АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ МНОГОМОДУЛЬНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2021 года по МПК C12N15/10 C12N9/22 C12M3/00 C12M1/26 C12M1/42 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США 62/527,339, “Automated Editing of Nucleic Acids Within a Cell”, поданной 30 июня 2017 г.; заявке на патент США 62/551,069, “Electroporation Cuvettes for Automation”, поданной 28 августа 2017 г.; заявке на патент США 62/566,374, “Electroporation Device”, поданной 30 сентября 2017 г.; заявке на патент США 62/566,375, “Electroporation Device”, поданной 30 сентября 2017 г.; заявке на патент США 62/566,688, “Introduction of Exogenous Materials into Cells”, поданной 2 октября 2017 г.; заявке на патент США 62/567,697, “Automated Nucleic Acid Assembly and Introduction of Nucleic Acids into Cells”, поданной 3 октября 2017 г.; заявке на патент США 62/620,370, “Automated Filtration and Manipulation of Viable Cells”, поданной 22 января 2018 г.; заявке на патент США 62/649,731, “Automated Control of Cell Growth Rates for Induction and Transformation”, поданной 29 марта 2018 г.; заявке на патент США 62/671,385, “Automated Control of Cell Growth Rates for Induction and Transformation”, поданной 14 мая 2018 г.; заявке на патент США 62/648,130, “Genomic Editing in Automated Systems”, поданной 26 марта 2018 г.; заявке на патент США 62/657,651, “Combination Reagent Cartridge and Electroporation Device”, поданной 13 апреля 2018 г.; заявке на патент США 62/657,654, “Automated Cell Processing Systems Comprising Cartridges”, поданной 13 апреля 2018 г.; и заявке на патент США 62/689,068, “Nucleic Acid Purification Protocol for Use in Automated Cell Processing Systems”, поданной 20 июня 2018. Все указанные выше заявки включены в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки во всех отношениях.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] В описании ниже некоторые статьи и способы приведены для ознакомления в качестве справочной информации. Ничто из содержащегося в настоящем описании не должно быть истолковано как «признание» уровня техники. Заявитель оставляет за собой право продемонстрировать, где это уместно, что статьи и способы, упомянутые в настоящем описании, не представляют собой уровень техники в соответствии с применимым законодательством.

[0003] Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз является способом, который позволяет вносить изменения в нуклеиновые кислоты в геноме живого организма. Некоторые нуклеазы создают сайт-специфические двухцепочечные разрывы в целевых областях в геноме, которые могут быть восстановлены путем присоединения негомологичного конца или по механизму гомологичной рекомбинации, что приводит к целевым изменениям. Однако эти способы не поддавались автоматизации из-за низкой эффективности и проблем, связанных с трансформацией клеток, измерением роста и отбором клеток. Более того, традиционные настольные устройства не всегда можно масштабировать и интегрировать соответствующим образом в автоматизированную модульную систему. Таким образом, способы и системы для создания популяций отредактированных клеток остаются громоздкими, и проблемы, связанные с выполнением множества циклов редактирования с помощью рекурсивных методов, ограничивают природу и сложность клеточных популяций, которые могут быть созданы.

[0004] Таким образом, существует потребность в автоматизированных инструментах, системах и способах для введения собранных нуклеиновых кислот и других биологических молекул в живые клетки в автоматическом режиме, при котором отредактированные клетки можно использовать для дальнейших экспериментов за пределами этого автоматизированного инструмента.

СУЩНОСТЬ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В некоторых вариантах осуществления автоматизированные способы используются для направляемого нуклеазой редактирования генома одной или более целевых областей генома во множестве клеток, причем способы выполняются в автоматизированных многомодульных инструментах для редактирования клеток. Эти способы могут быть использованы для создания библиотек, представляющих интерес живых клеток с нужными изменениями генома. Автоматизированные способы, осуществляемые с помощью описанных в настоящей заявке автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток, могут быть использованы с различными направляемыми нуклеазой способами редактирования генома с использованием одного или более селективных маркеров или без них.

[0006] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к модулям, инструментам и системам для автоматизированного многомодульного редактирования клеток, включая направляемое нуклеазой редактирование генома. Другие конкретные варианты осуществления автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению разработаны для рекурсивного редактирования генома, например, для последовательного введения множества правок в геномы внутри одной или более клеток в клеточной популяции посредством двух или более операций редактирования, выполняемых внутри этих инструментов.

[0007] Таким образом, в настоящем описании представлены варианты осуществления автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, содержащего: корпус, выполненный с возможностью размещения всех или некоторых модулей; емкость, выполненную с возможностью приема клеток; одну или более емкостей, выполненных с возможностью приема нуклеиновых кислот; модуль трансформации, выполненных с возможностью введения нуклеиновых кислот в клетки; модуль восстановления, выполненный с возможностью восстановления клеток после трансформации клеток в модуле трансформации; модуль редактирования, выполненный с возможностью редактирования нуклеиновых кислот в клетке с помощью нуклеиновых кислот, введенных в эту клетку; и процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводе данных пользователем и/или выборе пользователем соответствующего скрипта контроллера.

[0008] В некоторых аспектах одна или более емкостей для нуклеиновых кислот содержат остов и редактирующую кассету, и автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток дополнительно содержит модуль сборки нуклеиновых кислот. В некоторых аспектах модуль сборки нуклеиновых кислот содержит магнит, и в некоторых аспектах модуль сборки нуклеиновых кислот выполнен с возможностью осуществления сборки с помощью одной изотермической реакции. В других аспектах модуль сборки нуклеиновой кислоты выполнен с возможностью выполнения способа амплификации и/или лигирования.

[0009] В некоторых аспектах автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток модуль редактирования и модуль восстановления объединены.

[0010] В некоторых аспектах автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток может дополнительно содержать модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток, и в некоторых вариантах осуществления модуль для выращивания измеряет оптическую плотность растущих клеток либо непрерывно, либо через некоторые интервалы времени. В некоторых вариантах осуществления процессор выполнен с возможностью настройки условий для выращивания в модуле для выращивания таким образом, чтобы клетки достигали целевой оптической плотности в момент времени, запрошенный пользователем. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления пользователь может обновить параметры, относящиеся к процессу выращивания.

[0011] В некоторых аспектах автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток содержит картридж с реагентами, причем внутри картриджа с реагентами содержатся емкость, выполненная с возможностью приема клеток, и одна или более емкостей, выполненных с возможностью приема нуклеиновых кислот. Кроме того, картридж с реагентами может также содержать некоторые или все реагенты, необходимые для редактирования клеток. В некоторых вариантах осуществления реагенты, содержащиеся в картридже с реагентами, обнаруживают с помощью скрипта, считываемого процессором, и в некоторых вариантах осуществления картридж с реагентами включает реагенты и предоставляется в наборе.

[0012] В некоторых аспектах модуль трансформации автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток содержит устройство электропорации; и в некоторых вариантах осуществления устройство электропорации представляет собой проточное устройство электропорации.

[0013] Некоторые аспекты автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток дополнительно содержат модуль фильтрации, выполненный с возможностью замены жидкостей и/или концентрации клеток. В определенных аспектах система фильтрации также может быть использована для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными.

[0014] В других вариантах осуществления предоставляется автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток, содержащий корпус, выполненный с возможностью размещения некоторых или всех модулей; емкость, выполненную с возможностью приема клеток; по меньшей мере одну емкость, выполненную с возможностью приема остова нуклеиновой кислоты и редактирующей кассеты; модуль сборки нуклеиновых кислот, выполненный с возможностью а) сборки остова и редактирующей кассеты и b) обессоливания собранных нуклеиновых кислот после сборки; модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток и измерения оптической плотности (OD) клеток; модуль фильтрации, выполненный с возможностью концентрировать клетки и делать клетки электрокомпетентными; модуль трансформации, содержащий проточный электропоратор для введения собранных нуклеиновых кислот в клетки; комбинированный модуль восстановления и редактирования, выполненный с возможностью восстановления клеток после электропорации в модуле трансформации и с возможностью редактирования нуклеиновых кислот в клетках с помощью собранных нуклеиновых кислот; и процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводе данных пользователем и/или выборе пользователем соответствующего скрипта контроллера.

[0015] В некоторых вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток предоставляет картридж с реагентами, содержащий несколько емкостей для реагентов, проточное устройство электропорации и скрипт, считываемый процессором для дозирования реагентов, расположенных в нескольких емкостях для реагентов, и управления проточным устройством электропорации.

[0016] В некоторых аспектах модуль для выращивания включает вращающийся флакон для выращивания с регулируемой температурой, силовой узел для вращения флакона, спектрофотометр для измерения, например, OD во флаконе, и процессор для приема вводимых пользователем данных и контроля скорости роста клеток. Модуль для выращивания может автоматически измерять величину OD растущих клеток во вращающемся флаконе для выращивания непрерывно или через заданные интервалы времени и контролировать рост клеток до заданного значения OD и заданного момента времени, которые указаны пользователем. Таким образом, способы и устройства, описанные в настоящей заявке, обеспечивают петлю обратной связи, которая отслеживает рост клеток в режиме реального времени и регулирует температуру вращающегося флакона для выращивания в режиме реального времени для достижения целевого значения OD в заданное время, указанное пользователем.

[0017] В некоторых аспектах автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток модуль трансформации содержит проточное устройство электропорации, содержащее впускное отверстие и впускной канал для введения образца клеток и собранных нуклеиновых кислот в проточное устройство электропорации; выходное отверстие и выходной канал для вывода образца электропорированных клеток из проточного устройства электропорации; проточный канал, пересекающий впускной канал и выпускной канал и расположенный между ними; и два или более электрода, которые расположены в проточном канале между точкой пересечения проточного канала с первым входным каналом и точкой пересечения проточного канала с выходным каналом, находятся в жидкостном соединении с образцом клеток в проточном канале, и которые выполнены с возможностью приложения электрического импульса или электрических импульсов к образцу клеток. В определенных аспектах проточное устройство электропорации может содержать два или более параллельно расположенных проточных канала.

[0018] Также предлагаются системы для использования автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток для осуществления операций редактирования генома внутри клеток. Эти системы необязательно могут включать один или более интерфейсов между инструментом и другими устройствами или емкостями для приготовления клеток, приготовления нуклеиновых кислот, отбора популяций отредактированных клеток, функционального анализа популяций отредактированных клеток, хранения популяций отредактированных клеток и т.п.

[0019] Кроме того, предлагаются способы использования автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток. В некоторых способах электрокомпетентные клетки подают непосредственно в инструмент предпочтительно с нужной оптической плотностью, которые переносят в модуль трансформации. В некоторых способах клетки переносят в модуль для выращивания, где их выращивают до требуемого значения оптической плотности. Затем клетки переносят из флакона для выращивания в модуль фильтрации, где их концентрируют и, необязательно, делают их электрокомпетентными. Затем клетки переносят в модуль трансформации.

[0020] В некоторых аспектах кассеты собранных нуклеиновых кислот вводят непосредственно в инструмент и переносят в модуль трансформации. В некоторых аспектах нуклеиновые кислоты, такие как остов вектора и одну или более редактирующих олигонуклеотидных кассет, переносят в модуль сборки нуклеиновых кислот либо одновременно, либо последовательно с введением или приготовлением клеток. В этом аспекте нуклеиновые кислоты собирают, обессоливают (например, путем замены жидкости или осмоса) и переносят в модуль трансформации для электропорации, чтобы сделать клетки электрокомпетентными. Электропорация или трансфекция происходит в модуле трансформации, затем клетки переносят в модуль восстановления/редактирования, который необязательно включает отбор клеток, содержащих одну или более геномных правок. После восстановления/редактирования/отбора клетки могут быть извлечены и использованы непосредственно для исследования или сохранены для дальнейшего исследования, или может быть выполнен другой цикл (или множество циклов) редактирования генома путем повторения этапов редактирования внутри инструмента.

[0021] Также предлагаются библиотеки клеток, созданные с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, предназначенного для направляемого нуклеазой редактирования генома, причем инструмент содержит: корпус; емкость, выполненную с возможностью приема клеток и одной или более рационально сконструированных нуклеиновых кислот, содержащих последовательности, облегчающие совершение события направляемого нуклеазой редактирования генома в клетках; модуль трансформации для введения нуклеиновой кислоты(кислот) в клетки; модуль редактирования, обеспечивающий события направляемого нуклеазой редактирования генома в клетках, и процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводимых пользователем данных, причем события направляемого нуклеазой редактирования генома генерируются автоматизированным инструментом, в результате чего создается библиотека клеток, содержащая отдельные клетки с рационально разработанными правками.

[0022] В некоторых аспектах библиотека клеток содержит библиотеку клеток, полученную методом насыщающего мутагенеза. В некоторых аспектах библиотека клеток содержит библиотеку клеток с заменой промотора. В других аспектах библиотека клеток содержит библиотеку клеток с заменой терминатора. В других аспектах библиотека клеток содержит библиотеку клеток с заменой единичного нуклеотидного полиморфизма (SNP). В других аспектах библиотека клеток содержит библиотеку клеток с заменой промотора.

[0023] В некоторых вариантах осуществления библиотека содержит, по меньшей мере, 100000 отредактированных клеток, а в других вариантах осуществления библиотека содержит по меньшей мере 1000000 отредактированных клеток.

[0024] В некоторых вариантах осуществления направляемое нуклеазой редактирование генома представляет собой RGN-направляемое редактирование генома. В предпочтительном аспекте инструмент выполнен с возможностью использования индуцибельной нуклеазы. Нуклеаза может быть, например, химически индуцируемой, индуцируемой вирусом, индуцируемой светом, температурой или теплом.

[0025] В некоторых вариантах осуществления инструмент обеспечивает мультиплексное редактирование генома множества клеток за один цикл. В некоторых аспектах инструмент способен обеспечить редактирование гена как минимум 5 клеток за один цикл. В других аспектах инструмент способен обеспечить редактирование гена по меньшей мере 100 клеток за один цикл. В других аспектах инструмент способен обеспечить редактирование гена по меньшей мере 1000 клеток за один цикл. В других аспектах инструмент способен обеспечить редактирование гена по меньшей мере 10000 клеток за один цикл. В конкретных аспектах автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток способны обеспечить редактирование генома по меньшей мере 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴ или более клеток за один цикл.

[0026] Количество участков в геноме в клеточной популяции, которые могут быть предназначены для редактирования в одном цикле, может составлять от 2 до 10000000.

[0027] В некоторых вариантах осуществления, которые включают рекурсивное редактирование, автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток обеспечивает введение двух или более правок генома в клетках, причем в одном цикле в геномы клеток в популяции добавляется одна геномная правка. Соответственно, некоторые аспекты автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению полезны для последовательного осуществления двух или более правок на клетку в клеточной популяции за цикл, трех или более правок на клетку в клеточной популяции, пяти или более правок на клетку в клеточной популяции, или 10 или более правок на клетку за один цикл в клеточной популяции.

[0028] В конкретных вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток обеспечивает эффективность редактирования по меньшей мере 10% клеток, вводимых в модуль редактирования, за один цикл, предпочтительно эффективность редактирования по меньшей мере 20% клеток, вводимых в модуль редактирования, за один цикл, более предпочтительно эффективность редактирования по меньшей мере 25% клеток, вводимых в модуль редактирования, за один цикл, еще более предпочтительно эффективность редактирования по меньшей мере 30% клеток, вводимых в модуль редактирования автоматизированного многомодульного инструмента, за один цикл, еще более предпочтительно эффективность редактирования по меньшей мере 40% клеток, вводимых в модуль редактирования, за один цикл и еще более предпочтительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более клеток, вводимых в модуль редактирования, за один цикл.

[0029] Другие особенности, преимущества и аспекты более подробно описаны ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0030] Прилагаемые чертежи, включенные в описание и являющиеся его частью, иллюстрируют один или более вариантов осуществления и вместе с описанием поясняют эти варианты осуществления. Прилагаемые чертежи не обязательно выполнены в масштабе. Любые значения, размеры, показанные на прилагаемых графиках и чертежах, служат только для иллюстрации и могут представлять, или нет, действительные или предпочтительные значения или размеры. В случаях, где это применимо, некоторые или все признаки могут быть не показаны для упрощения описания базовых признаков. На чертежах:

[0031] На фиг. 1А и 1В приведены виды сверху и в перспективе иллюстративного варианта осуществления автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток для мультиплексированного редактирования генома множества клеток с использованием сменного картриджа(ей), входящего в состав инструмента.

[0032] На фиг. 2А и 2В приведены виды сбоку и спереди автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, показанного на фиг. 1А и 1В.

[0033] На фиг. 2C и 2D показан второй пример шасси автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[0034] На фиг. 3А-3С показаны виды сбоку, в разрезе и в перспективе примера модуля промывки и/или концентрации клеток для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0035] На фиг. Фиг.4 показан пример комбинированных модуля сборки нуклеиновых кислот и модуля очистки для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0036] На фиг. 5А показан пример встроенного модуля электропорации для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0037] На фиг. 5B и 5C показан пример одноразового проточного модуля электропорации для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0038] На фиг. 6А-6В показан пример промывочного картриджа для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0039] На фиг. 6C-6E показан пример картриджа с реагентами для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0040] На фиг. 7А-7С представлена функциональная блок-схема и два вида в перспективе примера модуля фильтрации для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0041] На фиг. 7D представлен вид в перспективе примера фильтрующего картриджа для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

[0042] На фиг. 8A-8F показаны примеры модулей для выращивания клеток для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для редактирования.

[0043] На фиг. 9 представлена схема последовательности операций примера способа автоматизированной многомодульной обработки клеток.

[0044] На фиг. 10А представлена блок-схема первого примера рабочего процесса автоматизированной обработки бактериальных клеток с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[0045] На фиг. 10B представлена блок-схема второго примера рабочего процесса автоматизированной обработки бактериальных клеток с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[0046] На фиг. 10С представлена блок-схема примера рабочего процесса автоматизированной обработки дрожжевых клеток с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[0047] На фиг. 11 показан пример графического пользовательского интерфейса для предоставления инструкций и получения обратной связи от автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[0048] На фиг. 12А показана схема основных функциональных блоков другого иллюстративного варианта осуществления автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток для мультиплексного редактирования генома множества клеток.

[0049] На фиг. 12B показана схема основных функциональных блоков другого иллюстративного варианта осуществления автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток для рекурсивного, мультиплексированного редактирования генома множества клеток.

[0050] На фиг. 13 показан пример системы управления для использования в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0051] Описание, приведенное ниже в комбинации с прилагаемыми чертежами, предназначено для описания различных иллюстративных вариантов осуществления раскрытого объекта изобретения. Конкретные признаки и функциональные возможности описаны в отношении каждого иллюстративного варианта осуществления; однако специалистам в данной области техники будет очевидно, что раскрытые варианты осуществления могут быть реализованы на практике без каждого из этих конкретных признаков и функциональных возможностей.

[0052] Для практической реализации описанных в настоящей заявке методов можно использовать методы, описанные в Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual; Bowtell and Sambrook (2003), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis; Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; and Green and Sambrook, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London; Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; and Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.; каждый из этих документов включен в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.

[0053] Следует отметить, что используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также включают множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное. Так, например, указание «олиго» относится к одному или более олигонуклеотидам, выполняющим одну и ту же функцию, а «способы» включает ссылку на эквивалентные этапы и способы, известные специалистам в данной области, и так далее. Другими словами, если в явном виде не указано иное, используемое в настоящем описании единственное число подразумевает «один или более». Кроме того, следует понимать, что такие термины, как «левый», «правый», «верхний», «нижний», «передний», «задний», «боковой», «высота», «длина», «ширина», «выше», «ниже», «внутренний», «внешний», «внутри», «вне», которые могут использоваться в настоящем описании, просто описывают точки отсчета и не обязательно ограничивают варианты осуществления настоящего изобретения какой-либо конкретной ориентацией или конфигурацией. Кроме того, такие термины, как «первый», «второй», «третий» и т.д., просто идентифицируют одну из нескольких частей, компонентов, этапов, операций, функций и/или точек отсчета, указанных в настоящем описании, и аналогично не ограничивают варианты осуществления настоящего изобретения какой-либо конкретной конфигурацией или ориентацией.

[0054] Кроме того, термины «примерный», «приблизительный», «малый» и аналогичные термины обычно относятся к диапазонам, которые в некоторых вариантах осуществления включают определенное значение в пределах 20%, 10% или предпочтительно 5% и любые значения между ними.

[0055] Если не указано иное, все технические и научные термины, которые используются в настоящей заявке, имеют те же значения, как их обычно понимают специалисты в соответствующей области техники, к которой относится настоящее изобретению.

[0056] Все публикации (включая патенты, опубликованные заявки и непатентную литературу), упомянутые в настоящем описании, включены в качестве ссылки во всех отношениях, включая, без ограничения, для описания и раскрытия устройств, систем и способов, которые могут быть использованы или могут быть модифицированы применительно к описанным в настоящей заявке способам, модулям, приборам и системам.

[0057] В тех случаях, когда предоставляется диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределами этого диапазона и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в объем изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов, которые независимо могут быть включены в меньшие диапазоны, также входят в объем изобретения, с учетом любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает одно или оба предела, диапазоны, исключающие оба предела включенных пределов, также включены в объем изобретения.

[0058] Встречающееся в описании указание «один из вариантов осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанная в отношении варианта осуществления включена по меньшей мере в один из вариантов осуществления раскрытого объекта изобретения. Таким образом, появление фраз «в одном из вариантов осуществления» или «в варианте осуществления» в различных местах описания не обязательно относится к одному и тому же варианту осуществления.

[0059] Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим способом в одном или более вариантах осуществления. Также подразумевается, что варианты осуществления раскрытого объекта изобретения включают его модификации и варианты.

Введение и обзор

[0060] В выбранных вариантах осуществления автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток, системы и способы, описанные в настоящей заявке, могут использоваться для мультиплексного редактирования генома в живых клетках, а также в способах конструирования библиотек отредактированных клеточных популяций. Описанные в настоящей заявке автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток могут использоваться с различными методами редактирования генома, в частности направляемого нуклеазой редактирования генома. Автоматические многомодульные инструменты для редактирования клеток по настоящему изобретению предоставляют новые способы введения последовательностей нуклеиновых кислот, нацеленных на геномные участки, для редактирования генома живых клеток, включая способы создания библиотек, содержащих различные классы геномных правок в кодирующих областях, некодирующих областях или и тех, и других. Автоматические многомодульные инструменты для редактирования клеток особенно подходят для введения правок в геном множества клеток за один цикл, тем самым генерируя библиотеки клеток, имеющих одну или более правок в геноме, в автоматическом мультиплексном режиме. Автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток также подходят для введения двух или более правок, например, правок в различных геномных целевых участках в геноме в отдельных клетках клеточной популяции. Независимо от количества, эти правки генома предпочтительно являются рационально разработанными правками; т.е. нуклеиновыми кислотами, которые спроектированы и созданы для внесения определенных правок в целевые области в геноме клетки. Последовательности, используемые для генерации событий редактирования генома, включают последовательности, которые позволяют управлять нуклеазным расщеплением, введением правок в представляющую интерес область генома и/или и тем, и другим. Эти последовательности также могут включать правку в области генома клетки, позволяющее отслеживать конкретную рационально разработанную правку в геноме клетки. Такие способы введения правок в клетки описаны, например, в патенте США 9982278, “CRISPR enabled multiplexed genome engineering”, Gill et al., и патенте США 10017760, заявке на патент 15/632222, “Methods for generating barcoded combinatorial libraries”, Gill et al.

[0061] Предполагается, что такие нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды (или «олиго») включают, без ограничения, полимерную форму нуклеотидов, которые могут иметь различную длину, включая либо дезоксирибонуклеотиды, либо рибонуклеотиды или их аналоги. Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, используемые в иллюстративных вариантах осуществления, могут быть модифицированы в одном или более положениях для улучшения стабильности модификации, введенной во время химического синтеза, или последующей ферментативной модификации, или копирования при помощи полимеразы. Эти модификации включают, без ограничения, введение в олигомер одной или более алкилированных нуклеиновых кислот, закрытых нуклеиновых кислот (LNA), пептидо-нуклеиновых кислот (PNA), фосфонатов, фосфотиоатов. Примеры модифицированных нуклеотидов включают, без ограничения, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодоурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеуозин, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-D46-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, урацил-5-оксиуксусной кислоты метиловый эфир, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), 5-метил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил, (acp3)w и 2,6-диаминопурин. Молекулы нуклеиновой кислоты также могут быть модифицированы в основном фрагменте, сахарном фрагменте или фосфатном остове.

Направляемое нуклеазой редактирование генома

[0062] В выбранных вариантах осуществления в автоматизированных многомодульных инструментах для редактирования клеток, описанных в настоящей заявке, используется система направляемого нуклеазой редактирования генома. Существует множество различных систем на основе нуклеаз для редактирования генома организма, и каждая из них может использоваться либо в отдельных системах редактирования, либо в системах последовательного редактирования (например, при последовательном использовании различных направляемых нуклеазой систем для внесения двух или более правок в геном клетки) и/или в рекурсивных системах редактирования (например, при использовании одной направляемой нуклеазой системы для введения двух или более правок в геном клетки). В настоящей заявке описаны примеры систем направляемого нуклеазой редактирования генома, хотя после ознакомления с настоящим описанием специалисту в данной области техники будет понятно, что в автоматизированных многомодульных инструментах для редактирования клеток, приведенных в иллюстративных вариантах осуществления, также могут использоваться другие системы направляемого нуклеазой редактирования.

[0063] Следует отметить, что в раскрытых в настоящей заявке автоматизированных системах могут использоваться нуклеазы для расщепления генома и введения правки в целевую область генома с помощью инструмента по изобретению.

[0064] В конкретных аспектах иллюстративных вариантов осуществления нуклеазная система редактирования является индуцибельной системой, которая позволяет контролировать время редактирования. Индуцибельная система может включать индуцибельную экспрессию нуклеазы, индуцибельную экспрессию редактирующих нуклеиновых кислот или и то, и другое. Способность модулировать активность нуклеазы может уменьшить расщепление вне целевого участка и облегчить точную инженерию генома. С автоматизированными многомодульными инструментами для редактирования клеток по настоящему изобретению можно использовать множество различных индуцибельных систем, что станет очевидным специалисту в данной области техники после изучения настоящего раскрытия.

[0065] В некоторых аспектах расщепление нуклеазой с помощью автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток, представленных в иллюстративных вариантах осуществления, также можно использовать для отбора клеток с геномной правкой в целевой области. Например, автоматизированные многомодульные инструменты и системы для редактирования клеток, приведенные в иллюстративных вариантах осуществления, позволяют осуществить отбор клеток, которые были подвергнуты геномному редактированию, в результате которого произошло удаление сайта распознавания конкретной нуклеазой (например, путем гомологичной рекомбинации), путем воздействия на клетки нуклеазой после такого редактирования. ДНК в клетках без редактирования генома будет расщепляться, что приведет к ограниченному росту и/или гибели таких клеток, в то время как клетки, которые получили правку генома, удаляющую сайт узнавания нуклеазой, не будут затронуты последующим воздействием нуклеазы.

[0066] Если клетка или популяция клеток содержит ДНК, кодирующую управляемую нуклеиновой кислотой нуклеазу и которая индуцируется молекулой-индуктором, нуклеаза будет экспрессироваться только в присутствии молекулы-индуктора. Альтернативно, если клетка или популяция клеток содержит ДНК, кодирующую нуклеазу, управляемую нуклеиновой кислотой, которая репрессируется молекулой-репрессором, нуклеаза будет экспрессироваться только в отсутствие молекулы-репрессора.

[0067] Например, описаны индуцибельные системы редактирования с помощью РНК-управляемой нуклеазы, в которых используется химическая индукция для ограничения временного воздействия на клетки РНК-управляемой нуклеазы. (Публикация заявки на патент США 2015/0291966 A1, Zhang et al., «Inducible DNA Binding Proteins and Genome Perturbation Tools and Applications Thereof», поданная 23 января 2015 года; см. также индуцибельные лентивирусные векторы экспрессии, доступные в Horizon/Dharmacon, Lafayette, CO. Дополнительные методы см., например, в Campbell, Targeting protein function: the expanding toolkit for conditional disruption, Biochem J., 473(17):2573-2589 (2016).

[0068] В других примерах для индукции редактирования генов в клетках может быть использована индуцируемая вирусом нуклеаза. См., например, Dong, Establishment of a highly efficient virus-inducible CRISPR/Cas9 system in insect cells, Antiviral Res., 130:50-7 (2016). В другом примере для индуцибельной экспрессии направляемых нуклеиновой кислотой нуклеаз варианты могут включаться и выключаться в клетках млекопитающих с помощью 4-гидрокситамоксифена (4-НТ) через слияние нуклеазы с гормон-связывающим доменом рецептора эстрогена (ERT2). (Liu, et al., Nature Chemical Biology, 12: 980-987 (2016), и см. публикацию международной заявки на патент WO 2017/078631 A1, Tan, «Chemical-Inducible Genome Engineering Technology», поданную 7 ноября 2016 года.

[0069] Кроме того, разработан ряд систем контроля регуляции генов для контролируемой экспрессии генов в клетках, как прокариотических, так и эукариотических. Эти системы включают контролируемую тетрациклином систему активации транскрипции (Tet-On/Tet-Off, Clontech, Inc. (Palo Alto, CA), индуцибельную систему Lac Switch (патент США № 4833080, Brent et al., «Regulation of eucaryotic gene expression»), индуцируемую экдизоном систему экспрессии генов (No et al., Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice, PNAS, 93(8):3346-3351 (1996)) и систему переключения генов с помощью кумата (Mullick, et al., The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells, BMC Biotechnology, 6:43 (2006)).

[0070] Клетки, которые можно редактировать с помощью автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток, описанных в иллюстративных вариантах осуществления, включают любую прокариотическую, археальную или эукариотическую клетку. Например, прокариотические клетки для использования с иллюстративными вариантами осуществления настоящего изобретения могут быть грамположительными бактериальными клетками, например Bacillus subtilis, или грамотрицательными бактериальными клетками, например клетками E.coli. Эукариотические клетки для использования с автоматизированными многомодульными инструментами для редактирования клеток, приведенными в иллюстративных вариантах осуществления, включают любые клетки растений и любые клетки животных, например, клетки грибов, клетки насекомых, клетки амфибий, клетки нематод или клетки млекопитающих.

Редактирование генома с помощью нуклеазы с цинковыми пальцами

[0071] В выбранных вариантах осуществления автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток выполняют редактирование генома с помощью нуклеазы с цинковыми пальцами. Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) представляют собой искусственные ферменты рестрикции, полученные путем слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с ДНК-разрезающим доменом. Домены цинкового пальца могут быть сконструированы для областей в геноме организма, специфических в отношении мишени. (Urnov et al., Nature Reviews Genetics, 11:636-646 (2010); публикация международной заявки на патент WO 2003/087341 A2, Carroll et al., «Targeted Chromosomal Mutagenesis Using Zinc Finger Nucleases», поданная 22 января. 2003). Используя эндогенные механизмы репарации ДНК в организме, ZFN могут быть использованы для точного изменения целевой области генома. ZFN могут быть использованы для отключения доминантных мутаций у гетерозиготных индивидуумов через создание двухцепочечных разрывов («DSB») в ДНК в мутантном аллеле, которые в отсутствие гомологичной матрицы будут восстановлены негомологичным соединением концов (NHEJ). NHEJ восстанавливает DSB, соединяя два конца вместе и обычно не генерирует мутации, при условии, что разрез является чистым и несложным. (Durai et al., Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells, Nucleic Acids Res., 33(18):5978-90 (2005)). Этот механизм репарации может быть использован для индуцирования ошибок в геноме посредством вставок/делеций или хромосомной перестройки, что часто дает нефункциональные генные продукты, кодируемыми в этом участке.

[0072] Альтернативно, ДНК может быть введена в геном в присутствии экзогенных двухцепочечных фрагментов ДНК с помощью гомологичной репарации (HDR). Для репарации DSB можно использовать зависимость HDR от гомологичной последовательности, вставляя нужную последовательность в последовательность, которая является гомологичной фланкирующим последовательностям DSB, что, при ее использовании системой HDR в качестве матрицы, обеспечит нужное изменение в представляющей интерес области генома.

[0073] Также можно использовать множество пар ZFN для полного удаления цельных больших сегментов геномной последовательности (см. Lee et al., Genome Res., 20 (1):81-9 (2009) и публикацию заявки на патент США 2011/0082093 А1, Gregory et al., «Methods and Compositions for Treating Trinucleotide Repeat Disorders», поданную 28 июля 2010 г.). Удлиненные тракты CAG/CTG-повторов являются генетической основой для более чем дюжины наследственных неврологических расстройств, включая болезнь Хантингтона, миотоническую дистрофию и несколько видов спиноцеребеллярной атаксии. На клетках человека было продемонстрировано, что ZFN могут направлять DSB на CAG-повторы и укорачивать патологическую длину этих повторов до более коротких и менее токсичных (см. Mittelman, et al., Zinc-finger directed double-strand breaks within CAG repeat tracts promote repeat instability in human cells, PNAS USA, 106 (24): 9607-12 (2009); и публикацию заявки на патент США 2013/0253040 A1, Miller et al., «Methods and Compositions for Treating Huntington’s Disease», поданную 28 февраля. 2013).

Редактирование генома с помощью мегануклеазы

[0074] В выбранных вариантах осуществления автоматизированное многомодульное редактирование клеток, модули, инструменты и системы, описанные в настоящей заявке, выполняют редактирование генома с помощью мегануклеазы. Мегануклеазы были идентифицированы в 1990-х годах, и последующая работа показала, что они являются особенно многообещающими инструментами для редактирования генома, поскольку способны эффективно индуцировать гомологичную рекомбинацию, генерировать мутации в кодирующих или некодирующих областях генома и изменять рамки считывания кодирующих участков геномов. (См., например, Epinat, et al., A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in eukaryotic cells, e.g., yeast and mammalian cells, Nucleic Acids Research, 31(11): 2952-2962; и патент США № 8,921,332, Choulika et al., «Chromosomal Modification Involving the Induction of Double-stranded DNA Cleavage and Homologous Recombination at the Cleavage Site», выданный 30 декабря 2014 г.). Высокая специфичность мегануклеаз обеспечивает высокую степень точности и делает их значительно менее токсичными для клеток по сравнению с другими природными ферментами рестрикции.

Редактирование с помощью эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции

[0075] В выбранных вариантах осуществления модули, автоматизированные многомодульные инструменты и системы для редактирования клеток, описанные в настоящей заявке, выполняют редактирование с помощью эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции. Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции, (TALEN) представляют собой ферменты рестрикции, которые могут быть сконструированы для разрезания определенных последовательностей ДНК. Их получают путем слияния ДНК-связывающего домена эффектора TAL с ДНК-разрезающим доменом (нуклеазой, которая разрезает нити ДНК). Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции, (TALEN) могут быть сконструированы так, чтобы они связывались практически с любой требуемой последовательностью ДНК, поэтому при объединении с нуклеазой ДНК может быть разрезана в конкретных местах. (См., например, A TALE nuclease architecture for efficient genome editing, Nature Biotechnology, 29 (2): 143-8 (2011); Boch, Nature Biotech., TALEs of genome targeting, 29(2):135-6 (2011); публикация международной заявки на патент WO 2010/079430 А1, Bonas et al., «Modular DNA-binding Domains and Methods of Use», поданная 12 января 2010 г.; публикация международной заявки на патент WO 2011/072246 A2, Voytas et al., «TAL Effector-Mediated DNA Modification», поданная 10 декабря 2010 г.).

[0076] Подобно ZFN, TALEN могут редактировать геномы, индуцируя DSB. Созданные TALEN сайт-специфические DSB в целевых участках восстанавливаются через NHEJ или HDR, что приводит к целевым изменениям генома. TALEN могут быть использованы для введения вставок/делеций, перегруппировок или для введения ДНК в геном через NHEJ в присутствии экзогенных двухцепочечных фрагментов ДНК.

Редактирование с помощью РНК-направляемой нуклеазы (RGN)

[0077] В некоторых аспектах при редактировании генома с помощью автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток, описанных в иллюстративных вариантах осуществления, используются методы, основанные на регулярно расположенных коротких палиндромных кластерных повторах (CRISPR), в которых для редактирования конкретных целевых областей в геноме организма используются РНК-направляемые нуклеазы (RGN). Путем доставки в клетку RGN в комплексе с синтетической направляющей РНК (gРНК) геном клетки можно разрезать в нужном месте, обеспечивая редактирование целевого участка генома. Направляющая РНК помогает белкам RGN распознавать и разрезать ДНК в целевой области генома. Путем манипулирования нуклеотидной последовательностью направляющей РНК можно запрограммировать систему RGN на нацеливание на любую последовательность ДНК для ее расщепления.

[0078] Система RGN, используемая с автоматизированными многомодульными инструментами для редактирования клеток, описанными в иллюстративных вариантах осуществления, может выполнять редактирование генома с помощью любой системы РНК-управляемой нуклеазы и способна как вырезать, так и осуществлять вставку в нужной целевой области генома. В некоторых аспектах в системе РНК-направляемой нуклеазы могут использоваться две отдельные молекулы РНК в качестве gРНК, например, CRISPR РНК (crРНК) и транс-активирующая CRISPR РНК (tracrРНК). В других аспектах, gРНК может представлять собой отдельную gРНК, которая включает как последовательности crРНК, так и последовательность tracrРНК.

[0079] В некоторых аспектах редактирование генома включает как введение требуемого изменения ДНК в целевую область, так и удаление области мотива протоспейсера (PAM) из целевой области, таким образом предотвращая любое дополнительное редактирование генома в этой целевой области, например при воздействии РНК-управляемой нуклеазы в комплексе с синтетической gРНК, комплементарной целевой области. В этом аспекте первое событие редактирования может представлять собой, например, RGN-направляемое событием редактирования или событие гомологичной рекомбинации, и клетки, имеющие нужную правку, могут быть отобраны с помощью RGN в комплексе с синтетической gРНК, комплементарной целевой области. Клетки, которые не подверглись первому событию редактирования, будут разрезаны, и, таким образом, не выживут при соответствующих критериях отбора. Клетки, содержащие нужную мутацию, не будут разрезаны, поскольку они больше не будут содержать необходимый сайт PAM, и будут продолжать расти и размножаться в автоматизированном многомодульном инструменте для редактирования клеток.

[0080] Когда белковая система RGN используется для селекции, в первую очередь требуется разрезающая активность; таким образом, РНК-направляемая нуклеазная белковая система либо может быть той же самой, что и используемая для редактирования, либо может быть белковой системой RGN, которая эффективна при разрезании с использованием конкретного сайта PAM, но не обязательно эффективна при редактировании этого сайта. Одним из важных аспектов нуклеазы, используемой для отбора, является распознавание сайта PAM, который заменяется с помощью подхода редактирования предыдущей операции редактирования генома.

Редактирование генома с помощью гомологичной рекомбинации

[0081] В других аспектах при редактировании генома с помощью автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток, описанных в иллюстративных вариантах осуществления, могут использоваться способы гомологичной рекомбинации, включая метод cre-lox и метод FRET. Сайт-специфическая гомологичная рекомбинация отличается от общей гомологичной рекомбинации тем, что короткие специфические последовательности ДНК, которые необходимы для распознавания рекомбиназой, являются единственными сайтами, в которых происходит рекомбинация. При сайт-специфической рекомбинации требуется, чтобы специализированные рекомбиназы распознавали эти сайты и катализировали рекомбинацию в этих сайтах. Показано, что несколько сайт-специфических рекомбинационных систем, полученных на основе бактериофагов и дрожжей, каждая из которых содержит рекомбиназу и специфические родственные сайты, работают в эукариотических клетках с целью интеграции в ДНК и, следовательно, применимы для использования в настоящем изобретении; к ним относятся бактериофаг P1 Cre/lox, дрожжевая система FLP-FRT и система Dre семейства тирозиновых сайт-специфических рекомбиназ. Такие системы и способы их использования описаны, например, в патентах США 7422889; 7112715; 6956146; 6774279; 5677177; 5885836; 5654182; и 4959317, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки как описывающие методы использования таких рекомбиназ. Известно, что другие системы семейства тирозинов, такие как интеграза Int бактериофага лямбда, интеграза HK2022, а также системы, принадлежащие к отдельному семейству сериновых рекомбиназ, такие как бактериофаг phiC31, интегразы R4Tp901, работают в клетках млекопитающих через использование соответствующих им сайтов рекомбинации и также применимы для использования в настоящем изобретении. Типичные методы гомологичной рекомбинации описаны в патентах США 6688910; 6204061; 5631153; 5627059; 5487992; и 5464764, каждый из которых включен в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.

Архитектура инструмента

[0082] На фиг. 1А и 1В показан пример автоматизированного многомодульного инструмента 100 для обработки клеток, в котором используются исходные материалы на основе картриджа (например, реагенты, ферменты, нуклеиновые кислоты, промывочные растворы и т.д.). Например, инструмент 100 может быть выполнен в виде настольного прибора для использования в лабораторных условиях. Инструмент 100 может включать набор элементов многократного и однократного использования для выполнения различных поэтапных операций при проведении автоматизированного расщепления и/или редактирования генома в клетках. Исходные материалы на основе картриджа, например, могут быть расположены в специально отведенных местах на платформе 102 инструмента 100, доступных для роботизированного инструмента 108 подачи. Как показано на фиг. 1B, платформа 102 может включать защитную выемку, такую что загрязняющие вещества, которые проливаются, капают или переливаются из любого модуля инструмента 100, будут находиться за выступом защитной выемки.

[0083] Как показано на фиг. 1А, в некоторых вариантах осуществления инструмент 100 включает картридж 104 с реагентами для ввода образцов ДНК и других исходных материалов в инструмент 100, промывочный картридж 106 для ввода элюента и других исходных материалов в инструмент 100 и роботизированную систему 108 подачи для переноса материалов между модулями (например, модулями 110a, 110b и 110c), гнезда для картриджей (например, гнездами для картриджей 104 и 106) и блоками хранения (например, блоками 112, 114, 116 и 118) инструмента 100 для осуществления автоматизированного расщепления и/или редактирования генома. После завершения процесса подачи 106 клеток, в некоторых вариантах осуществления клеточный продукт может быть перенесен роботизированным инструментом 108 подачи в блок хранения или емкость, размещенную, например, в картридже 104 с реагентами, или промывочный картридж 106 для временного хранения и последующего извлечения.

[0084] Роботизированная система 108 подачи, например, может включать поршневой насос 120 для переноса жидкостей из различных источников материалов в картриджах 104, 106 в различные модули 110 и в блок хранения, который может представлять собой емкость в картридже 104 с реагентами, или в промывочный картридж 106. В других вариантах осуществления роботизированная система 108 подачи может включать головку захвата и размещения (не показана) для переноса контейнеров с исходными материалами (например, пробирки или флаконов) из картриджа 104 с реагентами и/или промывочного картриджа 106 в различные модули 110. В некоторых вариантах осуществления одна или более камер или других оптических датчиков (не показаны) подтверждают правильное перемещение и положение роботизированного устройства подачи вдоль гентри 122.

[0085] В некоторых вариантах осуществления в роботизированной системе 108 подачи используются одноразовые наконечники для переноса, предусмотренные в источнике 116 наконечников для переноса (например, в стойке с наконечниками для дозаторов), для переноса исходных материалов, реагентов (например, сборки нуклеиновой кислоты) и клеток внутри инструмента 100. Например, использованные наконечники 116 для переноса могут сбрасываться в блок 112 для твердых отходов. В некоторых вариантах осуществления блок 112 для твердых отходов содержит сбрасыватель для удаления пробирок, наконечников, флаконов и/или фильтров с головки захвата и размещения роботизированной системы 108 подачи. Например, как показано, роботизированная система 108 подачи включает головку 124 для захвата фильтра.

[0086] В некоторых вариантах осуществления инструмент 100 включает кюветы электропоратора с сиппером, которые соединены с поршневым насосом 120. В некоторых вариантах осуществления клетки и реагент аспирируют в кювету электропорации через сиппер, и кювету перемещают в сторону одного или более модулей 110 инструмента 100.

[0087] В некоторых вариантах осуществления инструмент 100 находится под управлением системы 126 обработки, такой как система 1310 обработки, показанная на фиг. 13. Система 126 обработки может быть выполнена с возможностью обеспечения работы инструмента 100 на основе введенных пользователем данных. Например, ввод данных пользователем в инструмент 100 может осуществляться через управляющий дисплей 128 с сенсорным экраном. Система 126 обработки может управлять синхронизацией, продолжительностью, температурой и другими операциями различных модулей 110 инструмента 100. Как показано на фиг. 1B, система 126 обработки может быть подключена к источнику 150 питания для обеспечения работы инструмента 100.

[0088] Возвращаясь к фиг. 1А, картридж 104 с реагентами, как показано, включает шестнадцать резервуаров (матрица из 5×3 резервуаров плюс дополнительный резервуар) и проточный модуль трансформации (устройство электропорации) 110с. Промывочный картридж 106 может быть выполнен с возможностью размещения больших пробирок или резервуаров для хранения, например, промывочных растворов или растворов, которые часто используются во время итеративного процесса. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления промывочный картридж 106 может включать несколько небольших пробирок, флаконов или резервуаров для хранения меньших объемов, например, исходных сред, а также емкость или хранилище для отредактированных клеток. Например, промывочный картридж 106 может быть выполнен с возможностью оставаться на месте в случае последовательного использования и замены двух или более картриджей 104 с реагентами. Хотя картридж 104 с реагентами и промывочный картридж 106 показаны на фиг. 1А в виде отдельных картриджей, в других вариантах осуществления содержимое промывочного картриджа 106 может быть включено в картридж 104 с реагентами. В дополнительных вариантах осуществления в автоматизированный многомодульный инструмент 100 для обработки клеток могут быть загружены три или более картриджей. В некоторых вариантах осуществления картридж 104 с реагентами, промывочный картридж 106 и другие компоненты модулей 110 в автоматизированном многомодульном инструменте 100 для обработки клеток упакованы вместе в виде набора.

[0089] В некоторых вариантах осуществления промывочный картридж 106 и картридж 104 с реагентами представляют собой одноразовые наборы, предоставляемые для использования в автоматизированном многомодульном инструменте 100 для обработки клеток. Например, перед запуском процесса обработки клеток пользователь может открывать и разместить каждый из картриджа 104 с реагентами и промывочного картриджа 106 на шасси автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Пример шасси более подробно обсуждается ниже со ссылкой на фиг. 2А-2D.

[0090] В некоторых вариантах осуществления компоненты картриджей 104, 106 имеют машиночитаемые знаки, такие как штрих-коды, распознаваемые роботизированной системой 108 подачи. Например, роботизированная система 108 подачи может сканировать контейнеры внутри каждого из картриджей 104, 106 для подтверждения содержимого. В других вариантах осуществления на каждый из картриджей 104, 106 могут быть нанесены машиночитаемые знаки, и система обработки автоматизированного многомодульного инструмента 100 для обработки клеток может идентифицировать карту хранящихся материалов на основании машиночитаемых знаков.

[0091] Как показано на фиг. 6A-6B, в некоторых вариантах осуществления промывочный картридж 106 представляет собой промывочный картридж 600, включающий пару больших бутылей 602, набор из четырех небольших пробирок 604 и большую пробирку 606, которые находятся в корпусе 608 картриджа. В некоторых вариантах осуществления каждая из бутылей 602 и пробирок 604, 606 запечатаны прокалываемой фольгой для доступа автоматизированной системы подачи жидкости, такой как сиппер или дозатор. В других вариантах осуществления каждая из бутылей 602 и пробирок 604, 606 включает герметизирующий входной уплотнитель. В некоторых вариантах осуществления верхняя часть каждой из бутылей 602 и пробирок 604, 606 маркирована машиночитаемыми знаками (не показаны) для автоматизированной идентификации содержимого.

[0092] В некоторых вариантах осуществления каждая большая бутыль 602 содержит промывочный раствор. Промывочный раствор может быть одним и тем же или различаться. В некоторых примерах промывочные растворы могут содержать, например, буфер, буфер и 10% глицерин, 80% этанол.

[0092] В некоторых вариантах осуществления бутыли 602 и пробирки 604, 606 внутри корпуса 608 картриджа закрыты крышкой 610. Как показано на фиг. 6B, крышка 610 может включать отверстия для доступа к каждой из бутылей 602 и пробирок 604, 606. Кроме того, крышка 610 может включать машиночитаемые знаки 612 для идентификации типа картриджа (например, для доступа к карте содержимого картриджа). В качестве альтернативы, каждое отверстие может быть маркировано отдельно с указанием содержимого.

[0094] Как показано на фиг. 6C-E, в некоторых вариантах осуществления картридж 104 с реагентами представляет собой картридж 620 с реагентами, включающий набор из шестнадцати небольших пробирок или флаконов 626 и проточный модуль 624 электропорации, которые находятся в корпусе 622 картриджа. В некоторых вариантах осуществления каждая из небольших пробирок или флаконов 626 запечатана прокалываемой фольгой для доступа автоматизированной системы подачи жидкости, такой как сиппер или дозатор. В других вариантах осуществления каждая из небольших пробирок или флаконов 626 включает герметизирующий входной уплотнитель. В некоторых вариантах осуществления верхняя часть каждой из небольших пробирок или флаконов 626 маркирована машиночитаемыми знаками (не показаны) для автоматизированной идентификации содержимого. Машиночитаемые знаки могут включать штрих-код, QR-код или другое машиночитаемое кодирование. Другие автоматизированные средства для идентификации конкретного контейнера могут включать цветовое кодирование, распознавание символов (например, текст, изображение, знак и т.д.) и/или распознавание формы (например, относительной формы контейнера). Вместо нанесения маркировки на сам сосуд, в некоторых вариантах осуществления верхняя поверхность корпуса картриджа и/или крышки картриджа может содержать машиночитаемые знаки для идентификации содержимого. Небольшие пробирки или флаконы могут быть одинакового размера. Альтернативно, в картридже 620 с реактивами могут быть предусмотрены пробирки или флаконы нескольких объемов. В иллюстративном примере каждая пробирка или флакон может быть выполнен с возможностью вмещения от 2 до 20 мл, от 4 до 10 мл или примерно 5 мл.

[0095] В иллюстративном примере каждая из небольших пробирок или флаконов 626 может содержать один из следующих материалов: каркас вектора, олигонуклеотиды, реагенты для изотермической сборки нуклеиновых кислот, предоставляемый пользователем образец клеток, агент-индуктор, магнитные шарики в буфере, этанол, антибиотик для отбора клеток, реагенты для элюции клеток и нуклеиновых кислот, масляное покрытие, другие реагенты и среды для выращивания и/или восстановления клеток.

[0096] В некоторых вариантах осуществления небольшие пробирки или флаконы 626 внутри корпуса 622 картриджа закрыты крышкой 628. Как показано на фиг. 6D, крышка 628 может включать отверстия для доступа к каждой из небольших пробирок или флаконов 626. Три больших отверстия 632 выделены жирной (например, синей) полосой для указания позиций для добавления вносимых пользователем материалов. Вносимые пользователем материалы, например, могут включать остов вектора, олигонуклеотиды и образец клеток. Кроме того, крышка 610 может содержать машиночитаемые знаки 630 для идентификации типа картриджа (например, для доступа к карте содержимого картриджа). В качестве альтернативы, каждое отверстие может быть маркировано отдельно с указанием содержимого. В некоторых вариантах осуществления для гарантированного обозначения позиций для вносимых пользователем материалов, флаконы или пробирки, заполняемые в условиях лаборатории, могут иметь уникальные формы или размеры, такие что флакон или пробирка с образцом клеток помещается только в отверстие для образца клеток, флакон или пробирка с олигонуклеотидами помещается только в отверстие для олигонуклеотидов и т.д.

[0097] На фиг. 1А также показана роботизированная система 108 подачи, включающая гентри 122. В некоторых примерах роботизированная система 108 подачи может включать автоматизированную систему подачи жидкости, такую как системы, производимые Tecan Group Ltd. of Mannedorf, Switzerland, Hamilton Company of Reno, NV (см., например, WO2018015544A1, Ott, «Pipetting device, fluid processing system and method for operating a fluid processing system») или Beckman Coulter, Inc. of Fort Collins, CO. (см., например, US20160018427A1, Striebl et al., «Methods and systems for tube inspection and liquid level detection»). Роботизированная система 108 подачи может включать поршневой дозатор 120. Картриджи 104, 106 с реагентами можно легко интегрировать с измерительным оборудованием для подачи жидкости роботизированной системы 108 подачи, таким как дозатор 120. В некоторых вариантах осуществления с помощью гентри 122 перемещается только поршневой дозатор 120, а различные модули 110 и картриджи 104, 106 находятся в стационарных положениях. Для использования поршневым дозатором 120 могут быть предусмотрены наконечники 116 дозатора.

[0098] В некоторых вариантах осуществления автоматизированная система механического переноса (привод) (не показан) дополнительно обеспечивает управление движением по оси XY или управление движением по оси XYZ одного или более модулей 110 и/или картриджей 104, 106 автоматизированной многомодульной система 100 для обработки клеток. Использованные наконечники 116 дозатора, например, могут быть помещены роботизированной системой подачи в хранилище 112 отходов. Например, активный модуль может быть поднят в положение, обеспечивающее контакт с роботизированной системой подачи, или, наоборот, опущен после использования, чтобы избежать столкновения с роботизированной системой подачи в то время, когда роботизированная система подачи переносит материалы в другие модули 110 в автоматизированном многомодульном инструменте 100 для обработки клеток.

[0099] В некоторых вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент 100 для обработки клеток включает проточный модуль 110c электропорации, включенный в картридж 104 с реагентами. Например, соединительный мост 132 для проточной электропорации, например, соединяется с проточным устройством электропорации после доставки клеток и нуклеиновых кислот в устройство через входной канал. Мост 132 обеспечивает как непроницаемое для жидкости уплотнение, так и электрическое соединение с электродами, а также управление для проведения электропорации в модуле 110с электропорации. Например, соединительный мост 132 для электропорации может быть соединен с элементами управления 134 проточной электропорацией внутри стойки 136 с электронным оборудованием автоматизированного многомодульного инструмента 100 для обработки клеток.

[00100] В некоторых вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент 100 для обработки клеток включает двойные модули 110a, 110b для выращивания клеток. Как показано, каждый из модулей 110а, 110b для выращивания клеток включает вращающийся флакон 130а, 130b для выращивания клеток. По меньшей мере, один из модулей 110a, 110b для выращивания клеток может дополнительно включать интегрированный модуль фильтрации (не показан). В альтернативных вариантах осуществления модуль фильтрации или модуль промывки и концентрации клеток может быть, напротив, отделен от модулей 110a, 110b для выращивания клеток (например, как описано в отношении модуля 1210a для выращивания клеток и модуля 1210b фильтрации, показанных на фиг. 12A и 12В). Например, каждый из модулей 110a, 110b для выращивания клеток может включать признаки и выполнять функции, обсуждаемые в отношении модуля 800 для выращивания клеток, показанного на фиг. 8A-F.

[00101] В некоторых вариантах осуществления в фильтрующей части одного или обоих модулей 110a, 110b для выращивания клеток используются сменные фильтры, хранящиеся в кассете 118 для фильтров. Например, роботизированная система подачи может включать головку 124 для захвата фильтров и установки фильтров для использования одним или обоими модулями для выращивания клеток 110a, 110b. Головка для захвата фильтра доставляет фильтр в модуль для выращивания, набирает с помощью дозатора клетки из модуля для выращивания, затем промывает и делает клетки электрокомпетентными. Среду от клеток и промывочные жидкости сливают в модуль 114 для отходов.

[00102] В некоторых вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент 100 для обработки клеток включает функцию сборки и очистки нуклеиновых кислот (например, модуль сборки нуклеиновых кислот) для объединения материалов, предоставляемых в картридже 104 с реагентами, в собранную нуклеиновую кислоту для редактирования клеток. Кроме того, операция обессоливания или очистки обеспечивает очистку собранных нуклеиновых кислот и обессоливание буфера таким образом, что происходит более эффективная электропорация нуклеиновых кислот в клетки. Признак сборки и очистки нуклеиновых кислот может включать реакционную камеру или емкость с пробирками (не показана) и магнит (не показан).

[00103] Хотя пример инструмента 100 показан как включающий конкретную компоновку модулей 110, этот вариант осуществления предназначен только для иллюстративных целей. Например, в других вариантах осуществления инструмент 100 может включать больше или меньше модулей 110, и могут быть включены разные модули, такие как, например, модуль для слияния клеток для получения гибридом и/или модуль для продуцирования белка. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления некоторые модули могут быть дублированы, например модули 110a, 110b для выращивания клеток как на фиг. 1А.

[00104] В некоторых вариантах осуществления клетки модифицируют перед введением в автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток. Например, клетки могут быть модифицированы путем использования красной системы λ для замены гена-мишени геном устойчивости к антибиотикам, обычно к канамицину или хлорамфениколу. (См. Datsenko and Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, PNAS USA, 97(12):6640-5 (2000); патент США 6509156 B1, Stewart et al., «DNA Cloning Method Relying on the E. coli recE/recT Recombination System», выданный 21 января 2003 г.). В некоторых вариантах осуществления клетки уже могут быть трансформированными или трансфицированными вектором, содержащим кассету экспрессии для нуклеазы. В другом примере нужная правка гена может быть введена в популяцию клеток до введения в автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток (например, с помощью направляемой гомологией репарации), и систему, используемую для отбора этих правок с помощью нуклеазы и/или добавления дополнительных правок в клеточную популяцию.

[00105] На фиг. 2A-2D показаны примеры шасси 200 и 230 для использования в настольных версиях автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Например, шасси 200 и 230 могут иметь ширину примерно 0,61-1,22 м (24-48 дюймов), высоту примерно 0,61-1,22 м (24-48 дюймов) и глубину примерно 0,61-1,22 м (24-48 дюймов). Каждое из шасси 200 и 230 может быть выполнено с возможностью размещения множества модулей и источников расходных материалов, используемых в автоматизированной обработке клеток. Кроме того, на каждом из шасси 200 и 250 может быть установлена роботизированная система подачи для переноса материалов между модулями.

[00106] На фиг. 2А и 2В изображен первый пример шасси 200 автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Как показано, шасси 200 включает крышку 202, имеющую ручку 204 и шарниры 206 для подъема крышки 202 и доступа к внутренней части шасси 200. Охлаждающая решетка 214 может пропускать поток воздуха через внутренний вентилятор (не показан). Кроме того, шасси 200 поднимается с помощью регулируемых ножек 220. Например, ножки 220 могут обеспечивать дополнительный воздушный поток под шасси 200. В некоторых вариантах осуществления кнопка 216 управления обеспечивает как автоматический запуск, так и остановку обработки клеток внутри шасси 200.

[00107] В некоторых вариантах осуществления внутри шасси 200 роботизированная система 208 подачи перемещается вдоль гентри 210 над картриджами 212a, 212b с материалами и модулями. В некоторых вариантах осуществления схема управления, трубки для подачи жидкости, элементы управления компрессором, клапаны, тепловые блоки (например, блоки нагрева и охлаждения) и другие механизмы управления расположены ниже палубы шасси 200 в области 218 блока управления.

[00108] Хотя это не показано, в некоторых вариантах осуществления экран дисплея может быть расположен на лицевой стороне шасси 200, например, покрывая часть крышки 202. Экран дисплея может предоставлять пользователю информацию относительно статуса обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В другом примере экран дисплея может принимать входные данные от пользователя для выполнения обработки клеток.

[00109] На фиг. 2C и 2D изображен второй пример шасси 230 автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Шасси 230, как показано, включает прозрачную дверь 232 с шарниром 234. Например, дверь может поворачиваться влево относительно страницы, обеспечивая доступ к рабочей области шасси. Пользователь, например, может открыть прозрачную дверь 232 для загрузки в шасси 230 расходных материалов, таких как картриджи с реагентами и промывочные картриджи.

[00110] В некоторых вариантах осуществления передняя сторона шасси 230 дополнительно включает дисплей (например, устройство с сенсорным экраном) 236, показанный справа от двери 232. Дисплей 236 может предоставлять пользователю информацию относительно статуса обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В другом примере дисплей 236 может принимать входные данные от пользователя для проведения обработки клеток.

[00111] Воздушная решетка 238 на правой стороне шасси 230 может обеспечивать воздушный поток в рабочую зону (например, над платформой) шасси 230 (например, над платформой). Вторая воздушная решетка 240 на левой стороне шасси 230 может обеспечивать воздушный поток в область 242 блока управления (например, под платформой) шасси 230. Хотя и не показаны, в некоторых вариантах осуществления ножки, такие как ножки 220 шасси 200, могут поднимать шасси 230 над рабочей поверхностью, обеспечивая дополнительный поток воздуха.

[00112] В некоторых вариантах осуществления внутри шасси 230 роботизированная система 248 подачи перемещается вдоль гентри 250 над картриджами 252a, 252b, источниками расходных материалов 254a, 254b (например, наконечников для дозаторов и фильтров) и модулями 256 (например, двойными флаконами для выращивания). В некоторых вариантах осуществления схема управления, трубки для подачи жидкости, элементы управления компрессором, клапаны и другие механизмы управления расположены ниже платформы шасси 230 в области 242 блока управления.

[00113] В некоторых вариантах осуществления блок 246 для жидких отходов установлен снаружи левой стенки шасси 230. Блок 246 для жидких отходов, например, может быть установлен снаружи шасси 230, чтобы избежать потенциального загрязнения и обеспечить быстрое опорожнение и замену блока 246 для жидких отходов.

Модуль сборки нуклеиновых кислот

[00114] Некоторые варианты осуществления автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению включают модуль сборки нуклеиновых кислот, расположенный внутри инструмента. Модуль сборки нуклеиновых кислот выполнен с возможностью приема нуклеиновых кислот, необходимых для осуществления требуемых событий редактирования генома. Модуль сборки нуклеиновых кислот также может быть выполнен с возможностью приема соответствующей основы вектора для сборки вектора и последующей трансформации в представляющие интерес клетки.

[00115] Как правило, термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Векторы включают, без ограничения, молекулы нуклеиновых кислот, которые являются одноцепочечными, двухцепочечными или частично двухцепочечными; молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат один или более свободных концов, не содержат свободных концов (например, циклические); молекулы нуклеиновых кислот, которые включают ДНК, РНК или и то, и другое; и другие разновидности полинуклеотидов, известные в данной области техники. Одним типом вектора является «плазмида», которая относится к петле кольцевой двухнитевой ДНК, в которую могут быть вставлены дополнительные сегменты ДНК, например, с помощью стандартных методов молекулярного клонирования. Другим типом вектора является вирусный вектор, причем в векторе присутствуют последовательности, полученные от ДНК- или РНК-вируса, для упаковки в вирус (например, ретровирусы, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы, дефектные по репликации аденовирусы и аденоассоциированные вирусы). Вирусные векторы также включают полинуклеотиды, переносимые вирусом для трансфекции в клетку-хозяина. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный источник репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом-хозяином. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в настоящем описании как «векторы экспрессии». Обычные векторы экспрессии, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Обсуждение векторов приведено в настоящем описании ниже.

[00116] Рекомбинантные векторы экспрессии могут включать нуклеиновую кислоту в форме, подходящей для трансформации, а для некоторых последовательностей нуклеиновых кислот, трансляцию и экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные векторы экспрессии включают один или более регуляторных элементов, которые могут быть выбраны в зависимости от клеток-хозяев, используемых для экспрессии, и которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, предназначенной для экспрессии. В рекомбинантном векторе экспрессии термин «функционально связанный» означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторным(и) элементом(ами) таким образом, что она обеспечивает транскрипцию, а для некоторых последовательностей нуклеиновой кислоты, трансляцию и экспрессию нуклеотидной последовательности (например, в системе транскрипции/трансляции in vitro или в клетке-хозяине, когда вектор вводят в клетку-хозяина). Подходящие способы рекомбинации и клонирования раскрыты в заявке на патент США 10/815730, «Recombinational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites», опубликованной 2 сентября 2004 г. под номером US 2004-0171156 А1, содержание которой включено в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки во всех отношениях.

[00117] В некоторых вариантах осуществления регуляторный элемент функционально связан с одним или более элементами нацеливаемой нуклеазой системы для управления транскрипцией, а для некоторых последовательностей нуклеиновых кислот, трансляцией и экспрессией одного или более компонентов нацеливаемой нуклеазой системы.

[00118] В некоторых вариантах осуществления вектор может включать регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, управляемую нуклеиновой кислотой. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу, управляемую нуклеиновой кислотой, может быть оптимизирована по кодонам для экспрессии в конкретных клетках, таких как прокариотические или эукариотические клетки. Эукариотическими клетками могут быть клетки дрожжей, грибов, водорослей, растений, животных или человека. Эукариотические клетки могут быть клетками или могут быть получены из конкретного организма, такого как млекопитающее, включая, без ограничения, человека, мышь, крысу, кролика, собаку или млекопитающее, не относящееся к человеку, включая примата, не относящегося к человеку. В дополнение или в качестве альтернативы, вектор может включать регуляторный элемент, функционально похожий на полинуклеотидную последовательность, которая при транскрибировании образует направляющую РНК.

[00119] Модуль сборки нуклеиновых кислот может быть выполнен с возможностью осуществления широкого спектра различных методов сборки нуклеиновых кислот в автоматическом режиме. Методы сборки нуклеиновых кислот, которые могут быть выполнены в модуле сборки нуклеиновых кислот в раскрытых автоматизированных многомодульных инструментах для редактирования клеток, включают, без ограничения, методы сборки, в которых используются рестрикционные эндонуклеазы, включая ПЦР, сборку BioBrick (патент США 9361427, Hillson, «Scar-less Multi-part DNA Assembly Design», выданный 7 июня 2016 г.), клонирование типа IIS (например, сборка GoldenGate; публикация Европейской заявки на патент EP 2 395 087 A1, Weber et al., «System and Method of Modular Cloning», поданная 6 июля 2010 г.), и реакция циклирования с помощью лигазы (de Kok S, Rapid and Reliable DNA Assembly via Ligase Cycling Reaction, ACS Synth Biol., 3(2):97-106 (2014); Engler, et al., PLoS One, A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability, 3(11):e3647 (2008); патент США 6143527, Pachuk et al., «Chain Reaction Cloning Using a Bridging Oligonucleotide and DNA Ligase», выданный 7 ноября 2000 г.). В других вариантах осуществления способы сборки нуклеиновых кислот, выполняемые раскрытыми автоматическими многомодульными инструментами для редактирования клеток, основаны на наложении смежных частей нуклеиновых кислот, такие как Gibson Assembly®, CPEC, SLIC, Ligase Cycling и т.д. Дополнительные способы сборки включают восстановление разрывов в дрожжах (Bessa, Improved gap repair cloning in yeast: treatment of the gapped vector with Taq DNA polymerase avoids vector self-ligation, Yeast, 29(10):419-23 (2012)), gateway-клонирование (Ohtsuka, Lantibiotics: mode of action, biosynthesis and bioengineering, Curr Pharm Biotechnol, 10(2):244-51 (2009); патент США 5888732, Hartley et al., «Recombinational Cloning Using Engineered Recombination Sites», выданный 30 марта. 1999; патент США 6277608, Hartley et al., «Recominational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites», выданный 21 августа 2001 г.), и опосредованное топоизомеразой клонирование (Udo, An Alternative Method to Facilitate cDNA Cloning for Expression Studies in Mammalian Cells by Introducing Positive Blue White Selection in Vaccinia Topoisomerase I-Mediated Recombination, PLoS One, 10(9):e0139349 (2015); патент США 6916632 В2, Chestnut et al., «Methods and Reagents for Molecular Cloning», выданный 12 июля 2005 г.). Эти и другие методы сборки нуклеиновых кислот описаны, например, в Sands and Brent, Overview of Post Cohen Boyer Methods for Single Segment Cloning and for Multisegment DNA Assembly, Curr Protoc Mol Biol., 113:3.26.1-3.26.20 (2016); Casini et al., Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly, Nat Rev Mol Cell Biol., (9):568-76 (2015); Patron, DNA assembly for plant biology: techniques and tools, Curr Opinion Plant Biol., 19:14-9 (2014)).

[00120] Сборка нуклеиновой кислоты является температурно регулируемой в зависимости от типа сборки нуклеиновой кислоты, используемой в автоматизированном многомодульном инструменте для редактирования клеток. Например, когда в модуле сборки нуклеиновых кислот используется ПЦР, модуль обладает возможностью термоциклирования, позволяющей задавать температурные циклы между денатурацией, отжигом и удлинением. Когда в модуле сборки нуклеиновых кислот используются методы сборки, выполняемые при одной температуре, модуль обладает возможностью достигать и удерживать температуру, которая оптимизирует конкретный процесс сборки. Такая температура и время поддержания такой температуры могут быть определены с помощью предварительно запрограммированного набора параметров, обработанных скриптом, или управляться пользователем вручную с помощью системы обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[00121] В одном из вариантов осуществления модуль сборки нуклеиновых кислот представляет собой модуль для выполнения сборки с помощью одной изотермической реакции, такой как показана на фиг. 4. Модуль изотермической сборки выполнен с возможностью осуществления метода молекулярного клонирования с помощью одной изотермической реакции. Некоторые методы изотермической сборки могут объединять одновременно до 15 фрагментов нуклеиновой кислоты на основе идентичности последовательности. В некоторых вариантах осуществления метод сборки обеспечивает собранные нуклеиновые кислоты, которые включают примерно 20-40 оснований, перекрывающихся с соседними фрагментами нуклеиновой кислоты. Фрагменты смешивают с коктейлем, состоящим из трех ферментов - экзонуклеазы, полимеразы и лигазы, с компонентами буфера. Поскольку процесс является изотермическим и может выполняться одноэтапным или двухэтапным методом с использованием одного реакционного сосуда, реакции изотермической сборки идеально подходят для использования в автоматизированном многомодульном устройстве для обработки клеток. Одноэтапный метод позволяет собирать до пяти различных фрагментов, используя одноэтапный изотермический процесс. Фрагменты и маточную смесь ферментов объединяют и инкубируют при 50°С в течение одного часа. Для создания более сложных конструкций, содержащих до пятнадцати фрагментов, или для включения фрагментов от 100 пар оснований до 10 тыс. пар оснований, обычно используется 2-этапная реакция, в которой требуются два отдельных добавления маточной смеси: один для экзонуклеазы и этапа отжига и второй для полимеразы и этапа лигирования.

[00122] На фиг. 4 показан пример модуля 400 изотермической сборки нуклеиновых кислот со встроенной очисткой. Модуль 400 изотермической сборки нуклеиновых кислот включает камеру 402, имеющую входной уплотнитель 404 для переноса жидкостей в модуль 400 изотермической сборки нуклеиновых кислот и из него (например, с помощью дозатора или сиппера). В некоторых вариантах осуществления входной уплотнитель 404 соединен со сменным флаконом, который расположен внутри камеры 402. Например, управляемая пользователем или роботизированная система подачи может помещать флакон в модуль 400 изотермической сборки нуклеиновых кислот для обработки.

[00123] Камера 402 имеет общий корпус 406 с резистивным нагревателем 408. После введения образца введен в камеру 402 модуля 400 изотермической сборки нуклеиновых кислот, резистивный нагреватель 408 можно использовать для нагревания содержимого камеры 402 до требуемой температуры. Повышение температуры можно задавать, исходя из содержимого камеры 402 (например, материалов, подаваемых через входной уплотнитель 404 посредством блока дозатора или сиппера роботизированной системы подачи). Система обработки автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток может определять целевую температуру и режим изменения температуры. Линейное изменение температуры и заданную температуру можно контролировать с помощью теплового датчика, такого как термистор 410, включенный в корпус 406. В конкретном варианте осуществления резистивный нагреватель 408 предназначен для поддержания температуры в корпусе 406 от 20° до 80°С, от 25° до 75ºC, от 37º до 65ºC, от 40º до 60ºC, от 45º до 55ºC или предпочтительно примерно 50ºC.

Модуль очистки

[00124] В некоторых вариантах осуществления, когда в автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток включен модуль сборки нуклеиновых кислот, инструмент также может включать модуль очистки для удаления нежелательных компонентов из смеси для сборки нуклеиновых кислот (например, солей, минералов) и, в некоторых вариантах осуществления, концентрации собранных нуклеиновых кислот. Примеры способов замены жидкости после сборки нуклеиновых кислот включают магнитные шарики (например, SPRI или Dynal (Dynabeads) от Invitrogen Corp. of Carlsbad, CA), кварцевые шарики, silica spin колонки, стеклянные шарики, осаждение (например, с помощью этанола или изопропанола), щелочной лизис, осмотическую очистку, экстракцию бутанолом, мембранные методы разделения, фильтрацию и т.д.

[00125] В одном из аспектов модуль очистки обеспечивает фильтрацию, например ультрафильтрацию. Например, доступен ряд микроконцентраторов, снабженных анизотропными, гидрофильными целлюлозными мембранами различной пористости. (См., например, микроконцентраторы Millipore SCX, используемые Juan, Li-Jung, et al. "Histone deacetylases specifically down-regulate p53-dependent gene activation." Journal of Biological Chemistry 275.27 (2000):20436-20443.). В другом примере очистка и концентрация включают приведение в контакт жидкого образца, включающего собранные нуклеиновые кислоты и ионную соль, с ионообменником, включающим нерастворимую фосфатную соль, удаление жидкости и элюцию нуклеиновой кислоты из ионообменника.

[00126] В конкретном аспекте модуля очистки могут быть использованы шарики SPRI, причем к сборке нуклеиновой кислоты могут быть добавлены шарики SPRI в 0,6-2,0x объеме. Продукт сборки нуклеиновой кислоты связывается с шариками SPRI, и шарики SPRI осаждают путем автоматизированного размещения магнита рядом с пробиркой, сосудом или камерой, в которой скапливается осадок. Например, к сборке нуклеиновой кислоты могут быть добавлены шарики SPRI в 6-2,0х объеме. Шарики SPRI, например, могут быть промыты этанолом, и связанный продукт сборки нуклеиновой кислоты элюируют, например, водой, трис-буфером или 10% глицерином.

[00127] В конкретном аспекте магнит соединен с линейным приводом, который устанавливает магнит в нужное положение. В некоторых вариантах осуществления модуль сборки нуклеиновых кислот представляет собой комбинированный модуль сборки и очистки, предназначенный для интегрированной сборки и очистки. Например, как обсуждалось выше в отношении модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот, по истечении времени, достаточного для протекания изотермической реакции сборки нуклеиновой кислоты, в некоторых вариантах осуществления содержимое камеры 402 (например, реагенты для изотермической сборки нуклеиновой кислоты и нуклеиновые кислоты) объединяют с магнитными шариками (не показаны) для активации процесса очистки. Шарики SPRI в буфере добавляют к содержимому модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот, например, с помощью роботизированной системы подачи. После этого в некоторых вариантах осуществления с помощью магнита активируют соленоид 412, стимулируя магнитные шарики, содержащиеся в камере 402. В конкретном примере соленоид может притягивать магнитные шарики внутри камеры 402 с силой магнитного притяжения от 8,9 до 22,2 Н (2 до 5 фунт-сила), или примерно 17,8 Н (4 фунт-сила). Содержимое камеры 402 можно инкубировать в течение времени, достаточного для связывания собранного вектора и олигонуклеотидов с магнитными шариками.

[00128] После связывания в некоторых вариантах осуществления связанную смесь для изотермической сборки нуклеиновой кислоты (например, реагенты для изотермической сборки нуклеиновой кислоты+собранный вектор и олигонуклеотиды) удаляют из модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот, и нуклеиновые кислоты, присоединенные к шарикам, промывают один-несколько раз 80% этанолом. После промывки нуклеиновые кислоты, присоединенные к шарикам, элюируют буфером и переносят в модуль трансформации.

[00129] В некоторых вариантах осуществления флакон фиксируют в определенном положении в камере 402 для обработки. Например, пользователь может нажать на флакон за фиксатором в камере 402, предназначенном для удержания флакона при контакте с дозатором или сиппером. В другом примере пользователь может повернуть флакон в нужное положение, вставляя таким образом выступ в соответствующий канал и блокируя движение вверх. Датчик положения (не показан) может гарантировать отвод флакона. Датчик положения, в конкретном варианте осуществления, представляет собой магнитный датчик, детектирующий контакт между частью камеры 402 и флаконом. В других вариантах осуществления датчик положения представляет собой оптический датчик, детектирующий присутствие флакона в отведенном положении. В вариантах осуществления, использующих канал и выступ, механический переключатель, нажатый выступом, может детектировать наличие флакона.

Модуль для выращивания

[00130] По мере сборки нуклеиновых кислот, можно осуществлять выращивание клеток при подготовке к редактированию. Процесс выращивания клеток можно контролировать по оптической плотности (например, при OD600 нм), которая измеряется в модуле для выращивания, а для регуляции роста клеток используется петля обратной связи в целях достижения целевого значения OD в заданное время. Другие меры плотности клеток и физиологического состояния, которые могут быть измерены, включают, без ограничения, pH, растворенный кислород, высвобождаемые ферменты, акустические свойства и электрические свойства.

[00131] В некоторых аспектах модуль для выращивания включает культуральную пробирку в шейкере или вихревой мешалке, с которой снимаются показатели с помощью спектрофотометра или флуориметра. Шейкер или вихревая мешалка могут нагревать или охлаждать клетки, при этом рост клеток контролируют в режиме реального времени путем измерения величины поглощения или флуоресценции. В одном из аспектов клетки выращивают при 25-40°С до оптической плотности OD600 от 1 до 10 OD. Клетки также можно выращивать при температурах от 25°С до 35°С, от 25°С до 30°С, от 30°С до 40°С, от 30°С до 35°С, от 35°С до 40°С, от 40°С до 50°C, от 40°С до 45°C или от 44°С до 50°C. В другом аспекте клетки индуцируют нагреванием при 42-50°С или добавлением индуцирующего агента. Клетки также можно индуцировать нагреванием в диапазоне от 42°С до 46°С, от 42°С до 44°С, от 44°С до 46°С, от 44°С до 48°С, от 46°С до 48°С, от 46°С до 50°C или от 48°С до 50°C. В некоторых аспектах после индукции клетки охлаждают до 0°С-10°C. После индукции клетки также могут быть охлаждены до температуры в диапазоне от 0°С до 5°С, от 0°С до 2°С, от 2°С до 4°С, от 4°С до 6°С, от 6°С до 8°С, от 8°C до 10°C или от 5°C до 10°C.

[00132] На фиг. 8А показан один из вариантов осуществления вращающегося флакона 800 для выращивания, используемого с устройством для выращивания клеток, таким как устройство 850 для выращивания клеток, показанным на фиг. 8B-С. В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания представляет собой прозрачный контейнер, имеющий открытый конец 804 для введения жидких сред и клеток, центральную область 806 флакона, которая определяет основной контейнер для выращивания клеток, конусно-суженную область 818, определяющую по меньшей мере один путь 808, 810 светового луча, закрытый конец 816 и механизм 812 включения привода. Вращающийся флакон 800 для выращивания может иметь центральную продольную ось 820, вокруг которой вращается флакон 800, и пути 808, 810 световых лучей, как правило, могут быть перпендикулярны продольной оси флакона. В некоторых примерах первый путь 810 светового луча может быть расположен в нижней суженной части конусно-суженной области 818. В некоторых вариантах осуществления механизм 812 включения привода включает приводной механизм (например, привод, двигатель (не показан)) для вращения флакона 800. Привод может включать приводной вал 874 для приводного двигателя 864 (фиг. 8D).

[00133] В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания включает второй путь 808 светового луча, например, в верхней конической области конусно-суженной области 818. В некоторых примерах стенки, определяющие верхнюю коническую область конусно-суженной области 818 для второго пути 808 светового луча, могут быть расположены под более широким углом относительно продольной оси 820, чем стенки, определяющие нижнюю суженную часть конусно-суженной области 810 для первого пути 810 светового луча. Оба пути 808, 810 светового луча, например, могут быть расположены в области вращающегося флакона 800 для выращивания, которая постоянно заполнена клеточной культурой (клетки+питательная среда) и не зависит от скорости вращения флакона 800 для выращивания. Как показано, второй путь 808 светового луча короче, чем первый путь 810 светового луча, что позволяет выполнять точное измерение значений оптической плотности (OD), когда значения OD клеточной культуры во флаконе являются высокими (например, на более поздней стадии роста клеток), тогда как первый световой путь 810 позволяет выполнять точные измерения значений OD, когда значения OD клеточной культуры во флаконе являются более низкими (например, на ранней стадии роста клеток).

[00134] Вращающийся флакон 800 для выращивания может быть многоразовым или, предпочтительно, вращающийся флакон для выращивания является расходным материалом. В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания является расходным материалом и может предоставляться пользователю, предварительно заполненным питательной средой, при этом открытый конец 804 флакона 800 герметично запечатан фольгой. Вращающийся флакон для выращивания, заполненный средой и упакованный таким образом, может быть частью набора для использования в автономном устройстве для выращивания клеток или в модуле для выращивания клеток, который является частью автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток. Для введения клеток во флакон, пользователю нужно только внести с помощью дозатора требуемый объем клеток, используя наконечник дозатора, чтобы пробить фольгу флакона 800. В качестве альтернативы, конечно, автоматизированный инструмент может переносить клетки, например, из картриджа с реагентами во флакон для выращивания. Питательная среда может быть предоставлена во флаконе для выращивания или также может быть перенесена из картриджа с реагентами во флакон для выращивания перед добавлением клеток. Открытый конец 804 может включать выступающую кромку 802, которая частично накрывает устройство 850 для выращивания клеток и закрепляется на нем (фиг. 8B-C). В автоматизированных инструментах вращающийся флакон 800 для выращивания может быть помечен штрих-кодом или другим средством идентификации, которое может быть считано сканером или камерой, являющейся частью системы 1310 обработки, как показано на фиг. 13.

[00135] В некоторых вариантах объем вращающегося флакона 800 для выращивания и объем клеточной культуры (включая питательную среду) могут сильно различаться, но объем вращающегося флакона 800 для выращивания должен быть достаточно большим, чтобы культура клеток во флаконе 800 для выращивания аэрировалась надлежащим образом при вращении флакона 800. На практике объем вращающегося флакона 800 для выращивания может составлять от 1 до 250 мл, от 2 до 100 мл, от 5 до 80 мл, от 10 до 50 мл или от 12 до 35 мл. Аналогично, объем клеточной культуры (клетки+питательная среда) должен быть подходящим для обеспечения надлежащей аэрации во вращающемся флаконе 800 для выращивания. Таким образом, объем клеточной культуры должен составлять примерно 10-85% от объема флакона 800 для выращивания, или 15-80% от объема флакона для выращивания, или 20-70%, 30-60% или 40-50% от объема флакона для выращивания. В одном из примеров для флакона 800 для выращивания объемом 35 мл объем клеточной культуры может составлять от примерно 4 до примерно 27 мл.

[00136] В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания изготовлен из биосовместимого прозрачного материала, или по меньшей мере часть флакона 800, включающая путь(и) светового луча, является прозрачной. Кроме того, необходимо, чтобы материал, из которого изготовлен вращающийся флакон 800 для выращивания, мог охлаждаться до температуры примерно 0°С или ниже и нагреваться до температуры примерно 75°С или выше, например до примерно 2°С или до примерно 70°С, до примерно 4°С или до примерно 60°C, или до примерно 4°C, или до примерно 55°C, обеспечивая как температуру для анализа клеток, так и для длительного хранения при низких температурах. Кроме того, предпочтительно, чтобы материал, используемый для изготовления флакона, выдерживал температуру до 55°C без появления признаков деформации при вращении. Подходящие материалы включают стекло, поливинилхлорид, полиэтилен, полиамид, полиэтилен, полипропилен, поликарбонат, поли(метилметакрилат) (ПММА), полисульфон, полиуретан и сополимеры этих и других полимеров. Предпочтительные материалы включают полипропилен, поликарбонат или полистирол. В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания является недорогим в изготовлении и производится, например, литьем под давлением или методом экструзии.

[00137] На фиг. Фиг.8В показан вид сверху вращающегося флакона 800b для выращивания, который является альтернативным вариантом осуществления вращающегося флакона 800 для выращивания. В некоторых примерах флакон 800b может включать одну или более лопастей 822, прикрепленных к внутренней поверхности, которые выступают к центру флакона 800b. Флакон 800b, показанный на фиг. 8B, включает три лопасти 822, которые по существу равномерно распределены по периферии флакона 800b, но в других примерах флакон 800b может включать две, четыре или более лопастей 822. В некоторых вариантах осуществления лопасти обеспечивают хорошее перемешивание и аэрацию внутри флакона 800b, вращаясь внутри устройства для выращивания клеток, что облегчает рост микроорганизмов.

[00138] На фиг. 8C-D показаны изображения приведенного в качестве примера устройства 850 для выращивания клеток, в которое вставляется вращающийся флакон 800 для выращивания. В некоторых вариантах осуществления устройство 850 обеспечивает вращение для нагревания или охлаждения клеток или выращивания клеток во флаконе 800 до заданного диапазона температур. В некоторых вариантах осуществления вращающийся флакон 800 для выращивания может быть расположен внутри основного корпуса 852 и иметь выступающую кромку 802, выходящую за верхнюю поверхность основного корпуса 852. В некоторых аспектах выступающая кромка 802 обеспечивает поверхность захвата для пользователя, вставляющего или извлекающего флакон 800 из основного корпуса 852 устройства 850. Кроме того, когда флакон полностью вставлен в основной корпус 852, нижняя поверхность выступающей кромки 802 упирается в верхнюю поверхность основного корпуса 852. В некоторых примерах основной корпус 852 устройства 850 для выращивания клеток имеет такой размер, что внешние поверхности вращающегося флакона 800 для выращивания примыкают к внутренним поверхностям основного корпуса 852, тем самым закрепляя флакон 800 внутри основного корпуса 852. В некоторых вариантах осуществления устройство 850 для выращивания клеток может включать концевые корпуса 854, расположенные на каждой стороне основного корпуса 854, и нижний корпус 856, расположенный в нижней части основного корпуса 852. В некоторых примерах нижний корпус 856 может включать фланцы 858, которые можно использовать для прикрепления устройства 850 для выращивания клеток к механизму регулирования температуры (например, нагрева/охлаждения) или другой конструкции, такой как шасси автоматизированной системы для обработки клеток.

[00139] Как показано на фиг. 8D, в некоторых вариантах осуществления устройство 850 для выращивания клеток может включать верхний подшипник 860 и нижний подшипник 862, расположенные в основном корпусе 852, которые поддерживают вертикальную нагрузку вращающегося флакона 800 для выращивания, вставленного в основной корпус 852. В некоторых примерах, устройство 850 для выращивания клеток может также включать основной оптический порт 866 и вторичный оптический порт 868, которые совмещены с первым путем 810 светового луча и вторым путем 808 светового луча флакона 800, когда он вставлен в основной корпус 852. В некоторых примерах первичный и вторичный оптические порты 866, 868 представляют собой зазоры, отверстия или части основного корпуса, выполненными из прозрачных материалов, которые позволяют свету проходить сквозь флакон 800 для измерения оптической плотности в процессе выращивания клеток. В дополнение к оптическим портам 866, 868 устройство 850 для выращивания клеток может включать излучающую пластину 870 с одним или более источниками освещения для пути(ей) светового луча, и детекторную пластину 872 для детектирования света после его прохождения через культуральную жидкость во вращающемся флаконе 800 для выращивания. В одном из примеров источники освещения, расположенные на излучающей пластине 870, могут включать светоизлучающие диоды (СИД) или фотодиоды, которые обеспечивают освещение на одной или более целевых длинах волн, соответствующих питательной среде, обычно используемой в культуре клеток (например, клеток млекопитающих, бактериальных клеток, клеток животных, клеток дрожжей).

[00140] В некоторых вариантах осуществления излучающая пластина 870 и/или детекторная пластина 872 коммуникативно связана через проводное или беспроводное соединение с системой обработки (например, системой 126, 1220, 1310 обработки), которая управляет длиной волны света, выдаваемого излучающей пластиной 870, и принимает и обрабатывает освещение, определенное детекторной пластиной 872. В некоторых аспектах дистанционно управляемые излучающая пластина 870 и детекторная пластины 872 обеспечивают автоматическое измерение оптической плотности в процессе выращивания клеток. Например, система 126, 1220 обработки может задавать периодичность, с которой выполняются измерения OD, которые могут осуществляться через заданные интервалы времени или в ответ на запрос пользователя. Кроме того, система 126, 1220 обработки может использовать данные датчиков, полученные от детекторной пластины 872 для осуществления измерения OD в реальном времени и регулировать условия выращивания клеток (например, температуру, скорость/направление вращения).

[00141] В некоторых вариантах осуществления нижний корпус 856 может содержать приводной двигатель 864, который генерирует вращательное движение, вызывающее вращение вращающегося флакона 800 для выращивания внутри устройства 850 для выращивания клеток. В некоторых вариантах осуществления двигатель 864 может включать приводной вал 874, который приводит в движение нижний конец вращающегося флакона 800 для выращивания. В некоторых вариантах осуществления двигатель 864, генерирующий вращательное движение вращающегося флакона 800 для выращивания, представляет собой бесщеточный приводной двигатель постоянного тока со встроенными элементами управления приводом, который может быть выполнен с возможностью вращения с постоянной скоростью (количеством оборотов в минуту, об/мин) от 0 и до примерно 3000 об/мин. В качестве альтернативы могут быть использованы другие типы двигателей, такие как шаговые, сервоприводные или щеточные двигатели постоянного тока. Двигатель 864, необязательно, также может иметь управление направлением движения, что позволяет менять направление вращения, при этом двигатель может иметь тахометр для определения и регистрации фактического количества оборотов в минуту. В других примерах двигатель 864 может генерировать колебательное движение, изменяя направление вращения на заданную частоту. В одном из примеров флакон 800 вращается в каждом направлении в течение одной секунды со скоростью 350 об/мин. В некоторых вариантах осуществления двигатель 864 коммуникативно связан через проводную или беспроводную сеть связи с системой обработки (например, системой 126, 1220 обработки), которая выполнена с возможностью управления работой двигателя 864 и может включать выполнение протоколов, запрограммированных в процессоре и/или предоставляемых пользователем путем ввода данных, например, как описано в отношении контроллера 1330 модуля, показанного на фиг. 13. Например, двигатель 864 также может быть выполнен с возможностью изменения скорости и/или направления вращения флакона 800, вызывая осевую прецессию культуры клеток, тем самым усиливая перемешивание и предотвращая агрегацию клеток и увеличивая аэрацию. В некоторых примерах скорость или направление вращения двигателя 864 могут изменяться на основании данных датчика оптической плотности, получаемых с детекторной пластины 872.

[00142] В некоторых вариантах осуществления основной корпус 852, концевые корпуса 854 и нижний корпус 856 устройства 856 для выращивания клеток могут быть изготовлены из прочного материала, включающего алюминий, нержавеющую сталь и другие теплопроводящие материалы, включая пластмассы. Эти структуры или их части могут быть изготовлены различными способами, например, изготовлением из металла, литьем под давлением, сплавлением созданных структурных слоев и т.д. Хотя в некоторых примерах вращающийся флакон 800 для выращивания можно использовать повторно, в других вариантах осуществления флакон 800 предпочтительно является расходным материалом. В некоторых аспектах другие компоненты устройства 850 для выращивания клеток предпочтительно являются многоразовыми и могут функционировать в виде автономного настольного устройства или в виде модуля в автоматизированной многомодульной системе для обработки клеток.

[00143] В некоторых вариантах осуществления система обработки, которая коммуникативно связана с модулем для выращивания клеток, может быть запрограммирована с помощью информации, которая может использоваться в качестве «пустого образца» или контроля для растущей клеточной культуры. В некоторых примерах «пустой образец» или контроль представляет собой сосуд, содержащего только питательную среду, с коэффициентом пропускания 100% и 0 значением OD, тогда как образцы клеток отклоняют световые лучи и будут иметь более низкий процент пропускания и более высокое значение OD. По мере роста и уплотнения клеток в среде коэффициент пропускания уменьшается, а значение OD увеличивается. В некоторых вариантах осуществления процессор модуля для выращивания клеток может быть запрограммирован для использования значений длины волны для пустых образцов, соответствующих питательной среде, обычно используемой в культуре клеток (например, клеток млекопитающих, бактериальных клеток, клеток животных, клеток дрожжей). Альтернативно, модуль для выращивания клеток может включать второй спектрофотометр и сосуд, причем второй спектрофотометр может использоваться для считывания данных с пустого флакона через определенные интервалы времени.

[00144] На фиг. 8Е показан другой тип устройства 880 для выращивания клеток, в котором используется встряхивание, а не вращение, для управления температурой и обеспечения перемешивания и аэрации во флаконе 890 для выращивания клеток (фиг. 8F). В некоторых примерах устройство 880 для выращивания клеток меньше по размеру, чем обычные настольные шейкеры, что позволяет интегрировать его в автоматизированные многомодульные системы для обработки клеток. В некоторых вариантах осуществления устройство 880 для выращивания клеток включает корпус 884, в который устанавливают флакон 890 для выращивания клеток. В некоторых примерах устройство 880 для выращивания клеток может включать узел двигателя, расположенный под флаконом 890, который в зависимости от скорости мотора генерирует круговое движение флакона 890. В одном из примеров флакон 890 движется по кругу в горизонтальной плоскости со скоростью от 600 до 900 об/мин, например, со скоростью 750 об/мин, что значительно быстрее, чем у больших настольных шейкеров, которые вращаются со скоростью примерно 250 об/мин. В некоторых аспектах встряхивающее движение создается по меньшей мере в одной горизонтальной плоскости. В некоторых примерах флакон 890 для выращивания клеток, используемый со встряхивающим устройством 880 для выращивания клеток, представляет собой пробирку с коническим дном, по существу, напоминающую по форме на колбу, которая используется в обычном настольном шейкере. Аналогично вращательному устройству 850 для выращивания клеток, устройство 880 для выращивания клеток может включать излучающую пластину 870 и детекторную пластину 872 для автоматического измерения оптической плотности в процессе выращивания клеток. В некоторых примерах источник 882 света может быть соединен с устройством 880 для выращивания клеток, которое генерирует излучение, измеряемое детекторной пластиной, которая в некоторых примерах расположена под флаконом 890 или сбоку от флакона 890 на противоположной стороне от источника 882 света.

[00145] Для уменьшения фона клеток, которые не получили правку генома, модуль для выращивания также может обеспечивать процесс отбора для обогащения отредактированных клеток. Например, введенная нуклеиновая кислота может включать ген, который придает устойчивость к антибиотику, или другой селективный маркер. Чередование введения селективных маркеров для последовательных циклов редактирования также может устранять фон, создаваемый неотредактированными клетками, обеспечивая выполнение автоматизированным многомодульным инструментом для редактирования клеток множество циклов отбора клеток, имеющих последовательно введенные правки генома.

[00146] Подходящие гены устойчивости к антибиотикам включают, без ограничения, такие как ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к канаванину, ген устойчивости к бластицидину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к пуромицину и ген устойчивости к хлорамфениколу. В некоторых вариантах осуществления удаляют фон, создаваемый мертвыми клетками, с помощью усилителей лизиса, таких как детергенты, осмотический стресс, температура, ферменты, протеазы, бактериофаг, восстановители или хаотропы. В других вариантах осуществления для уменьшения фона, создаваемого мертвыми клетками, используется удаление клеток и/или замена среды.

Модуль для промывки и/или концентрации клеток

[00147] В модуле для промывки и/или концентрации клеток может использоваться любой способ замены жидкостей в клеточной среде, этот модуль также позволяет концентрировать клетки или оставлять их по существу в том же или большем объеме жидкости, который используется в модуле сборки нуклеиновых кислот. Кроме того, в некоторых аспектах процессы, выполняемые в модуле для промывки клеток, также делают клетки электрокомпетентными, например, путем использования глицерина в промывочной жидкости.

[00148] Для промывки клеток можно использовать множество различных методов, включая очистку в градиенте плотности, диализ, ионообменные колонки, фильтрацию, центрифугирование, разбавление и использование шариков для очистки.

[00149] В некоторых аспектах в модуле для промывки и/или концентрации клеток используется центрифужное устройство. В других аспектах в модуле для промывки и/или концентрации клеток используется модуль фильтрации. В другом аспекте шарики связаны с фрагментами, которые связываются с поверхностью клетки. Эти группы включают, без ограничения, антитела, лектины, агглютинин зародышей пшеницы, мутированные лизоцимы и лиганды.

[00150] В других аспектах клетки разработаны таким образом, чтобы они могли намагничиваться, позволяя магнитам осаждать эти клетки после этапов промывки. Механизм намагничивания клеток может включать, без ограничения, экспрессию белка ферритина.

[00151] В некоторых вариантах осуществления модуль для промывки и/или концентрации клеток представляет собой сборочный модуль центрифуги. Как видно на фиг. 3A-C, в некоторых вариантах осуществления сборочный модуль 300 центрифуги включает верхнюю дверцу 302, выполненную с возможностью приведения в действие роботизированной системой подачи (не показана) для доставки материалов для сборки нуклеиновой кислоты (например, олиго, остова вектора, ферментов и т.д.) в один или боле флаконов 304a, b, расположенных в стаканах 306a, b для флаконов, соединенных с ротором 308. В некоторых вариантах осуществления роботизированная система подачи доставляет флаконы 304a, b в сборочный модуль 300 центрифуги. В других вариантах осуществления пользователь размещает флаконы 304a, b внутри стаканов 306a, b для флаконов. В некоторых вариантах осуществления стаканы 306a, b для флаконов соединены с ротором 308 через шарнирное соединение так, что при вращении стаканы 306a, b для флаконов могут отклоняться кнаружи. В других вариантах осуществления положение стаканов 306a, b является фиксированным.

[00152] В некоторых вариантах осуществления сборочный модуль 300 центрифуги управляется климатически. Например, внутренняя температура может поддерживаться охлаждающим змеевиком 310 и изоляцией 312. Линии 314 подачи и возврата охлаждающей жидкости могут перекачивать охлаждающую жидкость к охлаждающему змеевику 310, тем самым охлаждая камеру 316 сборочного модуля 300 центрифуги. В некоторых примерах сборочный модуль 300 центрифуги может быть выполнен с возможностью охлаждения камеры 316 до температуры от 0º до 10ºC, от 2º до 8ºC и наиболее предпочтительно до примерно 4ºC. Кроме того, может быть предусмотрен контроль конденсации для ограничения влажности в камере 316. Климатический контроль в некоторых вариантах осуществления устанавливается через систему обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Например, система обработки может направлять сигналы на интерфейсы схемы 320.

[00153] В некоторых вариантах осуществления двигатель 318 вращает привод ротора 308. Ускорение и замедление двигателя 318 и, таким образом, ротора 308 могут управляться системой обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Как показано, у основания двигателя 318 расположен датчик 322 движения (например, акселерометр или гироскоп) для контроля параметров вращения. В качестве альтернативы, датчик движения (не показан), такой как акселерометр или гироскоп, может быть расположен внутри камеры 316 для отслеживания параметров вращения. Система обработки, например, может отслеживать сигналы от датчика движения и анализировать условия для гарантированного безопасного отключения, если вращение находится за пределами параметров. В иллюстративном варианте осуществления плечо ротора может быть спроектировано таким образом, чтобы ротор вращался со скоростью до 10000 оборотов в минуту (об/мин), до 8000 об/мин или до примерно 6500 об/мин. Система обработки может изменять скорость вращения в зависимости от материалов, подаваемых в сборочный модуль 300 центрифуги.

[00154] В некоторых вариантах осуществления модуль для промывки и/или концентрации клеток представляет собой модуль фильтрации. На фиг. 7A, на блок-схеме представлен пример функциональных блоков модуля 700 фильтрации. В некоторых вариантах осуществления основной элемент 702 управления модуля 700 фильтрации включает первый гидравлический насос 704а для закачки промывочной жидкости 706 и второй гидравлический насос 704b для удаления жидких отходов в блок 708 для жидких отходов (например, такой как блок 114 для жидких отходов на фиг. 1A или блок 1228 для жидких отходов на фиг. 12A и 12B). Датчик 712 потока может быть расположен на соединении 714 с блоком 708 для жидких отходов для отслеживания выведения жидких отходов из модуля фильтрации. Клапан 716 (трехходовой клапан, как показано) может быть расположен на соединении 718 с промывочной жидкостью 716 для избирательного соединения промывочной жидкости 716 и модуля 700 фильтрации.

[00155] В некоторых вариантах осуществления модуль 700 фильтрации включает коллектор 720 фильтра для фильтрации и концентрации образца клеток. Коллектор 720 фильтра может включать один или более датчиков 722 температуры и датчик(и) 724 давления для отслеживания потока и температуры промывочной жидкости и/или жидких отходов. В некоторых вариантах осуществления датчики 722, 724 контролируются и анализируются системой обработки автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток, такой как система 1310 обработки на фиг. 13. Коллектор 720 фильтра может включать один или более клапанов 726 для направления потока промывочной жидкости и/или жидких отходов. Например, система обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток может приводить в действие клапаны в соответствии с набором инструкций для направления фильтрации модулем 700 фильтрации.

[00156] Модуль 700 фильтрации включает по меньшей мере один фильтр 730. Примеры фильтров, подходящих для использования в модуле 700 фильтрации, включают мембранные фильтры, керамические фильтры и металлические фильтры. Может использоваться фильтр любой формы; фильтр может быть, например, цилиндрическим или, по существу, плоским. В некоторых вариантах осуществления фильтр, выбранный для данной операции или данного рабочего процесса, зависит от типа рабочего процесса (например, бактериального, дрожжевого, вирусного и т.д.) или объемов обрабатываемых материалов. Например, в то время как плоские фильтры являются относительно дешевыми и широко используемыми, фильтры с большей площадью поверхности, такие как цилиндрические фильтры, могут принимать более высокие скорости потока. В другом примере полые фильтры могут демонстрировать более низкие скорости извлечения при обработке небольших объемов образца (например, менее чем примерно 10 мл). Например, для использования с бактериями предпочтительным может оказаться фильтр, представляющий собой мембранный фильтр, в частности фильтр с полыми волокнами. Под термином «полое волокно» подразумевается трубчатая мембрана. Внутренний диаметр трубки, в некоторых примерах, составляет по меньшей мере 0,1 мм, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мм, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,75 мм, и предпочтительно внутренний диаметр трубки составляет не более 10 мм, более предпочтительно не более 6 мм, наиболее предпочтительно не более 1 мм. Модули фильтрации, имеющие полые волокна, можно приобрести у разных компаний, включая G.E. Life Sciences (Marlborough, MA) и InnovaPrep (Drexel, MO) (см., например, US20110061474A1, Page et al., «Liquid to Liquid Biological Particle Concentrator with Disposable Fluid Pat»).

[00157] В некоторых вариантах осуществления модуль 700 фильтрации включает средство 728 выброса фильтра (например, привод) для выброса фильтра 730 после использования. Например, пользователь или роботизированная система подачи может продвинуть фильтр 730 в положение для использования таким образом, чтобы фильтр удерживался коллектором 720 фильтра во время фильтрации. После фильтрации, чтобы удалить использованный фильтр 730, привод 728 для выброса фильтра может вытолкнуть фильтр 730, освободив фильтр 730 с тем, чтобы пользователь или роботизированная система подачи могла удалить использованный фильтр 730 из модуля 700 фильтрации. Использованный фильтр 730 в некоторых примерах может быть помещен в блок 112 для твердых отходов на фиг. 1А-1В, блок 1218 для твердых отходов на фиг. 12A и 12B, или возвращен в фильтрующий картридж 740, как показано на фиг. 7D.

[00158] Как показано на фиг. 7D, в некоторых вариантах осуществления фильтры 730, предусмотренные в фильтрующем картридже 740, расположенном внутри шасси автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, подают в модуль 700 фильтрации с помощью роботизированной системы обработки (например, роботизированной системы 108 подачи, описанной в отношении фиг.1А и 1В, или роботизированной системой 1218 подачи на фиг.12А и 12В) и до использования находятся внутри модуля 700 фильтрации.

[00159] В некоторых вариантах осуществления модуль 700 фильтрации требует периодической очистки. Например, система обработки может предупреждать пользователя, когда требуется очистка, через пользовательский интерфейс автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток и/или через средство беспроводного обмена сообщениями (например, приложение текстовых сообщений, электронной почты и/или персонального вычислительного устройства). В модуль 700 фильтрации, например, может быть загружен дезактивационный фильтр, а модуль 700 фильтрации может быть очищен промывочным раствором и/или смесью спирта.

[00160] В некоторых вариантах осуществления модуль 700 фильтрации находится в жидкостном соединении через соединение 718 с промывочным картриджем 710 (таким как промывочный картридж 600 на фиг. 6A), содержащим промывочную жидкость 716. Например, после размещения пользователем промывочного картриджа 710 внутри шасси автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, соединение 718 может быть совмещено с нижним входным отверстием промывочного картриджа 710, создавая проход для жидкости между промывочной жидкостью 716 и модулем 700 фильтрации.

[00161] Как показано на фиг. 7B и 7C, в некоторых вариантах осуществления модуль 750 фильтрации с двумя фильтрами включает двойные фильтры 752, 754, расположенные над двойными промывочными резервуарами 754. В примере, каждый фильтр может представлять собой волокнистый фильтр с полой сердцевиной, имеющий поры 45 мкм и площадь более 85 см². В некоторых примерах промывочные резервуары 754 могут иметь объем 50 мл, 100 мл или более 200 мл. В некоторых вариантах осуществления промывочные резервуары 754 расположены в промывочном картридже 756, таком как промывочный картридж или картридж 600 с реагентами на фиг. 6А.

[00162] В некоторых вариантах осуществления система обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток контролирует приведение в действии двойных фильтров 752 в X (по горизонтали) и Z (вертикальном) направлениях, располагая фильтры 752a, 752b в промывочных резервуарах 754. В конкретном примере двойные фильтры 752 могут перемещаться согласованно вдоль оси X, но по оси Z могут двигаться независимо.

[00163] Как показано, двойные фильтры 752 модуля 750 фильтрации соединены с корпусом 758 тонкого рычага. В некоторых вариантах осуществления любые насосы и клапаны модуля 750 фильтрации могут быть расположены удаленно от корпуса 758 (например, на дне шасси автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток). Таким образом, модуль 750 фильтрации может заменить гораздо более громоздкие обычные коммерческие модули фильтрации.

[00164] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления модуль 750 фильтрации находится в жидкостном соединении с системой удаления отходов, предназначенной для выведения жидких отходов в блок хранения жидких отходов, такой как блок 708 хранения на фиг. 7А или блок 114 хранения жидких отходов на фиг. 1А или 1228 на фиг. 12А и 12В.

Модуль трансформации

[00165] Модуль трансформации может реализовывать любые методы трансформации или трансфекции клеток, обычно используемые специалистами в области трансфекции, трансформации и микрофлюидики. Трансформация может происходить в микроцентрифужных пробирках, тестовых пробирках, кюветах, многолуночных планшетах, микроволоконах и проточных инструментах. Температура и управление модулем трансформации могут контролироваться с помощью системы обработки, такой как система 1310 обработки на фиг. 13, с элементами управления, настраиваемыми пользователем и/или с помощью скрипта, установленного в системе обработки.

[00166] Предполагается, что трансформация включает множество известных в данной области способов введения последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-мишень, и термин «трансформация», используемый в настоящем описании, включает все способы трансформации и трансфекции. Такие способы включают, без ограничения, электропорацию, липофекцию, оптопорацию, инъекцию, микропреципитацию, микроинъекцию, липосомы, бомбардировку частицами, сонопорацию, индуцированную лазером порацию, трансфекцию с помощью шариков, со-осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция или DEAE-декстран-опосредованную трансфекцию. Клетки также могут быть приготовлены для введения в них вектора, используя, например, промывку сахарозой или глицерином. Кроме того, могут быть использованы гибридные методы, в которых используются возможности методов механической и химической трансфекции, например магнитофекция, метод трансфекции, в котором химическая трансфекция объединена с механическими методами. В другом примере катионные липиды могут быть использованы в комбинации с генными пушками или электропораторами. Подходящие материалы и методы для трансформации или трансфекции клеток-мишеней можно найти, например, в Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014).

[00167] Среда или буфер, используемые для суспендирования клеток и материала (реагента), подлежащего электропорации в клетки, предназначенные для электропорации, могут быть средой или буфером, включая, без ограничения, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, PBS Хэнкса или раствор Рингера, причем среда может быть предоставлена в картридже с реагентами как часть набора. Для электропорации большинства эукариотических клеток среда или буфер обычно содержит соли для поддержания надлежащего осмотического давления. Соли в среде или буфере также создают проводящую среду. Для электропорации очень мелких прокариотических клеток, таких как бактерии, иногда используют воду или 10% глицерин в качестве среды с низкой проводимостью, обеспечивая очень высокую напряженность электрического поля. В этом случае предназначенные для доставки заряженные молекулы все еще делают водную среду более проводящей, чем клеточные мембраны на липидной основе, и такую среду все еще можно условно считать проводящей, особенно по сравнению с клеточными мембранами.

[00168] Соединение, предназначенное для введения с помощью электропорации в выбранные клетки, может представлять собой любое соединение, известное в данной области, которое может быть использовано для электропорации, такое как нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, ДНК, РНК, пептиды, белки и малые молекулы, такие как гормоны, цитокины, хемокины, лекарственные вещества или прекурсоры лекарственных веществ.

[00169] Важно использовать напряжение, достаточное для осуществления электропорации материала в клетке, но не слишком высокое, поскольку слишком большая мощность снизит жизнеспособность клетки. Например, для электропорации суспензии человеческой клеточной линии необходимо 200 вольт для образца объемом 0,2 мл в кювете с зазором 4 мм с экспоненциальным разрядом из конденсатора примерно 1000 мкФ. Однако, если такую же суспензию клеток объемом 0,2 мл поместить в более длинный контейнер с расстоянием между электродами 2 см (с 5-кратно увеличенным зазором в кювете), требуемое напряжение составит 1000 вольт, при этом, необходим конденсатор емкостью всего 40 мкФ (1/25 от 1000 мкФ), потому что электрическая энергия от конденсатора определяется из уравнения:

E=0,5 U² C

где E - электрическая энергия, U - напряжение, а C - емкость. Поэтому генератор импульсов высокого напряжения на самом деле прост в изготовлении, поскольку для хранения такого же количества энергии требуется гораздо меньший конденсатор. Аналогично, не сложно генерировать другие формы волны при более высоких напряжениях.

[00170] Устройства электропорации по настоящему изобретению могут обеспечивать высокую скорость трансформации клеток за относительно короткое время. Скорость трансформации клеток зависит от типа клеток и количества трансформируемых клеток. Например, для E. Coli устройства электропорации могут обеспечивать скорость трансформации клеток от 1 до 10¹⁰ клеток в секунду, от 10⁴ до 10⁷ в секунду, от 10⁵ до 10⁸ в секунду или от 10⁶ до 10⁹ в секунду. Устройства электропорации также позволяют трансформировать партии клеток в диапазоне от 1 клетки до 10¹⁰ клеток за одну процедуру трансформации с помощью такого устройства.

[00171] Эффективность трансформации с помощью устройств для электропорации по настоящему изобретению может привести к тому, что по меньшей мере 10% клеток будут подвергнуты порации в достаточной степени, чтобы обеспечить доставку биологической молекулы. Предпочтительно эффективность трансформации с помощью устройств электропорации по настоящему изобретению может приводить к получению по меньшей мере 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более клеток, которые подвергнуты порации в достаточной степени, чтобы обеспечить доставку биологической молекулы.

[00172] В некоторых вариантах осуществления электропорацию проводят в кювете, лунке, пробирке, камере, проточной ячейке, канале или наконечнике дозатора. В других вариантах осуществления кювету, лунку, пробирку или камеру заполняют и опорожняют снизу. В некоторых вариантах осуществления кювета содержит сиппер, соединенный с дном.

[00173] На фиг. 5А показан пример одноблочного устройства 500 электропорации (модуля электропорации), включающего, в направлении сверху вниз, корпус 502, который содержит элемент 504 захвата, выполненный с возможностью захвата дозатора, такого как автоматический поршневой дозатор (не показан), и фильтра 506. В дополнение к корпусу 502 имеется часть кюветы 510 электропорации в устройстве 500 электропорации, включающая электроды 512, и стенки 514 камеры 516 электропорации. В некоторых примерах камера может иметь ширину от 0,01 до 100 мм, высоту от 1 до 5000 мм и объем от 1 до 20000 мкл; ширину от 0,03 до 50 мм, высоту от 50 до 2000 мм и объем от 500 до 10000 мкл; или ширину от 0,05 до 30 мм, высоту от 2 до 500 мм и объем от 25 до 4500 мкл.

[00174] В некоторых вариантах осуществления первый резервуар 508 может быть размещен между фильтром 506 и камерой 516 электропорации, при этом первый резервуар находится в жидкостном соединении с камерой 516 электропорации и обеспечивает пустое хранилище для любого образца клеток, который может быть размещен за пределами камеры электропорации 516. В некоторых примерах первый резервуар 508 может иметь ширину от 0,1 до 150 мм, высоту от 0,1 до 250 мм и объем от 0,5 до 10000 мкл; ширину от 0,3 до 100 мм, высоту от 30 до 150 мм и объем от 20 до 4000 мкл; или ширину от 0,5 до 100 мм, высоту от 0,5 до 100 мм и объем от 5 до 2000 мкл.

[00175] В некоторых вариантах осуществления устройство 500 электропорации может дополнительно включать другой резервуар 524, находящийся в жидкостном соединении (через фильтр 506) с первым резервуаром 508. Второй резервуар 524 может быть размещен между фильтром 506 и элементом 504 захвата для защиты дозатора от загрязнения любыми жидкостями, которые могут находиться вне фильтра 506. В некоторых примерах второй резервуар 524 может иметь ширину от 0,1 до 250 мм, высоту от 0,2 до 1000 мм и объем от 0,1 до 2,500 мкл; ширину от 0,1 до 150 мм, высоту от 50 до 400 мм и объем от 1 до 1000 мкл; или ширину от 0,2 до 100 мм, высоту от 0,5 от 200 мм и объем от 2 до 600 мкл.

[00176] В некоторых вариантах осуществления сиппер 518 находится в жидкостном соединении с камерой 516 электропорации и соединен с ней, при этом сиппер 518 имеет проксимальный конец 520 по отношению к камере 516 электропорации, и дистальный конец 522 по отношению к камере 516 электропорации. Дистальный конец 522 сиппера 518 может всасывать и дозировать образец клеток из устройства 500 электропорации. В некоторых вариантах осуществления сиппер 518 является частью роботизированной системы подачи. В некоторых примерах сиппер 518 может быть изготовлен из пластика, такого как поливинилхлорид, полиэтилен, полиамид, полиэтилен, полипропилен, акрилонитрилбутадиен, поликарбонат, полиэфиртекетон (PEEK), полисульфон и полиуретан, сополимеры этих и других полимеров, стекла (например, стеклянный капилляр) и металлических трубок, таких как алюминий, нержавеющая сталь или медь. Примеры материалов включают сополимеры кристаллического стирола и циклического олефина. PEEK является предпочтительным пластиком, учитывая его низкую стоимость и простоту изготовления. В некоторых примерах сиппер 518 может иметь ширину от 0,02 до 2000 мм, высоту от 0,25 до 2000 мм и объем от 1 до 2000 мкл; ширину от 0,02 до 1250 мм, высоту от 250 до 1500 мм и объем от 1,5 до 1500 мкл; или ширину от 0,02 до 10 мм, высоту от 4,0 до 1000 мм и объем от 2,5 до 1000 мкл.

[00177] В некоторых примерах корпус 502 и элемент 504 захвата устройства электропорации могут быть изготовлены из силикона, смолы, поливинилхлорида, полиэтилена, полиамида, полиэтилена, полипропилена, акрилонитрилбутадиена, поликарбоната, полиэфиртекетона (PEEK), полисульфонона и полиуретана, сополимеров этих и других полимеров. Аналогично, стенки 512 камеры электропорации, в некоторых примерах, могут быть выполнены из силикона, смолы, стекла, стекловолокна, поливинилхлорида, полиэтилена, полиамида, полиэтилена, полипропилена, акрилонитрилбутадиена, поликарбоната, полиэфиртекетона (PEEK), полисульфона и полиуретана, сополимеров этих и других полимеров. Примеры материалов включают сополимеры кристаллического стирола и циклического олефина. Эти структуры или их части могут быть созданы различными способами, например, литьем под давлением, сплавлением созданных структурных слоев и т.д. Поликарбонатные и циклические олефиновые полимеры являются предпочтительными материалами.

[00178] В некоторых вариантах осуществления камера 516 электропорации обычно имеет цилиндрическую форму. В других вариантах осуществления камера 516 электропорации может быть прямоугольной, конической или квадратной.

[00179] В некоторых примерах фильтр 506 может быть изготовлен из пористых пластмасс, гидрофобного полиэтилена, хлопка или стекловолокна. Предпочтительно фильтр 506 состоит из недорогого материала, такого как пористая пластмасса. Фильтр может иметь ширину от 0,2 до 500 мм, высоту от 0,2 до 500 мм и объем от 1 до 3000 мкл; ширину от 0,3 до 250 мм, высоту от 20 до 200 мм и объем от 50 до 2500 мкл; или ширину от 0,5 до 150 мм, высоту от 0,2 до 80 мм и объем от 10 до 2000 мкл.

[00180] Элемент 504 захвата выполнен таким образом, чтобы его размер был совместим с устройством подачи жидкости, используемым в инструменте электропорации.

[00181] Компоненты устройств электропорации могут быть изготовлены отдельно и затем собраны, или определенные компоненты устройств электропорации могут быть изготовлены или отлиты как единое целое, с другими компонентами, добавленными после формования. Например, сиппер, стенки и корпус модуля электропорации могут быть изготовлены или отлиты в виде единой детали, к которой затем добавляют электроды, фильтр, элемент захвата для формирования модуля электропорации. Аналогично, стенки и корпус модуля электропорации могут быть изготовлены как единое целое, при этом после формования в модуль электропорации добавляют сиппер, электроды, фильтр, элемент захвата. Возможны другие комбинации встроенных и неинтегрированных компонентов.

[00182] Электроды 512 могут быть выполнены из металла, такого как медь, титан, алюминий, латунь, серебро, родий, золото или платина, или графита, способного выдерживать воздействие электрического поля. Например, прикладываемое электрическое поле может разрушить электроды, сделанные из металлов, таких как алюминий. Если требуется многоразовое устройство электропорации, электродные пластины могут быть покрыты металлами, стойкими к электрохимической коррозии. Для защиты электродных пластин могут быть использованы проводящие покрытия, такие как благородные металлы, например золото. В конкретном примере кювета для электропорации может включать первый металлический электрод и второй металлический электрод, выполненный из титана, покрытого слоем золота. И наоборот, если устройство 500 электропорации предназначено для одноразового использования (например, расходный материал), могут использоваться менее дорогие металлы, такие как алюминий.

[00183] В одном из вариантов осуществления расстояние между электродами может составлять от 0,3 мм до 10 мм. В другом варианте осуществления расстояние между электродами может составлять от 1 мм до 20 мм, или от 1 мм до 10 мм, или от 2 мм до 5 мм. Внутренний диаметр камеры электропорации может составлять от 0,1 мм до 10 мм. Чтобы избежать разной напряженности поля между электродами, электроды должны быть расположены параллельно на постоянном расстоянии друг от друга по всей поверхности электродов. Предпочтительно, первый металлический электрод и второй металлический электрод расположены параллельно на расстоянии 2-4 мм друг от друга с погрешностью менее +/-20 мкм. Кроме того, поверхность электродов должна быть как можно более гладкой, без отверстий и выступов. Электроды, имеющие шероховатость Rz от 1 до 10 мкм, являются предпочтительными. В других вариантах осуществления устройство электропорации включает по меньшей мере один дополнительный электрод, который прикладывает потенциал заземления, например, к участку сиппера устройства электропорации.

[00184] Хотя показано одноблочное устройство 500, в других вариантах осуществления модуль электропорации включает множество модулей электропорации. Каждый блок электропорации может быть выполнен с возможностью электропорации клеток объемом от 1 мкл до 20 мл. Например, в многоблочном устройстве электропорации могут быть использованы блоки электропорации с разной объемной емкостью.

[00185] В некоторых вариантах осуществления в многоблочном модуле электропорации электроды представляют собой независимые автономные элементы. В других вариантах осуществления многоблочное устройство электропорации может включать электроды, расположенные так, что возможно совместное использование электродов в кюветах электропорации смежных блоков электропорации. Такие многоблочные устройства электропорации могут включать, например, 2 или более блоков электропорации, 4 или более блоков электропорации, 8 или более блоков электропорации, 16 или более блоков электропорации, 32 или более блоков электропорации, 48 или более блоков электропорации, 64 или более блоков электропорации или даже 96 или более блоков электропорации предпочтительно в автоматизированном устройстве. При использовании нескольких параллельных устройств в каждом блоке обычно используются одинаковые объемы.

[00186] Хотя приведены примерные размеры, эти размеры, конечно, будут меняться в зависимости от объема образца клеток и контейнера(ов), которые используются для хранения клеток и/или материала, подлежащего электропорации.

[00187] В предпочтительных вариантах осуществления модуль трансформации включает, по меньшей мере, одно проточное устройство электропорации, имеющее корпус с камерой электропорации, первый электрод и второй электрод, выполненные с возможностью взаимодействия с генератором электрического импульса. В некоторых вариантах осуществления проточные устройства электропорации выполнены с возможностью стыковки со сменным картриджем, таким как картриджи 104, 106 на фиг. 1А (например, модуль 110с трансформации), посредством которого электрические контакты соединяются с электродами устройства электропорации. В некоторых вариантах осуществления устройства электропорации являются автоклавируемыми и/или расходным материалом, упакованы с реагентами в картридже с реагентами и/или могут быть удаляемыми из картриджа с реагентами. Устройство электропорации может быть выполнено с возможностью осуществления электропорации клеточных образцов объемом от 1 мкл до 2 мл, от 10 мкл до 1 мл, от 25 мкл до 750 мкл или от 50 мкл до 500 мкл. Клетки, которые могут быть электропорированы с помощью раскрытых устройств электропорации, включают клетки млекопитающих (включая клетки человека), клетки растений, дрожжей, другие эукариотические клетки, бактерий, архей и другие типы клеток.

[00188] В некоторых вариантах осуществления картриджи с реагентами для использования в автоматизированных многомодульных системах для обработки клеток (например, картридж 104 на фиг.1А) включают одно или более устройств электропорации (например, модуль 110с электропорации на фиг.1А), предпочтительно проточные устройства электропорации. Фиг. 5B представляет собой вид снизу в перспективе набора 530 из шести объединенных проточных устройств электропорации (например, блоков или модулей) 532a-f, которые могут быть частью картриджа с реагентами, а на фиг. 5С показан вид сверху того же самого набора. Картридж может включать от одного до шести или более проточных блоков 532a-f электропорации, расположенных на одной подложке 534. Каждый из шести проточных блоков 532a-f электропорации имеет соответствующие лунки 536a-f для введения образцов клеток и лунки 538a-f (см. фиг. 5C) выдачи образцов клеток. Кроме того, как видно на фиг. 5B, каждый блок 532a-f электропорации включает соответствующий вход 540a-f, соответствующий выход 542a-f, соответствующий проточный канал 544a-f и два электрода 546a-f по обе стороны от сужения в соответствующем проточном канале 544a-f в каждом проточном блоке 532a-f электропорации.

[00189] После изготовления шести проточных блоков 532a-f электропорации, в некоторых вариантах осуществления, они могут быть отделены друг от друга вдоль линий разлома, отделяющей каждый блок от смежного блока (т.е. «отломаны»), и использованы одновременно или, альтернативно, в других вариантах осуществления, два или более проточных блока 532a-f электропорации могут быть использованы параллельно, и в этом случае эти два или более блоков предпочтительно остаются соединенными по линии разлома.

[00190] Говоря в общем, микрофлюидная электропорация - с использованием клеточной суспензии объемом менее чем примерно 10 мл и всего лишь 1 мкл - позволяет более точно контролировать процесс трансфекции или трансформации и обеспечивает гибкую интеграцию с другими инструментами для обработки клеток по сравнению с лабораторными устройствами электропорации. Таким образом, микрофлюидная электропорация обеспечивает уникальные преимущества, например, для трансформации, обработки и анализа единичных клеток; конфигурации многомодульного устройства электропорации; и интегрированную автоматическую многомодульную обработку, и анализ клеток.

[00191] Проточные устройства электропорации, включенные в картриджи с реагентами, могут обеспечить высокоэффективную электропорацию клеток с низкой токсичностью. В конкретных вариантах осуществления проточных устройств электропорации по изобретению уровень токсичности трансформации позволяет получить более чем 10% жизнеспособных клеток после электропорации, предпочтительно, более чем 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже 95% жизнеспособных клеток после трансформации в зависимости от типа клеток и нуклеиновых кислот, вводимых в клетки.

[00192] После трансформации клеткам дают возможность восстановиться в условиях, способствующих процессу редактирования генома, который происходит в клетках в результате трансформации и экспрессии введенных нуклеиновых кислот.

Способ автоматизированной многомодульной обработки клеток

[00193] На фиг. 9 представлена схема последовательности операций примера способа 900 применения автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток, такой как системы, показанные на фиг. 1А-1В и 12А-12В. Система обработки по фиг. 13, например, может направлять этап обработки способа 900. Например, программный скрипт может идентифицировать установочные параметры для каждого этапа обработки и инструкции для перемещения роботизированной системы подачи для выполнения действия способа 900. В некоторых вариантах осуществления программный скрипт с инструкциями может быть определен картриджем, установленным в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток. Например, картридж может включать машиночитаемые знаки, такие как штрих-код или QR-код, включая идентификацию скрипта, хранящегося в памяти автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток (например, такого как память 1302 на фиг. 13). В другом примере картридж может содержать загружаемый скрипт, встроенный в машиночитаемый знак, такой как радиочастотная (RF) метка. В других вариантах осуществления пользователь может идентифицировать скрипт, например, путем загрузки скрипта через проводное или беспроводное соединение в систему обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток или путем выбора сохраненного скрипта через пользовательский интерфейс автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В конкретном примере, автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток может включать интерфейс с сенсорным экраном для предоставления пользовательских установочных параметров и для активации процесса обработки клеток.

[00194] В некоторых вариантах осуществления способ 900 начинается с переноса клеток в модуль (902) для выращивания. Модуль для выращивания, например, может представлять собой модуль 800 для выращивания, описанный со ссылкой на фиг. 8А-8F. В конкретном примере система 120 обработки может направлять роботизированную систему 108 подачи на передачу клеток 106 в модуль 110a для выращивания, как описано со ссылкой на фиг. 12А и 12В. В другом примере, описанном со ссылкой на фиг. 1А, клетки могут быть перенесены роботизированной системой 108 подачи из одного из картриджей 104, 106 в модули 110а, 110b для выращивания. В некоторых вариантах осуществления флакон для выращивания может быть заполнен средой для выращивания и поставляться, например, как часть набора. В других вариантах осуществления флакон для выращивания может быть заполнен средой, переносимой, например, с помощью устройства подачи жидкости из контейнера с реагентом.

[00195] В некоторых вариантах осуществления перед переносом клеток (например, из картриджа 104 с реагентами или из флакона, добавленного к инструменту), машиночитаемые знаки могут сканироваться на флаконе или другом контейнере, расположенном в положении, предназначенном для клеток, таким образом подтверждая тот факт, что флакон или контейнер помечены как содержащие клетки. Кроме того, машиночитаемый знак может указывать тип клеток, доставленных в инструмент. В некоторых вариантах осуществления инструмент может выбирать конкретный скрипт обработки (например, серию инструкций для роботизированной системы подачи и установочные параметры, и активацию различных модулей) в зависимости от типа клеток.

[00196] В некоторых вариантах осуществления клетки выращивают в модуле для выращивания до требуемой оптической плотности (904). Например, система 126 обработки на фиг. 1А-1В или система обработки 1220 на фиг. 12A-B может управлять настройкой температуры модуля 110a для выращивания для инкубации клеток в процессе цикла выращивания. Система 126, 1220 обработки может дополнительно принимать сигналы датчиков от модуля 110а, 110b для выращивания, указывающие оптическую плотность, и анализировать сигналы датчиков для контроля роста клеток. В некоторых вариантах осуществления пользователь может устанавливать параметры роста для управления ростом клеток, например, температуру и степень перемешивания клеток. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления пользователь может обновлять процесс выращивания. Обновления, в некоторых примерах, могут включать сообщение, представленное в пользовательском интерфейсе автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток, текстовое сообщение на номер мобильного телефона пользователя, сообщение электронной почты на электронную почту клиента или сообщение, переданное в приложение, исполняемое на портативном электронном устройстве (например, на мобильном телефоне, планшете и т.д.). В некоторых вариантах осуществления в ответ на сообщения пользователь может изменять параметры, такие как температура, для регулировки роста клеток. Например, пользователь может передавать обновленные параметры через пользовательский интерфейс автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток или через приложение портативного вычислительного устройства, связанного с автоматизированной многомодульной системой для обработки клеток, такое как пользовательский интерфейс 1100 по фиг. 11.

[00197] Хотя описание представлено в отношении оптической плотности, в других вариантах осуществления рост клеток в модуле для выращивания можно отслеживать с помощью другой меры плотности и физиологического состояния клеток, такой как, в некоторых примерах, pH, растворенный кислород, высвобождаемые ферменты, акустические свойства и электрические свойства.

[00198] В некоторых вариантах осуществления после достижения требуемой оптической плотности (904) клетки переносят из модуля для выращивания в модуль фильтрации или в модуль промывки и концентрации клеток (906). Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1А-1В или 1208 на фиг. 12A-12B, например, может переносить клетки из модуля 1210a для выращивания в модуль 1210b фильтрации. Модуль фильтрации, например, может быть предназначен для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными. Кроме того, модуль фильтрации может быть выполнен с возможностью уменьшения объема образца клеток до объема, подходящего для электропорации. В другом примере модуль фильтрации может быть выполнен с возможностью удаления нежелательных компонентов, таких как соли, из образца клеток. В некоторых вариантах осуществления роботизированная система 108 подачи передает промывочный раствор в модуль 1210b фильтрации для промывки клеток.

[00199] В некоторых вариантах осуществления в модуле фильтрации или модуле промывки и концентрации клеток (908) клетки делают электрокомпетентными и элюируют. Клетки могут быть элюированы с помощью промывочного раствора. Например, клетки могут быть элюированы с помощью реагентов из источника реагентов. Например, модуль фильтрации или модуль промывки и концентрации клеток может быть аналогичен модулю 700 фильтрации, показанному на фиг. 7А и 7В. Как обсуждалось выше, для промывки клеток можно использовать множество различных методов, включая очистку в градиенте плотности, диализ, ионообменные колонки, фильтрацию, центрифугирование, разбавление и использование шариков для очистки. В некоторых аспектах в модуле промывки и концентрации клеток используется центрифужное устройство. В других аспектах в модуле фильтрации используется инструмент фильтрации. В других аспектах шарики связаны с фрагментами, которые связываются с поверхностью клетки. Эти группы включают, без ограничения, антитела, лектины, агглютинин зародышей пшеницы, мутированные лизоцимы и лиганды. В других аспектах клетки разработаны таким образом, чтобы они могли намагничиваться, позволяя магнитам осаждать клетки после этапов промывки. Механизм намагничивания клеток может включать, без ограничения, экспрессию белка ферритина.

[00200] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор подают в модуль фильтрации перед элюцией. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 12A-12B, например, может переносить промывочный раствор из флакона или контейнера, расположенного в положении, предназначенном для промывочного раствора. Перед переносом промывочного раствора машиночитаемые знаки могут быть отсканированы на флаконе или другом контейнере или резервуаре, расположенном в положении, предназначенном для промывочного раствора, для подтверждения содержимого флакона, контейнера или резервуара. Кроме того, машиночитаемый знак может указывать тип промывочного раствора, подаваемого в инструмент. В некоторых вариантах осуществления, исходя из типа промывочного раствора, система осуществляет выбор конкретного скрипта обработки (например, установочных параметров и активации модуля фильтрации, подходящего для конкретного промывочного раствора).

[00201] В других вариантах осуществления клетки элюируют в модуле для промывки клеток промывочного картриджа. Например, элюированные клетки могут быть собраны в пустом сосуде промывочного картриджа 106, показанного на фиг. 1А, и роботизированная система 108 подачи может доставить среду из картриджа 104 с реагентами (или лунки с реагентами промывочного картриджа 10b) в элюированные клетки.

[00202] После того, как клетки стали электрокомпетентными и были суспендированы в соответствующем объеме, таком как от 50 мкл до 10 мл, или от 100 мкл до 80 мл, или от 150 мкл до 8 мл, или от 250 мкл до 7 мл, или от 500 мкл до 6 мл или от 750 мкл до 5 мл, для трансформации в модуле (906) фильтрации, в некоторых вариантах осуществления клетки переносят в модуль (918) трансформации. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B, например, может переносить клетки из модуля фильтрации в модуль 110c трансформации. Модуль фильтрации может быть физически связан с модулем трансформации или эти модули могут быть отдельными. В варианте осуществления, таком как инструмент 100 на фиг. 1А, с картриджами в виде расходных материалов, перед переносом в модуль трансформации клетки могут быть элюированы в резервуар внутри картриджа, такого как картридж 104 с реагентами.

[00203] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты получают вне автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Например, собранный вектор или другая сборка нуклеиновой кислоты может быть введена пользователем в качестве реагента до запуска процесса трансформации и других процессов в способе 900.

[00204] Однако в других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты получают с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Часть следующих этапов 910-916, в некоторых вариантах осуществления, выполняется параллельно с частью этапов 902-908. По меньшей мере, часть следующих этапов, в некоторых вариантах осуществления, выполняется до и/или после этапов 902-908.

[00205] В некоторых вариантах осуществления в модуль (910) сборки нуклеиновых кислот доставляют нуклеиновые кислоты, такие как редактирующий олигонуклеотид и остов вектора, а также, в некоторых примерах, ферменты и другие компоненты реакции. Модуль сборки нуклеиновых кислот может быть выполнен с возможностью выполнения одного или более из множества различных методов сборки нуклеиновых кислот в автоматическом режиме. Методы сборки нуклеиновых кислот, которые могут быть выполнены в модуле сборки нуклеиновых кислот, могут включать, без ограничения, методы сборки, в которых используются рестрикционные эндонуклеазы, включая ПЦР, сборку BioBrick, клонирование типа IIS (например, сборку GoldenGate) и лигазную циклическую реакцию. В других примерах модуль сборки нуклеиновых кислот может выполнять метод сборки, основанный на перекрывании смежных частей нуклеиновых кислот, такой как Gibson Assembly®, CPEC, SLIC, Ligase Cycling и т.д. Дополнительные примеры методов сборки, которые могут выполняться модулем сборки нуклеиновых кислот включают восстановление зазоров (гэпов) в дрожжах, gateway-клонирование и клонирование, опосредованное топоизомеразой. Модуль сборки нуклеиновых кислот, например, может быть модулем 400 сборки нуклеиновых кислот, описанным со ссылкой на фиг. 4. В конкретном примере система 120 обработки может направлять роботизированную систему 1208 подачи на перенос нуклеиновых кислот 1206 в модуль 1210e сборки нуклеиновых кислот, описанный со ссылкой на фиг. 12В. В другом примере, описанном со ссылкой на фиг. 1А, нуклеиновые кислоты могут быть перенесены роботизированной системой 108 подачи из одного из картриджей 104, 106 в модуль сборки нуклеиновых кислот.

[00206] В некоторых вариантах осуществления, перед переносом каждого из образцов нуклеиновых кислот, ферментов и других компонентов реакции, машиночитаемые знаки могут быть отсканированы на флаконах или других контейнерах, расположенных в местах, предназначенных для этих материалов для подтверждения того, что флаконы или контейнеры помечены как содержащие требуемый материал. Кроме того, машиночитаемые знаки могут указывать тип одного или более образцов нуклеиновых кислот, ферментов и других компонентов реакции, доставляемых в инструмент. В некоторых вариантах осуществления, инструмент может выбирать конкретный скрипт обработки (например, серию инструкций для роботизированной системы подачи для идентификации дополнительных материалов и/или установочные параметры и активацию модуля для сборки нуклеиновой кислоты) в зависимости от типа(ов) материалов.

[00207] В некоторых вариантах осуществления температура в модуле сборки нуклеиновых кислот контролируется в зависимости от типа используемой сборки нуклеиновой кислоты. Например, когда в модуле сборки нуклеиновых кислот используется ПЦР, модуль может быть выполнен с возможностью термоциклирования, позволяя устанавливать температурный цикл между денатурацией, отжигом и удлинением. Когда в модуле сборки нуклеиновых кислот используются методы сборки при одной температурой, модуль выполнен с возможностью достижения и поддержания температуры, которая оптимизирует конкретный процесс сборки.

[00208] В некоторых вариантах осуществления управление температурой осуществляется системой обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, такой как система 1310 обработки на фиг. 13. Эти температуры и продолжительность поддержания температуры могут быть определены с помощью предварительно запрограммированного набора параметров (например, идентифицированного в скрипте для обработки или в другой области памяти, доступной для системы обработки), или могут управляться пользователем вручную через интерфейс с системой обработки.

[00209] После того, как прошло достаточное количество времени для протекания реакции сборки, в некоторых вариантах осуществления сборку нуклеиновой кислоты переносят в модуль (914) очистки. Система обработки, например, может контролировать время реакции сборки на основе одного или более из: типа реакции, типа материалов и пользовательских установочных параметров, предоставленных автоматизированному многомодульному инструменту для обработки клеток. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, например, может переносить сборку нуклеиновой кислоты в модуль очистки через интерфейс сиппера или дозатора. В другом примере роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, может переносить флакон, содержащий сборку нуклеиновых кислот, из камеры модуля сборки нуклеиновых кислот в камеру модуля обессоливания/очистки.

[00210] В некоторых вариантах осуществления сборку нуклеиновых кислот обессоливают и элюируют в модуле (916) очистки. Модуль очистки, например, может удалять нежелательные компоненты из смеси для сборки нуклеиновых кислот (например, соли, минералы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления модуль очистки концентрирует собранные нуклеиновые кислоты в объеме меньшем, чем объем, используемый для сборки нуклеиновых кислот. Примеры способов замены жидкости после сборки нуклеиновых кислот включают магнитные шарики (например, SPRI или Dynal (Dynabeads) от Invitrogen Corp. of Carlsbad, CA), кварцевые шарики, silica spin колонки, стеклянные шарики, осаждение (например, с помощью этанола или изопропанола), щелочной лизис, осмотическую очистку, экстракцию бутанолом, мембранные методы разделения, фильтрацию и т.д.). Например, можно использовать один или более микроконцентраторов, снабженных анизотропными, гидрофильными целлюлозными мембранами различной пористости. В другом примере обработка жидкого образца, включающего нуклеиновую кислоту и ионную соль, в модуле обессоливания/очистки может проходить путем приведения смеси в контакт с ионообменником, включающим нерастворимую фосфатную соль, удаления жидкости и элюции нуклеиновой кислоты из ионообменника.

[00211] В иллюстративном варианте осуществления сборка нуклеиновых кислот может быть объединена с магнитными шариками, такими как шарики SPRI, в камере модуля очистки. Сборку нуклеиновых кислот можно инкубировать при заданной температуре в течение времени, достаточного для связывания сборки нуклеиновых кислот с магнитными шариками. После инкубации рядом с камерой может быть установлен магнит таким образом, что сборка нуклеиновых кислот может быть промыта и элюирована. Иллюстративный пример этого процесса обсуждается в отношении комбинации модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот с модулем очистки, показанным на фиг. 4.

[00212] После элюции сборки нуклеиновых кислот, в некоторых вариантах осуществления, сборку нуклеиновых кислот переносят в модуль (918) трансформации. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, например, может переносить сборку нуклеиновых кислот в модуль трансформации через интерфейс сиппера или дозатора, например, к модулю электропоратора на основе кюветы или модуль проточного электропоратора, как описано выше. Например, обессоленные собранные нуклеиновые кислоты во время переноса могут быть объединены с электрокомпетентными клетками, полученными на этапе 908. В других вариантах осуществления модуль трансформации может принимать электрокомпетентные клетки и сборку нуклеиновых кислот по отдельности и смешивать их (например, открыть один или более каналов для объединения материалов в общей камере).

[00213] Клетки могут быть трансформированы в модуле (920) трансформации. Трансформация может включать любой известный в данной технике метод введения последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-мишень (трансформацию или трансфекцию), включая, в некоторых случаях, электропорацию, липофекцию, оптопорацию, инъекцию, микропреципитацию, микроинъекцию, липосомы, бомбардировку частицами, сонопорацию, индуцированную лазерм порацию, трансфекцию с помощью шариков, со-осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция или трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном. В некоторых вариантах осуществления, могут быть использованы гибридные методы, в которых используются возможности методов механической и химической трансфекции, например магнитофекция, метод трансфекции, в котором химическая трансфекция объединена с механическими методами. В другом примере в комбинации с генными пушками или электропораторами могут быть использованы катионные липиды.

[00214] В некоторых вариантах осуществления в модуле трансформации используется электропорация для инициации поглощения ДНК-материала. Буфер или среду можно перенести в модуль трансформации и добавить к клеткам для возможности суспендирования клеток в буфере или среде, которые благоприятны для выживания клеток во время электропорации. Перед переносом буфера или среды машиночитаемые знаки могут быть отсканированы на флаконе или другом контейнере или резервуаре, расположенном в положении, предназначенном для буфера или среды, для подтверждения содержимого флакона, контейнера или резервуара. Кроме того, машиночитаемый знак может указывать тип буфера или носителя, подаваемого на инструмент. В некоторых вариантах осуществления, исходя из типа буфера или среды, инструмент осуществляет выбор конкретного скрипта обработки (например, установочных параметров и активации модуля трансформации, подходящего для конкретного буфера или среды). Для электропорации бактериальных клеток могут быть использованы среды с низкой проводимостью, такие как растворы воды или глицерина, для уменьшения тепловыделения сильным проходящим током. Для дрожжевых клеток можно использовать раствор сорбита. Для электропорации клеток млекопитающих клетки можно суспендировать в среде с высокой проводимостью или в буфере, таком как MEM, DMEM, IMDM, RPMI, Хэнкса, PBS, HBSS, HeBS и раствор Рингера. В конкретном примере роботизированная система 108 подачи может передавать буферный раствор в модуль 110c трансформации из одного из картриджей 104, 106. Например, модуль трансформации может быть проточным модулем электропорации, таким как модули электропорации, описанные в отношении фиг. 5А и 5В. Как описано в отношении фиг. 1А и фиг. 5B, модуль трансформации может представлять собой одноразовый проточный модуль 110c электропорации, снабженный картриджем 104, показанным на фиг. 1А.

[00215] В некоторых вариантах осуществления модуль трансформации дополнительно подготавливает клетки к поглощению нуклеиновых кислот. Например, перед добавлением нуклеиновых кислот бактериальные клетки могут быть обработаны промывкой сахарозой или глицерином, а дрожжевые клетки могут быть обработаны раствором ацетата лития, дитиотреитола (DTT) и TE-буфера. В других вариантах осуществления, включающих подготовку клеток для поглощения нуклеиновых кислот, модуль фильтрации или другой отдельный модуль (например, модуль для промывки клеток) может подготовить клетки к корректировке нуклеиновой кислоты.

[00216] После трансформации клетки переносят во второй модуль (922) для выращивания/восстановления/редактирования. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, например, может переносить трансформированные клетки во второй модуль для выращивания через интерфейс сиппера или дозатора. В другом примере роботизированная система 108 обработки на фиг. 1А-1В или 12А-12В может переносить флакон, содержащий трансформированные клетки, из камеры модуля трансформации в камеру второго модуля для выращивания.

[00217] В некоторых вариантах осуществления, второй модуль для выращивания функционирует как модуль восстановления, позволяя клеткам восстановиться после процесса трансформации. В других вариантах осуществления клетки могут быть доставлены в отдельный модуль восстановления перед транспортировкой во второй модуль для выращивания. Во время восстановления во втором модуле для выращивания может происходить поглощение трансформированными клетками введенных нуклеиновых кислот и, в некоторых аспектах, их встраивание в геном клетки. Второй модуль для выращивания может быть выполнен с возможностью инкубации клеток при любой определенной пользователем температуре, оптимальной для выращивания клеток, предпочтительно 25º, 30º или 37ºC.

[00218] В некоторых вариантах осуществления второй модуль для выращивания функционирует как модуль отбора, в котором происходит отбор трансформированных клеток с использованием антибиотика или другого реагента. В одном из примеров для отбора используется белковая система РНК-направляемой нуклеазы (RGN) для расщепления геномов клеток, которые не получили нужную правку. Белковая система RGN, используемая для отбора, может быть такой же или отличаться от RGN, используемой для редактирования. В примере селективного агента, представляющего собой антибиотик, антибиотик может быть добавлен во второй модуль для выращивания для осуществления отбора. Подходящие гены устойчивости к антибиотикам включают, без ограничения, такие как ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к канаванину, ген устойчивости к бластицидину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к пуромицину и ген устойчивости к хлорамфениколу. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, например, может переносить антибиотик во второй модуль для выращивания через интерфейс типа «сиппер» или «дозатор». В некоторых вариантах осуществления удаляют фон, создаваемый мертвыми клетками, используя литические усилители, такие как детергенты, осмотический стресс при промывке гипотоническим раствором, температуру, ферменты, протеазы, бактериофаг, восстановители или хаотропы. Система обработки 1310 на фиг. 13, например, может изменять параметры среды, такие как температура, для стимуляции отбора, тогда как роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B может доставлять дополнительные материалы (например, детергенты, ферменты, восстановители и т.д.) для облегчения отбора. В других вариантах осуществления для уменьшения фона мертвых клеток используются удаление клеток и/или замена среды фильтрацией.

[00219] В других вариантах осуществления, в дополнение или в качестве альтернативы к отбору, второй модуль для выращивания служит в качестве модуля редактирования, обеспечивающего редактирование генома в трансформированных клетках. Альтернативно, в других вариантах осуществления клетки после восстановления и отбора (если выполняются) переносят в отдельный модуль редактирования. В качестве модуля редактирования, второй модуль для выращивания индуцирует редактирование геномов клеток, например, путем экспрессии введенных нуклеиновых кислот. Экспрессия нуклеазы может быть индуцирована одним или более способами: химическим, световым, вирусным или температурным способом. Второй модуль для выращивания, например, может быть выполнен с возможностью нагревания или охлаждения клеток в процессе тепловой индукции. В конкретном примере, клетки могут быть индуцированы нагреванием при 42-50°С. В качестве дополнительной иллюстрации, затем после индукции клетки могут быть охлаждены до 0-10°C. В примере химической или вирусной индукции индуцирующий агент может быть перенесен во второй модуль для выращивания, вызывая редактирование. Если индуцибельная нуклеаза была введена в клетки во время редактирования, она индуцируется путем введения молекулы-индуктора, такой как молекула-индуктор 1224, описанная в отношении фиг. 12А. В некоторых вариантах осуществления индуцирующий агент или молекулу-индуктор переносят во второй модуль для выращивания с помощью роботизированной системы 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B (например, через интерфейс дозатора или сиппера).

[00220] В некоторых вариантах осуществления, если никакое дополнительное редактирование клеток не требуется (924), клетки могут быть перенесены из модуля для выращивания клеток в модуль хранения для последующего удаления из автоматизированной многомодульной системы (926) для обработки клеток. Блок хранения, например, может включать блок 114 хранения, показанный на фиг. 12A-12B. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-1B или 12A-12B, например, может передавать клетки в блок 114 хранения через интерфейс сиппера или дозатора. В другом примере роботизированная система 108 подачи на фиг. 1А-1В или 12А-12В может переносить флакон, содержащий клетки, из камеры второго модуля для выращивания во флакон или пробирку, находящуюся внутри блока хранения.

[00221] В некоторых вариантах осуществления, если требуется дополнительное редактирование клеток (924), клетки могут быть перенесены в тот же самый или другой модуль фильтрации и могут быть сделаны электрокомпетентными (908). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления в это время в модуле сборки нуклеиновых кислот может быть приготовлен новый образец собранной нуклеиновой кислоты. Перед рекурсивным редактированием, в некоторых вариантах осуществления, может потребоваться, чтобы пользователь внес в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток дополнительные материалы (например, сменные картриджи).

[00222] Во время второго цикла редактирования этапы могут быть одинаковыми или разными. Например, в некоторых вариантах осуществления при последующем выполнении этапа 904 селективную питательную среду переносят в модуль для выращивания, что позволит осуществить отбор отредактированных клеток из первого цикла редактирования. Роботизированная система 108 подачи на фиг. 1A-B или 12A-B, например, может переносить селективную питательную среду из флакона или контейнера в картридж с реагентами, расположенный в положении, предназначенном для селективной питательной среды. Перед переносом селективной питательной среды машиночитаемые знаки могут быть отсканированы на флаконе или другом контейнере или резервуаре, расположенном в положении, предназначенном для селективной питательной среды, для подтверждения содержимого флакона, контейнера или резервуара. Кроме того, машиночитаемые знаки могут указывать тип селективной питательной среды, предоставляемой инструменту. В некоторых вариантах осуществления, исходя из типа селективной питательной среды, инструмент осуществляет выбор конкретного скрипта обработки (например, установочные параметры и активацию модуля для выращивания, подходящего для конкретной селективной питательной среды). Конкретные примеры рабочих процессов рекурсивного редактирования описаны со ссылкой на фиг. 10А-10С.

[00223] В некоторых вариантах осуществления способ 900 может быть хронометрирован для запроса материалов и/или завершения цикла редактирования по согласованию с определенным пользователем графиком. Например, автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток может предоставлять пользователю возможность планировать завершение одного или более циклов обработки клеток (например, введения одной или более рекурсивных правок) таким образом, что способ 900 запускается с расчетом завершения в предпочтительное для пользователя время. Временной график может быть установлен, например, через пользовательский интерфейс, такой как пользовательский интерфейс 1316 на фиг. 13. В качестве конкретной иллюстрации, пользователь может установить завершение первого цикла на 16:00 с тем, чтобы у него была возможность подачи в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток дополнительных картриджей с материалами для обработки другого цикла редактирования клеток в течение ночи.

[00224] В некоторых вариантах осуществления автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток может предупреждать пользователя о своем текущем состоянии на протяжении всего времени выполнения способа 900. Например, пользовательский интерфейс 1316 на фиг. 13 может представлять графическое указание текущего этапа обработки. В конкретном примере на передней стороне автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток может быть установлен пользовательский интерфейс (например, сенсорный экран), который представляет собой анимированную графику, отображающую текущее состояние обработки клеток. Пользовательский интерфейс может дополнительно представлять любые пользовательские и/или стандартные установочные параметры, связанные с текущим этапом обработки (например, настройку температуры, установку времени и т.д.).

[00225] Хотя проиллюстрирована конкретная серия операций, в других вариантах осуществления способ 900 может включать большее или меньшее количество этапов. Например, в некоторых вариантах осуществления перед каждым циклом редактирования содержимое резервуаров, картриджей и/или флаконов могут проверяться для подтверждения наличия соответствующих материалов для продолжения обработки. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более датчиков формирования изображения (например, сканеры штрих-кода, камеры и т.д.) могут подтверждать содержимое в различных местах внутри корпуса автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В одном из примеров несколько датчиков формирования изображения могут быть расположены внутри корпуса автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, причем каждый датчик формирования изображения выполнен с возможностью детектирования одного или более материалов (например, машиночитаемых знаков, таких как штрих-коды или QR-коды, формы/размера материалов и т.д.). В другом примере роботизированная система подачи может перемещать по меньшей мере один датчик формирования изображения в несколько положений для детектирования одного или более материалов. В дополнительных вариантах осуществления один или более датчиков веса могут детектировать наличие или отсутствие одноразовых или сменных материалов. В иллюстративном примере подставка 116 с наконечниками для переноса может включать датчик веса для определения, загружены ли наконечники в этой области. В другом иллюстративном примере оптический датчик может детектировать достижение порогового уровня жидкими отходами и потребности в их удалении до продолжения обработки клеток. Запросы на дополнительные материалы, удаление использованных материалов или другие вмешательства пользователя (например, ручная очистка одного или более элементов и т.д.), в некоторых вариантах осуществления, представлены в графическом пользовательском интерфейсе автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В некоторых вариантах осуществления, автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток связывается с пользователем для запроса новых материалов или другого ручного вмешательства, например, через программное приложение, электронную почту или текстовое сообщение.

Рабочие процессы для обработки клеток в автоматизированном многомодульном устройстве для обработки клеток

[00226] Автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток предназначен для выполнения различных рабочих процессов по обработке клеток с использованием одних и тех же модулей. Например, исходные материалы в отдельных контейнерах или в форме картриджа могут отличаться, и соответствующие инструкции (например, программный скрипт) могут выбираться соответствующим образом с помощью одного и того же основного инструмента и роботизированной системы подачи; т.е., многомодульная система обработки клеток может быть выполнена с возможностью выполнения нескольких различных рабочих процессов для обработки образцов клеток и различных типов образцов клеток. В вариантах осуществления один и тот же рабочий процесс может выполняться итеративно для рекурсивного редактирования образца клеток. В других вариантах осуществления образец клеток редактируется рекурсивно, но рабочий процесс может меняться от итерации к итерации.

[00227] На фиг. 10A-10C показаны примеры рабочих процессов, которые могут выполняться с помощью автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, включающего два модуля 1002, 1008 для выращивания клеток, два модуля 1004 и 1010 фильтрации и проточный модуль 1006 электропорации. Хотя модули 1002, 1008 для выращивания и модули 1004, 1010 фильтрации описаны как отдельные модули, каждый из них может быть выполнен как двойной модуль. Например, двойной модуль для выращивания, включающий модули 1002 и 1008 для выращивания, может включать двойные вращающиеся флаконы для выращивания, которые совместно используют некоторые схемы, элементы управления и источник питания и которые размещены в одном корпусе. Аналогично, двойной модуль фильтрации может включать модули 1004 и 1010 фильтрации, в том числе два отдельных фильтра и трубки подачи жидкости, которые совместно используют схему, элементы управления, источник питания и корпус. Модули 1002, 1004, 1006, 1008 и 1010, например, могут быть частью инструмента 100, описанного со ссылкой на фиг. 1А и 1Б.

[00228] На фиг. 10А на блок-схеме показан первый рабочий процесс 1000 редактирования бактериального генома, включающий два этапа обработки, имеющие идентичные этапы обработки, что в результате обеспечивает две правки в клеточной массе 1012. Картриджи исходных материалов в каждом из этапов могут различаться. Например, первый картридж может включать первую библиотеку 1014a олиго и первый остов 1016a sgРНК. Второй картридж, введенный в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток между этапами обработки или до обработки, но в положении, отличном от первого картриджа, может включать вторую библиотеку 1014b олиго и второй остов 1016b sgРНК. Каждый картридж может рассматриваться как «библиотечный картридж» для создания библиотеки отредактированных клеток. Клеточная масса 1012 в некоторых вариантах осуществления включена в первый библиотечный картридж. Клеточная масса 1012 может поставляться в комплекте, включающем два картриджа. В качестве альтернативы пользователь может добавить контейнер (например, флакон или пробирку) с клеточной массой 1012 в купленный картридж.

[00229] Рабочий процесс 1000, в некоторых вариантах осуществления, выполняется на основе скрипта, исполняемого системой обработки автоматизированного многомодульного устройства для обработки клеток, такого как система 1310 обработки на фиг. 13. Скрипт в первом примере может быть доступен через машиночитаемый маркер или тег, добавленный к первому картриджу. В некоторых вариантах осуществления каждый этап обработки выполняется с использованием отдельного скрипта. Например, каждый картридж может включать указание скрипта или сам скрипт для обработки содержимого картриджа.

[00230] В некоторых вариантах осуществления первый этап начинается с введения клеточной массы 1012 в первый модуль 1002 для выращивания для инокуляции, роста и мониторинга (1018a). В одном из примеров роботизированная система подачи добавляет флакон с клеточной массой 1012 к среде, содержащейся во вращающемся флаконе для выращивания первого модуля 1002 для выращивания. В другом примере роботизированная система обработки отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1012 из первого картриджа и добавляет клеточную массу 1012 в среду, содержащуюся во вращающемся флаконе для выращивания. В этом месте клетки могут содержаться при температуре 4ºC. В конкретном примере во вращающемся флаконе для выращивания первого модуля 1002 для выращивания можно выращивать 20 мл клеточной массы при температуре 30ºC до значения OD 0,50. Клеточную массу 1012, добавленную в первый модуль 1002 для выращивания, можно отслеживать с течением времени до тех пор, пока с помощью автоматического мониторинга флакона для выращивания не будет определено, что значение OD равно 0,50. Мониторинг может быть периодическим или непрерывным. Это может занять, например, примерно 900 минут (по оценкам), хотя точное время зависит от детектирования требуемого значения OD.

[00231] В некоторых вариантах осуществления после выращивания клеток до требуемого значения OD в первый модуль 1002 для выращивания добавляют индуктор для индукции клеток. В конкретном примере может быть добавлено 100 мкл индуктора, и модуль 1002 для выращивания может довести температуру смеси до 42ºC и поддерживать ее в течение 15 минут.

[00232] В некоторых вариантах осуществления, после выращивания и индукции клеточную массу 1012 переносят в первый модуль 1004 фильтрации для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными (1020a), и для уменьшения объема клеток для трансформации. В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1012 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания в держатель флакона первого модуля 1004 фильтрации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1012 из вращающегося флакона для выращивания из первого модуля 1002 для выращивания и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. Например, для переноса клеточной массы 1012 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации может использоваться одноразовый наконечник для дозирования, использованный для переноса клеточной массы 1012 в первый модуль 1002 для выращивания. В некоторых вариантах осуществления перед переносом клеточной массы 1012 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации первый модуль 1002 для выращивания охлаждают до 4ºC, снижая температуру клеточной массы 1012 до этой температуры. В конкретном примере температура первого модуля 1002 для выращивания может быть снижена до примерно 4ºC в течение примерно 8 минут, и модуль 1002 для выращивания может поддерживать температуру на уровне 4ºC в течение примерно 15 минут, чтобы обеспечить снижение температуры клеточной массы 1012.

[00233] В некоторых вариантах осуществления перед переносом клеточной массы фильтр первого модуля 1004 фильтрации предварительно промывают с помощью промывочного раствора. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Первый модуль 1004 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00234] Первый модуль 1004 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере первый модуль 1004 фильтрации может поддерживаться при 4°C во время процесса промывки и элюции при переносе клеточных материалов между элюирующим флаконом и первым модулем 1004 фильтрации.

[00235] В некоторых вариантах осуществления после того, как клетки стали электрокомпетентными в модуле 1004 фильтрации, клеточную массу 1012 подают в модуль 1006 трансформации (например, проточный модуль электропорации) для трансформации. В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1012 из держателя флакона первого модуля 1004 фильтрации в резервуар проточного модуля 1006 электропорации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1012 из первого модуля 1002 фильтрации или временного резервуара и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. В конкретном примере, 400 мкл концентрированной клеточной массы 1012 из первого модуля 1004 фильтрации подают в смесительный резервуар перед подачей в модуль 1006 трансформации. Например, клеточная масса 1012 может быть перенесена в резервуар в картридже для смешивания с собранными нуклеиновыми кислотами, а затем перенесена роботизированной системой подачи с помощью наконечника дозатора. В конкретном примере модуль трансформации поддерживают при температуре 4°С. В иллюстративном примере клеточная масса 1012 может быть трансформирован примерно за четыре минуты.

[00236] По мере роста клеток и/или по мере того, как они становятся электрокомпетентными, в некоторых вариантах осуществления, собирают первую библиотеку 1014a олиго и остов 1016a sgРНК с помощью процесса изотермической сборки нуклеиновых кислот для создания собранных нуклеиновых кислот в мастер-миксе (1022a) изотермической сборки нуклеиновых кислот. Собранные нуклеиновые кислоты могут быть созданы в некоторой точке во время первых этапов 1018a, 1020a обработки первого этапа рабочего процесса 1000. В качестве альтернативы, собранные нуклеиновые кислоты могут быть созданы до начала первого этапа 1018 обработки.

[00237] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты собирают с помощью модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Например, роботизированная система подачи может добавлять первую библиотеку 1014a олиго и остов 1016а sgРНК из сосуда с библиотекой в картридже с реагентами в автоматическом многомодульном инструменте для обработки клеток в модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот (не показан), такой как модуль 1210g сборки нуклеиновых кислот, описанный со ссылкой на фиг. 12B. Например, в конкретном примере, смесь для сборки нуклеиновых кислот может включать 50 мкл Мастер-микса Gibson Assembly®, 25 мкл остова 1016a вектора и 25 мкл олиго 1014a. Модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот можно хранить при комнатной температуре. Процесс сборки может занять примерно 30 минут.

[00238] В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты собирают вне многомодульного инструмента для обработки клеток и добавляют в него качестве исходного материала. Например, флакон или пробирка с собранными нуклеиновыми кислотами могут быть добавлены в картридж с реагентами перед активацией первого этапа 1018a обработки клеток. В конкретном примере предоставляют 100 мкл собранных нуклеиновых кислот.

[00239] В некоторых вариантах осуществлениях собранные нуклеиновые кислоты очищают (1024a). Собранные нуклеиновые кислоты, например, могут быть перенесены роботизированной системой подачи из модуля изотермической сборки нуклеиновых кислот в модуль очистки (не показан), такой как модуль 1210h очистки на фиг. 12B. В других вариантах осуществления модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот может включать признаки очистки (например, комбинированный модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот и модуль очистки). В других вариантах осуществления собранные нуклеиновые кислоты очищают вне многомодульного инструмента для обработки клеток и добавляют в него качестве исходного материала. Например, флакон или пробирку с очищенными собранными нуклеиновыми кислотами можно добавить в картридж с реагентами, содержащий клеточную массу 1012 до активации первого этапа 1018a обработки клеток.

[00240] В конкретном примере очищают 100 мкл собранных нуклеиновых кислот в смеси для изотермической сборки нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления в модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот добавляют магнитные шарики, например, в модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот роботизированной системой подачи может быть добавлено 180 мкл магнитных шариков в жидкой суспензии. Магнит, функционально связанный с модулем изотермической сборки нуклеиновых кислот, может быть активирован, и образец может быть промыт 200 мкл этанола (например, роботизированная система подачи может доставить этанол в модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот). Жидкие отходы из этой операции, в некоторых вариантах осуществления, переносят в находящуюся в картридже емкость для отходов (например, с помощью роботизированной системы подачи, использующей тот же наконечник дозатора, что и при переносе этанола). В этот момент обезвоженные собранные нуклеиновые кислоты могут быть перенесены в контейнер для хранения, такой как резервуар картриджа. Обессоленные собранные нуклеиновые кислоты могут храниться, например, при температуре 4ºC до тех пор, пока клетки не будут готовы к трансформации. В конкретном примере можно добавить 100 мкл собранных нуклеиновых кислот к 400 мкл концентрированной клеточной массы 1012 в смесительном резервуаре перед передачей в модуль 1006 трансформации. В некоторых вариантах осуществления процесс очистки может занимать примерно 16 минут.

[00241] В некоторых вариантах осуществления, собранные нуклеиновые кислоты и клеточную массу 1012 добавляют в проточный модуль 1006 электропорации, клеточную массу 1012 трансформируют (1026a). Роботизированная система подачи, например, может переносить смесь клеточной массы 1012 и собранных нуклеиновых кислот в проточный модуль 1006 электропорации из смесительного резервуара, например, с помощью наконечника дозатора или путем переноса флакона или пробирки. В некоторых вариантах осуществления для трансформации клеточной массы 1012 используется встроенный проточный модуль электропорации, такой как проточные модули 500 электропорации на фиг. 5A. В других вариантах осуществления, для трансформации клеточной массы 1012 используется модуль электропорации на основе картриджа, такой как проточный модуль 530 электропорации на фиг. 5B. Например, модуль 1006 электропорации может поддерживаться при температуре 4°C. Процесс электропорации, в иллюстративном примере, может занять примерно четыре минуты.

[00242] В некоторых вариантах осуществления трансформированную клеточную массу 1012 переносят во второй модуль 1008 для выращивания для восстановления (1028a). В конкретном примере трансформированные клетки проходят процесс восстановления во втором модуле 1008 для выращивания при температуре 30°С. Трансформированные клетки, например, могут восстанавливаться во втором модуле 1008 для выращивания в течение примерно часа.

[00243] В некоторых вариантах осуществления, во второй флакон для выращивания (не показан) переносят селективную среду, и клетки оставляют для инкубации в течение дополнительного периода времени в процессе отбора. В иллюстративном примере антибиотик может быть перенесен во второй флакон для выращивания, и клетки можно инкубировать в течение дополнительных двух часов при температуре 30°С.

[00244] После восстановления клетки могут быть готовы либо к другому циклу редактирования, либо к хранению в сосуде, например, для дальнейших экспериментов, проводимых вне среды автоматической обработки клеток. В качестве альтернативы, часть клеток может быть перенесена в блок хранения в качестве продукта библиотеки клеток, тогда как другая часть клеток может быть подготовлена для второго цикла редактирования.

[00245] В некоторых вариантах осуществления при подготовке ко второму циклу редактирования трансформированные клетки переносят во второй модуль 1010 фильтрации для замены среды и для фильтрации (1030a). В некоторых вариантах осуществления перед переносом трансформированной клеточной массы фильтр второго модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Второй модуль 1010 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00246] Второй модуль 1010 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере, во время процесса промывки и элюции при переносе клеточной массы между элюирующим флаконом и вторым модулем 1010 фильтрации второй модуль 1010 фильтрации может поддерживаться при 4°С. Продукт этого процесса фильтрации, в конкретном примере, помещают во флакон или пробирку для дальнейшей обработки, например передачи в модуль трансформации. Флакон или пробирку можно хранить в блоке хранения при температуре 4ºС.

[00247] Первый этап обработки может осуществляться в течение одного дня. В иллюстративном варианте осуществления, первый этап обработки может длиться менее 19 часов (например, примерно 18,7 часа). На этом этапе рабочего процесса 1000, в некоторых вариантах осуществления, новые материалы добавляют вручную в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток. Например, может быть добавлен новый картридж с реагентами. Кроме того, в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток на этом этапе могут быть добавлены новый промывочный картридж, сменные фильтры и/или сменные наконечники дозатора. В некоторых вариантах осуществления, модуль фильтрации также может подвергаться процессу очистки, и/или твердые и жидкие отходы могут быть удалены при подготовке к следующему этапу обработки. В других вариантах осуществления картриджи с реагентами могут предоставлять реагенты для двух или более циклов редактирования.

[00248] В некоторых вариантах осуществления второй цикл редактирования включает такие же модули 1002, 104, 1006, 1008 и 1010, такие же этапы обработки 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 и 1030 и такие же температуру и интервалы времени, что и в первом этапе обработки, описанном выше. Например, вторая библиотека 1014b олиго и второй остов 1016b sgРНК могут использоваться для редактирования трансформированных клеток практически таким же образом, как описано выше. Хотя в качестве примера приведен двухэтапный процесс, в других вариантах осуществления может быть проведено до двух, четырех, шести, восьми или более рекурсий для продолжения редактирования одного и того же набора 1012 клеток.

[00249] В других вариантах осуществления, как показано на фиг. 10B, первый этап рабочего процесса 1040 включает такие же модули 1002, 1004, 1006, 1008 и 1010, и такие же этапы обработки 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 и 1030. Однако, в отличие от рабочего процесса 1000 на фиг. 10А, второй этап рабочего процесса 1040 на фиг. 10B включает этапы излечивания. «Излечивание» является процессом, в котором вектор, например, редактирующий вектор, использованный в предыдущем цикле редактирования, вектор-«двигатель» («engine»), содержащий последовательность экспрессии нуклеазы, или оба вектора удаляют из трансформированных клеток. Излечивание может осуществляться, например, путем расщепления редактирующего вектора с помощью излечивающей плазмиды (curing plasmid), тем самым приводя к нефункциональности редактирующего вектор и/или вектора-двигателя (как показано в рабочем процессе на фиг. 10b); путем разбавления вектора в клеточной популяции по мере роста клеток (т.е., чем больше циклов выращивания проходят клетки, тем меньше дочерних клеток содержат редактирующий вектор(ы) или вектор-двигатель) (не показано), или, например, путем использования в редактирующем векторе или векторе-двигателе термочувствительной точки начала репликации (не показан). В одном из примеров «излечивающая плазмида» может содержаться в картридже с реагентами автоматического инструмента или может добавляться вручную в инструмент перед вторым этапом обработки. Как в случае рабочего процесса 1000, в некоторых вариантах осуществления, рабочий процесс 1040 выполняется на основе скрипта, исполняемого системой обработки автоматизированного многомодульного устройства для обработки клеток, такого как система 1310 обработки на фиг. 13. Скрипт в первом примере может быть доступен через машиночитаемый маркер или метку, добавленную к первому картриджу. В некоторых вариантах осуществления каждый этап обработки выполняется с использованием отдельного скрипта. Например, каждый картридж может включать указание скрипта или сам скрипт для обработки содержимого картриджа. Таким образом, например, второй этап, в котором используется картридж для излечивания, может быть выполнен с помощью скрипта, разработанного для установочных параметров (например, температуры, времени, количества материала и т.д.), подходящих для излечивания. Условия для излечивания будут зависеть от механизма, используемого для излечивания; т.е., в этом примере, каким образом излечивающая плазмида расщепляет редактирующую плазмиду и/или плазмиду-двигатель.

[00250] В некоторых вариантах осуществления второй этап рабочего процесса 1040 начинается с получения первых отредактированных в первом модуле 1002 для выращивания клеток из первого этапа рабочего процесса 1040. Например, первые отредактированные клетки могут быть отредактированы с использованием клеточной массы 1042, библиотеки 1044 олиго и остова 1046 sgРНК путем осуществления этапов 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 и 1030, как описано в отношении рабочего процесса 1000 на фиг. 10A. Например, первая отредактированная клеточная масса 1042 может быть перенесена в первый модуль 1002 для выращивания роботизированной системой подачи. В одном из примеров, роботизированная система подачи добавляет флакон с отредактированной клеточной массой 1042 во вращающийся флакон для выращивания первого модуля 1002 для выращивания. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора первую отредактированную клеточную массу 1042 из емкости блока хранения и добавляет клеточную массу 1042 во вращающийся флакон для выращивания. В этой точке клетки могут поддерживаться при температуре 4ºC.

[00251] В некоторых вариантах осуществления первые отредактированные клетки инокулируют, выращивают и контролируют в первом модуле 1002 для выращивания (1018d). В конкретном примере, аликвоту первой отредактированной клеточной массы 1042 можно перенести во вращающийся флакон для выращивания, содержащий, например, 20 мл питательной среды при температуре 30°C, до достижения величины OD 0,50. Клеточную массу 1042, добавленную в первый модуль 1002 для выращивания, можно отслеживать с течением времени до тех пор, пока с помощью автоматического мониторинга не будет определено, что величина OD равна 0,50. Мониторинг может быть периодическим или непрерывным. Это может занять, например, примерно 900 минут (по оценкам), хотя точное время зависит от детектирования требуемого значения OD.

[00252] В некоторых вариантах осуществления после выращивания до требуемого значения OD к первому модулю 1002 для выращивания добавляют индуктор для индукции клеток. В конкретном примере может быть добавлено 100 мкл индуктора, и модуль 1002 для выращивания может довести температуру смеси до 42ºC и поддерживать ее в течение 15 минут.

[00253] После выращивания и индукции первую отредактированную клеточную массу 1042 передают в первый модуль 1004 фильтрации, в некоторых вариантах осуществления для того, чтобы сделать первую отредактированную клеточную массу электрокомпетентной (1020d). В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с первой отредактированной клеточной массой 1042 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания в держатель флакона первого модуля 1004 фильтрации. В другом примере, роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора первую отредактированную клеточную массу 1042 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. Например, для передачи клеточной массы 1042 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации может использоваться одноразовый наконечник дозатора, использованный для переноса первой отредактированной клеточной массы 1042 в первый модуль 1002 для выращивания. В некоторых вариантах осуществления, перед переносом клеточной массы 1042 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации первый модуль 1002 для выращивания охлаждают до 4ºC, снижая температуру клеточной массы 1042 до этой температуры. В конкретном примере температура первого модуля 1002 для выращивания может быть снижена до примерно 4°С в течение примерно 8 минут, и модуль 1002 для выращивания может поддерживать температуру 4°С в течение примерно 15 минут, чтобы обеспечить снижение температуры клеточной массы 1012.

[00254] Перед переносом первой отредактированной клеточной массы 1042 в модуль фильтрации, в некоторых вариантах осуществления, фильтр первого модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Первый модуль 1004 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00255] Первый модуль 1004 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере первый модуль 1004 фильтрации может поддерживаться при 4°C во время процесса промывки и элюции при переносе клеточных материалов между элюирующим флаконом и первым модулем 1004 фильтрации.

[00256] В некоторых вариантах осуществления после того, как первые отредактированные клетки стали электрокомпетентными в фильтрующем модуле 1004 (1020d), первую отредактированную клеточную массу 1042 подают в модуль 1006 трансформации (например, проточный модуль электропорации) для трансформации. В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1042 из держателя флакона первого модуля 1004 фильтрации в резервуар проточного модуля 1006 электропорации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1042 из первого модуля 1002 фильтрации или временного резервуара и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. В конкретном примере, 400 мкл концентрированной клеточной массы 1042 из первого модуля 1004 фильтрации подают в смесительный резервуар перед подачей в модуль 1006 трансформации. Например, клеточная масса 1042 может быть перенесена в резервуар в картридже для смешивания с излечивающей плазмидой 1050, затем смешана и перенесена роботизированной системой подачи с помощью наконечника дозатора. В конкретном примере модуль 1006 трансформации поддерживают при температуре 4°С. В иллюстративном примере клеточная масса 1042 может быть трансформирована примерно за четыре минуты.

[00257] Трансформированную клеточную массу 1042, в некоторых вариантах осуществления, переносят во второй модуль 1008 для выращивания для восстановления/излечивания (1028d). В конкретном примере 20 мл трансформированных клеток проходят процесс восстановления во втором модуле 1008 для выращивания при температуре 30°С. Трансформированные клетки, например, могут проходить процесс восстановления во втором модуле 1008 для выращивания в течение примерно часа. Если требуется еще один цикл редактирования, первую редактирующую плазмиду или вектор извлекают. Если другой цикл редактирования нежелателен, первая редактирующая плазмида и плазмида-двигатель могут быть извлечены.

[00258] После восстановления и излечивания клетки могут быть готовы либо к другому циклу редактирования, либо к хранению для использования в дальнейших исследованиях вне автоматизированного инструмента для обработки клеток. Например, часть клеток может быть перенесена в блок хранения в качестве продукта библиотеки клеток, тогда как другая часть клеток может быть подготовлена для второго цикла редактирования.

[00259] В некоторых вариантах осуществления при подготовке ко второму циклу редактирования трансформированные клетки переносят во второй модуль 1010 фильтрации для замены среды и фильтрации (1030d), содержащий глицерин для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными. В некоторых вариантах осуществления перед переносом трансформированной клеточной массы фильтр второго модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Второй модуль 1010 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00260] Второй модуль 1010 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере второй модуль 1010 фильтрации может поддерживаться при 4°С во время процесса промывки и элюции при переносе клеточных материалов между элюирующим флаконом и вторым модулем 1010 фильтрации. Продукт этого процесса фильтрации, в конкретном примере, представляет собой электрокомпетентные клетки, находящиеся во флаконе или пробирке для дальнейшей обработки. Флакон или пробирку можно хранить в блоке хранения при температуре 4ºС.

[00261] На фиг. 10С на блок-схеме показан рабочий процесс 1060 с использованием дрожжей, включающий два этапа обработки, имеющие идентичные этапы обработки, что в результате обеспечивает две правки в клеточной массе 1062. Картриджи исходных материалов в каждом из этапов могут различаться. Например, первый картридж может включать первую библиотеку 1070a олиго и первый остов 1072a sgРНК. Второй картридж, введенный в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток между этапами обработки или до обработки, но в положении, отличном от первого картриджа, может включать вторую библиотеку 1070b олиго и второй остов 1072b sgРНК. Каждый картридж может рассматриваться как «библиотечный картридж» для создания библиотеки отредактированных клеток. В качестве альтернативы пользователь может добавить контейнер (например, флакон или пробирку) с клеточной массой 1062а в каждый купленный картридж, включенный в набор дрожжевых клеток.

[00262] В некоторых вариантах осуществления, рабочий процесс 1060 выполняется на основе скрипта, исполняемого системой обработки автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток, такой как система 1310 обработки на фиг. 13. Скрипт в первом примере может быть доступен через машиночитаемый маркер или метку, добавленную к первому картриджу. В некоторых вариантах осуществления каждый этап обработки выполняется с использованием отдельного скрипта. Например, каждый картридж может включать указание скрипта или сам скрипт для обработки содержимого картриджа.

[00263] В некоторых вариантах осуществления первый этап начинается с введения клеточной массы 1062 в первый модуль 1002 для выращивания для инокуляции, роста и мониторинга (1018е). В одном из примеров роботизированная система подачи добавляет флакон с клеточной массой 1062 во вращающийся флакон для выращивания первого модуля 1002 для выращивания. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1062 из первого картриджа и добавляет клеточную массу 1062 во вращающийся флакон для выращивания. В этой точке клетки могут поддерживаться при температуре 4ºC. В конкретном примере во вращающемся флаконе для выращивания первого модуля 1002 для выращивания можно выращивать 20 мл клеточной массы при температуре 30ºC до значения OD 0,75. Клеточную массу 1012, добавленную в первый модуль 1002 для выращивания, можно отслеживаться с течением времени до тех пор, пока с помощью автоматического мониторинга флакона для выращивания не будет определено, что значение OD равно 0,50. Мониторинг может быть периодическим или непрерывным.

[00264] В некоторых вариантах осуществления может использоваться индуцибельная система экспрессии. В связи с этим, после выращивания до требуемого значения OD, в первый модуль 1002 для выращивания добавляют индуктор для индукции клеток. Индуктором может быть малая молекула или замена среды на среду с другим сахаром, таким как галактоза.

[00265] В некоторых вариантах осуществления после выращивания и индукции клеточную массу 1062 переносят в первый модуль 1004 фильтрации для замены среды (1064а). В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1062 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания в держатель флакона первого модуля 1004 фильтрации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1062 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. Например, для переноса клеточной массы 1062 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации может использоваться одноразовый наконечник дозатора, использованный для переноса клеточной массы 1062 в первый модуль 1002 для выращивания. В некоторых вариантах осуществления перед переносом клеточной массы 1062 из первого модуля 1002 для выращивания в первый модуль 1004 фильтрации первый модуль 1002 для выращивания охлаждают до 4ºC, снижая температуру клеточной массы 1012 до этой температуры. В конкретном примере температура первого модуля 1002 для выращивания может быть снижена до примерно 4°С в течение примерно 8 минут, и модуль 1002 для выращивания может поддерживать температуру 4°С в течение примерно 15 минут, чтобы обеспечить снижение температуры клеточной массы 1062. При замене среды, в иллюстративном примере, в клеточную массу 1062 может быть добавлено 0,4 мл 1М сорбита.

[00266] Перед переносом клеточной массы 1062, в некоторых вариантах осуществления, фильтр первого модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Первый модуль 1004 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00267] Первый модуль 1004 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере первый модуль 1004 фильтрации может поддерживаться при температуре 4°C во время процесса промывки и элюции при переносе клеточных материалов между элюирующим флаконом и первым модулем 1004 фильтрации.

[00268] После операции замены среды, в некоторых вариантах осуществления, клеточную массу 1062 переносят обратно в первый модуль 1002 для выращивания для кондиционирования (1066a). В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон 1062 с клеточной массой из первого модуля 1004 фильтрации в первый модуль 1002 для выращивания. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1062 из первого модуля 1004 фильтрации и доставляет ее во вращающийся флакон для выращивания первого модуля 1002 для выращивания. Во время кондиционирования, например, в клеточную массу 1062 могут быть добавлены 5 мл DTT/LIAc и 80 мМ сорбита. Например, роботизированная система подачи может переносить DTT/LIAc и сорбит по отдельности или одновременно с первым модулем 1002 для выращивания. Клеточная масса 1062 может быть смешана с DTT/LIAc и сорбитом, например, путем вращения вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания. Во время кондиционирования клеточная масса 1062 может поддерживаться при температуре 4ºС.

[00269] В некоторых вариантах осуществления после кондиционирования клеточную массу 1062 переносят в первый модуль 1004 фильтрации для промывки и подготовки клеток (1068). Например, на этом этапе клетки могут быть сделаны электрокомпетентными. В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1062 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания в держатель флакона первого модуля 1004 фильтрации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1062 из вращающегося флакона для выращивания первого модуля 1002 для выращивания и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации.

[00270] В некоторых вариантах осуществления перед переносом клеточной массы фильтр первого модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Первый модуль 1004 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А. В других вариантах осуществления для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными, используют тот же фильтр, который использовался для замены среды на этапе 1064а. В некоторых вариантах осуществления для того, чтобы сделать дрожжевые клетки электрокомпетентными, используют 1М сорбит.

[00271] В некоторых вариантах осуществления, в процессе превращения клеток в электрокомпетентные в модуле 1004 фильтрации клеточную массу 1062 переносят в модуль 1006 трансформации (например, проточный модуль электропорации) трансформации. В одном из примеров роботизированная система подачи переносит флакон с клеточной массой 1062 из держателя флакона первого модуля 1004 фильтрации в резервуар проточного модуля 1006 электропорации. В другом примере роботизированная система подачи отбирает с помощью дозатора клеточную массу 1062 из первого модуля 1004 фильтрации или временного резервуара и доставляет ее в первый модуль 1004 фильтрации. В конкретном примере из первого модуля 1004 фильтрации 400 мкл концентрированной клеточной массы 1062 переносят в смесительный резервуар перед ее переносом в модуль 1006 трансформации. Например, клеточная масса 1062 может быть перенесена в резервуар в картридже для смешивания с компонентами нуклеиновых кислот (остов и редактирующий олигонуклеотид), затем смешана и перенесена роботизированной системой подачи с помощью наконечника дозатора. Поскольку основа (вектор) и редактирующий олигонуклеотид собираются в клетках (in vivo), модуль сборки нуклеиновых кислот не является необходимым компонентом для редактирования дрожжей. В конкретном примере модуль трансформации поддерживают при 4°С.

[00272] В некоторых вариантах осуществления предназначенные для сборки нуклеиновые кислоты и клеточную массу 1062 добавляют в проточный модуль 1006 электропорации, и клеточную массу 1062 подвергают трансформации (1026е). Роботизированная система подачи, например, может переносить смесь клеточной массы 1062е и сборку нуклеиновых кислот в проточный модуль 1006 электропорации из смесительного резервуара, например, с помощью наконечника дозатора или путем переноса флакона или пробирки. В некоторых вариантах осуществления для трансформации клеточной массы 1062е используется встроенный проточный модуль электропорации, такой как проточные модули 500 электропорации на фиг. 5A. В других вариантах осуществления для трансформации клеточной массы 1062е используется модуль электропорации на основе картриджа, такой как проточный модуль 530 электропорации фиг. 5B. Например, модуль 1006 электропорации может поддерживаться при температуре 4°C.

[00273] Трансформированную клеточную массу 1062, в некоторых вариантах осуществления, переносят во второй модуль 1008 для выращивания для восстановления (1028a). В конкретном примере 20 мл трансформированных клеток проходят процесс восстановления во втором модуле 1008 для выращивания.

[00274] В некоторых вариантах осуществления во второй флакон для выращивания (не показан) переносят селективную среду, например, ауксотрофную питательной среду или среду, содержащую лекарственное вещество, и клетки оставляют для инкубации в течение дополнительного периода времени в процессе отбора. В иллюстративном примере антибиотик может быть перенесен во второй флакон для выращивания, и клетки можно инкубировать в течение дополнительных двух часов при температуре 30°С.

[00275] После восстановления клетки могут быть готовы либо к другому циклу редактирования, либо к хранению в клеточной библиотеке. Например, часть клеток может быть перенесена в блок хранения в качестве продукта (1076а) клеточной библиотеки, тогда как другая часть клеток может быть подготовлена для второго цикла редактирования (1078а). Клетки могут храниться, например, при температуре 4ºC.

[00276] В некоторых вариантах осуществления при подготовке ко второму циклу редактирования трансформированные клетки переносят во второй модуль 1010 фильтрации для замены среды и фильтрации (1078a). В некоторых вариантах осуществления перед переносом трансформированной клеточной массы фильтр второго модуля 1004 фильтрации предварительно промывают промывочным раствором. Промывочный раствор, например, может подаваться в промывочный картридж, такой как картридж 1006, описанный со ссылкой на фиг. 1А. Второй модуль 1010 фильтрации, например, может находиться в жидкостном соединении с промывочным раствором промывочного картриджа, как описано со ссылкой на фиг. 7А.

[00277] Второй модуль 1010 фильтрации, например, может быть частью двойного модуля фильтрации, такого как модуль 750 фильтрации, описанный со ссылкой на фиг. 7В и 7С. В конкретном примере второй модуль 1010 фильтрации может поддерживаться при температуре 4°С во время процесса промывки и элюции при переносе клеточных материалов между элюирующим флаконом и вторым модулем 1010 фильтрации.

[00278] В некоторых вариантах осуществления во время процесса фильтрации добавляют ферментный препарат для лизиса клеточной стенки в клеточной массе 1062а. Например, для лизиса клеточной стенки может быть добавлен литический фермент для дрожжей, такой как зимолаза (Zylomase®). В конкретном примере литический фермент для дрожжей может быть инкубирован с клеточной массой 1026а в течение 5-60 минут при температуре 30ºC. Продукт этого процесса фильтрации, в конкретном примере, представляет собой электрокомпетентные клетки, находящиеся во флаконе или пробирке для дальнейшей обработки. Флакон или пробирку можно хранить в блоке хранения при температуре 4ºС.

[00279] Первый этап обработки может осуществляться в течение одного дня. На этом этапе в рабочем процессе 1060, в некоторых вариантах осуществления, в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток новые материалы добавляют вручную. Например, можно добавлять новую клеточную массу 1062b и новый картридж с реагентами. Кроме того, на этом этапе в автоматизированную многомодульную систему для обработки клеток могут быть добавлены новый промывочный картридж, сменные фильтры и/или сменные наконечники дозатора. При этом, в некоторых вариантах осуществления модуль фильтрации может подвергаться процессу очистки, и/или твердые и жидкие отходы могут быть удалены при подготовке к следующему циклу обработки.

[00280] В некоторых вариантах осуществления второй цикл редактирования включает такие же модули 1002, 104, 1006, 1008 и 1010, такие же этапы обработки 1018, 1064, 1066, 1026, 1028, 1076 и 1078 и такие же условия среды (например, температуру, временные интервалы, и т.д.), что и на первом этапе обработки, описанном выше. Например, вторая библиотека 1070b олиго и второй остов 1072b sgРНК могут использоваться для редактирования комбинации трансформированных клеток практически таким же образом, как описано выше. Хотя в качестве примера приведен двухэтапный процесс, в других вариантах осуществления может быть проведено до двух, трех, четырех, шести, восьми или более рекурсий для продолжения редактирования клеточной массы 1062.

Пример I: Полностью автоматизированный одноплексный RGN-направляемый цикл редактирования

[00281] Одноплексное автоматизированное редактирование генома с использованием нуклеазы MAD7 было успешно выполнено с помощью автоматизированного многомодульного инструмента по настоящему изобретению. См. патент США № 9982279.

[00282] Остов плазмиды ampR и редактирующую кассету lacZ_F172* собирали через Gibson Assembly® в «редактирующий вектор» в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот, включенном в автоматизированный инструмент. lacZ_F172 приводит к функциональному нокауту гена lacZ. «lacZ_F172*» указывает на то, что правка происходит 172-го остатка в аминокислотной последовательности lacZ. После сборки продукт обессоливали в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот с помощью AMPure шариков, промывали 80% этанолом и элюировали в буфере. Собранный редактирующий вектор и готовые к рекомбинации электрокомпетентные клетки E. Coli переносили в модуль трансформации для электропорации. Модуль трансформации содержал кювету ADP-EPC. См., например, патент США № 62/551069. Клетки и нуклеиновые кислоты объединяли и оставляли перемешиваться в течение 1 минуты, а электропорацию выполняли в течение 30 секунд. Параметры импульса, приводящего к образованию пор, были следующими: напряжение - 2400 В; длина - 5 мс; интервал - 50 мс; количество импульсов - 1; полярность - +. Параметры импульсов, обеспечивающих перенос, были следующими: напряжение - 150 В; длина - 50 мс; интервал - 50 мс; количество импульсов - 20; полярность - +/-. После электропорации клетки переносили в модуль восстановления (другой модуль для выращивания) и оставляли для восстановления в среде SOC, содержащей хлорамфеникол. Через 1 час в среду добавляли карбенициллин, и клетки оставляли для восстановления еще на 2 часа. После восстановления клетки хранили при 4°С до момента извлечения пользователем.

[00283] После автоматизированной обработки и восстановления аликвоту клеток высевали на агаровую основу MacConkey с добавлением лактозы (в качестве сахарного субстрата), хлорамфеникола и карбенициллина и выращивали до появления колоний. Белые колонии представляли собой функционально отредактированные клетки, пурпурные колонии представляли собой неотредактированные клетки. Перенос любой жидкости осуществляли с помощью автоматизированного устройства подачи жидкости автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток.

[00284] Результатом автоматизированной обработки было общее количество трансформированных клеток, которое составило примерно 1,0E^-03 (сравнимое с обычными результатами для настольного устройства), и эффективность редактирования, равная 83,5%. Правку lacZ_172 в белых колониях подтверждали секвенированием отредактированной области генома клеток. Кроме того, с помощью веб-камеры дистанционно отслеживались этапы автоматизированной обработки клеток, и текстовые сообщения отправляли для обновления статуса процедуры автоматизированной обработки.

Пример II: Полностью автоматизированный рекурсивный цикл редактирования

[00285] Рекурсивное редактирование было успешно выполнено с использованием автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток. Остов плазмиды ampR и редактирующую кассету lacZ_V10* собирали через Gibson Assembly® в «редактирующий вектор» в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот, включенном в автоматизированную систему. Подобно правке lacZ_F172, правка lacZ_V10 приводит к функциональному нокауту гена lacZ. «lacZ_V10» указывает на то, что происходит правка происходит аминокислоты в положении 10 в аминокислотной последовательности lacZ. После сборки продукт обессоливали в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот с помощью AMPure шариков, промывали 80% этанолом и элюировали в буфере. Первый собранный редактирующий вектор и готовые к рекомбинации электрокомпетентные клетки E. Coli переносили в модуль трансформации для электропорации. Модуль трансформации содержал кювету ADP-EPC. Клетки и нуклеиновые кислоты объединяли и оставляли перемешиваться в течение 1 минуты, и электропорацию выполняли в течение 30 секунд. Параметры импульса, приводящего к образованию пор, были следующими: напряжение - 2400 В; длина - 5 мс; интервал - 50 мс; количество импульсов - 1; полярность - +. Параметры импульсов, обеспечивающих перенос, были следующими: напряжение - 150 В; длина - 50 мс; интервал - 50 мс; количество импульсов - 20; полярность - +/-. После электропорации клетки переносили в модуль восстановления (другой модуль для выращивания) и оставляли для восстановления в среде SOC, содержащей хлорамфеникол. Через 1 час в среду добавляли карбенициллин, и клетки выращивали в течение еще 2 часов. Затем клетки переносили в центрифужный модуль, после чего среду заменяли. Клетки ресуспендировали в среде TB, содержащей хлорамфеникол и карбенициллин, где их выращивали до значения OD600 2,7, затем концентрировали и делали электрокомпетентными.

[00286] Во время выращивания клеток в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот готовили второй редактирующий вектор. Второй редактирующий вектор содержал ген устойчивости к канамицину, а редактирующая кассета содержала правку galK Y145*. В случае успеха правка galK Y145* наделяет клетки способностью поглощать и метаболизировать галактозу. Правка, генерируемая кассетой galK Y154*, вводит стоп-кодон в 154-й аминокислотный остаток, заменяя аминокислоту тирозина стоп-кодоном. Эта правка приводит к тому, что продукт гена galK становится нефункциональным и препятствует способности клеток метаболизировать галактозу. После сборки продукт второго редактирующего вектора обессоливали в модуле изотермической сборки нуклеиновых кислот, используя шарики AMPure, промывали 80% этанолом и элюировали в буфере. Собранный второй редактирующий вектор и электрокомпетентные клетки E. Coli (которые были трансформированы и отобраны для первого редактирующего вектора) переносили в модуль трансформации для электропорации, используя те же параметры, которые подробно описаны выше. После электропорации клетки переносили в модуль восстановления (другой модуль для выращивания), восстанавливали в среде SOC, содержащей карбенициллин. После восстановления клетки хранили при 4°С до момента извлечения, после чего аликвоту клеток высевали на агар LB с добавлением хлорамфеникола и канамицина. Для количественной оценки правок как lacZ, так и galK создавали пластыри-реплики на двух типах сред: 1) агаризованная основа MacConkey с добавлением лактозы (в качестве сахарного субстрата), хлорамфеникола и канамицина и 2) агаризованная основа MacConkey с добавлением галактозы (в качестве сахарного субстрата), хлорамфеникола и канамицина. Перенос любой жидкости осуществляли с помощью автоматизированного устройства подачи жидкости автоматизированной многомодульной системы для обработки клеток.

[00287] В этом эксперименте рекурсивного редактирования 41% отобранных колоний имели правки как lacZ, так и galK, и эти результаты сопоставимы с эффективностью двойного редактирования, полученные с помощью «настольного» или ручного подхода.

Альтернативные варианты осуществления архитектуры инструмента

[00288] На фиг. 12A и 12B показаны альтернативные примеры вариантов осуществления автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток для выполнения автоматизированной обработки клеток, например, редактирования во множестве клеток за один цикл. Например, автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток могут быть настольными инструментами, разработанными для использования в лабораторных условиях. Автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток могут включать смесь элементов многократного и однократного использования для выполнения различных поэтапных операций при проведении автоматизированного расщепления и/или редактирования генома в клетках.

[00289] Фиг.12А представляет собой блок-схему первого примера инструмента 1200 для выполнения автоматизированной обработки клеток, например, согласно одному из вариантов осуществления изобретения, для редактирования во множестве клеток за один цикл. В некоторых вариантах осуществления инструмент 1200 включает платформу 1202, емкость 1204 с исходными реагентами для введения компонентов образца ДНК в инструмент 1200, емкость 1206 с исходными клетками для ввода клеток в инструмент 1200 и роботизированную систему 1208 подачи для переноса материалов между модулями (например, модулями 1210a, 1210b, 1210c, 1210d), емкостями (например, емкостями 1204, 1206, 1212, 1222, 1224 и 1226) и блоками хранения (например, блоками 1216, 1218, 1228 и 1214) инструмента 1200 для выполнения автоматизированной обработки клеток. После завершения процесса подачи 1206 клеток, в некоторых вариантах осуществления, клеточный продукт 1212 может быть перенесен роботизированной системой 1212 подачи в блок 1214 хранения для временного хранения и последующего извлечения.

[00290] Роботизированная система 1208 подачи, например, может включать поршневой насос для переноса жидкостей из различных источников материала в различные модули 1210 и блок 1214 хранения. В других вариантах осуществления роботизированная система 1208 подачи может включать головку захвата и размещения (не показана) для переноса контейнеров с исходными материалами (например, пробирками) из картриджа с исходными материалами (не показан, см. описание Фиг. 1А) в различные модули 1210. В некоторых вариантах осуществления одна или более камер или других оптических датчиков (не показаны) подтверждают правильность перемещения и положения гентри.

[00291] В некоторых вариантах осуществления в роботизированной системе 1208 подачи используются одноразовые наконечники для переноса, предусмотренные в источнике 1216 наконечников для переноса исходных материалов, реагентов 1204 (например, для сборки нуклеиновых кислот) и клеток 1206 внутри инструмента 1200. Например, использованные наконечники 1216 для переноса могут выбрасываться в блок 1218 для твердых отходов. В некоторых вариантах осуществления блок 1218 для твердых отходов содержит съемник для удаления пробирок с головки захвата и размещения роботизированной системы 1208 подачи.

[00292] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1200 включает кюветы электропаратора с сипперами, соединенными с поршневым насосом. В некоторых вариантах осуществления клетки 1206 и реагент 1204 аспирируют в кювету электропорации через сиппер, и перемещают кювету в сторону одного или более модулей 1210 инструмента 1200.

[00293] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1200 находится под управлением системы 1220 обработки, такой как система 1310 обработки, показанная на фиг. 13. Система 1220 обработки может быть выполнена с возможностью работы с инструментом 100 на основе вводимых пользователем данных. Система 1220 обработки может управлять синхронизацией, продолжительностью, температурой и другими операциями различных модулей 1210 инструмента 1200. Система 1220 обработки может быть соединена с источником питания (не показан) для работы инструмента 1200.

[00294] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1200 включает модуль 1210c трансформации для введения, например, в контексте редактирования, нуклеиновой кислоты(кислот) в клетках 1206. Например, роботизированная система 1208 подачи может переносить реагент 1204 и клетки 1206 в модуль 1210c трансформации. Модуль 1210 трансформации может выполнять любые методы трансформации или трансфекции клеток, обычно используемые специалистами в области трансфекции, трансформации и микрофлюидики. Трансформация включает множество известных в данной области способов введения последовательности экзогенной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-мишень и включает все способы трансформации и трансфекции. Такие способы включают, без ограничения, электропорацию, липофекцию, оптопорацию, инъекцию, микропреципитацию, микроинъекцию, липосомы, бомбардировку частицами, сонопорацию, индуцированную лазером порацию, трансфекцию с помощью шариков, со-осаждение фосфатом кальция или хлоридом кальция или DEAE-декстран-опосредованную трансфекцию. Трансформация может происходить в микроцентрифужных пробирках, тестовых пробирках, кюветах, многолуночных планшетах, микроволоконах или проточных инструментах. Система 1220 обработки может управлять температурой и работой модуля 1210c трансформации. В некоторых вариантах осуществления система 1270 обработки обеспечивает работу модуля 1210c трансформации в соответствии с одним или более изменяемыми элементами управления, устанавливаемыми пользователем.

[00295] В некоторых вариантах осуществления модуль 1210c трансформации выполнен с возможностью подготовки клеток к поглощению вектора путем повышения компетентности клеток с помощью раствора 1222 для предварительной обработки, например путем промывки сахарозой или глицерином. Кроме того, могут быть использованы гибридные методы, в которых используются возможности методов механической и химической трансфекции, например магнитофекция, метод трансфекции, в котором химическая трансфекция объединена с механическими методами. В другом примере катионные липиды могут использоваться в комбинации с генными пушками или электропораторами. Подходящие материалы и методы для трансформации или трансфекции клеток-мишеней можно найти, например, в Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014 и других лабораторных руководствах.

[00296] После трансформации в некоторых вариантах осуществления клетки могут быть перенесены в модуль 1210d восстановления. В некоторых вариантах осуществления модуль 1210d восстановления представляет собой комбинацию модуля восстановления и индукции редактирования. В модуле 1210d восстановления клетки могут быть восстановлены, нуклеиновые кислоты экспрессированы, и в системе индуцибельной нуклеазы в клетки может быть введена нуклеаза, например, с помощью контролируемой по времени индукции, такой как, в некоторых примерах, химическая, световая, вирусная или тепловая индукция, или введение молекулы-индуктора 1224 для экспрессии нуклеазы.

[00297] После редактирования, в некоторых вариантах осуществления, клетки переносят в блок 1214 хранения, где клетки могут храниться в качестве клеточного продукта 1212 до тех пор, пока они не будут извлечены для дальнейшего изучения или поиска отредактированной популяции клеток, например отредактированной библиотеки клеток.

[00298] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1200 предназначен для рекурсивного редактирования генома, в котором в геномы клеток в клеточной популяции последовательно вводят множество правок. В некоторых вариантах осуществления перед получением клеточного продукта 1212 из блока хранения пополняют источник 1204 реагентов для рекурсивной обработки. В других вариантах осуществления в инструмент 1200 может быть введено несколько источников 1204 реагентов и/или их большие объемы, благодаря чему исчезает необходимость во взаимодействие с пользователем перед последующим циклом обработки.

[00299] В некоторых вариантах осуществления часть клеточного продукта 1212a переносят в автоматизированный модуль 1210a для выращивания клеток. Например, может быть перенесен весь клеточный продукт 1212a или только аликвота, так что в инструменте сохраняются пошагово модифицированные образцы. Модуль 1210a для выращивания клеток, в некоторых вариантах осуществления, измеряет OD клеток во время их роста для подтверждения того, что они находятся в требуемой концентрации перед индукцией редактирования. Другие меры плотности клеток и физиологического состояния, которые могут быть использованы, включают, без ограничения, pH, растворенный кислород, высвобождаемые ферменты, акустические свойства и электрические свойства.

[00300] Для уменьшения фона клеток, которые не получили редактирования генома, в некоторых вариантах осуществления модуль 1210а для выращивания выполняет процесс обогащения отредактированных клеток с помощью селективной питательной среды 1226. Например, введенная нуклеиновая кислота может включать ген, который придает устойчивость к антибиотику, или другой селективный маркер. В некоторых вариантах осуществления во время рекурсивного редактирования в клетки может быть введено несколько селективных генов или маркеров 1226. Например, чередование введения селективных маркеров для последовательных циклов редактирования может устранить фон неотредактированных клеток и позволить инструменту 1200 выполнить множество циклов отбора клеток, имеющих последовательно введенные правки генома. Подходящие гены устойчивости к антибиотикам включают, без ограничения, такие как ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину, ген устойчивости к канаванину, ген устойчивости к бластицидину, ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к пуромицину и ген устойчивости к хлорамфениколу.

[00301] Из модуля 1210a для выращивания клетки могут быть перенесены в модуль 110b фильтрации. Модуль 1210b фильтрации или, альтернативно, модуль промывки и концентрации клеток, может осуществлять замену среды. В некоторых вариантах осуществления удаляют фон, создаваемый мертвыми клетками, с помощью усилителей лизиса, таких как детергенты, осмотический стресс, температура, ферменты, протеазы, бактериофаг, восстановители или хаотропы. В других вариантах осуществления для уменьшения фона, создаваемого мертвыми клетками, используется удаление клеток и/или замена среды. Отходы из модуля 1210b фильтрации, в некоторых вариантах осуществления, собирают в блок 1228 для жидких отходов.

[00302] После фильтрации клетки могут быть доставлены в модуль 1210c трансформации, а затем в модуль 1210d восстановления и, наконец, в блок 1214 хранения, как подробно описано выше.

[00303] Как показано на фиг. 12B, аналогично фиг. 12А, второй пример инструмента 1240 для выполнения автоматизированного расщепления и/или редактирования генома во множестве клеток за один цикл включает платформу 1202, емкость 1204 с исходными реагентами для введения одного или более компонентов нуклеиновых кислот в инструмент 1240, емкость 1206 с исходными клетками для введения клеток в инструмент 1240 и роботизированную систему 1208 подачи для переноса материалов между модулями (например, модулями 1210a, 1210b, 1210c, 1210f, 1210g, 1210m и 1210h), емкостями (например, емкостями 1204, 1206, 1212). 1214, 1224, 1242, 1244 и 1246) и блоками хранения (например, блоками 1214, 1216, 1218 и 1228) инструмента 1240 для выполнения автоматизированной обработки клеток. После завершения обработки источника 1206 клеток в некоторых вариантах осуществления клеточный продукт 1212 может быть передан роботизированной системой 1208 подачи в блок 1214 хранения для временного хранения и последующего извлечения.

[00304] В некоторых вариантах осуществления роботизированная система 1208 подачи использует одноразовые наконечники для переноса, предусмотренные в источнике 1216 наконечников для переноса, для переноса исходных материалов, остова 1242 вектора, редактирующих олиго 1244, реагентов 1204 (например, для сборки нуклеиновых кислот, очистки нуклеиновых кислот, для того, чтобы сделать клетки электрокомпетентными, и т.д.) и клеток 1206 внутри инструмента 1240, как описано со ссылкой на фиг. 12А.

[00305] В других вариантах осуществления инструмент 1240 включает кюветы электропоратора с сипперами, соединенными с поршневым насосом 120. В некоторых вариантах осуществления клетки 1206 и реагент 1204 аспирируют в кювету электропорации через сиппер, и перемещают кювету в сторону одного или более модулей 1210 инструмента 1240.

[00306] Как описано в отношении фиг. 12А, в некоторых вариантах осуществления инструмент 1240 находится под управлением системы 1220 обработки, такой как система 1310 обработки, показанная на фиг. 13.

[00307] Инструмент 1240, в некоторых вариантах осуществления, включает модуль 1210g сборки нуклеиновых кислот, и в некоторых примерах автоматизированных многомодульных инструментов для обработки клеток, модуль 1210g сборки нуклеиновых кислот может включать, в некоторых вариантах осуществления, изотермическую сборку нуклеиновых кислот. Как описано выше, модуль изотермической сборки нуклеиновых кислот выполнен с возможностью выполнения способа молекулярного клонирования Gibson Assembly®.

[00308] В некоторых вариантах осуществления после сборки нуклеиновых кислот нуклеиновые кислоты (например, в примере изотермической сборки нуклеиновых кислот, смесь для изотермической сборки нуклеиновых кислот (нуклеиновые кислоты+реагенты для изотермической сборки нуклеиновых кислот) переносят в модуль 1210h очистки. В этом случае, нежелательные компоненты, находящиеся в смеси для сборки нуклеиновых кислот (например, соли, минералы), удаляют, и в некоторых вариантах осуществления собранные нуклеиновые кислоты концентрируют. Например, в иллюстративном варианте осуществления в модуле 1210h очистки изотермическая смесь для сборки нуклеиновой кислоты может быть объединена с не содержащим соли буфером и магнитными шариками, такими как магнитные шарики для твердофазной обратимой иммобилизации (SPRI) или AMPure шарики. Изотермическая смесь для сборки нуклеиновых кислот может быть инкубирована в течение достаточного времени (например, от 30 секунд до 10 минут) для связывания собранных нуклеиновых кислот с магнитными шариками. В некоторых вариантах осуществления модуль очистки включает магнит, выполненный с возможностью взаимодействия с магнитными шариками. Магнит может быть активирован таким образом, чтобы можно было удалить супернатант из связанных собранных нуклеиновых кислот, и связанные собранные нуклеиновые кислоты могут быть промыты, например, 80% этанолом. Снова, магнит может быть активирован, и 80% промывочный раствор этанола удален. Магнитные шарики/собранные нуклеиновые кислоты могут быть высушены, затем собранные нуклеиновые кислоты могут быть элюированы, и магнит снова может быть активирован, на этот раз для отделения шариков и удаления супернатанта, который содержит элюированные собранные нуклеиновые кислоты. Собранные нуклеиновые кислоты затем могут быть перенесены в модуль трансформации (например, электропоратор в предпочтительном варианте осуществления). При переносе модуль трансформации уже может содержать электрокомпетентные клетки.

[00309] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1240 включает модуль 1210c трансформации для введения нуклеиновой кислоты(кислот) в клетки 1206, как описано в отношении фиг. 12А. Однако в этом случае собранные нуклеиновые кислоты 1204, выводимые из модуля 1210h очистки, переносят в модуль 1210c трансформации для объединения с клетками 1206.

[00310] После трансформации в модуле 1210с трансформации, в некоторых вариантах осуществления, клетки могут быть перенесены в модуль 1210m восстановления. В модуле 1210e восстановления клетки могут быть восстановлены, нуклеиновые кислоты экспрессированы, и в системе индуцибельной нуклеазы индуцирована нуклеаза, например, с помощью контролируемой по времени индукции, такой как, в некоторых примерах, химическая, световая, вирусная или тепловая индукция, или введения молекулы-индуктора для экспрессии нуклеазы.

[00311] После восстановления, в некоторых вариантах осуществления, клетки переносят в модуль 1210f редактирования. Модуль 1210f редактирования обеспечивает соответствующие условия для индукции редактирования геномов клеток, например, путем экспрессии введенных нуклеиновых кислот и индукции индуцибельной нуклеазы. Клетки могут включать индуцибельную нуклеазу. В некоторых примерах нуклеаза может быть индуцирована химически, биологически (например, через индуцибельный промотор), с помощью вируса, света, температуры и/или нагревания модуля 1210f редактирования.

[00312] После редактирования, в некоторых вариантах осуществления, клетки переносят в блок 1214 хранения, как описано со ссылкой на фиг. 12А.

[00313] В некоторых вариантах осуществления инструмент 1240 предназначен для рекурсивного редактирования генома, при котором в геномы клеток в клеточной популяции последовательно вводят множество правок. В некоторых вариантах осуществления перед получением клеточного продукта 1212 пополняют источник 1204 реагентов из блока хранения для рекурсивной обработки. Например, дополнительный остов 1242 вектора и/или редактирующие олиго 1244 могут быть введены в инструмент 1240 для сборки и подготовки через модуль 1210g сборки нуклеиновых кислот и модуль 1210h очистки. В других вариантах осуществления в инструмент 1244 могут быть введены объемы 1242 множества остовов векторов и/или редактирующих олиго 1244, благодаря чему исчезает необходимость во взаимодействии с пользователем перед последующим циклом обработки. Для каждого последующего цикла остов 1242 вектора и/или редактирующие олиго 1244 могут меняться. При приготовлении сборки нуклеиновой кислоты сборка нуклеиновой кислоты может быть предусмотрена в источнике 1204 реагентов или в другой области хранения.

[00314] Часть клеточного продукта 1212a, в некоторых вариантах осуществления, переносят в автоматизированный модуль 1210a для выращивания клеток, как описано в отношении фиг. 12А.

[00315] Для уменьшения фона клеток, которые не получили редактирования генома, в некоторых вариантах осуществления модуль 1210а для выращивания выполняет процесс обогащения отредактированных клеток с помощью селективной питательной среды 1226, как описано в отношении фиг. 12А.

[00316] Из модуля 1210a для выращивания клетки могут быть перенесены в модуль 1210b фильтрации, как обсуждалось в отношении фиг. 12А. Как показано, элюент из источника 1246 материалов для элюции (например, буфера, глицерина) может быть перенесен в модуль 1210b фильтрации для замены среды.

[00317] После фильтрации клетки могут быть представлены в модуль 1210c трансформации для трансформации, а затем в модуль 110m восстановления и модуль 1210f редактирования и, наконец, в блок 1214 хранения, как подробно описано выше.

[00318] В некоторых вариантах осуществления автоматизированные многомодульные инструменты для обработки клеток по фиг. 12А и/или 12В содержат один или более сменных картриджей с исходными материалами и роботизированную систему подачи, как обсуждалось со ссылкой на фиг. 1А и 1В. Каждый картридж может содержать одну или более смесей для сборки нуклеиновых кислот, олигонуклеотиды, векторы, питательные среды, селективные агенты (например, антибиотик), индуцирующий агент, реагенты для очистки нуклеиновых кислот, такие как шарики с твердофазной обратимой иммобилизацией (SPRI), этанол и 10% глицерин.

[00319] Хотя примеры инструментов 1200, 1240 проиллюстрированы как имеющие конкретную компоновку модулей 1210, они представлены только с целью иллюстрации. Например, в других вариантах осуществления каждый из инструментов 1200, 1240 может включать большее или меньшее количество модулей 1210. Также в инструмент могут быть включены различные модули, такие как, например, модуль, который облегчает слияние клеток для получения, например, гибридомы, модуль, который осуществляет амплификацию нуклеиновых кислот перед сборкой, и/или модуль, который облегчает экспрессию и/или секрецию белка. Кроме того, в некоторых примерах некоторые модули 1210 могут быть дублированы, например модули 110a, 110b для выращивания клеток, как показано на фиг. 1А. В другом примере каждый из инструментов 1200 и 1240 может быть выполнен с возможностью приема картриджа со средой, такого как картриджи 104 и 106 на фиг. 1А. Возможны и другие модификации.

Система управления для автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток

[00320] На фиг. 11 снимок экрана иллюстрирует пример графического пользовательского интерфейса (GUI) 1100 для взаимодействия с автоматизированным многомодульным инструментом для обработки клеток. Интерфейс, например, может быть представлен на дисплее 236 на фиг. 1С и 2D. В одном из примеров GUI 1100 может быть представлен на сенсорном экране 1316 системы 1310 обработки на фиг. 13.

[00321] В некоторых вариантах осуществления GUI 1100 разделен на несколько панелей ввода информации и данных, таких как панель 1102 протокола, панель 1106 температуры, панель 1108 электропорации и панель 1110 роста клеток. Возможны другие панели. Например, в некоторых вариантах осуществления GUI 1100 включает панели для каждого модуля, такого как, в некоторых примерах, одного или более каждого из: модуля сборки нуклеиновых кислот, модуля очистки, модуля для выращивания клеток, модуля фильтрации, модуля трансформации, модуля редактирования и модуля восстановления. Нижние панели GUI 1100 в некоторых вариантах осуществления представляют модули, применимые к текущему рабочему процессу (например, выбранному на панели 1102 протоколов или обозначенному в скрипте, загруженном через интерфейс скрипта (не показан)). В некоторых вариантах осуществления функция прокрутки или поискового вызова может предоставлять пользователю доступ к дополнительным панелям, не показанным на снимке экрана на фиг. 11.

[00322] GUI 1100, в некоторых вариантах осуществления, включает серию элементов 1120 управления для доступа к различным экранам, таким как проиллюстрированный снимок экрана (например, используя основной элемент 1120a управления). Например, путем выбора элемента 1120b управления редактированием, пользователь может получить возможность устанавливать один, два или несколько этапов обработки клеток. Путем выбора элемента 1120c управления скриптом пользователь может получить возможность добавлять новый скрипт обработки или изменять существующий скрипт обработки. В некоторых вариантах осуществления пользователь может выбрать элемент 1120d управления справкой для получения дополнительной информации, касающейся особенностей GUI 1100 и автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. В некоторых вариантах осуществления пользователь выбирает элемент 1120e управления установочными параметрами для доступа к операциям с установочными параметрами для требуемых процессов и/или GUI 1100, таким как, в некоторых примерах, часовой пояс, язык, единицы измерения, параметры доступа к сети. При выборе элемента 1120f управления мощностью, пользователь может выключить автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток.

[00323] Обращаясь к панели 1102 протоколов, в некоторых вариантах осуществления пользователь выбирает протокол (например, скрипт или рабочий поток) для выполнения автоматизированным многомодульным инструментом для обработки клеток путем ввода протокола в поле 1112 для ввода протокола (или альтернативно, выпадающего меню). В других вариантах осуществления протокол может быть выбран через отдельный экран пользовательского интерфейса, доступ к которому осуществляется, например, путем выбора элемента 1120b управления скриптом. В другом примере автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток может выбирать протокол и презентовать его в поле 1112 для ввода протокола. Например, система обработки автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток может сканировать машиночитаемые знаки, расположенные на одном или более картриджах, загруженных в автоматизированный многомодульный инструмент для обработки клеток для определения соответствующего протокола. Как показано, был выбран протокол «Microbe_Kit1 (1.0.2)», который может соответствовать набору картриджей и других одноразовых расходных материалов, приобретенных для использования автоматизированным многомодульным инструментом для обработки клеток.

[00324] В некоторых вариантах осуществления панель 1102 протоколов дополнительно включает элемент 1114a управления запуском и элемент 1114b управления остановкой для управления выполнением протокола, представленного в поле 1112 ввода протокола. GUI 1100 может быть предусмотрен, например, на интерфейсе с сенсорным экраном, где выбор касанием элемента 1111a управления запуском запускает обработку клеток, а выбор элемента 1114b управления остановкой останавливает обработку клеток.

[00325] Обращаясь к панели 1104 состояния рабочего цикла, в некоторых вариантах осуществления, на диаграмме 1116 показаны этапы обработки протокола, идентифицированного на панели 1102 протоколов. Например, завершенная часть 1118a рабочего цикла, показана синим цветом, а часть, относящаяся к текущему этапу 1118b рабочего цикла, показана зеленым цветом, и любые ошибки 1118c отмечены маркерами, начиная с момента времени в ходе завершенной части 1118a рабочего процесса, когда произошла ошибка. Область 1118d сообщения показывает процент завершенности рабочего процесса, процент завершенности этапа и общее количество ошибок. В некоторых вариантах осуществления после выбора диаграммы 1116 пользователю может быть предоставлена более подробная информация о состоянии выполнения процесса, такая как, в некоторых примерах, идентификация типа ошибки, название текущей стадии обработки (например, сборка нуклеиновой кислоты, очистка, рост клеток, фильтрация, трансформация, восстановление, редактирование и т.д.), а также список этапов обработки в рабочем цикле. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления сообщение о времени завершения рабочего цикла указывает дату и время, в которое, по оценкам, рабочий процесс будет завершен. В некоторых примерах рабочий процесс может представлять собой один процесс редактирования клеток или несколько процессов рекурсивного редактирования клеток, запланированных для выполнения без вмешательства пользователя. В некоторых вариантах осуществления (не показаны) панель 1104 состояния рабочего процесса дополнительно показывает предполагаемое время, когда потребуется вмешательство пользователя (например, замена картриджа, удаление твердых отходов, удаление жидких отходов и т.д.).

[00326] В некоторых вариантах осуществления панель 1104 состояния рабочего процесса включает элемент 1124 управления паузой для приостановки обработки клеток. Пользователь может выбрать приостановку выполнения текущего цикла, например, для исправления обнаруженной ошибки или выполнения ручных операций, например удаления отходов.

[00327] На панели 1106 температуры, в некоторых вариантах осуществления, отображается несколько пиктограмм 1126 с соответствующими сообщениями 1128, указывающими установочные параметры температуры для различных устройств автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Пиктограммы слева направо могут представлять модуль 112 трансформации (например, проточный картридж электропорации, связанный с картриджем 110с с реагентами на фиг.1А или проточные устройства 534 электропорации на фиг.5В), модуль 1126b очистки, первый модуль 1126c для выращивания, второй модуль 1126d для выращивания и модуль 1126e фильтрации. Соответствующие сообщения 1128a-e идентифицируют текущую температуру, низкую температуру и высокую температуру соответствующего модуля (например, для этого этапа или этого рабочего процесса). При выборе одной из пиктограмм 1126, в некоторых вариантах осуществления, можно посмотреть графическое представление зависимости температуры от времени.

[00328] Под панелью температуры, в некоторых вариантах осуществления, несколько панелей идентифицируют текущее состояние нескольких модулей. Например, панель 1108 электропорации показывает состояние модуля трансформации, в то время как панель 1110 роста клеток представляет статус модуля для выращивания. В некоторых вариантах осуществления представленные в настоящем описании панели идентифицируют состояние работающего в данный момент модуля (например, модуля, задействованного в обработке клеток на текущем этапе), а также состояние любых модулей, которые уже были использованы в ходе выполнения текущего рабочего процесса (как показано на фигуре, например, на панели 1104 состояния рабочего процесса). Информация о прошлом статусе, например, может представлять пользователю информацию, касающуюся параметров, использованных на предыдущем этапе(ах) обработки клеток.

[00329] Обращаясь к панели 1108 электропорации, в некоторых вариантах осуществления, представлены рабочие параметры 1130a, такие как, вольты, миллиамперы и джоули. Кроме того, сообщение 1132a о состоянии может давать дополнительную информацию, касающуюся функционирования модуля трансформации, такую как, в некоторых примерах, состояние ошибки, оставшееся время обработки, или содержимое модуля (например, материалы, добавленные в модуль). В некоторых вариантах осуществления пиктограмма 1134a над сообщением 1132a о состоянии может быть представлена в активном режиме (например, быть цветной, «подсвеченной», отмеченной жирным шрифтом и т.д.), когда соответствующий модуль является активным в процессе обработки. Выбор пиктограммы 1134a, в некоторых вариантах осуществления, вызывает графическое представление подробной информации, касающейся рабочих параметров 1130a.

[00330] Обращаясь к панели 1110 роста клеток, в некоторых вариантах осуществления, показаны рабочие параметры 1130b OD и время (часы) роста. Кроме того, сообщение 1132b о состоянии может давать дополнительную информацию, касающуюся функционирования модуля для выращивания, такую как, в некоторых примерах, состояние ошибки, оставшееся время обработки или содержимое модуля (например, материалы, добавленные в модуль). В некоторых вариантах осуществления пиктограмма 1134b над сообщением 1132b о состоянии может быть представлена в активном режиме (например, быть цветной, «подсвеченной», отмеченной жирным шрифтом и т.д.), когда соответствующий модуль является активным в процессе обработки. Выбор пиктограммы 1134b, в некоторых вариантах осуществления, вызывает графического представление подробной информации, касающейся рабочих параметров 1130b.

[00331] Далее описание аппаратных средств примера системы обработки и среды обработки в соответствии с примерными вариантами осуществления описано со ссылкой на фиг. 13. На фиг. 13, система 1310 обработки включает CPU 1308, который исполняет часть описанных выше процессов. Например, CPU 1308 может управлять этапами обработки способа 900 на фиг. 9 и/или рабочими процессами на фиг. 10A-C. Данные процесса и скрипты, инструкции и/или пользовательские установочные параметры могут храниться в памяти 1302. Эти данные процесса и скрипты, инструкции и/или пользовательские установочные параметры также могут храниться на дисковом носителе данных 1304, таком как портативный носитель данных (например, USB-накопитель, оптический дисковод и т.д.) или может храниться удаленно. Например, данные процесса и скрипты, инструкции и/или пользовательские установочные параметры могут храниться в месте, доступном для системы 1310 обработки через сеть 1328. Кроме того, заявленные преимущества не ограничены формой машиночитаемого носителя, на котором хранятся инструкции процесса по изобретению. Например, инструкции могут храниться во флэш-памяти, ОЗУ, ПЗУ или любом другом устройстве обработки информации, с которым взаимодействует система 1310 обработки, таком как сервер, компьютер, смартфон или другом портативном вычислительном устройстве.

[00332] Кроме того, компоненты заявленных решений могут быть предоставлены в виде служебного приложения, фонового процесса-демона или компонента операционной системы или их комбинации, выполняемой совместно с CPU 1308 и операционной системой, например, другими вычислительными системами, известными специалистам в данной области.

[00333] CPU 1308 может представлять собой ARM процессор, систему-на-кристалле (SOC), микропроцессором, микроконтроллер, цифровой сигнальный процессор (DSP) или может быть процессором другого типа, который известен специалисту в данной области техники. Кроме того, CPU 1308 может быть реализован в виде нескольких процессоров, совместно работающих параллельно для выполнения инструкций процессов по изобретению, описанных выше.

[00334] Система 1310 обработки является частью среды 1300 обработки. Система 1310 обработки на фиг.13 также включает сетевой контроллер 1306 для взаимодействия с сетью 1328 для доступа к дополнительным элементам в среде 1300 обработки. Очевидно, что сеть 1328 может быть сетью общего пользования, такой как Интернет, или частной сетью, такой как сеть LAN или WAN, или любой их комбинацией, и также может включать подсети PSTN или ISDN. Сеть 1328 может быть беспроводной, такой как сотовая сеть, включающая беспроводные сотовые системы EDGE, 3G и 4G. Беспроводная сеть также может представлять собой Wi-Fi, Bluetooth или любую другую известную беспроводную форму связи.

[00335] Система 1310 обработки дополнительно включает интерфейс 1312 ввода/вывода общего назначения, взаимодействующий с пользовательским интерфейсом (например, сенсорным экраном) 1316, одним или более датчиками 1314 и одним или более периферийными устройствами 1318. Периферийные устройства ввода/вывода 1318 могут включать, в некоторых примерах, систему видеозаписи, систему аудиозаписи, микрофон, внешние запоминающие устройства и/или внешние акустические системы. Один или более датчиков 1314 могут включать одно или более из: гироскопа, акселерометра, датчика силы тяжести, линейного акселерометра, системы глобального позиционирования, сканера штрих-кода, сканера QR-кода, сканера RFID, монитора температуры и системы освещения или элемента освещения.

[00336] Контроллер 1324 хранения общего назначения соединяет дисковый носитель 1304 данных с шиной 1340 связи, такой как параллельная шина или последовательная шина, такая как универсальная последовательная шина (USB) или аналогичная, для соединения всех компонентов система обработки. Для краткости, в настоящем описании опущено описание общих признаков и функциональных возможностей контроллера 1324 хранения, сетевого контроллера 1306 и интерфейса 1312 ввода/вывода общего назначения, поскольку эти признаки известны.

[00337] Система 1310 обработки, в некоторых вариантах осуществления, включает один или более встроенных и/или периферийных датчиков 1314. Датчики 1314, например, могут быть встроены непосредственно во внутреннюю электронику и/или корпус автоматизированного многомодульного инструмента для обработки. Часть датчиков 1314 может находиться в прямом физическом контакте с интерфейсом 1312 ввода/вывода, например, через провод; или в беспроводном контакте, например, через соединение Bluetooth, Wi-Fi или NFC. Например, контроллер 1326 беспроводной связи может обеспечивать связь между одним или более беспроводными датчиками 1314 и интерфейсом 1312 ввода/вывода. Кроме того, один или более датчиков 1314 могут находиться в опосредованном контакте, например, через промежуточные серверы или устройства хранения, которые находятся в сети 1328; или в (проводном, беспроводном или опосредованном) контакте с аккумулятором сигналов, расположенном внутри автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток, который, в свою очередь, находится в (проводном, беспроводном или опосредованном) контакте с интерфейсом 1312 ввода/вывода.

[00338] Группа датчиков 1314, обменивающихся данными с интерфейсом 1312 ввода/вывода, может использоваться в комбинации для сбора сигналов заданного типа из множества мест для генерации более полной карты сигналов. Один или более датчиков 1314, связывающихся с интерфейсом 1312 ввода/вывода, могут использоваться в качестве компаратора или элемента проверки, например, для фильтрации, отмены или отклонения других сигналов.

[00339] В некоторых вариантах осуществления среда 1300 обработки включает вычислительное устройство 1338, поддерживающее связь с системой 1310 обработки через контроллер 1326 беспроводной связи. Например, контроллер 1326 беспроводной связи может обеспечивать обмен сообщениями по электронной почте, текстовыми сообщениями и/или оповещениями программных приложений, разработанными для смартфона или другого персонального вычислительного устройства пользователя.

[00340] Среда 1300 обработки, в некоторых вариантах осуществления, включает роботизированную систему 1322 подачи материала. Система 1310 обработки может включать контроллер 1320 роботизации для выдачи управляющих сигналов для приведения в действие элементов роботизированной системы подачи материалов, таких как манипулирование положением гентри, опусканием или подъемом элемента сиппера или дозатора и/или приведением в действие насосов и клапанов для обеспечения переноса жидкости между сиппером/дозатором и различными сосудами (например, камерами, флаконами и т.д.) в автоматизированном многомодульном инструменте для обработки клеток. Контроллер 1320 роботизации, в некоторых примерах, может включать драйвер оборудования, элемент встроенного программного обеспечения и/или один или более алгоритмов или пакетов программного обеспечения для сопряжения системы 1310 обработки с роботизированной системой 1322 подачи материалов.

[00341] В некоторых вариантах осуществления среда 1310 обработки включает один или более интерфейсов 1332 модулей, таких как, в некоторых примерах, один или более интерфейсов датчиков, интерфейсов управления мощностью, интерфейсов клапанов и насосов и/или интерфейсов приводов для активации и управления обработкой каждого модуля автоматизированной многомодульной системы для обработки. Например, интерфейсы 1332 модулей могут включать интерфейс привода для приводного двигателя 864 вращающегося устройства 850 для выращивания клеток (фиг.8D) и интерфейс датчика для детекторной пластины 872, которая измеряет оптическую плотность растущих клеток во вращающемся флаконе 800 для выращивания. Контроллер 1330 модулей в некоторых вариантах осуществления выполнен с возможностью взаимодействия с интерфейсами 1332 модулей. Контроллер 1330 модулей может включать один или более контроллеров (например, возможно, один контроллер на модуль, хотя некоторые модули могут совместно использовать один контроллер). Контроллер 1330 модулей, в некоторых примерах, может включать драйвер оборудования, элемент встроенного программного обеспечения и/или один или более алгоритмов или пакетов программного обеспечения для сопряжения системы 1310 обработки с интерфейсами 1332 модулей.

[00342] Среда 1310 обработки, в некоторых вариантах осуществления, включает систему 1336 управления тепловым режимом для управления климатическими условиями в корпусе автоматизированной многомодульной системы обработки. Система 1336 управления тепловым режимом может дополнительно контролировать климатические условия в одном или более модулях автоматизированного многомодульного инструмента для обработки клеток. Система 1310 обработки, в некоторых вариантах осуществления, включает контроллер 1334 температуры для взаимодействия с системой 1336 управления температурой. Контроллер 1334 температуры, в некоторых примерах, может включать драйвер оборудования, элемент встроенного программного обеспечения и/или один или более алгоритмов или пакетов программного обеспечения для сопряжения системы обработки 1310 с системой 1336 управления температурой.

Создание библиотек клеток с помощью методов автоматизированного редактирования, модулей, инструментов и систем

[00343] В одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет автоматизированные способы редактирования, модули, инструменты и автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток для создания библиотеки клеток, которые изменяют экспрессию, уровни и/или активность представляющих интерес РНК и/или белков в различных типах клеток с помощью различных стратегий редактирования, более подробно описанных в настоящей заявке. Соответственно, настоящее изобретение охватывает библиотеки отредактированных клеток, созданных автоматизированными способами редактирования, автоматизированными многомодульными инструментами для редактирования клеток по изобретению. Эти библиотеки клеток могут иметь различные целевые изменения, включая, без ограничения, нокауты генов, включения генов, вставки, делеции, редактирования отдельных нуклеотидов, изменения коротких тандемных повторов, сдвиги рамок считывания, экспансию триплетных кодонов и тому подобное в клетках различных организмов. Эти правки могут быть направлены на кодирующие или некодирующие области генома и предпочтительно являются рационально разработанными.

[00344] В других аспектах настоящее изобретение включает способы автоматизированного редактирования, автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток для создания библиотеки клеток, которые изменяют процессы, связанные с ДНК. Например, библиотека клеток может включать отдельные клетки, имеющие правки в сайтах связывания ДНК, препятствуя связыванию регуляторных элементов, модулирующих экспрессию выбранных генов, с ДНК. Кроме того, библиотеки клеток могут включать изменения в геномной ДНК, которые влияют на клеточные процессы, такие как образование гетерохроматина, рекомбинация с переключением класса и рекомбинация VDJ.

[00345] В конкретных аспектах библиотеки клеток создают с помощью мультиплексного редактирования отдельных клеток в клеточной популяции, при этом множество клеток в клеточной популяции редактируют в одном цикле редактирования, т.е. множественные изменения в клетках библиотеки клеток происходят в результате одной автоматизированной операции. Библиотеки, которые могут быть созданы в результате одной мультиплексной автоматизированной операции, могут содержать до 500 отредактированных клеток, 1000 отредактированных клеток, 2000 отредактированных клеток, 10000 отредактированных клеток, 50000 отредактированных клеток, 100000 отредактированных клеток, 200000 отредактированных клеток, 300000 отредактированные клеток, 400000 отредактированных клеток, 500000 отредактированных клеток, 700000 отредактированных клеток, 800000 отредактированных клеток, 900000 отредактированных клеток, 1000000 отредактированных клеток, 2000000 отредактированных клеток, 3000000 отредактированных клеток, 4000000 отредактированных клеток, 5000000 отредактированных клеток, 6000000 отредактированных клеток, 7000000 отредактированных клеток, 8000000 отредактированных клеток, 9000000 отредактированных клеток, 10000000 отредактированных клеток или более.

[00346] В других конкретных аспектах библиотеки клеток создают с помощью рекурсивного редактирования отдельных клеток в клеточной популяции, при этом правки добавляются в отдельные клетки за два или более цикла редактирования. Использование рекурсивного редактирования приводит к объединению двух или более правок, нацеленных на два или более сайтов в геноме в отдельных клетках библиотеки. Библиотеки, которые могут быть созданы в результате автоматизированной рекурсивной операции, могут содержать до 500 отредактированных клеток, 1000 отредактированных клеток, 2000 отредактированных клеток, 5000 отредактированных клеток, 50000 отредактированных клеток, 100000 отредактированных клеток, 200000 отредактированных клеток, 300000 отредактированных клеток, 400000 отредактированных клеток, 500000 отредактированных клеток, 600000 отредактированных клеток, 700000 отредактированных клеток, 900000 отредактированных клеток, 1000000 отредактированных клеток, 2000000 отредактированных клеток, 3000000 отредактированных клеток, 4000000 отредактированных клеток, 5000000 отредактированных клеток, 6000000 отредактированных клеток, 7000000 отредактированных клеток, 8000000 отредактированных клеток, 9000000 отредактированных клеток, 10000000 отредактированных клеток или более.

[00347] Примеры неавтоматизированных стратегий редактирования, которые могут быть модифицированы на основе настоящего описания для использования автоматизированных систем, можно найти, например, в патентах США №№ 810360, 8323260, 9888824, 20170316353 и 20120277120.

[00348] В конкретных аспектах рекурсивное редактирование можно использовать, чтобы сначала создать фенотип клеток, а затем использовать более поздние циклы редактирования для изменения фенотипа и/или ускорения других свойств клеток.

[00349] В некоторых аспектах библиотека клеток содержит изменения для создания в клетке не встречающихся в природе аминокислот.

[00350] В конкретных аспектах изобретение предоставляет библиотеки отредактированных клеток, имеющих правки в одном или более регуляторных элементах, созданных с помощью автоматизированных способов редактирования, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по изобретению. Термин «регуляторный элемент» относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут влиять на транскрипцию и/или трансляцию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретной среде и/или контексте. Этот термин включает все элементы, которые способствуют или регулируют транскрипцию и стабильность РНК, включая промоторы, основные элементы, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, вышележащие элементы, энхансеры и элементы ответа (см., например, Lewin, «Genes V» (Oxford University Press, Oxford), стр. 847-873). Типичные регуляторные элементы в прокариотах включают, без ограничения, промоторы, операторные последовательности и сайты связывания рибосом. Регуляторные элементы, которые используются в эукариотических клетках, могут включать, без ограничения, промоторы, энхансеры, инсуляторы, сигналы сплайсинга и сигналы полиаденилирования.

[00351] Предпочтительно, библиотека отредактированных клеток включает рационально разработанные правки, которые разработаны на основе предсказаний структуры белка, экспрессии и/или активности в конкретном типе клеток. Например, рациональный дизайн может быть основан на общесистемной биофизической модели редактирования генома с конкретной нуклеазой и регулированием гена для предсказания того, как различные параметры редактирования, включая экспрессию нуклеазы и/или связывание, условия для выращивания и другие экспериментальные условия, совместно управляют динамикой редактирования с помощью нуклеазы. См., например, Farasat and Salis, PLoS Comput Biol., 29:12(1):e1004724 (2016).

[00352] В одном из аспектов настоящее изобретение предоставляет создание библиотеки отредактированных клеток с различными рационально разработанными регуляторными последовательностями, созданными с помощью автоматизированных инструментов, систем и способов редактирования по изобретению. Например, отредактированная библиотека клеток может включать популяции прокариотических клеток, созданные с помощью набора конститутивных и/или индуцибельных промоторов, энхансерных последовательностей, операторных последовательностей и/или участков связывания рибосом. В другом примере библиотека отредактированных клеток может включать эукариотические последовательности, созданные с помощью набора конститутивных и/или индуцибельных промоторов, энхансерных последовательностей, операторных последовательностей и/или различных последовательностей Козака (Kozak) для экспрессии представляющих интерес белков.

[00353] В некоторых аспектах изобретение предоставляет библиотеки клеток, включая клетки, с рационально разработанными правками, включающими правки одного или более классов в представляющих интерес последовательностях в геноме организма. В конкретных аспектах изобретение предоставляет библиотеки клеток, включая клетки, с рационально разработанными правками, включающими правки одного или более классов в представляющих интерес последовательностях в подмножестве генома. Например, библиотека клеток может включать клетки с рационально разработанными правками, содержащими правки одного или более классов в представляющих интерес последовательностях в экзоме, например, в каждой или в большинстве открытых рамок считывания генома. Например, библиотека клеток может включать клетки с рационально разработанными правками, содержащими один или более классов правок в представляющих интерес последовательностях в киноме. В еще одном примере библиотека клеток может включать клетки с рационально разработанными правками, содержащими один или более классов правок в представляющих интерес последовательностях в секретоме. В других аспектах библиотека клеток может включать клетки с рационально разработанными правками, созданными для анализа различных изоформ белков, кодируемых в экзоме, и такие библиотеки клеток могут быть предназначены для контроля экспрессии одной или более конкретных изоформ, например, для анализа транскриптома.

[00354] Важно отметить, что в некоторых аспектах библиотеки клеток могут содержать правки с использованием рандомизированных последовательностей, например рандомизированных промоторных последовательностей, для уменьшения сходства между экспрессией одного или более белков в отдельных клетках в библиотеке. Кроме того, промоторы в клеточной библиотеке могут быть конститутивными, индуцибельными или обоих типов для обеспечения высокого и/или титруемого уровня экспрессии.

[00355] В других аспектах настоящее изобретение предоставляет способы автоматизированного редактирования, автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток для создания библиотеки клеток, содержащей правки, для идентификации оптимальной экспрессию выбранного гена-мишени. Например, для продуцирования биохимических веществ с помощью метаболической инженерии часто требуется экспрессия ферментов сигнальных путей, и в клетке не всегда достигается наилучший выход продукции при максимальном количестве целевых ферментов сигнальных путей, а скорее за счет точной настройки уровней экспрессии отдельных ферментов и связанных с ними регуляторных белков и/или путей. Точно так же для получения оптимальных выходов иногда можно экспериментально отрегулировать уровни экспрессии гетерологичных белков.

[00356] Наиболее очевидным способом воздействия транскрипции на уровни экспрессии генов является скорость инициации Pol II, которая может модулироваться комбинациями сил промотора или энхансера и трансактивирующих факторов (Kadonaga et al., Cell, 116(2):247-57 (2004). У эукариот скорость элонгации также может определять паттерны экспрессии генов, влияя на альтернативный сплайсинг (Cramer et al., PNAS USA, 94 (21):11456-60 (1997). Неудачная терминация в гене может нарушать экспрессию нижестоящих генов, уменьшая доступность промотора для Pol II (Greger et al., 2000 PNAS USA, 97(15):8415-20 (2000). Этот процесс, известный как транскрипционная интерференция, особенно актуален для низших эукариот, так как они часто имеют близко расположенные гены.

[00357] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы оптимизации транскрипции клеточных генов. Транскрипция генов является результатом нескольких различных биологических явлений, включая инициацию транскрипции (рекрутирование РНКp и образование транскрипционного комплекса), элонгацию (синтез/элонгацию цепи) и терминацию транскрипции (отрыв РНКp и терминацию).

Сайт-направленный мутагенез

[00358] Библиотеки клеток могут быть созданы с помощью автоматизированных методов, модулей, инструментов и систем редактирования, использующих сайт-направленный мутагенез, т.е. когда аминокислотная последовательность белка или другого признака генома может быть намеренно и точно изменена путем мутации белка или признака генома. Эти клеточные линии могут быть полезны для различных целей, например, для определения функции белка в клетках, идентификации ферментативно активных участков в клетках и конструирования новых белков. Например, сайт-направленный мутагенез может использоваться в мультиплексном способе для замены одной аминокислоты в последовательности белка другой аминокислотой с другими химическими свойствами. Это позволяет определить влияние рационально разработанной или случайно сгенерированной мутации в отдельных клетках внутри клеточной популяции. Смотри, например, Berg, et al. Biochemistry, Sixth Ed. (New York: W.H. Freeman and Company) (2007).

[00359] В другом примере могут быть внесены изменения в отдельные клетки в клеточной библиотеке для замены аминокислот в связывающих участках, такие как замена одной или более аминокислот в связывающем участке белка для взаимодействия внутри белкового комплекса или замены одной или более аминокислот в ферментных карманах, которые могут вмещать кофактор или лиганд. Этот класс правок обеспечивает специфические манипуляции с белком для измерения определенных свойств одного или более белков, включая взаимодействие с другими кофакторами, лигандами и т.д. внутри белкового комплекса.

[00360] В другом примере с помощью сайт-специфического мутагенеза могут быть сделаны различные типы правок в отдельных клетках в библиотеке клеток для изучения локусов количественных признаков экспрессии (eQTL). eQTL представляет собой локус, который объясняет часть генетической изменчивости фенотипа экспрессии генов. Библиотеки по изобретению могут быть полезными для оценки и поиска связи eQTL с текущим болезненным состояниям.

[00361] В конкретных аспектах правки, введенные в библиотеки клеток по настоящему изобретению, могут быть созданы с помощью рационального дизайна, основанного на известных или предсказанных структурах белков. См., например, Chronopoulou EG and Labrou, Curr Protoc Protein Sci.; Chapter 26:Unit 26.6 (2011). Такой сайт-направленный мутагенез позволяет получать в отдельных клетках в библиотеке одну или более сайт-направленных правок и предпочтительно две или более сайт-направленных правок (например, комбинаторных правок) в клеточной популяции.

[00362] В других аспектах клеточные библиотеки по настоящему изобретению создают путем «сканирования» всех или по существу всех кодонов в кодирующей области гена на наличие сайт-направленных мутаций в кодоне. Таким образом, отдельные правки в конкретных кодонах могут быть проверены на предмет потери или усиления функции на основе специфических полиморфизмов в одном или более кодонах гена. Эти библиотеки могут оказаться мощным инструментом для определения того, какие генетические изменения молчат или приводят к появлению определенного фенотипа в клетке или популяции клеток. Правки в кодонах могут генерироваться случайным образом или могут быть рационально разработаны на основе известных полиморфизмов и/или мутаций, которые были идентифицированы в гене, подлежащем анализу. Кроме того, использование этих методов для двух или более генов одного пути в клетке может определить потенциальные белок:белок взаимодействия или избыточности в клеточных функциях или путях.

[00363] Например, для определения вклада конкретного остатка в стабильность или функцию определенного белка можно использовать аланиновое сканирование. См., например, Lefèvre et al., Nucleic Acids Research, Volume 25 (2):447-448 (1997). Аланин часто используется в этом методе сканирования кодонов благодаря своей негромоздкой, химически инертной, метильной функциональной группе, которая может имитировать предпочтения вторичной структуры, которую имеют многие другие аминокислоты. Сканирование кодонов также можно использовать для определения того, играет ли боковая цепь конкретного остатка важную роль в функции и/или активности клеток. Иногда при создании библиотек клеток для сканирования кодонов, когда необходимо сохранение размера мутированных остатков, можно использовать другие аминокислоты, такие как валин или лейцин.

[00364] В других конкретных аспектах клеточные библиотеки могут быть созданы с помощью автоматизированных способов редактирования, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по изобретению для определения активного сайта белка, такого как фермент или гормон, и для выяснения механизма действие одного или более из этих белков в клеточной библиотеке. Сайт-направленный мутагенез, связанный с исследованиями молекулярного моделирования, может быть использован для обнаружения структуры активного сайта фермента и, следовательно, его механизма действия. Анализ этих клеточных библиотек может дать представление о роли специфических аминокислотных остатков в активных сайтах белков, в контактах между субъединицами белковых комплексов, во внутриклеточном транспорте и стабильности/периоде полураспада белка в различных генетических средах.

Насыщающий мутагенез

[00365] В некоторых аспектах библиотеки клеток, созданные с помощью автоматизированных способов редактирования, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению, могут включать библиотеки, полученные методом насыщающего мутагенеза, в которых один кодон или набор кодонов рандомизированы для получения всех возможных аминокислот в положение конкретного гена или генов, представляющих интерес. Эти библиотеки клеток могут быть особенно полезны для создания вариантов, например, для направленной эволюции. См., например, Chica et al., Current Opinion in Biotechnology 16 (4):378-384 (2005); и Shivange, Current Opinion in Biotechnology, 13 (1):19-25.

[00366] В некоторых аспектах для кодирования наборов аминокислот в отдельных клетках в библиотеках можно использовать правки, содержащие разные вырожденные кодоны. Поскольку некоторые аминокислоты кодируются большим количеством кодонов, чем другие, точное соотношение аминокислот не может быть одинаковым. В некоторых аспектах используются более ограниченные вырожденные кодоны. «NNK» и «NNS» имеют преимущество в кодировании всех 20 аминокислот, но все же кодируют стоп-кодон в 3% случаев. Альтернативные кодоны, такие как «NDT», «DBK», полностью избегают стоп-кодонов и кодируют минимальный набор аминокислот, которые все еще охватывают все основные биофизические типы (анионный, катионный, алифатический гидрофобный, ароматический гидрофобный, гидрофильный, малый).

[00367] В конкретных аспектах, неизбыточный насыщающий мутагенез, в котором в процессе редактирования методом насыщающего мутагенеза используется наиболее часто используемый кодон для конкретного организма.

Замены и лэддеры промоторов

[00368] Одним из механизмов анализа и/или оптимизации экспрессии одного или более представляющих интерес генов является создание библиотеки клеток с «заменами промотора», в которой клетки содержат генетические правки, которые имеют специфические промоторы, связанные с одним или более представляющими интерес генами. Соответственно, библиотеки клеток, созданные с помощью способов, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению, могут быть библиотеками клеток с заменами промотора, которые можно использовать, например, для увеличения или уменьшения экспрессии представляющего интерес гена для оптимизации метаболического или генетического пути. В некоторых аспектах библиотеку клеток с заменами промотора можно использовать для определения увеличения или уменьшения экспрессии гена, который влияет на активность или жизнеспособность клеток, например, гена, кодирующего белок, который влияет на скорость роста или общее состояние клеток. В некоторых аспектах библиотека клеток с заменами промотора может использоваться для создания клеток, имеющих зависимости и логику между промоторами для создания синтетических генных сетей. В некоторых аспектах замену промоторов можно использовать для контроля межклеточной связи между клетками как гомогенных, так и гетерогенных (сложных тканей) популяций в природе.

[00369] В клеточных библиотеках можно использовать любое заданное количество промоторов, которые были сгруппированы вместе на основании наблюдаемого диапазона уровней экспрессии и любого заданного количества генов-мишеней. Лэддер промоторных последовательностей изменяет экспрессию по меньшей мере одного локуса при по меньшей мере одном условии. Этот лэддер затем систематически применяют к группе генов в организме, используя автоматизированные методы редактирования, автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток по изобретению.

[00370] В конкретных аспектах, библиотека клеток, сформированная с помощью процессов, модулей и систем автоматизированного редактирования по изобретению включает отдельные клетки, которые являются репрезентативными для данного промотора, функционально связанного с одним или более представляющими интерес генами-мишенями, которые в остальном имеют идентичные генетические условия. Примеры стратегий неавтоматизированного редактирования, которые могут быть модифицированы для использования автоматизированных систем, можно найти, например, в патенте США № 9988624.

[00371] В конкретных аспектах библиотеку клеток с заменой промоторов получают путем редактирования набора генов-мишеней, которые функционально связаны с предварительно выбранным набором промоторов, действующих как «лэддер промоторов», для экспрессии представляющих интерес генов. Например, клетки отредактированы таким образом, что один или более представляющих интерес отдельных генов отредактированы так, чтобы они были функционально связаны с различными промоторами из лэддера промоторов. Если эндогенный промотор отсутствует, или его последовательность неизвестна, или он был ранее каким-то образом изменен, то перед представляющими интерес генами могут быть вставлены отдельные промоторы из лэддера промоторов. Полученные таким образом библиотеки клеток имеют отдельные клетки с индивидуальным промотором из лэддера, который функционально связан с одним или более генами-мишенями в ином идентичном генетическом контексте.

[00372] Промоторы обычно выбирают так, чтобы они приводили к вариабельной экспрессии в разных локусах, и могут включать индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы или и тот, и другой.

[00373] Набор генов-мишеней, отредактированных с помощью лэддера промоторов, может включать все или большинство открытых рамок считывания (ORF) в геноме или выбранной подгруппе генома, например, ORF кинома или секретомы. В некоторых аспектах гены-мишени могут включать кодирующие области для различных изоформ генов, и библиотеки клеток могут быть сконструированы для экспрессии одной или более конкретных изоформ, например, для анализа транскриптомы с использованием различных промоторов.

[00374] Набором генов-мишеней также могут быть гены о которых известно или предполагается, что они участвуют в конкретном клеточном пути, например, регуляторном пути или сигнальном пути. Набор генов-мишеней может представлять собой ORF, связанные с функцией, путем соотнесения с ранее продемонстрированными полезными правками (предыдущими заменами промотора или предыдущими заменами SNP), путем выбора алгоритма на основе эпистатических взаимодействий между ранее сгенерированными правками, других критериев отбора на основе гипотез относительно полезного ORF для мишени, или путем случайного отбора. В конкретных вариантах осуществления гены-мишени могут содержать не кодирующие белок гены, включая некодирующие РНК.

[00375] Редактирование других функциональных генетических элементов, включая элементы-изоляторы и другие элементы геномной организации, также можно использовать для систематического изменения уровня экспрессии набора генов-мишеней, путем введения правок с помощью методов и автоматизированных многомодульных инструменты для редактирования клеток по изобретению. В одном из аспектов популяцию клеток редактируют с использованием лэддера энхансерных последовательностей, отдельно или в комбинации с выбранными промоторами или лэддером промоторов, для создания библиотеки клеток, имеющих различные правки в этих энхансерных элементах. В другом аспекте популяцию клеток редактируют с использованием лэддера последовательностей связывания рибосом, отдельно или в комбинации с выбранными промоторами или лэддером промоторов, для создания библиотеки клеток, имеющих различные правки в этих последовательностях связывания рибосом.

[00376] В другом аспекте популяцию клеток редактируют так, чтобы различные мРНК и/или белковые стабилизирующие или дестабилизирующие последовательности были присоединены к 5' или 3' концу или в любом другом месте транскрипта или белка.

[00377] В некоторых аспектах популяция клеток ранее установленной клеточной линии может быть отредактирована с помощью автоматизированных способов, модулей, инструментов и систем редактирования по изобретению для создания библиотеки клеток для улучшения функции, активности и/или жизнеспособности клеток. Например, многие промышленные штаммы, используемые в настоящее время для крупномасштабного производства, были разработаны с помощью итеративных процессов случайного мутагенеза, проводимых в течение многих лет, а иногда и десятилетий. Наряду с полезными изменениями в штаммы вводили нежелательные нейтральные и вредные мутации, и со временем это привело к созданию штаммов, недостаточно устойчивых и с недостатками в ключевых признаках, таких как темпы роста. В другом примере клеточные линии млекопитающих продолжают мутировать при пассировании с течением времени, и аналогичным образом эти клеточные линии могут становиться нестабильными и приобретать нежелательны признаки. Автоматизированные способы редактирования, автоматизированные многомодульные инструменты для редактирования клеток по настоящему изобретению могут использовать стратегии редактирования, такие как замена SNP и/или STR, генерация вставок или делеций или другие методы, для удаления или изменения нежелательных последовательностей в геноме и/или введения новых последовательностей в геном для устранения недостатки с сохранением при этом желательные свойств клеток.

[00378] При использовании рекурсивного редактирования редактирование в отдельных клетках в отредактированной библиотеке клеток может включать введение «посадочных площадок» в эктопический участок генома (например, локус CarT) для оптимизации экспрессии, стабильности и/или контроля.

[00379] В некоторых вариантах осуществления каждую полученную библиотеку, имеющую отдельные клетки, содержащие одну или более правок (либо введение, либо удаление), культивируют и анализируют по одному или более критериям (например, получению химического вещества или продукта, представляющего интерес)., Затем выполняют поиск ассоциаций или корреляций между клетками, обладающими определенными критериями, и одной или более конкретными правками в клетке. Таким образом, может быть определено влияние заданной правки на любое количество генетических или фенотипических признаков, представляющих интерес. Идентификация множества правок, связанных с конкретными критериями или улучшенными функциональными возможностями/устойчивостью, может привести к появлению клеток с весьма желательными характеристиками.

Библиотеки нокаутов или нокинов

[00380] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированным способам, модулям, инструментам и системам редактирования для создания библиотеки клеток, имеющих правки «нокаут» (KO) или «нокин» (KI) в различных представляющих интерес генах. Таким образом, изобретение охватывает отредактированные библиотеки клеток, созданные с помощью автоматизированных способов редактирования, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по изобретению, которые имеют одну или более мутаций, которые удаляют или уменьшают экспрессию выбранных представляющих интерес генов, для детального изучения влияния этих правок на функцию гена в отдельных клетках в библиотеке клеток.

[00381] Библиотеки клеток могут быть созданы с использованием КО целевого гена (например, путем вставки/делеции) или нескольких КО (например, путем гомологичной направленной репарации). Например, разрывы двойных цепей часто восстанавливаются путем репарации ДНК через соединение негомологичными концами. Известно, что репарация предрасположена к ошибкам, и, таким образом, могут быть введены вставки и делеции, которые могут нарушить функцию гена. Предпочтительными являются рационально разработанные правки, обеспечивающие конкретное воздействие на представляющие интерес гены, и могут быть созданы отдельные клетки, имеющие KI или KI в одном или более представляющих интерес локусах. Клетки, имеющие KO или KI в двух или более представляющих интерес локусах, могут быть созданы с помощью автоматизированного рекурсивного редактирования по изобретению.

[00382] В конкретных аспектах библиотеки клеток с KO или KI создают с помощью одновременного мультиплексного редактирования клеток в клеточной популяции, и множества клеток в клеточной популяции редактируют за один цикл редактирования, т.е. одна автоматизированная операция дает в результате множество изменений в клетках в библиотеке клеток. В других конкретных аспектах библиотеки клеток создают с помощью рекурсивного редактирования отдельных клеток в клеточной популяции и приводит в результате к накоплению множества правок в двух или более сайтах в геноме отдельных клеток.

Замены SNP или коротких тандемных повторов

[00383] В одном из аспектов библиотеки клеток создают с помощью автоматизированных методов редактирования, автоматизированных многомодульных инструментов для редактирования клеток по настоящему изобретению путем систематического введения или замены однонуклеотидных полиморфизмов («SNP») в геномах отдельных клеток для создания библиотеки клеток с «заменой SNP». В некоторых вариантах осуществления способы замены SNP по настоящему изобретению включают как добавление полезных SNP, так и удаление вредных и/или нейтральных SNP. Замены SNP могут быть направлены на кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, либо на то, и другое.

[00384] В другом аспекте библиотеку клеток создают с помощью автоматизированных способов, модулей, инструментов, инструментов и систем редактирования по изобретению путем систематического введения или замены коротких тандемных повторов («STR») в геномах отдельных клеток для создать библиотеки клеток с «заменой STR». В некоторых вариантах осуществления способы замены STR по настоящему изобретению включают как добавление полезных STR, так и удаление вредных и/или нейтральных STR. Замены STR могут быть направлены на кодирующие последовательности, некодирующие последовательности, либо на то, и другое.

[00385] В некоторых вариантах осуществления замену SNP и/или STR, используемую для создания библиотеки клеток, мультиплексируют, и множество клеток в клеточной популяции редактируют за один цикл редактирования, т.е. одна автоматизированная операция дает в результате множество изменений в клетках в библиотеке клеток. В других вариантах осуществления замена SNP и/или STR, используемая для создания библиотеки клеток, является рекурсивной и в результате приводит к накоплению множества полезных последовательностей и/или удалению вредных последовательностей в отдельных клетках. Множество изменений могут представлять собой либо конкретный набор определенных изменений, либо частично рандомизированную комбинаторную библиотеку мутаций. Удаление вредных мутаций и накопление полезных мутаций приводят к немедленному улучшению различных клеточных процессов. Удаление генетического бремени или накопление полезных изменений в штамме без генетического бремени также обеспечивает новую надежную отправную точку для дополнительного случайного мутагенеза, который может привести к дальнейшему улучшению.

[00386] Замена SNP преодолевает фундаментальные ограничения подходов случайного мутагенеза, поскольку это подход не случайного, а скорее систематического введения или удаления отдельных мутаций в клетках.

Редактирование сайта сплайсинга

[00387] РНК-сплайсинг представляет собой процесс, в ходе которого интроны вырезаются, а экзоны сплайсируются вместе, создавая мРНК, которая транслируется в белок. Точное распознавание сигналов сплайсинга клеточной машинерией имеет решающее значение для этого процесса. Соответственно, в некоторых аспектах популяцию клеток редактируют с помощью систематического редактирования известных и/или прогнозируемых донорных и/или акцепторных сайтов сплайсинга в различных локусах для создания библиотеки вариантов сайтов сплайсинга различных генов. Такое редактирование может помочь выяснить биологическую значимость различных изоформ генов в контексте клетки. Последовательности для рационального конструирования сайтов сплайсинга различных кодирующих областей, включая фактические или прогнозируемые мутации, связанные с различными нарушениями у млекопитающих, могут быть предсказаны с помощью методов анализа, которые описаны в Nalla and Rogan, Hum Mutat, 25:334-342 (2005); Divina et al., Eur J Hum Genet, 17:759-765 (2009); Desmet, et al., Nucleic Acids Res, 37:e67 (2009); Faber, et al., BMC Bioinformatics, 12 (Suppl 4):S2 (2011).

Замены старт/стоп кодонов и включение аналогов нуклеиновых кислот

[00388] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к созданию библиотек клеток с помощью автоматизированных способов, модулей, инструментов и систем редактирования по изобретению, в которых библиотеки создают путем замены вариантов старт- и стоп-кодонов в геноме организма или выбранном подмножестве кодирующих областей в геноме, например, киноме или секретоме. В клеточной библиотеке отдельные клетки будут иметь один или более старт- или стоп-кодонов, заменяющих нативный старт- или стоп-кодон в одном или более представляющих интерес генах.

[00389] Например, типичными старт-кодонами, используемыми эукариотами, являются ATG(AUG), а прокариоты чаще всего используют ATG(AUG), за которыми следуют GTG(GUG) и TTG(UUG). Клеточная библиотека может включать отдельные клетки, имеющие замены нативных старт-кодонов в одном или более представляющих интерес генах.

[00390] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному создание клеточной библиотеки путем замены старт-кодонов ATG на TTG перед выбранными представляющими интерес генами. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены старт-кодонов ATG на GTG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены старт-кодонов GTG на ATG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены старт-кодонов GTG на TTG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены старт-кодонов TTG на ATG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены старт-кодонов TTG на GTG.

[00391] В других примерах типичными стоп-кодонами для S. cerevisiae и млекопитающих являются TAA(UAA) и TGA(UGA), соответственно. Типичным стоп-кодоном для однодольных растений является TGA(UGA), тогда как насекомые и кишечная палочка обычно используют TAA(UAA) в качестве стоп-кодона (Dalphin. Et al., Nucl. Acids Res., 24: 216-218 (1996). Библиотека клеток может включать отдельные клетки, имеющие замены нативных стоп-кодонов в одном или более представляющих интерес генах.

[00392] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TAA на TAG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TAA на TGA. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TGA на TAA. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TGA на TAG. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TAG на TAA. В других аспектах настоящее изобретение относится к автоматизированному созданию библиотеки клеток путем замены стоп-кодонов TAG на TGA.

Замены и лэддеры терминаторов

[00393] Одним из механизмов идентификации оптимального завершения предварительно сплайсированной мРНК одного или более представляющих интерес генов является создание библиотеки клеток с «заменой терминатора», в которой клетки содержат генетические правки, которые имеют специфические последовательности терминатора, связанные с одним или более представляющими интерес генами. Соответственно, библиотеки клеток, созданные с помощью способов, модулей, инструментов и систем по настоящему изобретению, могут представлять собой библиотеки клеток с заменами терминаторов, которые можно использовать, например, для воздействия на стабильность мРНК путем высвобождения транскриптов из сайтов синтеза. В других вариантах осуществления библиотеку клеток с заменами терминаторов можно использовать для выявления усиления или снижения эффективности терминации транскрипции и, таким образом, накопления несплайсированной пре-мРНК (например, West and Proudfoot, Mol Cell.; 33(3-9); 354-364 (2009) и/или процессинга 3'-конца (например, West, et al., Mol Cell. 29 (5):600-10 (2008)). В случае, когда ген связан с несколькими сайтами терминации правки позволяют редактировать комбинацию правок нескольких терминаторов, связанных с геном. Для определения влияния длины белка на терминаторы к концам белков также могут быть добавлены дополнительные аминокислоты.

[00394] В библиотеках клеток может быть использовано любое заданное количество правок терминаторов, которые были выбраны для лэддера терминаторов на основе наблюдаемого диапазона активности и любого заданного количества генов-мишеней. Лэддер терминаторных последовательностей изменяет экспрессию по меньшей мере одного локуса при по меньшей мере одном условии. Затем такой лэддер систематически применяют к группе генов в организме с помощью автоматизированных методов, модулей, инструментов и систем редактирования по изобретению.

[00395] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к созданию библиотек клеток с помощью автоматизированных способов, модулей, инструментов и систем редактирования по изобретению, где библиотеки создают для редактирования сигналов терминатора в одной или более областях генома в отдельных клетках библиотеки. Терминация транскрипции у эукариот происходит через сигналы терминатора, которые распознаются белковыми факторами, связанными с РНК-полимеразой II. Например, библиотека клеток может содержать отдельные эукариотические клетки с правками в генах, кодирующих фактор специфичности полиаденилирования (CPSF) и фактор стимуляции расщепления (CstF), или в генах, кодирующих белки, рекрутированные факторами CPSF и CstF в сайты терминации. У прокариот терминацию транскрипции опосредуют два основных механизма, называемых Rho-независимой и Rho-зависимой терминацией. Например, библиотека клеток может содержать отдельные прокариотические клетки с правками в генах, кодирующих белки, которые влияют на связывание, эффективность и/или активность этих путей терминации.

[00396] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам отбора терминационных последовательностей («терминаторов») с оптимальными свойствами. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам введения и/или редактирования одного или более терминаторов и/или генерации вариантов одного или более терминаторов в клетке-хозяине, которые имеют определенный диапазон активности. Конкретная комбинация терминаторов может быть сгруппирована в виде лэддера терминаторов, и клеточные библиотеки по настоящему изобретению включают отдельные клетки, которые представляют терминаторы, функционально связанные с одним или более представляющими интерес генами-мишенями на ином идентичном генетическом фоне. Примеры стратегий неавтоматизированного редактирования, которые могут быть модифицированы для использования автоматизированных инструментов, можно найти, например, в патенте США № 9998824, выданном Serber et al. «Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform».

[00397] В конкретных аспектах библиотеку клеток с заменами терминаторов получают путем редактирования набора генов-мишеней, функционально связанных с предварительно выбранным набором терминаторов, которые действуют как «лэддер терминаторов», для экспрессии представляющих интерес генов. Например, клетки отредактированы так, чтобы эндогенный промотор был функционально связан с отдельными представляющими интерес генами, отредактированными с использованием различных промоторов из лэддера промоторов. Если эндогенный промотор отсутствует, или его последовательность неизвестна, или он был ранее каким-то образом изменен, то перед представляющими интерес генами могут быть вставлены отдельные промоторы из лэддера промоторов. Полученные таким образом библиотеки клеток имеют отдельные клетки с индивидуальным промотором из лэддера, который функционально связан с одним или более генами-мишенями в ином идентичном генетическом контексте. Затем определяют связь между исследуемым лэддером терминаторов и данным представляющим интерес геном.

[00398] В более широком смысле, лэддер терминаторов можно использовать для воздействия на терминацию всех или большинства ORF в геноме или на выбранную подгруппу в геноме, например, ORF кинома или секретомы. Набор генов-мишеней также может представлять собой гены, о которых известно или предполагается, что они участвуют в конкретном клеточном пути, например, регуляторном пути или сигнальном пути. Набор генов-мишеней может представлять собой ORF, связанные с функцией, путем соотнесения с ранее продемонстрированными полезными правками (предыдущими заменами промотора или предыдущими заменами SNP), путем выбора алгоритма на основе эпистатических взаимодействий между ранее сгенерированными правками, других критериев отбора на основе гипотез относительно полезного ORF для мишени, или путем случайного отбора. В конкретных вариантах осуществления гены-мишени могут содержать не кодирующие белок гены, включая некодирующие РНК.

[00399] Хотя описаны некоторые варианты осуществления, эти варианты осуществления представлены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Действительно, новые способы, устройства, модули, инструменты и системы, описанные в настоящей заявке, могут быть воплощены во множестве других форм; кроме того, различные опущения, замены и изменения в форме способов, устройств, модулей, инструментов и систем, описанных в настоящей заявке, могут быть сделаны без отклонения от сущности настоящего изобретения. Прилагаемая формула изобретения и ее эквиваленты предназначены для охвата таких форм или модификаций, которые входят в объем и сущность настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования с помощью РНК-направляемой нуклеазы конкретных целевых областей генома клеток (варианты). Инструмент содержит корпус, емкость для приема клеток, емкость для приема нуклеиновых кислот, модуль для выращивания клеток, модуль трансформации, модуль восстановления, модуль направляемого нуклеазой редактирования, процессор и автоматизированную систему подачи жидкости. В первом варианте инструмент содержит емкость для приема нуклеиновых кислот, во втором варианте - модуль сборки нуклеиновых кислот, а в третьем варианте - модуль сборки нуклеиновых кислот и модуль фильтрации. Изобретения обеспечивают введение собранных нуклеиновых кислот и других биологических молекул в живые клетки в автоматическом режиме, при котором отредактированные клетки можно использовать для дальнейших экспериментов. 3 н. и 17. з.п. ф-лы, 36 ил.

1. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования с помощью РНК-направляемой нуклеазы конкретных целевых областей генома клеток, содержащий:

корпус, выполненный с возможностью размещения всех или некоторых модулей;

емкость, выполненную с возможностью приема клеток;

одну или более емкостей, выполненных с возможностью приема нуклеиновых кислот;

модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток;

модуль трансформации, выполненный с возможностью введения нуклеиновых кислот в клетки;

модуль восстановления, выполненный с возможностью восстановления клеток после трансформации клеток в модуле трансформации;

модуль направляемого нуклеазой редактирования, выполненный с возможностью редактирования нуклеиновых кислот в клетках с помощью введенных нуклеиновых кислот;

процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводе данных пользователем и/или выборе пользователем предварительно подготовленного скрипта, и

автоматизированную систему подачи жидкости для перемещения жидкостей непосредственно из одного из: модуля для выращивания, модуля трансформации или модуля направляемого нуклеазой редактирования в другой из: модуля для выращивания, модуля трансформации или модуля направляемого нуклеазой редактирования без вмешательства пользователя.

2. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, в котором нуклеиновые кислоты в одной или более емкостях содержат остов и редактирующую кассету, причем автоматизированное многомодульное устройство для редактирования клеток дополнительно содержит модуль сборки нуклеиновых кислот.

3. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, в котором автоматизированная система подачи жидкости содержит сиппер или дозатор.

4. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.2, в котором модуль сборки нуклеиновых кислот выполнен с возможностью осуществления изотермической сборки нуклеиновых кислот.

5. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, в котором модуль редактирования и модуль восстановления объединены в один модуль.

6. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, дополнительно содержащий модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток.

7. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.6, где в модуле для выращивания измеряется оптическая плотность выращиваемых клеток.

8. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.7, в котором оптическая плотность измеряется непрерывно.

9. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.6, в котором процессор выполнен с возможностью регулирования условий для выращивания в модуле для выращивания таким образом, что клетки достигают целевой оптической плотности в момент времени, запрошенный пользователем.

10. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, в котором емкость, выполненная с возможностью приема клеток, и одна или более емкостей, выполненных с возможностью приема нуклеиновых кислот, содержатся в картридже с реагентами.

11. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.10, в котором некоторые или все реагенты, необходимые для редактирования клеток, содержатся внутри картриджа с реагентами.

12. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.11, в котором реагенты, содержащиеся в картридже с реагентами, обнаруживаются с помощью скрипта, считываемого процессором.

13. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.12, в котором картридж с реагентами включает реагенты и предоставляется в наборе.

14. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, в котором модуль трансформации содержит устройство электропорации.

15. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.14, в котором устройство электропорации представляет собой проточное устройство электропорации.

16. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.1, дополнительно содержащий модуль фильтрации, выполненный с возможностью концентрировать клетки и делать клетки электрокомпетентными.

17. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования с помощью РНК-направляемой нуклеазы конкретных целевых областей генома клеток, содержащий:

корпус, выполненный с возможностью размещения некоторых или всех модулей;

емкость, выполненную с возможностью приема клеток;

по меньшей мере, одну емкость, выполненную с возможностью приема нуклеиновых кислот;

модуль сборки нуклеиновых кислот, выполненный с возможностью сборки остова вектора и редактирующей кассеты, причем модуль сборки нуклеиновых кислот выполнен с возможностью приема и сборки нуклеиновых кислот для облегчения осуществления требуемого события редактирования генома в клетках;

модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток;

модуль трансформации, содержащий электропоратор для введения собранных нуклеиновых кислот в клетки;

модуль направляемого нуклеазой редактирования, выполненный с возможностью редактирования нуклеиновых кислот в клетках с помощью собранных нуклеиновых кислот;

автоматизированную систему подачи жидкости для перемещения жидкостей непосредственно из одного из: модуля сборки нуклеиновых кислот, модуля трансформации или модуля направляемого нуклеазой редактирования в другой из: модуля сборки нуклеиновых кислот, модуля трансформации или модуля направляемого нуклеазой редактирования без вмешательства пользователя; и

процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводе данных пользователем и/или выборе пользователем предварительно подготовленного скрипта.

18. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.17, дополнительно содержащий, по меньшей мере, один картридж с реагентами, содержащий реагенты, для выполнения редактирования клеток в автоматизированном многомодульном инструменте для редактирования клеток.

19. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования клеток по п.18, в котором емкости для клеток и нуклеиновых кислот расположены внутри картриджа с реагентами.

20. Автоматизированный многомодульный инструмент для редактирования с помощью РНК-направляемой нуклеазы конкретных целевых областей генома клеток, содержащий:

корпус, выполненный с возможностью размещения некоторых или всех модулей;

емкость, выполненную с возможностью приема клеток;

по меньшей мере, одну емкость, выполненную с возможностью приема нуклеиновых кислот;

модуль сборки нуклеиновых кислот, выполненный с возможностью а) сборки остова и редактирующей кассеты и b) обессоливания собранных нуклеиновых кислот после сборки;

модуль для выращивания, выполненный с возможностью выращивания клеток;

модуль фильтрации, выполненный с возможностью концентрировать клетки и делать клетки электрокомпетентными;

модуль трансформации, содержащий проточный электропоратор для введения собранных нуклеиновых кислот в клетки;

комбинированный модуль восстановления и направляемого нуклеазой редактирования, выполненный с возможностью восстановления клеток после электропорации в модуле трансформации и редактирования клеток с помощью нуклеиновых кислот;

автоматизированную систему подачи жидкости для перемещения жидкостей непосредственно из одного из модуля для выращивания, модуля фильтрации, модуля трансформации или комбинированного модуля восстановления и направляемого нуклеазой редактирования, в другой из: модуля для выращивания, модуля фильтрации, модуля трансформации или комбинированного модуля восстановления и направляемого нуклеазой редактирования, без вмешательства пользователя; и

процессор, выполненный с возможностью обеспечения работы автоматизированного многомодульного инструмента для редактирования клеток, основываясь на вводе данных пользователем.