Тест-система для количественной диагностики мРНК интерферонов I, II и III типов человека на основе ПЦР Российский патент 2021 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Область техники

Изобретение относится к средствам молекулярной диагностики и может быть использовано в иммунологии и медицине для оценки иммунного статуса методом ПЦР. Настоящее изобретение представляет собой многопараметрическую диагностическую тест-систему, предназначенную для количественного определения уровней мРНК интерферонов I, II и III типов человека в биологическом образце. В частности, система представляет собой две пробы - А и Б, в каждой из которых одновременно проходят несколько реакций: в пробе А - определение уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ человека, в пробе Б - одновременное определение экспрессии четырёх подтипов IFN-λ человека. Система позволяет дифференцированно определять три субтипа (1, 2/3 и 4, соответственно) IFN-λ, а также определять экспрессию любого из 14 существующих субтипов IFN-α (без детерминации на подтипы).

Технический результат состоит в создании тест-системы, которая позволяет измерять в образце уровень экспрессии различных типов интерферонов: IFNA, IFNB, IFNG, в т.ч. с учетом их подтипов, что позволяет дать комплексную оценку интерферонового профиля, и подобрать надлежащее лечение в случае острых респираторных вирусных инфекций. Данный результат достигается с помощью разработанных последовательностях праймеров и TaqMan-зондах, а также в алгоритме и условиях проведения ПЦР (концентраций вносимых реагентов и температурном профиле реакции).

Введение

Интерфероны играют важнейшую роль в иммунном ответе, подавляя распространение вирусной инфекции на ранних стадиях заболевания, и формируют первую линию защиты млекопитающих против вирусных инфекций (Killip et al., 2015). Согласно аминокислотной последовательности и типу рецептора, через который опосредована передача сигнала, интерфероны подразделяются на три группы: интерфероны 1-го, 2-го и 3-го типа (Killip et al., 2015; Egli et al., 2014). Важнейшую роль в антивирусной защите организма играют интерфероны 1-го типа. В ответ на инфекцию поражённая клетка синтезирует, главным образом, интерфероны-α (IFN-α) и интерфероны-β (IFN-β), в то время как остальные интерфероны 1-го типа играют значительно меньшую роль в иммунном ответе организма. Матричная РНК IFN-α и IFN-β состоит из одного экзона (Randall, Goodbourn, 2008).

Кроме интерферонов 1-го типа в ответ на заражение респираторными вирусными инфекциями отмечено значительное повышение уровня интерферонов 3-го типа. Интерфероны 3-го типа (интерфероны-λ, IFN-λ) - это группа интерферонов, родственная интерферонам 1-го типа и демонстрирующая сходное с ними антивирусное действие (Egli et al., 2014). В организме человека обнаружено четыре подтипа IFN-λ: IFN-λ1 (IL-29), IFN-λ2 (IL-28A), IFN-λ3 (IL-28B) и IFN-λ4. Все IFN-λ закодированы на 19-й хромосоме человека, их мРНК состоит из 5 экзонов и 4 интронов (Egli et al., 2014). Среди IFNL1-3 наблюдается высокая консервативность последовательности (Miknis et al., 2010). До недавнего времени считалось, что IFN-λ4 является продуктом псевдогена. Однако в последние годы было показано, что люди имеют ген IFNL4, но в некоторых популяциях присутствует полиморфизм, который приводит к сдвигу рамки считывания и подавлению продукции IFN-λ4 (Prokunina-Olsson et al., 2013). В силу того, что экспрессия IFNL4 зависит от генетических особенностей пациентов, в разрабатываемом наборе определение мРНК IFNL4 не предусмотрено.

Действие IFN-λ реализуется через гетеродимерный рецептор IFNLR, состоящий из субъединиц IFNλR1 и IL10R2. Субъединица IL10R2 также входит в состав рецепторных комплексов для IL-10, IL-22 и IL-26 и экспрессируется в клетках различных тканей (Miknis et al., 2010). Экспрессия субъединицы IFNλR1 демонстрирует ограниченное клеточное распространение. Например, IFN-λ не действует на фибробласты, спленоциты, мигрировавшие из костного мозга макрофаги и эндотелиальные клетки. Экспрессия IFNλR1 в основном ограничена эпителиальными клетками, кератиноцитами, дифференцированными дендритными клетками и гепатоцитами. Следовательно, слизистые дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта - ткани, на которые главным образом направлено действие IFN-λ. Такая тканевая специфичность коррелирует с антивирусной активностью IFN-λ, которая проявляется, главным образом, по отношению к вирусам с повышенным тропизмом к эпителиальным тканям (Hermant, Michiels, 2014). Существует ряд данных об изменении уровня экспрессии специфической субъединицы рецептора к IFN-λ, IFNLR1, при заражении некоторыми вирусами. В работе (Pierangeli et al., 2018) было установлено, что у детей с тяжёлым течением риновируса уровень экспрессии IFNLR1 был повышен по сравнению с образцами инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом детей. Также показано, что вирус Денге увеличивает экспрессию IFNLR1 (Palma-Ocampo et al., 2015). Следовательно, важную роль в патогенезе вирусных инфекций может играть не только изменение экспрессии IFNL, но и субъединиц рецептора к IFN-λ (IFNλR1 и IL10R2). В силу этого, для более комплексного понимания изменений IFN-λ-зависимого сигналинга при различных инфекциях в разрабатываемую тест-систему были включены праймеры и зонды к субъединицам данного рецептора.

В свою очередь, интерфероны 2-го типа (интерфероны-γ, IFN-γ) играют важную роль как во врождённом, так и в адаптивном иммунном ответе организма. Известно, что IFN-γ, главным образом, секретируются активированными Т-лимфоцитами, естественными киллерами и профессиональными антиген-презентирующими клетками (моноцитами, макрофагами и дендритными клетками). Если секреция IFN-γ естественными киллерами и профессиональными антиген-презентирующими клетками играет роль во врождённом иммунном ответе организма, то продукция IFN-γ T-лимфоцитами скорее важна для развития приобретённого ответа (Killip et al., 2015). Например, IFN-γ необходим для вирус-индуцированного гуморального иммунного ответа (продукции иммуноглобуллинов IgG2a/c, IgG3) (Xi-zhi, Thomas, 2017).

Следовательно, интерфероны не только играют важную роль в подавлении вирусных инфекций, но также имеют широкий спектр иммуномодуляторных и противоопухолевых функций. Интерфероны 1-го типа имеют терапевтическое применение при лечении вирусных инфекций, рака и аутоиммунных заболеваний. Интерфероны-γ важны для контроля заболеваний, вызванных внутриклеточными бактериями, паразитами и грибковыми инфекциями. Также, интерфероны-γ оказывают влияние на адаптивный иммунный ответ организма, их активность связана с патогенезом таких заболеваний, как фиброз лёгких и астма (Laurent, Shapiro, 2006) Интерфероны-λ обеспечивают антивирусную защиту эпителиальных барьеров и также проявляют иммуномодуляторные функции (Lazear, Nice, Diamond, 2015). Таким образом, можно заключить, что интерфероны являются важнейшими медиаторами иммунной системы.

Определение интерферонового профиля позволяет дать комплексную оценку состояния иммунной системы организма. Особенную актуальность данная оценка приобретает при анализе патогенеза острых респираторных вирусных инфекций, вызванных вирусами гриппа, пневмовирусами, аденовирусами, коронавирусами. Так, избыточный уровень интерферонов может служить одним из маркеров возникновения «цитокинового шторма», одной из основных причин патогенности вирусных инфекций (Xi-zhi, Thomas, 2017).

Таким образом, существует потребность в анализе уровней экспрессии интерферонов различных типов одновременно в образце.

В настоящее время не зарегистрировано тест-систем, которые можно использовать для одновременного определения IFN-λ, IFNLR1 и IL10R2 методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Ранее в патенте № RU 2627179 C1 (Морозова, Оспельникова, 2016) описано определение уровня экспрессии тотального интерферона IFNL методом ОТ-ПЦР, при этом без определения каждого подтипа интерферона лямбда.

Техническая проблема, которую решает предложенное изобретение, состоит в разработке независимого и точного анализа уровней интерферонов в образце.

Технический результат состоит в создании тест-системы, которая позволяет измерять в образце уровень экспрессии различных типов интерферонов: IFNA, IFNB, IFNG, в т.ч. с учетом их подтипов, что позволяет дать комплексную оценку интерферонового профиля, и подобрать надлежащее лечение в случае острых респираторных вирусных инфекций.

Описание фигур

На Фиг. 1 показана регистрация продуктов ПЦР методом электрофоретического разделения в агарозном геле.

На Фиг. 2 приведен уровни эффективности амплификации специфических продуктов: А - IFNB, Б - IFNL1, В - IFNG: А - IFNB, Б - IFNL1, В - IFNG.

Слева представлены кривые накопления целевых продуктов в разрабатываемой мультиплексной ПЦР, справа - калибровочные кривые, используемые для расчёта эффективностей.

На Фиг. 3 показаны уровни относительной экспрессии IFNB, IFNL1 и IFNL2/3, полученный при анализе предложенной тест-системой.

По оси абсцисс отмечены вирусы: IBV - B (B/Phuket/3073/13), RSV - штамм A2A, H1 - A/California/07/09pdm (H1N1), H3 - A/Texas/50/12 (H3N2), AdV - штамм Adenoid 75, Cntr - клетки, не инфицированные вирусом.

Описание изобретения

Предложена многопараметрическая диагностическая тест-система, предназначенная для количественного определения уровней мРНК интерферонов I, II и III типов человека в биологическом образце, включающая:

- пробу А, предназначенную для определения уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ человека в образце, содержащую праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды SEQ ID NO:1-10;

- пробу Б, предназначенную для определения экспрессии четырёх подтипов IFN-λ человека, содержащую праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды SEQ ID NO:11-19.

При этом описанная система предназначена для одновременного определения уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включая четыре подтипа IFN-λ человека, с дифференцированным определением трёх субтипов (1, 2/3 и 4, соответственно) IFN-λ, и любого из 14 существующих субтипов IFN-α.

Предложенный способ определения уровней экспрессии интерферонов IFN-α, IFN-β и IFN-γ включает следующие стадии:

- сбор образца;

- помещение образца в тест-систему;

- проведение реакции ПЦР при следующих условиях:

- добавление Трис-HCl с рН 8,5, KCl, нуклеозидтрифосфата, MgCl₂, HS-Taq ДНК-полимеразы, Tween 20, стабилизаторов Taq ДНК-полимеразы в необходимых для проведения реакции количествах,

- добавление в пробу А праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных TaqMan-зондов с последовательностями SEQ ID NO:1-10,

- добавление в пробу Б праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных TaqMan-зондов с последовательностями SEQ ID NO:11-19,

и следующем температурном профиле: 1) первичная денатурация 95°С в течение 3 мин, 2) 40 двухступенчатых циклов: денатурация 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров и элонгация цепи 64°С в течение 30 c,

- расчёт относительного уровня экспрессии соответствующего интерферона в образце, при наличии эндогенного контроля глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ).

В частном случае способ определения уровней экспрессии интерферонов IFN-α, IFN-β и IFN-γ включает:

- сбор образца;

- помещение образца в тест-систему;

- проведение реакции ПЦР при следующих условиях:

с использованием реагента, включающего 100 мМ Трис-HCl, рН 8,5, 100 мМ KCl, 0,4 мМ каждого нуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgCl₂, 0,1 ед. акт./мкл HS-Taq ДНК-полимеразы, 0,025% Tween 20, стабилизаторы Taq ДНК-полимеразы,

и добавление в пробу А праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных TaqMan-зондов с последовательностями SEQ ID NO:1-10 по 10 пмоль в одну реакцию каждого,

добавление в пробу Б праймеров и флуоресцентно меченых олигонуклеотидных TaqMan-зондов с последовательностями SEQ ID NO:11-19 по 10 пмоль в одну реакцию,

и следующем температурном профиле: 1) первичная денатурация 95° С в течение 3 мин, 2) 40 двухступенчатых циклов: денатурация 95° С в течение 10 с, отжиг праймеров и элонгация цепи 64° С в течение 30 c,

- расчёт относительного уровня экспрессии соответствующего интерферона в образце, при наличии эндогенного контроля ГАФДГ.

Согласно предложенному способу, определяют уровни экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включая четыре подтипа IFN-λ человека, с дифференцированным определением трёх субтипов (1, 2/3 и 4, соответственно) IFN-λ, и любого из 14 существующих субтипов IFN-α, одновременно.

Данное изобретение включает праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды с последовательностями, которые предназначены для определения экспрессии IFN I, II и III типа и имеют следующие последовательности: SEQ ID NO: 1-10.

Данное изобретение также включает праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды, которые предназначены для определения экспрессии IFN I, II и III типа и имеют следующие последовательности: SEQ ID NO: 11-19.

За счет использования данной тест-системы возможна мультиплексная оценка не только всех известных типов интерферонов, но и IFNLR1 и IL10R2, субъединиц рецептора IFN-λ, медиатора, который играет ключевую роль в защите эпителиальных барьеров от вирусных патогенов (Lazear, Nice, Diamond, 2015). Данную тест-систему используют для определения цитокинового профиля методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Согласно способу, предполагается наличие двух праймеров и флуоресцентно меченого олигонуклеотидного зонда, специфических к интересующей мРНК.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые ни в коей мере не предназначены для ограничения объёма изобретения.

Примеры

Пример 1

Дизайн праймеров и олигонуклеотидных TaqMan-зондов

Для определения уровня экспрессии мРНК IFNLs были подобраны праймеры и олигонуклеотидные зонды (таблица 1).

Интерферон альфа человека представлен в базе данных 14 транскрипционными вариантами, было проведено множественное выравнивание этих вариантов и к идентичному участку подобрана пара праймеров и олигонуклеотидный зонд. Для выявления всех транскрипционных вариантов не удалось подобрать одного специфического олигонуклеотидного зонда, поэтому ПЦР-набор для количественного определения уровня мРНК IFN-α включает два зонда, один из которых выявляет транскрипционные варианты 1 и 14, второй - все остальные.

Интерферон бета представлен одним транскрипционным вариантом.

К интерферонам III типа, также называемым интерферонами лямбда, относят четыре субкласса интерферонов: IFNL2 (IL28A), IFNL3 (IL28B), IFNL1 (IL29) и обнаруженный сравнительно недавно IFNL4 (или IFNAN). IFNLs 1-3 имеют высокую степень сходства аминокислотных последовательностей от 72% до 96%, причём IFNL2 и IFNL3 наиболее похожи. Эти данные свидетельствуют в пользу происхождения субтипов IFN III от одного общего гена (Hamming et al., 2013; Bruening et al., 2017). Экспрессия IFNL4 является следствием сдвига рамки считывания в результате мутации, и схожесть его мРНК с тремя другими IFNLs составляет от 27% до 29%.

Таблица 1: Подобранные праймеры и TaqMan-зонды для определения экспрессии интерферонов

Пример 2

Подбор и оптимизация условий ПЦР

На этом этапе работы экспериментально оценили качество подобранных пар праймеров и зондов, а также возможность образования ими гетеро- и гомодимеров и неспецифических продуктов. Материалом для этого исследования служили образцы кДНК, полученные из препаратов тотальной РНК, выделенных из клеток A549, инфицированных вирусом гриппа A. Работа проводилась с использованием набора для проведения ПЦР HS 2× ПЦР-микса («Биолабмикс», Россия). В реакцию объёмом 25 мкл добавляли по 5 пмоль праймеров и зондов (0,5 мкл из стока праймеров и зондов с концентрациями 10 пмоль/мкл).

Для определения оптимального термального профиля были проведены следующие ПЦР с градиентом отжига:

1) первичная денатурация 95° С - 3 мин,

далее следовали 40 трёхступенчатых циклов:

2) денатурация 95° С - 10 с;

3) отжиг праймеров при температурах в диапазоне от 50° до 65° С - 20 с (точные температуры составили 65°, 64°, 62,5°, 59,5°, 55,9°, 53°, 51°, 50° С);

4) элонгация 72° С - 30 с;

Детекцию результатов осуществляли по росту флуоресценции, наличие неспецифических продуктов оценивали электрофоретическим разделением продуктов в агарозном геле (Фиг. 1).

С учётом полученных результатов в качестве оптимального температурного профиля ПЦР было предложено использовать следующий:

1) первичная денатурация 95° С - 3 мин,

далее 40 двухступенчатых циклов:

2) денатурация 95° С - 10 с;

3) отжиг праймеров и элонгация цепи 64° С - 30 c.

Пример 3

Расчёт эффективностей ПЦР

Для корректного проведения относительного количественного анализа экспрессии генов интерферонов в мультиплексном формате значения эффективностей амплификации соответствующих мРНК должны быть идентичными или максимально приближенными друг к другу. Поэтому далее при подобранных оптимальных условиях рассчитали эффективности ПЦР.

Эффективность амплификации продуктов ПЦР рассчитывали по углу наклона кривых, полученных серией последовательных десятикратных разбавлений образцов кДНК.

На Фиг. 2 продемонстрировано, что эффективности амплификации продуктов трёх генов IFNB, IFNL1 и IFNG составили: 94,96%, 85,50%, 99,09%, соответственно. Графически это выражается в том, что стандартные калибровочные кривые (представлены в правой части Фиг. 2) имеют похожие углы наклона, т.е. параллельны.

Пример 4

Оценка уровней экспрессии генов интерферонов в клетках A549, инфицированных гриппом

С использованием разработанной диагностической системы были исследованы уровни экспрессии интерферонов в ответ на инфицирование клеток A549 вирусами гриппа A (A/California/07/09pdm (H1N1), A/Texas/50/12 (H3N2)), вирусом гриппа B (B/Phuket/3073/13), аденовирусом типа 5 (штамм Adenoid 75) и респираторно-синцитиальным вирусом (штамм A2).

Согласно полученным результатам (Фиг. 3), уровни как IFNB, так и трёх подтипов IFNL (1, 2 и 3) увеличились более чем в 1000 раз на 24 hpi. Оба ВГА - как A(H1), так и A (H3) - являются мощными индукторами ИФН I и III типа, и при сравнении экспрессии интерферонов между ними достоверных различий обнаружено не было.

Литература:

1. Морозова О. В., Оспельникова Т. П. ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РНК ИНТЕРФЕРОНА λ, ИНТЕРЛЕЙКИНА IL23 И ПРОТИВОВИРУСНОГО БЕЛКА MxA: . пат. RU 2627179 C1 Россия. - 2016.

2. Egli A. et al. The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections //Emerging microbes & infections. - 2014. - Т. 3. - №. 1. - С. 1-12.

3. Killip M. J., Fodor E., Randall R. E. Influenza virus activation of the interferon system //Virus research. - 2015. - Т. 209. - С. 11-22.

4. Laurent G. J., Shapiro S. D. (ed.). Encyclopedia of respiratory medicine. - Academic Press, 2006. - Т. 3. https://doi.org/10.1016/B0-12-370879-6/00190-3.

5. Lazear H. M., Nice T. J., Diamond M. S. Interferon-λ: immune functions at barrier surfaces and beyond //Immunity. - 2015. - Т. 43. - №. 1. - С. 15-28.

6. Miknis Z. J. et al. Crystal structure of human interferon-λ1 in complex with its high-affinity receptor interferon-λR1 //Journal of molecular biology. - 2010. - Т. 404. - №. 4. - С. 650-664.

7. Hermant P., Michiels T. Interferon-λ in the context of viral infections: production, response and therapeutic implications //Journal of innate immunity. - 2014. - Т. 6. - №. 5. - С. 563-574.

8. Palma-Ocampo H. K. et al. Interferon lambda inhibits dengue virus replication in epithelial cells //Virology journal. - 2015. - Т. 12. - №. 1. - С. 150.

9. Pierangeli A. et al. Interferon lambda receptor 1 (IFNL1R) transcript is highly expressed in rhinovirus bronchiolitis and correlates with disease severity //Journal of Clinical Virology. - 2018. - Т. 102. - С. 101-109.

10. Prokunina-Olsson L. et al. A variant upstream of IFNL3 (IL28B) creating a new interferon gene IFNL4 is associated with impaired clearance of hepatitis C virus //Nature genetics. - 2013. - Т. 45. - №. 2. - С. 164.

11. Randall R. E., Goodbourn S. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures //Journal of General Virology. - 2008. - Т. 89. - №. 1. - С. 1-47.

12. Xi-zhi J. G., Thomas P. G. New fronts emerge in the influenza cytokine storm //Seminars in immunopathology. - Springer Berlin Heidelberg, 2017. - Т. 39. - №. 5. - С. 541-550.

13. Bruening, J., Weigel, B., & Gerold, G. (2017). The role of type III interferons in hepatitis C virus infection and therapy. Journal of Immunology Research, 2017.

14. Hamming, O. J., Terczyńska‐Dyla, E., Vieyres, G., Dijkman, R., Jørgensen, S. E., Akhtar, H., … & Hartmann, R. (2013). Interferon lambda 4 signals via the IFNλ receptor to regulate antiviral activity against HCV and coronaviruses. The EMBO journal, 32(23), 3055-3065.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский

политехнический университет Петра Великого»

<120> ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ МРНК ИНТЕРФЕРОНОВ I,

II И III ТИПОВ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ ПЦР

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

agccatctct gtcctccatg ag 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

tttctgctct gacaacctcc c 21

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

ccagcagacc ttcaatctct tcagcaca 28

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

tgcaggagga gagggtggga gaaact 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

tgcctcaagg acaggatgaa ct 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ttagccagga ggttctcaac aatag 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

ccagaaggag gacgccgcat tgac 24

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ccgctacatc tgaatgacct g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

tggctgttac tgccaggacc ca 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gtcactcaag ctgaaaaact gga 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

ggttcccatc ggccacatat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ttctccaggt gagggagcgc c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

gagggccaaa gatgccttag aa 22

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

agtgtcagcg gtggcct 17

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

gcagctgcag gtgagggagc 20

<---

Изобретение относится к средствам молекулярной диагностики и может быть использовано в иммунологии и медицине для оценки иммунного статуса методом ПЦР. Настоящее изобретение представляет собой многопараметрическую диагностическую тест-систему, предназначенную для количественного определения уровней мРНК интерферонов I, II и III типов человека в биологическом образце. В частности, система представляет собой две пробы – А и Б, в каждой из которых одновременно проходят несколько реакций: в пробе А – определение уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ человека, в пробе Б – одновременное определение экспрессии четырёх подтипов IFN-λ человека. Система позволяет дифференцированно определять три субтипа (1, 2/3 и 4, соответственно) IFN-λ, а также определять экспрессию любого из 14 существующих субтипов IFN-α (без детерминации на подтипы). 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Многопараметрическая диагностическая тест-система, предназначенная для количественного определения уровней мРНК интерферонов человека в биологическом образце, включающая:

- пробу А, предназначенную для определения уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включая дифференцированное определение субтипов IFN-λ: 1, 2/3 и 4, человека в образце, содержащую праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды SEQ ID NO:1–10;

- пробу Б, содержащую праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды SEQ ID NO:11–19;

- дополнительные реагенты: Трис-HCl, с рН 8,5, KCl, нуклеозидтрифосфат, MgCl₂, 0,1 ед. акт./мкл HS-Taq ДНК-полимеразы, Tween 20, стабилизаторы Taq ДНК-полимеразы в необходимых для проведения реакции количествах.

2. Система по п. 1, предназначенная для одновременного определения уровней экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включая четыре подтипа IFN-λ человека, включая дифференцированное определение IFN-λ 1, 2/3 и 4, соответственно.

3. Способ определения уровней экспрессии интерферонов IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включающий:

- сбор образца;

- помещение образца в тест-систему;

- проведение реакции ПЦР при следующих условиях:

- добавление Трис-HCl с рН 8,5, KCl, нуклеозидтрифосфата, MgCl₂, HS-Taq ДНК-полимеразы, Tween 20, стабилизаторов Taq ДНК-полимеразы в необходимых для проведения реакции количествах,

- добавление пробы А, содержащей праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды с последовательностями SEQ ID NO:1–10,

- добавление пробы Б, содержащей праймеры и флуоресцентно меченые олигонуклеотидные TaqMan-зонды с последовательностями SEQ ID NO:11–19,

и следующем температурном профиле: 1) первичная денатурация 95°С в течение 3 мин, 2) 40 двухступенчатых циклов: денатурация 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров и элонгация цепи 64°С в течение 30 c,

- расчёт относительного уровня экспрессии соответствующего интерферона в образце, при наличии эндогенного контроля глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ).

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что определяют уровни экспрессии IFN-α, IFN-β и IFN-γ, включая дифференцированное определение субтипов IFN-λ 1, 2/3 и 4, соответственно, одновременно.