Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя лептоспироза, обладающий выраженной антигенной активностью и используемый как тест-штамм для детекции антител к L.icterohaemorrhagiae.
Лептоспироз - широко распространенная и социально значимая зооантропонозная инфекция. Ежегодно в среднем в мире официально регистрируется около миллиона случаев лептоспироза и 60 тысяч смертей, что делает его одним из ведущих по заболеваемости и летальности среди зоонозных инфекций (Costa F, Hagan J. Е., Calcagno J., Kane M., Torgerson P., Martinez-Silveira M.S., Stein C, Abela-Ridder В., Ко A. L Global Morbidity and Mortality of Leptospirosis: A Systematic Review. PLOS Neglected Trop. Dis. 2015, 9 e0003898 [CrossRef]). Многие исследователи в разных странах мира отмечают вероятность занижения показателей заболеваемости лептоспирозом, что связано не с истинной ситуацией, а скорее с клинической гиподиагностикой и недостаточным объемом проводимой специфической лабораторной диагностики. По мнению ряда исследователей разных стран мира на долю лептоспироза приходится от 20% до 50% лихорадок неизвестного происхождения (Crump J.F., Morrissey А.В., Nicholson W.L., Masswung R.F., Stoddard R.A. at al. Etiology of Severe Non-malaria Febrille illness in Northern Tanzania: A Prospective Cohort Study. PLOS Neglected Trop.Dis. 2013,7. e2324 [CrossRef]). В связи с этим растет признание того, что лептоспироз обусловливает гораздо большее бремя для здравоохранения, чем указано в официальной статистике.
Несмотря на большое количество серологических групп патогенных лептоспир, вызывающих заболевания (в настоящее время насчитывается около 300 сероваров, объединенных почти в 30 серологических групп (Lorena Mejia et al. The impact of genetic recombination on pathogenic Leptospira. //Infection, Genetics and Evolution. 102 (2022) 105315. https: //doi.Org/10.1016/j.Melgid. 2022/105315), лептоспироз представляет собой единую нозологическую форму, но при этом тяжесть клинического течения инфекции может отличаться в зависимости от серологической принадлежности возбудителя. На территории России наиболее распространены лептоспиры серогрупп Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Pomona, Canicola. Известно, что наиболее тяжело протекающие заболевания обусловлены лептоспирами серогруппы Icterohaemorrhagiae, летальность в этих случаях может достигать 20-30% (Нафеев А.А., Нечаева А.С., Салин Г.В., Аббязова В.И., Ветлугин Н.И. Необратимые последствия лептоспироза//Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2012. - №1. - С. 25-28). Определение серогрупповой принадлежности, возбудителя, обусловившего заболевание, имеет существенное значение для решения эпидемиологических задач - выявление источника инфекции т.к. лептоспирам свойственна гостальная (хозяинная) специфичность. Установлено, что основным резервуаром иктерогеморрагических лептоспир являются серые крысы (Ананьина Ю.В. Лептоспирозы в Российской Федерации: современные особенности эпидемического проявления природных и техногенных очагов // Ветеринарная патология. - 2004. - №4. - С. 54-57).
В связи с трудностями диагностики, связанной с полиморфизм клинических проявлений, результаты лабораторного обследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. При всем разнообразии разрабатываемых современных методов лабораторной диагностики лептоспироза, важным остается классический серологический методам и прежде всего реакции микроагглютинации с живыми культурами лептоспир, которая до сих пор является «золотым стандартом» (Киселева Е.Ю., Бренева Н.В., Носков А.К., Шаракшанов М.Б., Балахонов С.В., Гефан Н.Г. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов: особенности постановки, преимущества и недостатки// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2015. - №3(103). - С. 85-93).
Для выявления антител в РМА рекомендован диагностический набор лептоспир (Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами: методические указания МУ 3.1.1128-02. / Москва; Минздрав России, 2002), в котором для определения антител к L. icterohaemorrhagiae рекомендован эталонный штамм М-20, выделенный в Дании от человека в 1938 году. К недостаткам данного штамма можно отнести: потерю ряда антигенных свойств в результате длительного (более 70 лет) культивирования на искусственной питательной среде.
В связи с этим нами был предложен тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серовара copenhageni для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae (Патент RU 2607006). Этот штамм (Абайдулаев ГКПМ - Оболенск В-7745) был взят за прототип. Недостатком и этого штамма может быть снижение антигенных свойств за период длительного культивирования на питательной среде (штамм был выделен от человека 10 лет назад в 2013 г.).
Изобретение направлено на получение тест-штамма для выявления антител к лептоспирам серогруппы Icterohaemorrhagiae.
Разработанный штамм позволит осуществлять выявление антител к L. icterohaemorrhagiae в крови людей и различных животных, диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией иктерогеморрагических лептоспир на территории России. Результаты серологического исследования могут быть повышены за счет использования штаммов, циркулирующих в регионе где могло произойти инфицирование (Goros V.G.A., Hartskeerl R.A. Leptospirosis serodiagnosis by the microscopic agglutination test. // Curr.Protoc. Mocrodiol., 2014.- 32(1) P. Ш.7.1.-12E. 5. 18).
Технический результат: обеспечение наиболее эффективного выявления антител к лептоспирам серогруппы Icterohaemorrhagiae, циркулирующих на территории России за счет сохранности штаммом выраженных антигенных свойств, что связано с небольшим числом пассажей на искусственной питательной среде, а также за счет выделения штамма на территории России от основного резервуара лептоспир этой серогруппы в природе.. В связи с этим предлагаемый штамм может быть использован для серологической диагностики лептоспироза, как у людей, так и у различных видов животных.
Полученный штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae «Серая крыса 5» депонирован в Российскую коллекцию эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации по номером 531. Штамм выделен из почки серой крысы, отловленной в Санкт-Петербурге в 2022 год. Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные спирохеты с характерной морфологией и подвижностью, спор и капсул не образуют.Относятся к хемоорганотрофам и гидрофилам, культивируются на жидкой питательной среде. Лаг-фаза длится двое суток, экспотенциальная фаза характеризуется продолжительностью в 5 суток, время генерации 19 ч. В стационарной фазе наибольшая концентрация составляет (6,7±0,2)×107 лептоспир в 1 мл. Культивируются на жидкой фосфатно-сывороточной среде Терских, состоящей из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Оптимальная температура культивирования +28°С.
Генетические характеристики. На основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16sRNA заявленного штамма, полученной в ходе секвенирования по Сенгеру, путем сравнения с известными нуклеотидными последовательностями, доступными в базе данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov), выявлено сходство с идентичностью 99% с нуклеотидной последовательностью гена 16SrRNA геномовида Leptospira interrogans, что позволяет отнести штамм к данному геномовиду.
Антигенные свойства: реакция микроагглютинации с сывороткой к L. icterohaemorrhagiae положительная в разведении 1:51200.
По сравнению со штаммом-аналогом в настоящем изобретении предлагается свежевыделенный штамм L. icterohaemorrhagiae, выделенный на территории России от синантропного грызуна - серой крысы (Rattus norvegicus), являющегося основным резервуаром лептоспир этой серогруппы в природе. Известно, что «свежевыделенные штаммы лептоспир обладают наиболее выраженной антигенной активностью нежели штаммы, выделенные несколько лет назад».
Изобретение реализуется следующим образом.
Пример 1. Способ получения штамма
Штамм получен путем посева крови коркового слоя почки серой крысы на жидкую питательную фосфатно-сывороточную среду Терских, состоящую из 90% дистиллированной воды, 10% фосфатного буфера (рН=7,2) с добавлением 5% сыворотки кролика. Культивирование штамма осуществлялось при температуре -28°С в течение 10 суток, с последующим определением серологической принадлежности и генотипированием штамма, изучением его биологических свойств.
Пример 2. Способ применения штамма
Для постановки РМА используют живую культуру L. icterohaemorrhagiae, выращенную на среде Терских с добавлением сыворотки кролика, со сроком культивировавния 7-14 суток. Культура должна иметь хорошую подвижность, накопление 5×107клеток на 1 мл, что соответствует 50-100 лептоспирам в поле зрения микроскопа при увеличении ×400. Исследуемую сыворотку разводят и титруют в физиологическом растворе, начиная с 1:50 с последующим двукратным разведением. Разведенную сыворотку и живую культуру L. icterohaemorrhagiae смешивают в равных объемах по 50 мкл в лунках полистироловых планшет. После экспозиции в течение 30 минут при комнатной температуре производят учет реакции. Пример использования штаммов «Абайдулаев» и «Серая крыса 5» для выявления антител к L. icterohaemorrhagiae в сыворотке крови больных лептоспирозом людей в Санкт-Петербурге.
Предлагаемый штамм, по сравнению с прототипом, позволяет выявлять антитела к L. icterohaemorrhagiae в более высоком разведении сывороток (более высокие титры антител).
Таким образом, заявленный штамм пригоден для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae, что позволит диагностировать лептоспироз, установить серогрупповую принадлежность возбудителя, вызвавшего заболевание, установить источник инфекции в очаге, а также проводить мониторинг за циркуляцией иктерогеморрагических лептоспир на территории России.
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae, обладающий выраженными антигенными и имунногенными свойствами, депонирован в Российскую коллекцию эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации под номером 531. Изобретение обеспечивает серологическую диагностику лептоспироза, мониторинг за распространением иктерогеморрагического лептоспироза как среди людей, так и среди различных видов животных. 1 табл.
Тест-штамм Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae Российской коллекции эталонных штаммов патогенных и сапрофитных лептоспир национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени академика Н.Ф. Гамалеи, номер 531, для детекции антител к L. icterohaemorrhagiae.
