Способ ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводными группами Российский патент 2021 года по МПК A61K31/00 C12N11/02 C12N9/00 C12P1/00 C12P7/00 C07D309/02 

Изобретение относится к области биотехнологической промышленности, биоорганического синтеза и служит для получения α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводными, а именно арильными и алкильными, группами, ферментативным способом с целью создания предшественников для синтеза сложных фармакофорных соединений, используемых для диагностикумов, доставки лекарств, создания биочипов, а также как субстраты для анализа активности ферментов: Carbohydrate Research. 2019. Т. 485, 107806 [1]; Bioorg. Khim. 2004. Т. 30, №2, С. 156-167 [2].

Известен способ получения α-L-дифукопиранозидов с алкильной (пропильной) группой методами органического синтеза: [2]; Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Москва, 2010 [3], а также способ получения α-L-дифукопиранозида: Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Москва, 2015 [4], содержащего две ортогональные защитные группы: пара-метоксибензильную (MBn) при O-2' и хлорацетильную (СА) при О-3'. В этих способах использовались предварительное получение α-L-дифукопиранозидов с последующей избирательной защитой свободных гидроксильных групп моносахаридных звеньев. После введения алкильной или других групп к молекуле α-L-дифукопиранозида были необходимы стадия снятия защит с реакционноспособных групп и хроматографическое разделение получившихся аномерных соединений. При таком подходе используется не менее 8-ми стадий органического синтеза, что существенно усложняет процедуру получения и понижает выходы итоговых соединений. Кроме того, отсутствие методов органического синтеза для получения олигосахаридов со строгой регио- и стереоспецифичностью требует применения хроматографических методов разделения продуктов на каждой стадии синтеза, что также усложняет весь процесс, в целом.

Известны способы ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой. В синтезе таких соединений используются ферменты α-L-фукозидазы, обладающие способностью катализировать не только расщепление гликозидных (L-фукозидных) связей при прохождении реакции гидролиза, но и осуществлять реакции синтеза (реакции трансгликозилирования) путем переноса L-фукозильного остатка на другую молекулу сахара. Исходный субстрат в реакции обозначают как донор, а молекула, принимающая гликозильный остаток - акцептор. При протекании реакции трансгликозилирования фермент α-L-фукозидаза переносит L-фукозильный остаток исходного субстрата (донора) не на молекулу воды, как в случае гидролиза, а на другую молекулу (акцептор), имеющую, по крайней мере, одну гидроксильную группу (например, сахариды, спирты, сам субстрат). В приведенных ниже работах арил-α-L-дифукопиранозиды, а именно пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозиды, были получены в результате реакций синтеза (трансгликозилирования), катализируемых ферментами α-L-фукозидазами, полученными из бактерий Thermotoga maritima: Biochemistry, 2007, Т. 46, №4, С. 1022-1033 [5], Paenibacillus thiaminolyticus: Glycobiology, 2013, Т. 23, №9, С. 1052-1065 [6], а также из мицелиального гриба Fusarium proliferatum LEI: Biochimie, 2017, №132, С. 54-65 [7], где донором и акцептором служил пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид.

Важным преимуществом использования ферментов α-L-фукозидаз в синтезе α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой, является то, что процесс протекает в одну стадию и, кроме того, осуществляется в мягких условиях без использования агрессивных химических реагентов [1]. Все упомянутые α-L-фукозидазы были использованы в синтезе лишь α-L-дифукопиранозидов, модифицированных арильной группой, тогда как ферментативный синтез α-L-дифукопиранозидов, модифицированных другими неуглеводными группами, описан не был.

В качестве прототипа заявляемому изобретению рассмотрен способ ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой, заключающийся в проведении реакции в растворе между высокоочищенным ферментным препаратом α-L-фукозидазы из мицелиального гриба Fusarium proliferatum LEI и пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозидом, являющимся и донором, и акцептором одновременно в реакции синтеза (трансгликозилирования) пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида: [7]. Способ осуществляется путем проведения реакции между растворенным ферментным препаратом α-L-фукозидазы и пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозидом в растворе натрий-ацетатного буфера (рН 5,5). На Схеме 1 представлена реакция, катализируемая ферментом α-L-фукозидазой. Реакция происходит следующим образом: в зависимости от созданных условий будет преимущественно осуществляться либо гидролиз пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозида, либо синтез пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида, катализируемые ферментом α-L-фукозидазой. Важным условием сдвига реакции в сторону синтеза (трансгликозилирования) пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида является высокая (насыщенная) концентрация пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозида, что понижает динамическую активность воды и способствует преимущественному переносу гликозильного (L-фукозильного) остатка на молекулу-акцептор, в данном случае на пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид.

В точке максимального выхода целевого пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида, синтезированного в результате реакции трансгликозилирования, катализируемой α-L-фукозидазой, возникает необходимость инактивации фермента с целью снижения последствий гидролиза синтезированного α-L-дифукопиранозида, катализируемого этим же ферментом. При этом каталитическая активность α-L-фукозидазы, как катализатора реакции, использована не полностью, а способа быстрого и эффективного разделения растворенного фермента и продуктов реакции для дальнейшего использования каталитического потенциала α-L-фукозидазы нет.

Схема 1. Схема реакций гидролиза и синтеза (трансгликозилирования), катализируемых α-L-фукозидазой из F. proliferatum LEI, с использованием пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозида в качестве донора и акцептора как пример ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой.

Таким образом, недостатком данного способа следует считать его низкую эффективность. Это вызвано тем, что для завершения реакции в момент достижения максимального выхода целевого продукта необходимо инактивировать α-L-фукозидазу с высокой остаточной каталитической активностью, т.е. потенциал α-L-фукозидазы не используется полностью.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение эффективности способа путем более полного использования каталитического потенциала α-L-фукозидазы.

Технический результат достигается тем, что в способе ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой, заключающемся в проведении реакции между α-L-фукозидазой и фукозилированными акцепторами, являющимися также донорами, новым является то, что α-L-фукозидаза иммобилизована в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом, в качестве донора и акцептора используют арил-α-L-фукопиранозид (пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид) или алкил-α-L-фукопиранозид (пропил-α-L-фукопиранозид), причем иммобилизованная в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом α-L-фукозидаза помещена в колонку, через которую многократно порциями подают раствор донора и акцептора до момента снижения каталитической активности α-L-фукозидазы, и полученную реакционную смесь, содержащую α-L-дифукопиранозиды, модифицированные неуглеводной группой, отбирают из колонки и направляют на хроматографическую очистку.

Предлагаемая совокупность операций обеспечивает многократное применение каталитически активного ферментного препарата α-L-фукозидазы в синтезе α-L-дифукопиранозидов, модифицированных различными неуглеводными группами.

На Фигуре 1 представлена схема процесса ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводной группой, катализируемая иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазой и помещенной в колонку, через которую многократно порциями подают раствор донора и акцептора с последующим мониторингом и хроматографической очисткой и разделением продуктов реакции. На Фиг. 1 использованы следующие обозначения:

1 - колонка с иммобилизованной α-L-фукозидазой из F. proliferatum LEI;

2 - емкость для исходного донора-акцептора реакции (пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид или пропил-α-L-фукопиранозид в буферном растворе);

3 - система для высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающая:

3а - аналитическая колонка для разделения продуктов реакции;

3б - детектор (УФ-детектор (для синтеза пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида) или рефрактометрический детектор (для синтеза пропил-α-L-дифукопиранозида));

3в - персональный компьютер (коллектор данных);

3г - коллектор для разделенных продуктов реакции или емкость для отработанного раствора;

4 - емкость для контрольного отбора с целью мониторинга выхода целевого продукта реакции трангликозилирования.

На Фигуре 2 представлен профиль элюции продуктов реакции гидролиза и трансгликозилирования с использованием пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозида в качестве донора и акцептора, катализируемых иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазы, для очистки синтезированного пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.

На Фигуре 3 показана оценка эффективности использования иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазы, помещенной в колонку, в синтезе пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида при осуществлении 4-х загрузок донора-акцептора.

На Фигуре 4 представлен (А) анализ выхода продукта реакции трансгликозилирования, катализируемой иммобилизованной α-L-фукозидазой, от концентрации пропил-α-L-фукопиранозида в реакции, выполненный методом тонкослойной хроматографии и (Б) кривая зависимости выхода продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой иммобилизованной α-L-фукозидазой, от концентрации взятого в реакцию донора-акцептора (оценка выполнена с использованием программы BioVision).

Способ конкретной реализации

Способ приготовления α-L-фукозидазы, иммобилизованной в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом. Выделение α-L-фукозидазы из мицелиального гриба F. proliferatum LEI (фермент) было выполнено аналогично процедуре, описанной в прототипе [7]. Иммобилизацию α-L-фукозидазы в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом осуществляли с использованием метода: Int. J. Biol. Macromol. 2018, Т. 111, С. 1206-1213 [8] с некоторыми модификациями. К приготовленному и охлажденному до 37°С 10%-ному (вес./об.) раствору пищевого желатина в 0,05 М натрий ацетатном буфере, рН 5,5 добавляли очищенный ферментный препарат α-L-фукозидазы (0,3 ед. акт.) и тщательно перемешивали. Смесь переносили в колонку (20 × 5 мм), выдерживали при 4°С в течение 1 часа. После этого, на поверхность застывшего желатина наливали 2 части 12,5% (об./об.) раствора глутарового альдегида и выдерживали при 4°С в течение 1 часа. Оставшийся над поверхностью желатина раствор глутарового альдегида удаляли и трижды промывали иммобилизованный в желатине фермент 0,05 М натрий ацетатным буфером, рН 5,5. Иммобилизованный фермент хранили при 4°С в 0,05 М натрий ацетатном буфере, рН 5,5.

Далее полученную иммобилизованную в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазу используют при реализации способа ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов с неуглеводной группой (Фигура 1). Рассчитанное с учетом кинетических и термодинамических параметров для эффективного протекания реакций гидролиза и синтеза (трансгликозилирования), а также с учетом емкости колонки количество иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазы, помещается в колонку 1. Из емкости 2 подается определенное количество раствора донора-акцептора, реакция проводится при тех же условиях, что описано и для прототипа (рН 5,5; 37°С). Реакционную смесь, содержащую целевой продукт, направляют на хроматографическую очистку (3). К каталитически активному иммобилизованному ферменту в колонку 1 подается следующая порция донора-акцептора. И таким образом реакция проводится многократно. При этом момент снижения каталитической активности фермента контролируется по снижению выхода целевого продукта путем отбора промежуточной контрольной фракции после проведения нескольких актов реализуемого способа (4). При реализации такой схемы видно, что α-L-фукозидаза, выступающая в роли катализатора в реакции синтеза, используется более эффективно и исчезает необходимость инактивировать α-L-фукозидазу с высокой остаточной каталитической активностью, что значительно повышает эффективность способа. Последовательное соединение узлов схемы, реализующей способ, позволяет объединить стадии ферментативного синтеза и очистки в единый процесс (Фигура 1).

ПРИМЕР КОНКРЕТНОЙ РЕАЛИЗАЦИИ 1. Осуществление реакции синтеза дифукозидов с неуглеводной группой иммобилизованным биокатализатором α-L-фукозидазы из F. proliferatum LEI, а именно синтез шра-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида.

Раствор пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозида (80 мМ) в 10% диметилсульфоксиде в 20 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащим 50 мМ NaCl подавали на колонку, заполненную иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазой. Биокаталитическую колонку с реакционной смесью инкубировали при температуре 37°С. Реакционную смесь с продуктами реакций гидролиза и синтеза и содержащую в том числе и пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозид, отбирали из колонки и подавали на хроматографическую систему. Получившуюся смесь продуктов гидролиза и трансгликозилирования разделяли хроматографически на колонке Resolve С18 (90, 5 мкм, 3,9 × 300 мм, Waters, Ирландия) с использованием линейного градиента ацетонитрил-вода 0-90% (об./об). Элюирование проводили в течение 80 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Обнаружение компонентов реакционной смеси осуществляли при длине волны 302 нм с использованием УФ-детектора (Фигура 2). Полученные фракции высушивали лиофильно.

В качестве промежуточного контроля, накопление продуктов трансгликозилирования отслеживали с помощью ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системе этилацетат/уксусная кислота/вода (7:2:2, об./об./об.) в качестве подвижной фазы. Для определения компонентов с пара-нитрофенольной группой, пластины ТСХ анализировали в ультрафиолетовом свете. Для визуализации молекул с сахаридной частью, пластины опрыскивали раствором 5% (об./об.) серной кислоты в изопропаноле и прогревали до 110°С в течение 10 мин.

Количественное определение получаемого в результате ферментативного синтеза пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида показало, что выход продукта реакции трансгликозилирования составил 1,5% на каждый цикл реакции. При проведении четырех повторных циклов реакции трансгликозилирования, катализируемых иммобилизованным ферментным препаратом α-L-фукозидазы, выход продукта пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида снижался лишь на 10% к четвертому циклу, что подтверждено методами тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующим расчетом выхода продукта реакции путем интегрирования пиков (Фигура 3). Это подтверждает эффективность использования иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазы в процессе синтеза пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида при осуществлении многократной подачи донора и акцептора на колонку с биокатализатором.

Лиофильно высушенная фракция, соответствующая продукту реакции синтеза (трансгликозилирования) с яара-нитрофенил-а-1-фукопиранозидом в качестве донора и акцептора, была проанализирована с использованием масс-спектрометрического анализа. Масс-спектры синтезируемого пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида были сняты на приборе Bruker micrOTOF с ионизацией электростатическим распылением. Были использованы растворы образцов в MeCN. Диапазон регистрации положительных ионов m/z 110-1500. Напряжение на капилляре -4500 V и 500 V на выходе, давление небулайзера 1,0 бар, скорость подачи газа-осушителя 4,0 л/мин. На полученном масс-спектре очищенного продукта реакции трансгликозилирования имеется только один пик, соответствующий иону [М+Na]⁺ и ассоциированные изотопные пики. Формирование диассоциированных аддуктов [М+2Na]²⁺, монодиассоциированных димеров [2М+Na]⁺ подавлялось в условиях эксперимента. Расчетное значение m/z [М+Na]⁺ для пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида (m/z_{pасчетное} 454,1320) коррелирует с наблюдаемым экспериментальным значением m/z [М+Na]⁺ (m/z_{экспериментальное} 454,1320). Полученные данные подтверждают предположение о том, что продуктом реакции трансгликозилирования, катализируемой иммобилизованным биокатализатором α-L-фукозидазы, где донором и акцептором выступал пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид, является пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозид (C₁₈H₂₅O₁₁N).

ПРИМЕР КОНКРЕТНОЙ РЕАЛИЗАЦИИ 2. Осуществление реакции синтеза дифукозидов с неуглеводной группой иммобилизованным биокатализатором α-L-фукозидазы из Eproliferatum LEI, а именно синтез пропил-α-L-дифукопиранозида.

Раствор пропил-α-L-фукопиранозида (0,42 М) в 20 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5), содержащим 50 мМ NaCl, подавали на колонку, заполненную иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазой. Колонку с реакционной смесью инкубировали при температуре 37°С. Накопление продуктов трансгликозилирования отслеживали с помощью ТСХ на пластинах Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) в системе этилацетат/изопропанол/вода (6:2:1, об./об./об.) в качестве подвижной фазы, затем пластины опрыскивали раствором 5% (об./об.) серной кислоты в изопропаноле и прогревали до 110°С в течение 10 мин.

Получившуюся смесь продуктов гидролиза и трансгликозилирования разделяли хроматографически на колонке Biogel Р2 Extra fine (30 см × 0,5 см), уравновешенной водой. Элюирование проводили водой со скоростью потока 0,1 мл/мин. Полученные фракции высушивали лиофильно. На Фигуре 4 представлены результаты анализа с использованием тонкослойной хроматографии ферментативного синтеза алкил-α-L-дифукопиранозидов (пропил-α-L-дифукопиранозида), катализируемый иммобилизованной и помещенной в колонку α-L-фукозидазой, иллюстрирующий возможность расширения ассортимента синтезируемых α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводными группами (как дополнительное преимущество).

Масс-спектрометрический анализ продуктов реакций синтеза пропил-α-L-дифукопиранозида, катализируемых иммобилизованной α-L-фукозидазой. На полученном масс-спектре очищенного продукта реакции трансгликозилирования (предполагаемого пропил-α-L-дифукопиранозида) имеется только один пик, соответствующий иону [М+Na]⁺ и ассоциированные изотопные пики. Формирование диассоциированных аддуктов [М+2Na]²⁺, монодиассоциированных димеров [2М+Na]⁺ подавлялось в условиях эксперимента. Расчетное значение m/z [М+Na]⁺ для пропил-α-L-дифукопиранозида (m/z_{paсчетное} 375,1626) коррелирует с наблюдаемым экспериментальным значением m/z [М+Na]⁺ (m/z_{экспериментальное} 375,1638). Полученные данные подтверждают предположение о том, что продуктом реакции трансгликозилирования, катализируемой иммобилизованным биокатализатором α-L-фукозидазы, где донором и акцептором выступал пропил-α-L-фукопиранозид, является пропил-α-L-дифукопиранозид (С₁₅Н₂₈О₉).

Выводы: на основании результатов экспериментов можно сделать вывод, что реализованный способ ферментативного синтеза пара-нитрофенил- и пропил-α-L-дифукопиранозидов иммобилизованной в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом и помещенной в колонку α-L-фукозидазой, через которую многократно порциями подают раствор донора-акцептора, показал перспективность применения полученного биокатализатора для использования каталитического потенциала α-L-фукозидазы полностью. При проведении четырех повторных циклов реакции трансгликозилирования, катализируемых иммобилизованным ферментным препаратом α-L-фукозидазы, выход продукта пара-нитрофенил-α-L-дифукопиранозида снижался лишь на 10% к четвертому циклу.

Рекомендуемая форма для практического применения. Предполагается изготовлять иммобилизованный биокатализатор α-L-фукозидазы в форме колонки, заполненной иммобилизованной в желатиновой матрице с глутаровым альдегидом α-L-фукозидазы, и хроматографической колонки с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии, которые встраиваются последовательно с использованием короткого промежуточного капиллярного адаптера. Контроль процесса проводят в два этапа, а именно: каталитическая реакция синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных неуглеводными группами, иммобилизованным ферментом (через колонку с иммобилизованной α-L-фукозидазой многократно порциями подают раствор донора и акцептора и инкубируют при оптимальных условиях (0,05 М Na-ацетатный буфер, рН 5,0-5,5; 37°С) при закрытом выходе с колонки с биокатализатором; процесс повторяют до момента снижения каталитической активности α-L-фукозидазы) и анализ и фракционирование образующихся продуктов на хроматографической колонке с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Список использованной литературы

1. Suprunchuk V.E. Low-molecular-weight fucoidan: Chemical modification, synthesis of its oligomeric fragments and mimetics. Carbohydrate Research. 2019, T. 485, 107806.

2. Gerbst A.G., Grachev A.A., Ustiuzhanina N.E. et al. Synthesis, NMR and conformational studies of fucoidan fragments. VI. Fragments, content of alpha-(1--->2)-bound fucobioside unit. Bioorg. Khim. 2004, T. 30, №2, C. 156-167.

3. Крылов В.Б. Синтез сполна сульфатированных олигосахаридов, родственных природным полисахаридам фукоиданам. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Москва, 2010.

4. Винницкий Д.З. Синтез и изучение антикоагулянтной активности олигосахаридов, родственных разветвленным фрагментам фукоидана из водоросли Chordaria flagelliformis. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук, Москва, 2015.

5. Osanjo G, Dion М., Drone J., et al. Directed evolution of the alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha-L-transfucosidase. Biochemistry. 2007, T. 46, №4, C. 1022-1033.

6. α-L-Fucosidase From Paenibacillus thiaminolyticus: Its Hydrolytic and Transglycosylation Abilities. Glycobiology. 2013, T. 23, №9, C. 1052-1065.

7. Shvetsova, S.V., Shabalin K.A., Bobrov K.S., at al. Characterization of a new α-L-fucosidase isolated from Fusarium proliferatum LEI that is regioselective to α-(1→4)-Z-fucosidic linkage in the hydrolysis of α-L-fucobiosides. Biochimie. 2017, №132, C. 54-65. - прототип.

8. Nishida V.S., Oliveira R.F. de, Bragnari T. et al. Immobilization of Aspergillus awamori β-glucosidase on commercial gelatin: An inexpensive and efficient process. Int. J. Biol. Macromol. 2018, T. 111, C. 1206-1213.

Изобретение относится к способу ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных пара-нитрофенильной или пропильной группой, заключающемуся в проведении реакции между α-L-фукозидазой и фукозилированными акцепторами, являющимися также донорами, причем α-L-фукозидаза иммобилизована в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом, в качестве донора и акцептора используют пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид или пропил-α-L-фукопиранозид, причем иммобилизованная α-L-фукозидаза помещена в колонку, через которую многократно порциями подают раствор донора и акцептора до момента снижения каталитической активности α-L-фукозидазы, и полученную реакционную смесь, содержащую модифицированные α-L-дифукопиранозиды, отбирают из колонки с целью мониторинга выхода целевого продукта и направляют на хроматографическую очистку. 2 пр., 4 ил.

Способ ферментативного синтеза α-L-дифукопиранозидов, модифицированных пара-нитрофенильной или пропильной группой, заключающийся в проведении реакции между α-L-фукозидазой и фукозилированными акцепторами, являющимися также донорами, отличающийся тем, что α-L-фукозидаза иммобилизована в желатиновую матрицу с глутаровым альдегидом, в качестве донора и акцептора используют пара-нитрофенил-α-L-фукопиранозид или пропил-α-L-фукопиранозид, причем иммобилизованная α-L-фукозидаза помещена в колонку, через которую многократно порциями подают раствор донора и акцептора до момента снижения каталитической активности α-L-фукозидазы, и полученную реакционную смесь, содержащую модифицированные α-L-дифукопиранозиды, отбирают из колонки с целью мониторинга выхода целевого продукта и направляют на хроматографическую очистку.