ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1 ТИПА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2024 года по МПК C12N7/01 C12N15/869 A61K48/00 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к онколитическому вирусу для лечения опухолей и, в частности, к онколитическому вирусу простого герпеса 1 типа (oHSV-1), генетически сконструированному для лечения опухолей головного мозга. Настоящее изобретение также относится к способу лечения опухолей головного мозга с применением рекомбинантного онколитического вируса, раскрытого в настоящем документе, и фармацевтическим композициям и их применениям.

Уровень техники

[0002] Первичные опухоли головного мозга могут возникать из различных типов клеток центральной нервной системы. Медуллобластомы происходят из предшественников нейронов, в то время как астроцитомы происходят из астроцитарной субпопуляции глиальных клеток, а олигодендроглиомы происходят из субпопуляции предшественников олигодендроглии глиальных клеток. Другие типы первичных опухолей происходят из клеток, которые образуют внутреннюю и внешнюю мозговые оболочки, такие как эпендимомы из эпендимальных клеток и менингиомы из клеток, которые составляют оболочки головного мозга, соответственно. Мультиформная глиобластома (GBM), происходящая из астроцитов, является наиболее распространенной и самой смертоносной первичной опухолью головного мозга и поэтому классифицируется как астроцитома IV степени злокачественности согласно классификации ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения).

[0003] Текущая схема лечения злокачественной мультиформной глиобластомы (GBM) заключается в резекции опухоли с последующей химио- и радиотерапией. Несмотря на доказанную безопасность онколитического вируса простого герпеса (oHSV) в клинических исследованиях лечения GBM, его эффективность недостаточна, в основном из-за недостаточного распространения вируса после резекции опухоли. Мультиформная глиобластома (GBM) является наиболее распространенной опухолью головного мозга у взрослых, и, несмотря на большие успехи в ее изучении на молекулярном уровне, она остается одним из наименее поддающихся лечению злокачественных новообразований. Хотя резекция опухоли GBM представляет собой важное терапевтическое вмешательство, стандартное лечение радиотерапией и химиотерапией темозоломидом после резекции опухоли дает лишь умеренные клинические результаты. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых местных терапевтических средств, которые можно вводить непосредственно в резекционную полость опухоли GBM после удаления опухолевой ткани.

[0004] В предыдущих исследованиях, где были предприняты попытки использовать местную терапию клинически одобренными пластинами Gliadel, представляющими собой полиангидридные пластины, содержащие химиотерапевтический агент BCNU, в полости резецированной GBM, был продемонстрирован ограниченный терапевтический эффект. В рамках продолжающихся поисков терапевтических средств, способных устранять такие остатки опухолевой ткани после резекции опухоли, онколитические вирусы показали большой потенциал в доклинических исследованиях. Эти вирусы, как правило, генетически сконструированы таким образом, чтобы они могли реплицироваться только в клетках новообразования и уничтожать их, и этот подход хорошо подходит для головного мозга, где активно пролиферирующие опухолевые клетки находятся среди непролиферирующих или медленно пролиферирующих нормальных клеток. Среди терапевтических вирусов oHSV является одним из наиболее перспективных кандидатов для терапии GBM, поскольку он по своей природе является нейротропным вирусом и его онколитический эффект в меньшей степени зависит от определенных рецепторов, мутаций или внутриклеточных путей клеток-хозяев. Кроме того, oHSV обладает хорошо изученным геномом и большой трансгенной емкостью для вставки дополнительных терапевтических генов с целью дополнительного усиления его онколитической активности. Хотя клинические исследования oHSV фазы I и Ib, проведенные на сегодняшний день в отношении лечения GBM, продемонстрировали признаки противоопухолевой активности, частота клинического ответа была недостаточной.

Краткое описание изобретения

[0005] Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что oHSV-1 с делециями обеих копий гена γ34.5 и области инвертированного внутреннего повтора обладает неожиданно лучшей противоопухолевой активностью, избирательной в отношении опухолей головного мозга относительно опухолей, не относящихся к головному мозгу, по сравнению с существующими вирусами oHSV-1.

[0006] В одном аспекте настоящего изобретения предложен онколитический вирус простого герпеса 1 типа (oHSV-1), содержащий модифицированный геном, где указанная модификация включает (а) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и (b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора, где представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

[0007] В некоторых вариантах осуществления указанное изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5.

[0008] В некоторых вариантах осуществления дуплицированные некодирующие последовательности включают интроны ICP0, домен LAT и последовательность «а».

[0009] В некоторых вариантах осуществления все представленные в одной копии гены в обоих компонентах U_L и U_S включают гены с U_L1 по U_L56 в компоненте U_L и гены с U_S1 по U_S12 в компоненте U_S.

[0010] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 выбран из группы, состоящей из штаммов F, KOS и 17. В некоторых вариантах осуществления делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию положений нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома штамма F.

[0011] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 имеет изомер генома, представляющий собой прототип (Р), и делеция области внутреннего инвертированного повтора проходит от стоп-кодона последнего гена (например, U_L56) в компоненте U_L до промотора первого гена (например, U_S1) в компоненте U_S.

[0012] В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент, где указанное встраивание не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий агент и иммунотерапевтический агент.

[0013] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12.

[0014] В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент, анти-CTLA-4 агент или оба из них. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления анти-PD-1 агент включает антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как Fab, scFv, (scFv)₂, Fab' или F(ab')₂. В некоторых вариантах осуществления анти-CTLA-4 агент включает антитело к CTLA-4 или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как Fab, scFv, (scFv)₂, Fab' или F(ab')₂. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 или антитело к CDLA-4 включает модифицированную форму антитела, включающую конъюгат антитела с лекарственным средством (ADC), биспецифичное антитело и нанотело (или VHH).

[0015] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и/или между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

[0016] В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12 и анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12, встроена в область внутреннего инвертированного повтора, и гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-PD-1 агент, встроена между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

[0017] В другом аспекте предложена фармацевтическая композиция для лечения опухоли головного мозга, содержащая эффективное количество любого из oHSV-1, раскрытых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

[0018] В другом аспекте предложено применение любого из oHSV-1, раскрытых в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства для лечения опухоли головного мозга. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

[0019] В другом аспекте предложено применение любого из oHSV-1, раскрытых в настоящем документе, для лечения опухоли головного мозга. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

[0020] В другом аспекте предложен способ лечения опухоли головного мозга у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества любого из oHSV-1, раскрытых в настоящем документе, или любой из фармацевтических композиций, раскрытых в настоящем документе.

[0021] В некоторых вариантах осуществления субъекту проводят вторую терапию до, одновременно с или после введения oHSV-1, раскрытого в настоящем документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вторая терапия представляет собой химиотерапевтическое, радиотерапевтическое, иммунотерапевтическое и/или хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

Краткое описание графических материалов

[0022] Эти и другие аспекты и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего далее описания, в котором они подробно описаны со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых:

[0023] На фиг.1 показаны структуры генома конструкций oHSV-1 Т3011, С5252, С8282, С1212 и R3616.

[0024] На фиг.2 показаны результаты отсутствия экспрессии белка ICP34.5 С5252, С8282 и С1212. Шестилуночные планшеты с клетками Vero подвергали имитации инфицирования или инфицированию при 1 БОЕ HSV-1 (F), R3616, С5252, С8282, С1212 на клетку. Клетки собирали через 6, 12 и 24 часа (ч) после инфицирования соответственно. Экспрессию белка ICP34.5 определяли с помощью иммуноблоттинга.

[0025] На фиг.3 показаны результаты оценки ингибирующего эффекта С5252 на пролиферацию клеток злокачественной глиомы человека in vitro. Для каждого образца использовали 6 дублирующих лунок, и эти результаты подтверждали в другом независимом эксперименте. U87-MG, U138-MG, U373-MG, D54-MG и U251-MG высевали в 96-луночный планшет (5000 клеток/лунка) и инфицировали серией титров С5252/С1212 (0,01, 0,1, 1, 10, 33,33, 100 БОЕ/клетка). Через 48 часов инфицирования определяли степень ингибирования U87-MG, U373-MG, U138-MG, D54-MG и U251-MG с помощью анализа жизнеспособности на основе люминесценции клеток Cell Titer-Glo и рассчитывали IC₅₀.

[0026] На фиг.4 показаны результаты в отношении ингибирующего эффекта С5252 на нормальные клетки и опухолевые клетки. U373-MG, ACHN, НА и HRGEC высевали в 96-луночный планшет (5000 клеток/лунка) и инфицировали серией титров С5252 (0,01-500 БОЕ/клетка). Через 48 часов инфицирования определяли относительную жизнеспособность клеток U373-MG, ACHN, НА и HRGEC с помощью анализа жизнеспособности на основе люминесценции клеток Cell Titer-Glo и рассчитывали IC₅₀.

[0027] На фиг.5 показаны результаты исследования эффективности С8282 при лечении подкожно имплантированной модели GL261 у мышей C57BL/6. Тридцати двум самкам мышей C57BL/6J подкожно инокулировали опухолевые клетки GL261 (1×10⁶) в правый бок. Когда объем опухолей достиг ~70 мм³, мышей случайным образом делили на 4 группы, по 8 мышей в каждой группе. Мышам внутриопухолево вводили С8282 (5×10⁴, 5×10⁵ или 5×10⁶ БОЕ/животное, всего 3 раза, один раз в 3 дня. Объем опухоли и массу тела измеряли два раза в неделю. Объем опухоли и масса тела были представлены как среднее значение ± SEM.

[0028] На фиг.6 показаны результаты исследования эффективности С5252 при лечении ортотопической модели глиомы человека U87 у голых мышей. Тридцати самкам голых мышей Balb/c интрацеребрально инокулировали 5 мкл опухолевых клеток U87-Luc в полосатое тело левого полушария. Через 2 недели после инокуляции мышей случайным образом делили на 3 группы, по 8 мышей в каждой группе, в соответствии с сигналом люминесценции в исследуемой области (ROI), полученной с помощью системы визуализации IVIS. Мышам вводили С5252 (3×10⁴ или 3×10⁵ БОЕ/мышь в 5 мкл), всего 6 раз (D1, 4, 7, 10, 13, 16), один раз в 3 дня. IVIS проводили один раз в неделю для отслеживания роста опухоли.

Подробное описание изобретения

Определения

[0029] Следует отметить, что термин, обозначающий объект в единственном числе, относится к одному или более таким объектам; например, «онколитический HSV-1» следует понимать как относящийся к одному или более онколитическим вирусам HSV-1. Таким образом, термины, обозначающие объект в единственном числе, «один или более» объектов и «по меньшей мере один» объект, могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.

[0030] «Гомология», или «идентичность», или «сходство» относится к сходству последовательностей двух пептидов или двух молекул нуклеиновых кислот.Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которые могут быть выровнены в целях сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято таким же основанием или аминокислотой, то молекулы гомологичны по этому положению. Степень гомологии последовательностей является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, общих для последовательностей. «Неродственная» или «негомологичная» последовательность обладает менее чем 40% идентичностью, однако предпочтительнее менее чем 25% идентичностью одной из последовательностей согласно настоящему изобретению.

[0031] Полинуклеотид или область полинуклеотида (или полипептид или область полипептида), обладающий определенным процентом (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) «идентичности последовательности» другой последовательности, означает, что при выравнивании этот процент оснований (или аминокислот) при сравнении двух последовательностей является одинаковым. Это выравнивание и процент гомологии или идентичности последовательностей могут быть определены с помощью программного обеспечения, известного в данной области техники.

[0032] В контексте настоящего документа «антитело» или «антигенсвязывающий полипептид» относится к полипептиду или полипептидному комплексу, который специфично распознает один или более антигенов и связывается с ними. Антитело может представлять собой целое антитело и любой его антигенсвязывающий фрагмент или одну цепь. Таким образом, термин «антитело» включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, обладающую биологической активностью связывания с антигеном. Примеры этого включают, не ограничиваясь перечисленным, определяющую комплементарность область (CDR) тяжелой цепи или легкой цепи или ее лиганд-связывающую часть, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасную (FR) область или любую их часть, или по меньшей мере одну часть связывающего белка. Термин «антитело» также включает в себя полипептиды или полипептидные комплексы, которые при активации обладают антигенсвязывающими свойствами.

[0033] Термины «фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» в контексте настоящего документа представляют собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и т.п. Вне зависимости от структуры фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин «фрагмент антитела» включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин «фрагмент антитела» также включает любые синтетические или генетически сконструированные белки, которые функционируют аналогично антителу посредством связывания с определенным антигеном с образованием комплекса.

[0034] Антитела, антигенсвязывающие полипептиды, их варианты или производные согласно изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитопсвязывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fv, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидной связью Fv (sdFv), фрагменты, содержащие домен VK или VH, фрагменты, полученные в экспрессионной библиотеке Fab, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам LIGHT, раскрытым в настоящем документе). Молекулы иммуноглобулина или антитела согласно настоящему изобретению могут относиться к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу молекулы иммуноглобулина. Например, антитело к PD-1 может относиться к его Fab-фрагменту или scFv.

[0035] Под «специфично связывается» или «характеризуется специфичностью к», как правило, подразумевают, что антитело связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание подразумевает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. В соответствии с этим определением говорят, что антитело «специфично связывается» с эпитопом в том случае, если оно связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена легче, чем оно связывалось бы с произвольным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в настоящем документе для оценки относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, может считаться, что антитело «А» обладает более высокой специфичностью к данному эпитопу, чем антитело «В», или можно сказать, что антитело «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем его специфичность к родственному эпитопу «D».

[0036] В контексте настоящего документа термины «рак» или «опухоль» используются взаимозаменяемо и обозначают группу заболеваний, подлежащих лечению согласно настоящему изобретению, которые сопровождаются патологическим ростом клеток с потенциалом инвазии или распространения в другие части тела. Не все опухоли являются раковыми; доброкачественные опухоли не распространяются в другие части тела. Возможные признаки и симптомы включают, среди прочих: новое уплотнение, аномальное кровотечение, длительный кашель, необъяснимую потерю массы тела и изменение перистальтики кишечника. Существует свыше 100 различных известных видов рака, которые поражают людей. Настоящее изобретение предпочтительно применимо для солидных опухолей, более предпочтительно опухолей головного мозга.

[0037] В контексте настоящего документа термины «лечить» или «лечение» относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование рака. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь перечисленным, облегчение симптомов, уменьшение степени выраженности заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию (будь то частичную или полную), поддающиеся определению или не поддающиеся определению. «Лечение» может также означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью без получения лечения. Нуждающиеся в лечении субъекты включают субъектов, уже страдающих от состояния или нарушения, а также субъектов, подверженных развитию состояния или нарушения, либо субъектов, у которых состояние или нарушение необходимо предотвратить.

[0038] Под «субъектом», или «индивидуумом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» подразумевается любой субъект, в частности, субъект, относящийся к млекопитающему, для которого желательны диагностика, прогноз или терапия. Субъекты, относящиеся к млекопитающим, включают людей, одомашненных животных, сельскохозяйственных животных и животных в зоопарках, спортивных или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и так далее.

[0039] В контексте настоящего документа такие выражения, как «пациенту, нуждающемуся в лечении» или «субъекту, нуждающемуся в лечении» включают субъектов, таких как субъекты, относящиеся к млекопитающим, которые получили бы пользу от введения oHSV-1 или композиции согласно настоящему изобретению, при применении, например, для выявления, для процедуры диагностики и/или для лечения.

[0040] Специалисту в данной области техники также ясно, что модифицированные геномы, раскрытые в настоящем документе, могут быть модифицированы так, что их нуклеотидная последовательность отличается от модифицированных полинуклеотидов, из которых они были получены. Например, полинуклеотидная или нуклеотидная последовательность, полученная из обозначенной последовательности ДНК, может быть схожей с исходной последовательностью, например, может характеризоваться определенным процентом идентичности исходной последовательности, например, она может быть на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична исходной последовательности.

[0041] Кроме того, могут быть произведены замены, делеции или вставки нуклеотидов или аминокислот, приводящие к консервативным заменам или изменениям в «несущественных» областях аминокислот.Например, полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из обозначенного белка, может быть идентична исходной последовательности за исключением одной или более замен, вставок или делеций отдельных аминокислот, например, одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, пятнадцати, двадцати или более замен, вставок или делеций отдельных аминокислот.В отдельных вариантах осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность, полученная из обозначенного белка, содержит от одной до пяти, от одной до десяти, от одной до пятнадцати или от одной до двадцати замен, вставок или делеций отдельных аминокислот по сравнению с исходной последовательностью.

Онколитический вирус простого герпеса 1 типа

[0042] Геном HSV-1 состоит из двух ковалентно связанных компонентов, обозначаемых L и S. Каждый компонент состоит из уникальных последовательностей (U_L для компонента L, U_S для компонента S), фланкированных инвертированными повторами, т.е. концевыми повторами и внутренними повторами. Инвертированные повторы компонента L обозначаются ab и b'a'. Инвертированные повторы компонента S обозначаются а'с' и са. Инвертированные повторы b'a' и а'с' составляют область внутреннего инвертированного повтора. Известно, что области инвертированных повторов обоих компонентов L и S содержат две копии пяти генов, кодирующих белки, обозначаемые ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, соответственно, и длинные участки ДНК, которые транскрибируются, но не кодируют белки, включая, например, интроны ICP0, домен LAT, последовательности «а» и т.д.

[0043] Гомологичная рекомбинация между концевыми повторами приводит к инверсии компонентов L и S генома HSV-1, что дает четыре линейных изомера в эквимолярных концентрациях. Эти изомеры обозначаются Р (прототип), I_L (инверсия компонента L), I_S (инверсия компонента S) и I_SL (инверсия обоих компонентов L и S). Геном HSV-1 кодирует приблизительно 90 уникальных единиц транскрипции (генов), приблизительно половина из которых являются существенными для репликации вируса в благоприятной среде культуры ткани. Остальные не являются обязательными для роста в клетках в культуре. Однако эти так называемые «несущественные» гены, скорее всего, являются обязательными для репликации в системе животных. Они часто кодируют функции, которые участвуют во взаимодействиях вирус-хозяин, например, вызывая уклонение от иммунного ответа и «отключение» клетки-хозяина.

[0044] Белок инфицированной клетки 34.5 (ICP34.5) представляет собой белок, кодируемый геном γ34.5 (также известный как γ₁34.5), и он блокирует ответ в виде клеточного стресса на вирусную инфекцию. При инфицировании клетки HSV, протеинкиназа R активируется двухцепочечной РНК вируса. Затем протеинкиназа R фосфорилирует белок, называемый эукариотическим фактором инициации-2А (eIF-2A), который инактивирует eIF-2A. EIF-2A необходим для трансляции, поэтому, отключая eIF-2A, клетка предотвращает захват вирусом своего собственного белок-синтезирующего аппарата. В свою очередь, чтобы преодолеть эту защиту, в ходе эволюции вирусы приобрели ICP34.5; он активирует белковую фосфатазу-1А, которая дефосфорилирует eIF-2A, вновь обеспечивая осуществление трансляции. HSV, не имеющий гена γ34.5, не сможет реплицироваться в нормальных клетках, потому что он не может синтезировать белки. В геноме HSV-1 есть две копии гена γ34.5, фланкирующие компонент U_L: одна в концевом повторе, а другая - во внутреннем повторе.

[0045] В одном аспекте настоящего изобретения предложен онколитический вирус простого герпеса 1 типа (oHSV-1), генетически сконструированный таким образом, чтобы обе копии гена γ34.5 были неспособны экспрессировать функциональные белки ICP34.5, и oHSV-1 дополнительно модифицирован для делеции области внутреннего инвертированного повтора генома. Делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов, включая гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора. Однако все представленные в одной копии гены, включая U_L1 - U_L56 и U_S1 - U_S12, в компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

[0046] В некоторых вариантах осуществления модификация включает изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5. Под «неспособностью экспрессировать функциональный белок ICP34.5» подразумевается, что γ34.5 не определяется на уровне белка или мРНК в сконструированном вирусе, или белок ICP34.5 экспрессируется вирусом, но является нефункциональным или частично функциональным. Процедуры для достижения вышеуказанного легко доступны в области генной инженерии и известны специалисту в данной области техники. Например, изменение может включать вставку, мутацию или добавление одного или более нуклеотидов в кодирующую или регуляторную область копии гена γ34.5 или делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5. В некоторых вариантах осуществления изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5.

[0047] OHSV-1, раскрытый в настоящем документе, не имеет обеих копий гена γ34.5. Вторую копию гена γ34.5, которая расположена во внутреннем повторе компонента U_L, подвергают делеции посредством делеции области внутреннего инвертированного повтора генома. Как описано выше, область внутреннего инвертированного повтора состоит из внутреннего повтора компонента U_L и внутреннего повтора компонента U_S. Одна копия представленных в двух копиях генов, включая гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и одна копия дуплицированных некодирующих последовательностей расположены в области внутреннего инвертированного повтора. Следовательно, делеция области внутреннего инвертированного повтора приведет к делеций одной копии представленных в двух копиях генов, включая вторую копию гена γ34.5, и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления дуплицированные некодирующие последовательности включают, например, интроны ICP0, домен LAT и последовательности «а». Следовательно, в некоторых вариантах осуществления делеция области внутреннего инвертированного повтора генома приводит к делеции одной копии каждого из ICPO, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О и одной копии каждого из интронов ICP0, домена LAT и последовательностей «а». Таким образом, вторая копия каждого из ICP0, ICP4, ORF Р и ORF О и вторая копия каждого из интронов ICP0, домена LAT и последовательностей «а» сохраняются в сконструированном геноме oHSV-1.

[0048] В настоящем изобретении делецию области внутреннего инвертированного повтора осуществляют точным образом, чтобы все представленные в одной копии гены, включая U_L1-U_L56 и U_S1-U_S12, в компонентах генома U_L и U_S остались интактными, так чтобы они были способны экспрессировать соответствующие функциональные белки. В данном контексте «все представленные в одной копии гены в компонентах генома U_L и U_S являются интактными» означает, что ORF (открытая рамка считывания) каждого из этих представленных в одной копии генов и регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии каждой ORF, такие как промоторы и энхансеры, являются интактными, для обеспечения успешной экспрессии ORF и функциональности белков, транслируемых с ORF. Под «интактными» подразумевается, что кодирующие последовательности каждого из представленных в одной копии генов являются по меньшей мере функциональными, но это не означает, что последовательности должны быть на 100% идентичными встречающимся в природе последовательностям. Последовательности могут незначительно отличаться нуклеотидной последовательностью от встречающихся в природе последовательностей вследствие, например, консервативных замен или изменений в «несущественных» областях. В данном контексте последовательности могут быть на 90%, 95%, 98% или 99% идентичны встречающимся в природе последовательностям.

[0049] Учитывая, что положения каждого из представленных в одной копии генов в геноме HSV-1 известны из уровня техники и зависят от штаммов и изомеров генома вируса HSV-1, специалистам в данной области техники будет ясно, что точное первое и последнее положения нуклеотидов, которые должны быть подвергнуты делеции в области внутреннего инвертированного повтора, варьируются от штаммов к штаммам и от изомеров к изомерам, но их можно легко определить с помощью известных в данной области техники методик. Следует принимать во внимание, что не предполагается ограничения настоящего изобретения какими-либо конкретными изомерами генома или штаммами вируса HSV-1. Напротив, авторы настоящего изобретения полагают, что все штаммы и изомеры вируса HSV-1 являются подходящими.

[0050] Например, в одном из вариантов осуществления изобретения, в котором используется штамм F HSV-1, геном которого доступен под учетным номером GenBank №GU734771.1, делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома. Специалисту в данной области техники также ясно, что также возможны другие штаммы, при условии, что геномная ДНК секвенирована. Технологии секвенирования легко доступны в литературных источниках и на рынке. Например, в другом варианте осуществления делеция может быть осуществлена в штамме 17 HSV-1, геном которого доступен под учетным номером GenBank №NC_001806.2. В другом варианте осуществления делеция может быть осуществлена в штамме KOS 1.1, геном которого доступен под учетным номером GenBank №KT899744.

[0051] В некоторых вариантах осуществления делецию осуществляют точно в заранее определенных положениях, чтобы достичь вырезания фрагмента ДНК от последнего гена в компоненте L (такого как U_L56 в случае изомера Р) до первого гена в компоненте S (такого как U_S1 в случае изомера Р). Учитывая, что для HSV-1 существует четыре различных изомера (т.е. изомеры Р, I_S, I_L и I_SL), названия первых генов и последних генов среди изомеров будут различаться. В контексте настоящего изобретения нумерация генов (т.е. первого и последнего) в компоненте U_L определяется в ориентации от концевого повтора компонента U_L к внутреннему повтору компонента U_L, а нумерация генов в компоненте U_S определяется в ориентации от внутреннего повтора компонента U_S к концевому повтору компонента U_S. Следовательно, в случае изомера «прототип» (Р) первый ген в компоненте U_L будет таким, как ген U_L1, а последний ген в компоненте U_L будет таким, как U_L56, и первый ген в компоненте U_S будет таким, как ген U_S1, а последний ген в компоненте U_S будет таким, как U_S12. В случае изомера I_S первый ген в компоненте U_L будет таким, как ген U_L1, а последний ген в компоненте U_L будет таким, как U_L56, и первый ген в компоненте U_S будет таким, как ген U_S12, а последний ген в компоненте U_S будет таким, как U_S1. В случае изомера I_L первый ген в компоненте U_L будет таким, как ген U_L56, а последний ген в компоненте U_L будет таким, как U_L1, и первый ген в компоненте U_S будет таким, как ген U_S1, а последний ген в компоненте U_S будет таким, как U_S12. В случае изомера I_SL первый ген в компоненте U_L будет таким, как ген U_L56, а последний ген в компоненте U_L будет таким, как U_L1, и первый ген в компоненте U_S будет таким, как ген U_S12, а последний ген в компоненте U_S будет таким, как U_S1.

[0052] Делеция области внутреннего инвертированного повтора не приведет к повреждению представленных в одной копии генов в компоненте U_S или U_L, так что кодирующие и регуляторные последовательности представленных в одной копии генов, включая про моторные последовательности, необходимые для экспрессии представленных в одной копии генов, будут интактными. Например, в случае изомера Р делеция приводит к вырезанию фрагмента ДНК от конца стоп-кодона такого гена, как U_L56, до начала промоторной последовательности такого гена, как U_S1. Например, в случае изомера I_L делеция приводит к вырезанию фрагмента ДНК от начала промоторной последовательности такого гена, как U_L1, до начала промоторной последовательности такого гена, как U_S1.

[0053] Сохранение всех представленных в одной копии генов и второй копии каждого из ICP0, ICP4, ORF Р и ORF О, и второй копии каждого из интронов ICP0, домена LAT и последовательностей «а» в сконструированном геноме oHSV-1 обеспечивает более сильный вирус до или после включения вставленных чужеродных генов. Таким образом, oHSV-1 является в максимальной степени устойчивым к факторам окружающей среды, таким как температура, давление, УФ-излучение и т.д. Данный подход также позволяет максимизировать диапазон раковых клеток, в которых онколитический HSV-1 является эффективным.

[0054] Для получения модифицированного вектора на основе HSV-1, описанного в настоящем описании, могут быть использованы различные способы манипуляций с генами, известные в данной области техники. Например, применяют технологию искусственных бактериальных хромосом (ВАС). В качестве другого примера в настоящем изобретении может быть использована COS-плазмида. В публикации WO 2017/181420 раскрыт вектор на основе oHSV-1, сконструированный по технологии ВАС, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

[0055] Количество чужеродных последовательностей ДНК, которое можно вставить в вирус дикого типа, ограничено, поскольку они препятствуют упаковке ДНК в вирионы. Точная делеция в обозначенной области обеспечивает идеальное пространство для вставки чужеродных последовательностей ДНК. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения делеция удаляет по меньшей мере 15 т.п.о. (тысяч пар оснований) онколитического вирусного вектора, в результате чего можно разместить аналогичное количество чужеродных последовательностей ДНК. В других исследованиях было показано, что геномы дикого типа допускают еще 7 т.п.о. ДНК.

[0056] В некоторых вариантах осуществления в генетически сконструированный oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент.В настоящем изобретении встраивание гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1, таких как любые из представленных в одной копии генов или других представленных в двух копиях генов, как описано выше.

[0057] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена между соседними представленными в одной копии генами в компоненте U_L или U_S. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и между соседними представленными в одной копии генами в компоненте U_L или U_S. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и между генами U_L3 и U_L4.

[0058] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуностимулирующий агент.В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12. В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12 человека или гуманизированный IL-12.

[0059] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммунотерапевтический агент.В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент выбран из анти-PD-1 агента, анти-CTLA-4 агента или обоих из них. В одном из вариантов осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

[0060] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую как иммуностимулирующий агент, так и иммунотерапевтический агент.В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12. В одном из вариантов осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12 человека или гуманизированный IL-12. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент выбран из анти-PD-1 агента, анти-CTLA-4 агента или обоих из них. В одном из вариантов осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

[0061] В вариантах осуществления изобретения, в которых вставляют только одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуностимулирующий или иммунотерапевтический агент, указанную гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно встраивают в делетированную область внутреннего инвертированного повтора генома. В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину, аналогичную длине делетированного фрагмента. В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину, на 20% большую или меньшую, чем длина делетированного фрагмента. В другом варианте осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину, на 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% большую или меньшую, чем длина делетированного фрагмента.

[0062] В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину менее приблизительно 18 т.п.о., приблизительно 17 т.п.о. или приблизительно 16 т.п.о. В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину более приблизительно 10 т.п.о., 11 т.п.о., 12 т.п.о., 13 т.п.о. или 14 т.п.о. В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину от приблизительно 14 т.п.о. до приблизительно 16 т.п.о. В одном из вариантов осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину приблизительно 15 т.п.о.

[0063] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит по меньшей мере две гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие иммуностимулирующие и/или иммунотерапевтические агенты. В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие два разных иммуностимулирующих агента. Например, в одном из вариантов осуществления oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие как IL-12, так и GM-CSF. В другом варианте осуществления oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие как IL-15, так и GM-CSF. В дополнительном варианте осуществления oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие как IL-12, так и IL-15.

[0064] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие два разных иммунотерапевтических агента. В одном из вариантов осуществления, например, oHSV-1 содержит гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие как анти-PD-1 агент, так и анти-CTLA-4 агент.

[0065] В вариантах осуществления, в которых встраивают более одной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуностимулирующие и/или иммунотерапевтические агенты, первую гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно вставляют в делетированную область внутреннего повтора генома. Вторая или последующие гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты могут быть вставлены в компонент L генома. В одном из вариантов осуществления вторую гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты вставляют между генами U_L3 и U_L4 компонента L. В одном из вариантов осуществления вторую гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты вставляют между генами U_L37 и U_L38 компонента L.

[0066] В одном из вариантов осуществления первая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует IL-12, вставленный в делетированную область внутреннего повтора генома. В одном из вариантов осуществления вторая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует анти-PD-1 агент, вставленный между генами U_L3 и U_L4 компонента L.

[0067] Следует иметь в виду, что вставки одной или более гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты в геном онколитического HSV-1 не препятствуют экспрессии нативных генов HSV-1, и гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты стабильно встроены в модифицированный геном HSV-1, вследствие чего можно ожидать функциональной экспрессии гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты.

[0068] Гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие иммуностимулирующие и/или иммунотерапевтические агенты, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид или белок, вместе с регуляторными элементами для экспрессии. Как правило, регуляторные элементы, которые присутствуют в рекомбинантном гене и которые выбирают в зависимости от клеток-хозяев, применяемых для экспрессии, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии, включают промотор транскрипции, участок связывания рибосомы и терминатор. В рекомбинантном векторе экспрессии под «функционально связанным» подразумевается, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, связана с регуляторной последовательностью(ями) с обеспечением возможности экспрессии этой нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда вирус вводят в клетку-хозяина). Подразумевается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности включают последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во множестве типов клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности исключительно в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности).

[0069] Специалисты в данной области техники могут выбрать подходящие регуляторные элементы на основании, например, желаемой тканевой специфичности и уровня экспрессии. Например, может быть использован специфичный для типа клеток или опухолеспецифический промотор для ограничения экспрессии продукта гена определенным типом клеток. Помимо использования тканеспецифических промоторов, местное введение вирусов может обеспечить локальную экспрессию и эффект.Примеры нетканеспецифических промоторов, которые могут быть использованы, включают ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (патент США №4168062) и промотор вируса саркомы Рауса. Также могут быть использованы промоторы HSV, такие как промоторы HSV-1 IE.

[0070] Примеры тканеспецифических промоторов, которые могут быть использованы в данной технологии, включают, например, промотор простат-специфического антигена (PSA), специфичный для клеток предстательной железы; промотор десмина, специфичный для мышечных клеток; промотор енолазы, специфичный для нейронов; промотор бета-глобина, специфичный для эритроидных клеток; промотор тау-глобина, также специфичный для эритроидных клеток; промотор гормона роста, специфичный для питуицитов; промотор инсулина, специфичный для бета-клеток поджелудочной железы; промотор глиального фибриллярного кислого белка, специфичный для астроцитов; промотор тирозингидроксилазы, специфичный для катехоламинергических нейронов; промотор предшественника бета-амилоида, специфичный для нейронов; промотор дофамин-бета-гидроксилазы, специфичный для норадренергических и адренергических нейронов; промотор триптофангидроксилазы, специфичный для серотонина/клеток шишковидной железы; промотор холинацетилтрансферазы, специфичный для холинергических нейронов; промотор декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (AADC), специфичный для катехоламинергических клеток/5-НТ/типа D; промотор проэнкефалина, специфичный для нейрональных/сперматогенных эпидидимальных клеток; промотор reg (литостатин), специфичный для опухолей толстой и прямой кишки, а также клеток поджелудочной железы и почек; и промотор пептида, родственного паратиреоидному гормону (PTHrP), специфичный для опухолей печени и слепой кишки, а также неврилемомы, клеток почек, поджелудочной железы и надпочечников.

[0071] Примеры промоторов, которые специфично функционируют в опухолевых клетках, включают промотор стромелизина-3, специфичный для клеток рака молочной железы; промотор поверхностно-активного белка А, специфичный для клеток немелкоклеточного рака легкого; промотор секреторного ингибитора лейкоцитарных протеаз (SLPI), специфичный для экспрессирующих SLPI карцином; промотор тирозиназы, специфичный для клеток меланомы; стресс-индуцибельный промотор grp78/BiP, специфичный для фибросаркомы/туморогенных клеток; адипоцитарный энхансер АР2, специфичный для адипоцитов; промотор а-1-антитрипсина и транстиретина, специфичный для гепатоцитов; промотор интерлейкина-10, специфичный для клеток мультиформной глиобластомы; промотор с-erbB-2, специфичный для клеток поджелудочной железы, молочной железы, желудка, яичников и немелкоклеточного рака легкого; промотор а-В-кристаллина/белка теплового шока 27, специфичный для клеток опухоли головного мозга; промотор основного фактора роста фибробластов, специфичный для клеток глиомы и менингиомы; промотор рецептора эпидермального фактора роста, специфичный для клеток плоскоклеточной карциномы, глиомы и опухоли молочной железы; промотор муцин-подобного гликопротеина (DF3, MUC1), специфичный для клеток карциномы молочной железы; промотор mts1, специфичный для метастатических опухолей; промотор NSE, специфичный для клеток мелкоклеточного рака легкого; промотор рецептора соматостатина, специфичный для клеток мелкоклеточного рака легкого; промоторы с-erbB-3 и с-erbB-2, специфичные для клеток рака молочной железы; промотор с-erbB4, специфичный для рака молочной железы и желудка; промотор тиреоглобулина, специфичный для клеток карциномы щитовидной железы; промотор альфа-фетопротеина (AFP), специфичный для клеток гепатомы; промотор виллина, специфичный для клеток рака желудка; и промотор альбумина, специфичный для клеток гепатомы. В другом варианте осуществления используют промотор TERT или промотор сурвивина.

[0072] Например, в некоторых вариантах осуществления гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны с промотором, например, промотором CMV или промотором Egr-1. В одном из вариантов осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая IL-12, функционально связана с промотором Egr-1. В другом варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая scFv к hPD1, функционально связана с промотором CMV.

[0073] В отдельных вариантах осуществления oHSV-1 согласно настоящему изобретению кодирует один или более иммуностимулирующих агентов (также называемых иммуностимулирующими молекулами), включая цитокины, такие как IL-2, IL4, IL-12, GM-CSF, IFN"y, хемокины, такие как MIP-1, МСР-1, IL-8, и фактор роста.

[0074] В качестве альтернативы или дополнительно, oHSV-1 согласно настоящему изобретению кодирует один или более иммунотерапевтических агентов, например, агент, связывающий PD-1 (или анти-PD-1 агент), или агент, связывающий CTLA-4 (или анти-CTLA-4 агент), включая антитела или их фрагменты, например, антитело к PD1, специфично связывающееся с PD-1, или антитело к CTLA-4, специфично связывающееся с CTLA-4. Антитело к PD-1 может представлять собой одноцепочечное антитело, которое выступает антагонистом активности PD-1. В других вариантах осуществления онколитический вирус экспрессирует агент, который выступает антагонистом связывания лигандов PD-1 с рецептором, например, антитела к PD-L1 и/или PD-L2, ловушки PD-L1 и/или PD-L2, или растворимый рецептор PD-1.

[0075] Путь передачи сигналов PD-1 играет важную роль в опухолеассоциированной дисфункции иммунной системы. Инфицирование и лизис опухолевых клеток могут вызвать высокоспецифичный противоопухолевый иммунный ответ, который уничтожает клетки инокулированной опухоли, а также клетки отдаленной, развившейся, неинокулированной опухоли. Опухоли и их микроокружения выработали механизмы для уклонения от природного противоопухолевого иммунного ответа, его подавления и инактивации. Например, опухоли могут понижающе регулировать рецепторы-мишени, заключать себя в волокнистый внеклеточный стромальный матрикс или повышающе регулировать рецепторы или лиганды хозяина, участвующие в активации или ркурутинге регуляторных иммунных клеток. Было установлено, что естественные и/или адаптивные Т-регуляторные клетки (Treg) участвуют в опухоль-опосредованном подавлении иммунного ответа Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что блокада PD-1 может ингибировать активность Treg и улучшать эффективность опухолереактивных CTL(цитотоксических лимфоцитов). Другие аспекты данной технологии будут более подробно описаны ниже. Блокада PD-1 может также стимулировать противоопухолевый иммунный ответ за счет блокирования инактивации Т-клеток (CTL и хелперов) и В-клеток.

[0076] В одном аспекте настоящей технологии предложен онколитический вирус, который несет ген, кодирующий агент, связывающий PD-1. Программируемая клеточная гибель 1 (PD-1) представляет собой трансмембранный рецептор I типа массой 50-55 кДа, изначально выявленный методом вычитающей гибридизации линии мышиных Т-клеток, претерпевающей апоптоз. Будучи членом семейства гена CD28, PD-1 экспрессируется на активированных Т-, В-клетках и клетках миелоидной линии. PD-1 человека и мыши характеризуются приблизительно 60% идентичностью аминокислот с сохранением четырех потенциальных сайтов N-гликозилирования и остатков, которые определяют V-домен Ig. Были идентифицированы два лиганда PD-1: лиганд 1 (PD-L1) и лиганд 2 (PD-L2) PD; оба принадлежат к надсемейству В7. PD-L1 экспрессируется на многих типах клеток, включая Т-, В-, эндотелиальные и эпителиальные клетки, а также антигенпрезентирующие клетки. Напротив, PD-L2 имеет узкий диапазон экспрессии на профессиональных антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки и макрофаги.

[0077] PD-1 отрицательно модулирует активацию Т-клеток, и эта ингибирующая функция связана с иммунорецепторным ингибирующим мотивом на основе тирозина (ITIM) его цитоплазматического домена. Нарушение этой ингибирующей функции PD-1 может привести к аутоиммунным реакциям. Обратный сценарий также может быть пагубным. Было установлено, что устойчивые отрицательные сигналы от PD-1 участвуют в нарушении функции Т-клеток во многих патологических ситуациях, таких как уклонение опухоли от иммунного ответа и хронические вирусные инфекции.

[0078] Противоопухолевый иммунитет хозяина главным образом зависит от опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL). Множество данных позволили установить, что TIL подвержены ингибирующей регуляции PD-1. Во-первых, экспрессия PD-L1 подтверждена во многих человеческих и мышиных опухолевых линиях, и эта экспрессия может быть еще больше усилена под действием IFN-γ in vitro. Во-вторых, экспрессия PD-L1 опухолевыми клетками была непосредственно связана с их устойчивостью к лизису противоопухолевыми Т-клетками in vitro. В-третьих, мыши с нокаутом PD-1 являются устойчивыми к трансплантируемым опухолям, и Т-клетки от мышей с нокаутом PD-1 высокоэффективны в отношении отторжения опухоли при адоптивном переносе мышам с опухолями. В-четвертых, блокада ингибирующих сигналов PD-1 моноклональным антителом может усиливать противоопухолевый иммунитет хозяина у мышей. В-пятых, высокие степени экспрессии PD-L1 в опухолях (определенные посредством иммуногистохимического окрашивания) связаны с неблагоприятным прогнозом при многих видах рака человека.

[0079] Онколитическая виротерапия является эффективным способом формирования иммунной системы хозяина за счет увеличения популяций Т- или В- клеток, специфичных в отношении опухолеспецифических антигенов, которые высвобождаются после онколизиса. Иммуногенность опухолеспецифических антигенов в большой степени зависит от аффинности иммунных рецепторов хозяина (В-клеточных рецепторов или Т-клеточных рецепторов) к антигенным эпитопам и порога толерантности хозяина. Высокоаффинные взаимодействия будут направлять иммунные клетки хозяина для прохождения множества циклов пролиферации и дифференцировки для превращения в долгоживущие клетки памяти. Механизмы толерантности хозяина уравновесят такую пролиферацию и экспансию, чтобы минимизировать потенциальное повреждение тканей вследствие локальной иммунной активации. Ингибирующие сигналы PD-1 являются частью таких механизмов толерантности хозяина, что подтверждается следующими данными. Во-первых, экспрессия PD-1 повышена в активно пролиферирующих Т-клетках, в особенности в клетках с терминально дифференцированными фенотипами, т.е. эффекторными фенотипами. Эффекторные клетки часто связаны с мощной цитотоксической функцией и продукцией цитокинов. Во-вторых, PD-L1 важен для поддержания периферической толерантности и для локального ограничения чрезмерно активных Т-клеток. Таким образом, ингибирование PD-1 с помощью агента, связывающего PD-1, экспрессируемого в микроокружении опухоли, может являться эффективной стратегией для повышения активности TIL и стимуляции эффективного и долговременного противоопухолевого иммунного ответа.

[0080] В одном аспекте настоящей технологии предложен онколитический вирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления анти-PD-1 агенты содержат вариабельную область антитела, которая обеспечивает специфичное связывание с эпитопом PD-1. Вариабельная область антитела может присутствовать, например, в полноразмерном антителе, фрагменте антитела и рекомбинантном производном антитела или фрагмента антитела. Термин «антитело» описывает иммуноглобулин, вне зависимости от того, является ли он природным либо полученным частично или полностью синтетическим путем. Таким образом, анти-PD-1 агенты согласно настоящей технологии включают любой полипептид или белок, имеющий связывающий домен, специфичный в отношении связывания с эпитопом PD-1.

[0081] Различные классы антител характеризуются различными структурами. Различные области антитела могут быть проиллюстрированы на примере IgG. Молекула IgG содержит четыре полипептидные цепи: две более длинные тяжелые цепи и две более короткие легкие цепи, которые соединены между собой дисульфидными связями. Каждая из тяжелой и легкой цепей содержит константную область и вариабельную область. Тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH1, СН2 и СН3). Легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). В пределах вариабельных областей присутствует три гипервариабельных области, которые отвечают за антигенную специфичность.

[0082] Гипервариабельные области, которые обычно называют определяющими комплементарность областями («CDR»), расположены между более консервативными фланкирующими областями, называемыми «каркасными областями» («FW»). Существует четыре (4) области FW и три (3) CDR, которые расположены от NH2-конца к СООН-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Например, каркасные области и CDR могут быть идентифицированы на основании анализа определений как согласно Kabat, так и согласно Chothia. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Две карбоксильные области тяжелой цепи представляют собой константные области, соединенные дисульфидными связями с получением Fc-области. Fc-область важна для обеспечения эффекторных функций. Каждая из двух тяжелых цепей, образующих Fc-область, продолжается разными Fab-областями через шарнирную область.

[0083] Анти-PD-1 агенты или анти-CTLA-4 агенты, как правило, содержат вариабельную область антитела. Такие фрагменты антител включают, не ограничиваясь перечисленным, (i) Fab-фрагмент одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VH, VL, СН и CL; (ii) Fab2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VH и VL одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент, содержащий либо домен VH, либо VL; (vi) scAb - фрагмент антитела, содержащий VH и VL, а также либо С1, либо СН1, и (vii) искусственные антитела на основе белковых каркасов, включая, не ограничиваясь перечисленным, антитела на основе полипептида фибронектина III типа. Более того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных технологий синтетическим линкером, позволяющим получить их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул, известных как одно цепочечный Fv (scFv). Таким образом, в рекомбинантном производном может присутствовать вариабельная область антитела. Примеры рекомбинантных производных включают одноцепочечные антитела, диатело, триатело, тетратело и миниантитело. Анти-PD-1 агент или анти-CTLA-4 агент может также содержать одну или более вариабельных областей, распознающих одинаковые или разные эпитопы.

[0084] В некоторых вариантах осуществления анти-PD-1 агенты или анти-CTLA-4 агенты кодируются онколитический вирусом, полученным с помощью технологий рекомбинантных нуклеиновых кислот.Различные анти-PD-1 агенты могут быть получены различными методами, включая, например, одноцепочечный белок, содержащий область VH и область VL, соединенные линкерной последовательностью, такой как scFv, и антитела или их фрагменты; и многоцепочечный белок, содержащий область VH и VL на отдельных полипептидах. Технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот включают конструирование нуклеиновой кислоты-матрицы для синтеза белка. Подходящие технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области техники. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к PD-1 или антитело к CTLA-4, может экспрессироваться в клетке, инфицированной онколитическим вирусом, и высвобождаться в микроокружение опухоли после вирусного лизиса. По существу, клетка выступает фабрикой по производству кодируемого белка.

[0085] Нуклеиновая кислота, содержащая один или более рекомбинантных генов, кодирующих область VH или область VL, или обе из них, анти-PD-1 или анти-CTLA-4 агента, может быть использована для получения полноразмерного белка/полипептида, связывающегося с PD-1/CTLA-4. Полноразмерный связывающий агент может быть получен, например, с использованием одного гена для кодирования одноцепочечного белка, содержащего область VH и область VL, соединенные линкером, такого как scFv, или с использованием нескольких рекомбинантных областей, например, для получения как области VH, так и области VL.

[0086] Примеры антител к PD-1 или антител к CTLA-4, либо их фрагментов или производных, подходящих для настоящего изобретения, доступны в данной области техники. См., например, публикации WO 2006/121168, WO 2014/055648, WO 2008/156712, заявку US 2014/0234296 или патент США №6984720.

Фармацевтические композиции

[0087] В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения опухоли, содержащая эффективное количество генетически сконструированного oHSV-1, как описано в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.

[0088] В некоторых вариантах фармацевтическая композиция для лечения опухоли содержит эффективное количество генетически сконструированного oHSV-1 и фармацевтически приемлемый носитель, где генетически сконструированный oHSV-1 содержит модифицированный геном, где указанная модификация включает (а) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и (b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеций одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора, где представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

[0089] В некоторых вариантах осуществления указанное изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5. В некоторых вариантах осуществления дуплицированные некодирующие последовательности включают интроны ICP0, домен LAT и последовательность «а». В некоторых вариантах осуществления все представленные в одной копии гены в обоих компонентах U_L и U_S включают гены с U_L1 по U_L56 в компоненте U_L и гены с U_S1 по U_S12 в компоненте U_S.

[0090] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 выбран из группы, состоящей из штаммов F, KOS и 17. В некоторых вариантах осуществления делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию положений нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома штамма F.

[0091] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 имеет изомер генома, представляющий собой прототип (Р), и делеция области внутреннего инвертированного повтора проходит от стоп-кодона последнего гена (например, U_L56) в компоненте U_L до промотора первого гена (например, U_S1) в компоненте U_S.

[0092] В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент, где указанное встраивание не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий агент и иммунотерапевтический агент.

[0093] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент, анти-CTLA-4 агент или оба из них. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

[0094] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и/или между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12 и анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12, встроена в область внутреннего инвертированного повтора, и гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-PD-1 агент, встроена между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

[0095] Онколитический вирус может быть приготовлен в подходящем фармацевтически приемлемом носителе или вспомогательном веществе. В обычных условиях хранения и применения такие препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии, и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и достаточно текучей для легкого введения через шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы.

[0096] Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, включающие, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), их подходящие смеси и/или растительные масла. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Действие микроорганизмов можно предотвращать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включение в состав изотонических агентов, например, сахаров или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может быть обеспечено посредством включения в композиции агентов, которые замедляют всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

[0097] Для парентерального введения в водном растворе, например, раствор при необходимости должен содержать буфер, и жидкому растворителю сначала необходимо придать изотоничность с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Эти конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутриопухолевого и внутрибрюшинного введения. В этом отношении, специалистам в данной области техники известна стерильная водная среда, которая может быть использована для настоящего изобретения. Например, одна доза может быть растворена в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавлена к 1000 мл жидкости для гиподермоклиза, либо инъецирована в предложенное место инфузии. Некоторые вариации дозировки будут неизбежны в зависимости от состояния субъекта, лечение которого осуществляют. В любом случае лицо, ответственное за введение, определит подходящую дозу для отдельно взятого субъекта. Более того, для введения людям препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты согласно требованиям Службы биологических стандартов Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA Office of Biologies standards).

[0098] Стерильные растворы для инъекций готовят посредством включения активных соединений в требуемом количестве в подходящий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по необходимости, с последующей стерилизующей стерилизацией. Обычно дисперсии готовят посредством включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную несущую среду, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, дающие порошок действующего ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент, получаемый из их раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации.

[0099] Композиции, раскрытые в настоящем документе, могут представлены в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные со свободными аминогруппами белка), которые образованы с неорганическими кислотами, такими как, например, хлороводородная или фосфорная кислоты, или с органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены с неорганическими основаниями, такими как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и с органическими основаниями, такими как изо пропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. После приготовления растворы вводят способом, совместимым с дозированной формой, и в количестве, которое является терапевтически эффективным. Составы легко могут быть введены в ряде дозированных форм, таких как растворы для инъекций, капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и т.п.

[0100] В контексте настоящего документа «носитель» включает все возможные растворители, дисперсионные среды, несущие среды, покрытия, разбавители, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, предусмотрено их использование в терапевтических композициях. Также в композиции могут быть включены вспомогательные активные ингредиенты.

[0101] Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям и композициям, которые не вызывают аллергической или схожей неблагоприятной реакции при введении людям. Приготовление водной композиции, которая содержит белок в качестве активного ингредиента, хорошо известно в данной области техники. Обычно такие композиции готовят в виде препаратов для инъекций, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией.

[0102] В некоторых вариантах осуществления композицию, раскрытую в настоящем документе, применяют для лечения опухоли. В некоторых вариантах осуществления композицию, раскрытую в настоящем документе, применяют для лечения солидной опухоли. В некоторых вариантах осуществления композицию, раскрытую в настоящем документе, применяют для лечения опухоли головного мозга. В некоторых вариантах осуществления композицию, раскрытую в настоящем документе, применяют для лечения опухоли головного мозга, которая выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

Варианты применения и терапии

[0103] В другом аспекте настоящего изобретения предложен генетически сконструированный oHSV-1, описанный в настоящем документе, для применения для лечения опухоли у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения предложен генетически сконструированный oHSV-1, описанный в настоящем документе, для применения для лечения солидной опухоли у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения предложен генетически сконструированный oHSV-1, описанный в настоящем документе, для применения для лечения опухоли головного мозга у субъекта.

[0104] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный oHSV-1 содержит модифицированный геном, где указанная модификация включает (а) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и (b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора, где представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

[0105] В некоторых вариантах осуществления указанное изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5. В некоторых вариантах осуществления дуплицированные некодирующие последовательности включают интроны ICP0, домен LAT и последовательность «а». В некоторых вариантах осуществления все представленные в одной копии гены в обоих компонентах U_L и U_S включают гены с U_L1 по U_L56 в компоненте U_L и гены с U_S1 по U_S12 в компоненте U_S.

[0106] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 выбран из группы, состоящей из штаммов F, KOS и 17. В некоторых вариантах осуществления делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию положений нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома штамма F.

[0107] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 имеет изомер генома, представляющий собой прототип (Р), и делеция области внутреннего инвертированного повтора проходит от стоп-кодона последнего гена (например, U_L56) в компоненте U_L до промотора первого гена (например, U_S1) в компоненте U_S.

[0108] В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент, где указанное встраивание не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий агент и иммунотерапевтический агент.

[0109] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент, анти-CTLA-4 агент или оба из них. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

[0110] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и/или между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12 и анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12, встроена в область внутреннего инвертированного повтора, и гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-PD-1 агент, встроена между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

[0111] В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение генетически сконструированного oHSV-1, описанного в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства для лечения опухоли у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение генетически сконструированного oHSV-1, описанного в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства для лечения солидной опухоли у субъекта. В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение генетически сконструированного oHSV-1, описанного в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства для лечения опухоли головного мозга у субъекта.

[0112] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный oHSV-1 содержит модифицированный геном, где указанная модификация включает (а) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и (b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора, где представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF Р и ORF О, и где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

[0113] В некоторых вариантах осуществления указанное изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5. В некоторых вариантах осуществления дуплицированные некодирующие последовательности включают интроны ICP0, домен LAT и последовательность «а». В некоторых вариантах осуществления все представленные в одной копии гены в обоих компонентах U_L и U_S включают гены с U_L1 по U_L56 в компоненте U_L и гены с U_S1 по U_S12 в компоненте U_S.

[0114] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 выбран из группы, состоящей из штаммов F, KOS и 17. В некоторых вариантах осуществления делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию положений нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома штамма F.

[0115] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1 имеет изомер генома, представляющий собой прототип (Р), и делеция области внутреннего инвертированного повтора проходит от стоп-кодона последнего гена (например, U_L56) в компоненте U_L до промотора первого гена (например, U_S1) в компоненте U_S.

[0116] В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент, где указанное встраивание не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий агент и иммунотерапевтический агент.

[0117] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент, анти-CTLA-4 агент или оба из них. В некоторых вариантах осуществления иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

[0118] В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и/или между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L. В некоторых вариантах осуществления в oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12 и анти-PD-1 агент.В некоторых вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12, встроена в область внутреннего инвертированного повтора, и гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-PD-1 агент, встроена между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

[0119] В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или облегчения опухоли у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вируса oHSV-1 или фармацевтической композиции, содержащей вирус oHSV-1, описанных в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления опухоль представляет собой солидную опухоль. В отдельных вариантах осуществления опухоль представляет собой опухоль головного мозга. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы. В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.

[0120] В отдельных вариантах осуществления вирус oHSV-1 или фармацевтическую композицию вводят внутриопухолевым способом. В одном из вариантов осуществления вирус HSV-1 или фармацевтическую композицию инъецируют непосредственно в опухолевую массу в форме раствора для инъекций.

[0121] Способы согласно изобретению подходят для лечения опухолей головного мозга. Они включают в себя все опухоли внутри человеческого черепа (cranium) или в центральном спинномозговом канале. Опухоль может происходить из самого головного мозга, но также может происходить из лимфатической ткани, кровеносных сосудов, черепных нервов, мозговых оболочек (оболочек головного мозга, meninges), черепа, гипофиза или шишковидной железы. В самом головном мозге пораженные клетки могут представлять собой нейроны или глиальные клетки (которые включают астроциты, олигодендроциты и эпендимальные клетки). Опухоли головного мозга также могут происходить от распространившегося рака, первично локализованного в других органах (метастатические опухоли).

[0122] В некоторых вариантах осуществления опухоль головного мозга представляет собой глиому, такую как эпендимома, астроцитома, олигоастроцитома, олигодендроглиома, ганглиоглиома, глиобластома (также известная как мультиформная глиобластома) или смешанная глиома. Глиомы являются первичными опухолями головного мозга и подразделяются на четыре степени злокачественности (I, II, III и IV) в зависимости от их внешнего вида под микроскопом, и, в частности, наличия атипичных клеток, митозов, пролиферации эндотелия и некроза Опухоли I и II степени злокачественности, называемые «глиомами низкой степени злокачественности», не имеют ни одного из этих признаков и включают диффузные астроцитомы, пилоцитарные астроцитомы, астроцитомы низкой степени злокачественности, олигоастроцитомы низкой степени злокачественности, олигодендроглиомы низкой степени злокачественности, ганглиоглиомы, дисэмбриопластические нейроэпителиальные опухоли, плеоморфные ксантоастроцитомы и смешанные глиомы. Опухоли III и IV степени злокачественности, называемые «глиомами высокой степени злокачественности», имеют два или более из этих признаков и включают анапластические астроцитомы, анапластические олигодендроглиомы, анапластические олигоастроцитомы, анапластические эпендимомы и глиобластомы (включая гигантоклеточные глиобластомы и глиосаркомы). В одном из аспектов этих вариантов осуществления глиома представляет собой глиому низкой степени злокачественности. В другом аспекте этих вариантов осуществления глиома представляет собой глиому высокой степени злокачественности. В другом аспекте этих вариантов осуществления глиома представляет собой глиобластому.

[0123] В некоторых вариантах осуществления может быть желательно комбинировать oHSV-1 с другими агентами, эффективными для лечения рака. Например, лечение рака может быть осуществлено с помощью онколитического вируса и других видов противораковой терапии, таких как противораковые агенты или хирургическое вмешательство. В контексте настоящей технологии предусмотрено, что терапия онколитическим вирусом может применяться в сочетании с химиотерапевтическим, радиотерапевтическим, иммунотерапевтическим или другим биологическим вмешательством.

[0124] «Противораковый» агент способен отрицательно влиять на рак у субъекта, например, посредством уничтожения раковых клеток, индукции апоптоза раковых клеток, снижения скорости роста раковых клеток, снижения частоты возникновения или количества метастазов, уменьшения размера опухоли, ингибирования роста опухоли, снижения кровоснабжения опухоли или раковых клеток, стимуляции иммунного ответа против раковых клеток или опухоли, предотвращения или ингибирования прогрессирования рака или увеличения продолжительности жизни субъекта, страдающего от рака. Противораковые агенты включают биологические агенты (биотерапию), химиотерапевтические агенты и радиотерапевтические агенты. В более широком смысле эти другие композиции будут представлены в комбинированном количестве, эффективном для уничтожения или ингибирования пролиферации клетки. Данный процесс может включать приведение клеток в контакт с конструкцией экспрессии и агентом(ами) или несколькими факторами одновременно. Этого можно достичь путем приведения клетки в контакт с одной композицией или фармакологическим составом, которые включают оба агента, или путем приведения клетки в контакт с двумя отдельными композициями или составами одновременно, где одна композиция включает конструкцию экспрессии, а другая включает второй агент(ы).

[0125] В некоторых вариантах осуществления oHSV-1, раскрытый в настоящем документе, комбинируют с адъювантом. В одном из вариантов осуществления адъювант представляет собой олигонуклеотид, содержащий неметилированный CpG-мотив. Неметилированные CpG-динуклеотидные мотивы в бактериальной дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) характеризуются преимуществом, которое заключается в стимуляции секреции цитокинов некоторыми иммунными клетками для усиления врожденного и адаптивного иммунитета.

[0126] Вирусная терапия может быть проведена до или после лечения другим агентом с интервалами от нескольких минут до нескольких недель. В вариантах осуществления, в которых другой агент и онколитический вирус применяют в отношении клетки по отдельности, как правило, следует убедиться, что в промежутке между этими доставками не прошел значительный период времени, чтобы агент и вирус все еще были способны оказать эффективное комбинированное действие на клетку. В таких случаях предусмотрено, что контакт клетки с обоими агентами может быть осуществлен в пределах приблизительно 12-24 ч между контактами. Однако, в некоторых ситуациях может быть желательным значительно увеличить срок лечения, когда между соответствующими введениями проходит от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).

[0127] В некоторых вариантах осуществления субъекту проводят вторую терапию до, одновременно с или после введения oHSV-1, раскрытого в настоящем документе, или фармацевтической композиции, раскрытой в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вторая терапия представляет собой химиотерапевтическое, радиотерапевтическое, иммунотерапевтическое и/или хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

[0128] Последовательности, используемые в настоящем изобретении, обобщены ниже.

Примеры

[0129] Как показано в приведенных ниже примерах, генетически сконструированный вирус oHSV-1 с делецией обеих копий гена γ34.5, а также дополнительной делецией области внутреннего инвертированного повтора, продемонстрировал удивительно и неожиданно более высокую противоопухолевую активность на различных клетках опухолей головного мозга по сравнению с опухолевыми клетками, не относящимися к головному мозгу, или нормальными клетками. Эти результаты являются неожиданными с учетом того, что вирусы oHSV-1 со схожими структурами генома, известные из уровня техники (такие как Т3011, R3616, WT штамм F), менее эффективны в уничтожении опухолевых клеток головного мозга, чем вирусы oHSV-1, раскрытые в настоящем документе (т.е. С1212, С5252, С8282).

Конструкции oHSV-1 С5252, С8282 и С1212

Конструкция oHSV-1 С5252

С5252 содержит делецию генов γ34.5, вставку кассеты экспрессии антитела к PD-1 человека между U_L3 и U_L4 и модифицированную область внутреннего повтора (IR), замененную кассетой экспрессии IL-12. Рекомбинантный вирус конструировали в несколько этапов с использованием системы искусственных бактериальных хромосом (ВАС). Подробности конструирования вируса описаны ниже.

[0130] Использовали конструкцию ВАС HSV-1 с делецией двух копий генов γ34.5 (ВАС-Δ34.5). Кассеты экспрессии IL-12, фланкированные против хода транскрипции от нуклеотида 117005 и по ходу транскрипции от нуклеотида 132096 в контексте генома дикого типа, подвергали ПЦР-амплификации из вирусного генома HSV-1 с двумя наборами праймеров соответственно (GAAGATCTAATATTTTTATTGCAACTCCCTG (SEQ ID NO: 5), CTAGCTAGCTTATAAAAGGCGCGTCCCGTGG (SEQ ID NO: 6)) и (GCTCTAGATTGCGACGCCCCGGCTC (SEQ ID NO: 7), CCTTAATTAAGGTTACCACCCTGTAGCCCCGATGT (SEQ ID NO: 8)), и вставляли в плазмиду для замещения генов pKO5 с получением pKO1407. Затем рКО1407 трансфицировали в Escherichia coli с ВАС-Δ34.5 путем электропорации с получением BAC-Δ34.5-IL12. Затем кассету промотора CMV, управляющего геном Fab к PD-1, фланкированную против хода транскрипции от нуклеотида 11658 и по ходу транскрипции от нуклеотида 11659 в контексте генома дикого типа, подвергали ПЦР-амплификации из вирусного генома HSV-1 с двумя наборами праймеров соответственно (TCCCATGGATTTAACAAACGGGGGGGTGTCG (SEQ ID NO: 9), GGCCCCCGAGGCCAGCATGACGTTATCT (SEQ ID NO: 10)) и (GAGTAACCGCCCCCCCCCCATGCCACCCTCAC (SEQ ID NO: 11), GTGTTTTACTGCCACTACACCCCCGGGGAAC (SEQ ID NO: 12)), и лигировали в pKO5 по сайтам Bg1II и PacI с получением плазмиды pKOE1002. Затем плазмиду pKOE1002 трансфицировали в Escherichia coli, несущие ВАС-Δ34.5-IL12, путем электропорации с получением ВАС-5252. Вирус С5252 получали путем трансфекции плазмиды ВАС-5252 с последующими несколькими этапами очистки бляшек и амплификации в клетках Vero с последующей идентификацией вируса путем определения секреции IL-12 и Fab к PD-1 (таблица 1) и экспрессии белка ICP34.5, кодируемого геном γ34.5 (фиг.2).

[0131] С8282 представляет собой функционально идентичную мышиную версию С5252, за исключением того, что С8282 несет мышиную версию IL-12 и мышиное антитело к PD-1 (одноцепочечный фрагмент антитела, scFv, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно) в том же месте вирусного генома, в котором С5252 несет IL-12 человека и антитело к PD-1 человека.

[0132] С1212 представляет собой функционально идентичную версию С5252, за исключением того, что С1212 несет промотор CMV, за которым следуют три повторяющихся стоп-кодона и зеленый флуоресцентный белок (GFP) в том же месте вирусного генома, в котором С5252 несет IL-12 человека и антитело к PD-1 человека (Fab к PD-1, содержащее вариабельную область и константную область тяжелой цепи, а также вариабельную область и константную область легкой цепи, имеющие последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1-4, соответственно).

Подтверждение экспрессии IL-12 и антитела к PD-1 и экспрессии белка ICP34.5 вирусом С5252, С8282 и С1212

[0133] Клетки Vero высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 4×10⁵ клеток на лунку. После инкубации в течение ночи клетки подвергали имитации инфицирования или инфицированию при 1 БОЕ (бляшкообразующих единиц) HSV-1 (F), R3616, С5252, С8282, С1212 на клетку. Клетки собирали через 6, 12 и 24 часа (ч) после инфицирования соответственно. Белки электрофоретически разделяли в 10% денатурирующих гелях и подвергали взаимодействию с антителами ICP34.5 или GAPDH. GAPDH служил в качестве контроля загрузки (фиг.2). Клеточные супернатанты, собранные через 24 часа (ч) после инфицирования С5252, С8282 и С1212, использовали для анализа методом ELISA для определения уровней экспрессии IL-12 и антитела к PD-1. Результаты приведены в таблице 1.

[0134] Как показано в таблице 1, уровни экспрессии IL-12 и антитела к PD-1 вирусами С5252 и С8282 были определены на сопоставимых уровнях. В случае С1212, который является каркасным вирусом, экспрессия IL-12, а также антитела к PD-1 не поддавалась определению при определении с помощью анализа методом ELISA.

[0135] Экспрессия белка ICP34.5, определенная с помощью иммуноблоттинга, как показано на фиг.2, показала, что белок ICP34.5 не экспрессировался в образцах, инфицированных С5252, С8282, С1212 и R3616, но экспрессировался в образцах, инфицированных диким типом (WT) F.

[0136] Все вышеуказанные результаты продемонстрировали, что рекомбинантные вирусы С5252, С8282 и С1212 были подтверждены экспрессией IL-12, антитела к PD-1 и отсутствием экспрессии белка ICP34.5.

Активность уничтожения клеток in vitro - линии клеток опухолей головного мозга

[0137] Клетки А172, D54-MG, U87-MG, U138-MG и D458 высевали в 96-луночный планшет (4000 клеток/лунка) и инфицировали F, R3616, Т3011 и С5252 (0,1 и 1,0 БОЕ/клетка). Через 48 часов инфицирования (48 ч п/инф.) определяли жизнеспособность клеток с помощью набора CCK8-Kit. Степень ингибирования =(OD неинфицированной лунки - OD лунки, инфицированной oHSV)/(OD неинфицированной лунки - OD холостой лунки)×100%. Холостая лунка содержала только культуральную среду. Все значения в экспериментах выражали как среднее значение ± SEM. Результаты приведены в таблице 2.

[0139] Как показано в таблице 2, oHSV-1 С5252 оказался эффективным агентом для уничтожения клеток во всех клетках опухолей головного мозга при тестировании в дозе 1,0 БОЕ/клетка. В линиях клеток А172, D54-MG, U138-MG С5252 продемонстрировал самую высокую способность к уничтожению клеток среди протестированных вирусов oHSV-1. Для линий клеток U87-MG и D458 противоопухолевый эффект С5252 был сопоставим с Т3011. По сравнению с R3616, который также является oHSV-1 с выключенным геном γ34.5, С5252 был почти в 2-3 раза эффективнее в большинстве протестированных линий клеток.

Активность уничтожения клеток in vitro - линии опухолевых клеток, не относящихся к головному мозгу

[0140] Клетки высевали в 96-луночный планшет (4000 клеток/лунка) и инфицировали F, Т3011 и С5252 (0,1 и 1,0 БОЕ/клетка). Через 48 часов инфицирования (48 ч п/инф.) определяли жизнеспособность клеток с помощью набора CCK8-Kit. Степень ингибирования=(OD неинфицированной лунки - OD лунки, инфицированной oHSV)/(OD неинфицированной лунки - OD холостой лунки)×100%. Холостая лунка содержала только культуральную среду. Все значения в экспериментах выражали как среднее значение ± SEM. Результаты приведены в таблице 3.

[0142] Как показано в таблице 3, при тестировании на линиях опухолевых клеток, не относящихся к головному мозгу, как Т3011, так и С5252 показали себя как эффективные агенты для уничтожения опухолей против различных опухолевых клеток, не относящихся к головному мозгу. Было отмечено, что противоопухолевая активность С5252 была по существу эквивалентна Т3011 во всех из 8 линий клеток, протестированных в этом примере, как при более низкой, так и при более высокой множественности заражения (MOI). Этот результат был неожиданным, поскольку С5252 является еще более ослабленной версией Т3011, в которой удалена вторая копия гена γ34.5. Однако делеция второй копии гена γ34.5 не продемонстрировала неблагоприятного влияния на противоопухолевую активность вируса oHSV-1 против опухолевых клеток, не относящихся к головному мозгу, но значительно улучшила его эффект уничтожения опухоли против клеток опухолей головного мозга, как показано в таблице 2. Таким образом, вирус oHSV-1, раскрытый в настоящем документе, в целом более эффективен в отношении уничтожения опухоли, чем oHSV-1, из которого он был получен.

Оценка ингибирующего эффекта С5252 на пролиферацию клеток злокачественной глиомы человека in vitro

[0143] Как показано на фиг.3, чувствительность С5252 к линиям клеток глиомы человека U87-MG, U138-MG, U373-MG, D54-MG и U251-MG в целом была одинаковой, и значения IC₅₀ для С5252 и С1212 против этих клеток глиомы составили менее 10 MOI. Ингибирующий эффект для С5252 сопоставим с каркасным С1212. Встраивание гетерологичных генов в геном вируса существенно не повлияло на репликацию и, следовательно, ингибирующую способность oHSV, но при введении in vivo значительно способствовало бы уничтожению опухолевых клеток иммунной системой субъекта из-за природы иммуностимулирующих (IL-12) и иммунотерапевтических агентов (антитело к PD-1), экспрессируемых вирусом oHSV-1.

Ингибирующий эффект С5252 на нормальные клетки и опухолевые клетки

[0144] Как показано на фиг.4, значения IC₅₀ С5252 в отношении опухолевых клеток U373-MG и ACHN составили 6,890 и 9,102 MOI, соответственно, и значения IC₅₀ С5252 в отношении нормальных клеток НА и HRGEC все превышали 500 MOI. В условиях этого эксперимента С5252 не проявлял очевидного ингибирующего эффекта на нормальные клетки, но проявлял значительный ингибирующий эффект на опухолевые клетки. По сравнению с нормальными клетками С5252 оказывал более направленный ингибирующий эффект на опухолевые клетки человека. Результаты показали, что С5252 селективно уничтожает опухолевые клетки при сохранении нормальных клеток.

Исследование эффективности С8282 при лечении подкожно имплантированной модели GL261 у мышей C57BL/6

[0145] С8282 является мышиной имитацией С5252, в которой в геном вируса были введены IL-12 мыши (m-IL-12) и антитело к PD-1 мыши (m-PD-1) вместо соответствующих человеческих аналогов. Как показано на фиг.5, внутриопухолевая инъекция С8282 продемонстрировала значительную эффективность против подкожной модели опухоли GL261. Животные хорошо переносили лечение, когда мыши получали С8282 в дозе ≤5×10⁶ БОЕ/животное. Средний уровень дозирования при 5×10⁵ БОЕ/животное показал, по-видимому, самую высокую эффективность среди испытанных диапазонов доз.

Исследование эффективности С5252 при лечении ортотопической модели глиомы человека U87 у голых мышей

[0146] Как показано на фиг.6, интрацеребральная инъекция С5252 продемонстрировала значительную эффективность против клеток U87-MG у голых мышей. Различные уровни дозирования не показали существенной разницы.

[0147] Следует принимать во внимание, что, хотя настоящее изобретение было подробно раскрыто посредством предпочтительных вариантов осуществления и необязательных характеристик, специалисты в данной области техники могут прибегнуть к модификации, усовершенствованию и варьированию настоящих концепций, реализованных в настоящем изобретении и раскрытых в настоящем документе, и что такие модификации, усовершенствования и вариации считаются входящими в объем настоящего изобретения. Материалы, методы и примеры, представленные в настоящем документе, характеризуют предпочтительные варианты осуществления, являются иллюстративными и не имеют ограничительного характера в отношении объема настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ImmVira Co., Limited

<120> ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 1 ТИПА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

ОПУХОЛЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА

<130> 191792-23D-RUP

<150> PCT/CN2020/133943

<151> 2020-12-4

<160> 14

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи Fab к hPD-1

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 330

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> константная область тяжелой цепи Fab к hPD-1

<400> 2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 3

<211> 111

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи Fab к hPD-1

<400> 3

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Thr Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 107

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<220>

<223> константная область легкой цепи Fab к hPD-1

<400> 4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 5

gaagatctaa tatttttatt gcaactccct g 31

<210> 6

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 6

ctagctagct tataaaaggc gcgtcccgtg g 31

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 7

gctctagatt gcgacgcccc ggctc 25

<210> 8

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 8

ccttaattaa ggttaccacc ctgtagcccc gatgt 35

<210> 9

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 9

tcccatggat ttaacaaacg ggggggtgtc g 31

<210> 10

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 10

ggcccccgag gccagcatga cgttatct 28

<210> 11

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 11

gagtaaccgc ccccccccca tgccaccctc ac 32

<210> 12

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

gtgttttact gccactacac ccccggggaa c 31

<210> 13

<211> 121

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<223> вариабельная область тяжелой цепи scFv к mPD-1

<400> 13

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Asn Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Phe Gly Gly Ala Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 111

<212> Белок

<213> Mus musculus

<220>

<223> вариабельная область легкой цепи scFv к mPD-1

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Asp Ser

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Thr Lys

85 90 95

Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<---

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. Предложено применение онколитического вируса простого герпеса 1 типа (oHSV-1) при изготовлении лекарственного средства для лечения опухоли головного мозга, причем указанный oHSV-1 содержит модифицированный геном, где указанная модификация включает: a) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора, где указанные представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF P и ORF O, и где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки. Указанный онколитический вирус HSV-1 продемонстрировал превосходную противоопухолевую активность, специфичную для опухолей головного мозга. 20 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

1. Применение онколитического вируса простого герпеса 1 типа (oHSV-1) при изготовлении лекарственного средства для лечения опухоли головного мозга, причем указанный oHSV-1 содержит модифицированный геном, где указанная модификация включает

a) изменение копии гена γ34.5, которая находится в концевом повторе генома, делающее эту копию гена γ34.5 неспособной экспрессировать функциональный белок ICP34.5, и

b) делецию области внутреннего инвертированного повтора генома, приводящую к делеции одной копии каждого из представленных в двух копиях генов и одной копии дуплицированных некодирующих последовательностей в области внутреннего инвертированного повтора,

где указанные представленные в двух копиях гены включают гены, кодирующие ICP0, ICP4, ICP34.5, ORF P и ORF O, и

где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах генома U_L и U_S являются интактными, так что они способны экспрессировать соответствующие функциональные белки.

2. Применение oHSV-1 по п. 1, где указанное изменение включает делецию всей или части кодирующей или регуляторной области копии гена γ34.5.

3. Применение oHSV-1 по п. 1 или 2, где указанные дуплицированные некодирующие последовательности включают интроны ICP0, домен LAT и последовательность «a».

4. Применение oHSV-1 по п. 1 или 2, где все представленные в одной копии гены в обоих компонентах U_L и U_S включают гены с U_L1 по U_L56 в компоненте U_L и гены с U_S1 по U_S12 в компоненте U_S.

5. Применение oHSV-1 по любому из пп. 1-4, где указанный HSV-1 выбран из группы, состоящей из штаммов F, KOS и 17.

6. Применение oHSV-1 по любому из пп. 1-5, где указанный HSV-1 имеет изомер генома, представляющий собой прототип (P).

7. Применение oHSV-1 по любому из пп. 1-6, где указанная делеция области внутреннего инвертированного повтора приводит к вырезанию положений нуклеотидов с 117005 по 132096 из генома штамма F.

8. Применение oHSV-1 по п. 6, где указанная делеция области внутреннего инвертированного повтора проходит от стоп-кодона последнего гена в компоненте U_L до промотора первого гена в компоненте U_S.

9. Применение oHSV-1 по п. 8, где последний ген в компоненте U_L представляет собой ген U_L56.

10. Применение oHSV-1 по п. 8 или 9, где первый ген в компоненте U_S представляет собой ген U_S1.

11. Применение oHSV-1 по любому из пп. 1-10, где в указанный oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий и/или иммунотерапевтический агент, где указанное встраивание не препятствует экспрессии нативных генов генома HSV-1.

12. Применение oHSV-1 по п. 11, где в указанный oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуностимулирующий агент и иммунотерапевтический агент.

13. Применение oHSV-1 по п. 11 или 12, где указанный иммуностимулирующий агент выбран из группы, состоящей из GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15, IL-24 и IL-27.

14. Применение oHSV-1 по п. 13, где указанный иммуностимулирующий агент представляет собой IL-12.

15. Применение oHSV-1 по любому из пп. 11-14, где указанный иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент, анти-CTLA-4 агент или оба из них.

16. Применение oHSV-1 по п. 15, где указанный иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 агент.

17. Применение oHSV-1 по любому из пп. 11-16, где указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты встроена в область внутреннего инвертированного повтора и/или между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

18. Применение oHSV-1 по любому из пп. 11-17, где в указанный oHSV-1 встроена гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12 и анти-PD-1 агент.

19. Применение oHSV-1 по п. 18, где указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая IL-12, встроена в область внутреннего инвертированного повтора и указанная гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая анти-PD-1 агент, встроена между генами U_L3 и U_L4 в компоненте U_L.

20. Применение oHSV-1 по п. 1, где указанная опухоль головного мозга выбрана из группы, состоящей из глиомы, глиобластомы, олигодендроглиомы, астроцитомы, эпендимомы, примитивной нейроэктодермальной опухоли, атипичной менингиомы, злокачественной менингиомы и нейробластомы.

21. Применение oHSV-1 по п. 1, где указанная опухоль головного мозга представляет собой мультиформную глиобластому.