ВАРИАНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ IL-10 И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ Российский патент 2025 года по МПК C07K14/54 C07K16/28 A61K38/20 A61K39/395 A61P3/06 A61P29/00 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 62/814669, поданной 6 марта 2019 года, предварительной патентной заявки США № 62/899504, поданной 12 сентября 2019 года, и предварительной патентной заявки США № 62/962332, поданной 17 января 2020 года, содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте.

ВВЕДЕНИЕ

Заявка относится к вариантным формам Интерлейкина 10 (IL-10), которые включают модификации связывающей области для рецептора IL-10 и/или доменов, ответственных за междоменные углы, которые существуют в молекуле IL-10. Изменяя один или оба этих домена в IL-10, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что полученная биологическая функция рецептора IL-10 может быть настроена или модулирована для вызывания определенного биологического ответа. Заявка также относится к IL-10 или вариантной молекуле IL-10 c увеличенным временем полувыведения, которые включают не-белковые группы для увеличения времени полувыведения из сыворотки, а также к способам увеличения времени полувыведения на основе белков. Заявка также относится к слитым белкам, содержащим вариантные молекулы IL-10.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

IL-10 был описан как фактор, ингибирующий синтез цитокинов, из-за его способности ингибировать как (i) секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами/макрофагами в ответ на липополисахарид, так и (ii) секрецию интерлейкина 2 (IL-2) и пролиферацию CD4⁺ Т-клеток. Когда были обнаружены вирусные аналоги IL-10 и сообщалось о том, что они обладают сходными или идентичными функциями с человеческим IL-10, предполагалось, что эти вирусные аналоги IL-10 усиливают вирулентность вирусов, принимая на себя функцию супрессивного цитокина, обнаруженного в геноме человека.

Дальнейшее исследование супрессивного действия IL-10 стало возможным благодаря созданию мышей, нокаутированных по IL-10, у которых развивается хронический энтероколит. Данные, полученные с помощью этих мышей, ясно продемонстрировали, что у мышей с нокаутом IL-10 развивается тяжелое воспаление на всем протяжении желудочно-кишечного тракта, преимущественно за счет хронической секреции воспалительных цитокинов моноцитами/макрофагами и CD4⁺ Т-клетками, что соответствует первоначальным наблюдениям in vitro.

В совокупности данные дают основание полагать, что IL-10 играет доминирующую роль в подавлении воспаления. В частности, пациенты, у которых отсутствуют функциональные рецепторы IL-10 или способность продуцировать IL-10, проявляют повышенную предрасположенность к развитию связанных с воспалением заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Проводили множество клинических испытаний для оценки противовоспалительной функции IL-10 в контексте псориаза, ревматоидного артрита и болезни Крона. В основном, лечение рекомбинантным человеческим IL-10 (rHuIL-10) оказалось безопасным, но неэффективным. В частности, лечение пациентов с болезнью Крона при помощи rHuIL-10 приводило к обратному дозозависимому эффекту, при которой низкие дозы, по-видимому, умеренно подавляли воспаление, и подавляющий эффект терялся при высоких дозах. Строгий анализ последнего исследования для болезни Крона показал, что пациенты, получавшие 10 и 20 мкг/кг rHuIL-10, продемонстрировали повышенную концентрацию интерферона гамма (IFNγ) и неоптерина. IFNγ, как известно, ухудшает патогенез воспалительного заболевания кишечника и болезни Крона. Данные позволяют предположить, что в высоких дозах лечение IL-10 индуцирует IFNγ, который, в свою очередь, усугубляет воспалительное заболевание.

Дальнейший анализ воздействий IL-10 у здоровых людей позволяет предположить, что введение IL-10 перед воздействием провоспалительного фактора липополисахарида (ЛПС) ингибирует выработку провоспалительных цитокинов. Однако введение rHuIL-10 после воздействия ЛПС усиливает секрецию провоспалительных цитокинов. Поскольку ЛПС является продуктом как нормальной, так и чужеродной кишечной бактерии у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), эти пациенты никогда не будут «свободны» от ЛПС и таким образом никогда не будут находиться в состоянии, в котором лечение IL-10 могло бы быть применено до ЛПС. Таким образом, эти данные позволяют предположить, что пациенты с болезнью Крона и с другими воспалительными заболеваниями никогда не увидят терапевтических преимуществ лечения IL-10.

Дополнительную путаницу к роли IL-10 добавляют накопленные данные, указывающие на то, что IL-10 активирует иммунную систему, вызывая противоопухолевые ответы. Первоначальные данные предполагали, что IL-10 активировал NK-клетки, но дальнейшие исследования показали, что лечение IL-10 ингибирует рост опухоли CD8+ T-клеточным и IFNγ-зависимым образом. Продолжение исследования показало, что лечение IL-10 ингибирует пролиферацию регуляторных FoxP3⁺CD4⁺ Т-клеток и усиливает утилизацию при помощи купферовских клеток, и все эти функции предполагают, что IL-10 является мощным иммуностимулятором, а не супрессором. Наконец, эти стимулирующие действия были подтверждены в клинических исследованиях онкологических пациентов, получавших пэгилированный IL-10.

В совокупности эти данные показывают, что лечение IL-10 у пациентов, страдающих аутоиммунным воспалением, не дало терапевтического эффекта, что позволяет предположить, что IL-10 не является общеиммунным супрессором. В соответствии с этим, лечение пациентов со злокачественными опухолями при помощи (ПЭГ) IL-10 приводит к мощной и терапевтически полезной иммунной активации, в частности, к индукции дозозависимого сывороточного IFNγ, как у пациентов с болезнью Крона, получавших IL-10, что означает, что IL-10 является мощным иммуностимулятором.

Остается неясным, почему вирусы приобретают последовательность IL-10. Дальнейший анализ гомологов вируса Эпштейна-Барр (EBV-IL10) и цитомегаловируса (CMV-IL10) показал, что эти вирусы изменили последовательность нативного IL-10 двумя преобладающими способами. EBV-IL10, по-видимому, сохраняет аналогичный третичный угол гомодимерного взаимодействия, приводящий к определенному углу взаимодействия лиганд-рецептор, хотя по существу уменьшает его аффинность для рецептора IL-10. CMV-IL10 проявляет повышенную аффинность для рецептора IL-10, по существу изменяя угол взаимодействия с рецепторами IL-10. Хотя последовательности EBV-IL10 и CMV-IL10 соответственно сохраняют приблизительно 80% и 27% гомологии с нативным IL-10, каждый из вирусных гомологов имеет совершенно разную аффинность к рецептору IL-10, разные углы взаимодействия с рецептором, при этом каждый из вирусных гомологов, по-видимому, проявляет противовоспалительные функции, очень похожие на нативный IL-10. Таким образом неясно, как аффинность к рецепторам IL-10 и/или угол взаимодействия с рецептором влияют на последующую нисходящую передачу сигнала IL-10.

СУЩНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящая заявка, в основном, относится к новым вариантным молекулам IL-10, которые модулируют передачу сигнала рецептора IL-10. Таким образом, заявка относится к вариантным молекулам IL-10, которые включают модификации в структуре молекулы IL-10, в результате чего новые вариантные молекулы IL-10 имеют измененную аффинность связывания с рецептором IL-10 и/или измененные междоменные углы в IL-10. Автор изобретения неожиданно обнаружил, что модификация IL-10 в ключевых доменах, влияющих на аффинность к рецептору IL-10 и/или междоменные углы IL-10, приводит к созданию агонистов рецептора IL-10, которые можно использовать для лечения иммунных заболеваний, воспалительных заболеваний или состояний, а также при лечении злокачественной опухоли. Кроме того, вариантные молекулы IL-10 могут также иметь увеличенное время полувыведения из сыворотки за счет включения вариантных молекул IL-10 в виде части слитого белка, такого как различные домены антитела (Fc или вариабельные домены), не препятствуя мономерам IL-10 или вариантам IL-10, формировать гомодимер IL-10.

В определенных вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой модифицированный человеческий IL-10. В других вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой модифицированный мышиный IL-10. В предпочтительных вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой модифицированный вирусный гомолог IL-10. В более предпочтительном варианте осуществления вирусный гомолог IL-10 представляет собой CMV-IL10. В наиболее предпочтительном варианте осуществления вирусный гомолог IL-10 представляет собой EBV-IL10.

В дополнительных вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 включает, по меньшей мере, одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислот в рецептор-связывающей области. В еще одних вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 включает, по меньшей мере, одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислот в области, ответственной за формирование междоменного угла IL-10. В предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 включает одну или обе модификации связывающего домена для рецептора и/или области, отвечающей за междоменный угол. В наиболее предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 включает одну или обе модификации в молекуле белка EBV-IL10.

В различных вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 по сравнению с IL-10 дикого типа имеет повышенную аффинность к рецептору IL-10 или рецепторному комплексу IL-10. В других вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 по сравнению с IL-10 дикого типа имеет сниженную аффинность к рецептору IL-10 или рецепторному комплексу IL-10. В других вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 образует более узкий или ограниченный междоменный угол по сравнению с IL-10 дикого типа, более предпочтительно EBV-IL10. В другом варианте осуществления вариантная молекула IL-10 образует более широкий или ослабленный междоменный угол, по сравнению с IL-10 дикого типа, более предпочтительно EBV IL-10.

В дополнительных вариантах осуществления вариантные молекулы EBV IL-10 включают, по меньшей мере, одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислот в рецептор-связывающей области, расположенной в спирали A, петле AB и/или спирали F («сайт 1») EBV IL-10. Модификации в области рецептор-связывающего домена могут в определенных вариантах осуществления увеличить или усилить аффинность к рецептору или рецепторному комплексу IL-10. В некоторых вариантах осуществления модификации рецептор-связывающей области могут снижать или уменьшать аффинность к рецептору или рецепторному комплексу IL-10.

В дополнительных вариантах осуществления вариантные молекулы EBV IL-10 включают, по меньшей мере, одну или несколько вставок, делеций или замен аминокислот в областях EBV IL-10, ответственных за образование междоменного угла. В предпочтительных вариантах осуществления модификации могут происходить в петле DE в EBV IL-10. Модификации в петле DE приводят к вариантным молекулам EBV IL-10, которые имеют ограниченный междоменный угол или ослабленный междоменный угол.

В других аспектах, вариантные молекулы IL-10 представляют собой химерные или слитые молекулы. В одном из вариантов осуществления химерный или слитый белок будет содержать один или несколько доменов из разных белков или мутации в пределах одного белка, придающие характеристики другого белка. В предпочтительном варианте осуществления химерный или слитый белок будет включать первую часть, содержащую молекулу IL-10, представленную в настоящем документе, слитую с другой молекулой, включая в качестве неограничивающих примеров альбумин, ферменты, гликозилтрансферазы, галактозилрансферазы, шарнирные области IgG (например, Fc-область), один или несколько вариабельных доменов (таких как, но не ограничиваясь ими, вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи) одного или нескольких антител, цитокины (такие как IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, ИЛ-3, ИЛ-5, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-12, ИЛ-15, GM-CSF, G-CSF, интерфероны-α, -β, -γ, TGF-β и факторы некроза опухоли -α, -β), метки, агенты, химиотерапевтические средства, радиоактивные изотопы, средства, увеличивающие время полувыведения (такие как гидроксилэтилкрахмал (ГЭКилирование), полисиаловую кислоту, полимеры гепарозана, эластиноподобные полипептиды и гиалуроновую кислоту). В другом варианте осуществления вариантная молекула IL-10 слита с одним или несколькими вариабельными областями тяжелой или легкой цепи антитела. Слитые белки могут включать один или несколько линкеров, которые ковалентно связаны с разными частями слитого белка. Слитый белок может образовывать нековалентно связанный комплекс с другим слитым белком того же типа. Такой слитый белок позволит мономерам IL-10 или мономерам вариантной молекулы IL-10 связываться вместе в функциональный гомодимер IL-10 или вариантный IL-10.

В других вариантах осуществления вариантная молекула IL-10 является частью сконструированного слитого белка. Слитый белок будет содержать, по меньшей мере, один мономер IL-10 или вариантную молекулу IL-10, конъюгированную на первом конце слитого белка с линкером или спейсером, где один или несколько спейсеров используют для связывания различных частей слитого белка, которые затем конъюгированы, по меньшей мере, с одной другой молекулой, конъюгированной на другом конце, где молекула выбрана, по меньшей мере, из одного цитокина или его мономера, терапевтического средства, метки, молекулы, увеличивающей время полувыведения из сыворотки, или белка (например, но не ограничиваясь, указанными, рецептора, лиганда или различных частей антитела). В предпочтительном варианте осуществления слитый белок содержит мономер IL-10 или мономер вариантной молекулы IL-10, конъюгированный через линкеры или спейсеры, по меньшей мере, с одной вариабельной областью тяжелой и/или легкой цепи. В наиболее предпочтительном варианте осуществления слитый белок содержит мономер EBV IL-10 или мономер вариантной молекулы EBV IL-10, конъюгированный через линкеры или спейсеры, по меньшей мере, с одной областью тяжелой и/или легкой цепи. В наиболее предпочтительном варианте осуществления мономер EBV IL-10 или мономер вариантной молекулы EBV IL-10 конъюгирован с одной вариабельной областью тяжелой цепи и одной вариабельной областью легкой цепи, где мономеры вместе образуют димерный комплекс. Мономер EBV IL-10 или мономер вариантной молекулы EBV IL-10 может быть конъюгирован либо с амино-концом, либо с карбокси-концом вариабельной области тяжелой или легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления терапевтическое количество вариантной молекулы IL-10, его слитого белка или его химерного белка вводят индивидууму, страдающему воспалительным заболеванием или состоянием, таким как, но не ограничиваясь указанными, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, язвенный колит, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), и неалкогольное ожирение печени (НАЖБП). В другом варианте осуществления терапевтическое количество терапевтическое количество вариантной молекулы IL-10, его слитого белка или его химерного белка вводят индивидууму, страдающему злокачественной опухолью. Также предусмотрено лечение индивидуумов, имеющих более одного патологического состояния. В более предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой вариант EBV-IL10, его слитый белок или химерный белок. В еще одном варианте осуществления вариантную молекулу IL-10, его слитый белок или химерный белок, применяют в комбинированном лечении. Например, вариантную молекулу IL-10, его слитый белок или химерный белок можно вводить индивидуально в сочетании с другими методами лечения. В еще одних вариантах осуществления терапевтическое количество вариантной молекулы IL-10, его слитого белка или его химерного белка вводят индивидууму, страдающему заболеваниями, связанными с липидами, такими как, но не ограничиваясь указанным, заболевания с повышенными уровнями холестерина.

В различных вариантах осуществления вариантную молекулу IL-10 или его слитый белок по настоящей заявке доставляют в виде изолированного и очищенного белка. Доставка может происходить в виде подкожной болюсной инъекции или в виде нескольких микроинъекций в дерму и подкожную ткань. В еще одном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 может быть доставлена в виде вектора с нуклеиновой кислотой, содержащего последовательность, кодирующую вариант IL-10, слитый белок или химерный белок. Вектор с нуклеиновой кислотой может быть плазмидой или вирусной частицей, несущей вирусный вектор. В одном из вариантов осуществления вариантные молекулы IL-10 можно доставлять индивидууму способами генетической медицины, в основном известными специалистам в данной области.

В других вариантах осуществления вариантную молекулу IL-10 также можно вводить как часть схемы комбинированного лечения. В одном из вариантов осуществления вариантную молекулу IL-10 можно вводить в комбинации с Bispecific T-Cell Engagers (BITES), доступной в настоящее время иммунотерапией для лечения злокачественной опухоли, ВЗК, болезни Крона, НАЖБП, НАСГ и аутоимунных заболеваний, например.

В другом варианте осуществления вектором с нуклеиновой кислотой является вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий один или несколько элементов последовательности инвертированных концевых повторов AAV (ITR) и контрольных элементов для управления экспрессией последовательности, кодирующей вариантную молекулу IL-10, в клетке-мишени, в которую вектор AAV можно вводить либо как плазмиду («голую» ДНК), либо упакованным в частицу AAV. В другом варианте осуществления вектором с нуклеиновой кислотой является вектор на основе вируса осповакцины. Ряд вирусных векторов на основе осповакцины, полученные из различных штаммов, можно использовать для введения вариантных молекул IL-10 по настоящей заявке, такие как штамм WR (ATCC VR-119), штамм Wyeth (ATCC VR-325), штамм Lederle-Chorioallantoic (ATCC VR-325), штамм CL (ATCC VR-117) и другие; все эти штаммы доступны в Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния).

В другом варианте осуществления любая из вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе, включая пэгилированные вариантные молекулы IL-10, но не ограничиваясь ими, может быть доставлена индивидууму любым способом, описываемым в настоящем документе, или способом, в основном известным в данной области.

Эти и другие варианты осуществления данной заявки будут легко понятны специалистам в данной области с учетом описания в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 представлена ленточная диаграмма (Josephson et al, Immunity, 15, p. 35-46) мономерной Молекулы IL-10. Части, выделенные красным, обозначают сайт I интерфейса контакта с рецептором, а зеленым - сайт II интерфейса контакта с рецептором.

Фигуры 2A-2C сравнивают способность IL-10 и EBV IL-10 активировать моноциты/макрофаги (Mθ) путем исследования выработки цитокинов IL-1β (фигура 2A) и TNFα (фигура 2B) и стимуляцию T-клеток путем исследования продукции IFNγ (фигура 2C) у Донора 1.

Фигуры 3A-3C сравнивают способность IL-10 и EBV IL-10 активировать моноциты/макрофаги (Mθ) путем исследования выработки цитокинов IL-1β (фигура 3A) и TNFα (фигура 3B и стимуляцию T-клеток путем исследования продукции IFNγ (фигура 3C) у Донора 1.

Фигуры 4A-B показывают количество IFNγ, индуцируемое Т-клетками после стимуляции IL-10 или EBV IL-10.

Фигуры 5A-5C демонстрируют влияние N-концевого 5 кДа моно- и ди-ПЭГилированного EBV-IL-10 на пролиферацию клеток MC/9 (фигура 5A), секрецию TNFα моноцитами/макрофагами (Mθ) в ответ на ЛПС (фигура 5B) и секрецию IFNγ Т-клетками в ответ на стимуляцию Т-клеточного рецептора (фигура 5C).

Фигуры 6A-6E демонстрируют специфические аминокислотные последовательности для различных вариантных молекул IL-10 и слитые белки, содержащие EBV-IL-10.

На фигуре 7 представлено схематическое изображение слитого белка, содержащего IL-10 или вариантную молекулу IL-10, конъюгированную с линкером или спейсером (в этом случае scFv). Этот типичный пример показывает IL-10 или вариантные молекулы IL-10, конъюгированные как с N-конца, так и с C-конца.

Фигуры 8A-8C представляют собой схематическое изображение различных вариантов IL-10, таких как варианты, сделанные в EBV IL-10. Фигура 8A (DV05) представляет собой вариант IL-10, содержащий единственную точечную мутацию в аминокислотном положении 31 (V31L - V31L) SEQ ID NO: 3. Фигура 8B (DV06) представляет собой вариант IL-10, содержащий единственную точечную мутацию в аминокислотном положении 75 (A75I A75I) в SEQ ID NO: 3. Фигура 8C (DV07) представляет собой вариант IL-10, содержащий две точечные мутации в аминокислотных положениях 31 и 75 (V31L и A75I) из SEQ ID NO: 3.

Фигура 8D показывает анализы моноцитарно/макрофагального ответа в ответ на различные формы IL-10, включая человеческий IL-10 дикого типа, EBV-IL-10, DV05, DV06 и DV07. Все формы, включая варианты IL-10 - DV05, DV06, DV07 - подавляют секрецию TNFα в ответ на ЛПС.

Фигура 8E показывает анализы T-клеточного ответа на различные формы IL-10 - человеческий IL-10 дикого типа, EBV IL-10, DV05, DV06, и DV07 - и не все формы индуцируют IFN-гамма.

Фигуры 9A-9F представляют собой схематическое изображение различных конфигураций конструкций слитый белок IL-10/иммуноконъюгат/диатело. Фигуры 9 (a)-(c) представляют собой комплекс слитый белок (т.е. диатело), где каждый слитый белок содержит области VH и VL, полученные из двух различных антител, связанные с мономером IL-10 (который также может быть замещен вариантной молекулой IL-10) через карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер, с (а) одиночной мутацией, например, в аминокислотном положении 31, влияющей на связывание с рецептором IL-10; (б) одиночной мутацией, например, в аминокислотном положении 75, влияющей на связывание с рецептором IL-10; и (c) с двумя мутациями, например, в аминокислотных положениях 31 и 75, влияющих на связывание с рецептором IL-10. Фигуры 9 (d)-(f) представляют собой комплекс слитый белок (т.е. миниантитело), где каждый слитый белок содержит одну область VH или VL, полученную из одного антитела, связанную с мономером IL-10 (который также может быть замещен вариантной молекулой IL-10) через карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер, с (d) одиночной мутацией, например, в аминокислотном положении 31, влияющей на связывание с рецептором IL-10; (e) одиночной мутацией, например, в аминокислотном положении 75, влияющей на связывание с рецептором IL-10; и (f) с двумя мутациями, например, в аминокислотных положениях 31 и 75, влияющих на связывание с рецептором IL-10.

Фигуры 10 (A)-10 (F) представляют собой схематическое изображение различных конфигураций конструкций слитый белок IL-10/иммуноконъюгат/диатело. Фигуры 10 (a)-(c) представляет собой один слитый белок (т.е. миниантитело), где каждый мономер IL-10 (который также может быть замещен вариантной молекулой IL-10) связан через карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер либо с VH, либо с VL от одного и того же антитела, и VH и VL связаны вместе. Мономеры IL-10 включают (а) одиночную мутацию, например, в аминокислотном положении 31, влияющую на связывание с рецептором IL-10; (б) одиночную мутацию, например, в аминокислотном положении 75, влияющую на связывание с рецептором IL-10; и (c) две мутации, например, в аминокислотных положениях 31 и 75, влияющие на связывание с рецептором IL-10. Фигуры 10 (d)-(f) представляют собой один слитый белок, где мономеры IL-10 (который также может быть заменен вариантной молекулой IL-10) связаны вместе, и каждый мономер IL-10 дополнительно связан через карбокси-концевой линкер или амино-концевой линкер с одной областью VH или VL, полученной из одного антитела. Мономеры IL-10 включают (d) одиночную мутацию (например, в аминокислотном положении 31), влияющую на связывание рецептора IL-10; (e) одиночную мутацию, например, в аминокислотном положении 75, влияющую на связывание с рецептором IL-10; и (f) две мутации, например, в аминокислотных положениях 31 и 75, влияющие на связывание с рецептором IL-10.

На фигуре 11 представлено уменьшение объема опухоли in vivo с использованием диатела, содержащего мутацию DV07. Состав буфера (1× фосфатно-солевой буфер; «контроль») и диатела DV07 (комплекс слитого белка, содержащий вариант EBV IL-10 с V31 - V31L и A75I A75I зрелого белка и вариабельные домены из анти-CD3α и анти-EGFR, ни одна из этих пар VH/VL не связывается с мышиной мишенью) вводили в однократной дозе на сутки 3. Концентрации дозы 1 мг/кг и 0,4 мг/кг тестировали для диатела DV07.

На фигуре 12 представлен Т-клеточный ответ in vitro на опубликованный вариант IL-10 (ромб), IL-10 дикого типа (круг) и альтернативную форму диатела DV07, называемую DHivDEbo:DV07 (ромб; комплекс слитого белка, содержащий вариант EBV IL-10 с мутациями V31L и A75I и вариабельные домены из анти-ВИЧ и анти-Эбола (ни одна из этих пар VH/VL не связывается с белками мыши), где диатело имеет структуру, схематически представленную на фигуре 9 (c)).

На фигуре 13A сравнивается подавление TNFα, индуцированного воздействием ЛПС на моноциты/макрофаги, с использованием различных форм вариантной молекулы EBV IL-10 с мутациями V31L и A75I в форме диатела. «Wt» представляет собой человеческий IL-10; «EBV» - EBV IL-10; «DCd3DEgfr:DV05» представляет собой диатело, содержащее области VH и VL из антитела к CD3 и антитела к EGFR, связанные с вариантом EBV IL-10, содержащим мутацию V31; «DCd3DEgfr:DV07» представляет собой диатело, содержащее области VH и VL из антитела к CD3 и антитела к EGFR, связанные с вариантом EBV IL-10, содержащим мутации V31 и A75I; «DHivDEbo:DV07» представляет собой диатело, содержащее области VH и VL из антитела к ВИЧ и антитела к вирусу Эбола, связанные с вариантом IL-10 EBV, содержащим мутации V31L и A75I.

На фигуре 13B сравнивается секреция IFNγ в T-клетке в анализе ответа с использованием человеческого IL-10 («wt»), EBV IL-10 («EBV») с различными формами диатела, содержащими вариантные молекулы EBV IL-10 с мутациями V31L и A75I и области VH и VL из разных антител. Форма DHivDEgfr:DV07 представляет собой диатело EBV IL-10 с заменами V31 и A75I, содержащее вариабельные области из антител к ВИЧ и к EGFR. Форма DHivDEbo:DV07 представляет собой диатело EBV IL-10 с мутациями V31 и A75I, содержащее вариабельные области из анти-ВИЧ и анти-Эбола.

На фигурах 14A-14B сравниваются две формы диатела EBV IL-10, DH:DV07 и DHDE:DV07 на моноцитах/ макрофагах (фигура 14A) и T-клетках (фигура 14B), выделенных от двух доноров. Форма DHDV07 представляет собой диатело варианта IL-10 EBV с заменами V31 и A75I, содержащее вариабельные области из антител к ВИЧ и EGFR. Форма DHDE:DV07 представляет собой диатело EBV IL-10 с заменами V31 и A75I, содержащее вариабельные области из анти-ВИЧ и анти-Эбола. На фигуре 14A сравнивается подавление TNFα, индуцированного ЛПС на изолированных моноцитах/макрофагах,, с использованием человеческого IL-10 («wt»), DH:DV07 и DHDE:DV07. На фигуре 14B сравнивается секреция IFNγ изолированной Т-клеткой в ответ на IL-10 («wt»), EBV IL-10, DH:DV07 и DHDE:DV07.

Фигура 15 представляет собой прямое сравнение различных форм варианта EBV-10 в форме диатела на тучных клетках MC/9. В этом анализе сравнивают IL-10, EBV IL-10, D:DV05 (EBV IL-10 с мутацией V31, включающее вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR), D:DV06 (EBV IL-10 с мутацией A75I, содержащее вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR), D:DV07 с мутациями V31L и A75I, содержащее вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR), и DhivDEbo:DV07 (диатело варианта EBV IL-10 с заменами V31L и A75I, содержащее вариабельные области из анти-ВИЧ и анти-Эбола).

Фигуры 16A-16C представляют собой результаты исследования опухолей in vivo с использованием D:DV07 (с мутациями V31 и A75I, включающее вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR). Объем опухоли in vivo оценивали после введения буфера для дозирующего состава («контроль»), 0,4 мг/кг три раза в неделю (q3w), 0,2 мг/кг три раза в неделю (q3w), 0,2 мг/кг ежедневно и двое суток перерыв (qd), 0,1 мг/кг ежедневно и двое суток перерыв (qd).

Фигуры 17A-17B представляют собой результаты исследований in vivo двух форматов слитого белка с вариантом IL-10, с большой молекулярной массой (большой) и с малой молекулярной массой (малого), которые соответствуют схематическим диаграммам на фигурах 9C и 9F, соответственно. Вариант IL-10 включает мутации V31L и A75I. Эти результаты проверяли влияние слитых белков с IL-10 без возможности нацеливания на уменьшение размера опухоли. Области VH и VL из слитых белков представляют собой ненацеленные последовательности или из анти-ВИЧ и анти-Эбола (большой), или из анти-Эбола (малый). Фигура 17A представляет собой исследование дозирования ненацеленного малого формата с дозировкой пять суток через двое по сравнению с пегилированным IL-10 (0,75 мг/кг в сутки). Фигура 17B представляет собой исследование дозирования ненацеленного малого (1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,25 мг/кг) и большого (0,2 мг/кг) форматов с дозированием три раза в неделю по сравнению с пегилированным рекомбинантным человеческим IL-10 (0,75 мг/кг ежедневно).

Фигуры 18A-18C представляют собой результаты исследования in vivo двух форматов слитого белка с вариантом IL-10, большого и малого, которые соответствуют схематическим диаграммам фигур 9C и 9F, соответственно. Эти результаты проверяли влияние слитых белков IL-10 с нацеливающими способностями на уменьшение размера опухоли. Вариант IL-10 включает мутации V31L и A75I. В большом формате один набор областей VH и VL из слитых белков представляет собой антитело к EGFR, тогда как другой набор VH и VL представляет собой антитело к Эбола. Малый формат включает VH и VL только из антитела к EGFR. Фигура 18A представляет собой результаты исследования ежедневного дозирования нацеленных слитых белков IL-10 большого формата (0,25 мг/кг), малого формата (0,25 мг/кг) и ненацеленного слитого белка IL-10 малого формата (0,25 мг/кг) по сравнению с пегилированным рекомбинантным человеческим IL-10 (0,75 мг/кг). Фигура 18B представляет результаты исследования с дозированием трижды в неделю нацеленного слитого белка IL-10 большого формата (1 мг/кг, 0,25 мг/кг, и 0,25 мг/кг ежедневно) по сравнению с ненацеленным слитым белком IL-10 большого формата (DhDe:DV07 при 0,2 мг/кг) и пегилированным IL-10 (0,75 мг/кг ежедневно). Фигура 18C представляет результаты исследования с дозированием трижды в неделю нацеленного слитого белка IL-10 малого формата (1 мг/кг, 0,25 мг/кг) по сравнению с ненацеленным слитым белком IL-10 малого формата (Debo:DV07 при 1 мг/кг) и пегилированным IL-10 (0,75 мг/кг в сутки).

Фигуры 19A-19B представляют собой результаты исследования холестерина in vivo с использованием диатела с вариантом EBV IL-10 с мутацией V31, включающего вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR.

Фигуры 20A-20B представляют собой результаты сравнительного исследования двух вариантных слитых белков IL-10 на макрофагах и T-клетках in vitro. Анализы исследуют эффективность двух форм слитого белка DV06 in vitro по сравнению с человеческим IL-10. Фигура 20A представляет собой анализ моноцитов/макрофагов с использованием DhivDebo:DV06 (SEQ ID NO: 26 и 27) и DmadcamDEbo:DV06 (SEQ ID NO: 41 и 42). Фигура 20B представляет собой анализ T-клеточного ответа, измеренный с помощью IFN-гамма с использованием DhivDebo:DV06 (SEQ ID NO: 26 и 27) и DmadcamDEbo:DV06 (SEQ ID NO: 41 и 42).

Фигуры 21A-21D представляют собой аминокислотные последовательности EBV IL-10. Фигура 21A представляет собой EBV IL-10. Фигура 21B представляет собой DV05, включая замену V31. Фигура 21C представляет собой DV06, включая замену A75I. Фигура 21D представляет собой DV07, включая замены V31L и A75I.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Перед подробным описанием различных вариантов осуществления заявки следует понимать, что эта заявка не ограничивается конкретными составами или параметрами процесса, поскольку они, конечно, могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания различных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Хотя ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных описанным в настоящем документе, можно использовать в практическом осуществлении различных описанных вариантов осуществления, предпочтительными являются материалы и способы, описанные в настоящем документе.

Если не указано иначе, варианты осуществления описаны в настоящем документе с использованием общепринятые способов и техник молекулярной биологии, биохимии, фармакологии, химии и иммунологии, хорошо известных специалистам в данной области. Многие из общих способов конструирования и изготовления вариантов IL-10, включая в качестве неограниченных примеров человеческий IL-10 и формы IL-10 из CMV и/или EBV, а также анализы тестирования вариантов IL-10, являются хорошо известными способами, которые являются легкодоступны и подробно описаны в данной области. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., текущее дополнение). Химия пегилирования на основе N-концевого альдегида также хорошо известна в данной области.

Следующие термины будут использованы для описания различных вариантов осуществления, обсуждаемых в настоящем документе, и предназначены для определения, как указано ниже.

Как применяются в настоящем документе при описании различных вариантов осуществления, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если содержание явно не указывает иное.

Термин «приблизительно» относится к отклонению в пределах 0,0001-5% от указанного числа или диапазона чисел. В одном из вариантов осуществления термин «приблизительно» относится к отклонению в пределах 1-10% от указанного числа или диапазона чисел. В одном из вариантов осуществления термин «приблизительно» относится к отклонению до 25% от указанного числа или диапазона чисел. В более конкретном варианте осуществления термин «относится» к разнице в 1-25% в отношении гомологии нуклеотидной последовательности или гомологии аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью дикого типа.

Термин «интерлейкин-10» или «IL-10» относится к белку, включающему две субъединицы, нековалентно соединенные с образованием гомодимера, где IL-10 представляет собой интеркалированный димер из двух пучков по шесть спиралей (спираль A-F). Как применяют в настоящем документе, если не указано иное, «интерлейкин-10» и «IL-10» могут относиться к белку (SEQ ID №: 1) или нуклеиновой кислоте (SEQ ID №: 2) человеческого IL-10 («hIL-10»; номер доступа GeneBank NP_000563; или патент США № 6217857); к белку (SEQ ID №: 7) или нуклеиновой кислоте (SEQ ID №: 8) мышиного IL-10 («mIL-10»; номер доступа в Genbank: M37897; или патент США № 6217857); или к вирусному IL-10, («вIL-10»). Гомологи вирусного IL-10 могут происходить из EBV или CMV (номера доступа GeneBank NC_007605 и DQ367962, соответственно). Термин EBV-IL10 относится к гомологу белка (SEQ ID №: 3) или нуклеиновой кислоты (SEQ ID №: 4) IL-10 из EBV. Термин CMV-IL10 относится к гомологу белка (SEQ ID №: 5) или нуклеиновой кислоты (SEQ ID №: 6) IL-10 из CMV. Как применяют в настоящем документе, термин «мономерный IL-10» относится к индивидуальным субъединицам IL-10 или варианту IL-10, которые при нековалентном соединении образуют гомодимер IL-10 или вариант IL-10. Термины «дикого типа», «wt» и «нативный» в настоящем документе используют взаимозаменяемо для обозначения последовательности белка (например, IL-10, CMV-IL10 или EBV-IL10), которая обычно встречается в природе у видов, из которых происходит конкретный рассматриваемый IL-10. Например, термин «дикого типа» или «нативный» EBV-IL10, таким образом, соответствовал бы аминокислотной последовательности, которая чаще всего встречается в природе.

Термин «происходящий», «производный», «производный от» или «происходящий из из» применяют в настоящем документе для идентификации исходного источника молекулы, такой как вирусная форма молекулы IL-10, но он не предназначен для ограничения способа, которым молекула приготовлена, произведена, изготовлена или сделана. Спосб мог бы включать, но не ограничиваясь указанными, такие способы как химические или рекомбинантные способы.

Термин «производное» предназначен для включения любой подходящей модификации референсной молекулы, представляющей интерес, или ее аналога, такой как сульфатирование, ацетилирование, гликозилирование, фосфорилирование, конъюгация (например, с полиэтиленгликолем), гезилирование или другое добавление чужеродных групп, при условии, что сохраняется желаемая биологическая активность (например, противовоспалительное действие и/или отсутствие стимуляции Т-клеток) контрольной молекулы или варианта.

Термины «вариант», «аналог» и «мутеин» относятся к биологически активным производным референсной молекулы, которые сохраняют желаемую активность, например, противовоспалительную активность. В основном, термины «вариант», «варианты», «аналог» и «мутеин», поскольку они относятся к полипептиду, относятся к соединению или соединениям, имеющим нативную полипептидную последовательность и структуру с одной или несколькими аминокислотными вставками, заменами (которые являются консервативными по своей природе) и/или делециями относительно нативной молекулы. Таким образом, термины «вариант IL-10», «вариантная молекула IL-10» и их грамматические вариации и формы множественного числа предназначены быть эквивалентными терминами, которые относятся к аминокислотной последовательности IL-10 (или последовательности нуклеиновой кислоты), которая отличается от IL-10дикого типа по идентичности или гомологии последовательности на 1-25%. Таким образом, например, вариантная молекула EBV IL-10 отличается от EBV IL-10 дикого типа наличием одной или нескольких вставок, замен и/или делеций в аминокислотной последовательности (или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоту). Таким образом, в одной форме вариант EBV IL-10 представляет собой вариант, который отличается от последовательности дикого типа из SEQ ID NO::3 наличием примерно от 1% до 25% различия в гомологии последовательности, что составляет примерно 1-42 аминокислоты.

Термин «слитый белок» относится к комбинации или конъюгации двух или более белков или полипептидов, которая приводит к новому расположению белков, которое обычно не существует в природе. Слитый белок является результатом ковалентных связей двух или более белков или полипептидов. Два или более белков, составляющих слитый белок, могут иметь любую конфигурацию от амино-конца до карбокси-конца. Таким образом, например, карбокси-конец одного белка может быть ковалентно связан с карбокси-концом или амино-концом другого белка. Типичные слитые белки могут включать сочетание мономерного IL-10 или мономерной вариантной молекулы IL-10 с одним или несколькими вариабельными доменами антитела. Слитые белки также могут образовывать димеры или связи с другими слитыми белками того же типа, что приводит к образованию комплекса слитых белков. В некоторых случаях образование комплекса слитых белков может активировать или усилить функциональность слитого белка по сравнению со слитым белком, не входящим в комплекс. Например, мономерный IL-10 или мономерная вариантная молекула IL-10 с одним или несколькими вариабельными доменами антитела могут иметь ограниченную или пониженную способность связываться с рецептором IL-10; однако, когда слитый белок образует комплекс, мономерные формы IL-10 или вариантной молекулы IL-10 становятся гомодимером, и вариабельные домены связываются в функциональное диатело.

«Функциональный вариант» представляет собой вариантную молекулу IL-10, которая включает модификации (например, вставки, замены и/или делеции), которые не разрушают биологическую активность референсной молекулы. Эти варианты могут быть «гомологичными» референсной молекуле, как определено ниже. В основном, аминокислотные последовательности таких аналогов будут иметь высокую степень гомологии последовательности с референсной последовательностью, например, гомологию аминокислотной последовательности более чем 50%, в основном, более чем 60%-70%, даже более конкретно 80%-85% или больше, такую как, по меньшей мере, 90%-95% или больше, когда две последовательности выровнены. Часто аналоги включают такое же количество аминокислот, но включают замены. Функциональный вариант сохраняет биологическую активность, которая увеличена, уменьшена или по существу такая же, как у нативной молекулы. Конкретно, термин «вариантная» молекула IL-10, который является взаимозаменяемым с терминами «сконструированная» молекула IL-10 или вариантная молекула IL-10 или «сконструированный» вариантный IL-10, относится к молекуле или к белку IL-10, который включает одну или обе модификации в рецептор-связывающем домене/доменах IL-10 и/или в областях, ответственных за формирование междоменного угла или межгомодимерного угла в иолекуле или белке IL-10. «Слитый белок», или «диатело», или «слияние» вариантного IL-10, в основном, относится к образованию слитого белка (или комплекса слитых белков), содержащего вариантный IL-10 (в любой мономерной или гомодимерной форме) и, по меньшей мере, один другой белок. Как применяют в настоящем документе вариантный IL-10 «или его слитый белок» можно использовать на всем протяжении этого описания для описания такого слитого белка вариантного IL-10.

«Аналог» или «аналоги» могут содержать замены, носящие консервативный характер. Например, консервативные замены могут включать в себя замены сходного типа в качестве неограничивающих примеров, такие как (1) кислотная замена между аспартатом и глутаминатом; (2) основная замена между лизином, аргинином или гистидином; (3) неполярная замена между аланином, валином, лейцином, изолейцином, пролином, фенилаланином, метионином или триптофаном; и (4) незаряженная полярная замена между любым из глицина, аспарагина, глутамина, цистеина, серина, треонина или тирозина. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Также возможно, что при условии, что желаемая и специфическая биологическая активность остается интактной, может быть произведена изолированная замена лейцина изолейцином или валином, аспартата глутаминатом, треонина серином или аналогичная консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту. Например, представляющий интерес полипептид может включать приблизительно до 1-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или даже приблизительно до 15-25 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, или любое целое число от 1 до 50, при условии, что желаемая функция молекулы остается интактной. Специалист в данной области может легко определить области интересующей молекулы, которые могут выдержать изменения, хорошо известные в данной области.

«Мутеин» дополнительно включает полипептиды, содержащие один или несколько молекул, подобных аминокислотам, включая в качестве неограничивающих примеров соединения, содержащие только амино и/или имино молекулы, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, и т.д.), полипептиды с замещенными связями, а также другими модификациями, известными в данной области, как природными, так и не-природными (например, синтетическими), циклизованные, разветвленные молекулы и т.п. Предпочтительно, аналог или мутеин будет сохранять некоторую биологическую активность, которая усиливается, уменьшается или по существу такая же, как у нативной молекулы. Способы создания аналогов полипептидов и мутеинов хорошо известны в данной области.

Термин «гомолог», «гомология», «гомологичный» или «по существу гомологичный» относится к процентной идентичности между, по меньшей мере, двумя полинуклеотидными последовательностями или, по меньшей мере, двумя полипептидными последовательностями. Последовательности гомологичны друг другу, когда показывают, по меньшей мере, приблизительно 50%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80%-85%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90%, и наиболее по меньшей мере приблизительно 80% -85%, по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95%-98% идентичности последовательности на определенной длине молекул.

«Идентичность последовательности» относится к точному соответствию нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота. Идентичность последовательности может варьироваться от 100% идентичности последовательности до 50% идентичности последовательности. Процент идентичности последовательности можно определить с использованием ряда способов, включая в качестве неограничивающих примеров, прямое сравнение информации о последовательности между двумя молекулами (референсная последовательность и последовательность с неизвестным % идентичности с референсной последовательностью) путем выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, деления на длину референсной последовательности и умножения результата на 100. Для помощи в определении процента идентичности можно использовать легкодоступные компьютерные программы.

Термин «фрагмент» предназначен для включения части молекулы полноразмерной аминокислотной или полинуклеотидной последовательности и/или структуры. Фрагмент полипептида может включать, например, C-концевую делецию, N-концевую делецию и/или внутреннюю делецию нативного полипептида. Активный или функциональный фрагмент определенного белка, в основном, включает в себя, по меньшей мере, приблизительно 5-10 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 15-25 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы или любое целое число между 5 аминокислотами и полноразмерной последовательностью, при условии, что рассматриваемый фрагмент сохраняет биологическую активность, такую как противовоспалительная активность. Что касается антитела, то фрагмент антитела относится к части интактного антитела, содержащей антигенсвязывающий участок или вариабельную область (области тяжелой цепи и/или легкой цепи) интактного антитела. Они могут включать, например, Fab, Fab', Fab'-SH, (Fab')₂, Fv-фрагменты, диатела, одноцепочечные Fv (ScFv), одноцепочечные полипептиды с одним вариабельным доменом легкой цепи, фрагмент, имеющий три CDR вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи.

Термин «в значительной степени очищенный», в основном, относится к выделению вещества, таким образом, что вещество составляет основную процентную часть образца, в котором оно находится. В значительной степени очищенный компонент составляет 50%, предпочтительно 80-85%, более предпочтительно 90-95% образца. Подобным образом термин «изолированный» означает, когда речь идет о полипептиде или полинуклеотиде, что указанная молекула является отдельной и дискретной от всего организма, в котором молекула находится в природе, или присутствует при существенном отсутствии других биологических макромолекул того же самого типа.

Термины «субъект», «индивидуум» или «пациент» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и относятся к позвоночному, предпочтительно млекопитающему. Млекопитающие в качестве неограничивающих примеров включают мышей, грызунов, обезьян, человека, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и некоторых домашних животных.

Термин «введение» включает путиы введения, которые позволяют активному ингредиенту по изобретению выполнять свои намеченные функции.

«Терапевтически эффективное количество», если оно относится, например, к введению вариантных EBV-IL-10 или их слитых белков, описываемых в настоящем документе, относится к достаточному количеству вариантного EBV-IL-10 или его слитых белков для стимулирования определенных видов биологической активности. Такие виды могут включать, например, подавление функции миелоидной клетки, усиление активности купферовской клетки и/или отсутствие какого-либо эффекта на CD8⁺ T-клетки или усиление активности CD8⁺ T-клеток, а также блокаду положительной регуляции рецептора Fc за счет тучной клетки или предотвращение дегрануляции. Таким образом, «эффективное количество» улучшит или предотвратит симптом или признак заболевания. Эффективное количество также означает количество, достаточное для проведения или облегчения диагностики.

Термин «лечить» или «лечение» относится к способу уменьшения последствий заболевания или состояния. Лечение может также относиться к способу уменьшения основной причины заболевания или самого состояния, а не просто к симптомам. Лечение может быть любым снижением от естественного уровня и может быть, в качестве неограничивающих примеров, полным устранением заболевания, состояния или симптомов заболевания или состояния.

«Химиотерапевтическое» средство представляет собой химическое соединение, полезное при лечении злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклосфосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретамина оксид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, уромустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, калихимицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, келамицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зористатин; анти-метаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидин аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; фолиевая кислота, такая как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиний ацетат; этоглюцид; галлий нитрат; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-C); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL® Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J) и доксетаксел (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, так как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (ВП-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; Кселода® Roche, Швейцария; ибандронат; CPT11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (ДМФО); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных. В это определение также включены противогормональные средства, которые регулируют или ингибируют действие гормона на опухоли, такие как анти-эстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4 (5) имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных.

Термин «конъюгат», «конъюгированный», «конъюгация» или «конъюгирование», как применяют в настоящей заявке, относится к связыванию двух или более частей молекулы вместе. Связывание происходит посредством ковалентной связи (например, пептидной связи).

Вариантные белки IL-10

Вариантная молекула IL-10 по настоящей заявке включает модификации к любой форме IL-10. Эти модификации в молекуле IL-10 включают вставки, делеции и/или замену одной или нескольких аминокислот в областях и/или доменах, участвующих в связывании рецептора IL-10, и/или в тех, которые участвуют в образовании междоменного или межгомодимерного угла в молекуле IL-10. Примеры последовательностей IL-10, которые могут быть использованы при конструировании вариантных молекулх IL-10 по настоящей заявке в качестве неограничивающих примеров включают гомологи из вируса Эпштейна-Барр («EBV»; см., например, Moore et al., Science (1990) 248: 1230-1234; Hsu et al., Science (1990) 250: 830-832; Suzuki et al., J. Exp. Med. (1995) 182: 477-486), цитомегаловируса («CMV» ; см., например, Lockridge et al., Virol. (2000) 268: 272-280; Kotenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97: 1695-1700), и вируса герпеса лошадей (см., например, Rode et al., Virus Genes (1993) 7: 111-116), вирус OrF (см., например, Imlach et al., J. Gen. Virol. (2002) 83: 1049- 1058 и Fleming et al., Virus Genes (2000) 21: 85-95). Другие типичные последовательности IL-10 включают в себя последовательности, описанные в NCBI с номерами доступа NM010548, AF307012, M37897, M84340 (мышиные последовательности); U38200 (лошадиные); U39569, AF060520 (кошачьи последовательности); U00799 (бычьи); U11421, Z29362 (овечьи последовательности); L26031, L26029 (последовательности макаки); AF294758 (обезьяньи); U33843 (собачьи); AF088887, AF068058 (последовательности кролика); AF012909, AF120030 (последовательности сурка); AF026277 (опоссума); AF097510 (морской свинки); U11767 (оленя); L37781 (песчанки); AB107649 (ламы и верблюда).

В одном из вариантов осуществления вариантные молекулы IL-10, описанные в настоящем документе, получены путем модификации последовательностей IL-10 человеческого белка дикого типа (SEQ ID NO::1), CMV (SEQ ID NO: 5), EBV (SEQ ID NO: 3) или мыши (SEQ ID №: 7). Типичные примеры различных вариантных молекул IL-10 представлены в SEQ ID NO: 9-23.

Модификации, относящиеся к IL-10 дикого типа, включают вставки, делеции и/или замены одной или нескольких аминокислот в областях, ответственных за (i) связывание рецептора IL-10 и/или (ii) образование междоменного. или межгомодимерного угла молекулы IL-10.

Вариантные молекулы IL-10: рецептор-связывающие области IL-10

Области, ответственные за связывание рецептора, включают любую аминокислотную часть, расположенную в областях, которые непосредственно вовлечены или ответственны за связывание IL-10 с рецептором 1 IL-10 (IL10R1) и/или рецептором 2 IL-10 (IL10R2). Эти области могут включать, например, прерывающиеся части молекулы IL-10, ранее обсуждавшиеся и нанесенные на карту в данной области (см., например, Yoon 2005; Josephson 2001). Например, модификации любой области, в качестве неограничивающих примеров, такой как спираль A, спираль F и петля AB, отвечающей за формирование точек контакта, и щелей, связанных со связыванием IL-10 с рецептором IL-10, рассматриваются в этой заявке. В предпочтительном варианте осуществления модификация (например, вставка, делеция, и/или замена) рецептор-связывающего домена включает аминокислоту 31 и/или 75 из SEQ ID NO: 3. В особенно предпочтительном варианте осуществления модификация включает замену валина в положении 31 на лейцин (V31L, в настоящем документе называемая «DV05») в SEQ ID NO: 3, замену аланина в позиции 75 на изолейцин (A75I, в настоящем документе называемая «DV06») в SEQ ID NO: 3, или обе замены V31L и A75I (в настоящем документе обозначенные как «DV07») в SEQ ID NO: 3. В одном из вариантов, DV05 представляет собой SEQ ID NO: 55, DV06 представляет собой SEQ ID NO: 57, и DV07 представляет собой SEQ ID NO: 59.

В одном из вариантов осуществления рецептор-связывающий домен включает любую одну или несколько точек контакта интерфейса сайта Ia и/или сайта Ib, которые обсуждаются у Josephson et al. (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, фигура 1). В одном из вариантов осуществления изобретения точки контакта интерфейса сайта Ia включают одну или несколько аминокислот, расположенных в изгибе спирали F и в петле AB. В другом варианте осуществления точки контакта интерфейса сайта Ib включают одну или несколько аминокислот, расположенных на N-конце спирали A и на C-конце спирали F. В другом варианте осуществления любые одна или несколько аминокислот, расположенные на IL-10 и ответственные за связывание с рецептором будут включать любую одну или несколько из 1-10 аминокислот внутри спирали A и 1-7 аминокислот внутри петли AB. В другом варианте осуществления рецептор-связывающая область может включать одну или несколько модификаций следующих аминокислот или 1-10 аминокислот, сосредоточенных вокруг них, где аминокислоты представляют собой Glu-142, Lys-138, Asp-144, Gln-38, Ser-141, Asp-44, Gln-42, Gln-38, Arg-27, Glu-151, Arg-24, Pro-20, Ile-158 или любое их сочетание.

В одном из аспектов, модификации рецептор-связывающего домена включают любую одну или несколько точек контакта интерфейса сайта IIa и/или сайта IIb которые обсуждаются у Josephson et al. (Immunity, 2001, 15, p. 35-46, фигура 1). В одном из вариантов осуществления изобретения точки контакта интерфейса сайта IIa включают одну или несколько аминокислот, расположенных в петле DE. В другом варианте осуществления рецептор-связывающая область может включать одну или несколько модификаций следующих аминокислот или 1-10 аминокислот, сосредоточенных вокруг них, где аминокислоты представляют собой Ser-11, Thr-13, Asn-18, Arg-104, Arg-107 или любое их сочетание. В одном из вариантов осуществления вариантная молекула IL-10 будет содержать 1-100 (или любое целое число в пределах диапазона) аминокислотных вставок, делеций и/или замен, которые влияют на рецептор-связывающий домен, где такие вставки, делеции и/или замены либо увеличивают, либо снижают аффинность связывания вариантной молекулы IL-10 с рецептором IL-10.

Вариантные молекулы IL-10: Модификации междоменного угла

Области, ответственные за формирование междоменного (или межгомодимерного, что применяют взаимозаменяемо) угла молекулы IL-10, включают любую аминокислотную часть, расположенную в областях, которые непосредственно вовлечены или ответственны за образование определенных междоменных углов гомодимеров IL-10. IL-10 дикого типа образует «L-образный» димер, когда два мономерных звена IL-10 переплетаются антипараллельно. Полученный междоменный угол для человеческого IL-10 и EBV-IL10 составляет приблизительно 89 и 97 градусов, соответственно. Чтобы настроить передачу сигнала рецептора IL-10, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на модификацию аминокислот, ответственных за образование междоменного угла, в петле DE, частях спирали D или спирали E, ответственных за образование L-образного димера в каждом мономере. В другом варианте осуществления области, ответственные за междоменный угол, включают область линкера приблизительно из 12 аминокислот, расположенную между спиралью D и спиралью E белка IL-10. Модификации за счет вставки, делеции или замены приводят к ограниченному или ослабленному междоменному углу IL-10 по сравнению с человеческим IL-10 или EBV-IL10. Когда модифицируют мономерную молекулу IL-10, что приводит к ограниченному/плотному/закрытому или расслабленному/свободному/открытому междоменному углу IL-10 при гомодимеризации, модифицированная молекула IL-10 будет производить вариантную молекулу IL-10, которая имеет измененный междоменный угол, который задействует и модулирует свой рецептор (рецептор IL-10). В другом варианте осуществления замена включает введение пролина в аминокислотный сегмент, расположенный между спиралью D и спиралью Е EBV-IL10 и/или между спиралью С и спиралью D.

Таким образом, в варианте осуществления, вариантная молекула IL-10 будет содержать одну или несколько вставок, делеций и/или замен, которые демонстрируют измененный межмолекулярный угол или измененный междоменный угол по сравнению с IL-10 дикого типа. Измененный межмолекулярный угол или измененный междоменный угол могут димеризоваться с идентичной или другой вариантной молекулой IL-10, в результате чего получается вариантная молекула IL-10, который взаимодействует с рецептором IL-10 с другим углом взаимодействия по сравнению с молекулой IL-10 дикого типа. Отличающийся угол взаимодействия вариантной молекулы IL-10 приводит к способности модулировать или «настраивать» передачу сигнала рецептора IL-10 для активации или подавления воспаления и/или иммунного ответа. В предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой EBV-IL10. В другом предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 использует молекулу EBV-IL10 в качестве основы для модификации. В еще одном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой гибридную молекулу с частями и доменами из других молекул IL-10 (таких как, но не ограничиваясь указанными, IL-10 человека, IL-10 мыши и/или CMV-IL10).

В другом предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 продуцирует ослабленный междоменный угол, который будет подавлять ответ воспалительных клеток (клетки миелоидной линии) и не управлять активацией лимфоцитарных клеток, таких как Т-клетки. В сочетании с модификациями рецептор-связывающего домена, предпочтительно с модификациями, которые приводят к пониженной или неизменной аффинности к рецептору, вариантные молекулы IL-10 с ослабленным междоменным углом будут эффективны для подавления секреции цитокинов миелоидными клетками (моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, гранулоцитами, тучными клетками, купферовскими клетками) в ответ на провоспалительные раздражители. Эта конфигурация вариантной молекулы IL-10 подходит, например, для лечения воспалительных заболеваний, в качестве неограничивающих примеров, таких как ВЗК, болезнь Крона, псориаз, ревматоидный артрит, НАЖБП и НАСГ.

В другом предпочтительном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 продуцирует ограниченный междоменный угол, который будет усиливать активацию иммунных клеток, таких как Т-клетки. В сочетании с модификациями рецептор-связывающего домена, предпочтительно с модификациями, которые приводят к более высокой аффинности к рецептору, вариантные молекулы IL-10 с ограниченным междоменным углом будут эффективны для усиления, например, CD8⁺ T-клеток, NK-клеток и утилизации для клеток Купфера. Эта конфигурация вариантной молекулы IL-10 подходит, например, для лечения ряда солидных и гематологических злокачественных опухолей, включая метастатические злокачественные опухоли.

Области, ответственные за формирование междоменного угла, могут быть непрерывными или прерывистыми частями, расположенными внутри молекулы IL-10. В одном из вариантов осуществления междоменный угол для вариантной молекулы IL-10 будет иметь изменение степени на 1-25 градусов, в другом предпочтительном варианте осуществления изменение степени составляет 1-10 градусов, в более предпочтительном варианте осуществления изменение степени составляет 1-5 градусов, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изменение степени составляет менее 5 градусов. В одном из вариантов осуществления вариантная молекула IL-10 будет содержать 1-100 (или любое целое число в диапазоне) аминокислотных вставок, делеций и/или замен, которые влияют на междоменный угол.

В одном из вариантов осуществления изобретения будут спроектированы и созданы молекулы IL-10 с помощью компьютерного моделирования для прогнозирования области или областей, наиболее ответственных за связывание рецептора IL-10 и/или междоменные углы. Компьютерное моделирование поможет предоставить более быстрые и эффективные средства прогнозирования областей, которые больше всего выиграют от модификации рецептор-связывающего домена и/или междоменных углов.

В другом варианте осуществления молекула по настоящей заявке включает производные вариантных молекул IL-10. Они могут включать модификации вариантных молекул, чтобы включить части, которые увеличивают размер, полувыведение и биодоступность вариантных молекул.

Вариантные молекулы IL-10: Модификации с ПЭГ

В одном из вариантов осуществления вариантные молекулы IL-10 могут включать добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ). Варианты пегилированного IL-10 будут включать присоединение, по меньшей мере, одной молекулы ПЭГ. Не привязываясь к какой-либо конкретной теории, присоединение ПЭГ к вариантному IL-10 может защищать от протеолиза, снижать иммуногенность, способствовать дестабилизации вариантного IL-10 на рецепторе, чтобы поддерживать его подавляющее действие на миелоидные клетки и предотвращать активацию Т-клеток.

В своей наиболее распространенной форме ПЭГ представляет собой линейный или разветвленный простой полиэфир, оканчивающийся гидроксильными группами и имеющий общую структуру:

HO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH

Способы связывания ПЭГ с вариантными молекулами IL-10 в настоящей заявке будут следовать тем способам/протоколам, которые уже известны в данной области. Например, конъюгация или связывание ПЭГ требует активации ПЭГ путем получения производного ПЭГ, имеющего функциональную группу на одном или обоих концах. Наиболее распространенным способом конъюгации белков с ПЭГ была активация ПЭГ с помощью функциональных групп, подходящих для реакции с лизином и N-концевыми аминокислотными группами. В частности, наиболее распространенными реакционноспособными группами, участвующими в связывании ПЭГ с полипептидами, являются альфа или эпсилон аминогруппы лизина.

Реакция пегилирования линкера с вариантной молекулой IL-10 приводит к присоединению группы ПЭГ преимущественно на следующих участках: альфа-аминогруппа на N-конце белка, эпсилон-аминогруппа на боковой цепи лизиновых остатков и имидазольная группа на боковой цепи гистидиновых остатков. В некоторых вариантах осуществления, поскольку вариантные молекулы IL-10 представляют собой рекомбинантные белки, которые обладают одной альфа- и рядом эпсилон-амино- и имидазольных групп, можно получить множество позиционных изомеров в зависимости от химического состава линкера.

Двумя широко используемыми активированными монометокси-ПЭГ первого поколения (мПЭГ) были сукцинимидил-карбонатный ПЭГ (SC-ПЭГ; см., например, Zalipsky, et al. (1992) Biotechnol. Appl. Biochem 15: 100-114; и Miron и Wilcheck (1993) Bioconjug. Chem. 4: 568-569) и бензотриазол карбонатный PEG (BTC-PEG; см., например, Dolence, et al., патент США № 5650234), которые реагируют преимущественно с лизиновыми остатками с образованием карбаматной связи, но также известно, что они реагируют с гистидиновыми и тирозиновыми остатками. Было показано, что связь с остатками гистидина на IFNα представляет собой гидролитически нестабильную имидазолкарбаматную связь (см., например, Lee и McNemar, патент США № 5985263, который в полном объеме включен в качестве ссылки).

Технология ПЭГилирования второго поколения была разработана, чтобы избежать этих нестабильных связей, а также отсутствия селективности в отношении остаточной реактивности. Использование ПЭГ-альдегидного линкера нацелено на единственный сайт на N-конце полипептида и/или белковой субъединицы посредством восстановительного аминирования. IL-10 может быть пегилирован с использованием линкеров разных типов и pH для получения различных форм пегилированной молекулы (см., например, патент США № 5252714, патент США № 5643575, патент США № 5919455, патент США № 5932462, патент США № 5932462, патент США № 5252714, патент США № 5643575, патент США № 5643575, патент США № 5932462, патент США № 5985263, патент США № 7052686, которые включены посредством ссылки в полном объеме).

Молекулы-миметики IL-10

В другом варианте осуществления настоящая заявка включает молекулы-миметики, которые подражают биологической функции вариантных молекул IL-10. Эти миметики в качестве неограничивающих примеров включают пептиды, низкомолекулярные соединения, модифицированные гормоны и антитела, которые имеют структуры и функции, которые являются такими же или по существу такими же, как и те, которые получены из вариантных молекул IL-10. Молекулы-миметики IL-10, которые могут формировать основу для модификации для воспроизводства или повторения вариантных молекул IL-10, включают те, которые описаны в US20080139478, US20120238505 и/или US20150218222, все из которых в полном объеме включены в качестве ссылки.

Гибридные молекулы IL-10 и слитые белки IL-10

В другом варианте осуществления настоящая заявка включает вариантные молекулы IL-10, которые представляют собой гибридные молекулы, состоящие из частей, полученных из IL-10, EBV-IL10 и/или CMV-IL10. Например, можно комбинировать вместе разные домены внутри каждого из IL-10, EBV-IL10 и/или CMV-IL10 для создания гибридной молекулы, таким образом, что в комбинации находится весь рецептор-связывающий домен или его части и/или домены, ответственные за интердоменный угол в IL-10 целиком или их части.

Еще в одном варианте осуществления вариантная молекула IL-10 является частью сконструированного слитого белка. Линкер или спейсер может представлять собой случайную аминокислотную последовательность (например, SSGGGGS (SEQ ID №: 30, GGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID №: 31) или SSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID № 54)) константную область антитела, scFv или диатело. Константная область может происходить, но не ограничиваясь указанными, из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD или IgE. Линкер или спейсер может быть преимущественно константной (CH) областью 1, CH2, или CH3 тяжелой цепи. В более предпочтительном варианте осуществления линкер или спейсер представляет собой случайную аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 30 и/или 31. В другом аспекте линкер или спейсер может дополнительно содержать, по меньшей мере, две межцепочечных дисульфидных связи.

Слитый белок также может включать, по меньшей мере, один мономер IL-10 или вариантной молекулы IL-10, конъюгированный с N-концом слитого белка, с C-концом или с обоими. В другом варианте осуществления слитый белок, содержащий IL-10 или вариантный IL-10, также может включать, по меньшей мере, один цитокин, конъюгированный с концом, противоположном IL-10 или вариантному IL-10, и включает IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-10, вариантную молекулу IL-10, IFN-альфа, TGF-бета, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL -11, или IL-13, или любое их сочетание. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления слитый белок содержит две мономерные формы IL-10 или вариантных молекул IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка и два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с C-концом слитого белка; слитый белок включает две мономерные формы IL-10 или вариантных молекул IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка и, по меньшей мере, одну молекулу IL-2, конъюгированную с C-концом слитого белка; слитый белок включает два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка, и, по меньшей мере, одну молекулу IL-15, конъюгированную с C-концом слитого белка. В другом варианте осуществления C-конец слитого белка может иметь, по меньшей мере, два разных цитокина, выбранных из IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-10, вариантной молекулы IL-10, IFN-альфа, TGF-бета, основного FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13.

В другом варианте осуществления слитый белок изготовлен с использованием одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), диатела, Fab или любого фрагмента антитела в качестве основного каркаса, на котором конъюгированы один мономер или два мономера IL-10, один мономер или два мономера вариантной молекулы IL-10, IL-2, IL-7, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IFN-альфа, TGF-бета, основного FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13, или их сочетания.

В одном из особенно предпочтительных вариантов изобретения, слитый белок содержит, по меньшей мере, одну вариабельную область, имеющую вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL), связанную с IL-10 или вариантной молекулой IL-10. В этой конфигурации слитый белок содержит мономер IL-10 или мономер вариантной молекулы IL-10, связанный, по меньшей мере, с одной вариабельной областью антитела. В одном из аспектов, этот слитый белок представляет собой линейную смежную последовательность, включающую мономер IL-10 или мономер вариантной молекулы IL-10, связанный с VH, связанной с VL, связанной с мономером IL-10. Вариабельная область антитела может быть вариабельной областью тяжелой (VH) цепи, вариабельной областью легкой (VL) цепи или обеими. Первый слитый белок содержит белковую последовательность, имеющую такую линейную конфигурацию, что мономер IL-10 или мономер вариантного IL-10 конъюгирован с карбокси-концом вариабельной области (VH, или VL, или обе). Второй слитый белок может содержать белковую последовательность, имеющую такую линейную конфигурацию, что мономер IL-10 или мономер вариантного IL-10 связан с амино-концом вариабельной области (VH, или VL, или обе). Типичный пример первого слитого белка, описанного выше, может включать следующую конфигурацию:

a) _NH2(Ab1VL)_COOH-(линкер)-_NH2(моноIL10)_COOH

Типичный пример второго слитого белка, описанного выше, может включать следующую конфигурацию:

b) _NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)-_NH2(Ab₁VH)_COOH

Вместе первый (a) и второй (b) слитые белки образуют функциональный белковый комплекс антипараллельным образом, в результате чего мономеры IL-10 или вариантного IL-10 с концевыми связями образуют функциональный гомодимер, и вариабельные области, вместе способны к формированию функционального антигенсвязывающего участка («ABS») (см. например, фигуры 9 (a)-(f)).

В альтернативном варианте осуществления мономер IL-10 или мономер вариантного IL-10 может быть конъюгирован, по меньшей мере, с двумя вариабельными областями из одного и того же антитела или из двух различных антител. В этой конфигурации, по меньшей мере, два вариабельных области представляют собой VH и VL. Пример такой конфигурации мог бы включать первый слитый белок с линейной смежной белковой последовательностью области VH из первого антитела, связанной своим карбокси-концом с амино-концом области VL из второго антитела, связанной с амино-концом мономера IL-10 или мономера вариантной молекулы IL-10. Альтернативная конфигурация могла бы включать второй слитый белок с линейной смежной белковой последовательностью мономера IL-10 или мономера вариантной молекулы IL-10, связанной карбокси-концом с амино-концом области VH из второго антитела, связанной с амино-концом области VL из первого антитела. Типичный пример первого слитого белка, описанного выше, может включать следующую конфигурацию:

a) _NH2(Ab_1-VH)_COOH--(линкер)-_NH2(Ab₂VL)_COOH-(линкер)-_NH2(моноIL10)_COOH

Типичный пример второго слитого белка, описанного выше, может включать следующую конфигурацию:

b) _NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)-_NH2(Ab₂VH)_COOH-(линкер)-_NH2(Ab_1-VL)_COOH

Вместе первый (a) и второй (b) слитые белки образуют функциональный белковый комплекс антипараллельным образом, в результате чего мономеры IL-10 или вариантного IL-10 с концевыми связями образуют функциональный гомодимер, и вариабельные области, вместе способны к формированию ABS (см. например, фигуры 9(a)-(c)).

В еще одном варианте осуществления слитый белок содержит два мономера IL-10 или два мономера вариантного IL-10, которые слиты вместе, и одну или несколько областей VH и VL. Каждый мономер индивидуально связан с одной или несколькими областями VH и/или областями VL антитела. Когда более одной области VH и/или VL задействовано в этой конфигурации слитого белка, области VH и VL могут происходить из одного и того же антитела или, по меньшей мере, из двух различных антител. В одной конкретной конфигурации этого слитого белка область VH или VL связана с амино-концом первого мономера, который затем связан своим карбокси-концом с амино-концом второго мономера, который затем связан с амино-концом VL или VH. Необязательно, дополнительные области VH или VL могут быть связаны с амино- или карбокси-концами, где области VH или VL могут происходить из одного и того же антитела или из разных антител. Типичные примеры слитого белка, описанного выше, могут включать следующие конфигурации (см. например, фигуры 10 (d)-(f)):

_NH2(Ab_1-VH)_COOH--(линкер)-_NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)-_NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)_-NH2(Ab_1-VL)_COOH

Слитый белок, описанный выше, будет способен сворачиваться таким образом, чтобы мономеры IL-10 образовывали гомодимер, а вариабельные домены (VH и VL) антитела формировали функциональный ABS.

В другом варианте осуществления слитый белок содержит два мономера IL-10 или два мономера вариантного IL-10, расположенных на противоположных концах слитого белка и, по меньшей мере, одну область VH и VL, где области VH и VL связаны вместе. В этой конфигурации области VH и VL слиты вместе, и каждый мономер индивидуально связан либо с областью VL, либо с областью VH из первого антитела. В этой конфигурации каждый из мономеров IL-10 или мономеров вариантного IL-10 индивидуально связан или с VH, или с VL из первого антитела. Типичный пример слитого белка, описанного выше, может включать следующие конфигурации (см., например, фигуры 10 (a)-(c)):

a) _NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)_-NH2(Ab_1-VH)_COOH-(линкер)-_NH2(Ab_1-VL)_COOH-(линкер)_-NH2(моноIL10)_COOH

b) _NH2(моноIL10)_COOH-(линкер)_-NH2(Ab_1-VL)_COOH-(линкер)-_NH2(Ab_1-VH)_COOH-(линкер)_-NH2(моноIL10)_COOH

Мономер IL-10 или мономер вариантного IL-10 может быть связан с последовательностью VH или VL через линкерную последовательность. Линкер может быть карбокси-концевым линкером, связывающим карбокси-конец области вариабельной цепи (VH или VL) с амино-концом мономера IL-10 или мономера вариантной молекулы IL-10. Альтернативно, линкер может быть амино-концевым линкером, посредством чего карбокси-конец мономерного IL-10 или мономерной вариантной молекулы IL-10 связан с амино-концом области вариабельной цепи (VH или VL).

Таким образом, в одной форме слитый белок содержит мономер молекулы IL-10 или вариантной молекулы IL-10, связанный с двумя вариабельными областями, по меньшей мере, из двух различных антител, где две вариабельные области сконфигурированы в виде области VH из первого антитела, связанной с областью VL из второго антитела, или VL из первого антитела, связанной с VH из второго антитела. Слитый белок в соответствии с этой формой может включать мономерную молекулу IL-10 или ее вариант, включая, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, которая увеличивает или снижает аффинность к рецептору IL-10. Замена аминокислот, влияющая на связывание с рецептором IL-10, может происходить в IL-10 от человека, CMV или EBV. Замена аминокислоты может предпочтительно происходить в EBV IL-10 и включать замену аминокислоты в положении 31, 75 или в обеих. Аминокислоты могут включать любую замену или несколько замен V31 или A75I, или и то, и другое. В дополнение к замене аминокислот, влияющих на аффинность связывания с рецептором IL-10, вариантный IL-10 также может включать модификации, которые влияют на междоменный угол. В другом варианте осуществления слитый белок включает конфигурацию, выбранную из: (a) область VH из первого антитела, связанная своим карбокси-концом с амино-концом области VL из второго антитела, связанной с карбокси-концом мономера IL-10 или его варианта; или (b) молекула IL-10 или ее вариант, связанная своим карбокси-концом с амино-концом области VH из второго антитела, затем связанной с амино-концом области VL из первого антитела. Эти конфигурации слитого белка включают в себя в одном предпочтительном варианте осуществления последовательности SEQ ID NO: 24-28, 29, и 33-53. Эти последовательности слитых белков способны к формированию комплекса, где мономеры IL-10 или мономеры вариантного IL-10 способны к формированию гомодимера. Такой комплекс может включать и/или конфигурироваться как комплекс диатела.

В другой форме слитый белок может быть сформирован как иммуноконъюгат, включающий первый слитый белок, содержащий на своем амино-конце вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела, связанную с вариабельной областью легкой цепи (VL) из второго антитела, далее связанную с мономером IL-10; и второй слитый белок, содержащий на своем амино-конце мономер IL-10, связанный с VH из второго антитела, далее связанную с VL из первого антитела, где VH и VL из первого и второго антитела ассоциируют в диатело и мономеры IL-10 образуют функциональную димерную молекулу IL-10. В другом предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгатный комплекс включает первый слитый белок, содержащий на своем амино-конце область VH из первого антитела и мономерную молекулу IL-10, связанную при помощи своего амино-конца; и второй слитый белок, содержащий на своем амино-конце мономер IL-10, связанный с VL из первого антитела, где область VH из первого антитела ассоциируется с областью VL из первого антитела, тем самым позволяя мономерным молекулам IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10. Мономер (-ы) IL-10 или вариант (-ы) IL-10 может включать, как описано выше, модификации аминокислот, которые влияют на связывание с рецептором IL-10 и/или на междоменный угол. В другом предпочтительном варианте осуществления иммуноконъюгатный комплекс включает первый слитый белок, содержащий на своем амино-конце область VH из первого антитела, связанную с мономерной молекулой IL-10; и второй слитый белок, содержащий на своем амино-конце мономер IL-10, связанный с VL из первого антитела, где область VH из первого антитела ассоциируется с областью VL из первого антитела, тем самым позволяя мономерным молекулам IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10. В еще одном варианте осуществления иммуноконъюгат содержит на своем амино-конце мономер первого IL-10 (или вариантной молекулы IL-10), связанный с областью VH из первого антитела, связанной с областью VL из первого антитела, связанной с мономером второго IL-10 (или вариантной молекулой IL-10), где два мономера IL-10 способны связываться вместе с образованием функционального димера IL-10. Описанные области VH и VL способны к формированию антигенсвязывающего участка, который специфически нацелен на антиген (например, рецептор, белок, нуклеиновую кислоту и т.д.). Таким образом, есть две цепи, цепь 1 и цепь 2, которые вместе образуют комплекс слитых белков, который создает функционирующий гомодимер IL-10 (или вариантной молекулы IL-10). Типичные цепи слитого белка (т.е. цепь 1 и цепь 2) включают следующие:

Цепь 1 Цепь 2 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51

Слитые белки включают пару VH и VL, по меньшей мере, от одного антитела. Пара VH и VL действует как каркас, к которому могут быть прикреплены мономеры IL-10 или его вариантов, так что они могут гомодимеризоваться в функционирующую молекулу IL-10. Специалисту в данной области таким образом понятно, что каркас VH и VL, используемый в слитом белке, можно выбирать на основе желаемых физических характеристик, необходимых для правильной димеризации белка IL-10 или варианта IL-10 и/или желания поддерживать нацеливающие свойства VH и VL. Аналогичным образом, специалисту понятнот, что участки CDR в паре VH и VL также могут быть заменены другими участками CDR для получения специфически нацеленного слитого белка. Также предполагается, что если слитый белок не предназначен для нацеливания на какой-либо конкретный антиген, пара VH и VL может быть выбрана в качестве основы, которая не нацелена на какой-либо конкретный антиген (или является антигеном в низком количестве in vivo), такая как пара VH и VL от анти-ВИЧ и/или анти-Эбола. Слитый белок может включать в себя 1-4 вариабельные области. Вариабельные области могут происходить от одного и того же антитела или, по меньшей мере, от двух разных антител. Вариабельные цепи антитела можно получать или они могут происходить из множества антител (например, те, которые нацелены на белки, клеточные рецепторы и/или антигены, ассоциированные с опухолью и т.д.). В другом варианте осуществления вариабельные области получены из антител, которые нацелены на антигены, связанные с различными заболеваниями (например, злокачественной опухолью), или те, которые, как правило, не обнаруживаются или редко обнаруживаются в сыворотке здорового индивидуума, например вариабельные области из антител, направленных на EGFR, PDGFR, VEGFR, Her2Neu, FGFR, GPC3 или другие антигены, ассоциированные с опухолью, MadCam, ICAM, VCAM или другие ассоциированные с воспалением белки клеточной поверхности белки, ВИЧ и/или вирус Эбола. Таким образом, в одном из вариантов осуществления вариабельные области получены или происходят из анти-EGFR, анти-MadCam, анти-ВИЧ (Chan et al, J. Virol, 2018, 92 (18): e006411-19), анти-ICAM, анти-VCAM или анти-Эбола (опубликованная в США заявка 2018/0180614, в полном объеме включенная в качестве ссылки, особенно мАТ, описанные в таблицах 2, 3 и 4), например. В другом варианте осуществления вариабельные области получены или происходят из антител, способных повышать концентрацию цитокинов, таких как IL-10, в конкретной области-мишени, чтобы позволить IL-10 вызывать свой биологический эффект. Такие антитела могут включать антитела, которые нацелены на сверхэкспрессированные или активированные рецепторы или антигены в определенных пораженных областях, или те, которые специфически экспрессируются в определенных пораженных областях. Например, вариабельные области могут быть получены из антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; Ловушка TGFβ; MadCam, субъединица β7 интегрина; интегрин α4β7; интегрин α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; и SR-J1 и многие другие. Мономер IL-10 (например, человеческий, CMV или EBV) или вариантная молекула IL-10 (описываемая в настоящем документе) конъюгированы либо с амино-концом, либо с карбокси-концом вариабельной области (VH или VL), так что IL-10 или вариантная молекула IL-10 способны димеризоваться друг с другом.

Слитый белок или комплекс слитых белков также может иметь антиген-нацеливающую функцию. Слитый белок или комплекс слитых белков будет включать области VH и VL, которые способны связываться вместе, образуя антигенсвязывающий участок или ABS. В некоторых конфигурациях IL-10 или вариантная молекула IL-10 или его мономеры будут ковалентно связаны с концом, содержащим антигенсвязывающий участок. Эти нацеленные слитые белки могут включать, по меньшей мере, одну функционирующую вариабельную область или парные VH и VL на одном конце слитого белка, так что слитый белок сохраняет способность нацеливаться на антиген, а также имеет функционирующий гомодимер IL-10 или вариантной молекулы IL-10 (см., Фиг.9 (а)-(е) и 10 (а)-(е)). Вариабельные области могут быть дополнительно изменены (например, путем вставки, делеции или замены) путем изменения одной или нескольких аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума. Пара VH и VL образует каркас, на который можно прививать участки CDR, полученные из множества антител. Такие CDR-области антитела включают те антитела, которые известны и описаны выше. Например, участки CDR от любого антитела могут быть привиты к паре VH и VL, такой как те, что описаны в SEQ ID NO: 37, 44 или 45 или те слитые белки, которые способны к формированию комплекса слитых белков, такие как те, что описаны в SEQ ID NO: 46 и 47; 48 и 49; или 50 и 51. Области CDR в описанных выше каркасах VH и VL будут включать следующее количество аминокислотных положений, доступных для пересадки/вставки CDR:

Тяжелая цепь CDR1 3-7 аминокислот Тяжелая цепь CDR2 7-11 аминокислот Тяжелая цепь CDR3 7-11 аминокислот Легкая цепь CDR1 9-14 аминокислот Легкая цепь CDR2 5-9 аминокислот Легкая цепь CDR3 7-11 аминокислот

В другом аспекте вышеописанный слитый белок может быть представлен одной из следующих общих формул:

1) IL10-L¹-X¹-L¹-X²-L¹-IL10 (Формула I);

2) (Z)_n-X¹-L²-Y²-L¹-IL10 (Формула II);

3) IL10-L¹-Y¹-L²-X²-(Z)_n (Формула III);

4) X¹-L²-X²-L¹-IL10 (Формула IV);

5) IL10-L¹-X¹-L²-X² (Формула V);

6) X¹-L¹-IL10 (Формула VI); и

7) IL10-L¹-X² (Формула VII)

где

«IL-10» представляет собой человеческий IL-10 (SEQ ID NO: 1); EBV IL-10 (SEQ ID NO: 3), DV05 (SEQ ID NO:14, 18 или 55), DV06 (SEQ ID NO: 15, 19 или 57), или DV07 (SEQ ID NO:16, 20 или 59), в предпочтительном варианте осуществления «IL-10» состоит из DV05, DV06, или DV07, более предпочтительно «IL-10» состоит из SEQ ID NO: 55, 57, или 59;

«L¹» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 31 или 54;

«L²» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 30;

«X¹» представляет собой область VH, полученную из первого антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; Ловушка TGFβ; MadCam, субъединица β7 интегрина; интегрин α4β7; интегрин α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; и SR-J1; ВИЧ, или Эбола;

«X2» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и X1;

«Y1» представляет собой область VH, полученную из второго антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; Ловушка TGFβ; MadCam, субъединица β7 интегрина; интегрин α4β7; интегрин α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; и SR-J1; ВИЧ, или Эбола;

«Y2» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и Y1;

где X и Y получены из одного или разных антител;

«Z» представляет собой цитокин, выбранный из IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL_15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерферонов -α, -β, -γ, TGF- β, или фактора некроза опухоли -α, -β, основного FGF, EGF, PDGF, ИЛ-4, ИЛ-11 или ИЛ-13;

«n» представляет собой целое число, выбранное из 0-2.

В варианте осуществления заместители вышеупомянутой Формулы I-VII предпочтительно выбраны из следующих: IL-10 является предпочтительно DV05, DV06 или DV07, более предпочтительно IL-10 включает DV05, DV06 или DV07 или наиболее предпочтительно IL-10 состоит из SEQ ID №: 55, 57 или 59; X1 и X2 представляют собой предпочтительно анти-EGFR, анти-PDGFR, анти-FGFR, анти-VEGF, анти-Her2Neu, анти-GPC3, анти-MAdCAM, анти-ICAM-1, -2, -3, -4, анти-VCAM, анти-ВИЧ или анти-Эбола; Y1 и Y2 представляют собой предпочтительно анти-EGFR, анти-MAdCAM, анти-ICAM-1, -2, -3, -4, анти-VCAM, анти-ВИЧ или анти-Эбола; Z выбран из IL-2, IL-7 или IL-15; и n равно 1. В наиболее предпочтительном варианте осуществления слитые белки представляют собой любой из SEQ ID NO: 33-53, 61, 63, 65 или 67. Специалисты в данной области поймут, что гистидиновую метку используют в процессе очистки слитого белка, и она может остаться интактной или быть удалена из конечного продукта. Специалисты в данной области также поймут, что каркасные области VH и VL любого из описанных выше антител могут быть заменены другими областями, определяющими комплементарность (CDR). Например, если области VH и VL происходят из антитела к вирусу Эбола, шесть участков CDR (т.е. CDR 1-3 как VH, так и VL) могут быть заменены шестью участками CDR антитела к EGFR (например, цетуксимаб). Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 33-34, 52 или 53. В другом предпочтительном варианте осуществления слитый белок представляет собой белок, имеющий каркас, представленный SEQ ID NO: 37; 44; 45; 46-47; 48-49; или 50-51, где могут быть привиты любые шесть участков CDR от любого антитела. В других предпочтительных вариантах осуществления области CDR из областей VH и VL антитела к вирусу Эбола могут быть привиты с областями CDR из анти-MAdCAM, анти-VCAM или анти-ICAM-1, -2, -3, -4 антител, где в предпочтительном варианте осуществления области CDR могут быть привиты в слитый белок из SEQ ID №: 37. Слитые белки, как описано в вышеуказанных формулах II и III, формулах IV и V, и формулах VI и VII предназначены для связывания вместе с образованием биологически активного гомодимера IL-10 (или его варианта). Вышеописанные слитые белки предназначены либо для не-нацеливания, либо для нацеливания в зависимости от пары выбранных областей VH и VL и/или областей CDR, внедренных в VH и VL. Термин «ненацеленный» предназначен для описания области VH и VL, которая не способна нацеливаться на конкретный антиген, расположенный in vivo, потому что антиген отсутствует или антигенсвязывающий участок (ABS) был отключен или изменен для устранения функциональности ABS.

Вышеописанныее слитые белки могут быть дополнительно конъюгированы с дополнительными белками/молекулами. Дополнительный белок, применяемый в настоящем документе, описывает белок, который конъюгирован со слитым белком или комплексом слитых белков, таким образом, что он связан со стороной, противоположной стороне мономера IL-10 или мономера вариантной молекулы IL-10. Добавление вспомогательного белка эффективно создает многофункциональную молекулу, которая включает как функциональность IL-10 или вариантной молекулы IL-10, так и функциональность вспомогательного белка. Присоединение дополнительных белков (например, цитокинов IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 и т.д.) может происходить, например, к слитому белку, содержащему каркас VH и VL, к N-концу области VH. Например, по отношению к комплексам слитых белков или слитому белку для лечения онкологии, вспомогательный белок в качестве неограничивающих примеров включает IL-10, вариантную молекулу IL-10, IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерфероны α, β, γ, TGF-β, или фактор некроза опухоли α, β, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13 или любое их сочетание. По отношению к комплексам слитых белков или слитым белкам для лечения воспалительных заболеваний, дополнительный белок в качестве неограничивающих примеров включает TGF-β. По отношению к комплексам слитых белков или слитым белкам для лечения аутоиммунных заболеваний (таких как, но не ограничиваясь ими, жировое заболевание печени), дополнительная молекула в качестве неограничивающих примеров включает обтихолевую кислоту, арамхол, элафибранор, лираглутид, селонсертиб или симтузумаб. Дополнительные белки, определенные выше, при описании с использованием формул I-V выше, могут быть присоединены к заместителю X1 или Y1 на стороне N-конца VH-части каркаса.

Слитые белки, описанные выше, также могут включать дополнительные аминокислотные последовательности, которые помогают в восстановлении или очистке слитых белков в процессе производства. Эти последовательности могут включать различные модификации последовательностей или аффинные метки, такие как, но не ограничиваясь ими, белок A, альбумин-связывающий белок, щелочная фосфатаза, FLAG-эпитоп, галактоза-связывающий белок, гистидиновые метки и любые другие метки, которые хорошо известны в данной области. См., например, Kimple et al. (Curr. Protoc. Protein Sci., 2013, 73: Unit 9.9, Table 9.91, в полном объеме включенную в качестве ссылки). В одном из аспектов аффинная метка представляет собой гистидиновую метку, имеющую аминокислотную последовательность HHHHHH (SEQ ID NO:: 32). Гистидиновая метка может быть удалена из конечного продукта или оставлена интактной. В другом варианте осуществления аффинная метка представляет собой модификацию белка A, которая включена в слитый белок (например, в область VH слитых белков, описываемых в настоящем документе), как это описано в SEQ ID NO: 34 или 44-53. Специалист в данной области поймет, что любая последовательность слитого белка, описываемая в настоящем документе, может быть изменена, чтобы включить модификацию белка A путем вставки точечных замен аминокислот в каркасные области антитела, как описано в данной области.

В еще одном варианте осуществления различные слитые белки, описанные выше, можно использовать в способе лечения злокачественной опухоли, лечения или предотвращения ВЗК или болезни Крона, аутоиммунного заболевания, НАЖБП или НАСГ.

Вариантные полинуклеотиды IL-10

Также в объем настоящей заявки включены полинуклеотидные оследовательности, которые кодируют вариантные молекулы IL-10 и различные слитые белки и/или иммуноцитокины, описанные выше. После локализации ключевых рецептор-связывающих областей IL-10 и/или областей для междоменного угла в вариантных молекулах IL-10 по настоящему изобретению, модификации ДНК, необходимые для осуществления желаемых модификаций в аминокислотных последовательностях, входят в набор навыков квалифицированного специалиста в данной области. В таких модификациях будут использоваться общепринятые способы и способы рекомбинантной ДНК. Например, добавление или замена специфических аминокислотных последовательностей может быть введена в последовательность IL-10 на уровне нуклеиновой кислоты (ДНК) при помощи способов сайт-специфического мутагенеза с использованием синтетических олигонуклеотидов, которые также хорошо известны в данной области.

В другом варианте осуществления полинуклеотиды, кодирующие последовательность вариантного IL-10, можно получить с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Например, полинуклеотидные последовательности, кодирующие вышеописанный вариантные молекулы, можно получать с помощью рекомбинантных способов, таких как скрининг кДНК и геномных библиотек из клеток, экспрессирующих ген, или путем получения гена из вектора, который, как известно, включает этот ген. Интересующий ген также можно получать синтетически, а не клонировать, основываясь на известных последовательностях. Молекулы могут быть сконструированы с соответствующими кодонами для конкретной последовательности. Полную последовательность затем собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами, и собирают в полную кодирующую последовательность. См., например, Edge, Nature (1981) 292: 756; Nambair et al., Science (1984) 223: 1299; и Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 6311.

В одном из вариантов осуществления вариантная молекула IL-10 или его белки представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из SEQ ID №: 9-29, 33-53, 55, 57 или 59. В другом варианте осуществления вариантная молекула IL- 10 представляет собой DV05, DV06 или DV07 из SEQ ID NO: 56, 58 или 60, соответственно. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая DV05, DV06 или DV07, может включать вставки, делеции или замены (например, вырожденный код), которые не изменяют функциональность вариантной молекулы IL-10. Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариантный IL-10 и слитые белки, описываемые в настоящем документе, могут отличаться от последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9-29, 33-53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, или 67 из-за вырожденности генетического кода и могут быть гомологичными на 70-99%, предпочтительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% вышеуказанным последовательностям. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариантный IL-10, и слитые белки из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9-29, 33-53, 55, 57, 59, 61, 63, 65 или 67 также может быть на 70%-99%, предпочтительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, гомологична из-за вставок, делеций или замен, по меньшей мере, одного нуклеотида. Также в настоящей заявке описаны нуклеотидные последовательности, которые имеют 70-99%, предпочтительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологии последовательности с SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 56, 58, 60, 62, 64, 66 и 68 из-за вставки, добавления, делеции или замены, по меньшей мере, одного нуклеотида. Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариант IL-10 и слитые белки, описываемые в настоящем документе, могут дополнительно содержать хорошо известные последовательности, которые помогают, например, экспрессии, продукции или секреции белков. Такие последовательности может включать, например, лидерную последовательность, сигнальный пептид, и/или сайты/последовательность инициации трансляции (например, консенсусную последовательность Козака). Нуклеотидные последовательности, описываемые в настоящем документе также могут включать один из нескольких участков распознавания рестрикционных ферментов, которые позволяют производить вставку в различные экспрессирующие системы/векторы.

В другом варианте осуществления полинуклеотиды содержатся в векторах, содержащих желаемые последовательности требуемый IL-10, или искусственно синтезированы с использованием способов синтеза олигонуклеотидов, известных в данной области, таких как сайт-специфический мутагенез и полимеразная цепная реакция (ПЦР). См., например, Sambrook, выше. В другом варианте осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие вариантные молекулы IL-10, получают посредством процесса отжига комплементарных перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, продуцируемых в автоматическом синтезаторе полинуклеотидов, с последующим лигированием и амплификацией лигированных нуклеотидных последовательностей посредством ПЦР. См., например, Jayaraman et al., Proc. Natl. Акад. Sci. США (1991) 88: 4084-4088. Кроме того, можно использовать олигонуклеотид-направленный синтез (Jones et al., Nature (1986) 54: 75-82), олигонуклеотид-направленный мутагенез предсуществующих нуклеотидных областей (Riechmann et al., Nature (1988) 332: 323-327 и Verhoeyen et al. , Science (1988) 239: 1534-1536), и ферментативное заполнение пропущенных олигонуклеотидов с использованием ДНК-полимеразы T4 (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 10029-10033) для получения молекул для применения в указанных способах.

Специалисту в данной области хорошо известен ряд подходящих экспрессирующих векторов, которые можно использовать для экспрессии и введения вариантных молекул IL-10 и слитых белков. Эти векторы включают, например, векторы типа pUC, векторы типа pBR, векторы типа pBI, векторы типа pGA, pBinl9, pBI121, серии pGreen, серии pCAMBRIA, серии pPZP, pPCV001, pGA482, pCLD04541, серии pBIBAC, серии pYLTAC, pSB11, pSB1, серии pGPTV, и вирусные векторы и т.п.

Векторы, несущие вариантные молекулы IL-10, также могут включать другие компоненты вектора, необходимые для работы векторов. Например, вектор может включать сигнальные последовательности, последовательности метки, последовательности для распознавания протеазой, селективные маркеры и другие регуляторные последовательности, такие как промоторы, необходимые для правильной репликации и экспрессии вариантных молекул IL-10. Конкретные промоторы, используемые в векторе, конкретно не ограничены при условии, что они могут управлять экспрессией вариантной молекулы IL-10 в ряде типов клеток-хозяев. Аналогично, тип последовательности метки не ограничен при условии, что последовательность метки упрощает или облегчает очистку экспрессированной вариантной молекулы IL-10. Они могут включать, например, 6-гистидин, GST, MBP, HAT, HN, S, TF, Trx, Nus, биотин, FLAG, myc, RCFP, GFP и т.п. Последовательности для расопзнавания протеазой конкретно не ограничены, например, можно использовать последовательности для распознавания, такие как Фактор Xa, тромбин, HRV, протеаза 3C. Выбранные маркеры конкретно не ограничены при условии, что они могут обнаруживать трансформированные растительные клетки риса, например, можно использовать гены устойчивости к неомицину, гены устойчивости к канамицину, гены устойчивости к гигромицину и т.п.

Полученные конструкции ДНК, несущие желаемые варианты IL-10 или слитый белок, затем могут быть использованы непосредственно в генотерапии или могут быть использованы для получения рекомбинантного варианта IL-10 или слитых белков. В одном из вариантов осуществления вариантные молекулы IL-10 или слитый белок по настоящему изобретению могут быть доставлены любым известным в данной области способом, включая прямое введение мутантного белка IL-10 и генотерапию с вектором, кодирующим мутантный белок IL-10. Генотерапия может быть выполнена с использованием плазмидной ДНК или вирусного вектора, такого как аденоассоциированный вирусный вектор, аденовирусный вектор, ретровирусный вектор и т.д. В некоторых вариантах осуществления вирусные векторы по изобретению вводят в виде вирусных частиц, а в других их вводят в виде плазмид (например, как «голую» ДНК).

Другие способы доставки нуклеотидных последовательностей включают способы, которые уже известны в данной области. Эти способы могут включать доставку нуклеотидных последовательностей, таких как, но не ограничиваясь ими, ДНК, РНК, миРНК, мРНК, олигонуклеотиды или их варианты, кодирующие IL-10 или вариантные молекулы IL-10, с помощью пептида, проникающего в клетку, гидрофобной группы, электростатического комплекса, липосомы, лиганда, липосомальных наночастиц, липопротеина (предпочтительно ЛПВП или ЛПНП), фолат-нацеленной липосомы, антитела (например, к рецептору фолатов, рецептору трансферрина), нацеленного пептида или аптамера. Нуклеотидные последовательности, кодирующие вариантные молекулы IL-10 можно доставлять индивидууму путем прямой инъекции, инфузии, пластырей, повязок, аэрозоля или дымки или путем доставки при помощи тонкой пленки. Нуклеотид (или белок) может быть направлен в любую область, которой необходима направленная доставка цитокинового стимула. Области могут включать, например, легкое, желудочно-кишечный тракт, кожу, печень, головной мозг посредством внутричерепной инъекции, глубоко расположенные метастатические опухолевые поражения с помощью инъекций под ультразвуковым контролем.

Тестирование вариантов IL-10

В одном из вариантов осуществления вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки будут подвергаться скринингу на предмет новых функций, которые ранее не генерировались, с использованием последовательностей гомодимера IL-10, который подавляет секрецию воспалительных цитокинов макрофагами, но не активирует Т-клетки. В одном из предпочтительных вариантов осуществления вариантная молекула IL-10 или его слитые белки будут основаны на остове EBV-IL10, который обладает противовоспалительным ответом, но не обладает способностью стимулировать Т-клетки. Эти вариантные молекулы или слитые белки EBV-IL10 будут включать модификации рецептора-связывающих доменов и ранее не исследованных областях связывания, которые изменяют первичную, вторичную и третичную структуру для ограничения или расширения угла между гомодимерами IL-10. В другом варианте осуществления вариантные молекулы IL-10, содержащие модификации в областях связывания или в областях, ответственных за образование междоменного угла, будут обладать функцией усиления CD8⁺ Т-клеток. В другом варианте осуществления вариантные молекулы IL-10 или их белки, содержащие модификации в области связывания или в областях, ответственных за образование междоменного угла, будут обладать функцией подавления миелоидных клеток, но но функцией усиления клеток Купфера.

После того, как вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки конструируют и экспрессируют, специалист в данной области может провести анализы вариантных молекул IL-10 или их слитых белков, чтобы определить, обладают ли молекулы желаемыми биологическими функциями, передаваемыми путем модификаций рецептор-связывающих областей ИЛ-10 и/или междоменного угла. Известно и доступно множество скрининговых анализов для проверки желаемой биологической функции. В одном из вариантов осуществления желаемая биологическая функция включает, но не ограничивается ими, снижение противовоспалительного ответа, снижение стимуляции Т-клеток, усиление функции Т-клеток, усиление функциональности клеток Купфера и снижение дегрануляции тучных клеток.

Например, известно, что воздействие IL-10 заставляет Т-клетки генерировать и секретировать больше IFNγ при стимуляции Т-клеточного рецептора. Одновременно воздействие IL-10 предотвращает секрецию TNFα, IL-6 и других провоспалительных цитокинов, секретируемых моноцитами/макрофагами в ответ на ЛПС. IL-10 также подавляет пролиферацию FoxP3⁺CD4⁺ Treg. В одном из вариантов осуществления те вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки, которые максимизируют подавление моноцитов/макрофагов, но не воздействуют на T-клетки, включая как стимулирующие, так и подавляющие ответы, пройдут положительный отбор. В одном из вариантов осуществления скрининг вариантных молекул IL-10 или их слитых белков, которые обладают повышенными противовоспалительными эффектами, будет оценен положительно для лечения аутоиммунного, противовоспалительного заболевания или их обоих. В других вариантах осуществления вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки, которые усиливают утилизирующие функции клеток Купфера и не подавляющие Treg, также будут выбраны для разработки для лечения неалкогольного стеатотического гепатита (НАСГ) и/или неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП). В еще одном варианте осуществления варианты IL-10, которые максимизируют биологию Т-клеток, включая как стимулирующие, так и подавляющие ответы, а также обладают усилением утилизации у клеток Купфера, будут выбраны для разработки для лечения злокачественной опухоли.

Литература изобилует описаниями анализа влияния цитокинов на клетки иммунной системы, такие как Т-клетки, моноциты/макрофаги, клетки Купфера, клетки Treg и тучные клетки, например. В настоящем изобретении будут применяться эти системы анализа для тестирования биологического ответа с использованием аналогичных анализов путем контактирования с вариантными молекулами IL-10 или слитыми белками по настоящему изобретению.

Различные способы способы описаны на известном уровне техники для анализа эффективности индукции Т-клеточного ответа. Любой из этих способов применим для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Chan et al. (2015) описывают один из таких способов, применимый к вариантным молекулам IL-10. CD8⁺ Т-клетки выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) с использованием микрогранул против CD8. Выделенные CD8⁺ Т-клетки активируют с помощью анти-CD3 и антитела к CD28. Например, активация может происходить с использованием планшетов, покрытых, по меньшей мере, приблизительно от 5 до 20 мкг/мл антитела к CD3 и, по меньшей мере, приблизительно от 1 до 5 мкг/мл антитела к CD28 в течение периода примерно 3 суток. После активации Т-клетки собирают, высевают и обрабатывают вариантами EBV-IL10 или их слитыми белками в течение периода приблизительно 3-5 суток. Коммерчески доступный рекомбинантный пегилированный человеческий IL-10 или EBV-IL10 можно использовать в качестве контроля. После обработки вариантами EBV-IL10 T-клетки обрабатывали растворимым анти-CD3. После обработки анти-CD3 собирают среду для культивирования клеток и анализируют с помощью ELISA на секрецию интерферона гамма (IFNγ).

Различные способы описаны на известном уровне техники для анализа стимуляции моноцитов/макрофагов цитокинами. Любой из этих способов применим для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Conway et al (2017) описывают один такой способ, который применим к вариантным молекулам IL-10. Человеческие моноциты выделяют из лейкоцитарного слоя свежей донорской крови с использованием градиента Фиколл с последующим центрифугированием с гипертонической плотностью в перколле. После 30-минутного культивирования в RPMI с добавлением 5% человеческой сыворотки и 1% L-глутамина моноциты стали прикрепляться к субстрату, и их отмывают средой SMEM Spinner для удаления контаминирующих лимфоцитов. Растворы и материалы тестировали на отсутствие ЛПС. Через четверо суток культивирования моноциты/макрофаги приводят в контакт или инкубируют с 10 нг/мл ЛПС и различными концентрациями вариантных молекул IL-10 в течение периода, по меньшей мере, в 24 часа. Собирают культуральные супернатанты и определяют концентрации TNF-α и IL-1β способом ELISA.

Различные способы описаны на известном уровне техники для анализа ответа клеток Купфера на цитокины. Любой из этих способов применим для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Chan et al (2016) описывают один такой способ, который применим к вариантным молекулам IL-10. Клетки Купфера высевают в 24-луночные или 96-луночные планшеты и инкубируют в течение ночи в среде для инкубации гепатоцитов (RPMI без фенола красного, пенициллин/стрептавидин, добавка B для поддержания клеток (Invitrogen)). Клетки отмывали и подвергали воздействию вариантных молекул IL-10 в течение 24 часов. Клетки отмывали один раз и подвергали воздействию 15-20 мкл DiI-LDL, DiI-VLDL, DiI-OxLDL или DiI-AcLDL, 2 мкл DMSO, 15 мкл Цитохалазина D, и измеряли захват через 4 часа. Все клетки отмывали один раз в 1× PBS и лизировали в 110 мкл буфера для лизиса клеток. Переносили 45 мкл клеточного лизата переносятся на прозрачное дно планшетов с черными стенками, где считывали флуоресценцию при 575 нм.

Различные способы описаны на известном уровне техники для анализа эффективности стимулирования ответа Т-регуляторных клеток с помощью цитокинов. Любой из этих способов применим для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Chan et al (2016) описывают один такой способ, применимый к вариантным молекулам IL-10. CD4⁺ Т-клетки выделяют с помощью микрогранул CD4⁺ и культивируют в течение 5-6 суток в средах AIMV, содержащих различные концентрации вариантной молекулы IL-10 и 2 мкг/мл иммобилизованного анти-CD3 и 1 мг/мл анти-CD28. Клетки анализируют на экспрессию FoxP3 с помощью проточного цитометрического анализа, чтобы определить, индуцируется ли TGF-β или IL-2 в FOXP3⁺CD4⁺ регуляторных T-клетках.

Различные способы описаны на известном уровне техники для анализа эффективности пролиферации тучных клеток в ответ на стимуляцию цитокинами. Мышиная линия тучных клеток MC/9 представляет собой обычную клеточную линию, которую используют для производственных испытаний молекул IL-10. В частности, IL-10 и вариантные молекулы IL-10 индуцируют дозозависимую пролиферацию тучных клеток. И наоборот, IL-10 подавляет экспрессию Fc тучными клетками, что позволяет предположить, что IL-10 оказывает как стимулирующее, так и подавляющее действие на эти клетки. Любой из этих способов применим для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Thompson-Snipes и др. (1991) описывают один такой способ, который применим к вариантным молекулам IL-10. Тучные клетки MC/9 высевают на плоскодоннных 24-луночных планшетах, содержащих 1 мл RPMI 1640, 10% ЭТС, 50 мМ 2-ME и различные концентрации вариантных цитокинов. После культивирования в течение 3 суток, клетки подсчитывают с помощью счетчика клеток для определения воздействия вариантных молекул IL-10 на пролиферацию тучных клеток.

Известно, что IL-10 играет роль в ингибировании экспрессии тучной клеткой рецептора IgE, FcεRI, и продукции цитокинов, опосредованной IgE. Таким образом, на известном уровне техники были описаны способы тестирования воздействия IL-10 на тучные клетки. Эти способы применимы для тестирования вариантных молекул IL-10, описываемых в настоящем документе. Например, Kennedy Norton et al (2008) описывают один такой способ. Человеческие тучные клетки выделяют из образцов кожи донора и культивируют в среде, содержащей фактор стволовых клеток (SCF), в присутствии или отсутствии IL-10. Экспрессию FcεRI определяли проточной цитометрией с использованием анти-FcεRI специфических антител, за которыми следовали меченные FITC антитела против мышиного F(ab')₂.

Композиции и составы, содержащие вариантные молекулы IL-10

Вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки по настоящему изобретению также можно формулировать в виде фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество вариантной молекулы IL-10 и фармацевтические носители и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты. Фармацевтическая композиция может быть сформулирована с широко используемыми буферами, эксципиентами, консервантами, стабилизаторами. Фармацевтическую композицию формулируют для введения пациенту в терапевтически эффективном количестве, достаточном для обеспечения желаемого терапевтического результата. Предпочтительно, такое количество имеет минимальные отрицательные побочные эффекты. В одном из вариантов осуществления количество вводимой вариантной молекулы IL-10 или ее слитого белка будет достаточным для лечения воспалительных заболеваний или состояний. В другом варианте осуществления вводимое количество вариантной молекулы IL-10 или его слитых белков будет достаточным для лечения злокачественной опухоли. Вводимое количество может варьироваться от пациента к пациенту, и его необходимо будет определять с учетом заболевания или состояния индивидуума или пациента, общего состояния здоровья пациента, способа введения, тяжести побочных эффектов и т.п. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция будет содержать вариантную молекулу IL-10 или ее слитый белок, которые включают одну или обе из модификаций рецептор-связывающего домена и/или междоменного угла IL-10. В другом варианте осуществления вариантная молекула IL-10 представляет собой пегилированную форму вариантной молекулы IL-10. В еще более предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит вариантную молекулу IL-10, включенную в виде слитого белка или иммуноцитокина, и фармацевтические эксципиенты.

Эффективное количество для конкретного пациента может варьироваться в зависимости от факторов, таких как состояние, которое лечат, общее состояние здоровья пациента, способ и доза введения и тяжесть побочных эффектов. Подходящая доза, вводимая пациенту, как правило, определяется врачом с использованием параметров или факторов, которые в данной области определенно или предположительно влияют на лечение, или по расчетам влияют на лечение. В основном, доза начинается с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и затем ее увеличивают небольшими приращениями до тех пор, пока не будет достигнут желаемый или оптимальный эффект относительно любых отрицательных побочных эффектов. Важные диагностические измерения включают измерения симптомов, например воспаления или уровня вырабатываемых воспалительных цитокинов.

Доза, вводимая пациенту, также может быть оптимизирована на основе добавления модификаций в IL-10 или вариантную молекулу IL-10 для увеличения конкретного времени полувыведения из сыворотки (см., например, известно, что пегилированный IL-10, подробно описанный, например, в патентах США 9943568, 10010588, и 10143726, улучшает время полувыведения IL-10 из циркуляции). Слитый белок, иммуноконъюгаты, минитела и диатела, содержащие IL-10 или вариантный IL-10, описываемый в настоящем документе, также способны удлинять полувыведение из кровообращения, одновременно сохраняя высокую аффинность связывания с рецептором IL-10. Таким образом, в одном из вариантов осуществления различные заболевания, нарушения или состояния, связанные с IL-10, или которые могут быть улучшены путем введения слитого белка, комплекса слитых белков, иммуноконъюгата или диатела, содержащего IL-10 или вариантный IL-10, можно вводить нуждающемуся в этом пациенту. В одном предпочтительном варианте осуществления заболевания, нарушения или состояния, связанные с IL-10, можно лечить или предотвращать путем введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества иммуноконъюгатного комплекса, слитого белка или диатела с EBV IL-10 или его вариантом (включая вариант, влияющий на аффинность к рецептору IL-10), где иммуноконъюгатный комплекс, слитый белок или диатело имеет молекулярную массу приблизительно от 60 до 155 кДа, где терапевтически эффективное количество находится в диапазоне приблизительно от 0,5 мкг/кг до 100 микрограмм/килограмм. Иммуноконъюгат, слитый белок, диатело описываемые в настоящем документе, можно вводить ежедневно, три раза в неделю, дважды в неделю, раз в неделю, раз в два месяца или раз в месяц. Часть EBV IL-10 и вариабельные области иммуноконъюгата, слитый белок или диатело могут иметь любую конфигурацию или комбинацию этих структур, обсуждаемых в настоящем документе. Молекулы с увеличенным полувыведением, описываемые в настоящем документе, будут эффективны при лечении ряда заболеваний, включая в качестве неограничивающих примеров, злокачественную опухоль, воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания (например, неалкогольный стеатотический гепатит (НАСГ) или неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП)) и повышенный холестерин.

Способы совместного введения или лечения вторым терапевтическим средством, например цитокином, стероидом, химиотерапевтическим средством, антибиотиком, противовоспалительными средствами или радиацией, хорошо известны в данной области. Они могут включать комбинированное лечение с другими терапевтическими средствами, такими как одно или несколько из следующих, но не ограничиваясь ими: интерферон-β, например, IFNβ-1α и IFN-β-1β; белок, имитирующий основной белок миелина; кортикостероиды; ингибиторы IL -1; ингибиторы TNF; антитела к TNFα, антитела к IL-6, слияние IL-1br-Ig, антитела к IL-23, антитела к CD40, лиганд и CD80; антагонисты IL-12 и IL-23, например, антагонисты субъединицы p40 IL-12 и IL-23 (например, ингибиторные антитела против субъединицы p40); антагонисты IL-22; низкомолекулярные ингибиторы, например, метотрексат, лефлуномид, сиролимус (рапамицин) и его аналоги, например, CCI-779; ингибиторы Cox-2 и cPLA2; НПВП; ингибиторы p38; TPL-2; Mk-2; ингибиторы NFkβ; RAGE или растворимый RAGE; ингибиторы P-селектина или PSGL-1 (например, низкомолекулярные ингибиторы, антитела к ним, например, антитела к P-селектину); агонисты эстрогенового рецептора бета (ERB) или антагонисты ERB-NFkβ.

Дополнительно, комбинированное лечение, полезное для введения с вариантными молекулами IL-10 или их слитыми белками, может включать ингибиторы TNF, включая, например, химерные, гуманизированные, эффективно человеческие, человеческие или созданные in vitro антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с TNF; растворимые фрагменты рецептора TNF, например, p55 или p75 человеческого TNF или его производные, например, рецептор 75 кДа TNFR-IgG (слитый белок рецептор TNF-IgG массой 75 кДа, ЭНБРЕЛ™), p55 кДа слитый белок рецептор TNF-IgG; и антагонисты ферментов TNF, например, ингибиторы TNFα-превращающего фермента (TACE). Другое комбинированное лечение с противовоспалительными средствами/лекарственными средствами, включает, но не ограничивается ими, стандартные нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НПВП) и ингибиторы циклооксигеназы-2. НПВП могут включать аспирин, целекоксиб, диклофенак, дифлунизал, этодолак, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, набуметон, напроксен, оксапрозин, пироксикам, салсалат, сулиндак и/или толметин. Ингибитор циклооксигеназы-2, используемый в композиции в соответствии с заявкой, может, например, быть целекоксибом или рофекоксибом.

Дополнительные терапевтические средства, которые можно вводить совместно и/или совместно формулировать с вариантными молекулами IL-10 или их белками, включают один или несколько из: интерферона-β, например, IFN β-1α и IFN β-1β; COPAXONE®; кортикостероидов; ингибиторов IL-1; антагонистов TNF (например, растворимый фрагмент рецептора TNF, например, p55 или p75 человеческого рецептора TNF или его производные, например, 75 kdTNFR-IgG; антител к лиганду CD40 и CD80; антагонистов IL-12 и/или IL-23, например, антагонистов субъединицы p40 IL-12 и IL-23 (например, ингибиторные антитела, которые связываются с субъединицей p40 IL-12 и IL-23); метотрексата, лефлуномида, и сиролимуса (рапамицина) или их аналога, например, CCI-779. Другие терапевтические средства могут включать Имфимзи или Атезолизумаб.

Для лечения НАСГ, например, вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки можно комбинировать с агентами, снижающими уровень холестерина, такими как статины и нестатиновые лекарственные средства. Эти агенты в качестве неограничивающих примеров включают симвастатин, аторвастатин, розувастатин, ловастатин, правастатин, гемфиброзил, флувастатин, холестирамин, фенофибрат, ингибиторы абсорбции холестерина, смолы, связывающие желчные кислоты или секвестранты, и/или ингибиторы микросомального белка-переносчика (MTP) триглицеридов.

Эффективное количество терапевтических средств повлияет на уровень воспаления или заболевания или состояния путем облегчения симптомов. Например, воздействие может включать уровень воздействия, который составляет, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%; или более того, таким образом, что заболевание или состояние облегчается или полностью излечивается.

Фармацевтические композиции, содержащие вариантную молекулу IL-10 или ее слитые белки, смешивают с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Различные фармацевтические носители известны в данной области и их можно использовать в фармацевтической композиции. Например, носитель может быть любым совместимым, нетоксическим веществом, подходящим для доставки пациенту композиций вариантной молекулы IL-10 по изобретению. Примеры подходящих носителей включают нормальный физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка. Носители также могут включать любые полоксамеры, в основном известные специалистам в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров, те, которые имеют молекулярные массы 2900 (L64), 3400 (P65), 4200 (P84), 4600 (P85), 11400 (F88), 4950 (P103), 5900 (P104), 6500 (P105), 14600 (F108), 5750 (P123) и 12600 (F127). Носители также могут содержать эмульгаторы, включая в качестве неограничивающих примеров, полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, и полисорбат 80, и многие другие. Также можно использовать неводные носители, такие как нелетучие масла и этилолеат. Носитель также может содержать добавки, такие как вещества, повышающие изотоничность и химическую стабильность, например, буферы и консерванты, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences и U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984). Составы терапевтических и диагностических средств можно получить путем смешивания с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в форме лиофилизированных порошков, суспензий, водных растворов или суспензий, например.

Композиции по изобретению можно вводить перорально или инъецировать в организм. Составы для перорального применения также могут включать соединения для дополнительной защиты вариантных молекул IL-10 от протеазы в желудочно-кишечном тракте. Инъекции, как правило, являются внутримышечными, подкожными, интрадермальными или внутривенными. Альтернативно, внутрисуставная инъекция или другие пути могут быть использованы в соответствующих обстоятельствах. Парентерально вводимые вариантные молекулы IL-10 преимущественно сформулированы в форме единицы дозирования для инъекций (раствор, суспензия, эмульсия) в сочетании с фармацевтическими носителями и/или фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В других вариантах осуществления композиция может быть введена пациенту с помощью имплантируемой или инъекционной системы доставки лекарств.

Терапевтические применения вариантов IL-10

В одном из вариантов осуществления настоящая заявка относится к способам лечения, облегчения или уменьшения симптомов, связанных с воспалением, воспалительным заболеванием или аутоиммунным заболеванием. Настоящая заявка также относится к IL-10, вариантным молекулам IL-10, их слитым белкам или их химерным молекулам для применения в качестве лекарственного средства против воспаления, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, злокачественной опухоли или онкологии. Настоящая заявка также относится к применению IL-10, вариантных молекул IL-10, их слитых белков или химерных молекул для лечения воспаления или воспалительного заболевания, или аутоиммунного заболевания, злокачественной опухоли или онкологии. К ним относятся, например, ВЗК, болезнь Крона, язвенный колит, НАСГ, НАЖБП, гиперхолестеринемия, злокачественная опухоль и многие другие. Способ предполагает введение терапевтически эффективного количества одной или нескольких вариантных молекул IL-10 или их слитых белков, описываемых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретение включает способ лечения воспалительных заболеваний или аутоиммунных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества вариантной молекулы IL-10, содержащей одну или несколько модификаций, связанных с рецептор-связывающим доменом и/или областью, ответственной за формирование междоменного угла. В одном предпочтительном варианте осуществления способ включает введение вариантной молекулы EBV-IL10 или его слитых белков. В одном предпочтительном варианте осуществления вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки, подходящие для лечения воспалительного заболевания, включают вариантные молекулы, которые имеют ограниченные междоменные углы, по сравнению с молекулами IL-10 дикого типа и/или также демонстрируют более низкую аффинность к рецептору. В других вариантах осуществления вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки, подходящие для лечения воспалительного заболевания, включают вариантные молекулы, которые имеют ослабленные междоменные углы, по сравнению с молекулами IL-10 дикого типа и/или также демонстрируют более низкую аффинность к рецептору. Пегилированные формы вариантных молекул IL-10 также рассматриваются как часть настоящего изобретения для воспалительного заболевания или воспаления.

Воспалительные заболевания или аутоиммунные заболевания по настоящему изобертению включают любое заболевание или состояние, связанное с нежелательным или ненужным воспалением и иммунной реакцией. Эти заболевания в качестве неограничивающих примеров включают воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, ревматоидный артрит, неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП) или неалкогольный стеатогепатит (НАСГ). В других вариантах осуществления заболевания или состояния включают нейродегенеративные нарушения, такие как болезнь Паркинсона, боковой амиелотрофический склероз (БАС), фатальная семейная бессонница, энцефалит Расмуссена, синдром Дауна, болезнь Хантингтона, болезнь Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, туберозный склероз, нейрональный цероидный липофусцидоз, подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Лайма; болезнь це-це (африканская сонная болезнь), деменцию при ВИЧ, бычью губчатую энцефалопатию (болезнь «коровьего бешенства»); болезнь Кройцфельда-Якоба; энцефалит при простом герпесе, опоясывающий лишайный церебеллит, общий парез (сифилис), туберкулезный менингит, туберкулезный энцефалит, неврит зрительного нерва, гранулематозный ангиит, височный артрит, церебральный васкулит, болезнь Шпатца-Линденберга, васкулит, ассоциированный с метамфетаминами, васкулит, ассоциированный с кокаином, травматическое повреждение головного мозга, инсульт, синдром Лэнса-Адамса, постаноксическую энцефалопатию, радиационный некроз, лимбический энцефалит, болезнь Альцгеймера, прогрессирующий супрануклеарный паралич, стриатонигральную дегенерацию, кортикокобазальную ганглионарную дегенерацию, первичную прогрессирующую спинальную афазию, фронтотемпоральную деменцию, ассоциированную с хромосомой 17, спинальную мышечную атрофию, ВИЧ-ассоциированную миелопатию, HTLV-1-ассоциированную миелопатию (тропический спастический парапарез), сухотку спинного мозга (сифилис), поперечный миелит, пост-полиомиелитовый синдром, повреждение спинного мозга, радиационную миелопатию, синдром Шарко-Мари-Тута, ВИЧ-ассоциированные полиневропатии, моторные аксонопатии, ассоциированные с кампилобактериями, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, диабетическую амиотрофию, синдром фантомной конечности, комплексный региональный болевой синдром, диабетические невропатии, паранеопластические невропатии, миотоническую дистрофию, HTLV-1-ассоциированную миопатию, трихинеллез, воспалительные миопатии, деримиозные миозиты (полимиозиты, миозиты) серповидноклеточную болезнь, недостаточность альфа-1-антитрипсина, туберкулез, подострый бактериальный эндокардит, хронический вирусный гепатит, вирусную кардиомиопатию, болезнь Шагаса, малярию, инфекцию Коксаки B, дегенерацию желтого пятна, пигментный ретинит, васкулит, воспалительное заболевание кишечника, ревматоидный артрит, пузырчатку, синдром Черджа-Строса, инфаркт миокарда, токсический эпидермальный некролиз, шок (например, анафилактический шок), диабет 1 типа, аутоиммунный тиреоидит, лимфому, рак яичников, волчанку (системную красную волчанку), астму, прогерию, саркоидоз, диабет типа 2 и метаболический синдром. Другие заболевания или состояния, связанные с воспалением, которые являются вариантами осуществления по изобретению, включают воспалительные нарушения легкого, такие как бронхит, вызванное окислителем повреждение легкого и хроническое обструктивное болезнь легких; воспалительные нарушения глаз, включая дистрофию роговицы, глазную гипертензию, трахому, онхоцеркоз, ретинит, увеит, симпатический офтальмит и эндофтальмит; хронические воспалительные нарушения десен, включая периодонтит; хронические воспалительные нарушения суставов, включая артрит, септический артрит и остеоартрит, туберкулезный артрит, лепрозный артрит, саркоидозный артрит; нарушения кожи, в том числе склеродермиятит, солнечный ожог, псориаз и экзему; энцефаломиелит и вирусный или аутоиммунный энцефалит; аутоиммунные заболевания, включая болезнь иммунных комплексов, васкулит, заболевание сердца, в том числе, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность и кардиомиопатия. Другие неограничивающие примеры заболеваний, для которых могут быть полезны вариантные молекулы IL-10 или их слитые белки, включают надпочечниковую недостаточность, гиперхолестеринемию, атеросклероз, заболевание костей, связанное с повышенной резорбцией костей, например, остеопороз, преэклампсию, эклампсию, уремические осложнения, хроническую печеночную недостаточность и другие нарушения, связанные с воспалением, такие как кистозный фиброз, туберкулез, кахексия, ишемия/реперфузия, состояния, связанные с гемодиализом, гломерулонефрит, рестеноз, воспалительные последствия вирусной инфекции, гипоксия, гипербарические судороги и токсичность, деменция, болезнь Сиденхама, болезнь Хантингтона, эпилепсия, болезнь Корсакова, слабоумие, связанное с нарушением сосудов головного мозга, опосредованная оксидом азота церебральная травма и связанные с ней последствия, ишемический отек головного мозга (инсульт), мигрень, рвота, иммунное заболевание, отторжение аллотрансплантата, инфекции, вызванные инвазивными микроорганизмами; и старение.

Вариантный IL-10 или его слитый белок, наиболее эффективные для лечения противовоспалительных заболеваний или состояний, включают те, которые обладают пониженной способностью стимулировать Т-клетки. Таким образом, модификация рецептор-связывающего домена посредством замены аминокислот в положении 75, как показал автор настоящего изобретения, индуцирует наименьшее количество стимуляции Т-клеток. В частности, было показано, что EBV IL-10, несущий замену A75I в SEQ ID NO: 3 (или SEQ ID NO: 57), снижает стимуляцию T-клеток (см., например, фигура 8E, обозначено как DV06). Таким образом, один особенно предпочтительный вариант осуществления относится к использованию диатела и монотела с вариантными молекулами IL-10, несущими мутацию на основе DV06 (замена аминокислоты в положении 75 в SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 57). В более предпочтительном варианте осуществления способы для воспалительного заболевания будут использовать комплекс слитых белков или слитый белок, содержащий SEQ ID NO: 26-27; 37; 40; 41-42, 43, 48-49 или их сочетание.

В другом варианте осуществления изобретения способ лечения включает введение IL-10 или вариантной молекулы IL-10 или его слитых белков для лечения или уменьшения симптомов, связанных с злокачественной опухолью. Способ предполагает введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких из IL-10 или вариантной молекулы IL-10 или его слитых белков, описываемых в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретение включает способ лечения или уменьшения симптомов, связанных с злокачественной опухолью, включающий введение терапевтически эффективного количества вариантной молекулы IL-10, содержащей одну или несколько модификаций, связанных с рецептор-связывающим доменом и/или областью, ответственной за образование междоменного угла. В одном предпочтительном варианте осуществления способ включает введение вариантной молекулы EBV-IL10 или его слитых белкови. Вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки, подходящие для лечения злокачественной опухоли, включают вариантные молекулы, который имеют ограниченный междоменный угол по сравнению с молекулами IL-10 дикого типа и/или также демонстрируют более высокую аффинность к рецептору. Вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки, полезные для лечения или уменьшения симптомов, связанных с злокачественной опухолью, включают вариантные молекулы, которые имеют ослабленные междоменные углы по сравнению с молекулами IL-10 дикого типа и/или также демонстрируют более высокую аффинность к рецептору. Пегилированные формы вариантных молекул IL-10 также рассматриваются как часть настоящего изобретения для лечения злокачественной опухоли. Один конкретный пример слитого белка, способного снижать объем опухоли in vivo, включает вариантный IL-10, несущий две замены в аминокислотных положениях 31 и 75 SEQ ID NO: 3, которые включают специфические замены V31 и A75I, обозначенные как DV07 (например, SEQ ID NO::59). Фигуры 16A-C демонстрирует, что при различных дозах слитый белок, содержащий молекулу DV07 EBV IL-10, конъюгированную со структурным диателом, обозначенным D:DV07, уменьшал объем опухоли в течение периода времени семь и десять суток. Таким образом, один особенно предпочтительный вариант осуществления предполагает использование диатела и монотела с вариантными молекулами IL-10, несущими мутацию на основе DV07 (замены в положениях аминокислот 31 и 75 SEQ ID NO: 3; или SEQ ID NO: 59). В более предпочтительном варианте осуществления способы лечения злокачественной опухоли или онкологии или опухолей будут использовать комплекс слитых белков или слитый белок, содержащий SEQ ID NO: 28-29; 33; 34; 35-36; 38-39; 46-47, 61, 63, 65 или 67, или их сочетание.

Злокачественная опухоль или пролиферативное нарушение, поддающиеся лечению с помощью вариантных молекул IL-10 или его слитых белков, описываемых в настоящем документе, включают различные формы злокачественной опухоли, включая в качестве неограничивающих примеров, злокачественную опухоль матки, шейки матки, молочной железы, предстательной железы, яичек, полового члена, желудочно-кишечного тракта, например, пищевода, ротоглотки, желудка, тонкой или толстой кишки, толстой или прямой кишки, почек, почечных клеток, мочевого пузыря, кости, костного мозга, кожи, головы или шея, кожи, печени, желчного пузыря, сердца, легкого, поджелудочной железы, слюнной железы, надпочечника, щитовидной железы, головного мозга, например, глиомы, ганглиев, центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), и иммунной системы, например, селезенки или тимуса. Настоящая заявка относится к способам лечения, например, иммуногенных опухолей, неиммуногенных опухолей, спящих опухолей, вирус-индуцированных злокачественных опухолей, например, рака эпителиальных клеток, рака эндотелиальных клеток, плоскоклеточных карцином, папилломавируса, аденокарцином, лимфом, карцином, меланом, лейкозов, миелом, сарком, тератокарцином, химически индуцированных злокачественных опухолей, метастазов и ангиогенеза. В заявке также рассматривается снижение толерантности к опухолевой клетке или антигену злокачественной клетки, например, путем модулирования активности регуляторной T-клетки (Treg) или CD8⁺ T-клетки. В предпочтительном варианте осуществления вариантные молекулы IL-10 особенно подходят для лечения пациентов или индивидуумов с метастатическим заболеванием печени.

В других вариантах осуществления способы лечения или уменьшения симптомов, связанных с воспалительным заболеванием или злокачественной опухолью, включают введение вариантных молекул IL-10 или его слитых белков или их производных форм (например, пегилирование) в комбинации с другими терапевтическими средствами. Эти терапевтические средства в качестве неограничивающих примеров включают цитокин или антагонист цитокина, такого как IL-12, IL-2, IL-15, интерферон-альфа, или средство против рецептора эпидермального фактора роста, доксорубицин, эпирубицин, антифолат, например, метотрексат или фторурацил, иринотекан, циклофосфамид, лучевую терапию, гормональную или противогормональную терапию, например, андроген, эстроген, антиэстроген, флутамид или диэтилстильбестрол, хирургическое вмешательство, тамоксифен, ифосфамид, митолактол, алкилирующее средство, например, мелфолактол, алкилирующее средство, например, мелфалан или цис-платин, этопозид, винорелбин, винбластин, виндезин, глюкокортикоид, антагонист рецептора гистамина, ингибитор ангиогенеза, облучение, сенсибилизатор облучения, антрациклин, алкалоид барвинка, таксан, например, паклителакс и доаксцетел, ингибитор клеточного цикла, например, ингибитор циклин-зависимой киназы, моноклональное антитело против другого опухолевого антигена, комплекс моноклонального антитела и токсина, адъювант Т-клеток, трансплантат костного мозга или антигенпредставляющие клетки, например, терапия дендритными клетками.

В других вариантах осуществления настоящая заявка также включает способы лечения нарушений, связанных с липидами, таких как гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия, и/или улучшения липидных параметров, таких как общий холестерин, холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), холестерин липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), триглицериды и холестерин, не относящийся к ЛПВП, включащий введение вариантных молекул IL-10 или их производных форм (например, пегилирование).

Вариантный IL-10 или его слитый белок, наиболее эффективные для лечения заболеваний или нарушений, связанных с липидами, включают те, которые обладают наименьшей подавляющей способностью относительно макрофагов. Таким образом, изменение рецептор-связывающего домена посредством замены аминокислот в положении 31 (в сочетании с увеличенным междоменным углом в гомодимере), как было показано автором настоящего изобретения, вызывает наименьший макрофагальный ответ. В частности, было показано, что EBV IL-10, несущий замену V31L в SEQ ID NO: 3, снижает макрофагальный ответ (см., например, фигуру 8A, обозначено как DV05, или SEQ ID NO: 55). Таким образом, один особенно предпочтительный вариант осуществления предполагает использование диатела и монотела с вариантными молекулами IL-10, несущими мутацию на основе DV05 (замена в аминокислотных положениях 31 SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 55). В более предпочтительном варианте осуществления способы лечения заболеваний или нарушений на основе липидов будут использовать комплекс слитых белков или слитый белок, содержащий SEQ ID NO: 24-25, 50-51 или 45.

В еще одном варианте осуществления изобретения вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки, вирусный IL-10 (включая EBV или CMV IL-10) или IL-10 дикого типа, любой из которых может необязательно включать пегилирование или гезилирование, используют в способе нацеливания на тучные клетки, уменьшая дегрануляцию тучных клеток. В предпочтительном варианте осуществления способ нацеливания на тучные клетки включает контактирование вирусного IL-10 или вариантных молекул IL-10 для лечения сезонных аллергий или острого анафилактического ответа. В другом аспекте вариантные молекулы IL-10, вирусный IL-10 (включая EBV или CMV IL-10), или IL-10 дикого типа применяют для снижения чувствительности к IgE.

В еще одном варианте осуществления вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки по настоящему изобретению предпочтительно полезны в описанных способах (например, противовоспалительных и/или против злокачественной опухоли) при скрининге популяции пациентов. В одном из вариантов осуществления те пациенты, которые демонстрируют профиль, где наблюдается повышенный или высокий ответ IFNγ, наиболее чувствительны или идеальны для использования вариантных молекул IL-10 для лечения злокачественной опухоли. В другом варианте осуществления те пациенты, которые проявляют профиль, при котором наблюдается сниженный или низкий ответ IFNγ, наиболее восприимчивы или идеальны для использования вариантных молекул IL-10 для лечения против воспаления.

Широкий объем этой заявки лучше всего понятен со ссылкой на следующие примеры, которые не предназначены для ограничения изобретения какими-либо конкретными вариантами осуществления. Все цитаты в настоящем документе включены в настоящий документ в качестве ссылок в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были специально и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки.

Многие модификации и вариации этого изобретения могут быть сделаны без выхода за рамки его сущности и объема, что будет очевидно специалистам в данной области. Конкретные варианты осуществления, описываемые в настоящем документе, предложены в качестве примера, и изобретение должно быть ограничено терминами прилагаемой формулы изобретения вместе с полным объемом эквивалентов, на которые такая формула имеет право; и изобретение не должно быть ограничено конкретными вариантами осуществления, которые были представлены в настоящем документе в качестве примера. Дополнительно, все ссылки, патенты и патентные заявки, указанные в вышеуказанном описании, включены в настоящий документ в качестве ссылок.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры являются просто иллюстрацией различных вариантов осуществления заявки и не должны рассматриваться каким-либо образом как ограничение объема заявки.

Пример 1

Варианты EBV-IL-10 или их белки конструируют путем изменения первичной последовательности с помощью стандартных способов клонирования молекулярной биологии. Изменения в первичной последовательности предназначены для изменения аффинности рецептор-связывающих доменов, а также открытия или закрытия междоменных углов. Аффинность к рецептору может быть изменена путем замены аминокислот в положениях 31 и/или 75 и рядом с ними в зрелой секретируемой последовательности. Междоменные углы могут быть изменены, например, но не ограничиваясь этим, введением пролина в последовательности спиралей, не являющихся альфа, между спиралями C и D, и D и E. Пролины приводят к изгибу первичной последовательности аминокислот в линейном направлении, потенциально изменяя последующий интердоменные углы, управляемые вторичными и третичными структурами спирали D и E. Аналогично, введение аминокислот с объемными боковыми цепями, таких как триптофан, может внести менее значительные изменения в линейную структуру основных цепей аминокислот, что приведет к менее глубоким изменениям во вторичных и третичных структурах.

Пример 2

В следующих примерах представлено описание того, как вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки оценивают в макрофагах.

Брали человеческую кровь у популяций здоровых пациентов или пациентов, страдающих воспалительным заболеванием (например, болезнью Крона), и свежеотобранный лейкоцитарный слой обрабатывали для получения PBMC с использованием стандартных процедур центрифугирования в градиенте плотности Фиколл. Затем PBMC подвергают обогащению по CD14⁺ моноцитарным клеткам с использованием набора EasySep™ Human Monocyte Enrichment (Каталожный номер 19059, Stem Cell Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Эффективность обогащения оценивают стандартной проточной цитометрией.

Обогащенные моноциты высевают в 24-луночные планшеты с концентрацией 2×10⁶ клеток/мл/лунку в среде RPMI с добавлением 5% человеческой сыворотки и PSG. Клетки обрабатывают серийными разведениями (0, 0,1, 1, 10, 100, 1000 нг/мл) вариантной молекулы IL-10 в течение 1 часа при 37°C/5% CO₂ в инкубаторе с контролем влажности, а затем подвергают воздействию 10 нг/мл ЛПС (Каталожный номер L4391, Sigma-Aldrich) в течение 12-16 часов. После инкубации в течение ночи собирают супернатанты и измеряют воспалительные цитокины (IL-6, TNFα, IL-1β) либо стандартным ELISA, либо с помощью iQue Screener (Intellicyt).

В исследовании применяют описанный выше способ для сравнения воздействия непегилированного EBV-IL10 и непегилированного человеческого IL-10 на иммуносупрессивные способности по отношению к макрофагам. Фигуры 2A, 2B и 3A, 3B показывают, что EBV-IL10 сохранил способность подавлять воспалительные цитокины IL-1β и TNFα, что указывает на то, что, несмотря на различия в междоменном угле, EBV-IL10 способен поддерживать свои супрессивные противовоспалительные функции, тем же образом, что и человеческий IL-10.

Пример 3

В следующих примерах представлено описание того, как вариантные молекулы IL-10 или его слитые белки оценивают на человеческих CD8⁺ T-клетках.

Собирали человеческую кровь у популяции здоровых пациентов или пациентов, страдающих воспалительным заболеванием (например, болезнью Крона), и свежесобранный лейкотромбоцитарный слой обрабатывали для получения PBMC с использованием стандартных способов центрифугирования в градиенте плотности Фиколл. Затем PBMC подвергали обогащению по CD8⁺ T-клеткам с использованием набора EasySep™ Human CD8⁺ T Cell Enrichment (Каталожный номер 19053, Stem Cell Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Эффективность обогащения оценивали стандартными способами проточной цитометрии. Обогащенные клетки суспендировали в среде для культивирования AIMV (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер 12055083). 24-луночные планшеты покрывали 10 мкг/мл анти-CD3 (каталожный номер 16-0039-85, Thermo Fisher Scientific) и 2 мкг/мл анти-CD28 (каталожный номер 16-0289-85, Thermo Fisher Scientific ) в течение 2 часов путем инкубирования при 37°C/5% CO₂ в инкубаторе для клеточной культуры с контролем влажности с последующими 1-2 промываниями 1× PBS.

Обогащенные CD8⁺ T-клетки (3×10⁶/мл/лунку) добавляли к планшетам, покрытым анти-CD3/анти-CD28, и инкубировали в течение 72 часов при 37°C/5% CO2 в инкубаторе для клеточной культуры с контролем влажности.

Через 72 часа клетки собирали, считали и 100 мкл перемещали в круглодонный 96-луночный планшет (2×10⁵ клеток/лунку) в присутствии/отсутствии серийных разведений (0, 0,1, 1, 10, 100, 1000 нг/мл с добавлением 100 мкл/лунку) вариантных молекул IL-10 или контрольного образца. Тестирование проводили в трех повторах. Клетки с вариантными молекулами IL-10 или его слитыми белками инкубируют в течение 72 часов при 37°C/5%CO₂ в инкубаторе с контролем влажности. Через 72 часа клетки собирают, промывают, помещают в свежий 96-луночный планшет с круглым дном, содержащим растворимое антитело к CD3 (каталожный номер 16-0039-85, Thermo Fisher Scientific), в течение 4 часов при 37°C/5%CO₂ в инкубаторе с контролем влажности.

В исследовании применяют вышеописанный способ для сравнения воздействий непегилированного EBV-IL10 и непегилированного человеческого IL-10 на стимуляцию CD8⁺ Т-клеток. Фигуры 2C и 3C показывают, что EBV-IL10 демонстрирует пониженные уровни IFNγ (показатель стимуляции Т-клеток) по сравнению с человеческим IL-10. Это указывает на то, что при изменении междоменного угла, появляется способность модулировать стимуляцию Т-клеток. Фигуры 4A и 4B показывают, что половина обработанных доноров проявляет желаемый полный противовоспалительный эффект, а половина - нет. Варианты, выбранные для разработки, будут имитировать ответ донора 1, полное подавление секреции воспалительных цитокинов макрофагальными клетками в ответ на ЛПС и отсутствие индукции IFNγ активированными CD8⁺ Т-клетками. Донор 2 демонстрировал такое же подавление секреции воспалительного цитокина моноцитами/макрофагами, как и донор 1, но только был сдвиг кривой и максимальной активации секреции IFNγ T-клетками вправо. Вариант молекулы IL-10, изменяющий аффинность к рецептору и междоменный угол, должен еще больше снижать активацию Т-клеток у пациентов, подобных донору 2.

Пример 4

Человеческие моноциты/макрофаги, Т-клетки и мышиные клетки MC/9, приобретенные у ATCC, культивировали, как указано ранее, и оценивали ответ на моно- или ди-пегилированный по N-концу 5кДа EBV-IL10. Пегилирование EBV-IL10 приводит к небольшому снижению ответа макрофагов на ЛПС (фигура 5B), но почти к полному подавлению индукции IFNγ у стимулированных Т-клеток (фигура 5C). Точно так же пегилирование EBV-IL10 почти отменяет его стимулирующее действие на клетки MC/9 (фигура 5A).

Различные формы вариантного диатела EBV-IL-10 с VH- и VL-областями из анти-CD3α и анти-EGFR тестировали с использованием анализа пролиферации клеток MC/9. Части варианта EBV-10 включали D:DV05 (EBV IL-10 с мутацией V31), D:DV06 (EBV IL-10 с мутацией A75I) и D:DV07 с мутациями V31L и A75I). Кроме того, были протестированы диатело DV07, включающее VH- и VL-области из анти-ВИЧ и анти-Эбола. Различные формы вариантного диатела сравнивали с человеческим IL-10 и EBV IL-10. Результаты представлены на Фиг. 15.

Другие формы слитых белков EBV-IL-10 также были протестированы in vitro. В частности DhivDebo:DV06 (SEQ ID NO: 26 и 27) и DmadcamDebo: DV06 (SEQ ID NO: 41 и 42) сравнивали с человеческим IL-10 в анализах макрофагального и Т-клеточного ответа, описываемых в настоящем документе. Результаты представлены на фигурах 20A и 20B.

Пример 5

В следующем примере представлен типичный протокол для тестирования IL-10 и вариантной молекулы IL-10 и его слитых белков на модели опухоли in vivo. Все исследования in vivo проводят в соответствии со стандартными рабочими способами и установленными руководствами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных («IACUC»).

Восьминедельных самок мышей Balb/C приобретали у соответствующего продавца, помещают на карантин на одну неделю и поддерживают на обычном питании и воде со сменой подстилки 1 раз/неделю в рамках стандартного 24-часового цикла свет/темнота.

Опухолевые клетки CT26 (2×10⁵) суспендируют в забуференном солевом растворе Хэнкса и подкожно имплантируют восьминедельным мышам, и дают расти. Мышей дикого типа Balb/C Envigo или нокаутных по В-клеткам (Джексон), несущих опухоль CT26 (в среднем 50-150 мм³), обрабатывают 0,4 и 0,2 мг/кг три раза в неделю (q3w), 0,2 и 0,1 мг/кг в день (qd) 5 суток через двое IL-10 или вариантными молекулами IL-10 или его слитыми белками (например, вариантной молекулой EBV IL-10, несущая две замены в рецептор-связывающем домене, DV07 (фигура 8C), ковалентно связанной с VH и VL от двух разных антител или диателом) подкожно (загривок) в течение 10 суток. Длину и ширину опухоли измеряют каждые трое суток электронными измерителями и рассчитывают объем опухоли ((L×W²)/2)). B-клетки у мышей дикого типа истощали внутривеннным (в/в) введением 200 мкг/мышь антитела к мышиному CD20. Результаты одного из таких исследований представлены на фигуре 16, в которой использовалась вариантная молекула IL-10, обозначенная D:DV07, которая представляет собой вариантный IL-10, несущий мутации V31 и A75I, и содержащая вариабельные области из анти-CD3α и анти-EGFR.

На фигуре 17A и 17B сравнивают на модели опухоли in vivo два формата вариантных слитых белков IL-10 (т.е. вариантный IL-10, включающий в себя как мутации V31L, так и A75I, DV07) представленные фигурами 9C (большой формат) и 9f (малый формат). Слитые белки представляют собой ненацеленные белки и содержат области VH и VL из антитела к ВИЧ и антитела к Эбола (большой формат) и области VH и VL из антитела к Эбола. В исследовании дозирования изучали эффекты малого формата ненацеленного слитого белка IL-10, вводимого пять суток через двое (фигура 17A), по сравнению с пегилированным рекомбинантным человеческим IL-10 (0,75 мг/кг в день). В исследовании дозирования также изучали эффекты большого и малого форматов ненацеленного слитого белка IL-10, вводимого три раза в неделю (фигура 17B), по сравнению с пегилированным IL-10 (0,75 мг/кг в день).

Исследования с использованием малого и большого формата слитых белков IL-10 (т.е. вариантного IL-10, включающего как мутацию V31l, так и A75I, DV07), обладающих способностью нацеливания на опухоль, также были проведены in vivo. Фигура 18A представляет собой результаты ежедневного введения различных нацеленных вариантных слитых белков IL-10, где большой формат (DegfDebo:DV07) и малый формат (Degf:DV07) сравнивали с малым форматом слитого белка IL-10 без нацеливания (Debo:DV07) и пегилированным IL-10. Фигура 18B представляет собой результаты введения трижды в неделю различных нацеленных вариантных слитых белков IL-10 большого формата, где большой формат (DegfDebo:DV07) в различных дозах (1 мг/кг и 0,25 мг/кг) сравнивали с малым форматом слитого белка IL-10 без нацеливания (DhDe: DV07) и пегилированным IL-10. Фигура 18C представляет собой результаты введения трижды в неделю различных нацеленных вариантных слитых белков IL-10 малого формата, где малый формат (Degf:DV07) в различных дозах (1 мг/кг и 0,25 мг/кг) сравнивали с малым форматом слитого белка IL-10 без нацеливания (Debo: DV07) и пегилированным IL-10.

Пример 6

В следующем примере представлен типичный протокол для тестирования IL-10 и вариантной молекулы IL-10, и его слитых белков на модели холестерина in vivo. Все исследования in vivo проводят в соответствии со стандартными рабочими способами и установленными руководствами, утвержденными IACUC.

Восьминедельных самок мышей C57BL/6J приобретали у соответствующего продавца, помещают на карантин на одну неделю и поддерживают на обычном питании и воде со сменой подстилки 1 раз/неделю в рамках стандартного 24-часового цикла свет/темнота

Восьминедельные самки мышей C57BL/6J из Jackson Laboratories находились на диете с высоким содержанием жиров (Envigo) в течение трех недель. Образцы плазмы получали путем ретроорбитального кровотечения из каждой мыши до лечения ее вариантным IL-10, или IL-10, или слитым белком (например, вариантным EBV IL-10, содержащим единственную замену в аминокислотном положении 31 (V31L) SEQ ID NO: 3 и связанным с диателом (вариантный D:DV05 EBV IL-10)). Мышей обрабатывают подкожно в течение двух недель с 0,4 и 0,2 мг/кг три раза в неделю (q3w), а также 0,2 и 0,1 мг кг еженедельно (qd) по 5 суток лечения с 2-дневным терапевтическим отпуском. Животных обрабатывают в течение двух недель и собирают кровь, после чего количественно определяют количество холестерина до и после введения дозы. За сутки до начала лечения B-клетки истощали при помощи внутривенного (в/в) введения 200 мкг/мышь антитела к мышиному CD20. Результаты одного такого исследования представлены на рисунках 19A и 19B.

Пример 7

В следующем примере представлен типичный протокол тестирования IL-10 и его слитых белков на модели воспаления с декстрансульфатом натрия («DSS») in vivo. Все исследования in vivo проводят в соответствии со стандартными рабочими процедурами и установленными руководствами, утвержденными IACUC.

Восьминедельных самок мышей Balb/C приобретали у соответствующего продавца, помещают на карантин на одну неделю и поддерживают на обычном питании и воде со сменой подстилки 1 раз/неделю в рамках стандартного 24-часового цикла свет/темнота. Нокаутных по В-клеткам мышей (Jackson) кормили 4% DSS в воде неограниченно в течение шести суток, после чего им предоставлялась нормальная вода. На сутки 5 мышей обрабатывают 0,4 и 0,2 мг/кг три раза в неделю (q3w), 0,2 и 0,1 мг/кг ежедневно (qd) пять суток через двое IL -10 или вариантным IL-10 или его слитым белком (например, вариантным EBV IL-10, содержащим единственную замену в аминокислотном положении 75 (A75I) SEQ ID NO: 3, связанным с диателом (вариантный D:DV06 EBV IL-10)) подкожно (загривок) в течение 10 суток. Мышей оценивают ежедневно по:

1) Массе

2) Крови в стуле

3) Обширному кровотечению

4) Консистенции стула.

Индекс активности заболевания определяют путем сложения баллов:

1. Потеря массы

2. Консистенция стула

3. Кровотечение (разделенное на 3)

Каждая оценка определяет следующее: изменение массы (0: <1%, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 3: 10-15%, 4> 15%, кровь в стуле (0: отрицательно, 2 : положительный результат) или сильное кровотечение (4) и консистенция стула (0: нормальный, 2: жидкий стул, 4: диарея).

СПИСОК ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Вариантный белок IL-10 вируса Эпштейна-Барр (EBV-IL10), содержащий одну или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен, демонстрирующий измененный междоменный угол и/или измененную аффинность к своему рецептору по сравнению с EBV-IL10 дикого типа, где измененный междоменный угол, при димеризации модулирует угол взаимодействия со своим рецептором.

2. Белок EBV-IL10 по предшествующему варианту осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен расположена в рецептор-связывающем домене IL-10.

3. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен расположена в альфа спирали A и/или спирали D.

4. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен расположена в связывающем домене EBV-IL10.

5. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен расположена в петле DE EBV-IL10.

6. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен расположена в области линкера из двенадцати аминокислот, обнаруженной между альфа спиралью D и альфа спиралью E, или альфа спиралью C и альфа спиралью D, предпочтительно добавление или замена пролина в области линкера из двенадцати аминокислот.

7. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где измененная аффинность к своему рецептору включает одну или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен в рецептор-связывающем домене IL-10.

8. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен, раасположенных в альфа спирали A и/или альфа спирали D.

9. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен в рецептор-связывающем домене IL-10.

10. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий одну или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен, раасположенных в альфа спирали A и/или альфа спирали D.

11. Белок EBV-IL10 по любому из предшествующих вариантов осуществления, где одна или несколько аминокислотных вставок, делеций и/или замен находится в аминокислотном положении 31 и/или 75 SEQ ID NO: 3.

12. Мономерный рекомбинантный белок, содержащий шесть альфа спиралей, пронумерованных A-F, способных образовывать гомодимер с идентичным мономерным белком, где альфа спирали D и E связаны межцепочечным аминокислотным линкером, причем линкер модифицирован вставкой, делецией или заменой, по меньшей мере, одной аминокислоты, которая изменяет межмолекулярный угол белка при гомодимеризации.

13. Рекомбинантный белок по предшествующему варианту осуществления, где белок представляет собой белок из вируса.

14. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вирус представляет собой вирус Эпштейна-Барр (EBV).

15. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомодимер, образованный двумя идентичными мономерными белками, образует определенный угол взаимодействия со своим рецептором.

16. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия больше, чем у природного белка дикого типа.

17. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия, образующийся при гомодимеризации, приводит к тому, что белок имеет более высокую аффинность к своему рецептору.

18. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия, образующийся при гомодимеризации, приводит к тому, что белок имеет более низкую аффинность к своему рецептору.

19. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия меньше, чем у природного белка дикого типа.

20. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействияприводит к тому, что белок имеет более высокую аффинность к своему рецептору.

21. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия приводит к тому, что белок имеет более низкую аффинность к своему рецептору.

22. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный белок представляет собой интерлейкин 10.

23. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный белок представляет собой EBV-IL10.

24. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол белка обеспечивается модификациями в линкере, приводя к углу взаимодействия со своим рецептором.

25. Рекомбинантный вариант белка IL-10 вируса Эпштейна-Барр (EBV-IL10), содержащий, по меньшей мере, одну аминокислотную вставку, делецию или замену в области линкера между альфа-спиралью D и E EBV-IL10 и/или в рецептор-связывающей области EBV-IL10.

26. Рекомбинантный белок по предшествующему варианту осуществления, где вариантный белок EBV-IL10 взаимодействует с идентичным белком, что приводит к гомодимеру с измененным углом взаимодействия с его рецептором и/или измененному межгомодимерному углу.

27. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок EBV-IL10 образует угол взаимодействия и/или измененный межгомодимерный угол, который больше, чем у белка EBV-IL10 дикого типа.

28. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок EBV-IL10 образует угол взаимодействия и/или измененный межгомодимерный угол, который меньше, чем у белка EBV-IL10 дикого типа.

29. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия при образовании гомодимера приводит к тому, что вариантный белок EBV-IL10 имеет повышенную аффинность к своему рецептору.

30. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия при образовании гомодимера приводит к тому, что вариантный белок EBV-IL10 имеет сниженную аффинность к своему рецептору.

31. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия придает увеличение аффинности к своему рецептору.

32. Рекомбинантный белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где угол взаимодействия придает снижение аффинности к своему рецептору.

33. Выделенный рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

34. Выделенный рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

35. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

36. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из предшествующих вариантов осуществления.

37. Способ лечения или профилактики воспаления у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества вариантного белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

38. Способ по предшествующему варианту осуществления, где измененный угол вариантного белка меньше чем у EBV-IL10 дикого типа.

39. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок связывается с умеренной аффинностью с рецептором IL10 по сравнению с EBV-IL10 дикого типа.

40. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где воспаление представляет собой воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), неалкогольное жировое заболевание печени (НАЖЗП), псориаз, ревматоидный артрит, острый анафилактический шок и/или сезонные аллергии.

41. Способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества вариантного белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

42. Способ по предшествующему варианту осуществления, где измененный угол вариантного белка меньше, чем у EBV-IL10 дикого типа.

43. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок связывается с умеренной аффинностью с рецептором IL10 по сравнению с EBV-IL10 дикого типа.

44. Способ лечения или профилактики ВЗК или болезни Крона у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества вариантного белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

45. Способ по предшествующему вариантуосуществления, где измененный угол вариантного белка меньше, чем у EBV-IL10 дикого типа.

46. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок связывается с умеренной аффинностью с рецептором IL10 по сравнению с EBV-IL10 дикого типа.

47. Способ лечения или профилактики неалкогольного жирового заболевания печени (НАЖЗП) или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества вариантного белка по п. 1.

48. Способ по предшествующему варианту осуществления, где измененный угол вариантного белка меньше, чем у EBV-IL10 дикого типа.

49. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок связывается с умеренной аффинностью с рецептором IL10 по сравнению с EBV-IL10 дикого типа.

50. Способ лечения или профилактики злокачественной опухоли у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества вариантного белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

51. Способ по предшествующему варианту осуществления, где измененный угол вариантного белка больше чем у EBV-IL10 дикого типа.

52. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный белок связывается с повышенной аффинностью с рецептором IL10 по сравнению с EBV-IL10 дикого типа.

53. Сконструированный слитый белок, содержащий, по меньшей мере, один мономер IL-10 или вариантной молекулы IL-10, конъюгированный на первом конце слитого белка, по меньшей мере, один цитокин, или его мономер, конъюгированный на втором конце слитого белка, и линкер или спейсер,

где линкер или спейсер соединяет первый и второй концы.

54. Слитый белок по предшествующему варианту осуществления, где линкер или спейсер представляет собой константную область антитела.

55. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где константная область получена из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, или IgE.

56. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где линкер или спейсер дополнительно содержит, по меньшей мере, две межцепочечные дисульфидные связи.

57. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где линкер или спейсер представляет собой scFv, диатело или их фрагменты.

58. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где константная область представляет собой константную область (CH) 1, CH2, CH3 тяжелой цепи или любое их сочетание.

59. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где, по меньшей мере, один IL-10 или вариантная молекула IL-10 конъюгированы с N-концом, C-концом или с обоими концами слитого белка.

60. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где, по меньшей мере, один цитокин, конъюгированный на другом конце, включает IL-10, вариантную молекулу IL-10, IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерфероны -α, -β, -γ, TGF-β, или факторы некроза опухоли -α, -β, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11, или IL-13, или любое их сочетание.

61. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка, и два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с C-концом слитого белка.

62. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка и, по меньшей мере, одну молекулу IL-2, конъюгированную с C-концом слитого белка.

63. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где C-конец дополнительно содержит IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерфероны -α, -β, -γ, TGF-β, или факторы некроза опухоли -α, -β, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13.

64. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка и, по меньшей мере, одну молекулу IL-15, конъюгированную с C- концом слитого белка.

65. Слитый белок, где C-конец дополнительно содержит IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерфероны -α, -β, -γ, TGF-β, или факторы некроза опухоли -α, -β, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13.

66. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит два IL-10 или две вариантные молекулы IL-10, конъюгированные с N-концом слитого белка и, по меньшей мере, одну молекулу IL-2, конъюгированную с C-концом слитого белка.

67. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где C-конец дополнительно содержит IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерфероны -α, -β, -γ, TGF-β, или факторы некроза опухоли -α, -β, основной FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13.

68. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок произведен на каркасе одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv).

69. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок произведен на каркасе диатела.

70. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок произведен на каркасе Fab.

71. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок образует комплекс с другим слитым белком, имеющим, по меньшей мере, один мономер IL-10, или вариантную молекулу IL-10, конъюгированную на первом конце слитого белка, по меньшей мере, один цитокин или его мономер, конъюгированный на втором конце слитого белка, и линкер или спейсер,

где линкер или спейсер соединяет первый и второй концы.

72. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму сконструированного слитого белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

73. Способ лечения или профилактики ВЗК или болезни Крона, включающий введение индивидууму сконструированного слитого белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

74. Способ лечения или профилактики неалкогольного жирового заболевания печени (НАЖЗП) или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества сконструированного слитого белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

75. Способ активации CD8-положительной T-клетки, включающий введение сконструированного слитого белка по любому из предшествующих вариантов осуществления.

76. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где введение представляет собой введение in vitro.

77. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где введение представляет собой введение in vivo нуждающемуся в этом индивидууму, где индивидууму диагностировали злокачественную опухоль, ВЗК или болезнь Крона, или НАЖЗП или НАСГ.

78. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит IL-10 или вариантную молекулу IL-10 на первом конце слитого белка и IL-2 и/или IL-15 на втором конце слитого белка.

79. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму биспецифического T-клеточного активатора (BITE) и IL-10, вариантной молекулы IL-10, или сконструированного слитого белка, содержащего IL-10 или вариантную молекулу IL-10.

80. Способ по предшествующему варианту осуществления, где сконструированный слитый белок содержит, по меньшей мере, один IL-10 или одну вариантную молекулу IL-10, конъюгированную на первом конце слитого белка, по меньшей мере, один цитокин конъюгированный на втором конце слитого белка, и линкер или спейсер, где линкер или спейсер соединяет первый и второй концы.

81. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где IL-10, вариантная молекула IL-10, или сконструированный слитый белок, содержащий IL-10 или Вариантную молекулу IL-10, усиливает и поддерживает передачу сигнала T-клеточного рецепторного комплекса (CD3).

82. Способ лечения или профилактики воспаления у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеотидной последовательности, кодирующей вариантную молекулу IL-10.

83. Способ по предшествующему варианту осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой ДНК, РНК, или их модифицированные варианты.

84. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой мРНК или модифицированную мРНК, связанную с нуклеозидом.

85. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность способна in vivo экспрессировать вариантную молекулу IL-10 в клетке, ткани, или организме.

86. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидную последовательность доставляют в клетку, ткань, или организм при помощи пептида, проникающего в клетку, гидрофобной группы, электростатического комплекса, липосомы, лиганда, липосомальной наночастицы, липопротеина (предпочтительно ЛПВП или ЛПНП), фолат-нацеленной липосомы, антитела (например, к рецептору фолатов, рецептору трансферрина), нацеленного пептида или аптамера.

87. Способ лечения или профилактики аутоиммунного заболевания у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеотидной последовательности, кодирующей вариантные молекулы IL-10.

88. Способ по предшествующему варианту осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой ДНК, РНК, или их модифицированные варианты.

89. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой мРНК или модифицированную мРНК, связанную с нуклеозидом.

90. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность способна in vivo экспрессировать вариантную молекулу IL-10 в клетке, ткани, или организме.

91. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидную последовательность доставляют в клетку, ткань, или организм с помощью пептида, проникающего в клетку, гидрофобной группы, электростатического комплекса, липосомы, лиганда, липосомальных наночастиц, липопротеина (предпочтительно ЛПВП или ЛПНП), фолат-нацеленной липосомы, антитела (например, к рецептору фолатов, рецептору трансферрина), нацеленного пептида или аптамера.

92. Способ лечения или профилактики ВЗК или болезни Крона у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеотидной последовательности, кодирующей вариантную молекулу IL-10.

93. Способ по предшествующему варианту осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой ДНК, РНК, или их модифицированные варианты.

94. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой мРНК или модифицированную мРНК, связанную с нуклеозидом.

95. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность способна in vivo экспрессировать вариантную молекулу IL-10 в клетке, ткани или организме.

96. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидную последовательность доставляют в клетку, ткань, или организм с помощью пептида, проникающего в клетку, гидрофобной группы, электростатического комплекса, липосомы, лиганда, липосомальных наночастиц, липопротеина (предпочтительно ЛПВП или ЛПНП), фолат-нацеленной липосомы, антитела (например, к рецептору фолатов, рецептору трансферрина), нацеленного пептида или аптамера.

97. Способ лечения или профилактики неалкогольного жирового заболевания печени (НАЖЗП) или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) у индивидуума, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеотидной последовательности, кодирующей вариантную молекулу IL-10.

98. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой ДНК, РНК, или их модифицированные варианты.

99. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность представляет собой мРНК или модифицированную мРНК, связанную с нуклеозидом.

100. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидная последовательность способна in vivo экспрессировать вариантную молекулу IL-10 в клетке, ткани или организме.

101. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где нуклеотидную последовательность доставляют в клетку, ткань, или организм с помощью пептида, проникающего в клетку, гидрофобной группы, электростатического комплекса, липосомы, лиганда, липосомальных наночастиц, липопротеина (предпочтительно ЛПВП или ЛПНП), фолат-нацеленной липосомы, антитела (например, к рецептору фолатов, рецептору трансферрина), нацеленного пептида или аптамера.

102. Слитый белок, содержащий мономерную молекулу IL-10 или ее вариант, связанный с двумя вариабельными областями, по меньшей мере, из двух различных антител, где две вариабельные области сконфигурированы в виде вариабельной области тяжелой цепи (VH) из первого антитела, связанной с вариабельной областью легкой цепи (VL) из второго антитела, или VL из первого антитела, связанной с VH из второго антитела

103. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерная молекула IL-10 или ее вариант включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или снижает аффинность к рецептору IL-10.

104. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерная молекула IL-10 или ее вариант включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает аффинность к рецептору IL-10.

105. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерная молекула IL-10 или ее вариант представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

106. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31, 75, или обеих.

107. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31.

108. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75.

109. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положениях 31 и 75.

110. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

111. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты A75I.

112. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L и A75I.

113. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH из первого антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и область VL из второго антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола.

114. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH из первого антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола и область VL из второго антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ.

115. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24-28, 29, 33-51, 61, 63, 65 или 67.

116. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок представляет собой диатело.

117. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит конфигурацию, выбранную из: (a) области VH из первого антитела, связанной карбокси-концом с амино-концом области VL из второго антитела, затем связанной с аминоконцом мономера IL-10 или его варианта; или

(b) молекулы IL-10 или ее варианта, связанной карбокси-концом с амино-концом области VH второго антитела, затем связанной с аминоконцом области VL первого антитела.

118. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где конфигурации (a) и (b) вместе образую комплекс диател.

119. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областью VH и областью VL.

120. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO: 24-28, 29, 33-53, 61, 63, 65, 67.

121. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

122. Иммуноконъюгатный комплекс, содержащий i) первый слитый белок, содержащий на амино-конце вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела, связанную с вариабельной областью легкой цепи (VL) второго антитела, далее связанную с мономером IL-10 или его вариантом; и ii) второй слитый белок, содержащий на амино-конце мономер IL-10 или его вариант, связанный с VH из второго антитела, далее связанной с VL первого антитела, где VH и VL из первого и второго антител ассоциируют в диатело, и мономеры IL-10 формируют функциональную димерную молекулу IL-10.

123. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или уменьшает аффинность к рецептору IL-10.

124. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где молекула IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает аффинность к рецептору IL-10.

125. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

126. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31, 75, или в обоих.

127. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31.

128. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75.

129. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положениях 31 и 75.

130. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

131. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты A75I.

132. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L и A75I.

133. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ, и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

134. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первый слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48, или 50.

135. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где второй слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25,27, 29, 36, 39, 42, 47, 49, или 51.

136. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областью VH и областью VL.

137. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 в первом слитом белке связан с областью VL посредством амино-конца.

138. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 во втором слитом белке связан с областью VH посредством карбокси-конца.

139. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

140. Диатело, содержащее первую пептидную цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела, вариабельную область легкой цепи (VL) из второго антитела, и мономерный IL-10; и вторую пептидную цепь, включающую VH и VL из второго антитела и мономерную молекулу IL-10, где область VH из первого антитела ассоциирует с областью VL из первого антитела и область VH из второго антитела ассоциирует с VL из второго антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

141. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или уменьшает аффинность к рецептору IL-10.

142. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерная молекула IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает аффинность к рецептору IL-10.

143. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерная молекула IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

144. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31, 75, или в обоих.

145. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31.

146. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75.

147. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положенииях 31 и 75.

148. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

149. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты A75I.

150. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L и A75I.

151. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ, и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

152. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48 или 50.

153. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вторая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25,27, 29, 36, 39, 42,47, 49 или 51.

154. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащая линкер между областями VH и VL.

155. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

156. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 связан с первой и второй пептидной цепью через свой карбокси-конец.

157. Диатело по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

158. Иммуноконъюгатный комплекс, содержащий i) первый слитый белок, содержащий на амино-конце вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела и мономерную молекулу IL-10, связанную посредством амино-конца; и ii) второй слитый белок, содержащий на амино-конце мономер IL-10, связанный с вариабельно1 областью легкой цепи (VL) первого антитела, где область VH из первого антитела ассоциирует с областью VL из первого антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

159. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или уменьшает аффинность к рецептору IL-10.

160. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где молекула IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает аффинность к рецептору IL-10.

161. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

162. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31, 75, или в обоих.

163. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31.

164. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75.

165. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислот в положениях 31 и 75.

166. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

167. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты A75I.

168. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L и A75I.

169. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где области VH и VL из первого антитела происходят из моноклонального антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR).

170. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первый слитый белок дополнительно содержит область VL из второго антитела, связывающую область VH из первого антитела с мономерным IL-10 и где второй слитый белок дополнительно содержит область VH из второго антитела, связывающую мономерный IL-10 с областью VL.

171. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где области VH и VL из второго антитела происходят из моноклонального антитела к Эбола.

172. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариабельные области связаны с мономерами IL-10 через линкеры.

173. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

174. Иммуноконъюгатный комплекс по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое и второе антитела содержат одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

175. Слитый белок, содержащий вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела, слитые с мономерами IL-10, где мономеры IL-10 напрямую связаны друг с другом.

176. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономеры IL-10 связаны карбокси-концом первого мономера IL-10 с амино-концом второго мономера IL-10.

177. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит следующую конфигурацию в направлении от амино-конца к карбокси-концу: область VL первого антитела связана с первым мономером IL-10, связанным со вторым мономером IL-10, связанным с областью VH первого антитела.

178. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий область VH второго антитела, связанную с амино-концом области VL первого антитела, и область VL второго антитела, связанную с карбокси-концом области VH первого антитела.

179. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждый из мономеров IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или уменьшает аффинность к рецептору IL-10.

180. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждый из мономеров IL-10 включает, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает аффинность к рецептору IL-10.

181. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономер IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

182. Слитый белок по п. 181, где гомолог EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31, 75, или в обоих.

183. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31.

184. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75.

185. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

186. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где гомолог EBV-IL-10 включает замену аминокислоты A75I.

187. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело представляет собой моноклональное анитело к Эбола.

188. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело представляет собой моноклональное анитело к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR).

189. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело антитело представляет собой моноклональное анитело к Эбола и второе антитело представляет собой моноклональное анитело к EGFR.

190. Способ лечения заболевания, нарушения, или состояния у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества иммуноконъюгатного комплекса с IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV), где иммуноконъюгатный комплекс имеет молекулярную массу приблизительно от 60 до 155 кДа, где терапевтически эффективное количество находится в диапазоне приблизительно от 0,5 микрограмм/килограмм до 100 микрограмм/килограмм, и где часть EBV IL-10 в иммуноконъюгате получена из SEQ ID NO: 3.

191. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс вводят раз в месяц, два раза в месяц, раз в неделю, дважды в неделю, три раза в неделю, или ежедневно.

192. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный EBV IL-10 представляет собой вариант, содержащий, по меньшей мере, одну замену аминокислоты, которая увеличивает или уменьшает аффинность к рецептору IL-10.

193. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный EBV IL-10 содержит замену аминокислоты в положениях 31, 75 или в обоих из SEQ ID NO: 3.

194. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вариантный EBV IL-10 содержит замену аминокислоты V31L.

195. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 содержит замену аминокислоты A75I.

196. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 содержит замены аминокислот V31L и A75I.

197. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс представляет собой комплекс из двух слитых белков.

198. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс содержит i.первый слитый белок, содержащий на амино-конце вариабельную область тяжелой цепи (VH) первого антитела, связанную с вариабельной областью легкой цепи (VL) второго антитела, далее связанную с карбокси-концом мономера EBV IL-10; и

ii. второй слитый белок, содержащий на амино-конце мономер EBV IL-10, связанный с VH второго антитела, далее связанную с VL первого антитела, где VH и VL первого и второго антител ассоциируют в диатело и мономеры EBV IL-10 формируют функциональную димерную молекулу EBV IL-10.

199. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело и второе антитело являются различными антителами.

200. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело представляет собой моноклональное антитело к ВИЧ и второе антитело представляет собой моноклональное антитело к Эбола.

201. Способ по п. 202, где слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24-51.

202. Способ по п. 202, где первый слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24, 26, 28, 35, 38, 41, 46, 48 или 50.

203. Способ по п. 202, где второй слитый белок представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25,27, 29, 36, 39, 42, 47, 49 или 51.

204. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс представляет собой диатело, содержащее мономеры EBV IL-10 слитые по обоим своим концам, где мономеры EBV IL-10 способны к ассоциации в функциональный димер EBV IL-10.

205. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где заболевание, нарушение, или состояние выбран из злокачественной опухоли, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, или холестерина.

206. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс с EBV IL-10 вводят в количестве, достаточном для поддержания устойчивой концентрации IL-10 в сыворотке, на основании введения, по меньшей мере, каждые 2-3 суток.

207. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгат способен подавлять секрецию TNFα и индуцировать выработку IFNγ в концентрациях, сходных с таковыми для IL-10 дикого типа.

208. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс с EBV IL-10 имеет активность, сходную с IL-10 дикого типа.

209. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где иммуноконъюгатный комплекс содержит:

(a) область VH первого антитела, на N-конце связанная с областью VL второго антитела, связанной с карбокси-концом молекулы IL-10; и

(b) молекулу IL-10, связанную с областью VH второго антитела, связанной с областью VL первого антитела.

210. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту диатела, содержащего первую пептидную цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи (VH) из первого антитела, вариабельную область легкой цепи (VL) из второго антитела, и мономерную молекулу IL-10; и вторую пептидную цепь, имеющую VH и VL из второго антитела и мономерную молекулу IL-10, где область VH первого антитела ассоциирует с областью VL первого антитела и область VH второго антитела ассоциирует с областью VL второго антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

211. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO: 3.

212. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31 SEQ ID NO: 3.

213. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

214. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH первого антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и область VL второго антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола.

215. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 28, 35, 38, 46.

216. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вторая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 29, 36, 39, 47.

217. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областями VH и областями VL.

218. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждая из VH и VL содержит одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

219. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

220. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где диатело сформировано двумя пептидными цепями со следующими конфигурациями от амино-конца к карбокси-концу: (a) первый пептид содержит область VH первого антитела, связанную с областью VL второго антитела, которая затем связана с амино-концом мономера IL-10 или его варианта; и

(b) второй пептид содержит мономер IL-10, связанный с областью VH второго антитела, которая затем связана с областью VL первого антитела.

221. Способ лечения холестерина у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту снижающее холестерин количество диатела, содержащего первую пептидную цепь с вариабельной областью тяжелой цепи (VH) из первого антитела, вариабельной областью легкой цепи (VL) из второго антитела, и мономерным IL-10; и вторую пептидную цепь с VH и VL из второго антитела и мономерной молекулой IL-10, где область VH первого антитела ассоциирует с областью VL первого антитела и область VH второго антитела ассоциирует с областью VL второго антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

222. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO:3.

223. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31 SEQ ID NO: 3.

224. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

225. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH первого антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и область VL второго антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола.

226. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24 или 50.

227. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вторая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25 или 51.

228. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областями VH и областями VL.

229. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждая из VH и VL содержит одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у индивидуума.

230. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

231. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где диатело сформировано двумя пептидными цепями со следующими конфигурациями от амино-конца к карбокси-концу:

(a) первый пептид содержит область VH первого антитела, связанную с областью VL второго антитела, которая затем связана с амино-концом мономера IL-10 или его варианта; и

(b) второй пептид содержит мономер IL-10 или его вариант, связанный с областью VH второго антитела, которая затем связана с областью VL первого антитела

232. Способ лечения неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) или неалкогольного жирового заболевания печени (НАЖЗП) у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту с НАСГ или НАЖЗП количества диатела, содержащего первую пептидную цепь с вариабельной областью тяжелой цепи (VH) из первого антитела, вариабельной областью легкой цепи (VL) из второго антитела, и мономерным IL-10; и вторую пептидную цепь с VH и VL из второго антитела и мономерной молекулой IL-10, где область VH первого антитела ассоциирует с областью VL первого антитела и область VH второго антитела ассоциирует с областью VL второго антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

233. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO:3.

234. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 31 SEQ ID NO: 3.

235. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, EBV IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

236. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH первого антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и область VL второго антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола.

237. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24 или 50.

238. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вторая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 25 или 51.

239. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областями VH и областями VL.

240. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждая из VH и VL содержит одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у пациента.

241. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

242. Способ лечения воспаления у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту противовоспалительного количества диатела, содержащего первую пептидную цепь с вариабельной областью тяжелой цепи (VH) из первого антитела, вариабельной областью легкой цепи (VL) из второго антитела, и мономерным IL-10; и вторую пептидную цепь с VH и VL из второго антитела и мономерной молекулой IL-10, где область VH первого антитела ассоциирует с областью VL первого антитела и область VH второго антитела ассоциирует с областью VL второго антитела, тем самым позволяя молекулам мономерного IL-10 на каждой пептидной цепи формировать функциональный димер IL-10.

243. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где мономерный IL-10 представляет собой гомолог IL-10 из вируса Эпштейна-Барр (EBV) из SEQ ID NO:3.

244. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты в положении 75 SEQ ID NO: 3.

245. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где EBV IL-10 включает замену аминокислоты V31L.

246. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где область VH первого антитела происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и область VL второго антитела происходит из моноклонального антитела к Эбола.

247. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 26, 41, или 48.

248. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где вторая пептидная цепь представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27, 42, 49.

249. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий линкер между областями VH и областями VL.

250. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где каждая из VH и VL содержит одну или несколько замен аминокислот, которые снижают антигенность у пациента.

251. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где первое антитело происходит из моноклонального антитела к ВИЧ и второе антитело происходит из моноклонального антитела к Эбола.

252. Слитый белок Формулы (I-VII)

IL10-L¹-X¹-L¹-X²-L¹-IL10 (Формула I); (Z)_n-X¹-L²-Y²-L¹-IL10 (Формула II); IL10-L¹-Y¹-L²-X²-(Z)_n (Формула III); X¹-L²-X²-L¹-IL10 (Формула IV); IL10-L¹-X¹-L²-X² (Формула V); X¹-L¹-IL10 (Формула VI); и IL10-L¹-X² (Формула VII), или любое их сочетание;

где

«IL-10» представляет собой мономерную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3, 14, 15, 16, 18, 19, 55, 57, или 59; более предпочтительно «IL-10» состоит из SEQ ID NO: 55, 57, или 59;

«L¹» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 31 или 54;

«L²» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 30;

«X¹» представляет собой область VH, полученную из первого антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; ловушка TGFβ; MadCam, субъединица β7 интегрина; интегрин α4β7; интегрин α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; и SR-J1; ВИЧ, или Эбола;

«X²» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и X1;

«Y¹» представляет собой область VH, полученную из второго антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; ловушка TGFβ; MadCam, субъединица β7 интегрина; интегрин α4β7; интегрин α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; и SR-J1; ВИЧ, или Эбола;

«Y²» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и Y1;

где X и Y получены из одного или разных антител;

«Z» представляет собой цитокин, выбранный из IL-10, вариантной молекулы IL-10, IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерферонов -α, -β, -γ, TGF-β, или факторов некроза опухоли -α, -β, основного FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13;

«n» представляет собой целое число, выбранное из 0-2.

253. Слитый белок по предшествующему варианту осуществления, где Формула II и III способны к формированию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул II и III способен к образованию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

254. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула II представляет собой SEQ ID NO: 24, 26, 28, 41, 48, или 50.

255. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула III представляет собой SEQ ID NO: 25, 27, 29, 42, 49, или 51.

256. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где комплекс слитых белков образован между SEQ ID NO: 24 и 25; 26 и 27, 28 и 29; 41 и 42; 48 и 49; или 50 и 51.

257. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула IV и V способны к формированию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул IV и V способен к образованию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

258. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула IV представляет собой SEQ ID NO: 35, 38, 46, 48 или 50.

259. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула V представляет собой SEQ ID NO: 36, 39, 47, 49 или 51.

260. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где комплекс слитых белков образован между SEQ ID NO: 35 и 36; 38 и 39, 46 и 47; 48 и 49; или 50 и 51.

261. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула VI и VII способны к формированию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул VI и способен к образованию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

262. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Формула I представляет собой SEQ ID NO: 33-34, 40, 43-44, 45, 52 53, 61, 63, 65 или 67.

263. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где «n» 1 и Z представляет собой IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 или любое их сочетание.

264. Слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления, где Z конъюгирована на N-конце X¹, Y¹, или обеих.

265. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

266. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 28-29, 35-36, 38-39, 46-47, 52 53, 61, 63, 65, или 67.

267. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок образует белковый комплекс, и белковый комплекс образован между SEQ ID No: 28 и 29; 35 и 36; 38 и 39; или 46 и 47.

268. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где композиция содержит слитый белок из SEQ ID NO: 33, 34, 44, 52 или 53, 61, 63, 65 или 67.

269. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок содержит IL-10, состоящий из DV07 из SEQ ID NO: 59.

270. Способ лечения воспалительного заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

271. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 26-27, 41-42, 48 или 49.

272. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок образует белковый комплекс, и белковый комплекс образован между SEQ ID NO: 26 и 27; 41 и 42; 48 и 49.

273. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где композиция содержит слитый белок из SEQ ID NO: 37, 40 или 43.

274. Способ по п. 18, где слитый белок содержит IL-10, состоящий из DV06 из SEQ ID NO: 57.

275. Способ лечения заболевания, связанного с липидами, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей слитый белок по любому из предшествующих вариантов осуществления.

276. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 24-25, 50 или 51.

277. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где слитый белок образует белковый комплекс, и белковый комплекс образован между SEQ ID No: 24 и 25; и 50 и 51.

278. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где композиция содержит слитый белок из SEQ ID NO: 45.

ССЫЛКИ

Asadullah, K. (1999). Interleukin 10 treatment of psoriasis: clinical results of a phase 2 trial. Archives Dermantology, 187-192.

Berman, R. M. (1996). Systemic Administration of Cellular IL-10 Induces an Effective Specific and Long-lived Immune Response Against Established Tumors in Mice. Journal of Immunology, 231-238.

Blum, A. M. (2003). CD4+ T cells from IL-10-deficient mice transfer susceptibility to NSAID-induced Rag colitis. American Journal of Physiology, G320 - G325.

Chan, I. H. (2015). The Potentiation of IFNg and Induction of Cytotoxic Proteins by Pegylated IL-10 in Human CD8 T cells. Journal of Interferon and Cytokine Research.

Chan, I. H. (2016). PEG-rIL-10 treatement decreases FoxP3+ T regs despite upregulation of intratumoral IDO. OncoImmunology.

Chan, I. H. (2016). PEGylated IL-10 Activates Kupffer Cells to Control Hypercholesterolemia. PLOS One.

Chernoff, A. E. (1995). A randomized, controlled trial of IL-10 in humans. Inhibition of inflammatory cytokine production and immune responses. Journal of Immunology, 5492-5499.

Conaway, E. A. (2017). Inhibition of Inflammatory Gene Transcription by IL-10 is Associated with Rapid Suppression of Lipopolysaccharide Induced Enhancer Activation. Journal of Immunology.

Correa, I. (2009). Defective IL-10 production in severe phenotypes of Crohn's disease. Journal of Leukocyte Biology, 896-903.

Correa, I. (2009). Defective IL-10 production in severe phenotypes of Crohn's disease. Journal of Leukocyte Biology.

Emmerich, J. (2012). IL-10 directly activates and expands tumor resident CD8⁺ T cells without de novo infiltration from secondary lymphoid organs. Cancer Research.

Fedorak, R. N. (2000). Recombinant Human Interleukin 10 in the Treatment of Patients With Mild to Moderately Active Crohn's DIsease. Gastroenterology, 1473-1482.

Friedrich, M. (2002). Immunomodulation by Interleukin-10 Therapy Decreases the Incidence of Relapse and Prolongs the Relapse-free Interval in Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology, 672-677.

Fujii, S.-i. (2001). Interleukin 10 promotes the maintenance of antitumor CD8⁺ T cell effector function in situ. Blood, 2143-2151.

Ghosh, S. (2006). Interferring with interferons in inflammatory bowel diseasse. Gut.

Hsu, D.-H. (1990). Expression of Interleukin-10 Activity by Epstein-Barr Virus Protein BCRF1. Science, 830-832.

Jones, B. C. (2002). Crystal structure of human cytomegalovirus IL-10 bound to soluble human IL-10R1. PNAS, 9404-9409.

Kennedy Norton (2008). IL-10 Suppresses Mast Cell IgE Receptor Expression and Signaling In Vitro and In Vivo. Journal of Immunology, 2848-2854.

Kimple et al (2013). Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Curr. Protoc. Protein Sci., 73:Unit 9.9

Kuhn, R. (1993). Interleukin-10 Deficient Mice Develop Chronic Enterocolitis. Cell, 263-274.

Kundu, N. (1997). Interleukin 10 Inhibits Tumor Metastasis Downregulates MHC Class I and Enhances NK Lysis. Cellualar Immunology, 55-61.

Lauw, F. N. (2000). Proinflammatory Effects of IL-10 During Human Endotoxemia. Journal of Immunology, 2783-2789.

Leach, M. W. (1999). The Role of IL-10 in Inflammatory Bowel DIsease: "Of Mice and Men". Toxicilogic Pathology, 123-133.

Liu, Y. (1997). The EBV IL-10 homologue is a selective agonist with impaired binding to the IL-10 receptor. Journal of Immunology, 604-613.

Maini, R. N. (1997). rHuIL-10 in subjects with active rheumatoid arthritis (RA): A phase I and cytokine response study. Arthritis Rheumatology, 40.

Malefyt, R. d. (1991). Interleukin 10 Inhibits Cytokine Synthesis by Human Monocytes An Autoregulatory Role of IL-10 Produced by Monocytes. J. Exp. Med., 1209-1220.

Malefyt, R. d. (1993). Direct effects of IL-10 on subsets of human CD4 T cell clones and resting T cells - Specific inhibition of IL-2 production and proliferation. Journal of Immunology, 4754-4765.

Minter, R. M. (2001). Adenoviral Delivery of Human and Viral IL-10 in Murine Sepsis. Journal of Immunology, 1053-1-59.

Mumm, J. B. (2011). IL-10 Elicits IFNg Dependent Tumor Immune Surveillance. Cancer Cell, 781-796.

Naing, A. (2016). Safety, Antitumor Activity, and Immune Activation of Pegylated Recombinant Human Interleukin-10 (AM0010) in Patients With Advanced Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology.

Naing, A. (2018). PEGylated IL-10 (Pegilodecakin) Induces Systemic Immune Activation, CD8⁺ T Cell Invigoration and Polyclonal T Cell Expansion in Cancer Patients. Cancer Cell.

Ouyang, P. (2014). IL-10 encoded by viruses: a remarkable example of indepenent acquisition of a cellular gene by viruses and it's subsequent evolution in the viral genome. Journal of General Virology, 245-262.

Salek-Ardakani, S. (2002). Epstein-Barr Virus Encoded Interleukin-10 Inhibits HLA-Class I, ICAM-1, and B7 Expression on Human Monocytes: Implications for Immune Evasion by EBV. Virology, 342-351.

Sasaki, T. (1992). The role of interferon g in the pathogenesis of Crohn's disease. Gastroenterologia Japanica.

Schreiber, S. (2000). Safety and Efficacy of Recombinant Human Interleukin 10 in Chronic Active Crohn's Disease. Gastroenterology, 1461-1472.

Slobedman, B. (2009). Virus-Encoded Homologs of Cellular Interleukin-10 and Their Control of Host Immune Function. Journal of Virology, 9618-9629.

Strober, W. (2011). Pro-Inflammatory Cytokines in the Pathogenesis of IBD. Gastroenterology, 1756-1767.

Thompson-Snipes, L. (1991). Interleukin 10: A Novel Stimulatory Factor for Mast Cells and Their Progenitors. Journal of Experimental Medicine, 507-510.

Tilg, H. (2002). Treatment of Crohn's disease with recombinant human interleukin 10 induces the proinflammatory cytokine interferon gamma. Gut, 191-195.

Vieira, P. (1991). Isolation and expression of human cytokine synthesis inhibitory factor cDNA clones Homology to Epstein Barr virus open reading frame BCRF1. PNAS, 1172-1176.

Yoon, S. I. (2005). Same Structure Different Function Crystal Structure of the Epstein Barr Virus IL-10 Bound to the Soluble IL-10R1 Chain. Structure, 551-564.

Yoon, S. I. (2012). Epstein-Barr Virus IL-10 Engages IL-10R1 by a Two-step Mechanism Leading to Altered Signaling Properties. Journal of Biological Chemistry.

Zheng, L. (1996). Interleukin 10 Inhibits Tumor Metastasis Through an NK Cell-dependent Mechanism. Journal of Experimental Medicine, 579-584.

Zhu, L. (2017). IL-10 and IL-10 Receptor Mutations in Very Early Onset Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology Research, 65-69.

Zigmond, E. (2014). Macrophage-Restricted Interkeukin-10 Receptor Deficiency, but Not IL-10 Deficiency, Causes Severe Spontaneous Colitis. Cell.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DEKA BIOSCIENCES, INC.

<120> ВАРИАНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ IL-10 И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

И ОНКОЛОГИИ

<130> 039451.00022

<140>

<141>

<150> 62/962,332

<151> 2020-01-17

<150> 62/899,504

<151> 2019-09-12

<150> 62/814,669

<151> 2019-03-06

<160> 68

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 178

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val

1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn

<210> 2

<211> 1629

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

acacatcagg ggcttgctct tgcaaaacca aaccacaaga cagacttgca aaagaaggca 60

tgcacagctc agcactgctc tgttgcctgg tcctcctgac tggggtgagg gccagcccag 120

gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg cctaacatgc 180

ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg aaggatcagc 240

tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac ctgggttgcc 300

aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa gctgagaacc 360

aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag accctcaggc 420

tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag gccgtggagc 480

aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc atgagtgagt 540

ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga aactgagaca 600

tcagggtggc gactctatag actctaggac ataaattaga ggtctccaaa atcggatctg 660

gggctctggg atagctgacc cagccccttg agaaacctta ttgtacctct cttatagaat 720

atttattacc tctgatacct caacccccat ttctatttat ttactgagct tctctgtgaa 780

cgatttagaa agaagcccaa tattataatt tttttcaata tttattattt tcacctgttt 840

ttaagctgtt tccatagggt gacacactat ggtatttgag tgttttaaga taaattataa 900

gttacataag ggaggaaaaa aaatgttctt tggggagcca acagaagctt ccattccaag 960

cctgaccacg ctttctagct gttgagctgt tttccctgac ctccctctaa tttatcttgt 1020

ctctgggctt ggggcttcct aactgctaca aatactctta ggaagagaaa ccagggagcc 1080

cctttgatga ttaattcacc ttccagtgtc tcggagggat tcccctaacc tcattcccca 1140

accacttcat tcttgaaagc tgtggccagc ttgttattta taacaaccta aatttggttc 1200

taggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggcgggtg 1260

gatcacttga ggtcaggagt tcctaaccag cctggtcaac atggtgaaac cccgtctcta 1320

ctaaaaatac aaaaattagc cgggcatggt ggcgcgcacc tgtaatccca gctacttggg 1380

aggctgaggc aagagaattg cttgaaccca ggagatggaa gttgcagtga gctgatatca 1440

tgcccctgta ctccagcctg ggtgacagag caagactctg tctcaaaaaa taaaaataaa 1500

aataaatttg gttctaatag aactcagttt taactagaat ttattcaatt cctctgggaa 1560

tgttacattg tttgtctgtc ttcatagcag attttaattt tgaataaata aatgtatctt 1620

attcacatc 1629

<210> 3

<211> 147

<212> Белок

<213> Гаммагерпесвирус 4 человека

<400> 3

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg

145

<210> 4

<211> 632

<212> ДНК

<213> Гаммагерпесвирус 4 человека

<400> 4

tataaatcac ttccctatct caggtaggcc tgcacacctt aggtatggag cgaaggttag 60

tggtcactct gcagtgcctg gtgctgcttt acctggcacc tgagtgtgga ggtacagacc 120

aatgtgacaa ttttccccaa atgttgaggg acctaagaga tgccttcagt cgtgttaaaa 180

cctttttcca gacaaaggac gaggtagata accttttgct caaggagtct ctgctagagg 240

actttaaggg ctaccttgga tgccaggccc tgtcagaaat gatccaattc tacctggagg 300

aagtcatgcc acaggctgaa aaccaggacc ctgaagccaa agaccatgtc aattctttgg 360

gtgaaaatct aaagacccta cggctccgcc tgcgcaggtg ccacaggttc ctgccgtgtg 420

agaacaagag taaagctgtg gaacagataa aaaatgcctt taacaagctg caggaaaaag 480

gaatttacaa agccatgagt gaatttgaca tttttattaa ctacatagaa gcatacatga 540

caattaaagc caggtgataa ttccataccc tggaagcagg agatgggtgc atttcacccc 600

aaccccccct ttcgactgtc atttacaata aa 632

<210> 5

<211> 177

<212> Белок

<213> Бетагерпесвирус 5 человека

<400> 5

Met Leu Ser Val Met Val Ser Ser Ser Leu Val Leu Ile Val Phe Phe

1 5 10 15

Leu Gly Ala Ser Glu Glu Ala Lys Pro Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ile

20 25 30

Lys Asn Thr Lys Pro Gln Cys Arg Pro Glu Asp Tyr Ala Ser Arg Leu

35 40 45

Gln Asp Leu Arg Val Thr Phe His Arg Val Lys Pro Thr Leu Gln Arg

50 55 60

Glu Asp Asp Tyr Ser Val Trp Leu Asp Gly Thr Val Val Lys Gly Cys

65 70 75 80

Trp Gly Cys Ser Val Met Asp Trp Leu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ile

85 90 95

Val Phe Pro Ala Gly Asp His Val Tyr Pro Gly Leu Lys Thr Glu Leu

100 105 110

His Ser Met Arg Ser Thr Leu Glu Ser Ile Tyr Lys Asp Met Arg Gln

115 120 125

Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ser Val Ile Ser Arg Leu Ser

130 135 140

Gln Glu Ala Glu Arg Lys Ser Asp Asn Gly Thr Arg Lys Gly Leu Ser

145 150 155 160

Glu Leu Asp Thr Leu Phe Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Leu His Ser Arg

165 170 175

Lys

<210> 6

<211> 693

<212> ДНК

<213> Бетагерпесвирус 5 человека

<400> 6

atgctgtcgg tgatggtctc ttcctctctg gtcctgatcg tcttttttct aggcgcttcc 60

gaggaggcga agccggcggc gacgacgacg acgataaaga atacaaagcc gcagtgtcgt 120

ccggaggatt acgcgagcag attgcaagat ctccgcgtca cctttcatcg agtaaaacct 180

acgttggtag gtcatgtagg tacggtttat tgcgacggtc tttcttttcc gcgtgtcggg 240

tgacgtagtt ttcctcttgt agcaacgtga ggacgactac tccgtgtggc tcgacggtac 300

ggtggtcaaa ggctgttggg gatgcagcgt catggactgg ttgttgaggc ggtatctgga 360

gatcgtgttc cccgcaggcg accacgtcta tcctggactt aagacggaat tgcatagtat 420

gcgctcgacg ctagaatcca tctacaaaga catgcggcaa tgcgtaagtg tctctgtggc 480

ggcgctgtcc gcgcagaggt aacaacgtgt tcatagcacg ctgttttact tttgtcgggc 540

tcccagcctc tgttaggttg cggagataag tccgtgatta gtcggctgtc tcaggaggcg 600

gaaaggaaat cggataacgg cacgcggaaa ggtctcagcg agttggacac gttgtttagc 660

cgtctcgaag agtatctgca ctcgagaaag tag 693

<210> 7

<211> 178

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 7

Met Pro Gly Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Met

1 5 10 15

Arg Ile Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe

35 40 45

Ser Gln Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile

50 55 60

Leu Leu Thr Asp Ser Leu Met Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Lys His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Arg Met Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser

130 135 140

Asp Phe Asn Lys Leu Gln Asp Gln Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Met Met Ile Lys Met

165 170 175

Lys Ser

<210> 8

<211> 1314

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 8

gggggggggg atttagagac ttgctcttgc actaccaaag ccacaaagca gccttgcaga 60

aaagagagct ccatcatgcc tggctcagca ctgctatgct gcctgctctt actgactggc 120

atgaggatca gcaggggcca gtacagccgg gaagacaata actgcaccca cttcccagtc 180

ggccagagcc acatgctcct agagctgcgg actgccttca gccaggtgaa gactttcttt 240

caaacaaagg accagctgga caacatactg ctaaccgact ccttaatgca ggactttaag 300

ggttacttgg gttgccaagc cttatcggaa atgatccagt tttacctggt agaagtgatg 360

ccccaggcag agaagcatgg cccagaaatc aaggagcatt tgaattccct gggtgagaag 420

ctgaagaccc tcaggatgcg gctgaggcgc tgtcatcgat ttctcccctg tgaaaataag 480

agcaaggcag tggagcaggt gaagagtgat tttaataagc tccaagacca aggtgtctac 540

aaggccatga atgaatttga catcttcatc aactgcatag aagcatacat gatgatcaaa 600

atgaaaagct aaaacacctg cagtgtgtat tgagtctgct ggactccagg acctagacag 660

agctctctaa atctgatcca gggatcttag ctaacggaaa caactccttg gaaaacctcg 720

tttgtacctc tctccgaaat atttattacc tctgatacct cagttcccat tctatttatt 780

cactgagctt ctctgtgaac tatttagaaa gaagcccaat attataattt tacagtattt 840

attattttta acctgtgttt aagctgtttc cattggggac actttatagt atttaaaggg 900

agattatatt atatgatggg aggggttctt ccttgggaag caattgaagc ttctattcta 960

aggctggcca cacttgagag ctgcagggcc ctttgctatg gtgtcctttc aattgctctc 1020

atccctgagt tcagagctcc taagagagtt gtgaagaaac tcatgggtct tgggaagaga 1080

aaccagggag atcctttgat gatcattcct gcagcagctc agagggttcc cctactgtca 1140

tcccccagcc gcttcatccc tgaaaactgt ggccagtttg ttatttataa ccacctaaaa 1200

ttagttctaa tagaactcat ttttaactag aagtaatgca attcctctgg gaatggtgta 1260

ttgtttgtct gcctttgtag cagcatctaa ttttgaataa atggatctta ttcg 1314

<210> 9

<211> 168

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 9

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu

50 55 60

Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln

65 70 75 80

Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu

85 90 95

Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Leu Arg Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys

115 120 125

Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly

130 135 140

Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu

145 150 155 160

Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165

<210> 10

<211> 167

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 10

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Gln Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ala

115 120 125

Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

130 135 140

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165

<210> 11

<211> 167

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 11

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Gln Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ala

115 120 125

Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

130 135 140

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165

<210> 12

<211> 167

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 12

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Gln Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ala

115 120 125

Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

130 135 140

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165

<210> 13

<211> 167

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 13

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Gln Cys Pro Leu Leu Gly Cys Gly Asp Lys Ala

115 120 125

Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

130 135 140

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165

<210> 14

<211> 170

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 14

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys

115 120 125

Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu

130 135 140

Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170

<210> 15

<211> 170

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 15

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys

115 120 125

Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu

130 135 140

Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170

<210> 16

<211> 170

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 16

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys

115 120 125

Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu

130 135 140

Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170

<210> 17

<211> 184

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 17

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe

145 150 155 160

Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170 175

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180

<210> 18

<211> 184

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 18

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe

145 150 155 160

Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170 175

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180

<210> 19

<211> 184

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 19

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe

145 150 155 160

Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170 175

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180

<210> 20

<211> 184

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 20

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala

130 135 140

Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe

145 150 155 160

Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

165 170 175

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180

<210> 21

<211> 192

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 21

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Ser Lys Ala

130 135 140

Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

165 170 175

Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180 185 190

<210> 22

<211> 186

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 22

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile

165 170 175

Arg Asn Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180 185

<210> 23

<211> 178

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 23

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln

20 25 30

Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe

35 40 45

Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu

50 55 60

Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile

65 70 75 80

Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro

85 90 95

Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu

100 105 110

Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys

115 120 125

Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu

130 135 140

Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

165 170 175

Asp Lys

<210> 24

<211> 398

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Gly Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Ser Glu Ile Ser Gly Ala Leu Asp

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn

145 150 155 160

Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu

195 200 205

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro

210 215 220

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp

245 250 255

Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val

260 265 270

Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys

275 280 285

Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu

305 310 315 320

Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn

325 330 335

Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro

340 345 350

Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn

355 360 365

Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile

370 375 380

Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 25

<211> 397

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 25

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly

290 295 300

Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys Lys Tyr

305 310 315 320

Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Leu Ala Pro Val Leu Val Ile

325 330 335

Tyr Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

340 345 350

Ser Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val

355 360 365

Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asp

370 375 380

His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

385 390 395

<210> 26

<211> 398

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Gly Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Ser Glu Ile Ser Gly Ala Leu Asp

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn

145 150 155 160

Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu

195 200 205

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro

210 215 220

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp

245 250 255

Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val

260 265 270

Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys

275 280 285

Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu

305 310 315 320

Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn

325 330 335

Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro

340 345 350

Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn

355 360 365

Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile

370 375 380

Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 27

<211> 397

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 27

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly

290 295 300

Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys Lys Tyr

305 310 315 320

Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Leu Ala Pro Val Leu Val Ile

325 330 335

Tyr Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

340 345 350

Ser Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val

355 360 365

Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asp

370 375 380

His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

385 390 395

<210> 28

<211> 398

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Gly Gly Asn Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Gly Asp Tyr Tyr Ser Glu Ile Ser Gly Ala Leu Asp

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn

145 150 155 160

Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu

195 200 205

Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro

210 215 220

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp

245 250 255

Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val

260 265 270

Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys

275 280 285

Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu

305 310 315 320

Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn

325 330 335

Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro

340 345 350

Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn

355 360 365

Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile

370 375 380

Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 29

<211> 397

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 29

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly

290 295 300

Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Val Leu Pro Lys Lys Tyr

305 310 315 320

Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Leu Ala Pro Val Leu Val Ile

325 330 335

Tyr Glu Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly

340 345 350

Ser Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val

355 360 365

Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Asp

370 375 380

His Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

385 390 395

<210> 30

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<400> 30

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 31

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<400> 31

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 32

<211> 6

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая метка

6xHis

<400> 32

His His His His His His

1 5

<210> 33

<211> 567

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 33

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser

290 295 300

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

305 310 315 320

Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln

325 330 335

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg

340 345 350

Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

355 360 365

Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr

370 375 380

Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr

385 390 395 400

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

405 410 415

Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg

420 425 430

Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys

435 440 445

Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe

450 455 460

Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr

465 470 475 480

Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys

485 490 495

Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg

500 505 510

Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala

515 520 525

Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile

530 535 540

Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala

545 550 555 560

Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 34

<211> 561

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 34

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro

210 215 220

Phe Thr Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Trp Gly Lys Gly

260 265 270

Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

290 295 300

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

305 310 315 320

Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

325 330 335

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Phe Pro Asp

340 345 350

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr

355 360 365

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn

370 375 380

Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

385 390 395 400

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp

405 410 415

Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

420 425 430

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu

435 440 445

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys

450 455 460

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

465 470 475 480

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu

485 490 495

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

500 505 510

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn

515 520 525

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu

530 535 540

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala

545 550 555 560

Arg

<210> 35

<211> 396

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Ser Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Trp Lys Gly Asp Val Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

130 135 140

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile

145 150 155 160

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

165 170 175

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu

195 200 205

Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr

210 215 220

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe

245 250 255

Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr

260 265 270

Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser

275 280 285

Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu

290 295 300

Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln

305 310 315 320

Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys

325 330 335

Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu

340 345 350

Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu

355 360 365

Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile

370 375 380

Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 36

<211> 403

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 36

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Asn

180 185 190

Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe

210 215 220

Thr Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

225 230 235 240

Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

245 250 255

Thr Ser Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Trp Lys Gly Asp Val

260 265 270

Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

290 295 300

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

305 310 315 320

Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

325 330 335

Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly

340 345 350

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro

355 360 365

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

370 375 380

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp

385 390 395 400

Asp Asp Lys

<210> 37

<211> 581

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (193)..(199)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (193)..(199)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (214)..(231)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (214)..(231)

<223> Эта область может охватывать 14-18 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (264)..(274)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (264)..(274)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (329)..(342)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (329)..(342)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (358)..(366)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (358)..(366)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (399)..(409)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (399)..(409)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 37

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly

195 200 205

Leu Glu Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser

225 230 235 240

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr

245 250 255

Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

260 265 270

Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val

275 280 285

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

305 310 315 320

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

325 330 335

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

340 345 350

Arg Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe

355 360 365

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

370 375 380

Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa

385 390 395 400

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

405 410 415

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

420 425 430

Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu

435 440 445

Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu

450 455 460

Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly

465 470 475 480

Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu

485 490 495

Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His

500 505 510

Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg

515 520 525

Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu

530 535 540

Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys

545 550 555 560

Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met

565 570 575

Thr Ile Lys Ala Arg

580

<210> 38

<211> 397

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 38

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Thr Thr

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp Val Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

130 135 140

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn Tyr

145 150 155 160

Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

165 170 175

Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro

195 200 205

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro Tyr

210 215 220

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn

245 250 255

Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys

260 265 270

Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu

275 280 285

Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser

290 295 300

Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn

305 310 315 320

Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu

325 330 335

Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys

340 345 350

Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys

355 360 365

Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe

370 375 380

Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 39

<211> 405

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 39

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

290 295 300

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg

305 310 315 320

Asn Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

325 330 335

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe

340 345 350

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu

355 360 365

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu

370 375 380

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys

385 390 395 400

Asp Asp Asp Asp Lys

405

<210> 40

<211> 569

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 40

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr

290 295 300

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

305 310 315 320

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn Tyr Ile Gly Trp Phe

325 330 335

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

340 345 350

Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

355 360 365

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

370 375 380

Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met

420 425 430

Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln

435 440 445

Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu

450 455 460

Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln

465 470 475 480

Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu

485 490 495

Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg

500 505 510

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser

515 520 525

Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys

530 535 540

Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile

545 550 555 560

Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 41

<211> 399

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Val Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

130 135 140

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg

145 150 155 160

Asn Tyr Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

165 170 175

Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu

195 200 205

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu

210 215 220

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys

245 250 255

Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

260 265 270

Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu

275 280 285

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

290 295 300

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

305 310 315 320

Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu

325 330 335

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

340 345 350

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe

355 360 365

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

370 375 380

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

385 390 395

<210> 42

<211> 401

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 42

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro

290 295 300

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His

305 310 315 320

Thr Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln

325 330 335

Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val

340 345 350

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys

355 360 365

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln

370 375 380

Asn Ile Gln Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

385 390 395 400

Lys

<210> 43

<211> 575

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 43

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro

165 170 175

Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

180 185 190

Ser Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Met Gly Trp Ile Ser Val Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln

210 215 220

Lys Val Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr

225 230 235 240

Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr

245 250 255

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly

260 265 270

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val

290 295 300

Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala

305 310 315 320

Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr Asp Gly Thr

325 330 335

Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu

340 345 350

Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

355 360 365

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

370 375 380

Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn Ile Gln Leu

385 390 395 400

Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys

420 425 430

Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg

435 440 445

Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu

450 455 460

Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala

465 470 475 480

Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala

485 490 495

Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu

500 505 510

Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu

515 520 525

Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe

530 535 540

Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp

545 550 555 560

Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565 570 575

<210> 44

<211> 573

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (193)..(199)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (193)..(199)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (213)..(230)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (213)..(230)

<223> Эта область может охватывать 14-18 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (263)..(273)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (263)..(273)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (321)..(334)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (321)..(334)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (350)..(358)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (350)..(358)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (391)..(401)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (391)..(401)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 44

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly

195 200 205

Leu Glu Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

260 265 270

Xaa Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser

290 295 300

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

305 310 315 320

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe

325 330 335

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa

340 345 350

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

355 360 365

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp

370 375 380

Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

385 390 395 400

Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn

420 425 430

Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys

435 440 445

Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu

450 455 460

Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser

465 470 475 480

Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn

485 490 495

Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu

500 505 510

Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys

515 520 525

Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys

530 535 540

Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe

545 550 555 560

Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565 570

<210> 45

<211> 573

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (193)..(199)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (193)..(199)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (213)..(230)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (213)..(230)

<223> Эта область может охватывать 14-18 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (263)..(273)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (263)..(273)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (321)..(334)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (321)..(334)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (350)..(358)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (350)..(358)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (391)..(401)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (391)..(401)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 45

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly

195 200 205

Leu Glu Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

225 230 235 240

Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

260 265 270

Xaa Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser

290 295 300

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

305 310 315 320

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe

325 330 335

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa

340 345 350

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

355 360 365

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp

370 375 380

Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

385 390 395 400

Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn

420 425 430

Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys

435 440 445

Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu

450 455 460

Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser

465 470 475 480

Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn

485 490 495

Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu

500 505 510

Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys

515 520 525

Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys

530 535 540

Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe

545 550 555 560

Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565 570

<210> 46

<211> 402

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (31)..(37)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (31)..(37)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (52)..(62)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (52)..(62)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (95)..(105)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (95)..(105)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (150)..(163)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (150)..(163)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (179)..(187)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (179)..(187)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (220)..(230)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (220)..(230)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 46

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

50 55 60

Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa

85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

115 120 125

Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg

195 200 205

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr

245 250 255

Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala

260 265 270

Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn

275 280 285

Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly

290 295 300

Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met

305 310 315 320

Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser

325 330 335

Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His

340 345 350

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys

355 360 365

Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser

370 375 380

Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys

385 390 395 400

Ala Arg

<210> 47

<211> 409

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (192)..(198)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (192)..(198)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (213)..(223)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (213)..(223)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (256)..(266)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (256)..(266)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (311)..(324)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (311)..(324)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (340)..(348)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (340)..(348)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (381)..(391)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (381)..(391)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 47

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Xaa

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

195 200 205

Glu Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg

210 215 220

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu

225 230 235 240

Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa

245 250 255

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp

260 265 270

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

275 280 285

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

290 295 300

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

305 310 315 320

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

325 330 335

Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp

340 345 350

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr

355 360 365

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa

370 375 380

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

405

<210> 48

<211> 402

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (31)..(37)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (31)..(37)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (52)..(62)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (52)..(62)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (95)..(105)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (95)..(105)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (150)..(163)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (150)..(163)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (179)..(187)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (179)..(187)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (220)..(230)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (220)..(230)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 48

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

50 55 60

Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa

85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

115 120 125

Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg

195 200 205

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr

245 250 255

Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala

260 265 270

Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn

275 280 285

Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly

290 295 300

Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met

305 310 315 320

Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn Ser

325 330 335

Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His

340 345 350

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys

355 360 365

Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser

370 375 380

Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys

385 390 395 400

Ala Arg

<210> 49

<211> 409

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (192)..(198)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (192)..(198)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (213)..(223)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (213)..(223)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (256)..(266)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (256)..(266)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (311)..(324)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (311)..(324)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (340)..(348)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (340)..(348)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (381)..(391)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (381)..(391)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 49

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Xaa

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

195 200 205

Glu Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg

210 215 220

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu

225 230 235 240

Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa

245 250 255

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp

260 265 270

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

275 280 285

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

290 295 300

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

305 310 315 320

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

325 330 335

Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp

340 345 350

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr

355 360 365

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa

370 375 380

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

405

<210> 50

<211> 402

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (31)..(37)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (31)..(37)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (52)..(62)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (52)..(62)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (95)..(105)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (95)..(105)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (150)..(163)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (150)..(163)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (179)..(187)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (179)..(187)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (220)..(230)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (220)..(230)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 50

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Val

50 55 60

Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa Xaa

85 90 95

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp Gly

100 105 110

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile

115 120 125

Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

130 135 140

Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg

195 200 205

Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

210 215 220

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr

245 250 255

Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala

260 265 270

Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn

275 280 285

Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly

290 295 300

Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met

305 310 315 320

Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser

325 330 335

Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His

340 345 350

Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys

355 360 365

Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser

370 375 380

Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys

385 390 395 400

Ala Arg

<210> 51

<211> 409

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (192)..(198)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (192)..(198)

<223> Эта область может охватывать 3-7 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (213)..(223)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (213)..(223)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (256)..(266)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (256)..(266)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (311)..(324)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (311)..(324)

<223> Эта область может охватывать 9-14 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (340)..(348)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (340)..(348)

<223> Эта область может охватывать 5-9 остатков

<220>

<221> Модифицированный остаток

<222> (381)..(391)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> Прочий признак

<222> (381)..(391)

<223> Эта область может охватывать 7-11 остатков

<220>

<223> См.поданное описание для подробного описания замен и предпочтительных

вариантов осуществления

<400> 51

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Xaa

180 185 190

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

195 200 205

Glu Trp Ile Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg

210 215 220

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu

225 230 235 240

Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Xaa

245 250 255

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Lys Gly Asp Val Trp

260 265 270

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

275 280 285

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

290 295 300

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

305 310 315 320

Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

325 330 335

Leu Ile Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Phe Pro Asp

340 345 350

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr

355 360 365

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa Xaa

370 375 380

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

385 390 395 400

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

405

<210> 52

<211> 569

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 52

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Thr Thr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Glu Val Asn Tyr Ser Gly Asn Ala Asn Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Arg Ile Arg Ser His Ile Ala Tyr Ser Trp Lys Gly Asp

260 265 270

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr

290 295 300

Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

305 310 315 320

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Pro Arg Asn Tyr Ile Gly Trp Phe

325 330 335

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

340 345 350

Ser Arg Ala Ala Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

355 360 365

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala

370 375 380

Met Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asp Arg Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met

420 425 430

Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln

435 440 445

Thr Lys Asp Glu Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu

450 455 460

Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln

465 470 475 480

Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu

485 490 495

Ile Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg

500 505 510

Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser

515 520 525

Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys

530 535 540

Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile

545 550 555 560

Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 53

<211> 563

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид

<400> 53

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro

210 215 220

Phe Thr Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Trp Gly Lys Gly

260 265 270

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr

290 295 300

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

305 310 315 320

Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

325 330 335

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Phe

340 345 350

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

355 360 365

Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln

370 375 380

Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

385 390 395 400

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

405 410 415

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

420 425 430

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

435 440 445

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

450 455 460

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

465 470 475 480

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

485 490 495

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

500 505 510

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

515 520 525

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

530 535 540

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

545 550 555 560

Lys Ala Arg

<210> 54

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид

<400> 54

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 55

<211> 147

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок DV05

<400> 55

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ala Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg

145

<210> 56

<211> 441

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота DV05

<220>

<221> Прочий признак

<222> (225)..(225)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 56

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag ctggacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg aggcnaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag a 441

<210> 57

<211> 147

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок DV06

<400> 57

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg

145

<210> 58

<211> 441

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота DV06

<220>

<221> Прочий признак

<222> (93)..(93)

<223> n представляет собой a, c, g, или t

<400> 58

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag gtngacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg agatcaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag a 441

<210> 59

<211> 147

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Белок DV07

<400> 59

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg

145

<210> 60

<211> 441

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота DV07

<400> 60

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag ctggacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg agatcaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag a 441

<210> 61

<211> 565

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант 1 DEboDV07

<400> 61

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser

210 215 220

Leu Lys Gly Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

260 265 270

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

305 310 315 320

Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile Gly Trp Phe Gln Gln Lys Pro

325 330 335

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Arg Ala Ala

340 345 350

Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

355 360 365

Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys

370 375 380

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

385 390 395 400

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu

420 425 430

Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu

435 440 445

Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly

450 455 460

Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu

465 470 475 480

Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His

485 490 495

Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg

500 505 510

Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu

515 520 525

Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys

530 535 540

Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met

545 550 555 560

Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 62

<211> 1698

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота вариант 1 DEboDV07

<400> 62

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag ctggacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg agatcaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag aggcggcgga ggatctggcg gaggtggaag cggaggcggt 480

ggatctcagg ttcagttgca gcaatggggc gctggcctgc tgaagccttc tgagacactg 540

tctctgacct gcgccgtgtc cggcttctct ctgaccaatt acggcgtgaa ctggattcgg 600

cagcctcctg gcaaaggcct ggaatggatc ggagtgattt ggagcggcgg caacaccgac 660

tacaacccca gtctgaaggg cagagtggcc atctccgtgg acacctccaa gaaccagttc 720

tccctgagac tgaactccgt gaccgccgct gataccgcca tctactactg tgctagagcc 780

ctgacctact acgactacga gttcgcctat tggggcaagg gcaccaccgt gactgttagt 840

agtggtggtg gcggtagtgg cggaggcggc tcaggcggtg gtggatctga aatcgtgatg 900

acccagtctc ctggcactct gtctctgtct cccggcgaga gagctaccct gtcttgtaga 960

gcctctcagt ccatcggcac caacatcggc tggttccagc agaagcctgg acaggctccc 1020

cggctgctga ttaagtacgc ctctgagaga gccgctggct tccctgacag attctccggc 1080

tctggctctg gcaccgactt caccctgacc atcaccagac tggaacccga ggacttcgct 1140

atgtactact gccagcagaa caacaactgg cccaccacct ttggccaggg caccaagctg 1200

gaaatcaaag gtggcggtgg ttcaggtggc ggaggaagcg gcggaggcgg atctacagat 1260

cagtgtgaca attttcccca aatgctgagg gatctgcggg acgccttcag ccgggtcaag 1320

acattttttc agacaaagga tgaactcgat aacctcttgc tcaaagagag cctgctcgag 1380

gactttaagg gatatctggg atgccaggct ctgagcgaaa tgattcagtt ttatctcgag 1440

gaagtcatgc ctcaagcaga gaaccaggat ccagagatta aggatcatgt gaatagcctc 1500

ggggagaacc tcaagacact gagactccgg ctgagaagat gccaccggtt tctgccttgt 1560

gaaaacaaaa gcaaggctgt cgagcagatt aagaatgctt ttaacaaact ccaagaaaaa 1620

gggatctata aggctatgtc tgagtttgat atctttatca attatatcga agcttatatg 1680

actattaagg cccggtag 1698

<210> 63

<211> 565

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант 2 DEboDV07

<400> 63

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro

210 215 220

Phe Thr Ser Arg Val Ala Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ser Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

260 265 270

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

305 310 315 320

Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro

325 330 335

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

340 345 350

Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

355 360 365

Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys

370 375 380

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

385 390 395 400

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu

420 425 430

Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu

435 440 445

Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly

450 455 460

Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu

465 470 475 480

Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His

485 490 495

Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg

500 505 510

Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu

515 520 525

Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys

530 535 540

Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met

545 550 555 560

Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 64

<211> 1770

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, вариант 2 DEboDV07

<400> 64

gctagcgccg ccaccatggg atggtctttg atcctgctgt tcctggtggc cgtggctacc 60

agagtgcatt ctaccgacca gtgcgacaac ttccctcaga tgctgcggga cctgagagat 120

gccttctcca gagtgaaaac attcttccag accaaggacg agctggacaa cctgctgctg 180

aaagagtccc tgctggaaga tttcaagggc tacctgggct gtcaggccct gtccgagatg 240

atccagttct acctggaaga agtgatgccc caggccgaga atcaggaccc cgagatcaag 300

gaccacgtga actccctggg cgagaacctg aaaaccctgc ggctgagact gcggcggtgc 360

cacagatttc tgccctgcga gaacaagtcc aaggccgtgg aacagatcaa gaacgccttc 420

aacaagctgc aagagaaggg catctacaag gccatgagcg agttcgacat cttcatcaac 480

tacatcgagg cctacatgac catcaaggcc agaggcggcg gaggatctgg cggaggtgga 540

agcggaggcg gtggatctca ggttcagttg cagcaatggg gcgctggcct gctgaagcct 600

tctgagacac tgtctctgac ctgcgccgtg tacggcttct ccctgaccaa ttatggcgtg 660

cactggatca gacagcctcc aggcaaaggc ctggaatgga tcggagtgat ttggagcggc 720

ggcaacaccg actacaacac ccctttcacc tctagagtgg ccatctccgt ggacacctcc 780

aagaaccagt tcagcctgag actgaactcc gtgaccgccg ctgataccgc catctactac 840

tgcacctccg ctctgaccta ctacgactac gagttcgcct actggggcaa gggcaccaca 900

gtgactgtta gtagtggtgg cggaggtagc ggtggtggtg gtagtggcgg tggcggatct 960

gagatcgtga tgacccaatc tcctggcact ctgtctctgt ctcccggcga gagagctacc 1020

ctgtcttgta gagcctctca gtccatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 1080

ggacaggccc ctagactgct gatctactac gcctccgaga gcatcagcgg cttccctgac 1140

agattctccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga caatcacccg gctggaacct 1200

gaggacttcg ctatgtacta ctgccagcag aacaacaact ggcccaccac ctttggccag 1260

ggcaccaagc tggaaatcaa aggcggaggc ggcagtggcg gcggtggctc cggcggaggc 1320

ggatctacag atcagtgtga caattttccc caaatgctga gggatctgcg ggacgccttc 1380

agccgggtca agacattttt tcagacaaag gatgaactcg ataacctctt gctcaaagag 1440

agcctgctcg aggacttcaa aggatatctg ggatgccagg ctctgagcga aatgattcag 1500

ttttatctcg aggaagtcat gccacaagca gagaaccagg atccagagat taaggatcat 1560

gtgaatagcc tcggggagaa cctcaagaca ctgagactcc ggctgagaag atgccaccgg 1620

tttctgcctt gtgaaaacaa aagcaaggct gtcgagcaga ttaagaatgc ttttaacaaa 1680

ctccaagaaa aagggatcta taaggctatg tctgagtttg atatctttat caattatatc 1740

gaagcttata tgactattaa ggcccggtag 1770

<210> 65

<211> 565

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант 3 DEboDV07

<400> 65

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro

210 215 220

Phe Thr Ser Arg Val Ala Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

260 265 270

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

305 310 315 320

Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

325 330 335

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

340 345 350

Gly Phe Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

355 360 365

Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys

370 375 380

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

385 390 395 400

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu

420 425 430

Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu

435 440 445

Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly

450 455 460

Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu

465 470 475 480

Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His

485 490 495

Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg

500 505 510

Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu

515 520 525

Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys

530 535 540

Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met

545 550 555 560

Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 66

<211> 1698

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, вариант 3 DEboDV07

<400> 66

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag ctggacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg agatcaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag aggcggcgga ggatctggcg gaggtggaag cggaggcggt 480

ggatctcagg ttcagttgca gcaatggggc gctggcctgc tgaagccttc tgagacactg 540

tctctgacct gcgccgtgta cggcttctcc ctgaccaatt atggcgtgca ctggatcaga 600

cagcctccag gcaaaggcct ggaatggctg ggagtgattt ggagcggcgg caacaccgac 660

tacaacaccc ctttcacctc tagagtggcc atctccaagg acaactccaa gaaccaggtg 720

tccctgagac tgaactccgt gaccgctgcc gataccgcca tctactactg tgctagagcc 780

ctgacctact acgactacga gttcgcctat tggggcaagg gcaccaccgt gactgttagt 840

agtggtggtg gcggtagtgg cggaggcggc tcaggcggtg gtggatctga aattgtgctg 900

acccagtctc ctggcactct gtctttgagc cctggcgaga gagctaccct gtcctgtaga 960

gcctctcagt ccatcggcac caacatccac tggtatcagc agaagcctgg acaggcccct 1020

cggctgctga ttaagtacgc ctccgagtcc atcagcggct tccctgacag attctccggc 1080

tctggctctg gcaccgactt caccctgaca atcacccggc tggaacctga ggacttcgct 1140

atgtactact gccagcagaa caacaactgg cccaccacct ttggccaggg caccaagctg 1200

gaaatcaaag gtggcggtgg ttcaggtggc ggaggaagcg gcggaggcgg atctacagat 1260

cagtgtgaca attttcccca aatgctgagg gatctgcggg acgccttcag ccgggtcaag 1320

acattttttc agacaaagga tgaactcgat aacctcttgc tcaaagagag cctgctcgag 1380

gacttcaaag gatatctggg atgccaggct ctgagcgaaa tgattcagtt ttatctcgag 1440

gaagtcatgc ctcaagcaga gaaccaggat ccagagatta aggatcatgt gaatagcctc 1500

ggggagaacc tcaagacact gagactccgg ctgagaagat gccaccggtt tctgccttgt 1560

gaaaacaaaa gcaaggctgt cgagcagatt aagaatgctt ttaacaaatt gcaagaaaaa 1620

gggatctata aggctatgtc tgagtttgat atctttatca attatatcga agcttatatg 1680

actattaagg cccggtag 1698

<210> 67

<211> 565

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант 4 DEboDV07

<400> 67

Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu Leu Asp

20 25 30

Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu

35 40 45

Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val

50 55 60

Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His Val Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys

85 90 95

His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile

100 105 110

Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met

115 120 125

Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile

130 135 140

Lys Ala Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro

165 170 175

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr

180 185 190

Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

195 200 205

Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro

210 215 220

Phe Thr Ser Arg Val Ala Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val

225 230 235 240

Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly

260 265 270

Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

290 295 300

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg

305 310 315 320

Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

325 330 335

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser

340 345 350

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

355 360 365

Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys

370 375 380

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

385 390 395 400

Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln Met Leu Arg Asp Leu

420 425 430

Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Glu

435 440 445

Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly

450 455 460

Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu

465 470 475 480

Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Glu Ile Lys Asp His

485 490 495

Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg

500 505 510

Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu

515 520 525

Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys

530 535 540

Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met

545 550 555 560

Thr Ile Lys Ala Arg

565

<210> 68

<211> 1695

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, вариант 4 DEboDV07

<400> 68

accgaccagt gcgacaactt ccctcagatg ctgcgggacc tgagagatgc cttctccaga 60

gtgaaaacat tcttccagac caaggacgag ctggacaacc tgctgctgaa agagtccctg 120

ctggaagatt tcaagggcta cctgggctgt caggccctgt ccgagatgat ccagttctac 180

ctggaagaag tgatgcccca ggccgagaat caggaccccg agatcaagga ccacgtgaac 240

tccctgggcg agaacctgaa aaccctgcgg ctgagactgc ggcggtgcca cagatttctg 300

ccctgcgaga acaagtccaa ggccgtggaa cagatcaaga acgccttcaa caagctgcaa 360

gagaagggca tctacaaggc catgagcgag ttcgacatct tcatcaacta catcgaggcc 420

tacatgacca tcaaggccag aggcggcgga ggatctggcg gaggtggaag cggaggcggt 480

ggatctcagg ttcagttgca gcaatggggc gctggcctgc tgaagccttc tgagacactg 540

tctctgacct gcaccgtgtc cggcttctcc ctgaccaatt atggcgtgca ctgggtccga 600

cagcctccag gcaaaggatt ggaatggctg ggagtgattt ggagcggcgg caacaccgac 660

tacaacaccc ctttcacctc tagagtggcc atctccaagg acaactccaa gaaccaggtg 720

tccctgagac tgaactccgt gaccgctgcc gataccgcca tctactactg tgctagagcc 780

ctgacctact acgactacga gttcgcctat tggggcaagg gcaccaccgt gactgttagt 840

agtggtggtg gcggtagtgg cggaggcggc tcaggcggtg gtggatctga aattgtgctg 900

acccagtctc ctggcactct gtctttgagc cctggcgaga gagctaccct gtcctgtaga 960

gcctctcagt ccatcggcac caacatccac tggtatcagc agaagcctgg acaggcccct 1020

cggctgctga ttaagtacgc ctccgagtcc atcagcggca tccctgacag attctccggc 1080

tctggctctg gcaccgactt caccctgaca atcacccggc tggaacctga ggacttcgcc 1140

gactactact gccagcagaa caacaactgg cccaccacct ttggccaggg caccaagctg 1200

gaaatcaaag gtggcggtgg ttcaggtggc ggaggaagcg gcggaggcgg atctacagat 1260

cagtgtgaca attttcccca aatgctgagg gatctgcggg acgccttcag ccgggtcaag 1320

acattttttc agacaaagga tgaactcgat aacctcttgc tcaaagagag cctgctcgag 1380

gacttcaaag gatatctggg atgccaggct ctgagcgaaa tgattcagtt ttatctcgag 1440

gaagtcatgc ctcaagcaga gaaccaggat ccagagatta aggatcatgt gaatagcctc 1500

ggggagaacc tcaagacact gagactccgg ctgagaagat gccaccggtt tctgccttgt 1560

gaaaacaaaa gcaaggctgt cgagcagatt aagaatgctt ttaacaaatt gcaagaaaaa 1620

gggatctata aggctatgtc tgagtttgat atctttatca attatatcga agcttatatg 1680

actattaagg cccgg 1695

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к слитым белкам интерлейкина 10 (IL-10) и способу лечения злокачественной опухоли. Предложен слитый белок Формулы (I-VII): IL-10-L¹-X¹-L¹-X²-L¹-IL-10 (Формула I); (Z)_n-X¹-L²-Y²-L¹-IL-10 (Формула II); IL-10-L¹-Y¹-L²-X²-(Z)_n (Формула III); X1-L²-X²-L¹-IL-10 (Формула IV); IL-10-L¹-X¹-L²-X² (Формула V); X¹-L¹-IL-10 (Формула VI); и IL-10-L¹-X² (Формула VII). «IL-10» представляет собой мономерную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3, 14, 15, 16, 18, 19, 55, 57 или 59. «L¹» и «L²» представляют собой линкеры. «X¹» и «X²» представляют собой области VH и VL, полученные из первого антитела. «Y¹» и «Y²» представляют собой области VH и VL, полученные из второго антитела. «Z» представляет собой цитокин. Изобретения обеспечивают создание агонистов рецептора IL-10 с измененной аффинностью связывания с рецептором IL-10 и/или измененными междоменными углами в IL-10, которые можно использовать для лечения злокачественной опухоли. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 21 ил., 7 пр.

1. Слитый белок Формулы (I-VII), являющийся агонистом рецептора IL-10,

IL-10-L¹-X¹-L¹-X²-L¹-IL-10 (Формула I);

(Z)_n-X¹-L²-Y²-L¹-IL-10 (Формула II);

IL-10-L¹-Y¹-L²-X²-(Z)_n (Формула III);

X¹-L²-X²-L¹-IL-10 (Формула IV);

IL-10-L¹-X¹-L²-X² (Формула V);

X¹-L¹-IL-10 (Формула VI); и

IL-10-L¹-X² (Формула VII);

где

«IL-10» представляет собой мономерную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 3, 14, 15, 16, 18, 19, 55, 57 или 59;

«L¹» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 31 или 54;

«L²» представляет собой линкер из SEQ ID NO: 30;

«X¹» представляет собой область VH, полученную из первого антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; ловушке TGFβ; MadCam, субъединице β7 интегрину; интегрину α4β7; интегрину α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; ВИЧ или Эбола;

«X²» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и X1;

«Y¹» представляет собой область VH, полученную из второго антитела, специфичного к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR); CD52; различным мишеням иммунных контрольных точек, таким как, но не ограничиваясь ими, PD-L1, PD-1, TIM3, BTLA, LAG3 или CTLA4; CD20; CD47; GD-2; HER2; EpCAM; ICAM (ICAM-1, -2, -3, -4, -5), VCAM, FAPα; 5Т4; Trop2; EDB-FN; ловушке TGFβ; MadCam, субъединице β7 интегрина; интегрину α4β7; интегрину α4 SR-A1; SR-A3; SR-A4; SR-A5; SR-A6; SR-B; dSR-C1; SR-D1; SR-E1; SR-F1; SR-F2; SR-G; SR-H1; SR-H2; SR-I1; SR-J1; ВИЧ или Эбола;

«Y²» представляет собой область VL, полученную из того же антитела, что и Y1;

где X и Y получены из одного или разных антител;

«Z» представляет собой цитокин, выбранный из IL-6, IL-4, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-15, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, GM-CSF, G-CSF, интерферонов -α, -β, -γ, TGF- β, или фактора некроза опухоли -α, -β, основного FGF, EGF, PDGF, IL-4, IL-11 или IL-13;

«n» представляет собой целое число, выбранное из 0-2.

2. Слитый белок по п. 1, где Формулы II и III способны к образованию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул II и III способен к формированию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

3. Слитый белок по п. 2, где Формула II представляет собой SEQ ID NO: 24, 26, 28, 41, 48, или 50.

4. Слитый белок по п. 2, где Формула III представляет собой SEQ ID NO: 25, 27, 29, 42, 49, или 51.

5. Слитый белок по п. 2, где комплекс слитых белков образован между SEQ ID NO: 24 и 25; 26 и 27; 28 и 29; 41 и 42; 48 и 49; или 50 и 51.

6. Слитый белок по п. 1, где Формулы IV и V способны к образованию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул IV и V способен к формированию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

7. Слитый белок по п. 6, где Формула IV представляет собой SEQ ID NO: 35, 38, 46, 48 или 50.

8. Слитый белок по п. 6, где Формула V представляет собой SEQ ID No: 36, 39, 47, 49 или 51.

9. Слитый белок по п. 6, где комплекс слитых белков образован между SEQ ID NO: 35 и 36; 38 и 39; 46 и 47; 48 и 49; или 50 и 51.

10. Слитый белок по п. 1, где Формулы VI и VII способны к образованию комплекса слитых белков, где мономер IL-10 из каждой из Формул VI и VII способен к формированию функционального гомодимерного IL-10 или его варианта.

11. Слитый белок по п. 1, где Формула I представляет собой SEQ ID NO: 33, 34, 40, 43, 44, 45, 52 или 53.

12. Слитый белок по п. 1, где «n» ≥1 и Z представляет собой IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 или любое их сочетание.

13. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей слитый белок по п. 1.

14. Способ по п. 13, где слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 28, 29, 35, 36, 38, 39, 46, 47, 52, 53, 61, 63, 65 или 67.

15. Способ по п. 14, где слитый белок образует белковый комплекс, и белковый комплекс образован между SEQ ID NO: 28 и 29; 35 и 36; 38 и 39; или 46 и 47.

16. Способ по п. 13, где слитый белок содержит IL-10, состоящий из DV07, который представляет собой SEQ ID NO: 59.

17. Способ по п. 16, где слитый белок представляет собой SEQ ID NO: 26, 27, 41, 42, 48 или 49.