МУТЕИНЫ ЛИПОКАЛИНА 2 ЧЕЛОВЕКА С АФФИННОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ГЛИПИКАНА-3 (GPC3) Российский патент 2021 года по МПК C07K14/47 C12P21/02 A61K38/00 A61P35/00 

I. Уровень техники

[0001] Глипикан-3 (GPC3) представляет собой онкоэмбриональный антиген, который относится к семейству глипиканов, относящемуся к гликозил-фосфатидилинозитол-заякоренным гепарансульфат-протеогликанам. Глипиканы характеризуются ковалентной связью со сложными полисахаридными цепями, называемыми гепарансульфат-гликозаминогликанами. Глипиканы вовлечены в сигнальную систему клетки на границе клеточного-внеклеточного матрикса. (Sasisekharan et al., Nat. Rev. Cancer 2:521-528 (2002). На сегодняшний день было идентифицировано шесть различных членов семейства глипиканов человека. Связанный с мембраной клетки GPC3 состоит из двух субъединиц, соединенных одной или более дисульфидными связями.

[0002] GPC3 экспрессируется в эмбриональной печени и плаценте в ходе развития и является подавленным или выключенным в нормальных зрелых тканях. Мутации и деплеции в гене GPC3 обуславливают синдром Симпсона-Голаби-Бемеля или дисморфии Симпсона у людей. GPC3 экспрессируется при различных формах рака и, в частности, при гепатоклеточной карциноме («HCC»), меланоме, опухоли Вильма и гепатобластоме. (Jakubovic and Jothy, Ex. MoI. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).

[0003] HCC является третьей основной причиной смертей, связанных с раком, по всему миру. Каждый год HCC приводит к приблизительно 1 миллиону смертей. (Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005). Вирус гепатита B, вирус гепатита C и хроническое злоупотребление алкоголем, приводящие к циррозу печени, остаются наиболее распространенными причинами HCC. Частота возникновения HCC значительно возросла в Соединенных Штатах отчасти из-за распространения вируса гепатита C. HCC лечат в основном с помощью трансплантации печени или резекции опухоли. Прогноз пациента зависит как от основной функции печени, так и от стадии, на которой диагностируется опухоль. (Parikh and Hyman, Am J Med. 120(3):194-202 (2007). Необходимы эффективные стратегии для лечения HCC и других опухолей, экспрессирующих GPC3. Поэтому было бы желательно иметь доступные средства и способы для целенаправленного воздействия на GPC3, предпочтительно GPC3, экспрессированные на опухолевых клетках.

[0004] В международной заявке на патент № PCT/EP 2011/070119 раскрыты мутеины липокалина, полученные из липокалина 2 человека (также называемого ассоциированным с желатиназой нейтрофилов липокалином человека (hNGAL), которые способны связывать GPC3. Однако настоящее раскрытие предусматривает дополнительные GPC3-связывающие белки, характеризующиеся улучшенными свойствами, присущими этим белкам.

II. Описание графических материалов

[0005] На фигуре 1 показано связывание выбранных оптимизированных GPC3-специфических мутеинов липокалина (SEQ ID NO: 7, 9 и 10) на клетках SK-HEP-1, трансфицированных GPC3 человека, как измерено в анализе на основе MSD. Оптимизированные клоны связывают GPC3-положительные клетки при значениях EC50 от субнаномолярных до низких наномолярных, при этом значительное связывание отрицательного контроля липокалина (SEQ ID NO: 2) не наблюдается. Схожее связывание наблюдается с клетками SK-HEP-1, трансфицированными GPC3 мыши или яванского макака, тогда как мутеины липокалина не связывают контрольные клетки (SK-HEP-1::вектор).

III. Подробное описание раскрытия

[0006] Один вариант осуществления настоящего раскрытия относится к мутеину липокалина, который способен связывать GPC3 человека с аффинностью, измеренной посредством K_D, составляющей приблизительно 1 нМ или ниже. Более предпочтительно мутеин может характеризоваться аффинностью, измеренной посредством K_D, составляющей приблизительно 1 нМ или приблизительно 0,2 нМ или ниже. В другом варианте осуществления мутеин способен конкурировать за связывание с GPC3 человека в анализе связывания клетки, таком как анализ, описанный, по сути, в примере 5, предпочтительно при значении EC50, составляющем приблизительно 25 нМ, 10 нМ или 3 нМ или ниже.

[0007] В другом варианте осуществления настоящее раскрытие относится к мутеину липокалина, где указанный мутеин содержит в одном или более положениях, соответствующих положению 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 1), замену, предпочтительно замену, описанную в данном документе.

[0008] В конкретных вариантах осуществления мутеин по настоящему раскрытию содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или даже больше, например, 21, 22, 23, 24, 25 или 26, замен в положении последовательности, соответствующем положению 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).

[0009] В дополнительных конкретных вариантах осуществления мутеин липокалина согласно настоящему раскрытию содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-16. В другом варианте осуществления мутеин характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью с последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1). Предпочтительно указанный мутеин содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или даже больше, например, 21, 22, 23, 24, 25 или 26, подвергнутых мутации аминокислотных остатков в положениях 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1).

[0010] В некоторых дополнительных вариантах осуществления для облегчения экспрессии в эукариотических клетках природный сайт N-гликозилирования, Asn, в положении 65 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) удаляют в соответствующем положении последовательности мутеина липокалина согласно настоящему раскрытию, например, посредством мутации с Asn на Asp в положении 65. Кроме того, предпочтительно, чтобы сайты N-гликозилирования (Asn-X-Ser/Thr) не существовали на мутеине липокалина согласно настоящему раскрытию.

[0011] В некоторых других вариантах осуществления мутеин липокалина согласно настоящему раскрытию не содержит мутацию в положении последовательности, соответствующем положению 28 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1), например, для того, чтобы дополнительно оптимизировать стабильность.

[0012] В другом варианте осуществления мутеин по настоящему раскрытию конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из органической молекулы, ферментной метки, радиоактивной метки, цветной метки, флуоресцентной метки, хромогенной метки, люминесцентной метки, гаптена, дигоксигенина, биотина, цитотоксического средства, токсина, металлокомплекса, металла и коллоидного золота. Мутеин может быть слитым на его N-конце и/или его C-конце с партнером по слиянию, который представляет собой белок, белковый домен или пептид.

[0013] В другом варианте осуществления мутеин конъюгирован с соединением, которое продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови. Более предпочтительно мутеин конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, гидроксиэтилкрахмала, Fc-части иммуноглобулина, домена CH3 иммуноглобулина, домена CH4 иммуноглобулина, альбумин-связывающего пептида и альбумин-связывающего белка.

[0014] В другом варианте осуществления мутеин по настоящему раскрытию является антагонистом GPC3.

[0015] В другом варианте осуществления настоящее раскрытие относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую мутеин по настоящему изобретению.

[0016] В еще одном варианте осуществления настоящее раскрытие охватывает клетку-хозяина, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты.

[0017] Настоящее раскрытие также включает способ лечения опухоли, предпочтительно опухоли или меланомы печени, при этом способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей мутеин, описанный в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом.

[0018] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к новым специфически связывающим белкам, направленным против или специфическим в отношении GPC3. Белки по настоящему раскрытию можно применять для терапевтических и/или диагностических целей. Белок по настоящему раскрытию включает, в частности, мутеин hNGAL, описанный в данном документе. Как используется в данном документе, белок по настоящему раскрытию «специфически связывает» мишень (в данном случае GPC3), если он способен отличать эту мишень от одной или более эталонных мишеней, поскольку специфичность связывания является не абсолютным, а относительным свойством. «Специфическое связывание» можно определять, например, в соответствии с вестерн-блоттингами, анализами ELISA, RIA, ECL, IRMA, FACS, IHC и пептидными сканированиями.

[0019] Аналогично этому, в другом аспекте настоящее раскрытие относится к мутеину hNGAL, где указанный мутеин содержит в одном или более положениях, соответствующих положению 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и/или 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1), замену, предпочтительно замену, описанную в данном документе.

[0020] В альтернативном аспекте настоящее раскрытие относится к полипептиду, содержащему мутеин hNGAL, где мутеин hNGAL содержит в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или даже больше, например, в 21, 22, 23, 24, 25 или 26, аминокислотных положениях, соответствующих положениям 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1), замену, предпочтительно замену, описанную в данном документе.

[0021] Подобным образом настоящее раскрытие относится к мутеину липокалина, полученному из hNGAL, имеющему участок с супервторичной структурой, представляющей собой цилиндрический β-складчатый лист, содержащий восемь β-нитей, соединенных попарно четырьмя петлями на одном конце с образованием, таким образом, связывающего кармана, где по меньшей мере одна аминокислота из каждой по меньшей мере из трех из указанных четырех петель была подвергнута мутации и где указанный липокалин эффективен для связывания GPC3, неприродной мишени, с выявляемой аффинностью. Преимущественно мутеин липокалина содержит в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных положениях, соответствующих аминокислоте в положении 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 1), замену, предпочтительно замену, описанную в данном документе.

[0022] Настоящее раскрытие также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим эти белки.

[0023] Термин «положение» при использовании в соответствии с настоящим раскрытием означает либо положение аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в данном документе, либо положение нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. Термин «соответствующий», используемый в данном документе, также предусматривает, что положение определено не только номером предыдущих нуклеотидов/аминокислот. Соответственно, положение данной аминокислоты в соответствии с настоящим раскрытием, которая может быть замещена, может варьировать вследствие делеции или добавления аминокислот в любом месте в (мутантном или дикого типа) липокалине. Подобным образом положение данного нуклеотида в соответствии с настоящим раскрытием, который может быть замещен, может варьировать вследствие делеции или дополнительных нуклеотидов в любом месте в мутеине или 5’-нетранслируемом участке (UTR) липокалина дикого типа, в том числе промоторе и/или любых других регуляторных последовательностях или гене (в том числе экзонах и интронах).

[0024] Таким образом, под «соответствующим положением» в соответствии с настоящим раскрытием предпочтительно понимают, что нуклеотиды/аминокислоты могут отличаться по обозначенным номерам, но могут все еще иметь схожие соседние нуклеотиды/аминокислоты. Указанные нуклеотиды/аминокислоты, которые могут быть обменены, удалены или добавлены, также предусматриваются термином «соответствующее положение».

[0025] В частности, для того, чтобы определить соответствует ли нуклеотидный остаток или аминокислотный остаток аминокислотной последовательности липокалина, отличного от мутеина липокалина hNGAL по настоящему раскрытию, определенному положению в нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности мутеина липокалина hNGAL, описанной, в частности, в любом SEQ ID NO: 5-16, или имеющему одну или более аминокислотных замен в положении 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности NGAL (SEQ ID NO: 1), специалист в данной области может применять средства и способы, хорошо известные из уровня техники, например выравнивания либо вручную, либо с использованием компьютерных программ, таких как BLAST2.0, которая означает средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любая другая подходящая программа, которая подходит для создания выравниваний последовательностей. Соответственно, мутеин по любому из SEQ ID NO: 1-8 или имеющий одну или более аминокислотных замен в положении 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 1), может служить в качестве «последовательности для сравнения», тогда как аминокислотная последовательность липокалина, отличного от hNGAL, служит в качестве «искомой последовательности».

[0026] С учетом вышеизложенного, специалист в данной области, таким образом, может легко определить, какое аминокислотное положение, подвергнутое мутации в hNGAL, описанном в данном документе, соответствует аминокислоте остова, отличного от hNGAL. В частности, специалист в данной области может выровнять аминокислотную последовательность мутеина, описанного в данном документе, в частности мутеина hNGAL по настоящему раскрытию с аминокислотной последовательностью отличного мутеина для определения, какая(-ие) аминокислота(-ы) указанного мутеина соответствует(-ют) соответствующей(-им) аминокислоте(-ам) аминокислотной последовательности указанного отличного липокалина. Более конкретно, специалист в данной области может, таким образом, определить, какая аминокислота аминокислотной последовательности указанного отличного липокалина соответствует аминокислоте в положении(-ях) 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 1).

[0027] Белки по настоящему раскрытию, которые направлены против или специфические в отношении GPC3, включают любое количество специфически связывающих белков-мутеинов, в которых за основу взят остов определенного белка. Как используется в данном документе, «мутеин», «подвергнутый мутации» объект (либо белок, либо нуклеиновая кислота) или «мутант» относится к обмену, делеции или вставке соответственно одного или более из нуклеотидов или аминокислот по сравнению со встречающимся в природе (дикого типа) «эталонным» остовом нуклеиновой кислоты или белка. Предпочтительно количество нуклеотидов или аминокислот соответственно, которое обменивают, удаляют или вставляют, составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже больше, например, 21, 22, 23, 24, 25 и 26. Однако предпочтительно, чтобы мутеин по настоящему раскрытию все еще был способен к связыванию GPC3.

[0028] Как используется в данном документе, «липокалин» определяется как мономерный белок весом примерно 18-20 кДа, имеющий участок с супервторичной структурой, представляющей собой b-складчатый лист, содержащий множество (предпочтительно восемь) b-нитей, соединенных попарно множеством (предпочтительно четырьмя) петель на одном конце с образованием, таким образом, связывающего кармана. Именно разнообразие петель в остальном жестком остове липокаина приводит к образованию разнообразия различных видов связывания среди представителей семейства липокалинов, при этом каждый способен приспосабливаться к мишеням различного размера, формы и с различными химическими особенностями. (См., например, Flower DR., The lipocalin protein family: structure and function, Biochem J. 318:1-14 (1996); Flower DR., er al., The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim. Biophys. Acta 1482:9-24 (2000); Skerra, A. Biochim. Biophys. Acta 1482:337-350 (2000). Действительно, семейство липокалинов белков естественным образом развивалось для связывания широкого спектра лигандов, характеризуясь необычайно низкими уровнями общей консервативности последовательностей (часто с идентичностями последовательностей менее 20%), но все же сохраняя высоко-консервативный общий паттерн сворачивания. Соответствие между положениями в разных липокалинах хорошо известно специалисту в данной области. См., например, патент США № 7250297.

[0029] В предпочтительном варианте осуществления белок по настоящему раскрытию представляет собой мутеин липокалина 2 (Lcn 2; также известного как ассоциированный с желатиназой нейтрофилов липокалин человека, hNGAL, или как сидерокалин). Термины «ассоциированный с желатиназой нейтрофилов липокалин человека», «hNGAL», «зрелый hNGAL», «липокалин 2», «липокалин 2 человека», «зрелый липокалин 2 человека» и «Lcn2» используются взаимозаменяемо и относятся к зрелому hNGAL с номером доступа базы данных SWISS-PROT/UniProt P80188 (изоформа 1). Аминокислотная последовательность, показанная под номером доступа базы данных SWISS-PROT/UniProt P80188, является предпочтительной в качестве «эталонной последовательности».

[0030] Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность, показанная под SEQ ID NO: 1, является предпочтительной в качестве «эталонной последовательности». На SEQ ID NO: 1 показан зрелый hNGAL. Термины «эталонная последовательность» и «последовательность дикого типа» используют в данном документе взаимозаменяемо. Зрелая форма этого белка имеет аминокислоты 21-198 полной последовательности, поскольку сигнальный пептид аминокислот 1-20 (MPLGLLWLGL ALLGALHAQA) является отщепленным. Этот белок дополнительно имеет дисульфидную связь, образованную между аминокислотными остатками в положениях 76 и 175 зрелого белка.

[0031] Мутеин по настоящему раскрытию может включать аминокислотную последовательность дикого типа (природную) «исходного» остова белка (такого как липокалин) за пределами подвергнутых мутации положений аминокислотной последовательности; в качестве альтернативы мутеин hNGAL может также содержать аминокислотные мутации за пределами положений последовательности, подвергнутых мутагенезу, которые не мешают активности связывания и сворачиванию мутеина. Такие мутации могут быть выполнены на уровне ДНК с использованием установленных стандартных способов (Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001). Возможные изменения аминокислотной последовательности представляют собой вставки или делеции, а также аминокислотные замены.

[0032] Такие замены могут быть консервативными, т.е. аминокислотный остаток замещают подобным по химическим свойствам аминокислотным остатком. Примеры консервативных замен представляют собой замещения из числа представителей следующих групп: 1) аланин, серин и треонин; 2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; 3) аспарагин и глутамин; 4) аргинин и лизин; 5) изолейцин, лейцин, метионин и валин и 6) фенилаланин, тирозин и триптофан. С другой стороны, в аминокислотную последовательность также возможно вводить неконсервативные изменения. Кроме того, вместо замещения отдельных аминокислотных остатков также возможно либо вставлять, либо удалять одну или более смежных аминокислот первичной структуры исходного остова белка, где эти делеции или вставка приводят в результате к стабильно свернутому/функциональному мутеину, что может легко проверить специалист в данной области.

[0033] Специалисту в данной области будут понятны способы, пригодные для получения белков-мутеинов, предполагаемых настоящим раскрытием, но чьи последовательности белков или нуклеиновых кислот явным образом не раскрыты в данном документе. В качестве обзора такие модификации аминокислотной последовательности включают, например, направленный мутагенез отдельных аминокислотных положений для упрощения субклонирования подвергнутого мутации гена липокалина или его частей путем введения сайтов расщепления для определенных рестрикционных ферментов. Кроме того, эти мутации также можно вводить для дополнительного улучшения аффинности мутеина липокалина в отношении данной мишени. Кроме того, мутации можно вводить для модулирования определенных характеристик мутеина, например, для улучшения стабильности сворачивания, стабильности в сыворотке крови, устойчивости белка или растворимости в воде или для снижения склонности к агрегации, при необходимости. Например, встречающиеся в природе остатки цистеина можно подвергать мутации в другие аминокислоты для предупреждения образования дисульфидного мостика.

[0034] Соответственно, настоящее раскрытие также включает функциональные варианты белков, раскрытых в данном документе, которые имеют пороговое значение идентичности последовательности или гомологии последовательности с эталонным белком. Под «идентичностью» или «идентичностью последовательности» понимают свойство последовательностей, с помощью которого определяют их сходство или родство. Термин «идентичность последовательности» или «идентичность», используемый в настоящем раскрытии, означает процентную долю попарно идентичных остатков - последующее (гомологичное) выравнивание последовательности полипептида по настоящему раскрытию с последовательностью запроса - относительно количества остатков в более длинной из этих двух последовательностей. Процентную идентичность определяют посредством деления количества идентичных остатков на общее количество остатков и умножения полученного результата на 100. Термин «гомология» используют в данном документе в его общепринятом значении, и он включает идентичные аминокислоты, а также аминокислоты, которые рассматриваются как консервативные замены (например, обмен остатка глутамата на остаток аспартата) в аналогичных положениях в линейной аминокислотной последовательности двух белков.

[0035] Процентную долю гомологии последовательностей или идентичности последовательностей, например, можно определять в данном документе с использованием программы BLASTP, версии blastp 2.2.5 (от 16 ноября 2002 года). Cм. Altschul, S. F. et al. Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402(1997). В данному варианте осуществления процентная доля гомологии основана на выравнивании целых полипептидных последовательностей (матрица: BLOSUM 62; штрафы за гэпы: 11,1; пороговое значение устанавливали как 10^-3), в том числе последовательностей пропептидов, предпочтительно с использованием остова белка дикого типа в качестве эталона в сравнительном анализе пар. Ее рассчитывают как процентную долю количества «положительных» (гомологичных аминокислот), указанных в качестве итога в результате программы BLASTP, разделенных на общее количество аминокислот, выбранных программой для выравнивания.

[0036] Также возможно преднамеренно мутировать другие аминокислотные положения последовательности в цистеин для введения новых реактивных групп, например для конъюгации с другими соединениями, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), биотин, пептиды или белки, или для образования не встречающихся в природе дисульфидных связей. В отношении мутеина липокалина 2 человека иллюстративными возможностями такой мутации являются введение остатка цистеина в аминокислотную последовательность липокалина, в том числе мутеина липокалина 2 человека, включение введения остатка цистеина (Cys) по меньшей мере в одно из положений последовательности, которое соответствует положениям 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 последовательности в последовательности дикого типа NGAL. В некоторых вариантах осуществления, где мутеин липокалина 2 человека по настоящему раскрытию характеризуется последовательностью, в которой по сравнению с последовательностью с номером доступа базы данных SWISS-PROT/UniProt P80188 цистеин был замещен другим аминокислотным остатком, соответствующий цистеин может быть повторно введен в последовательность. В качестве иллюстративного примера остаток цистеина в аминокислотном положении 87 может быть введен в таком случае путем возвращения цистеина, который первоначально присутствует в последовательности под номером доступа SWISS-PROT P80188. Полученный тиоловый фрагмент сбоку любого из аминокислотных положений 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 и/или 158 можно использовать для ПЭГилирования или ГЭКилирования мутеина, например, для увеличения времени полужизни соответствующего мутеина липокалина 2 человека в сыворотке крови.

[0037] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления мутеин согласно настоящему раскрытию связывает GPC3 человека или мыши с K_D, составляющей приблизительно 1 нМ или меньше, в том числе 0,5 нМ или меньше, 0,3 нМ или меньше и или 0,2 нМ или меньше. Мутеин по настоящему раскрытию может специфически связывать один или более смежных, несмежных или конформационных эпитопов зрелой свернутой биологически активной формы GPC3.

[0038] Аффинность связывания белка по настоящему раскрытию (например, мутеина липокалина) с выбранной мишенью (в данном случае GPC3) можно измерить (и, таким образом, определить значения K_D комплекса мутеин-лиганд) с помощью большого количества способов, известных специалисту в данной области. Такие способы включают без ограничения флуоресцентное титрование, конкурентный ELISA, калориметрические способы, такие как изотермическая титрационная калориметрия (ITC) и поверхностный плазмонный резонанс (BIAcore). Такие способы являются традиционными в уровне техники, и их примеры также подробно описаны ниже.

[0039] Аминокислотная последовательность мутеина по настоящему раскрытию может характеризоваться высокой идентичностью последовательности со зрелым липокалином 2 человека. В данном случае белок по настоящему раскрытию может характеризоваться по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90% идентичностью, в том числе по меньшей мере 95% идентичностью с белком, выбранным из группы, состоящей из последовательности под SEQ ID NO: 1, причем такой мутеин аминокислотной последовательности выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-16.

[0040] Настоящее раскрытие также включает структурные гомологи белков, выбранных из группы, состоящей из последовательностей под SEQ ID NO: 5-16, которые характеризуются гомологией аминокислотной последовательности или идентичностью последовательностей более чем приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более 95% относительно его.

[0041] Термины «глипикан-3», «протеогликан глипикан-3», «GPC3», «OTTHUMP00000062492», «GTR2-2», «SGB», «DGSX», «SDYS», «SGBS», «OCI-5» и «SGBSl» используют взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы и виды, гомологичные глипикану-3 человека. Полная аминокислотная последовательность иллюстративного глипикана-3 человека имеет номер доступа в Genbank/NCBI NM_004484.

[0042] В соответствии с вышеизложенным мутеин по настоящему раскрытию предпочтительно действует как антагонист GPC3. В некоторых вариантах осуществления мутеин по настоящему раскрытию может действовать как антагонист GPC3 посредством ингибирования способности молекулы GPC3 связываться или иным образом взаимодействовать с ее когнатным лигандом.

[0043] В еще одном аспекте настоящее раскрытие включает мутеины липокалина 2 человека, которые специфически связывают GPC3. В этом смысле GPC3 может быть рассмотрен как неприродный лиганд липокалина 2 человека дикого типа, где «неприродный лиганд» относится к соединению, которое не связывается с липокалином 2 человека в физиологических условиях. С помощью внесения в липокалины дикого типа, такие как липокалин 2 человека, мутаций в определенные положения авторы настоящего изобретения показали, что возможны высокая аффинность и высокая специфичность в отношении неприродного лиганда. В одном аспекте по меньшей мере в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и/или 20 нуклеотидных триплетах, кодирующих любые положения последовательности 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина 2 человека (SEQ ID NO: 1), случайный мутагенез можно выполнять посредством обеспечения замены в этих положениях подмножеством нуклеотидных триплетов.

[0044] К тому же, липокалины можно применять для создания мутеинов, которые имеют подвергнутый мутации аминокислотный остаток в любом одном или более, в том числе по меньшей мере в любых двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, шестнадцати, семнадцати, восемнадцати, девятнадцати или двадцати, положениях последовательности, соответствующих положениям 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина 2 человека (SEQ ID NO: 1).

[0045] Замена в положении 36 последовательности может, например, представлять собой замену Leu 36 → Val или Arg. Замена в положении 40 последовательности может, например, представлять собой замену Ala 40 → Leu, Val или Gly. Замена в положении 41 последовательности может, например, представлять собой замену Ile 41 → Leu, Arg, Met, Gly или Ala. Замена в положении 49 последовательности может, например, представлять собой замену Gln 49 → Pro или Leu. Замена в положении 52 последовательности может, например, представлять собой замену Tyr 52 → Arg или Trp. Замена в положении 68 последовательности может, например, представлять собой замену Asn 65 → Asp. Замена в положении 68 последовательности может, например, представлять собой замену Ser 68 → Val, Gly, Asn или Ala. Замена в положении 70 последовательности может, например, представлять собой замену Leu 70 → Arg, Ser, Ala или Val. Замена в положении 72 последовательности может, например, представлять собой замену Arg 72 → Asp, Trp, Ala или Gly. Замена в положении 73 последовательности может, например, представлять собой замену Lys 73 → Gly, Arg, Asn, Glu или Ser. Замена в положении 76 последовательности может, например, представлять собой замену Cys 76 → Val или Ile. Замена в положении 77 последовательности может, например, представлять собой замену Asp 77 → His, Met, Val, Leu, Thr или Lys. Замена в положении 79 последовательности может, например, представлять собой замену Trp 79 → Lys, Ser или Thr. Замена в положении 81 последовательности может, например, представлять собой замену Arg 81 → Gly. Замена в положении 81 последовательности может, например, представлять собой замену Cys 87 → Ser. Замена в положении 96 последовательности может, например, представлять собой замену Asn 96 → Arg, Asp, Gln или Pro. Замена в положении 100 последовательности может, например, представлять собой замену Tyr 100 → Gly, Glu, Pro или Gln. Замена в положении 103 последовательности может, например, представлять собой замену Leu 103 → Glu, Gln, Asn, Gly, Ser или Tyr. Замена в положении 106 последовательности может, например, представлять собой замену Ser 105 → Ala. Замена в положении 106 последовательности может, например, представлять собой замену Tyr 106 → Asn, Ser или Thr. Замена в положении 125 последовательности может, например, представлять собой замену Lys 125 → Glu. Замена в положении 127 последовательности может, например, представлять собой замену Ser 127 → Arg или Tyr. Замена в положении 132 последовательности может, например, представлять собой замену Tyr 132 → Trp или Ile. Замена в положении 134 последовательности может, например, представлять собой замену Lys 134 → Ala или Phe. Замена в положении 134 последовательности может, например, представлять собой замену Thr 136 → Ile. Замена в положении 175 последовательности может, например, представлять собой замену Cys 175 → Ala. Следует отметить, что любые из аминокислот, которые замещают соответствующую аминокислоту в эталонной последовательности, можно заменить соответствующей консервативной аминокислотой. В частности, консервативные замещения представляют собой замещения из числа представителей следующих групп: 1) аланин, серин и треонин; 2) аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; 3) аспарагин и глутамин; 4) аргинин и лизин; 5) изолейцин, лейцин, метионин и валин и 6) фенилаланин, тирозин и триптофан.

[0046] В одном варианте осуществления мутеин по настоящему раскрытию, который связывается с GPC3, включает следующие аминокислотные замещения:

(a) Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Ala;

(b) Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe;

(c) Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp; Lys 134 → Phe;

(d) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(e) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(f) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(g) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(h) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41 → Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile;

(i) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe;

(j) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Cys 76 → Val; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Thr; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Cys 175 → Ala;

(k) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala или

(l) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile; Cys 175 → Ala.

[0047] Нумерация предпочтительно связана с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1). Соответственно, с учетом идеи настоящего раскрытия специалист в данной области может легко определить, какие аминокислоты в предпочтительной эталонной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1) соответствуют описанным выше в (a)-(l); таким образом, чтобы подвергнуть мутации указанные аминокислоты в эталонной последовательности.

[0048] В некоторых конкретных вариантах осуществления мутеин согласно настоящему раскрытию связывается с GPC3 человека или мыши с более сильной аффинностью связывания, чем мутеин под SEQ ID NO: 3 и/или мутеин под SEQ ID NO: 4, например, такой мутеин может характеризоваться более низким значением K_D, чем мутеин под SEQ ID NO: 3 или 4 при измерении с помощью анализа с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR), описанного, по сути, в примере 4.

[0049] В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин согласно настоящему раскрытию характеризуется улучшенным значением EC50 по сравнению с мутеином под SEQ ID NO: 3 и/или мутеин под SEQ ID NO: 4, например, такой мутеин характеризуется более низким значением в нМ, чем мутеин под SEQ ID NO: 3 или 4 при измерении с помощью анализа с использованием клеток SK-HEP-1, трансфицированных GPC3 человека, мыши или яванского макака, по сути описанного в примере 5.

[0050] В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин по настоящему раскрытию является более биофизически стабильным, чем мутеин под SEQ ID NO: 3 и/или мутеин под SEQ ID NO: 4, например, когда такой мутеин может характеризоваться повышенной температурой плавления по сравнению с мутеином под SEQ ID NO: 3 или 4, измеренной посредством флуоресцентного анализа термической денатурации, описанного, по сути, в примере 6.

[0051] Следует также отметить, что на образование комплекса между соответствующим мутеином и его лигандом влияет много различных факторов, таких как концентрации соответствующих партнеров по связыванию, наличие конкурентов, pH и ионная сила используемой буферной системы и экспериментальный способ, используемый для определения константы диссоциации K_D (например, флуоресцентное титрование, конкурентный ELISA или поверхностный плазмонный резонанс к примеру), или даже математический алгоритм, который используют для оценки экспериментальных данных.

[0052] Следовательно, также очевидно специалисту в данной области, что значения K_D (константа диссоциации комплекса, образованного между соответствующим мутеином и его мишенью/лигандом) могут варьировать в пределах определенного экспериментального диапазона в зависимости от способа и экспериментальной установки, которую используют для определения аффинности конкретного мутеина липокалина в отношении данного лиганда. Это значит, что может иметь место незначительное отклонение в измеренных значениях K_D или диапазоне допусков, зависящее, например, от того, было ли значение K_D определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса (Biacore), с помощью конкурентного ELISA или с помощью «прямого ELISA».

[0053] В одном варианте осуществления мутеины, раскрытые в данном документе, могут быть соединены, либо N-, либо C-концом с партнером по слиянию, который предпочтительно представляет собой белок или белковый домен или пептид. Примерами партнеров по слиянию является аффинная метка, такая как пентагистидиновая метка, гексагистидиновая метка или стрептавидиновая метка (например, Streptag^®). Таким образом, настоящая заявка охватывает также все явно и в общем описанные мутеины, снабженные такими метками.

[0054] Термин «фрагмент», используемый в настоящем раскрытии применимо к особенности фрагмента мутеина липокалина, относится к белкам или пептидам, полученным из полноразмерного зрелого Lcn 2, которые укорочены с N-конца и/или C-конца, т.е. у них отсутствует по меньшей мере одна из N-концевых и/или C-концевых аминокислот. Такие фрагменты включают предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно 20, наиболее предпочтительно 30 или более последовательных аминокислот первичной последовательности зрелого Lcn 2 и обычно являются выявляемыми при иммуноанализе зрелого Lcn 2. Слово «выявлять» или «выявляющий», используемое в данном документе, понимается как на количественном, так и на качественном уровне, а также их комбинации. Таким образом, это включает количественные, полуколичественные и качественные измерения представляющей интерес молекулы. Соответственно, можно определить присутствие или отсутствие молекулы, такой как GPC3, например, в образце, а также ее концентрацию или уровень.

[0055] В объем настоящего раскрытия также включены вышеуказанные мутеины, которые были изменены в отношении их иммуногенности для уменьшения любой обнаруженной иммуногенности путем применения способов, известных специалисту в данной области.

[0056] Цитотоксические T-клетки распознают пептидные антигены на клеточной поверхности антиген-презентирующей клетки совместно с молекулой главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I. Способность пептидов связываться с молекулами MHC является аллельспецифической и коррелирует с их иммуногенностью. Для снижения иммуногенности данного белка большое значение имеет способность предсказать, какие пептиды в белке имеют большой потенциал связывания с данной молекулой MHC. Подходы, которые применяют вычислительный подход протягивания для идентификации потенциальных эпитопов T-клетки, были ранее описаны для предсказания связывания данной пептидной последовательности с молекулами MHC класса I. (Altuvia et al., J. Mol. Biol. 249:244-250 (1995). Такой подход можно также применять для идентификации потенциальных эпитопов T-клетки в мутеинах по настоящему раскрытию и для того, чтобы в зависимости от его предполагаемого использования выбрать конкретный мутеин на основе его прогнозируемой иммуногенности. Кроме того, участки пептида, которые, как было предсказано, содержат эпитопы T-клетки, можно подвергнуть дополнительному мутагенезу для уменьшения или устранения этих эпитопов T-клетки и, таким образом, сведения к минимуму иммуногенности. Было описано удаление амфипатических эпитопов из генетически сконструированных антител (Mateo et al., Hybridoma 19(6):463-471 (2000), и оно может быть адаптировано для мутеинов по настоящему раскрытию. Мутеины, полученные таким образом, могут характеризоваться сведенной к минимуму иммуногенностью, которая является желаемой для их применения в терапевтических и диагностических применениях, таких как описаны ниже.

[0057] Для некоторых применений пригодным также является применение мутеинов по настоящему раскрытию в конъюгированной форме. Конъюгирование можно осуществить с применением любого общепринятого способа сочетания, известного из уровня техники.

[0058] Термин «органическая молекула» или «малая органическая молекула», используемый в данном документе в отношении неприродной мишени, означает органическую молекулу, содержащую по меньшей мере два атома углерода, предпочтительно не более 7 или 12 вращающихся углеродных связей с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 2000 дальтон, предпочтительно от 100 до 1000 дальтон, и необязательно включающую один или два атома металла.

[0059] В целом, возможно метить мутеин липокалина, описанный в данном документе, любым соответствующим химическим веществом или ферментом, которые непосредственно или опосредованно образуют выявляемое соединение или сигнал при химической, физической, оптической или ферментативной реакции. Примером физической реакции и в то же время оптической реакции/маркера является испускание флуоресценции при облучении. Щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена или β-галактозидаза являются примерами ферментных меток (и в то же время оптических меток), которые катализируют образование продуктов хромогенной реакции. В целом все метки, широко используемые для антител (за исключением тех, которые используют только с сахарным фрагментом в Fc-части иммуноглобулинов), также можно использовать для конъюгации с мутеинами по настоящему раскрытию. Мутеины по настоящему раскрытию можно также конъюгировать с любым подходящим терапевтически активным средством, например, для направленной доставки таких средств к данной клетке, ткани или органу или для селективного целенаправленного воздействия на клетки, например опухолевые клетки без воздействия на окружающие нормальные клетки. Примеры таких терапевтически активных средств включают радионуклиды, токсины, малые органические молекулы и терапевтические пептиды (такие как пептиды, действующие в качестве агонистов/антагонистов рецептора клеточной поверхности, или пептиды, конкурирующие за сайт связывания белка на данной мишени, представляющей собой клетку). Примеры подходящих токсинов включают без ограничения коклюшный токсин, дифтерийный токсин, рицин, сапорин, экзотоксин синегнойной палочки, калихимицин или его производное, таксоид, майтанзиноид, тубулизин или аналог доластатина. Аналог доластатина может представлять собой ауристатин E, монометилауристатин E, ауристатин PYE и ауристатин PHE. Примеры цитотоксического средства включают без ограничения цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин, 5-фторурацил, таксотер (доцетаксел), паклитаксел, антрациклин (доксорубицин), метотрексат, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, дакарбазин, циклофосфамид, этопозид, адриамицин, камптотецин, родственные комбретастатину A-4 соединения, сульфонамиды, оксадиазолины, бензо[b]тиофенсинтетические спирокетальные пираны, соединения на основе монотетрагидрофурана, курацин и производные курацина, производные метоксиэстрадиола и лейковорин. Мутеины липокалина по настоящему раскрытию также можно конъюгировать с терапевтически активными нуклеиновыми кислотами, такими как молекулы антисмысловых нуклеиновых кислот, малые интерферирующие РНК, микроРНК или рибозимы. Такие конъюгаты можно получать посредством способов, хорошо известных из уровня техники.

[0060] В одном варианте осуществления мутеины по настоящему раскрытию можно также сшивать с нацеливающим фрагментом, который нацеливается на конкретный участок тела для доставки мутеинов по настоящему изобретению в желаемый участок или область в теле. Одним из примеров, когда такая модификация может быть желательна, является пересечение гематоэнцефалического барьера. Для пересечения гематоэнцефалического барьера мутеины по настоящему раскрытию можно сшивать с фрагментами, которые облегчают активный транспорт через этот барьер. (Gaillard PJ, et al., International Congress Series. 127:185-198 (2005);Gaillard PJ, et al., Expert Opin Drug Deliv. 2(2):299-309 (2005). Такие соединения, например, доступны под торговым названием 2B-Trans™ (to-BBB technologies BV, Лейден, Нидерланды). Другие иллюстративные нацеливающие молекулы, с которыми можно сшивать мутеины по настоящему раскрытию, включают антитела, фрагменты антител или мутеины липокалина с аффинностью к желаемой молекуле-мишени. Молекулой-мишенью нацеливающих фрагментов может являться, например, антиген клеточной поверхности. Антигены клеточной поверхности могут являться специфическими в отношении типа клетки или ткани, таких как, например, раковые клетки. Иллюстративными примерами таких белков клеточной поверхности являются HER-2 или протеогликаны, такие как NEU-2.

[0061] Как указано выше, мутеин по настоящему раскрытию в некоторых вариантах осуществления можно конъюгировать с соединением, которое продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови (в связи с этим см. также публикацию согласно PCT № WO2006/56464, в которой такие стратегии конъюгации описаны касательно мутеинов ассоциированного с желатиназой нейтрофилов липокалина человека с аффинностью связывания в отношении CTLA-4). Соединением, который продлевает время полужизни в сыворотке крови, может являться молекула полиалкиленгликоля, например полиэтилен («ПЭГ») или его активированное производное; гидроксиэтилкрахмал, молекулы жирных кислот, например пальмитиновая кислота (Vajo & Duckworth Pharmacol. Rev. 52:1-9 (2000), Fc-часть иммуноглобулина, домен C_H3 иммуноглобулина, домен C_H4 иммуноглобулина, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающий пептид, альбумин-связывающий белок, трансферрин или метка Pro-Ala-Ser, при этом упомянуты лишь некоторые из них. Альбумин-связывающий белок может являться бактериальным альбумин-связывающим белком, антителом, фрагментом антитела, в том числе доменными антителами (см. патент США №6696245, например), или мутеином липокалина с активностью связывания в отношении альбумина. Соответственно, подходящие соединения для конъюгации для продления времени полужизни мутеина липокалина по настоящему раскрытию включают альбумин (Osborn et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:540-548 (2002) или альбумин-связывающий белок, например, бактериальный альбумин-связывающий домен, такой как один из стрептококковых белков G. (König, T. and Skerra, A., J. Immunol. Methods 218:73-83 (1998). Другими примерами альбумин-связывающих пептидов, которые можно использовать в качестве партнера по конъюгации, например, являются таковые, имеющие консенсусную последовательность Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys, где Xaa₁ представляет собой Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Xaa₂ представляет собой Asn, Gln, His, Ile, Leu или Lys; Xaa₃ представляет собой Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr и Xaa₄ представляет собой Asp, Gly, Leu, Phe, Ser или Thr, описанную в публикации заявки на патент США № 2003/0069395 или Dennis et al. (Dennis et al., J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).

[0062] В других вариантах осуществления альбумин сам по себе или биологически активный фрагмент альбумина можно использовать в качестве соединения мутеина липокалина по настоящему раскрытию, которое продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови. Термин «альбумин» включает все альбумины млекопитающего, такие как человеческий альбумин сыворотки крови или бычий альбумин сыворотки крови или альбумин крысы. Альбумин или его фрагмент можно получить рекомбинантно, как описано в патенте США № 5728553 или заявках на европейский патент №№ EP 0330451 и EP 0361991. Рекомбинантный альбумин человека (Recombumin^®) для применения в качестве стабилизатора белка, например, доступен от Novozymes Delta Ltd. (Ноттингем, Великобритания).

[0063] Если альбумин-связывающий белок представляет собой фрагмент антитела, то он может являться доменным антителом. Доменные антитела (dAb) сконструированы для обеспечения точного контроля биофизических свойств и времени полужизни in vivo с обеспечением оптимальной безопасности и профиля эффективности продукта. Доменными антителами являются, например, коммерчески доступные от Domantis Ltd. (Кембридж, Великобритания и Массачусетс, США).

[00645] При использовании трансферрина в качестве фрагмента для продления времени полужизни мутеина по настоящему раскрытию в сыворотке крови мутеины можно генетически слить с N- или C-концом, или обоими, негликозилированного трансферрина. Негликозилированный трансферрин характеризуется временем полужизни, составляющим 14-17 дней, и слитый белок с трансферрином будет подобным образом характеризоваться продленным временем полужизни. Носитель, представляющий собой трансферрин, также обеспечивает высокие биодоступность, биораспределение и стабильность при нахождении в кровотоке. Такая технология коммерчески доступна от BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, Пенсильвания, США). Рекомбинантный трансферрин человека (DeltaFerrin™) для применения в качестве стабилизатора белка также коммерчески доступен от Novozymes Delta Ltd. (Ноттингем, Великобритания).

[0065] Если Fc-часть иммуноглобулина применяют с целью продления времени полужизни мутеинов по настоящему раскрытию в сыворотке крови, можно применять технологию SynFusion™, коммерчески доступную от Syntonix Pharmaceuticals, Inc (Массачусетс, США). Применение такой технологии слияния с Fc обеспечивает создание более длительно действующих биофармацевтических средств и, например, может содержать две копии мутеина, соединенного с Fc-участком антитела, для улучшения фармакокинетики, растворимости и эффективности продуцирования.

[0066] Еще одной альтернативой для продления времени полужизни мутеина по настоящему раскрытию является слияние с N- или C-концом мутеина по настоящему раскрытию длинных неструктурированных гибких богатых глицином последовательностей (например, полиглицина с приблизительно 20-80 последовательными остатками глицина). Такой подход, раскрытый в публикации согласно PCT № WO 2007/038619, например, также был назван «рПЭГ» (рекомбинантный ПЭГ).

[0067] Если полиалкиленгликоль применяют в качестве соединения, которое продлевает время полужизни мутеина, полиалкиленгликоль может являться замещенным или незамещенным. Он также может являться активированным производным полиалкилена. Примерами подходящих соединений являются молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), описанные в WO99/64016, в патенте США №6177074 или в патенте США №6403564 касательно интерферона, или описанные в отношении других белков, таких как ПЭГ-модифицированная аспарагиназа, ПЭГ-аденозиндезаминаза (ПЭГ-АДА) или ПЭГ-супероксиддисмутаза. (См., например, Fuertges et al., The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins, J. Control. Release 11:139-148 (1990). Молекулярная масса такого полимера, предпочтительно полиэтиленгликоля, может находяться в диапазоне от приблизительно 300 до приблизительно 70000 дальтон, в том числе, например, полиэтиленгликоль с молекулярной массой, составляющей приблизительно 10000, приблизительно 20000, приблизительно 30000 или приблизительно 40000 дальтон. Более того, например, как описано в патентах США №№ 6500930 или 6620413, углеводные олигомеры и полимеры, такие как крахмал или гидроксиэтилкрахмал («ГЭК»), можно конъюгировать с мутеином по настоящему раскрытию с целью продления времени полужизни в сыворотке крови.

[0068] В другом варианте осуществления для обеспечения подходящих аминокислотных боковых цепей для конъюгирования одного из приведенных выше соединений с мутеинами по настоящему раскрытию путем мутагенеза можно вводить искусственные аминокислоты. Как правило, такие искусственные аминокислоты конструируют так, чтобы они были более реактивными и, таким образом, облегчали конъюгацию с желаемым фрагментом. Одним примером такой искусственной аминокислоты, которую можно вводить посредством искусственной тРНК, является параацетилфенилаланин.

[0069] Для нескольких применений мутеинов, раскрытых в данном документе, может быть преимущественным применение их в виде слитых белков. В некоторых вариантах осуществления мутеин по настоящему изобретению слит на своем N-конце и/или своем C-конце с белком, белковым доменом или пептидом, таким как сигнальная последовательность и/или аффинная метка.

[0070] Для фармацевтических применений мутеин по настоящему раскрытию может быть cлит с партнером по слиянию, который продлевает время полужизни in vivo мутеина в сыворотке крови (см. снова публикацию согласно PCT № WO 2006/56464, в которой подходящие партнеры по слиянию описаны касательно мутеинов ассоциированного с желатиназой нейтрофилов липокалина человека с аффинностью связывания в отношении CTLA-4). Аналогично конъюгированным соединениям, описанным выше, партнер по слиянию может являться Fc-частью иммуноглобулина, доменом C_H3 иммуноглобулина, доменом C_H4 иммуноглобулина, альбумином, альбумин-связывающим пептидом или альбумин-связывающим белком, при этом упомянуты лишь некоторые из них. В свою очередь, альбумин-связывающий белок может являться бактериальным альбумин-связывающим белком или мутеином липокалина с активностью связывания в отношении альбумина. Соответственно, подходящие партнеры по слиянию для продления времени полужизни мутеина липокалина по настоящему раскрытию включают альбумин (Osborn, B.L. et al. supra J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:540-548 (2002) или альбумин-связывающий белок, например, бактериальный альбумин-связывающий домен, такой как стрептококковый белок G (König, T. and Skerra, A. J. Immunol. Methods 218:73-83 (1998). Альбумин-связывающие пептиды, описанные в Dennis et al. выше (2002) или публикации заявки на патент США №2003/0069395, имеющие консенсусную последовательность Cys-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Cys, где Xaa₁ представляет собой Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Xaa₂ представляет собой Asn, Gln, His, Ile, Leu или Lys; Xaa₃ представляет собой Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr и Xaa₄ представляет собой Asp, Gly, Leu, Phe, Ser или Thr, можно также использовать в качестве партнера по слиянию. Альбумин сам по себе или биологически активный фрагмент альбумина также возможно использовать в качестве партнера по слиянию мутеина липокалина по настоящему раскрытию. Термин «альбумин» включает альбумины всех млекопитающих, такие как человеческий альбумин сыворотки крови, или бычий альбумин сыворотки крови, или альбумин сыворотки крови крысы. Рекомбинантное получение альбумина или его фрагментов хорошо известно из уровня техники и, например, описано в патенте США №5728553, заявках на европейский патент №№ EP 0330451 или EP 0361991.

[0071] Партнер по слиянию может придавать новые характеристики мутеину липокалина по настоящему изобретению, такие как ферментативная активность или аффинность связывания в отношении других молекул. Примерами подходящих слитых белков являются щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глутатион-S-трансфераза, альбумин-связывающий домен белка G, белок A, фрагменты антител, домены олигомеризации, мутеины липокалина с такой же или отличной специфичностью связывания (что приводит к образованию «дуокалинов», см. Schlehuber, S., and Skerra, A., Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold (Biol. Chem. 382:1335-1342 (2001) или токсины.

[0072] В частности, может быть возможным слияние мутеина липокалина по настоящему раскрытию с активным сайтом отдельного фермента, вследствие чего оба «компонента» полученного в результате слитого белка действуют совместно на данную терапевтическую мишень. Связывающий домен мутеина липокалина присоединяется к обусловливающей заболевание мишени, обеспечивая возможность домену фермента разрушать биологическую функцию мишени.

[0073] Аффинные метки, такие как Strep-tag® или Strep-tag® II (Schmidt, T.G.M. et al., J. Mol. Biol. 255:753-766 (1996), myc-метка, FLAG-метка, His6-метка или HA-метка, или белки, такие как глутатион-S-трансфераза, также обеспечивающие легкое выявление и/или очистку рекомбинантных белков, являются дополнительными примерами предпочтительных партнеров по слиянию. В заключение, белки с хромогенными или флуоресцентными свойствами, такие как зеленый флуоресцентный белок («GFP») или желтый флуоресцентный белок («YFP»), также являются подходящими партнерами по слиянию для мутеина липокалина по настоящему раскрытию.

[0074] Термин «слитый белок», используемый в данном документе, также включает мутеины липокалина согласно настоящему раскрытию, содержащие сигнальную последовательность. Сигнальные последовательности на N-конце полипептида направляют этот полипептид к специфическому компартменту клетки, например периплазме E. coli или эндоплазматической сети эукариотических клеток. Из уровня техники известно большое количество сигнальных последовательностей. Предпочтительная сигнальная последовательность для секреции полипептида в периплазму E. coli представляет собой сигнальную последовательность OmpA.

[0075] Настоящее раскрытие также относится к молекулам нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК), содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие мутеины, описанные в данном документе. Поскольку вырожденность генетического кода допускает замены определенных кодонов другими кодонами, определяющими ту же аминокислоту, настоящее раскрытие не ограничено конкретной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин по настоящему раскрытию, а включает все молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие функциональный мутеин.

[0076] Молекула нуклеиновой кислоты, раскрытая в настоящей заявке, может быть «функционально соединена» с регуляторной последовательностью (или регуляторными последовательностями) для обеспечения экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты.

[0077] Молекулу нуклеиновой кислоты, такую как ДНК, называют «способной к экспрессии молекулой нуклеиновой кислоты» или способной «обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности», если она включает элементы последовательности, которые содержат информацию относительно транскрипционной и/или трансляционной регуляции, и такие последовательности «функционально соединены» с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. Функциональная связь представляет собой связь, при которой элементы регуляторной последовательности и последовательность, подлежащая экспрессии, соединены таким образом, который обеспечивает экспрессию гена. Определенные особенности регуляторных участков, необходимых для экспрессии гена, могут варьировать между видами, но в общем эти участки включают промотор, который у прокариот содержит как промотор per se, т.е. элементы ДНК, управляющие инициацией транскрипции, так и элементы ДНК, которые при транскрибировании в РНК будут подавать сигнал об инициации трансляции. Такие промоторные участки, как правило, включают 5'-некодирующие последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, такие как боксы -35/-10 и элемент Шайн-Дальгарно у прокариот или TATA-бокс, последовательности CAAT и 5'-кэпирующие элементы у эукариот. Такие участки также могут включать энхансерные или репрессорные элементы, а также сигнальные последовательности трансляции и лидерные последовательности для нацеливания природного полипептида на конкретный компартмент клетки-хозяина.

[0078] К тому же, 3'-некодирующие последовательности могут содержать регуляторные элементы, вовлеченные в терминацию транскрипции, полиаденилирование и т.п. Однако, если такие последовательности терминации не удовлетворительны с точки зрения функциональности для конкретной клетки-хозяина, тогда их можно заменить сигналами, функциональными в такой клетке.

[0079] Следовательно, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию может включать регуляторную последовательность, предпочтительно промоторную последовательность. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию включает промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции. Подходящими прокариотическими промоторами являются, например, промотор tet, промотор lacUV5 или промотор T7. Примерами промоторов, пригодных для экспрессии в клетках эукариот, являются промотор SV40 или промотор CMV.

[0080] Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию также могут быть частью вектора или любого другого типа вектора для клонирования, такого как плазмида, фагмида, фаг, бакуловирус, космида или искусственная хромосома, такая как YAC или BAC.

[0081] Молекулой ДНК, кодирующей мутеины липокалина по настоящему раскрытию, и, в частности, вектором для клонирования, содержащим кодирующую последовательность такого мутеина липокалина, можно трансформировать клетку-хозяина, способную экспрессировать ген. Трансформацию можно осуществлять с помощью стандартных методик. (Sambrook, J. et al. (2001) выше).

[0082] Таким образом, настоящее раскрытие также относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе.

[0083] Настоящее раскрытие также относится к способу получения мутеина по настоящему раскрытию, где мутеин, фрагмент мутеина или слитый белок мутеина и другого полипептида получают, исходя из нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, с помощью способов генной инженерии. Способ можно осуществлять in vivo, мутеин, например, можно получить в организме-хозяине, представляющем собой бактерию или эукариоту, и затем обогатить, очистить или выделить из этого организма-хозяина или его культуры. Также возможно получать белок in vitro, например путем использования системы трансляции in vitro. Термин «обогащенный» означает, что мутеин или его функциональный фрагмент составляют значительно большую фракцию от общего белка, присутствующего в представляющем интерес образце или растворе, чем в образце или растворе, из которого он был взят. Обогащение может, например, включать выделение определенной фракции из экстракта клетки. Это можно получить посредством стандартных методик, таких как центрифугирование. Примерами других способов обогащения являются фильтрация или диализ, которые, например, могут быть направлены на удаление нежелательных молекул ниже определенной молекулярной массы, или осаждение с применением органических растворителей или сульфата аммония. Очистка может, например, включать методику хроматографии, например гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, афинную очистку, хроматографию с гидрофобным взаимодействием или гидрофобную хроматографию с индуцированием заряда. Другим примером очистки является методика электрофореза, такая как препаративный капиллярный электрофорез. Выделение может включать комбинацию схожих способов. Как используется в данном документе, «чистый, по сути» или «очищенный, по сути» означает соединение или частицы, которые являются преобладающими частицами, присутствующими (т.е. на молярной основе они более распространены, чем любые другие отдельные частицы в композиции). В некоторых вариантах осуществления очищенная, по сути, композиция является композицией, в которой частица включает меньшей мере приблизительно 50 процентов (на молярной основе) всех молекулярных или, если применимо, всех присутствующих макромолекулярных частиц. В определенных вариантах осуществления чистая, по сути, композиция будет содержать более чем приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или приблизительно 99% всех молекулярных или, если применимо, всех макромолекулярных частиц, присутствующих в композиции.

[0084] При получении мутеина in vivo нуклеиновую кислоту, кодирующую мутеин по настоящему раскрытию, вводят в подходящий организм-хозяина, представляющий собой бактерию или эукариоту, с помощью технологии рекомбинантной ДНК (как уже обозначалось выше). С этой целью клетку-хозяина сперва трансформируют вектором для клонирования, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутеин по настоящему раскрытию, с применением установленных стандартных способов. (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual (1989). Клетку-хозяина затем культивируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию гетерологичной ДНК и, таким образом, синтез соответствующего полипептида. Впоследствии полипептид выделяют либо из клетки, либо из среды для культивирования.

[0085] В одном аспекте настоящее раскрытие относится к способу образования мутеина, который связывает GPC3, включающему осуществление мутагенеза в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей липокалин, в результате чего получают один или более мутеинов молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты.

[0086] Способ может дополнительно включать

экспрессию одного или более мутеинов молекулы(молекул) нуклеиновой кислоты, полученной(-ых) в подходящей экспрессирующей системе,

приведение множества мутеинов в контакт по меньшей мере с фрагментом или зрелой формой GPC3 и

обогащение одного или более мутеинов с выявляемой аффинностью связывания в отношении данной мишени, посредством отбора и/или выделения.

[0087] Термин «мутагенез», используемый в данном документе, означает, что экспериментальные условия выбраны таким образом, что аминокислота, встречающаяся в природе в данном положении последовательности липокалина, в том числе hNGAL, может быть заменена по меньшей мере одной аминокислотой, которая не присутствует в этом конкретном положении в соответствующей природной полипептидной последовательности. Термин «мутагенез» также включает (дополнительную) модификацию длины сегментов последовательности путем делеции или вставки одной или более аминокислот. Таким образом, в пределах объема настоящего раскрытия находится то, что, например, одну аминокислоту в выбранном положении последовательности заменяют отрезком из трех случайных мутаций, что приводит к вставке двух аминокислотных остатков по сравнению с длиной соответствующего сегмента белка дикого типа. Такую вставку или делецию можно вводить независимо друг от друга в любой из сегментов пептидов, которые могут быть подвергнуты мутагенезу в настоящем раскрытии. В одном иллюстративном варианте осуществления настоящего раскрытия вставка нескольких мутаций может быть введена в петлю AB остова выбранного липокалина (см. публикацию согласно PCT № WO2005/019256, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме). Термин «случайный мутагенез» означает, что в определенном положении последовательности не присутствует предопределенной единичной аминокислоты (мутации), но по меньшей мере две аминокислоты могут быть включены с определенной вероятностью в заранее определенное положение последовательности в ходе мутагенеза.

[0088] В одном неограничивающем подходе кодирующую последовательность липокалина 2 человека можно использовать в качестве исходной точки для мутагенеза сегментов пептида, выбранных в настоящем раскрытии. Для мутагенеза перечисленных аминокислотных положений специалист в данной области имеет в своем распоряжении различные установленные стандартные способы для сайт-направленного мутагенеза. (Sambrook, J. et al. (2001) выше). Широко используемой методикой является введение мутации с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с применением смесей синтетических олигонуклеотидов, которые имеют вырожденную основную композицию в желаемых положениях последовательности. Другие схожие методики хорошо известны специалистам в данной области.

[0089] Молекулы нуклеиновой кислоты, определенные выше, можно соединить посредством лигирования с недостающими 5'- и 3'-последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид липокалин и/или вектор, и можно клонировать в известный организм-хозяин. Для лигирования и клонирования доступно множество установленных процедур. (Sambrook, J. et al. (2001) выше). Например, последовательности распознавания для рестрикционных эндонуклеаз, также присутствующие в последовательности вектора для клонирования, можно сконструировать в последовательности синтетических олигонуклеотидов. Таким образом, после амплификации соответствующего продукта ПЦР и ферментативного расщепления полученный фрагмент можно легко клонировать с использованием соответствующих последовательностей распознавания.

[0090] Более длинные сегменты последовательности в пределах гена, кодирующего белок, выбранный для мутагенеза, можно также подвергнуть случайному мутагенезу посредством известных способов, например, с применением полимеразной цепной реакции в условиях повышенной частоты ошибок, посредством химического мутагенеза или с применением бактериальных штаммов-мутаторов. Такие способы можно также применять для дополнительной оптимизации целевой аффинности или специфичности мутеина липокалина. Мутации, возможно возникающие за пределами сегментов экспериментального мутагенеза, часто допустимы или могут даже оказаться преимущественными, например, если они способствуют улучшенной эффективности сворачивания или стабильности сворачивания мутеина липокалина.

[0091] В дополнительном варианте осуществления способ включает подвергание молекулы нуклеиновой кислоты мутагенезу в нуклеотидных триплетах, кодирующих по меньшей мере любое из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее число положений последовательности, соответствующих положениям 36, 40, 41, 49, 52, 65, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 105, 106, 125, 127, 132, 134, 136 и/или 175 последовательности в линейной полипептидной последовательности липокалина, в частности линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 1). Такую нуклеиновую кислоту можно подвергнуть мутагенезу и ввести в подходящий организм-хозяин, представляющий собой бактерию или эукариоту, с применением технологии рекомбинантной ДНК. Получение библиотеки нуклеиновых кислот липокалина можно осуществлять с применением любой подходящей методики, известной из уровня техники, для образования мутеинов липокалина с антителоподобными свойствами, т.е. мутеинов, которые характеризуются аффинностью в отношении данной мишени. Примеры таких основанных на комбинировании способов подробно описаны, например, в заявках согласно PCT №№ WO99/16873, WO00/75308, WO03/029471, WO03/029462, WO03/029463, WO2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256 или WO 2006/56464. Содержание каждой из этих заявок на патент включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. После экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, которые были подвергнуты мутагенезу в соответствующем хозяине, из полученной библиотеки можно выбрать клоны, несущие генетическую информацию для множества соответствующих мутеинов липокалина, которые связываются с данной мишенью. Для выбора этих клонов можно применять хорошо известные методики, такие как фаговый дисплей (Adey, NB et al., Identification of calmodulin-binding peptide consensus sequences from a phage-displayed random peptide library, Gene 169:133-4 (1996)(1996); Lowman, H.B., Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26:401-24 (1997); Rodi DJ et al., Phage-display technology--finding a needle in a vast molecular haystack Curr Opin Biotechnol. 10(1):87-93 (1999), скрининг колонии (рассмотренный в Pini, A. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 5:503-510 (2002), рибосомный дисплей (рассмотренный в Amstutz, P. et al. Curr. Opin. Biotechnol. 12:400-405 (2001) или мРНК-дисплей, описаный в Wilson, D.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-3755 (2001), или способы, особенно описанные в публикациях согласно PCT №№ WO99/16873, WO00/75308, WO03/029471, WO03/029462, WO03/029463, WO2005/019254, WO2005/019255, WO2005/019256 или WO2006/56464.

[0092] В соответствии с настоящим раскрытием другой вариант осуществления вышеуказанных способов включает

обеспечение по меньшей мере фрагмента GPC3, например, в качестве данной мишени/лиганда,

приведение множества мутеинов в контакт с указанной мишенью/лигандом для обеспечения образования комплексов между указанными лигандами и мутеинами, имеющими аффинность связывания в отношении указанной мишени/лиганда, и

удаление мутеинов, не имеющих или не имеющих существенной аффинности связывания.

[0093] В одном варианте осуществления способов по настоящему раскрытию отбор по аффинности связывания осуществляют при конкурентных условиях. Конкурентные условия, используемые в данном документе, означают, что отбор мутеинов охватывает по меньшей мере одну стадию, на которой приводят в контакт мутеины и фрагмент GPC3 в присутствии дополнительного лиганда, который конкурирует со связыванием мутеинов с мишенью, GPC3. В качестве альтернативы дополнительный лиганд конкурирует со связыванием мутеинов посредством образования комплекса эпитопа, отличного от сайта связывания мутеинов с мишенью посредством аллостерических эффектов. Соответственно, любой фрагмент, предшественник или зрелую форму GPC3 можно применять для образования мутеинов по настоящему раскрытию.

[0094] Дополнительный вариант осуществления способов по настоящему раскрытию включает функциональное слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей множество мутеинов по настоящему раскрытию и полученной в результате мутагенеза на 3’-конце, с геном, кодирующим белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13-семейства или фрагмент этого белка оболочки, для выбора по меньшей мере одного мутеина для связывания данного лиганда.

[0095] Слитый белок может включать дополнительные компоненты, такие как аффинная метка, которая обеспечивает иммобилизацию, выявление и/или очищение слитого белка или его частей. Кроме того, стоп-кодон может быть расположен между участками последовательности, кодирующей липокалин или его мутеины и ген капсида фага или его фрагменты, где стоп-кодон, предпочтительно янтарный стоп-кодон, по меньшей мере частично транслируется в аминокислоту в ходе трансляции в подходящем супрессорном штамме.

[0096] Молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующие мутеины по настоящему раскрытию, можно вставлять в вектор с применением двух сайтов рестрикции BstXI. После лигирования подходящий штамм-хозяин, такой как E. coli XL1-Blue, трансформируют полученной смесью нуклеиновой кислоты с получением большого количества независимых клонов. Соответствующий вектор может быть создан для получения гиперфагемидной библиотеки, при необходимости.

[0097] Как только мутеин с аффинностью в отношении данной мишени был выбран, дополнительно возможно подвергнуть такой мутеин другому мутагенезу для того, чтобы впоследствии выбрать варианты с еще более высокой аффинностью или варианты с улучшенными свойствами, такими как более высокая термостабильность, улучшенная стабильность в сыворотке, термодинамическая стабильность, улучшенная растворимость, улучшенное мономерное поведение, улучшенная устойчивость против термической денатурации, химической денатурации, протеолиза или детергентов и т.д. Этот дополнительный мутагенез, который в случае нацеливания на более высокую афинность может рассматриваться в качестве «созревания аффинности» in vitro, может быть достигнут с помощью сайт-специфической мутации на основе рационального конструирования или случайной мутации. Другим возможным подходом для получения более высокой аффинности или улучшенных свойств является применение допускающей ошибки ПЦР, что приводит к точечным мутациям в выбранном диапазоне положений последовательности мутеина липокалина. Допускающую ошибки ПЦР можно осуществлять в соответствии с любым известным протоколом, таким как описанный в Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 255:589-603 (1996). Другие способы случайного мутагенеза, которые подходят для таких целей, включают случайный мутагенез, предусматривающий вставку/делецию (RID), описанный в Murakami et al., Nat. Biotechnol. 20:76-81 (2002), или негомологичную случайную рекомбинацию (NRR), описаную в Bittker et al., Nat. Biotechnol. 20:1024-1029 (2002). При необходимости созревание аффинности также можно осуществлять в соответствии с процедурой, описанной в публикации согласно PCT № WO 00/75308 или Schlehuber et al., J. Mol. Biol. 297:1105-1120 (2000), где были получены мутеины билин-связывающего белка, характеризующиеся высокой аффинностью в отношении дигоксигенина. Дополнительным подходом для улучшения аффинности является позиционный насыщающий мутагенез. В этом подходе могут быть созданы библиотеки «малых» нуклеиновых кислот, в которых аминокислотные обмены/мутации вводят только в отдельных положениях в любом из четырех сегментов петли. Эти библиотеки затем непосредственно подвергают стадии отбора (скрининг аффинности) без дополнительных циклов пэннинга. Этот подход обеспечивает идентификацию остатков, которые способствуют улучшенному связыванию желаемой мишени, и обеспечивает идентификацию «горячих точек», которые являются важными для связывания.

[0098] В одном варианте осуществления вышеуказанные способы для модификации мутеина дополнительно включают введение остатка Cys по меньшей мере в одно из любых положений последовательности, которые соответствуют положениям 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 последовательности в последовательности дикого типа липокалина 2 человека, и соединение фрагмента, который способен модифицировать время полужизни указанного мутеина в сыворотке крови, посредством тиоловой группы остатка Сys, введенного по меньшей мере в одно из любых положений последовательности, которые соответствуют положениям 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 последовательности в последовательности дикого типа hNGAL. Фрагмент, который способен модифицировать время полужизни указанного мутеина в сыворотке крови, можно выбрать из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля и гидроксиэтилкрахмала.

[0099] Если белок по настоящему раскрытию представляет собой мутеин липокалина 2 человека по настоящему раскрытию, встречающуюся в природе дисульфидную связь между Cys 76 и Cys 175 можно удалить. Соответственно, такие мутеины (или любой другой мутеин липокалина 2 человека, который не содержит внутримолекулярную дисульфидную связи) можно получать в компартменте клетки со средой с восстанавливающим окислительно-восстановительным потенциалом, например, в цитоплазме грамотрицательных бактерий.

[00100] В случае, если мутеин липокалина по настоящему раскрытию содержит внутримолекулярные дисульфидные связи, может быть предпочтительным направлять образующийся полипептид в компартмент клетки со средой с окисляющим окислительно-восстановительным потенциалом с помощью соответствующей сигнальной последовательности. Такая окисляющая среда может обеспечиваться периплазмой грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, во внеклеточной среде грамотрицательных бактерий или в просвете эндоплазматической сети эукариотических клеток и, как правило, она способствует образованию дисульфидных связей в структуре.

[00101] Однако также возможно получение мутеина по настоящему раскрытию в цитозоле клетки-хозяина, предпочтительно E. coli. В данном случае полипептид может быть либо непосредственно получен в растворимом и свернутом состоянии, либо выделен в форме телец включения с последующей ренатурацией in vitro. Дополнительной возможностью является применение конкретных штаммов-хозяев с окисляющей внутриклеточной средой, которая может, таким образом, обеспечивать образование дисульфидных связей в цитозоле. (Venturi et al., J. Mol. Biol. 315:1-8 (2002).

[00102] Однако мутеин по настоящему раскрытию не обязательно можно создавать или получать только путем применения генной инженерии. Предпочтительнее мутеин липокалина также можно получить путем химического синтеза, такого как твердофазный синтез полипептидов Меррифилда, или путем транскрипции и трансляции in vitro. Например, возможно, что представляющие интерес мутации определяют с помощью молекулярного моделирования и затем синтезируют необходимый (сконструированный) полипептид in vitro и исследуют активность связывания в отношении данной мишени. Способы твердофазного синтеза и/или синтеза в жидкой фазе белков хорошо известны из уровня техники (рассмотренные, например, в Lloyd-Williams et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, Boca Raton, Fields, GB, (1997); Colowick Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego(1997); Bruckdorfer et al., Curr. Pharm. Biotechnol. 5:29-43 (2004).

[00103] В другом варианте осуществления мутеины по настоящему раскрытию можно получить путем транскрипции/трансляции in vitro с применением общепринятых способов, известных специалистам в данной области.

[00104] Настоящее раскрытие также относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один мутеин по настоящему изобретению, упоминаемый в формуле изобретения, или слитый белок или его конъюгаты и необязательно фармацевтически приемлемый наполнитель.

[00105] Мутеины липокалина согласно настоящему раскрытию можно вводить посредством любого парентерального или непарентерального (например, энтерального) пути, который является терапевтически эффективным для белковых лекарственных средств. Способы парентерального введения включают, например, методики внутрикожной, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции и инфузии, например в виде растворов для инъекции, растворов для инфузии или настоек, а также аэрозольную установку и ингаляцию, например в виде аэрозольных смесей, спреев или порошков. Непарентеральными способами доставки являются, например, пероральный, например в виде пилюль, таблеток, капсул, растворов или суспензий, или ректальный, например в виде суппозиториев. Мутеины по настоящему раскрытию можно вводить систематично или местно в составах, содержащих общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые наполнители или носители, добавки и среды-носители, по желанию.

[00106] В одном варианте осуществления по настоящему раскрытию фармацевтическую композицию вводят парентерально позвоночному животному, в том числе млекопитающему, и, в частности, человеку. Соответствующие способы введения включают без ограничения, например, методики внутрикожной, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции и инфузии, например в виде растворов для инъекции, растворов для инфузии или настоек, а также аэрозольную установку и ингаляцию, например в виде аэрозольных смесей, спреев или порошков. Комбинация внутривенной и подкожной инфузии и/или инъекции может являться наиболее подходящей в случае соединений с относительно коротким временем полужизни в сыворотке крови. Фармацевтическая композиция может представлять собой водный раствор, эмульсию типа "масло в воде" или эмульсию типа "вода в масле".

[00107] В связи с этим отмечается, что трансдермальные технологии доставки, например ионофорез, сонофорез или доставка с использованием микроиглы, как описано в Meidan and Michniak, Am. J. Ther. 11(4):312-316 (2004), также можно применять для трансдермальной доставки мутеинов, описанных в данном документе. Непарентеральными способами доставки являются, например, пероральное, например в виде пилюль, таблеток, капсул, растворов или суспензий, или ректальное введение, например в виде суппозиториев. Мутеины по настоящему раскрытию можно вводить систематично или местно в составах, содержащих множество общепринятых нетоксичных фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей, добавок и сред-носителей.

[00108] Вводимая доза мутеина может варьировать в широких пределах для достижения желаемого профилактического эффекта или терапевтического ответа. Например, она будет зависеть от аффинности соединения в отношении выбранного лиганда, а также от времени полужизни комплекса между мутеином и лигандом in vivo. К тому же, оптимальная доза будет зависеть от биораспределения мутеина или его слитого белка или его конъюгата, способа введения, тяжести заболевания/нарушения, поддающихся лечению, а также медицинского состояния пациента. Например, при применении в мази для местных применений можно использовать более высокую концентрацию белка по настоящему раскрытию. Однако в случае необходимости белок можно также вводить в составе с замедленным высвобождением, например липосомальных дисперсиях или полимерных микросферах на основе гидрогеля, таких как PolyActive™ или OctoDEX™ (см. Bos et al., Business Briefing: Pharmatech1-6 (2003).

[00109] Соответственно, мутеины по настоящему раскрытию можно составлять в композиции с применением фармацевтически приемлемых ингредиентов, а также установленных способов получения (см., например, Gennaro and Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000). Для получения фармацевтических композиций можно применять фармацевтически инертные неорганические или органические наполнители. Для получения, например, пилюль, порошков, желатиновых капсул или суппозиториев можно применять, например, лактозу, тальк, стеариновую кислоту и ее соли, жиры, воски, твердые или жидкие полиолы, натуральные и отвержденные масла. Подходящие наполнители для получения растворов, суспензий, эмульсий, аэрозольных смесей или порошков для растворения в растворах или аэрозольных смесях перед применением включают воду, спирты, глицерин, полиолы и их подходящие смеси, а также растительные масла.

[00110] Фармацевтическая композиция может также содержать добавки, такие как, например, заполнители, связующие вещества, смачивающие вещества, вещества, способствующие скольжению, стабилизаторы, консерванты, эмульгаторы и, кроме того, растворители или солюбилизаторы или средства для достижения депо-эффекта. Последнее состоит в том, что слитые белки могут быть включены в системы с медленным или замедленным высвобождением или целенаправленной доставкой, такие как липосомы и микрокапсулы.

[00111] Составы можно стерилизовать посредством многочисленных средств, включая фильтрацию через удерживающий бактерии фильтр, или посредством включения стерилизующих средств в виде стерильных твердых композиций, которые можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной среде непосредственно перед применением.

[00112] Мутеин по настоящему раскрытию или слитый белок или его конъюгат можно применять во многих применениях. В целом такой мутеин можно применять во всех применениях, в которых применяют антитела, за исключением тех, которые конкретно основываются на гликозилировании Fc-части.

[00113] Описанный в данном документе мутеин можно вводить организму, в том числе пациенту-человеку, сам по себе или в фармацевтической композиции, где он может включать или быть смешанным с фармацевтически активными ингредиентами или подходящими носителями или наполнителем(-ями). Методики составления и введения соответствующей композиции на основе мутеина липокалина схожи с таковыми для соединений с низкой молекулярной массой, традиционными в уровне техники, или идентичны им. Иллюстративные пути включают без ограничения пероральную, трансдермальную и парентеральную доставку. Мутеин липокалина или соответствующую композицию можно применять для наполнения капсулы или пробирки, или он может быть обеспечен в спрессованой фоме в качестве пеллеты. Мутеин липокалина или соответствующую композицию можно также применять в инъецируемой или распыляемой форме, например, в качестве суспензии соответствующего мутеина липокалина.

[00114] Композицию, которая включает мутеин липокалина по настоящему раскрытию, например, можно применять в отношении кожи или в отношении раны. Дополнительные подходящие пути введения могут, например, включать депо, пероральное, ректальное, чреcслизистое или интестинальное введение; парентеральную доставку, в том числе внутримышечную, подкожную, внутривенную, интрамедуллярную инъекции, а также интратекальную, прямую интравентрикулярную, внутрибрюшинную, интраназальную или интраокулярную инъекции. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина или соответствующую композицию можно вводить местно, а не системным образом, например, путем инъекции.

[00115] Фармацевтические композиции, которые содержат мутеин липокалина по настоящему раскрытию, могут быть изготовлены таким образом, который сам по себе известен, например, с помощью общепринятых способов смешивания, растворения, измельчения, получения драже, растирания, эмульгирования, инкапсулирования, заключения или лиофилизирования. Фармацевтическую композицию для применения в соответствии с настоящим раскрытием, таким образом, можно составлять традиционным способом с применением одного или более физиологически приемлемых носителей, в том числе наполнителей и вспомогательных средств, которые облегчают обработку гидрогеля и/или пептида/пептоида в препаратах, которые можно применять фармацевтически. Подходящий состав зависит от выбранного пути введения.

[00116] Для инъекции мутеин липокалина или соответствующую композицию можно составлять в водных растворах, например, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для чреcслизистого введения в составе применяют проникающие вещества, подходящие для барьера, подлежащего прониканию. Такие проникающие вещества, как правило, известны из уровня техники.

[00117] Для перорального введения мутеин липокалина или соответствующую композицию можно легко составлять посредством объединения их с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными из уровня техники. Такие носители обеспечивают возможность составлять мутеин липокалина или соответствующую композицию, а также фармацевтически активное соединение, если оно присутствует, в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом, подлежащим лечению. Фармацевтические препараты для перорального применения можно получить посредством добавления твердого наполнителя, необязательного измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул после добавления подходящих вспомогательных средств, при необходимости, для получения таблеток или ядер драже. Подходящие наполнители представляют собой, в частности, заполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон (PVP). При необходимости можно добавить разрыхлители, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

[00118] Ядра драже обеспечены подходящими покрытиями. С этой целью можно применять концентрированные растворы сахара, которые могут необязательно содержать аравийскую камедь, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакирующие растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты можно добавлять к покрытиям таблеток или драже для того, что идентифицировать или охарактеризовать разные комбинации доз активного соединения.

[00119] Фармацевтические препараты, которые можно применять перорально, включают твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметичные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого так глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с заполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах пептиды/пептоиды могут быть суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы. Все составы для перорального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения. Для трансбуккального введения композиции могут принимать форму таблеток или пастилок, составленных традиционным способом.

[00120] Мутеин липокалина по настоящему раскрытию можно составлять для парентерального введения посредством инъекции, например, посредством внутримышечных инъекций, или болюсной инъекции, или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут присутствовать в единичной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозных контейнерах, с добавленным консервантом. Соответствующие композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и могут содержать вспомогательные средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.

[00121] Мутеин липокалина по настоящему раскрытию можно также применять для нацеливания соединения на предварительно выбранный участок. В одном таком варианте осуществления мутеин липокалина по настоящему раскрытию применяют для нацеливания фармацевтически активного соединения на предварительно выбранный участок в организме или ткани, предусматривающего

a) конъюгирование мутеина липокалина с указанным соединением и

b) доставку мутеина липокалина/комплекса соединения в предварительно выбранный участок.

[00122] Для такой цели обеспечивают контакт мутеина с представляющим интерес соединением для обеспечения образования комплекса. Затем комплекс, содержащий мутеин и представляющее интерес соединение, доставляют в предварительно выбранный участок. Это, например, может быть достигнуто посредством сочетания мутеина с нацеливающим фрагментом, таким как антитело, фрагмент антитела или мутеин липокалина или фрагмент мутеина липокалина с аффинностью связывания в отношении выбранной мишени.

[00123] Это применение является, в частности, подходящим, но не ограничивается, для доставки лекарственного средства (выборочно) в предварительно выбранный участок в организме, такой как инфицированная часть тела, ткань или орган, который, как предполагают, подлежит лечению лекарственным средством. Помимо образования комплекса между мутеином и представляющим интерес соединением можно осуществлять реакцию мутеина с данным соединением с получением конъюгата мутеина и соединения. Подобно вышеуказанному комплексу такой конъюгат может являться подходящим для доставки соединения в предварительно выбранный сайт-мишень. Такой конъюгат мутеина и соединения может также включать линкер, который ковалентно связывает мутеин и соединение друг с другом. Необязательно такой линкер является стабильным в кровяном русле, но поддается расщеплению в клеточной среде.

[00124] Мутеины, раскрытые в данном документе, и их производные можно, таким образом, применять во многих областях, как и в случае их антител или фрагментов. В дополнение к их применению для связывания с подложкой, с обеспечением иммобилизации или отделения мишени данного мутеина или конъюгата или слитого белка этой мишени, мутеины можно применять для мечения ферментом, антителом, радиоактивным веществом или любой другой группой с биохимической активностью или определенными характеристиками связывания. При помощи такого подхода их соответствующие мишени или конъюгаты или их слитые белки можно выявлять или приводить в контакт с ними. Например, мутеины по настоящему раскрытию могут служить для выявления химических структур при помощи установленных аналитических способов (например, ELISA или вестерн-блоттинга) или при помощи микроскопического исследования или иммуносенсорных анализов. В данном случае сигнал для выявления может быть создан либо непосредственно путем применения подходящего конъюгата мутеина или слитого белка, либо опосредованно путем иммунохимического выявления связанного мутеина посредством антитела.

[00125] В медицине также существует множество возможных путей применения мутеинов по настоящему изобретению. В дополнение к их применению в диагностике и доставке лекарственного средства может быть создан мутантный полипептид по настоящему раскрытию, который связывается, например, с ткане- или опухолеспецифическими молекулами клеточной поверхности. Такой мутеин можно, например, применять в конъюгированной форме или в виде слитого белка для «иммуносцинтиграфии опухоли» или непосредственно для терапии рака.

[00126] В дополнительном аспекте настоящее раскрытие также охватывает применение мутеина согласно настоящему раскрытию для изготовления фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция, полученная таким образом, может подходить для лечения анемии. Фармацевтическую композицию можно применять в качестве монотерапии и в качестве комбинированной терапии. Соответственно, настоящее раскрытие также относится к мутеину, описанному выше, для лечения заболевания или нарушения, связанных с измененным, например повышенным или пониженным, уровнем GPC3, такого как анемия.

[00127] В еще одном аспекте настоящее раскрытие относится к применению мутеина согласно настоящему раскрытию в диагностировании. Применение мутеина согласно настоящему раскрытию, как правило, относится к диагностированию заболевания или нарушения, связанных с измененным уровнем GPC3, а также к соответствующему способу диагностирования.

[00128] Соответственно, настоящее раскрытие также относится к мутеину, описанному выше, для диагностирования заболевания или нарушения, связанных с измененным, например повышенным или пониженным, уровнем GPC3. В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой рак, в том числе без ограничения рак печени или меланому. Рак, подлежащий диагностированию, не является особенно ограниченным, и конкретные примеры могут включать рак печени, рак поджелудочной железы, холангиокарциному, рак легкого, рак толстой кишки, колоректальные злокачественные новообразования, неврофибросаркому, нейробластому, рак молочной железы, рак груди, рак яичников, рак предстательной железы, лейкоз и лимфому, опухоль Вильма, предпочтительно рак печени или (первичную/раннюю) гепатоклеточную карциному. (См. Sinnett D., GPC3 (glypican 3), Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2002; 6(3):206-208 (2002).

[00129] Также настоящее раскрытие относится к способу лечения опухоли или рака, при этом способ включает введение фармацевтической композиции, описанной в данном документе, содержащей мутеин по настоящему раскрытию, субъекту, нуждающемуся в этом. Аналогично этому, настоящее раскрытие относится к мутеину по настоящему раскрытию для применения в (способе) лечении опухоли или рака. Подобным образом, настоящее раскрытие касается применения мутеина по настоящему раскрытию для получения фармацевтической композиции для лечения опухоли или рака. Рак или опухоль, подлежащие лечению, не являются особенно ограниченными, и конкретные примеры могут включать рак печени, рак поджелудочной железы, холангиокарциному, рак легкого, рак толстой кишки, колоректальные злокачественные новообразования, неврофибросаркому, нейробластому, рак молочной железы, рак груди, рак яичников, рак предстательной железы, лейкоз и лимфому, опухоль Вильма, предпочтительно рак печени или (первичную/раннюю) гепатоклеточную карциному. (См. Sinnett D., GPC3 (glypican 3), Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2002; 6(3):206-208 (2002).

[00130] В еще одном аспекте настоящее раскрытие описывает диагностический или аналитический набор, содержащий мутеин согласно настоящему раскрытию.

[00131] Субъект, нуждающийся в таком лечении, может являться млекопитающим, таким как человек, собака, мышь, крыса, свинья, человекообразная обезьяна, такая как яванские макаки, при этом упомянуты лишь некоторые из иллюстративных примеров.

[00132] В еще одном аспекте настоящее раскрытие описывает способ для визуализации in vivo у субъекта, включающий введение указанному субъекту мутеина по настоящему раскрытию или фармацевтической композиции, содержащей мутеин по настоящему раскрытию. Субъект может быть определен, как описано выше.

[00133] Мутеин по настоящему раскрытию может быть конъюгирован с соединением, выбранным из группы, состоящей из органической молекулы, ферментной метки, радиоактивной метки, цветной метки, флуоресцентной метки, хромогенной метки, люминесцентной метки, гаптена, дигоксигенина, биотина, цитотоксического средства, токсина, металлокомплекса, металла и коллоидного золота.

[00134] Мутеин по настоящему раскрытию может быть слитым на его N-конце и/или его C-конце с партнером по слиянию, который представляет собой белок, белковый домен или пептид.

[00135] Мутеин по настоящему раскрытию может быть конъюгирован с соединением, которое продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления соединение, которое может продлевать время полужизни в сыворотке крови, выбрано из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, гидроксиэтилкрахмала, Fc-части иммуноглобулина, домена CH3 иммуноглобулина, домена CH4 иммуноглобулина, альбумин-связывающего пептида и альбумин-связывающего белка. В некоторых дополнительных вариантах осуществления полиалкиленгликоль представляет собой полиэтилен (ПЭГ) или его активированное производное.

[00136] В некоторых других вариантах осуществления партнер по слиянию мутеина представляет собой белковый домен, который продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови.

[00137] В некоторых дополнительных вариантах осуществления белковый домен представляет собой Fc-часть иммуноглобулина, домен CH3 иммуноглобулина, домен CH4 иммуноглобулина, альбумин-связывающий пептид или альбумин-связывающий белок.

[00138] Мутеин по настоящему раскрытию можно применять в (способе) терапии или диагностировании; например, применять в (способе) лечении или (способе) диагностировании опухоли, предпочтительно опухоли печени; или применять в (способе) подавлении роста опухоли; или применять в (способе) лечении или диагностировании опухоли печени.

[00139] Настоящее раскрытие дополнительно предусматривает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутеин по настоящему раскрытию. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью для обеспечения экспрессии указанной молекулы нуклеиновой кислоты. В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты входит в состав вектора или фагмидного вектора.

[00140] Настоящее раскрытие также раскрывает клетку-хозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему раскрытию.

[00141] Более того, настоящее раскрытие обеспечивает специалиста в данной области способом получения мутеина по настоящему раскрытию, где мутеин, фрагмент мутеина или слитый белок мутеина и другого полипептида получают, исходя из нуклеиновой кислоты, кодирующей мутеин, с помощью способов генной инженерии. В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутеин получают в организме-хозяине, представляющем собой бактерию или эукариоту, и выделяют из этого организма-хозяина или его культуры.

[00142] Настоящее раскрытие предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую мутеин по настоящему раскрытию и фармацевтически приемлемый наполнитель.

[00143] Настоящее раскрытие иллюстрирует применение мутеина по настоящему раскрытию для связывания/выявления GPC3, предусматривающее

(a) приведение мутеина в контакт с тестовым образцом, который, как предполагают, содержит GPC3, за счет чего обеспечивается образование комплекса между мутеином и GPC3, и

(b) выявление комплекса между мутеином и GPC3 посредством подходящего сигнала.

[00144] Настоящее раскрытие показывает специалисту способ лечения опухоли, при этом способ включает введение мутеина по настоящему раскрытию или его фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых дополнительных вариантах осуществления опухоль представляет собой рак печени, (первичную/раннюю) гепатоклеточную карциному, рак поджелудочной железы, холангиокарциному, рак легкого, рак толстой кишки, колоректальные злокачественные новообразования, неврофибросаркому, нейробластому, рак молочной железы, рак груди, рак яичников, рак предстательной железы, лейкоз и лимфому или опухоль Вильма.

[00145] Настоящее раскрытие обеспечивает способ выявления присутствия GPC3 в биологическом образце, включающий приведение образца в контакт с мутеином по настоящему раскрытию при условиях, которые обеспечивают образование комплекса мутеина и GPC3. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выявление комплекса мутеина и GPC3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления биологический образец выделяют из человека. В некоторых дополнительных вариантах осуществления образец содержит жидкость организма.

[00146] Настоящее раскрытие выявляет способ связывания GPC3 у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества одного или более мутеинов по настоящему раскрытию или одной или более композиций, содержащей такие мутеины.

[00147] Следует отметить, что как используется в данном документе, форма единственного числа включает множественные ссылки, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, упоминание «реагента» включает один или более таких разных реагентов, и упоминание «способа» включает упоминание эквивалентных стадий и способов, известных специалистам в данной области, которые могут быть модифицированы или заменены способами, описанными в данном документе.

[00148] Если не указано иное, термин «по меньшей мере», предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии. Специалистам в данной области будут понятны много эквивалентов конкретных вариантов осуществления по настоящему раскрытию, описанных в данном документе, или они будут способны установить их с помощью всего лишь проведения обычного эксперимента. Как предполагается, такие эквиваленты охватываются настоящим раскрытием.

[00149] По всему настоящему описанию и следующей формуле изобретения, если контекст не подразумевает иное, слово «содержать» и вариации, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, а не исключение какого-либо другого целого числа или шага или группы целых чисел или шагов. При использовании в данном документе термин «содержащий» можно заменить термином «включающий» или иногда при использовании в данном документе термином «имеющий».

[00150] При использовании в данном документе «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в элементе пункта формулы изобретения. При использовании в данном документе «состоящий, по сути, из» не исключает материалы или стадии, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики пункта формулы изобретения. В каждом случае в данном документе любые из терминов «содержащий», «состоящий, по сути, из» и «состоящей из» можно заменить любым из других двух терминов.

[00151] В тексте данного описания приводится несколько документов. Каждый из документов, приведенных в данном документе (в том числе все патенты, заявки на патент, научные публикации, технические паспорта, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В той степени, в которой материал, включенный посредством ссылки, противоречит или несовместим с настоящим описанием, настоящее описание будет превалировать над любым таким материалом. Ничто в данном документе не должно толковаться как признание того, что настоящее раскрытие не имеет права преподносить такое раскрытие в силу предшествующего изобретения.

[00152] Если не указано иное, применяли установленные способы технологии рекомбинантного гена, например, описанные в Sambrook et al. (2001) выше.

[00153] Дополнительные объекты, преимущества и особенности настоящего раскрытия станут очевидными специалистам в данной области при изучении следующих примеров и прилагаемых их фигур, которые не предназначены для ограничения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то, что настоящее раскрытие в особенности раскрыто с помощью иллюстративных вариантов осуществления и необязательных особенностей, к модификации и вариации раскрываемой информации, раскрытой в данном документе, могут прибегать специалисты в данной области и что такие модификации и вариации рассматриваются как часть объема настоящего раскрытия.

IV. ПРИМЕРЫ

[00154] Пример 1. Получение библиотек созревания и отбор оптимизированных мутеинов, специфически связывающихся с GPC3

[00155] Для оптимизации GPC3-специфических мутеинов создавали библиотеки на основе мутеина под SEQ ID NO: 3 и 4 с применением способов на основе либо несимметричной рандомизации выбранных положений, либо допускающей ошибки полимеразной цепной реакции (ПЦР). Несимметричная структура была создана таким образом, что для каждого из выбранных положений кодированная аминокислота соответствовала аминокислоте, обнаруженной в соответствующем материнском клоне с вероятностью 50-70%, тогда как она может быть другой аминокислотой с вероятностью 50-30%. С применением N, представляющим собой количество целевых положений, и B в качестве смещения наиболее вероятное количество обменов на один клон составляет N×(1-B). Для облегчения экспрессии в эукариотических клетках посредством мутации N65D удаляли полученный из hNGAL природный сайт N-гликозилирования N65; и что касается других потенциальных участков N-гликозилирования (Asn-X-Ser/Thr), вероятность возникновения была уменьшена посредством установки смещения в этих положениях библиотеки. Удаление SS-мостиков в выбранных библиотеках осуществляли посредством установки 50% смещения с помощью валина в качестве основной аминокислоты в положении C76 и посредством мутации C175A.

[00156] Фаговый дисплей применяли для выбора оптимизированных мутеинов с улучшенными термостабильностью и аффинностью связывания. Отбор фагмид осуществляли с повышенной точностью по сравнению с исходными отборами мутеина, и он включал стадии предварительной инкубации при повышенной температуре и ограничении концентрации мишени, среди прочего.

[00157] Пример 2. Идентификация мутеинов с улучшенным связыванием с GPC3 и улучшенной термостабильностью с применением высокопроизводительного скрининга ELISA

[00158] Отдельные колонии применяли для инокулирования среды 2xYT/Amp и выращивали в течение ночи (14-18 часов) до стационарной фазы. Далее 50 мкл 2xYT/Amp инокулировали из культур на стационарной фазе и инкубировали в течение 3 часов при 37°C, а затем осуществляли сдвиг до 22°C до того, пока не было достигнуто OD₅₉₅ 0,6-0,8. Получение мутеины индуцировали добавлением 10 мкл 2xYT/Amp, дополненной 1,2 мкг/мл ангидротетрациклина. Культуры инкубировали при 22°C до следующего дня. После добавления 40 мкл 5% (вес/об.) BSA в PBS/T и инкубации в течение 1 часа при 25°C культуры были готовы к применению в скрининговом исследовании. В то время как 20 мкл культур непосредственно наносили на скрининг-планшет для ELISA, остаточный объем инкубировали при 65°С в течение 1 ч.

[00159] Связывание выделенных мутеинов с GPC3 исследовали посредством нанесения на микротитровальные планшеты смеси 1:1 нейтравидина и стрептавидина (5 мкг/мл в PBS) в течение ночи при 4°C. После блокирования планшета с помощью 2% BSA в PBST осуществляли захват биотинилированного GPC3 на покрытых микротитровальных планшетах в концентрации 1 мкг/мл в PBS/T. Далее 20 мкл заблокированных BSA культур (с предварительным тепловым инкубированием или без него) добавляли в микротитровальные планшеты и инкубировали в течение 1 часа при 25°C. Связанные мутеины выявляли с помощью антитела к Streptag, конъюгированного с пероксидазой хрена (инкубирование в течение 1 часа; 2-1509-001; IBA). Для количественного анализа добавляли 20 мкл флуорогенного субстрата пероксидазы QuantaBlu и флюоресценцию определяли при длине волны возбуждения 330 нм и длине волны излучения 420 нм.

[00160] Кроме того, применяли форматы обратного скрининга, где осуществляли захват мутеинов посредством Streptag на микротитровальных планшетах, покрытых антителом к Streptag, и добавляли разные концентрации биотинилированной мишени, и выявляли посредством Extravidin-HRP (E2886; Sigma).

[00161] Клоны затем секвенировали на основе результатов скрининга и мутеины отбирали для дополнительной характеризации. После отбора оптимизированных мутеинов липокалина вводили мутацию His 28 → Gln для дополнительной оптимизации стабильности.

[00162] Пример 3. Экспрессия мутеинов

[00163] Уникальные мутеины экспрессировали с C-концевой последовательностью SAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 17); в том числе линкером SA и Strep-tag® II, WSHPQFEK (SEQ ID NO: 18) в E. coli в среде 2YT-Amp для очищения мутеинов после экспрессии с применением афинной хроматографии Streptactin и препаративной эксклюзионной хроматографии.

[00164] Пример 4. Измерение аффинности связывания в отношении GPC3 человека и мыши посредством поверхностного плазмонного резонанса

[00165] Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) применяли для измерения кинетики и аффинности связывания оптимизированных мутеинов липокалина, раскрытых в данном документе.

[00166] Анализ SPR связывания оптимизированных мутеинов Lcn2 с GPC3 человека и мыши осуществляли при 25°C на устройстве Biacore T200 (GE Healthcare) с применением HBS-EP+ (1x; BR-1006-69; GE Healthcare) в качестве подвижного буфера. Набор для захвата биотина Biotin CAPture (GE Healthcare) применяли для иммобилизации биотинилированного GPC3 на поверхности чипа. GPC3 человека (2119-GP; R&D systems) и GPC3 мыши (6938-GP; R&D systems) биотинилировали с применением стандартных химических методик NHS. Неразведенный реагент набора для захвата биотина Biotin CAPture (стрептавидин, конъюгированный с олигонуклеотидом ss-DNA) фиксировали на сенсорном чипе CAP с предварительно иммобилизированном комплементарным олигонуклеотидом ss-DNA. Затем биотинилированный GPC3 человека или мыши при концентрации 1 мкг/мл наносили в течение 300 с при скорости потока 5 мкг/мл.

[00167] Мутеины Lcn2 наносили в концентрациях 10 нМ, 40 нМ и 160 нМ при скорости потока 30 мкл/мин. Разведения вводили при времени ассоциации 180 с и времени диссоциации 600 с получением данных ka и kd. Восстановления поверхности чипа достигали посредством введения 6 M гуанидиний-HCl + 0,25 M NaOH (120 с) при скорости потока 10 мкл/мин. После введения восстанавливающих растворов следовала дополнительная стадия промывания с помощью H₂O и период стабилизации, составляющий 120 с.

[00168] Данные сравнивали с таковыми для двух контрольных образцов посредством вычитания соответствующих сигналов, измеренных для контрольного канала (загруженный только реагентом для захвата биотина) и посредством вычитания введений буфера из ответов связывания. Константу скорости ассоциации ka и константу скорости диссоциации kd для реакции связывания определяли с применением программного обеспечения для оценки Biacore T200 V2.0 для обработки данных и выравнивания кинетичеких измерений. Данные в целом выравнивали с 1:1 моделью связывания.

[00169] Значения, определенные для ka, kd и полученной равновесной константы диссоциации (K_D) для SEQ ID NO: 3 и 4 и оптимизированных мутеинов под SEQ ID NO: 5-16, подытожены в таблице 1. Оптимизированные GPC3-специфические мутеины липокалина связываются с GPC3 как человека, так и мыши с аффинностью от пикомолярной до низкой наномолярной, и значения аффинности улучшаются до 30 раз после оптимизации.

[00170] Таблица 1. Значения аффинности, константы скорости ассоциации ka и константы скорости диссоциации kd оптимизированных мутеинов в отношении GPC3 человека и мыши, определенные посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

GPC3 человека GPC3 мыши SEQ ID NO: ka [M^-1 с^-1] kd [с^-1] K_D [нМ] ka [M^-1 с^-1] kd [с^-1] K_D [нМ] 3 5,6E+05 2,2E-04 0,387 4,5E+05 3,0E-04 0,674 7 1,3E+06 1,3E-04 0,097 1,0E+06 1,5E-04 0,145 5 1,6E+06 2,0E-04 0,119 1,3E+06 2,6E-04 0,207 6 1,8E+06 3,3E-05 0,019 2,2E+06 4,2E-05 0,019 4 2,5E+06 2,2E-03 0,877 2,6E+06 2,8E-03 1,091 13 2,6E+06 1,8E-04 0,070 2,7E+06 2,4E-04 0,090 9 1,8E+06 9,8E-05 0,054 2,0E+06 1,5E-04 0,075 8 2,0E+06 1,3E-04 0,068 1,9E+06 1,8E-04 0,096 10 1,8E+06 1,2E-04 0,063 1,8E+06 1,7E-04 0,093 12 6,5E+06 2,4E-04 0,037 5,1E+06 3,0E-04 0,058 11 1,7E+06 4,6E-05 0,027 2,9E+06 3,2E-05 0,011 14 2,4E+06 2,0E-03 0,819 2,0E+06 3,1E-03 1,594 15 1,4E+06 4,9E-05 0,035 1,3E+06 9,1E-05 0,072 16 6,7E+05 1,1E-04 0,171 6,1E+05 1,9E-04 0,311

Пример 5. Связывание оптимизированных мутеинов липокалина с клетками SK-HEP-1, трансфицированными GPC3 человека, яванского макака и мыши

[00171] Клетки SK-HEP-1 из банка клеток DSMZ, которые не экспрессируют выявляемые уровни эндогенного GPC3, что определено посредством проточной цитометрии, стабильно трансфицировали с помощью вектора экспрессии, кодирующего GPC3 человека, яванского макака и мыши. Контрольные клетки с пустым вектором также получали и анализировали параллельно.

[00172] Связывание оптимизированных мутеинов липокалина под SEQ ID NO: 5-16 с GPC3 человека, яванского макака и мыши по сравнению с SEQ ID NO: 3 и 4 исследовали на клетках SK-HEP-1 с применением формата ECL (фигура 1). В этом эксперименте серии разведений мутеинов липокалина инкубировали на планшетах MSD, покрытых клетками SK-HEP-1, сверхэкспрессирующими GPC3 человека, яванского макака и мыши.

[00173] Все стадии инкубации осуществляли при комнатной температуре и планшеты промывали после каждой стадии инкубации с помощью 80 мкл буфера PBS два раза с применением устройства для избирательного промывания планшетов с глубокими лунками Biotek EL405.

[00174] На первой стадии 384-луночный планшет предварительно покрывали на 5 минут поли-D-лизином и дважды промывали с помощью PBS. 10000 клеток SK-HEP-1 на лунку высевали и обеспечивали прилипание в течение ночи при 37°C. После промывания покрытые клетками лунки блокировали с помощью 60 мкл PBS/казеина (0,1% казеина в PBS).

[00175] SEQ ID NO: 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 и 16 (с применением 1000 нМ в качестве начальной концентрации) серийно разводили в соотношении 1:3 до пикомолярного диапазона в PBS/казеине. В покрытые SK-HEP-1 планшеты переносили 20 мкл серий разведений на 1 час при комнатной температуре.

[00176] Для обеспечения выявления и количественного анализа связанных GPC3-специфических мутеинов липокалина остаточные надосадочные жидкости удаляли и в лунки добавляли 20 мкл смеси антитела кролика к остову (2 мкг/мл) и меченного Sulfotag антитела кролика (5 мкг/мл), полученной в PBS/казеине, и инкубировали в течение 1 ч. при к.т. После промывания в каждую лунку добавляли 35 мкл буфера для считывания без поверхностно-активных веществ и интенсивность ECL в каждой лунке считывали с применением считывающего устройства MSD.

[00177] Приведение в соответствие кривой осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 4.

[00178] Большинство оптимизированных GPC3-специфических мутеинов Lcn2 связывались с клетками SK-HEP-1, трансфицированными GPC3 человека, мыши или яванского макака, с улучшенными значениями EC50 по сравнению с SEQ ID NO: 3 и 4. Иллюстративные кривые связывания показаны на фигуре 1, и значения EC50 для связывания с SK-HEP-1::GPC3 человека, SK-HEP-1::GPC3 мыши и SK-HEP-1::GPC3 яванского макака обобщены в таблице 2.

[00179] Таблица 2. Значения EC50 для связывания оптимизированных мутеинов липокалина по сравнению с SEQ ID NO: 3 и 4 с иммобилизированными клетками SK-HEP-1, трансфицированными GPC3 человека, мыши или яванского макака соответственно, полученные в анализе связывания клеток на основе MSD. Большинство оптимизированных мутеинов проявляют более низкие значения EC50 по сравнению с SEQ ID NO: 3 и 4, что указывает на улучшенное связывания с GPC3, экспрессированным на клетках. Все мутеины проявляют перекрестную реактивность с GPC3 мыши и яванского макака.

SEQ ID NO: EC50 [нМ]
SK-HEP-1::
GPC3 человека EC50 [нМ]
SK-HEP-1::
GPC3 мыши EC50 [нМ]
SK-HEP-1::
GPC3 яванского макака 3 24,3 29,8 29,9 7 2,5 4,8 2,8 5 24,1 25,6 33,9 4 10,2 7,1 5,7 13 0,9 2,9 0,6 9 1,1 4,1 1,9 8 1,4 5,3 2,3 10 0,8 3,8 0,8 12 2,0 5,3 1,7 14 9,5 6,7 15,4 15 1,6 4,8 1,6 16 2,2 4,4 2,5

[00180] Пример 6. Измерение термостабильности посредством флуоресцентного анализа термической денатурации

[00181] Анализ термической денатурации на основе флуоресценции (обычно упоминаемый как анализ теплового сдвига дифференциальной сканирующей флюорометрии) применяли для измерения термостабильности мутеинов Lcn2, специфических в отношении GPC3 человека, с применением системы Mx3005P для qPCR (Agilent Technologies).

[00182] Растворы мутеина липокалина разводили до концентрации 10 мкМ в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS; pH 7,4; 10010; Life Technologies) и получали исходный раствор, разведенный в 15 раз в PBS флуоресцентного красителя SYPRO Orange (5000x концентрат в DMSO; S-6650; Life technologies). В планшете для qPCR (FrameStar 96 без кромки; № по кат. 4ti-0711; 4titude) 20 мкл разведения белка смешивали с 5 мкл исходного раствора SYPRO Orange и планшет герметизировали крышками (плоские оптически прозрачные крышки; № по кат. 4Ti-0751; 4titude). С применением системы Mx3005P для qPCR планшет постепенно нагревали с 25°C до 100°C (45 с/стадия), в то время как сигнал флуоресценции регистрировался при длине волны возбуждения 492 нм и длине волны излучения 610 нм.

[00183] Повышение флуоресценции указывает на разворачивание белка, поскольку SYPRO Orange неспецифически связывается с гидрофобными поверхностями, и вода сильно гасит флуоресценцию Sypro Orange. (См. Kranz J. and Schalk-Hihi, C., Protein thermal shifts to identify low molecular weight fragments, Methods Enzymol. 493. 277-298 (2011).

[00184] Сглаживание Савицкого-Голея (5x фильтр Савицкого-Голея) применяли в отношении первичных данных (сигнал флуоресценции относительно температуры) и рассчитывали первую производную. Для определения температуры плавления Tm максимальное значение первой производной (соответствующее точке перегиба кривой флуоресценции относительно температуры) считывали и согласовывали с соответствующей температурой (=Tm). Полное оценивание осуществляли в Microsoft Excel.

[00185] Значения температуры плавления (Tm) мутеинов липокалина, определенные в описанном выше анализе теплового сдвига, собраны в таблице 3.

[00186] Таблица 3. Значения температуры плавления (Tm) оптимизированных мутеинов липокалина, специфических в отношении GPC3, определенные в анализе теплового сдвига с применением красителя SYPRO Orange. Для оптимизированных мутеинов липокалина повышение температуры плавления составляет до 14°C по сравнению с неоптимизированными мутеинами.

SEQ ID NO: Tm [°C] 3 58 7 67 5 65 6 65 4 55 13 68 9 68 8 68 10 69 12 64 11 58 14 61 15 52 16 53

[00187] Пример 7. Оценка стабильности при хранении в буфере и плазме крови выбранных оптимизированных GPC3-специфических мутеинов липокалина

[00188] Для оценки стабильности при хранении иллюстративных выбранных мутеинов (SEQ ID NO: 7, 9 и 10) в неоптимизированном составе (PBS, pH 7,4) и плазме крови человека и мыши осуществляли следующие исследования стабильности.

[00189] Для исследования стабильности при хранении в буфере мутеины разводили до концентрации 1 мг/мл в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор, pH 7,4; 10010; Life Technologies) и одну аликвоту инкубировали в течение 1 недели при 42°C, в то время как контрольную аликвоту замораживали при -20°C. Активный мутеин измеряли в установке для количественного ELISA. Мономерный белок измеряли с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии.

[00190] Для оценки стабильности в образцах плазмы крови получали разведения мутеина в 50% плазме крови человека или мыши в PBS в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали при 37°C в течение 1 недели (контрольную аликвоту препарата немедленно замораживали при -20°C). Концентрацию активного мутеина оценивали посредством qELISA.

[00191] Для анализа активности белка применяли следующий ELISA. 384-Луночный полистирольный планшет (Greiner FLUOTRAC™ 600; черное плоское дно, высокая степень связывания) покрывали с помощью 20 мкл GPC3 (2119-GP; R&D Systems) в концентрации 5 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°C. После промывания лунки блокировали с помощью 100 мкл блокирующего буфера (2% вес/об. BSA в PBS, содержащем 0,1% об./об. Tween-20). Планшет промывали и 20 мкл соответствующим образом разведенного стандарта белка из не подвергнутого стрессу контрольного образца (хранили при -20°C после получения) или подвергнутого стрессу образца переносили в планшет для ELISA и инкубировали. Для выявления связанного с планшетом белка промывали планшет для ELISA, остаточные надосадочные жидкости удаляли и добавляли 20 мкл меченного HRP антитела к hNGAL при предопределенной оптимальной концентрации в блокирующем буфере и инкубировали. После промывания 20 мкл флуорогенного субстрата с HRP (QuantaBlu; Pierce) добавляли в каждую лунку и обеспечивали протекание реакции в течение 5 минут. Интенсивность флуоресценции каждой лунки на планшете считывали с применением устройства для считывания флуоресценции микропланшетов (Tecan).

[00192] Если не указано иное, все стадии инкубации осуществляли в течение 1 часа при комнатной температуре и после каждой стадии инкубации планшет промывали с помощью 100 мкл буфера PBS-T (PBS; 0,05% Tween 20) пять раз с применением устройства для избирательного промывания планшетов с глубокими лунками Biotek ELx405.

[00193] Для описанного выше ELISA получали калибровочную кривую, включающую 11 разведений мутеина, как правило в диапазоне 0,01-1000 нг/мл, и для каждого образца получали три различных независимых разведения в линейном диапазоне калибровочной кривой. Для разведений применяли блокирующий буфер, необязательно дополненный 1% плазмы крови человека или мыши.

[00194]Калибровочную кривую строили с применением 4-параметрической логистической (4PL) модели криволинейной регрессии и применяли для рассчитывания концентраций активного белка для тестируемых образцов. Определенные концентрации активного белка сравнивали относительно не подвергнутого стрессу контрольного образца, хранившегося при -20°C в такой же концентрации и в таком же матриксе.

[00195] Аналитическую эксклюзионную хроматографию осуществляли на системе Agilent HPLC с двумя колонками Superdex 75 5/150 GL (GE Healthcare) подряд с применением PBS (10010; Life Technologies) в качестве элюента при скорости потока 0,3 мл/мин.

[00196]Результаты исследования стабильности при хранении в PBS, pH 7,4, и плазме крови человека и мыши подытожены в таблице 4.

[00197] Таблица 4. Стабильность при хранении в неоптимизированном составе (PBS; 1 неделя; 42°C), плазме крови человека и мыши (1 неделя; 37°C) оценивали по восстановлению активности в qELISA и содержанию мономера в аналитической SEC: стабильный в qELISA = 100 +/- 15% (восстановление активности мутеина по сравнению с не подвергнутым стрессу контрольным образцом); стабильный в aSEC = 100 +/- 5% (восстановление площади пика мономера по сравнению с не подвергнутым стрессу контрольным образцом). Для всех образцов, в том числе контролей было выявлено содержание мономера в 100 процентах площади.

Плазма крови человека:
1 неделя при 37°C Плазма крови мыши:
1 неделя при 37°C PBS:
1 неделя при 42°C SEQ ID NO: Восстановление активности мутеина [%] Восстановление активности мутеина [%] Восстановление активности мутеина [%] Восстановление площади пика мономера [%] 7 98 105 93 103 9 92 101 96 105 10 105 95 101 98

[00198] Варианты осуществления, иллюстративно описанные в данном документе, надлежащим образом можно осуществлять на практике в отсутствие любых элемента или элементов, ограничения или ограничений, не раскрытых конкретно в данном документе. Таким образом, например, термины «содержащий», «включающий», «состоящий» и т.д. следует толковать расширительно и без ограничений. Кроме того, термины и выражения, используемые в данном документе, использовали в качестве терминов описания, а не ограничения, и в использовании таких терминов и выражений нет намерения исключить любые эквиваленты показанных и описанных особенностей или их частей, но следует понимать, что разные модификации возможны в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то, что данные варианты осуществления были конкретно раскрыты с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных особенностей, к их модификации и вариациям могут прибегать специалисты в данной области, и что такие модификации и вариации рассматриваются как часть объема настоящего изобретения. Все патенты, патентные заявки, руководства и отрецензированные публикации, описанные в данном документе, в данный документ включены посредством ссылки в полном объеме. Кроме того, в тех случаях, когда определение или использование термина в ссылочном материале, который включен посредством ссылки в данный документ, не согласуется или противоречит определению такого термина, представленному в данном документе, применяется определение термина, представленное в данном документе, а определение термина из ссылки не применяется. Каждое из более узких видов и субродовых группировок, находящихся в пределах родового раскрытия, также образует часть настоящего изобретения. Это включает родовое описание настоящего изобретения с ограничением или отрицательным признаком, удаляющим любой объект из рода, независимо от того, исключенный материал конкретно изложен в данном документе или нет. К тому же, в тех случаях, когда особенности описаны в контексте группы Маркуша, специалистам в данной области будет понятно, что настоящее раскрытие также таким образом раскрыто в контексте любого отдельного представителя или подгруппы представителей группы Маркуша. Дополнительные варианты осуществления будут очевидны из следующей формулы изобретения.

[00199] Эквиваленты. Специалистам в данной области будут понятны многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, или они будут способны установить их с помощью всего лишь проведения обычного эксперимента. Как предполагается, такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, таким образом, включены посредством ссылки в настоящее описание в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, отдельный патент или отдельная патентная заявка были конкретно и отдельно указаны как включенные в данный документ посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>ПиерисЭйДжи

<120>МУТЕИНЫ ЛИПОКАЛИНА 2 ЧЕЛОВЕКА С АФФИННОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ГЛИПИКАНА-3 (GPC3)

<130>PIE15296PCT

<150>EP15167922.2

<151> 2015-05-18

<160> 30

<170>PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>NGAL дикоготипа

<400> 1

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gln Lys Met TyrAla Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile

65 70 75 80

Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

AspGly

<210> 2

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>NGAL98 дикого типа

<400> 2

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Gln Lys Met TyrAla Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile

65 70 75 80

Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn

85 90 95

Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

AspGly

<210> 3

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина - исходный NGAL (P019-Seq2 - S375.1 M1.1 A16)

<400> 3

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Ala Met Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Leu Lys Met ArgAla Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Gly Val Ser Phe Trp Arg Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp

85 90 95

Ile Lys Ser Gly Pro Gly Gln Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Ala Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 4

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина - исходный NGAL (P019-Seq 3 - S375.2 M1.1 M2)

<400> 4

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met ArgAla Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Met Lys Lys Cys Met Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 5

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05N06M1)

<400> 5

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Ala Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Leu Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Val Val Ser Phe Trp Arg Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp

85 90 95

Ile Lys Ser Gly Pro Gly Gln Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Ala Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 6

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05K19M1)

<400> 6

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Val Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Gly Val Ser Phe Arg Gly Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asp

85 90 95

Ile Lys Ser Gly Pro Gly Glu Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 7

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05O04M1)

<400> 7

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Val Ala Gly Asn Gly Met Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Leu Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Ser Val Ala Phe Arg Asn Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Gly Pro Gly Glu Thr Ser Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Arg Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 8

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02J22M1)

<400> 8

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Leu Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 9

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02B06M1)

<400> 9

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Thr Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 10

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02L21M1)

<400> 10

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Gly Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Val Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Pro

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Ser Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 11

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02A11M1)

<400> 11

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Ala Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Leu Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Tyr Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 12

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.09P24M1)

<400> 12

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Ala Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Val Phe Ala Gly Lys Lys Cys Lys Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Pro Gly Asn ThrAla Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 13

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02N03M1)

<400> 13

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Leu Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Arg Lys Lys Cys Met Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Ser Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 14

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.10I10M1)

<400> 14

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Trp Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Arg Phe Ala Gly Lys Lys Val Lys Tyr Thr Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn ThrAla Thr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp GlnAla Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 15

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.10D09M1)

<400> 15

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Gly Val Arg Phe Gly Glu Lys Lys Ile Lys Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Gln Pro Gly Asp Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp GlnAla Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 16

<211> 178

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.04M18M2)

<400> 16

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Arg Ala Gly Asn Val Gly Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

Pro Lys Met Arg Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Val Thr Gly Val Arg Phe Asp Ser Lys Lys Val Thr Tyr Ser Ile

65 70 75 80

Gly Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Gln

85 90 95

Ile Lys Ser Glu Pro Gly Asn Thr Ala Asn Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Tyr Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp GlnAla Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 17

<211> 10

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223>Линкер SA и Strep-tag II

<400> 17

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 8

<212>БЕЛОК

<213>искусственный

<220>

<223> Strep-tag II

<400> 18

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 19

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05N06M1)

<400> 19

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatgct 120

ctgctgcgtg aggataagga tccgcttaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgttgtgtct ttttggagga agaaatgcca ttacaagatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagtggg 300

ccgggccaga catcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgag gcagaaccgc gagtggtttg ctatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 20

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05K19M1)

<400> 20

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatgtt 120

cgtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cggtgtgtct tttcggggga agaaatgcca ttacaagatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcgatat taaaagtggt 300

ccgggcgaga catcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgag gcagaaccgc gagtggtttt ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 21

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.05O04M1)

<400> 21

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcgttgc cggaaatggt 120

atgctgcgtg aggataagga tccgcttaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cagtgtggct tttcggaata agaaatgcca ttacaagatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtggt 300

ccgggcgaga catcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgag gcagaaccgc gagtggtttt ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 22

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02J22M1)

<400> 22

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtg 120

gggctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtgagg tttgctagga agaaatgctt gtactcgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtgag 300

ccgggcaata cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 23

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02B06M1)

<400> 23

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtg 120

ggtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtgagg tttgctagga agaaatgcac gtactcgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtgag 300

ccgggcggta cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 24

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02L21M1)

<400> 24

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatggg 120

gctctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtgagg tttgctagga agaaatgcgt gtactcgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcccgat taaaagtgag 300

ccgggcaata cagcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 25

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02A11M1)

<400> 25

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtt 120

gctctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cgctgtgagg tttgctagga agaaatgcct gtactcgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccggat taaaagtgag 300

ccgggctata cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 26

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.09P24M1)

<400> 26

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtg 120

gctctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtggtg tttgctggga agaaatgcaa gtactcgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccggat taaaagtccg 300

ccgggcaata cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 27

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.02N03M1)

<400> 27

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatctg 120

ggtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtgagg tttgctagga agaaatgcat gtactctatt 240

ggtacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtgag 300

ccgggcagta cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534

<210> 28

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.10I10M1)

<400> 28

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtg 120

ggtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgtgggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac caatgtgagg tttgctggga agaaagttaa gtacacgatt 240

gggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtgag 300

ccgggcaata cagcaacttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcacact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534

<210> 29

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.10D09M1)

<400> 29

caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60

aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcagggc cggaaatgtg 120

ggtctgcgtg aggataagga tccgcctaaa atgagggcga ccatttacga gttgaaagaa 180

gataaatcat atgacgtcac cggtgtgagg tttggtgaga agaaaattaa gtactcgatt 240

ggtacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggccagat taaaagtcag 300

ccgggcgata cagcaaattt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360

gtgttcttca aggaggtgta tcagaaccgc gagatttttt ttatcatact gtacgggcgc 420

acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480

ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc aggctatcga cggc 534

<210> 30

<211> 534

<212>ДНК

<213>искусственная

<220>

<223>Мутеин липокалина (S0569.04M18M2)

<400> 30

caggactccacctcagacctgatcccagccccacctctgagcaaggtccctctgcagcag 60

aacttccaggacaaccaattccaagggaaatggtatgtcgtgggccgggccggaaatgtg 120

ggtctgcgtgaggataaggatccgcctaaaatgagggcgaccatttacgagttgaaagaa 180

gataaatcatatgacgtcaccggtgtgaggtttgattctaagaaagtgacgtactctatt 240

gggacctttgtgccggggagccagccgggcgagtttactttaggccagattaaaagtgag 300

ccgggcaatacagcgaatttggtccgcgtcgtgagcaccaactacaaccagcatgccatg 360

gtgttcttcaaggaggtgtatcagaaccgcgagattttttttatcatactgtacgggcgc 420

acgaaagaactgacaagcgagctgaaggaaaattttatccgcttttccaaatctctgggc 480

ctccctgaaaaccacatcgtcttccctgtcccaatcgaccaggctatcgacggc 534

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению мутеинов липокалина человека, которые специфически связывают глипикан-3 (GPC3), и может быть использовано в медицине для лечения рака, клетки которого экспрессируют GPC3. Мутантный липокалин получают на основе зрелого ассоциированного с желатиназой нейтрофилов липокалина человека (hNGAL). Полученные мутеины используют также в составе конъюгатов и слитых белков с соединением, которое удлиняет время полужизни мутеина в сыворотке крови. Изобретение позволяет получить мутеины липокалина, специфически связывающие GPC3 с аффинностью, характеризующейся значением KD, составляющим 0,3 нМ или ниже. 11 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Мутеин ассоциированного с желатиназой нейтрофилов липокалина человека (hNGAL), специфически связывающий глипикан-3 (GPC3) с аффинностью, характеризующейся значением K_D, составляющим 0,3 нМ или ниже, где аминокислотная последовательность мутеина содержит один из следующих наборов подвергнутых мутации аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL, показанной под SEQ ID NO: 1:

(a) Leu 36 → Val; Ile 41 → Leu; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Val; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Trp; Lys 73 → Arg; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Gln; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp и Lys 134 → Ala;

(b) Leu 36 → Val; Ala 40 → Val; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Lys 73 → Gly; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Asp; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp и Lys 134 → Phe;

(c) Leu 36 → Val; Ala 40 → Gly; Ile 41 → Met; Gln 49 → Leu; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Leu 70 → Ala; Lys 73 → Asn; Asp 77 → His; Trp 79 → Lys; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gly; Leu 103 → Glu; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Arg; Tyr 132 → Trp и Lys 134 → Phe;

(d) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Thr 136 → Ile;

(e) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Gly; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Thr 136 → Ile;

(f) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Gly; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Val; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Pro; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Thr 136 → Ile;

(g) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Leu; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Tyr; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Thr 136 → Ile;

(h) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Ala; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Val; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Arg; Tyr 100 → Pro; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Thr 136 → Ile;

(i) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Leu; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Arg; Asp 77 → Met; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Ser; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile и Lys 134 → Phe;

(j) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Trp; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Asn; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Ala; Lys 73 → Gly; Cys 76 → Val; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Thr; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Thr; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe и Cys 175 → Ala;

(k) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Gly; Lys 73 → Glu; Cys 76 → Ile; Asp 77 → Lys; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Gln; Leu 103 → Asp; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile и Cys 175 → Ala; или

(l) Leu 36 → Arg; Ala 40 → Val; Ile 41→ Gly; Gln 49 → Pro; Tyr 52 → Arg; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Arg; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Ser; Cys 76 → Val; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ser; Arg 81 → Gly; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Gln; Tyr 100 → Glu; Leu 103 → Asn; Ser 105 → Ala; Tyr 106 → Asn; Lys 125 → Glu; Ser 127 → Tyr; Tyr 132 → Ile; Lys 134 → Phe; Thr 136 → Ile и Cys 175 → Ala;

где мутеин характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-16.

2. Мутеин по п. 1, где мутеин связывает GPC3 с более сильной аффинностью связывания, чем мутеин с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 3, при измерении с помощью анализа с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

3. Мутеин по п. 1, где мутеин характеризуется более низким значением EC50 по сравнению с мутеином с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 4 при связывании с GPC3 человека, мыши или яванского макака.

4. Мутеин по п. 1, где мутеин является более стабильным, чем мутеин с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 3.

5. Мутеин по п. 1, где мутеин содержит такую же аминокислоту, что и зрелый hNGAL, показанный под SEQ ID NO: 1, в положении последовательности, соответствующем положению 28 последовательности в линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL, показанной под SEQ ID NO: 1.

6. Мутеин по п. 1, где природный сайт N-гликозилирования, в остатке Asn, в положении 65 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL, показанной под SEQ ID NO: 1, удален в соответствующем положении последовательности указанного мутеина.

7. Мутеин по любому из пп. 1-6, где мутеин не содержит сайт N-гликозилирования.

8. Мутеин по любому из пп. 1-7, где мутеин характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-16.

9. Мутеин по любому из пп. 1-8, где мутеин имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-16.

10. Конъюгат для связывания GPC3, содержащий мутеин по любому из пп. 1-9, где мутеин конъюгирован с соединением, которое продлевает время полужизни мутеина в сыворотке крови, выбранным из группы, состоящей из молекулы полиалкиленгликоля, полиэтиленгликоля (ПЭГ) или его активированного производного, и гидроксиэтилкрахмала.

11. Слитый белок для связывания GPC3, содержащий мутеин по любому из пп. 1-9, где мутеин слит на своем N-конце и/или своем С-конце с партнером по слиянию, который представляет собой белок, белковый домен или пептид.

12. Слитый белок по п. 11, где партнер по слиянию выбран из группы, состоящей из Fc-части иммуноглобулина, домена C_H3 иммуноглобулина, домена C_H4 иммуноглобулина, альбумин-связывающего пептида и альбумин-связывающего белка.

13. Фармацевтическая композиция для лечения рака, клетки которого экспрессируют GPC3, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного мутеина по любому из пп. 1-9, конъюгата по п. 10 или слитого белка по п. 11 или 12, и один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

14. Молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии мутеина по любому из пп. 1-9, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую мутеин по любому из пп. 1-9.

15. Молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии слитого белка по п. 11 или 12, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок по п. 11 или 12.

16. Клетка-хозяин для экспрессии мутеина по любому из пп. 1-9, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 14, где молекула нуклеиновой кислоты по п. 14 функционально соединена с одной или более регуляторными последовательностями для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п. 14.

17. Клетка-хозяин для экспрессии слитого белка по п. 11 или 12, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 15, где молекула нуклеиновой кислоты по п. 15 функционально соединена с одной или более регуляторными последовательностями для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по п. 15.

18. Способ получения мутеина по любому из пп. 1-9, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 16 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по п. 14.

19. Способ получения слитого белка по п. 11 или 12, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 17 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по п. 15.

20. Способ лечения рака, клетки которого экспрессируют GPC3, у субъекта, включающий введение указанному субъекту эффективного количества мутеина по любому из пп. 1-9, конъюгата по п. 10, слитого белка по п. 11 или 12 или фармацевтической композиции по п. 13.