ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA SBSP. ENTERICA SEROVAR KENTUCKY B-9045 МЕЖДУНАРОДНОГО ПОЛИРЕЗИСТЕНТНОГО КЛОНА SALMONELLA KENTUCKY ST198, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/42 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости высокого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в генах gyrA и parC; филогенетические исследования методом MLST (от анг. Multi Locus Sequence Typing, мультилокусное сиквенстипирование).

По литературным данным в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky ST198, устойчивые к хинолонам за счет различных мутаций в хромосомных генах gyrA и parC, полирезистентные к другим классам антибиотиков. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky ST198, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике сальмонеллезов в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky, относящиеся к международному полирезистентному клону Salmonella Kentucky ST198, характеризующиеся устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам, обусловленной множественными мутациями в хромосомных генах gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn) и parC (Ser80Ile) ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

Диагностика сальмонеллезов должна сопровождаться контролем качества проводимых фенотипических и молекулярных исследований с использованием контрольных штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica с известной резистентностью к антибиотикам (в том числе к фторхинолонам, цефалоспоринам и карбапенемам) и молекулярными механизмами устойчивости (мутациями в хромосомных генах).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению являются штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky ST198 из коллекции французского национального референс-центра Парижского Института Пастера (French National Reference Center for Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Institut Pasteur), которые также имели устойчивость высокого уровня к фторхинолонам вследствие множественных мутаций в хромосомных генах gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn) и parC (Ser80Ile), как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения изобретении (Hawkey J, Le Hello S, Doublet B. et al. Global phylogenomics of multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Kentucky ST198 // Microbial genetics. 2019, vol. 5(7): e000269). Штаммы указанных авторов нечувствительны к цефалоспоринам и карбапенемам, что не позволяет использовать эти штаммы для комплексного контроля процедуры определения чувствительности к антибиотикам. Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky ST198 B-9045 помогает преодолеть это ограничение, поскольку сохраняет чувствительность к этим классам антибиотиков (цефалоспоринам и карбапенемам), и может быть использован в качестве контрольного штамма в рамках диагностики сальмонеллезов при определении чувствительности к антибиотикам различных классов.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky ST198, необходимого для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллезов.

Авторами получен контрольный штамм для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики сальмонеллезов: полирезистентный к антибиотикам, с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам вследствие трех мутаций в хромосомных генах gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn) и parC (Ser80Ile), относящийся к сиквенс-типу ST198.

Заявляемый штамм выделен от больного острой кишечной инфекцией, идентифицирован до вида и серовара Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky бактериологическими и серологическими методами. Резистентность к антибиотикам установлена методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; характер хромосомных мутаций и сиквенс-тип установлены при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9045.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-агар, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе 08 (С), серовару S. Kentucky и имеет антигенную формулу 8,20: i: z₆.

Основные свойства штамма:

1. Устойчивость к антибиотикам класса хинолонов, устойчивость высокого уровня к фторхинолонам:

- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;

- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина > 8,0 мг/л;

- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм.

2. Молекулярный механизм устойчивости к хинолонам: мутации в хромосомных генах (однонуклеотидные замены) gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn) и parC (Ser80Ile).

3. Принадлежность к сиквенс-типу ST 198 (по результатам типирования методом MLST).

Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 подтверждена путем повторного еженедельного тестирования штамма (хранящегося при -70°С в криосреде) в течение 6 мес.Стабильность значений МПК антибиотиков и диаметров зон задержки роста проверяли диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей в течение всего срока тестирования. Стабильность молекулярных свойств (молекулярный механизм устойчивости к хинолонам и принадлежность к сиквенс-типу ST198) подтверждена повторным секвенированием ДНК штамма и анализом генома после хранения штамма в течение 6 мес.при -70°С на криосреде. Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica к антибиотикам класса хинолонов диско-диффузионным методом.

Тестирование проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Для исследуемых и контрольного штаммов готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия из суточных культур, выращенных на кровяном агаре (24 ч., +37°С). Засевали ватным стерильным тампоном на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон (высотой 4 мм). На засеянный агар накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.

Пример 2. Контроль качества определения чувствительности Salmonella enterica sbsp. enterica к антибиотикам методом градиентной диффузии: определение уровня устойчивости к фторхинолонам.

Тестирование проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Для исследуемых и контрольного штаммов готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия из суточных культур, выращенных на кровяном агаре (24 ч., +37°С). Засевали ватным стерильным тампоном на чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон (высотой 4 мм). На засеянный агар накладывали полоски с ципрофлоксацином (в градиенте концентраций), инкубировали чашки 24 часа при +35°С. Учитывали значение МПК в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации ципрофлоксацина составляло > 8,0 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как высокий.

Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в генах gyrA и parC по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций в хромосомных генах gyrA и parC проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых и контрольного штамма проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологических жидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку геномных библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к хинолонам, у исследуемых и контрольного штамма проводили с помощью биоинформатической веб-платформы Center of Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org/), сервера ResFinder, куда вводили данные секвенирования в формате FASTA. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались три однонуклеотидные замены в двух хромосомных генах: в гене gyrA -Ser83Phe и Asp87Asn, в гене parC - Ser80Ile.

Пример 4. Контроль качества филогенетических исследований бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica методом MLST.

Выделение ДНК, подготовку геномных библиотек и секвенирование проводили как описано выше (Пример 3). Определяли сиквенс-тип штаммов, оценивая полиморфизм семи генов «домашнего хозяйства» (house keeping genes) Salmonella enterica (гены aroC, dnaN, hemD, hisD, purE, sucA, hrA) с помощью биоинформатической веб-платформы Center of Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org/), сервера MLST 2.0, куда вводили данные секвенирования в формате FASTA. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 проявлял заявленные свойства: относился к сиквенс-типу ST198.

Для обеспечения достоверной диагностики сальмонеллезов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky B-9045 обладает стабильными свойствами, позволяющими одновременно контролировать многочисленные исследования: фенотипические (определение устойчивости высокого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя методами) и молекулярные (выявление мутаций в генах gyrA и parC; определение сиквенс-типа).

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-9045. Штамм может быть использован в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике сальмонеллезов. 4 пр.

Штамм бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Kentucky, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКГТМ-Оболенск» под номером В-9045, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике сальмонеллезов.