Штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного Dracocephalum palmatum Steph. Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к культивированию штамма суспензионной культуры клеток растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.), и может быть использовано для получения биомассы суспензионных клеток.

Штамм суспензионной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 118 от 10.05.2023 года.

Заявленное изобретение позволяет получить штамм суспензионной культуры клеток из первичных каллусных культур клеток. При этом получаемый штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) характеризуется стабильными ростовыми параметрами и может быть использован в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения). Кроме того, для культивирования штамма суспензионной культуры клеток отсутствует сезонная зависимость.

Культура клеток высших растений может служить альтернативным способом изготовления фитосырья для медицины, ветеринарии, парфюмерии и пищевой промышленности.

В ряде случаев биомасса клеток in vitro превосходит по свойствам полученную от природного или плантационного растения. Культура клеток также оказывается незаменимой в том случае, когда необходимо произвести сырье редких, исчезающих или тропических видов лекарственных растений (см. Решетников В.Н., Спиридович Е.В., Фоменко Т.И., Носов А.М. Растительная биотехнология - способ рационального использования биосинтетического потенциала в журнале Инженерный журнал: наука и инновации, издательство МГТУ им. Н.Э. Баумана (Москва), 2014, № 5 (135), С. 21-25).

Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.

Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum (Steph.) было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum L. было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov D.N., Chirikova N.K., Okhlopkova Z.M., Zulfugarov I.S. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules. 2013 Nov 14; 18(11):14105-21).

Известно, что экстракты змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum (Steph.) обладают антираковой активностью подавляя рост и развитие рассмотренных раковых линий клеток человека (см. Kim J., Kim J.N., Park I., Sivtseva S., Okhlopkova Z., Zulfugarov I.S., Kim S.-W. Dracocephalum palmatum Stephan extract induces caspase- and mitochondria-dependent apoptosis via Myc inhibition in diffuse large B cell lymphoma. Oncol. Rep. 2020, 44, 2746-2756; Lee S.-E., Okhlopkova Z., Lim C., Cho S.I. Dracocephalum palmatum Stephan extract induces apoptosis in human prostate cancer cells via the caspase-8-mediated extrinsic pathway. Chin. J. Nat. Med. 2020, 18, 793-800.

Известен способ получения каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum (Steph.) в условиях in vitro (см. RU №2718253, опубл. 31.03.2020).

При этом в открытых источниках технические решения в области культивирования клеток D. palmatum (Steph.) в качестве суспензионной культуры не выявлены.

Задачей данного изобретения является получение суспензионной культуры клеток представителя рода Dracocephalum L. - Dracocephalum palmatum (Steph.) с устойчивыми морфологическими, биохимическими и ростовыми характеристиками.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм суспензионной культуры клеток Dracocephalum palmatum (Steph.) (NEFU Dpalm-2) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.

Заявленное изобретение иллюстрируется чертежом, где показана диаграмма роста сырой и сухой биомассы суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного, культивированной in vitro на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты (0,2 мг/л) и α-нафтилуксусной кислоты (0,5 мг/л).

Штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 118 от 10.05.2023 года.

Для интродукции в суспензионную культуру в качестве экспланта была взята каллусная культура клеток змееголовника дланевидного, полученная из листьев стерильных проростков растения. Состав питательной среды представлен в таблице 1.

В асептических условиях при помощи пинцета в колбы на 250 мл с жидкой питательной средой Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиукусусной кислоты и 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты помещали кусочки каллусной ткани, после чего, колбы ставили в мульти-шейкер при постоянном перемешивании на скорости 120 об/мин. Спустя 4 недели, при отсутствии признаков разрыхления каллуса до достояния суспензии, первичную суспензионную культуру пересаживали, при этом часть питательной среды сливали оставляя 1/3 среды с инокулянтом, поверх заливали по 100 мл свежей жидкой питательной среды с тем же составом. До разрыхления каллусной ткани до состояния суспензии, питательную среду меняли 3-4 раза, аккуратно сцеживая, не сливая каллусные биомассы с колб для культивирования.

После перехода каллусной ткани в суспензию из полученной первичной суспензионной культуры клеток с помощью простерилизованной силиконовой трубки с фильтрами в виде ваты и стеклянных пипеток извлекали примерно по 20 мл суспензии на 100 мл свежей жидкой питательной среды Мурасиге-Скуга с добавлением 0,2 мг/л бензиламинопурина и 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты. При этом культивирование суспензии проводили в условиях темноты, обеспечиваемой крафтовой бумагой, завернутой вокруг колб, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5% на мульти-шейкере (PSU-20i, Орбитальный шейкер; BioSan, Латвия) при скорости перешивания 100±20 об/мин. Цикл субкультивирования составил 3 недели. Таким образом была получена суспензионная культура клеток змееголовника дланевидного из биомассы каллусной культуры клеток, обладающая устойчивыми морфологическими, биохимическими и ростовыми характеристиками.

Во время процесса оптимизации питательной среды были определены цитологические и ростовые характеристики. Исходя из этих данных, культивируемый штамм можно отнести к жизнеспособным хорошо растущим (см. чертеж). Суспензионная культура характеризуется стабильными ростовыми характеристиками и отсутствием сезонной зависимости, параметры роста представлены в таблице 2.

Штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) имеет следующие морфологические признаки: суспензионная биомасса преимущественно неморфогенная, однородная, темно-коричневой окраски со светло-бежевыми участками. Состоит из дедифференцированных агрегатов паренхимоподобных иногда меристемоподобных клеток, а также содержит одиночные паренхимоподобные и меристемоподобные клетки.

Таким образом, заявленное решение позволяет получить суспензионную культуру клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro. При этом штамм каллусной культуры клеток характеризуется стабильными ростовыми параметрами с отсутствием сезонной зависимости при культивировании и может быть использован в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию штамма суспензионной культуры клеток растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.), и может быть использовано для получения биомассы суспензионных клеток. Штамм NEFU Dpalm-2 суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного, полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 118. Штамм используется для получения биомассы клеток Dracocephalum palmatum Steph. и характеризуется устойчивыми морфологическими, биохимическими и ростовыми характеристиками. Заявленное изобретение может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения). 1 ил., 2 табл.

Штамм суспензионной культуры клеток змееголовника дланевидного Dracocephalum palmatum Steph. NEFU Dpalm-2, депонированный в коллекции – депозитарии ВККК ВР под регистрационным номером 118 для использования в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего биологически активные соединения.