Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов Российский патент 2022 года по МПК C12N15/11 

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к иммунодиагностике, в частности к проблеме оценки иммунного статуса пациентов. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови).

Иммунный статус - это комплексный показатель состояния иммунной системы, это количественная и качественная характеристика состояния функциональной активности органов иммунной системы и некоторых неспецифических механизмов противомикробной защиты.

Иммунодефицитные состояния характеризуются полным или частичным отсутствием Т- или В-клеток, а также натуральных киллеров или ослаблением функций этих клеток. В качестве суррогатных маркеров созревания Т- и В-клеток и функциональной активности соответствующих звеньев иммунной системы может служить содержание в периферической крови, соответственно, Т-рецепторных эксцизионных колец (T-cell receptor excision circles - TREC) и В-клеточных эксцизионных колец (kappa-deleting recombination excision circles - KREC), формирующихся в процессе V(D)J-реарранжировки.

Полное или частичное отсутствие (снижение уровня) Т- и/или В-клеток у новорожденных определяется при первичных иммунодефицитах, трисомиях 21 и 18 хромосом, различных цитогенетических мутациях, а также при недоношенности младенцев, в том числе при плановом кесаревом сечении (КС).

Первичные иммунодефициты (ПИД) представляют собой группу генетически детерминированных заболеваний, обусловленных нарушением одного или нескольких механизмов иммунной защиты. При этом возможны структурное или функциональное нарушение Т- и В-клеток адаптивного иммунитета, а также нарушение развития гуморального и клеточного компонентов системы врожденного иммунитета. На сегодняшний день известно более 250 форм генетически подтвержденных ПИД, среди которых выделяют заболевания с дефицитом Т-клеток, дефицитом В-клеток (преобладающая группа), комбинированным дефицитом Т- и В-клеток. Клиническая тяжесть колеблется от легкой до потенциально опасной для жизни. Учитывая, что симптомы ПИД обычно не являются специфичными, значимой проблемой данной группы заболеваний остается гиподиагностика - большинство пациентов с ПИД скрыты под маской других диагнозов (достаточно упомянуть проблему часто и длительно болеющих детей). Данное обстоятельство приводит к несвоевременному и неадекватному лечению, а у пациентов с тяжелыми формами ПИД к 100% летальности. К таким заболеваниям относится, например, Х-сцепленная агаммаглобулинемия (ХГБ). Снижение Т- и/или В-клеток показано для синдрома ДиДжорджи (делеция 22q11.2), телеангиэктазии атаксии, синдрома Неймегена, синдрома CHARGE. Тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИН), представляющий собой редкую группу первичных нарушений иммунодефицита с известными или неизвестными генетическими изменениями. Дети с ТКИН обычно выглядят здоровыми при рождении, но в конечном итоге у них развиваются тяжелые, угрожающие жизни инфекции со 100%-ной смертностью, преимущественно в течение первого года жизни. Ранняя диагностика и лечение ТКИН с помощью трансплантации гемопоэтических стволовых клеток имеет важное значение для предотвращения смерти и восстановления нормальной функциональной иммунной системы. Если лечение проводится в течение первых 3,5 месяцев жизни, до развития угрожающих жизни инфекций, для детей с ТКИН показана более 95% выживаемость. Напротив, у детей с ТКИН, которые получали лечение после 3,5 месяцев, выживаемость падает до 60-70%, что свидетельствует о важности ранней диагностики и лечения. По оценкам, до 50% младенцев умирают из-за того, что им не был поставлен достаточно ранний диагноз для применения жизненно важных методов лечения.

Врожденные аномалии, включая пороки сердца, желудочно-кишечные пороки развития, множественные врожденные пороки развития, а также преждевременные роды могут быть связаны с вторичной лимфопенией младенцев.

Отдельный интерес представляет снижение иммунного статуса, связанное с преждевременными родами. Недоношенные дети имеют функциональную недостаточность иммунной системы. Незрелость врожденной иммунной системы и высокая потребность в инвазивных медицинских процедурах в контексте преждевременных родов делают этих детей очень восприимчивыми к распространенным патогенам новорожденных [Sharma А.А., Jen R., Butler A., Lavoie P.M. The developing human preterm neonatal immune system: a case for more research in this area. Clin Immunol. 2012 Oct;145(1):61-8. doi: 10.1016/j.clim.2012.08.006.].

Известно, что родоразрешение посредством КС связано с повышенным риском возникновения иммунных нарушений в более позднем возрасте, таких как аллергия, бронхиальная астма, диабет 1 типа, целиакия, злокачественные новообразования, иммунодефицитные состояния [Sevelsted A., Stokholm J., Bønnelykke K., Bisgaard Н. Cesarean section and chronic immune disorders. Pediatrics. 2015; 135(1):e92-8. doi: 10.1542/peds.2014-0596.]. К вероятным причинам развития этих заболеваний могут относиться несвоевременная и пониженная активация иммунной системы новорожденного, в том числе за счет более короткого гестационного возраста при КС по сравнению с естественными родами [Cho С.Е., Norman М. Cesarean section and development of the immune system in the offspring. Am J Obstet Gynecol. 2013;208(4):249-54. doi: 10.1016/j.ajog.2012.08.009.], что приводит уменьшению пула долгоживущих лимфоцитов и, в свою очередь, может иметь клинические последствия на более поздней стадии, особенно когда растущий индивид подвергается воздействию инфекционных агентов и антигенов. В связи с вышесказанным обращает на себя внимание, что, хотя клинически обоснованная частота КС не превышает 20%, мировой показатель КС увеличился в четыре раза менее чем за два десятилетия, что делает его наиболее распространенной хирургической процедурой, выполняемой у женщин детородного возраста без медицинских показаний [Schlinzig Т., Johansson S., Stephansson О., Hammarström L., Zetterström R.H., von Döbeln U., Cnattingius S., Norman M. Surge of immune cell formation at birth differs by mode of delivery and infant characteristics-A population-based cohort study. PLoS One. 2017;12(9):e0184748. doi: 10.1371/journal.pone.0184748.].

Современная стратегия развития скрининга новорожденных связана с максимально ранним, в идеале сразу после рождения, выявлением иммунодефицитов, связанных с нарушением пролиферации Т- и В-клеток. В случае генетически обусловленных заболеваний, таких как ПИД, отсутствие функциональных Т- и/или В-лимфоцитов служит диагностическим критерием, в случае преждевременных родов и КС оценка содержания Т- и/или В-лимфоцитов может служить прогностическим маркером, и в том, и в другом случае выявление и оценка уровня TREC и KREC может применяться для скрининга новорожденных. Таким образом, этот анализ дает ценную диагностическую и прогностическую информацию в отношении широкого спектра заболеваний, связанных с нарушением Т- и/или В-клеточного звена иммунитета, что позволяет выявлять пациентов для углубленного обследования и своевременного назначения адекватной терапии.

При первичном выявлении ПИД у взрослых пациентов определяют разнообразную и преимущественно сглаженную клиническую картину ПИД, например, селективный IgA-дефицит, ОВИН, являющихся наиболее частыми формами ПИД у лиц старше 18 лет. Характер клинических проявлений патологии у пациентов индивидуален и отличается вариабельностью течения даже в рамках одной нозологической формы [Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых. Медицинская иммунология. 2014. №4(16). С. 367-374]. Неоднородность клинической картины при ОВИН включает общую неспецифическую черту - рецидивирующие респираторные инфекции, которые поддаются определению и лечению на уровне первичного звена до более глубокого обследования пациентов [Deane S., Selmi С, Naguwa S.M., Teuber S.S., Gershwin M.E. Common variable immunodeficiency: etiological and treatment issues. International archives of allergy and immunology. 2009. №4 (150). C. 311-324. doi: 10.1159/000226232.].

У больных как с селективным IgA дефицитом, так и с ОВИН, снижено разнообразие кишечной микробиоты, значительно снижено альфа-разнообразие, что связано с повышенной проницаемостью для микробных компонентов, приводящих к усилению системного воспаления [Jørgensen S.F., Holm K., Macpherson М.Е., Storm-Larsen С., Kummen М., Fevang В., Aukrust P., Hov J.R. Selective IgA deficiency in humans is associated with reduced gut microbial diversity. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2019. 143(5): 1969-1971.e11. doi: 10.1016/j.jaci.2019.01.019.]. Согласно некоторым исследованиям, из-за задержки диагностики, ОВИН впервые может быть установлен и в возрасте 35 лет и старше. Несмотря на то, что состояния, связанные с гипогаммаглобулинемией, можно определить после исключения транзиторной младенческой гипогаммаглобулинемии, согласно возрасту [Латышева Е.А., Латышева Т.В. Федеральные клинические рекомендации Первичные иммунодефициты с преимущественным нарушением синтеза антител (Д80, Д83). 2018.]. Выделяют три возрастных пика диагностики ОВИН: 2-7, 25-30 и 50-60 лет; при установлении диагнозов селективного IgA дефицита (средняя продолжительность периода до установления диагноза 10,5 лет) и ОВИН (средняя продолжительность периода до установления диагноза 5,8 лет) [Deane S., Selmi С., Naguwa S.M., Teuber S.S., Gershwin M.E. Common variable immunodeficiency: etiological and treatment issues. International archives of allergy and immunology. 2009. №4 (150). C. 311-324. doi: 10.1159/000226232., Urm S.H., Yun H.D., Fenta Y.A., Yoo K.H., Abraham R.S., Hagan J., Juhn Y.J. Asthma and risk of selective IgA deficiency or common variable immunodeficiency: a population-based case-control study. Mayo Clinic proceedings. 2013. №8 (88). C. 813-21. doi: 10.1016/j.mayocp.2013.05.021.]. Однако в редких случаях у взрослых пациентов могут быть выявлены более тяжелые формы ПИД, например, синдром Ди Джорджи [Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых. Медицинская иммунология. 2014. №4 (16). С.367-374].

Диагностика таких ПИД, которые впервые дебютируют или выявляются в подростковом и взрослом возрасте, в основном стоится на исследовании клинической картины, анамнеза и исключении вторичной причины снижения уровней сывороточных иммуноглобулинов, оценке их количества в крови и проведении проточной цитометрии для количественной оценки имеющих поверхностно-мембранные Ig субпопуляции В-лимфоцитов в периферической крови. В связи с тем, что для пациентов с IgAdef не характерны отклонения количестве Т-лимфоцитов [Bateman Е.А., Ayers L., Sadler R., Lucas M., Roberts C, Woods A., Packwood K., Burden J., Harrison D., Kaenzig N., Lee M., Chapel H.M., Ferry B.L. T cell phenotypes in patients with common variable immunodeficiency disorders: associations with clinical phenotypes in comparison with other groups with recurrent infections. Clinical and experimental immunology. 2012. №2 (170): 202-11. doi: 10.1111/j.1365-2249.2012.04643.x.], исследование количества TREC у них в крови имеет малую диагностическую ценность. Описано применение анализа уровней TREC и KREC у взрослых пациентов с ОВИН и выявление его связи с тяжестью течения заболевания [Kamae С., Nakagawa N., Sato Н., Honma K., Mitsuiki N., Ohara О., Kanegane H., Pasic S., Pan-Hammarstrom Q., van Zelm M.C., Morio Т., Imai K., Nonoyama S. Common variable immunodeficiency classification by quantifying T-cell receptor and immunoglobulin к-deleting recombination excision circles. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2013. №5 (131): 1437-1440.e5. doi: 10.1016/j.jaci.2012.10.059.]. Уровни TREC достоверно снижены у взрослых больных с синдромом Ди Джорджи при нормальных уровнях KREC [Dar N., Gothelf D., Korn D., Frisch A., Weizman A., Michaelovsky E., Carmel M., Yeshayahu Y., Dubnov-Raz G., Pessach I.M., Simon A.J., Lev A., Somech R. Thymic and bone marrow output in individuals with 22q11.2 deletion syndrome. Pediatric Research. 2015. №4 (77): 579-585. doi: 10.1038/pr.2015.14.].

Известен метод оценки количества TREC с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), использовавшийся для выявления недавно вышедших из тимуса клеток у ВИЧ-инфицированных лиц, а также для диагностики иммунодефицитов [Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, Gage EA, Massey JM, Haynes BF, Polis MA, Haase AT, Feinberg MB, Sullivan JL, Jamieson BD, Zack JA, Picker LJ, Koup RA. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396(6712):690-695.; Amariglio N, Lev A, Simon A, Rosenthal E, Spirer Z, et al. Molecular assessment of thymus capabilities in the evaluation of T-cell immunodeficiency. Pediatr Res. 2010. 67(2): 211-216.]. Количественный анализ TREC применяли для диагностики новорожденных с ПИД при использовании выделения ДНК из сухих пятен крови [Douek DC, Vescio RA, Berts MR, Brenchley JM, Hill BJ, Zhang L, Berenson JR, Collins RH, Koup RA. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution. Lancet. 2000; 355(9218):1875-81.; Baker MW, Grossman WJ, Laessig RH, Hoffman GL, Brokopp CD, Kurtycz DF, Cogley MF, Litsheim TJ, Katcher ML, Routes JM. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009; 124(3):522-7]. Однако, методы, анализирующие состояние иммунной системы только по TREC, очевидно ограничены, так как учитывают только Т-клетки, но не В-клетки.

Известен метод использования количественного анализа TREC и BREC для определения репликативной истории субпопуляции Т-клеток или В-клеток [van Dongen JJ.M. Replicative history of T-and B-cell subsets. EP 1849877 A1. Application number: 06075943.8 31.10.2007. Bulletin 2007/44. Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR). Date of filing: 24.04.2006], способ ограничен моноплексным осуществлением анализа, за счет чего снижена точность и сопоставимость получаемых результатов анализа.

Известен метод дуплексного количественного анализа TREC и KREC для оценки количества наивных Т-лимфоцитов и наивных В-лимфоцитов [Borte S., von Döbeln U., Fasth A., Wang N., Janzi M., Winiarski J., Sack U., Pan-Hammarström Q., Borte M., Hammarström L. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15;119(11):2552-5. doi: 10.1182/blood-2011-08-371021.], но предложенный метод ограничен низкими уровнями отсечения, а также применением исключительно с использованием конкретных аналитических приборов ABI 7500 и ViiA7 (Applied Biosystems).

Известен предложенный нами ранее [Семенов А.В., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Тотолян А.А. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов. Патент на изобретение RU 2756979 С2, 07.10.2021. Патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера». Заявка №2019142752 от 17.12.2019. Бюл. «Изобретения. Полезные модели» №28/10.10.2021.] способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета на основании оценки уровня ДНК TREC, KREC у новорожденных с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, недостатком метода является использование в качестве калибраторов стандартных образцов ДНК человека и сложностью двухэтапной постановки для рутинной лабораторной диагностики.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе российских иммунологов: Гордукова М.А., Продеус А.П., Филипенко М.Л., Корсунский И.А. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки днк молекул trec, krec и количества геном эквивалентов днк. (Пат. №2587540 20.06.2016. Бюл. №17. Заявка: 2015132823/15, 06.08.2015). Согласно методу, выделяют ДНК из анализируемого образца крови. Затем производят одновременную амплификацию участков молекул ДНК TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA с использованием набора праймеров, зондов и стандартных образцов для оценки количества ДНК молекул TREC, KREC, IL17RA, регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции и определяют в режиме реального времени абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК с помощью калибровочных кривых, построенных при амплификации стандартных образцов ДНК, взятых не менее чем в 4-х последовательно убывающих десятикратных разведениях известных концентраций. По результатам оценки их количества производят диагностику состояния иммунной системы пациента. Недостатком способа является использование одного нормировочного гена для нормирования данных. Недостатком способа нормирования данных с использованием одного эталонного гена является вариабельность результатов анализа, так как не существует идеального нормировочного гена, постоянного в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. В связи с этим выбор эталонного гена является одним из самых ответственных этапов при проведении анализа. Наиболее оптимальным можно считать подход, при котором анализируется одновременно несколько эталонных генов. Кроме того, расчет полученных результатов без учета эффективности ПЦР, коэффициента пропорциональности и уровня флуоресценции порогового цикла снижает чувствительность, повторяемость и воспроизводимость метода.

Авторами предложен способ, согласно которому в образце ДНК, выделенном из цельной крови или из капли сухой крови, определяют количество целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Уровни целевых молекул ДНК TREC и KREC определяют путем пересчета полученных в ходе работы абсолютных значений (количество копий в реакции) на калибровочных графиках с использованием в качестве калибраторов серии последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30.

Технический результат - повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (отсутствие и/или низкие уровни молекул ДНК TREC, KREC) результатов, а значит и расширение возможностей метода, расширение арсенала средств, используемых для диагностики состояния иммунитета пациентов.

Сущность метода заключается в том, что экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Для амплификации используют набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Определение уровня TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, «нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Абсолютное значение (количество копий в реакции) целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных графиков, построенных при амплификации серии последовательных десятикратных разведений стандартных образцов плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, с известными концентрациями

По результатам определения количества TREC и KREC в анализируемом образце проводят сравнение с нормальными уровнями TREC и KREC, показанными для возрастной группы и расы пациентов, на основании чего делают выводы о состояния их иммунитета, то есть о нормальном иммунитете, если выявленные уровни TREC и KREC соответствуют норме, или о снижении иммунитета, если уровни TREC и/или KREC ниже нормы, так как это свидетельствует о полном или частичном отсутствии (снижении уровня) Т- и/или В-клеток, что характерно для иммунодефицитных состояний.

Для выявления образцов с отсутствием или снижением уровня целевых молекул TREC и KREC в одной емкости из одной навески экстрагированной ДНК проводят мультиплексную постановку ПЦР участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30 с использованием следующих олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов:

Состав амплификационной смеси представляет собой буферный раствор, содержащий Трис-HCl рН 8,8 (при 25°С), KCl, 6-7 мМ MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, SynTaq ДНК-полимеразу с ингибирующими активность фермента антителами (или 1 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы, или Hot-start Taq ДНК-полимеразы).

ПЦР и детекцию результатов проводят при следующих условиях:

Параллельно постановке ПЦР в образцах проводят постановку ПЦР для калибраторов, представляющих собой серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними: GCCACATCCCTTTCAACCATGCTGACGCCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCTCACTCCTGTGCACGGTGATGCATAGGCACCTGCAGCTGGCGTTCTCTTTCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTGCGCTGTCTGCACGGGCAGCAGGTTGGAACTCTAGGGTAAGAGCTGGCTCCTGGTGTCTTGCTCGAGATGTGATGAAGGAGATGGGAGGCCATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGGGCTATAAATTCTTTGCTGACCTGCTGAGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTG

Первичный анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:

- по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК TREC;

- по каналу для флуорофора HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК KREC;

- по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30;

- по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК HPRT.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct), сомнительным во всех других случаях.

Уровень ДНК TREC и KREC определяют в копиях на миллилитр и в копиях на 10⁵ клеток. Расчет уровней целевых молекул осуществляют с использованием следующих формул:

Эффективность ПЦР:

где Е - эффективность, а - коэффициент из уравнения у=ах+b, получаемого при аппроксимации зависимости порогового цикла от концентрации матрицы в образце.

Коэффициент пропорциональности:

где α - коэффициент пропорциональности, Ct - пороговый цикл, С₀ - исходная концентрация, F_Ct - уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е - эффективность.

где α_m - α средняя для флуорофора, α_1-5 - α для каждого калибратора.

Концентрация целевых молекул в копиях на мл:

где С₀ - исходная концентрация, α_m - α средняя для флуорофора, Ct - пороговый цикл, F_Ct - уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е - эффективность.

Концентрация целевых молекул в копиях на 100 тыс.клеток:

где С₁₀⁵ - количество TREC или KREC на 100 тысяч ядросодержащих клеток, С₀ - исходная концентрация TREC или KREC в миллилитре образца, C_hprt - исходная концентрация HPRT в миллилитре образца, C_RPP30 - исходная концентрация RPP30 в миллилитре образца.

Расчет по указанным формулам возможен как вручную, так и с использованием разработанной авторами расчетной таблицы.

Расчет уровней TREC, KREC с использованием расчетной таблицы осуществляется следующим образом: для всей серии последовательных разведений плазмидной ДНК (калибраторов) вносят в соответствующие строки и столбцы таблицы известные концентрации калибраторов и значения пороговых циклов, указывают уровни пороговых линий, затем указывают название образца и соответствующие им значения пороговых циклов. Расчетные результаты будут получены в графах «Количество TREC» и «Количество KREC», соответственно, представлены в вариантах пересчета: копий на мл; копий на 10⁵ клеток.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 - фиг. 2 представлены кривые флуоресценции и калибровочные графики, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе серии разведений калибраторов. А также чертежами, где на фиг. 3 представлен пример использования формул в расчетной таблице и расчета TREC и KREC в образцах с различными уровнями целевых молекул.

Таким образом, предложенный способ отличается от прототипа использованием двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, набором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зондов, использованием в качестве стандартных образцов серии последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетические последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30.

Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода, являющиеся одним из возможных способов его реализации.

Пример 1.

Новорожденные: образцы пуповинной крови 157 детей. Для всей группы количество TREC в пуповинной крови детей находилось в диапазоне от 10762 до 121068 копий/10⁵ лимфоцитов. Среднее значение TREC составило 29945±1412 копий/10⁵ лимфоцитов. Концентрация KREC составила от 10550 до 89533 копий/10⁵ лимфоцитов, среднее 36199±1347 копий/10⁵ лимфоцитов.

Пример 2.

Проанализирована кровь 5 пациентов с диагнозом Х-сцепленная агаммаглобулинемия. Диагноз поставлен на основании клинических и лабораторных данных, а также результатов генетического исследования ВТК-гена, выполненного в лаборатории молекулярной иммунологии НИИЭМ имени Пастера. Среди пациентов отмечается выраженное снижение KREC при содержании TREC в пределах нормальных значений.

Пример 3.

Обследованы более 2000 новорожденных с использованием анализа сухой капли крови на картах Гатри. Новорожденным с выявленным снижением уровней TREC и/или KREC была рекомендована консультация иммунолога. В обследованной группе выявлены 10 пациентов с ПИД различной нозологии, в том числе больные с синдромом Чарджа, ТКИН, транзиторная гипогаммаглобулинемия детского возраста, агаммаглобулинемия.

Пример 4.

Обследованы более 400 ВИЧ-инфицированных лиц в возрасте от 24 до 49 лет. Среднее количество TREC у ВИЧ-инфицированных с низкой вирусной нагрузкой составило 2539±510,5 копий/10⁵ лимфоцитов, KREC 6048±1629 KREC/10⁵ лимфоцитов. У больных с высокой вирусной нагрузкой среднее количество TREC составило 486,8±235,1 копий/10⁵ лимфоцитов, KREC 5125±2238 копий/10⁵ лимфоцитов. He выявлено достоверных различий ни по концентрации TREC, ни по концентрации KREC между ВИЧ-инфицированными с низкой вирусной нагрузкой и условно здоровыми донорами. Количество TREC у здоровых доноров в 7,6 раз выше, чем у ВИЧ-инфицированных с высокой вирусной нагрузкой (р=0,0001). Между группой больных с низкой вирусной нагрузкой и с высокой вирусной нагрузкой показаны достоверные различия по концентрации TREC (р=0,025).

Пример 5.

Также в течение 2017-2021 гг.проведено более 1200 исследований взрослых условно здоровых лиц различных возрастных групп предложенным методом. Все пациенты были разделены на возрастные группы: 18-29 лет, 30-39 лет, 40-49 лет, 50-59 лет, 60-69 лет, и лица старше 70 лет. Определены возрастные нормы содержания молекул TREC и KREC в периферической крови среди взрослых жителей Санкт-Петербурга и Ленинградской области.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека», ул. Мира, 14, Санкт-Петербург, 197101, Российская Федерация

<120> СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ИММУНИТЕТА ПАЦИЕНТОВ И НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕНЫХ ЗОНДОВ, И СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ

<160> 13

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 1

cacatccctt tcaaccatgc t 21

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 2

tgcaggtgcc tatgcatca 19

<210> 3

<211> 26

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор FAM, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1 или BHQ1

<400> 3

cacctctggt ttttgtaaag gtgccc 26

<210> 4

<211> 27

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 4

tcccttagtg gcattatttg tatcact 27

<210> 5

<211> 24

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 5

aggagccagc tcttacccta gagt 24

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор HEX, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ1 или BHQ1

<400> 6

tctgcacggg cagcaggttg g 21

<210> 7

<211> 22

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 7

cttgctcgag atgtgatgaa gg 22

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 8

cagcaggtca gcaaagaatt tatag 25

<210> 9

<211> 30

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор Cy5, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ2 или BHQ2

<400> 9

atcacattgt agccctctgt gtgctcaagg 30

<210> 10

<211> 16

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 10

tttggacctg cgagcg 16

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 11

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 12

<211> 23

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на 5’-конце флуорофор ROX, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель RTQ2 или BHQ2

<400> 12

ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

<210> 13

<211> 370

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Синтетическая последовательность, представляющая собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, включенная в ТА-вектор

<400> 13

gccacatccc tttcaaccat gctgacgcct ctggtttttg taaaggtgct cactcctgtg cacggtgatg cataggcacc tgcagctggc gttctctttc ccttagtggc attatttgta tcactgtgcg ctgtctgcac gggcagcagg ttggaactct agggtaagag ctggctcctg gtgtcttgct cgagatgtga tgaaggagat gggaggccat cacattgtag ccctctgtgt gctcaagggg ggctataaat tctttgctga cctgctgagg tgtttgcaga tttggacctg cgagcgggtt ctgacctgaa ggctctgcgc ggacttgtgg agacagccgc tcaccttggc tattcagttg 370

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов. Диагностику проводят с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а также с использованием стандартных образцов плазмидной ДНК. Способ включает синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, с известными концентрациями. Выделенную ДНК используют для одновременной амплификации в одной емкости участков целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Определение уровня TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, «нормировочный коэффициент» при этом вычисляется как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Вывод о состоянии иммунитета делают на основании нормального или сниженного уровней TREC и KREC. Технический результат заключается в расширении арсенала средств, используемых для диагностики состояния иммунитета пациентов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета пациентов на основе определения количества Т- и В-клеток, для осуществления которого экстрагируют ДНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), после чего проводят полимеразную цепную реакцию для целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а именно: TRECF-cacatccctttcaaccatgct, TRECR-tgcaggtgcctatgcatca, TRECzondFAM-FAM-cacctctggtttttgtaaaggtgccc-RTQ1/BHQ1, KRECF-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR-aggagccagctcttaccctagagt, KRECzondHEX-HEX-tctgcacgggcagcaggttgg-BHQ1, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2, а также стандартных образцов плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними, а именно:

gccacatccctttcaaccatgctgacgcctctggtttttgtaaaggtgctcactcctgtgcacggtgatgcataggcacctgcagctggcgttctctttcccttagtggcattatttgtatcactgtgcgctgtctgcacgggcagcaggttggaactctagggtaagagctggctcctggtgtcttgctcgagatgtgatgaaggagatgggaggccatcacattgtagccctctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgacctgctgaggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttg, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», анализ TREC и KREC проводят с нормализацией на эталонные гены, абсолютное значение (количество копий в реакции) целевых молекул TREC, KREC и нормировочных генов в анализируемых образцах определяют с использованием калибровочных графиков, построенных при амплификации серии последовательных десятикратных разведений стандартных образцов плазмидной ДНК известных концентраций, и по результатам определения количества TREC и KREC в анализируемом образце проводят сравнение с нормальными уровнями TREC и KREC, показанными для расы, к которой принадлежит пациент, на основании чего делают выводы о состоянии их иммунитета, то есть о нормальном иммунитете, если выявленные уровни TREC и KREC соответствуют норме, или о снижении иммунитета, если уровни TREC и/или KREC ниже нормы, так как это свидетельствует о полном или частичном отсутствии (снижении уровня) Т- и/или В-клеток, что характерно для иммунодефицитных состояний.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, тем самым выявляя среди анализируемых образцов образцы с отсутствием или низким уровнем целевых молекул TREC и KREC.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для нормализации целевого продукта на эталонный ген при наличии двух эталонных нормировочных генов вводят «нормировочный коэффициент», который вычисляют как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения эталонных нормировочных генов.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стандартных образцов используют серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество копий целевых молекул ДНК TREC и KREC на миллилитр рассчитывают по формуле: где С₀ - исходная концентрация, α_m - α средняя для флуорофора, Ct - пороговый цикл, F_Ct - уровень пороговой линии (флуоресценция в пороговом цикле), Е - эффективность,

а количество копий целевых молекул ДНК TREC и KREC на 10⁵ клеток рассчитывают по формуле: где С₁₀⁵ - количество TREC или KREC на 100 тысяч ядросодержащих клеток, С₀ - исходная концентрация TREC или KREC в миллилитре образца, C_hprt - исходная концентрация HPRT в миллилитре образца, C_RPP30 - исходная концентрация RPP30 в миллилитре образца.

6. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, и флуоресцентно меченых зондов, и стандартных образцов для проведения амплификации целевых молекул ДНК TREC, KREC и эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30: TRECF-cacatccctttcaaccatgct, TRECR-tgcaggtgcctatgcatca, TRECzondFAM-FAM-cacctctggtttttgtaaaggtgccc-RTQ1/BHQ1, KRECF-tcccttagtggcattatttgtatcact, KRECR-aggagccagctcttaccctagagt, KRECzondHEX-HEX-tctgcacgggcagcaggttgg-BHQ1, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2; в набор входят стандартные образцы, представляющие собой серию последовательных разведений плазмидной ДНК, включающей синтетическую последовательность, представляющую собой нуклеотидные последовательности, соответствующие фрагментам целевых молекул ДНК TREC, KREC и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, со спейсерами между ними:

gccacatccctttcaaccatgctgacgcctctggtttttgtaaaggtgctcactcctgtgcacggtgatgcataggcacctgcagctggcgttctctttcccttagtggcattatttgtatcactgtgcgctgtctgcacgggcagcaggttggaactctagggtaagagctggctcctggtgtcttgctcgagatgtgatgaaggagatgggaggccatcacattgtagccctctgtgtgctcaaggggggctataaattctttgctgacctgctgaggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacctgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttg.