ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR TYPHI В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРЮШНОГО ТИФА Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12R1/42 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и молекулярной детекции механизмов резистентности и может быть использовано в качестве контрольного штамма для контроля качества при диагностике брюшного тифа: на этапах фенотипических исследований (определение чувствительности к антибиотикам: выявление устойчивости высокого уровня к фторхинолонам) и молекулярных исследований (определение механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA).

По литературным данным в различных странах мира выделяют штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, устойчивые к фторхинолонам за счет мутаций в хромосомном гене gyrA. Большинство зарубежных штаммов имеют устойчивость низкого уровня к фторхинолонам, обусловленную одной мутацией вида Ser83Phe. Штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенные в других странах, не могут быть ввезены и использованы в качестве контрольных штаммов при диагностике брюшного тифа в РФ. На территории РФ штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующиеся устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам, обусловленной двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn ранее не обнаружены, не изучены и не депонированы.

При диагностике брюшного тифа необходимо проводить постоянный контроль качества различных этапов исследования, в том числе при определении чувствительности штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к существующим антимикробным препаратам, использующимся для лечения брюшного тифа в качестве препаратов первого выбора (фторхинолонов). Для разработки новых фторхинолонов для лечения брюшного тифа необходимо точно установить механизмы устойчивости к антибиотикам молекулярными методами. Для контроля качества этих этапов исследования требуются контрольные штаммы Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi с известным уровнем устойчивости к фторхинолонам и известным механизмом устойчивости (мутациями в хромосомных генах).

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, выделенный в Камбоджи, который имеет такие же две мутации в хромосомном гене gyrA (Ser83Phe и Asp87Asn), как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения (Kuijpers LMF, Phe Т, Veng СН, Lim K, Ieng S, Kham С, et al. (2017) The clinical and microbiological characteristics of enteric fever in Cambodia, 2008-2015//PLoS. Negl. Trop. Dis. - 2017. - Vol. 11, №9: e0005964. https://doi.org/10.1371/journal. pntd.0005964). Однако данный штамм характеризуется устойчивостью к хинолонам низкого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 0,38 мг/л) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью только низкого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 0,12 до 0,5 мг/л) и не позволяет проводить контроль диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня (с минимальной подавляющей концентрацией ципрофлоксацина от 2,0 до 32,0 мг/л).

Предлагаемый в качестве изобретения штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 помогает преодолеть это ограничение, поскольку характеризуется двумя свойствами, позволяющими использовать его как контрольный штамм (устойчивостью высокого уровня (минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина составляет 6,0 мг/л) и двумя мутациями в хромосомном гена gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) и может быть использован в качестве контрольного штамма при изучении штаммов с устойчивостью высокого уровня в рамках диагностики брюшного тифа.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. serovar Typhi, необходимого для обеспечения достоверной диагностики и лечения брюшного тифа.

Авторами получен контрольный штамм для контроля качества различных этапов лабораторной диагностики брюшного тифа, с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам и двумя мутациями в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.

Заявляемый штамм выделен от больного брюшным тифом, идентифицирован до вида Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi бактериологическими и серологическими методами. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам установлена стандартизованными методами диско-диффузионным и градиентных концентраций; наличие и вид мутаций в хромосомном гене gyrA определено при анализе данных полногеномного секвенирования штамма на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США).

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8452.

Характеристика штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспорообразующие.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 3 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: хемоорганотроф, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, растет на питательных средах (агар Эндо, висмут-сульфит-агар, гектоен-агар, XLD-arap, агар Плоскирева) при оптимальной температуре 37°С при рН 7,2, образуя характерные для бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi колонии.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм относится к группе O9 (D), серовару S.Typhi и имеет антигенную формулу 9,12, Vi:d:-

Основные свойства штамма:

1. Устойчивость высокого уровня к фторхинолонам:

- минимальная подавляющая концентрация налидиксовой кислоты более 256,0 мг/л, диаметр зоны задержки роста - 6 мм;

- минимальная подавляющая концентрация ципрофлоксацина - 6,0 мг/л;

- диаметр зоны задержки роста вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм.

Стабильность свойств штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 (диаметров зон задержки роста и значений минимальных подавляющих концентраций) подтверждена путем повторения в течение 7 дней процедуры определения чувствительности к фторхинолонам диско-диффузионным методом и методом градиентных концентраций с агаром Мюллера-Хинтон, дисков и полосок с антибиотиками различных производителей: Oxoid (Великобритания), BioRad (США), HiMedia (Индия) и НИЦФ (Россия). Штамм давал стабильные результаты на агарах, дисках и полосках всех производителей при тестировании в течение 7 дней.

2. Молекулярный механизм устойчивости к фторхинолонам: две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn. Стабильность наличия мутаций в геноме контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 мес.при -70°С на криосреде.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам диско-диффузионным методом.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам диско-диффузионным методом проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали диски, пропитанные антибиотиками - налидиксовая кислота, 30 мкг и пефлоксацин 5 мкг. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали результат путем измерения зоны задержки роста культуры вокруг дисков с антибиотиками, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: диаметр зоны задержки роста вокруг диска с налидиксовой кислотой - 6 мм, вокруг диска с пефлоксацином - 6 мм и относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам.

Пример 2. Контроль качества определения чувствительности возбудителя брюшного тифа S.Typhi к антимикробным препаратам методом градиентной диффузии.

Чувствительность штаммов Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi к фторхинолонам методом градиентной диффузии проводили согласно Клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» версия 03-2018. Использовали чашки Петри с агаром Мюллера-Хинтон высотой 4 мм. Исследуемые штаммы и контрольный штамм выращивали на кровяном агаре в течении 24 часов при +37°С. Для каждого исследуемого штамма и контрольного штамма отбирали несколько изолированных однотипных колоний и готовили инокулюмы мутностью 0,5 MF в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия. Инокулюмы засевали ватным стерильным тампоном на отдельные чашки Петри с агаром; накладывали градуированные полоски, пропитанные антибиотиками в градиенте концентраций: налидиксовая кислота - от 0,016 мг/л до 256,0 мг/л и ципрофлоксацин - от 0,002 мг/л до 32,0 мг/л. Инкубировали посевы в течении 24 часов при +35°С. Учитывали значение концентрации в месте пересечения эллипсовидной зоны задержки роста штамма с полоской, интерпретировали результат согласно Клиническим рекомендациям и относили исследуемые штаммы к категориям «Чувствительный», «Устойчивый», «Промежуточный». Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства и давал стабильные результаты: значение минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислотой составляло более 256,0 мг/л (полное отсутствие зоны задержки роста вокруг полоски), ципрофлоксацина - 6 мг/л. Контрольный штамм относился к категории «Устойчивый» к фторхинолонам, уровень устойчивости расценивался как высокий.

Пример 3. Контроль качества определения механизма устойчивости к фторхинолонам путем детекции мутаций в гене gyrA по данным полногеномного секвенирования.

Детекцию мутаций в хромосомном гене gyrA проводили путем анализа данных полногеномного секвенирования. Выделение ДНК из исследуемых штаммов и контрольного штамма Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit для выделения ДНК из тканей, мазков, крови и биологическихжидкостей (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество и количество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5×ТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле, а также используя спектрофотометр QIAxpert при длине волны 260 нм. Подготовку библиотек проводили с использованием набора для подготовки библиотек Nextera DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera Index Kit и сменных крышек, магнитных частиц AMPure ХР Beads согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq Reagent Kit v2 и Nextera XT (Illumina, США). Сборку и анализ геномов проводили с помощью CLC Genomics Workbench 8.0 (QIAGEN, США). Поиск мутаций в хромосомных генах, отвечающих за устойчивость к фторхинолонам, у исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили с помощью веб-сервера ResFinder Датского Технического Университета, куда вводили данные секвенирования в формате fasta. Контрольный штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались две мутации в хромосомном гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn.

Для обеспечения достоверной диагностики брюшного тифа необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования материала. Предлагаемый штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать два этапа диагностики: этап определение чувствительности и устойчивости высокого уровня возбудителя к фторхинолонам двумя фенотипическими методами, а также этапа определения механизма устойчивости (двух мутаций в гене gyrA вида Ser83Phe и Asp87Asn) молекулярными методами.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, характеризующийся устойчивостью к фторхинолонам, депонирован Государственной коллекцией патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером B-8452. Штамм Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi B-8452 используется в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа. Изобретение обеспечивает выполнение диагностики штаммов с устойчивостью высокого уровня к фторхинолонам. 3 пр.

Штамм бактерий Salmonella enterica sbsp. enterica serovar Typhi, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8452, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований при диагностике брюшного тифа.