Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к химии углеводов и их производных, и касается способа получения арилламинариОЛИГОЗИДО8.
Арилгликозиды и -олигозиды находят применение в научных целях как модельные соединения. Арилолигозиды используют в качестве субстратов для
,установления структуры углеводсодер жащих биополимеров - в качестве свидетелей продуктов их взаимодействия с различными классами соединений. Одним из основных стимулов развития химии гликозидов является все возрастающий интерес биохимиков к обширному классу низкомолекулярных биорегуляторов - сердечных, тритерпеновых, стероидных гликозидов. Многие арилгликозиды являются биологически активнь-ми веществами. Так, природное соединение 2-(п-oкcифeнил)-этил-p-D-глюкoпиpaнoзид - действующее начало широко известного лекарственного средства народной медицины золотого корня.
Гликозилирование вещества является трудной, но часто необходимой процедурой. Так, известно, что гликозилирование уменьшает токсичность агликонов {например, сердечных гли-козидов) и увеличивает проницаемость веществ через биологические мембраны Проблема перевода лекарственных веществ в водорастворимое состояние (что можно осуществить с помощью гликозилирования) хорошо известна фармакологам. Путем изменения углеводно компоненты можно управлять процессами транспорта биологически актив- ных веществ.
Большую часть указанных соединений получают путем химического синтеза, однако это почти всегда трудоемкий и многостадийный процесс.
Известен способ получения арилламинариолигозидов, который заключается в следующем.
1. Сийтез бензил-З-О-р-О-глюкопиранозил-р-О-глюкопиранозида (бензил-р-ламинарибйозида) проводят в несколько стадий:
а) конденсацией 2,3,,6-тетра-0-ацетил-«ио-глюкопиранозилбромидас метил-2-0-бензоил-,6-0-бензилиден-об-О- глюкопиранозидом в г)рисутствии трифтометансульфоната серебра (катализатор) и 1,1,3,3-тетраметил мочевины в дихлорметане получают
2-0-бензоил-,6-0-бензилиден-З-О-(2, 3,,6-тeтpa-0-aцeтил-p-D-глюкoпиpaнoзил)-ot.-D-глюкoпиpoнaзид;
б)последовательной обработкой полученного продукта метилатом натрия в метаноле, 60%-ной уксусной кислотой, смесью уксусный ангидрид-пиридин, 2 в уксусном ангидриде получают 1,2,,6-тетра-О-ацетил-3-0-(2,3,,6-тетра-0-ацетил-/ -0-глюкопиранозил) -ot-D-глюкопиранозид;
в)его подвергают бромированию насыщенным раствором НВг в уксусной килоте при получают 2,3, -три-0-ацетил-3-0-(2,3,,6-тетра-0-ацетил-/5-0-глюкопиранозил) -О-глюкопиранозилбромид;
г)обработкой которого сухим бензиловым спиртом в присутствии цианистой ртути получают бе.нзил-2,,6-три-0-ацетил-3-0-(2,3,,6-тетра-0-ацетил-(Ь-0-глюкопиранозил) -p-D-глюкопиранозид и далее;
д)снятием защитных групп (деацетилирование) метилатом натрия в сухом метаноле получают целевой продукт.
2. Фелил-З-О-р-О-глюкопиранозил-p-D-глюкопиранозид (фенил-|Ь-ламинарибоизид) получают конденсацией 2,3, 4-три-0-ацетил-ЗтО-(2,3,,6-тетра-0-ацетил-р-р-глюкопиранозил-оЮ-глюкопиранозил)-оС-0-глюкопиранозилбромида с фенолом в воде в присутствии КОН. Снятие защитных групп проводят так же, как и при получении бензил-р-ламинарибиозида.
Выходы целевых продуктов от ясходных веществ составляют 23-301 П 3
Известный способ обладает следующими недостатками : для его осуществления необходимо предварительно получить исходные ламйнариолигозиды; способ многостадийный (5 стадий) и трудоемкий, требует использования дорогостоящих, труднодоступных и ядовитых веществ (цианистая ртуть и трифторметансульфонат серебра в качестве катализаторов) ; требует использования широкого набора органических растворителей и реагентов: этилового спирта, хлороформа, ацетона, фенола, уксусного ангидрида, пиридина, этилацетата, петролейного эфира,бензилового спирта, уксусной кислоты, причем некоторые из них - после дополнительной очистки и абсолютирования; требует многократной перекристаллизации получаемых продуктов на промежуточных стаднях с целью их очистки; способ тре бует создания определенных условий реакции. Так, например, синтез бензил-3 -О -(Ь- D- глюкопиданозил-р- D глюкопиранозида проводится при полном отсутствии влажности, дневного све та и т.д. Целью изобретения является упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арилламинариолигозидов общей фо снгон & О-Аг где R - глюкоза, ламинарибиоза, ламинаритриоза, ламинаритетраоза;арил, выбранный из группы, включающей п-нитрофенил-, нафтил-, нитрофенил, фенил, -метилумбеллиферил, смесьр-1,3-глюкана (ламинарин) и арилглюкозида, где арил имее указанные значения, подвергают воздействию фермента эндо-р-1,3-глюканазы (ламинариназы Л1У} из Spisula sachalinensis в 0,05 М буферном растворе при рН 5,2-5, в течение i2Ц ч с последующим разделением обра зующихся в ходе ферментативного син теза арилламинариолигозидов с помощью жидкостной хроматографии. Обычно процесс ведут при концент рации р-1,3-глюкана 15-20 мг/мли арипглюкозйдс - 25-30 мг/мл реакционной смеси и активности фермента 0,75-1,5 Е/мл реакционной смеси. Предлагаемый способ основан на трансгликозилирующей способности фермента эндо-|Ь-1,3-г:пюканазы (лами нариназы Л1У), выделенной из молюска Spisula sachal inensis . Ламинариназа Д1У кэтализирует си тез арилламинариолигозидов из ламин
рина, используемого в качестве доно- ра, и Ar-p-D-плюкопиранозида-акцептора, т.е. в этом процессе используется трансгликозилирующая активность ламинариназы Л1У (способность к переносу глйкозильных остатков), которой обладает фермент Л1У, наряду с гидролитической способностью 20 мг/мл.
На фиг. пердставлены хроматограммы продуктов энзиматического синтеза при оптимальных концентрациях исходных компонентов и разном времени инкубации: 1 ч, k ч, 2 ч и В ч. Как видно, время инкубации 1 ч недосспосоЬностью катализировать гидролиз ламинарина. Фермент осуществляет наращивание углеводной цепи с образованием гомологов арилламинариолигозидов. Синтез можно представить схематически: где Д - донор - ламинарин; А -акцептор - арилглюкозид; П - продукты реакции; Е - фермент. В качестве акцепторов используют следующие арилглюкозиды: п-нйтрофенил- -О-глюкопиранозид, 1-нафтил-р-О-глюкопиранозид, фенил-р-О-глюкопиранозид, о-нитрофенил-(а-0-глюкопиранозид, -метилумбеллифе- . нил-р-О-глюкопиранозид. Выбор условий энзиматического синтеза проводится на основании фиксирования количества п-нитрофенола, освобождающегося в результате реакции трансгликозилирования при 400 пт. Поскольку авторами изобретения было установлено, что п-нитрофенол не отщепляется от самого акцептора (контрольный опыт Л1У+п-нитрофенилглюкозид показал это), то появление его в инкубационной смеси связано с синтезом ферменTOM п-нитрофенилпроизводных олигомеров, и является следствием обратного процесса их вторичного расщепления как субстратов. Таким образом, количество выделившегося п-нитрофенол а может свидетельствовать об интенсивности протекания реакции. На фиг. 1-3 приведены графики зависимости количества выделившегося п-нитрофенола от концентрации фермента (фиг. 1), акцептора (фиг. 2) и донора (фиг. 31. . Оптимальными концентрациями для протекания ферментативного синтеза на основании приведенных графиков были выбраны: для фермента - 0,3 мл в 2. мл инкубационной смеси, что составляет 1,5 Е активности; для акцептора - 25-30 мг/мл; для донора - 15таточно, так как при сравнении с последующими хроматограммами наблюдаем увеличение количества продуктов синтеза. Инкубация же свыше 2k ч, например B ч приводит к исчезнове- 5 нию высших олигомеров (заметно -сказывается обратный процесс расщепления) .
Эндо-р-1,3-глюканаза (ламинариназа Л1У) работает в интервале рН S|2- to S, в 0,05 М ацетатном буфере. Ферментативный синтез протекает при ко°мнатной температуре.
Подробное описание синтеза, выделения и идентификации целевых ве- И ществ дается на примере способа получения п-нитрофенилламинариолигозидов (пример 1). Синтез других арил ламинариолигозидов проводят аналогично описываемому в примере 1 и поэто- 20 му 6Н приведен в последующих примерах без подробного описания процесса .
На фиг. 5-10 представлены хроматограммы, отражающие ферментативный 25 синтез арилламинариолигозидов.
Пример 1. Ферментативный синтез п-нитрофенилламинарибиозида, ламинаритриозида и -ламинаритетраозида.ЭО
мг ламинарина и 750 мг п-нитрофенилглюкозида растворяют в 30 мл 0,05 Na-ацетатного буфера, рН 5,3. В этот раствор добавляют 0,75 мл энДО-1,3-глюканазы из моллюска Splsu- ,, la sachalinensis (ламинарйназа Л1У)
«-.«4T e±°N
инкубируют при 22-25 С 24 ч, если небходимо получить смесь с преоблада- Я щим содержанием п-нитрофенилламиарибиозида и п-нитрофенилламинаритриозида фиг. 5 или кривая U-- . .-,, на фиг. k). С целью получения относительно больших количеств п-нитрофенилламинаритетраозида, смесь инкубируют k ч (фиг. 6.
или кривая : на фиг. «) .Продукты
синтеза анализировали с помощью жидкостного углеводородного хроматографа jeol (модель jiC-бАН}. В аналитическом варианте анализ инкубационной смеси на биогеле П-2 (100x0,9 см, скорость эдюции 7,8 мл/ч, t 55 С) представляет собой следующую картину (фиг. 5): пики 1,2,3,t и т.д. со свидетелями идентифицированы соответственно как глюкоза, ламинарибиоза, триоза, -татраоза и т.д. Пик 1 был идентифицирован со свидетелем как п-нитрофенилглюкозид. По аналогии с разделением продуктов реакции пнитрофенилмальтоолигозидов, достигнутым в работе СЗ где эти гомологи мальтооолигозидов разделяли аналогично жидкостной хроматографией, на биогеле Р-2, пики Ц, W, Q принадлежат соответственно п-нитрофе нилламинарибиозиду, -триозиду и тетраозиду. (.доказательство - в разделе Идентификация продуктов).
Смесь, содерж.ащую набор продуктов ферментативного синтеза, разделяют на препаративной колонке на биогеле П-6 (100x3,3 см, t колонки 60°С, скорость элюции 30 мл/ч) на две фракции: ламинариолигосахариды и п-нитрофенилламинариолигозиды. Фракцию п-нитрофенилламинариолигозидов лиофильно высушивают и идентифицируют содержащиеся в ней вещества. Выход индивидуальных компонентов; в пересчете на исходный, .ламинарин приведен в табл. 1.
Т а б ц а 1
6,7 12,
,0
46
19,8
19,3
11,3
5,0
3,7 7 Препаративное разделение инкуба ционной смеси с получением индивидуальных целевых компонентов возможно на биогеле П-2 (аналогично фиг. 5 и 6), причем выделенные непрореагировавшие до конца, п-нитро. фенилглюкозид и ламинарин можно вновь запускать в последующий синтез. Как видно из табл. 1, с течением времени количество арилламина риолигозидов, особенно высших, начинает убывать, поскольку они также являются субстратами для . ланинариназы Л1У, и по мере уменьшения концентрации истинного субстрата - ламинарина фермент начинает гидролизовать им же синтезйpoBBHHbie, более короткие субстраты. Таким образом, варьируя концентрации исходных веществ, активность фёрмента либо время инкубаци (получают наиболее оптимальные условия производства -арилламинариол гозйдов с достаточно высоким выходом II р и м е р 2. Синтез 1-нафтилла нариолигозидов осуществляют аналоги но примеру 1, только в качестве.:акцептора используют Т-нафтил-р-О-глй копиранозид (фиг. 7) . Продолжител ность - t ч. Выход продуктов составляет, %: 1-нафтилламинарибиозида 9,1; -трио да 6,6; -тетраозида 8,9; -пентаози да 5,3. П р и м е р 3. Синтез о-нитрофен ламинариолигозидов проводят аналог; но примеру 1, качестве акцептора используют о-нитрофрнил-р-О-глюкоп ранозид (фиг. 8). Продолжительност 1. ч. Выход продуктов составляет, %: о-нитрофенилламинарибиозид 16,63; -триозид 7,98; -тетраозид «,. П ри м е р . Синтез фениллами нарнолигозидрв проводят по примеру 1, в качестве акцептора используют фенил-р-0-глюкопиранозид (фиг.9).. Продолжительность - 4 ч. Выход продуктов составляет, ; фенилламинарибиозид 21,62; -триозид. 6,67. П р и н е р S. Синтез 4-метилум беллиферилламинариолигозидов; акцептор - Л-метилумбеллиферил-р-Оглюкопиранозид. Время инкубации 2 ч. продуктов составляет, : метилумбеллиферилламинарибиозид 11,12; «триозид2,42; -тетраозид2,2 48 Идентификация продуктов энзиматического синтеза. Идентификацию продуктов проводили несколькими способами; а). Препаративно выделенные продукты - смесь п-нитрофенилламинариолигозидов |(пики Т-Г, фиг. 5) -с целью установления их структуры подвергли ферментативному гидролизу р глюкозидазой и.з сладкого миндаля (время инкубации - 9 ч, ). На фиг..11 представлены хроматограммы инкубационной Смеси до и после действия -глюкозидазы (скорость расщепления коротких субстратов наивысшая для этого фермента). Отсутствие на хроматограмме пика П-л-нитрОфенилбиозида, уменьшение пика Ш-п-нитрофенилбиозида и по-явление значительного количества выделенной глюкозы, а также увеличение в продуктах ферментативного гидролиза свободного п-нитрофенола (увеличение оптической плотности п-нитрофенола наблюдали по увеличению интенсивности окрашивания пробы в щелочной среме при Дурр, пт), Все это подтверждает, то синте&ир6ванные продукты (пики П | и 1У) содержат п-нитрофенольные радикалы, соединенные р-связью с глюкозными единицами, т.е. все полученные веществ являются -глюкозидами; б). Инкубация смеси продуктов реакции () с экзоламинариназой ЛП (экзо-р-1,3-глюканазой, выдeJoeннoй из Eulota nraaki, специфичность кото; рой установлена: фермент способен гидролизовать рН ,3-связи в -p-l,3-глюканах и р-1,3-глюкоолигозидах, рсвобои дая последовательно остатки глюкозы с невосстанавливающих концов молекул субстрата наилучшему расщеплению подвергаются более длинные субстраты). подтверждает наличие Р1,3-связанных глюкозных единиц, т.е. содержание в составе полученных веществ п-нитрофенилламинарибиозида, -ламинаритриозида. и -ламинаритетраозида (фиг. 12); в). Фракцию, содержащую п-нитрофенилламинариолигозиды (), лиофильно высушивают. Полученный С-ЯМР-спектр (табл. 2) в сравнении со спектром ламинарина подтверждает наличие р-1,3-связи между остатками глюкозы и отсутствие других типов гликозидных связей в данных веществах . Исследуемые вещества Ламинарин в ДяО Сумма п-нитрофенилОЛИГОЗИ/)ОВ пики ) в ЛоО
Использование предлагаемого способа получения арилламинариолигозидов обеспечивает пр сравнению с известным способом следующие преимущества: возможность одновременного получения нескольких арилламинариолигозидов непосредственно из ламинарина (без предварительного получения исходных ламинариолигозидов ; ферментативный синте з идет в одну стадию, : в то время как известный способ отличается многостадийностью (5 стаОЯШ
/т/п.
Таблиц a 2
дий) и трудоемкостью отдельных процессов;, удается избежать многочисленных операций по упариванию, фильтрации, перекристаллизации и т.д. на промежуточных стадиях, имеющих место в известном способе; способ не требует использования дорогостоящих катализаторов и ядовитых ge ществ; не требует специально псэдготовленных органических растворителей; способ не требует специальных условий. С-1 I С-2 I С-3 I C-if 1С-5I С-6 103,.28 Jt.U .85,32 693076,60 61,90 10,13 У ,13 85,32 69,3376,2061,20 Химические сдвиги
WI-S
0.5 f,5 5
го мг/мл
Фиг.З
Фиг, 6
7 8
ft Фиг. 7
11 час
П
