ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской и промышленной микробиологии.

Известна питательная среда следующего состава, г/л: агар-агар 300,0; соевая вода (бобы) 200,0; пептон 10,0; хлористый натрий 5,0 (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. 1950, с. 111).

Недостатком данной среды является то, что при выращивании вакцинного штамма чумного микроба сбор биомассы составляет 27 млрд. м.к.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению относится питательная среда, включающая г/л: агар микробиологический 18,0; гидролизат говяжьего мяса 180,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 4,0; 20%-ный гидроксид натрия 0,0002; дистиллированная вода до 1 л; рН 7,2±0,l (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, 1982, с. 53).

Целью предлагаемого изобретения является повышение накопительных свойств питательной среды, а также ее удешевление.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда содержит в равных количествах ферментативный гидролизат из говяжьего мяса и сои (бобов) и стимулирующую добавку, причем в качестве стимулирующей добавки используют сульфит натрия при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Агар микробиологический 16,0-18,0

Ферментативный гидролизат говяжьего мяса 100,0-150,0

Ферментативный гидролизат бобов сои 100,0-150,0

Натрий хлористый 4,0-6,0

Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,3-0,5

Натрий сернистокислый 0,0003-0,0005

Дистиллированная вода Остальное

Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса в реактор: наливают водопроводную воду из расчета имеющегося мяса (на 1 кг мяса 1,5 л воды). Мясо без жира и сухожилей режут на кусочки размером 2,5×2,5 см. Варят мясо 15 мин, затем вынимают, охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон остывший до 50°С подщелачивают Na₂CO₃ из расчета 3,0 г соды на 1 л взятой в реактор воды. Добавляют поджелудочную железу из расчета 80,0-100,0 г поджелудочной железы на 1 л воды в зависимости от активности поджелудочной железы. Активность должна быть не менее 5 тыс единиц по Фульд-Гроссу. Добавляют хлороформ 2% к общему объему жидкости. Переваривание идет при 37°С. Первые сутки гидролизат мешается механической мешалкой через каждые 15 мин по 5 мин. В дальнейшем переводят на автоматическую мешалку, которая включается через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-9 сутки, мешалку отключают, подогревание прекращают. Дают отстаяться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 2% хлороформа, эапробковывают и хранят при температуре 4-6°С.

Приготовление ферментативного гидролизата бобов сои: семена в количестве 0,5 кг, пятикратно вымачивают в 5 л горячей водой в течение суток, причем последний настой с бобами кипятят в течение 40 мин. Затем настой отливают в 10-литровый баллон, охлаждают, бобы измельчают мясорубкой и помещают в настой. Добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота, измельченную на мясорубке, активностью 5 тыс. единиц по Фульд-Гроссу из расчета 20,0 г на л, устанавливают рН до 8,2 20%-ным раствором натрия гидроокиси в количестве 0,003, добавляют 1% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при 37°С в течение 3 суток. Первые 2 ч смесь перемешивают через каждые 15 мин вручную, последующие сутки перемешивают через каждые 2 ч вручную. Ежедневно измеряют уровень аминного азота, который на 3 сутки гидролиза достигает 0,6±0,05%.

Характеристика ферментативного гидролизата говяжьего мяса: рН 7,2; общий азот 902 мг%; аминный азот 600 мг%; процент расщепления 74,0%; натрия хлорида 0,086%; пептон 1,2%; кальций 4,2 мг%; магний 5,16 мг%; фосфор общий 96,8 мг%; фосфор неорганический 56,4 мг%; сухой остаток 10,0+1,5%; редуцирующие вещества 364 мг%.

Характеристика ферментативного гидролизата бобов сои: рН 7,2; аминный азот 450 мг%; белок 7,8 г/л; мочевина 0,88 г/л; глюкоза 0,23 г/л; калий 0,76 г/л; натрий 5,45 г/л; кальций 0,02 г/л; хлор 0,53 г/л; железо 0,61 г/л.

Из равных основ двух ферментативных гидролизатов готовят питательную среду для выращивания вакцинного штамма чумного микроба следующим образом. Равные объемы гидролизатов разводят дистиллированной водой до показаний аминного азота 0,14% по 0,125 л каждого, натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,004; корректируют рН среды 20%-ным раствором натрия гидроокиси до показаний 7,2, агар микробиологический 17,0; дистиллированная вода остальное.

Среду нагревают в автоклаве при 1 атм 30 мин до полного растворения всех ингредиентов, затем устанавливают рН до 7,2±0,1, разливают в матрацы и стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин.

В качестве примера испытывали культуру вакцинного штамма чумного микроба, выращенную на пластинках 2%-ного агара Хоттингера, рН 7,2 при температуре 28°С в течение 24 ч. Из суточной культуры готовили 1 млрд взвесь микробных клеток тест-штамма, равную 10 ед по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 500 млн м.к. и из данного разведения взвеси культуры высевали по 1 мл в три матраца. Посевы инкубировали при 28°С в условиях термостата. Учет результатов проводили через 48 ч.

Пример 1. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержашей, г/л: агар микробиологический 16,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса 100,0; ферментативный гидролизат сои бобов 100,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 3,0; натрий сернистокислый 0,0003; дистиллированная вода до 1 л. Готовую среду корректируют до рН 7,2 20%-ным раствором натрия гидроокиси или раствором соляной кислоты 1:1. При таком соотношении ингредиентов количество биомассы составило 49 млрд м.к. в 1 мл.

Пример 2. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: агар микробиологический - 17,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 125,0; ферментативный гидролизат сои бобов - 125,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 4,0; натрий сернистокислый - 0,0004; дистиллированная вода до 1 л. Готовую среду корректируют до рН 7,2 20%, раствором натрия гидроокиси или раствором соляной кислоты 1:1. При таком соотношении ингредиентов количество биомассы составило 103 млрд м.к. в 1 мл.

Пример 3. Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: агар микробиологический 18,0; ферментативный гидролизат говяжьего мяса 150,0; ферментативный гидролизат сои бобов 150,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 5,0; натрий сернистокислый 0,0005; дистиллированная вода до 1 л. Готовую среду корректируют до рН 7,2 20%-ным раствором натрия гидроокиси или раствором соляной кислоты 1:1. При таком соотношении ингредиентов количество биомассы составило 45 млрд м. к. в 1 мл.

Таким образом, заявляемая питательная среда (пример 2), приготовленная на основе равных объемов ферментативных гидролизатов говяжьего мяса и сои-бобов, вполне способствует большему накоплению биомассы вакцинного штамма чумного микроба.

Изобретение относится к биотехнологии и санитарной микробиологии, в частности, касается получения питательной среды для накопления биомассы вакцинного штамма чумного микроба. Питательная среда содержит в качестве основы равные объемы ферментативных гидролизатов говяжьего мяса и бобов сои, агар микробиологический, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, натрий сернокислый, дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить накопительные свойства питательной среды, а также сделать ее более дешевой.

Питательная среда для накопления биомассы вакцинного штамма чумного микроба, содержащая ферментативный гидролизат мясного сырья, натрий хлористый, агар микробиологический, натрий фосфорнокислый двузамещенный, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она в качестве ферментативного гидролизата мясного сырья содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса, дополнительно ферментативный гидролизат бобов сои и сернистокислый натрий при следующем содержании ингредиентов, г/л:

Агар микробиологический 16,0-18,0

Ферментативный гидролизат говяжьего мяса 100,0-150,0

Ферментативный гидролизат бобов сои 100,0-150,0

Натрий хлористый 4,0-6,0

Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 0,3-0,5

Натрий сернистокислый 0,0003-0,0005

Дистиллированная вода Остальное