Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Grippotyphosa серовара grippotyphosa для детекции антител к L. grippotyphosa Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя лептоспироза, обладающий выраженной антигенной и иммуногенной активностью и используемый как тест-штамм для детекции антител к L. grippotyphosa.

Наибольшую эпидемиологическую угрозу для населения многих стран мира, включая Россию, представляют зоонозы. В их числе и лептоспироз. (Соболева Г.Л., Ананьина Ю.В., Непоклонова И.В. Актуальные вопросы лептоспироза людей и животных // Российский ветеринарный журнал. - 2017. - №8. - 0 С. 13-17.). На территории России наиболее распространены лептоспиры серогрупп Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Pomona, Canicola. Лептоспирам серогруппы Grippotyphosa свойственен обширный ареал в различных климато-географических условиях, широкий спектр резервуарных хозяев (дикие мелкие млекопитающие, сельскохозяйственные и домашние животные), способность к продолжительному существованию во внешней среде. (Ананьина Ю.В. Паразитические и свободноживущие лептоспиры (Leptospiraceae): эколого-генетические особенности // Зоологический журнал, 2010, том 89, №1, с. 48-52). В некоторых регионах России лептоспиры серогруппы Grippotyphosa имеют существенное эпидемиологической значение. Так, на территории Северо-Западного экономического района РФ лептоспиры этой серогруппы преобладают в этиологии лептоспирозной инфекции, достигая 69% у диких мелких млекопитающих в природных очагах, 43,3% у сельскохозяйственных животных и 56% у людей. (Роберман М.Г., Алиев А.А. Особенности этиологической структуры лептоспирозов людей и животных в условиях Северо-Западного экономического района РФ // Сб.: Материалы международного агротехнического симпозиума, посвященного 80-летию члена корреспондента РАН, заслуженного деятеля науки РФ Сочнева В.В., «Нижегородская ГСХА», 2016, с. 314-320).

Для лептоспироза характерен полиморфизм клинических проявлений, в связи с чем клиническая диагностика затруднена, особенно на ранних днях болезни, поэтому лабораторные методы исследования имеют решающее значение (Киселева Е.Ю., Бренева Н.В., Носков М.Б., Балахонов С.В., Гефан Н.Г. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов: особенности постановки, преимущества и недостатки // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2015, №3 (103), С. 85-93). В серологической диагностике реакция микроагглютинации (РМА) остается «золотым стандартом». Для выявления антител в РМА рекомендован диагностический набор лептоспир (Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: методические указания МУ 3.1.1128-02. / Москва; Минздрав России, 2002.), в котором для определения антител к L. grippotyphosa рекомендован эталонный штамм Moskva V, выделенный в России от человека в 1928 году. Этот штамм был выбран за прототип. К недостаткам данного штамма можно отнести потерю ряда антигенных свойств в результате длительного (более 90 лет) культивтрования на искусственной питательной среде (Самохвалов А.П. Антигенные и иммуногенные свойства лептоспир в зависимости от сроков выделения // Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных: материалы Всесоюз. конф. - Львов, 1988. - С. 211.).

Изобретение направлено на получение тест-штамма для выявления антител к L. grippotyphosa. Предложенный штамм позволит осуществлять выявление антител к L. grippotyphosa в крови людей и животных, диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией лептоспир серогруппы Grippotyphosa на территории России.

Технический результат: обеспечение наиболее эффективного выявления антител к L grippotyphosaa, циркулирующих на территории России за счет выделения предлагаемого штамма на данной территории, выраженных антигенных свойств предлагаемого штамма «Рыжая полевка-339» и использования его для серологической диагностики лептоспироза. Полученный штамм Leptospira interrogans серогруппы Grippotyphosa серовара с grippotyphosa №353 «Рыжая полевка-339» выделен из почки рыжей полевки (Clethrionomis glareolus), отловленной на территории Ленинградской области в 2019 году. Штамм депонирован в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под номером 524.

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные спирохеты с характерной морфологией и подвижностью, спор и капсул не образуют.Относятся к хемоорганотрофам и гидрофилам, культивируются на жидкой питательной среде. Лаг-фаза длится двое суток, экспотенциальная фаза характеризуется продолжительностью в 8 суток, время генерации 24 ч. В стационарной фазе наибольшая концентрация составляет (4,3±0,3) × 10⁷ лептоспир в 1 мл. Культивируются на жидкой фосфатно-сывороточной среде Терских, состоящей из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 10% сыворотки кролика. Оптимальная температура культивирования - 28°С.

Генетические характеристики. На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16sRNA заявленного штамма, полученной в ходе секвенирования по Сенгеру, путем сравнения с известными нуклеотидными последовательностями, доступными в базе данных GenBank, выявлено сходство с идентичностью 99% с нуклеотидной последовательностью гена 16SrRNA геномовида Leptospira kirschneri, что позволяет отнести штамм к данному геномовиду.

Антигенные свойства: реакция микроагглютинации с сывороткой к L. grippotyphosa положительная в разведении 1:51200.

По сравнению со штаммом аналогом в настоящем изобретении предлагается свежевыделенный штамм L. grippotyphosa. Известно, что «свежевыделенные штаммы лептоспир обладают наиболее выраженной антигенной активностью нежели штаммы, выделенные 10-30 лет тому назад»

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Способ получения штамма

Штамм получен путем посева крови больного лептоспирозом человека на жидкую питательную фосфатно-сывороточную среду Терских, состоящую из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Культивирование штамма осуществлялось при температуре - 28°С в течение 10 суток, с последующим определением серологической принадлежности и генотипированием штамма, изучением его биологических свойств.

Пример 2. Способ применения штамма

Для постановки РМА используют живую культуру L. grippotyphosa, выращенную на среде Терских с добавлением сыворотки кролика, со сроком культивировавния 7-14 суток. Культура должна иметь хорошую подвижность, накопление 4×10⁷ клеток на 1 мл, что соответствует 50-100 лептоспирам в поле зрения микроскопа при увеличении ×400.

Исследуемую сыворотку разводят и титруют в физиологическом растворе, начиная с 1:50 с последующим двукратным разведением. Разведенную сыворотку и живую культуру L. grippotyphosa смешивают в равных объемах по 50 мкл в лунках полистироловых планшет. После экспозиции в течение 30 минут при комнатной температуре производят учет реакции.

Пример использования штаммов «Moskva V» и «Рыжая полевка-339» для выявления антител к L. grippotyphosa в крови больных лептоспирозом людей в Санкт-Петербурге представлен в таблице.

Таблица 1. Сравнение эффективности предлагаемого штамма и прототипа для выявления антител к L. grippotyphosa.

Предлагаемый штамм, по сравнению с прототипом, позволяет выявлять антитела к L. grippotyphosa. в более высоком разведении сывороток (более высокие титры антител). Таким образом, заявленный штамм пригоден для детекции антител к L. grippotyphosa, что позволит диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией лептоспир серогруппы Grippotyphosa на территории России.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к диагностике лептоспироза. В качестве тест-штамма для детекции антител к L. grippotyphosa предлагается штамм бактерий Leptospira interrogans серогруппы Grippotyphosa серовара grippotyphosa №353 «Рыжая полевка 339», выделенный из почки рыжей полевки (Clethrionomis glareolus). Штамм депонирован в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под номером 524. Особенностью штамма являются выраженные антигенные и иммуногенные свойства. Использование изобретения позволит проводить эпидемиологическое расследование спорадических и групповых заболеваний лептоспирозом: серологическая диагностика, установление источника инфекции в очаге заболевания, а также мониторинг за распространением лептоспироза, вызванного возбудителями серогруппы Grippotyphosa, как среди людей, так и среди различных видов животных. 1 табл., 2 пр.

Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Grippotyphosa серовара grippotyphosa, депонированный в Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи под номером 524, для детекции антител к L. grippotyphosa.