легкой цепи антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела,

где вариабельная область тяжелой цепи антитела и вариабельная область легкой цепи антитела Ab содержат CDR любой из группы, состоящей из следующих с (1) по (2):

(1) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 6, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 7, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 8,

(2) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14,

где конъюгат антитела и лекарственного средства представляет собой антитело, которое переносит цитотоксическое лекарственное средство в раковые клетки и затем уничтожает раковые клетки диссоциированным цитотоксическим лекарственным средством.

2. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 1, где Ab представляет собой мышиное антитело или его фрагмент, химерное антитело или его фрагмент, человеческое антитело или его фрагмент и гуманизированное антитело или его фрагмент.

3. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 1 или 2, где Ab дополнительно содержит любую из (а), (b) и (с) или их комбинацию:

(a) каркасную(ые) область(и) легкой цепи и каркасную(ые) область(и) тяжелой цепи, происходящие от последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи зародышевой линии человека или их мутантной(ых) последовательности(ей),

(b) константную(ые) область(и) тяжелой цепи, происходящую от человеческого IgG1 или его варианта, IgG2 или его варианта, IgG3 или его варианта или IgG4 или его варианта, предпочтительно константную(ые) область(и) тяжелой цепи, происходящую от человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, более предпочтительно константную(ые) область(и) тяжелой цепи IgG1 с повышенной токсичностью ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после аминокислотной мутации, наиболее предпочтительно константную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 54,

(c) константную(ые) область(и) легкой цепи, происходящую от человеческой κ-цепи, λ-цепи или их варианта, предпочтительно константную(ые) область(и) легкой цепи, происходящую от человеческой κ-цепи, более предпочтительно константную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 55.

4. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-3, где вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи Ab представляют собой любую, выбранную из группы, состоящей из следующих:

(1) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 15, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 16,

(2) вариабельная область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 17, и вариабельная область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 18.

5. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 4, где Ab представляет собой любое антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих:

(1) легкая цепь, как показано в SEQ ID NO: 20, и тяжелая цепь, как показано в SEQ ID NO: 19,

(2) легкая цепь, как показано в SEQ ID NO: 22, и тяжелая цепь, как показано в SEQ ID NO: 21.

6. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-5, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечного антитела, димеризованной V-области (вариабельная область), V-области, стабилизированной дисульфидной связью, и антигенсвязывающих фрагментов пептида, содержащего CDR.

7. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-6, где цитотоксическое лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора тубулина или ингибитора топоизомеразы ДНК, который ингибирует деление клеток, предпочтительно SN-38, MMAF.

8. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-6, где цитотоксическое лекарственное средство выбрано из производных камптотецина, предпочтительно Экзатекана:

9. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 1, где конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства является таким, как показано в общей формуле (I) или (II-А),

где L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число, выбранное от 1 до 8, предпочтительно число, выбранное от 2 до 4,

Ab представляет собой В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено по любому из пп. 1-5.

10. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 1, где конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства является таким, как показано в общей формуле (III)

где L₁ и L₂ представляют собой линкерные звенья,

у представляет собой число, выбранное от 1 до 8, предпочтительно число, выбранное от 2 до 8, более предпочтительно число от 4 до 8, еще более предпочтительно число от 6 до 8 и наиболее предпочтительно 8,

Ab представляет собой В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено по любому из пп. 1-5.

11. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 9, где L₁ является таким, как показано в общей формуле (В)

где M₁ представляет собой -CR₁R₂-,

R₁ и R₂ представляют собой водород,

n представляет собой целое число от 0 до 5, предпочтительно 1, 2 или 3;

где L₂ является таким, как показано в общей формуле (С)

где М₂ представляет собой -CR₄R₅-,

R₃ представляет собой водород,

R₄ и R₅ представляют собой водород,

m представляет собой целое число от 0 до 5, предпочтительно 1, 2 или 3.

12. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по п. 10, где -L₂-L₁- является таким, как показано в следующей структуре:

K² представляет собой связь,

K³ представляет собой тетрапептидный остаток GGFG,

R⁵ представляет собой С_3-6 циклоалкил,

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, С_3-6 циклоалкила, или

R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют С_3-6 циклоалкил,

R², R³ или R⁴ каждый независимо представляют собой водород,

s представляет собой целое число от 2 до 8,

m представляет собой целое число от 0 до 4,

предпочтительно -L₂-L₁- выбран из группы, состоящей из следующих структур:

13. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-5, где конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства является таким, как показано в общей формуле (IV-A)

предпочтительно конъюгат антитела и лекарственного средства является таким, как показано ниже:

14. Конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемая соль или сольват по любому из пп. 1-13, где конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства выбран из группы, состоящей из следующих соединений:

где у выбран из от 2 до 8, предпочтительно от 4 до 8, более предпочтительно от 6 до 8, еще более предпочтительно от 7 до 8 и наиболее предпочтительно 8.

15. Способ получения конъюгата антитела и лекарственного средства общей формулы (IV) или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата, включающий следующие стадии:

после восстановления Ab его подвергают реакции сочетания с соединением общей формулы (F) с получением соединения общей формулы (IV),

где Ab представляет собой антитело к В7-Н4 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область легкой цепи антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела,

где вариабельная область тяжелой цепи антитела и вариабельная область легкой цепи антитела Ab содержат CDR любой из группы, состоящей из следующих с (1) по (2):

(1) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 3, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 4, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 5, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 6, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 7, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 8,

(2) HCDR1, как показано в SEQ ID NO: 9, HCDR2, как показано в SEQ ID NO: 10, и HCDR3, как показано в SEQ ID NO: 11, и

LCDR1, как показано в SEQ ID NO: 12, LCDR2, как показано в SEQ ID NO: 13, и LCDR3, как показано в SEQ ID NO: 14;

соединение общей формулы (F) представляет собой соединение общей формулы (F-1)

или его таутомер, мезомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или их смесь, или их фармацевтически приемлемую соль,

где К² представляет собой связь,

К³ представляет собой тетрапептидный остаток GGFG,

R⁵ представляет собой C_3-6 циклоалкил;

R⁶ выбран из группы, состоящей из водорода, C_3-6 циклоалкила,

или R⁵ и R⁶ и атом углерода, с которым они связаны, образуют C_3-6 циклоалкил,

R², R³ или R⁴ каждый независимо представляет собой водород,

s представляет собой целое число от 2 до 8,

m представляет собой целое число от 0 до 4.

16. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, связанного с человеческим В7-Н4, содержащая конъюгат антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по любому из пп. 1-14 и один или более фармацевтически приемлемых носителей.

17. Применение конъюгата антитела к В7-Н4 и лекарственного средства или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп. 1-14 и фармацевтической композиции по п. 16 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с человеческим В7-Н4.

18. Применение по п. 17, характеризующееся тем, что оно предназначено для получения лекарственного средства для лечения рака с высокой экспрессией В7-Н4, где рак выбран из группы, состоящей из астробластомы головного мозга человека, фарингеального рака человека, опухоли надпочечников, рака, связанного со СПИДом, альвеолярной мягкотканной саркомы, астроцитомы, рака мочевого пузыря, рака кости, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухоли каротидного тельца, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, пролиферативной соединительнотканной мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, саркомы Юинга, внекостной мукоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза кости, фиброзной дисплазии кости, карциномы желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационной трофобластической болезни, эмбрионально-клеточной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, инсулиномы, саркомы Капоши, рака почки, лейкоза, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярного рака щитовидной железы, аденомы паращитовидной железы, детского рака, периферической невриномы, феоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, задней увеальной меланомы, метастатического рака почки, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной карциномы, синовиальной саркомы, рака яичек, рака тимуса, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.