ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИЙ КЛАССА CORIOBACTERIIA ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЖКТ Российский патент 2021 года по МПК A61K35/741 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[001] Настоящее изобретение относится к применению микроорганизма класса Coriobacteriia для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта. Также предложен способ продуцирования хенодезоксихолевой кислоты (CDCA) и способ продуцирования литохолевой кислоты (LCA).

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[002] Согласно биомедицинской литературе, желчные кислоты или желчные соли имеют 24 атома углерода, откуда следует их условное обозначение «желчные кислоты C₂₄» в противоположность «примитивным» желчным кислотам, имеющим 25-27 атомов углерода (желчные кислоты C₂₇, C₂₆, C₂₅) и встречающимся в пуле желчных кислот у примитивных (например, целаканты и акулы) и менее примитивных (например, пресмыкающиеся и земноводные) позвоночных. У высших позвоночных основную долю желчи составляют желчные кислоты C₂₄ (Hofmann et al. (1992) “A proposed nomenclature for bile acids” Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604). В печени происходит синтез желчных кислот из холестерина и получение из крови реабсорбированных желчных кислот. Желчные кислоты вместе с холестерином и фосфолипидами секретируются из гепатоцитов в желчь против высокого градиента концентрации. Таким образом, в период между приемами пищи, большая часть пула желчных кислот скапливается в желчном пузыре, готовая к применению в любой момент.

[003] Первичные желчные кислоты представляют собой желчные кислоты, синтезируемые как таковые в печени, и включают в основном холевую (CA) и хенодезоксихолевую (CDCA) кислоты. Перед секрецией в желчь они в основном конъюгируют с глицином и таурином, что повышает их растворимость в воде. После высвобождения в кишечнике, желчные кислоты стимулируют абсорбцию жиров и жирорастворимых витаминов из пищи.

[004] Вторичные желчные кислоты являются производными первичных желчных кислот, и образуются в результате их модификации кишечными бактериями. Основные варианты модификаций включают деконъюгацию, окисление гидроксильных групп в положениях 3, 7 и 12 и 7-дегидроксилирование. Основные вторичные желчные кислоты представляют собой литохолевую (LCA) и дезоксихолевую (DCA) кислоты.

[005] Тем не менее, желчные кислоты не только участвуют в пищеварении, но и оказывают влияние на здоровое состояние и при заболеваниях. Кроме того, указанные кислоты функционируют как сигнальные молекулы. Например, желчные кислоты могут быть одним из множества факторов, влияющих на состав кишечной микрофлоры или оказывающих антимикробное воздействие (Boesjes and Brufau (2014) “Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease” Current Medicinal Chemistry, 21, 2822-2829).

[006] В частности, желчные кислоты опосредуют влияние на целостность и работу желудочно-кишечного тракта у поросят раннего отъема. Доступные экспериментальные данные указывают на то, что активация сигнальных путей в кишечнике, регулируемых желчными кислотами, обеспечивает стимуляцию высвобождения эндогенного ГПП-2, что улучшает целостность ЖКТ в экспериментальных моделях атрофии и дисфункции кишечника (de Diego-Cabero et al. (2015) “Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.” BMC veterinary research 11:111).

[007] В этой связи отмечено, что кишечный барьер и здоровье ЖКТ в целом определяют количество патогенов, которые могут мигрировать из просвета кишечника в организм, что в свою очередь повышает восприимчивость к болезни. Кроме того, чем лучше функционирует кишечный эпителий, тем больше усваивается питательных веществ, от которых в свою очередь зависит потенциал роста животных. Таким образом, здоровое состояние кишечного барьера оказывает значительное влияние на хорошее состояние животных.

[008] В принципе, можно выделить три стратегии усиления кишечного барьера, например, у поросят на этапе доращивания:

1) улучшение вкусовых качеств корма для увеличения потребления корма;

2) добавление незаменимых питательных веществ для компенсации потерь, связанных с повреждением кишечного барьера;

3) добавление биологических активных веществ для усиления кишечного барьера.

[009] Для решения описанных выше проблем и недостатков, возникла потребность в разработке концепции кормления поросят на доращивании, которая является с одной стороны эффективной, и с другой стороны может быть легко применена в практических условиях.

[0010] Кроме того, существовала необходимость в разработке способов/применений для стимуляции здоровья ЖКТ у здоровых субъектов.

[0011] Решение, предложенное в настоящем изобретении, описано ниже, подтверждено примерами в разделе экспериментальных данных, проиллюстрировано на фигурах, и охарактеризовано в формуле изобретения.

[0012] Настоящее изобретение относится к применению микроорганизма класса Coriobacteriia для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта.

[0013] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения хенодезоксихолевой кислоты (CDCA), включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с гликохенодезоксихолевой кислотой (G-CDCA);

с получением тем самым хенодезоксихолевой кислоты.

[0014] Кроме того, предложен способ получения литохолевой кислоты (LCA), включающий

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с хенодезоксихолевой кислотой (CDCA);

с получением тем самым литохолевой кислоты.

[0015] Настоящее изобретение также относится к способу стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта, включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с организмом субъекта.

[0016] В разделе Фигур представлены:

[0017] Фиг. 1 Результаты, полученные в эксперименте in vitro.

[0018] Фиг. 2 Влияние BBSH 797 на концентрацию желчных кислот в плазме крови (среднее значение ± стандартное отклонение, День 42) у поросят на доращивании. Животные (n = 8) получали корм для доращивания (Группа A) или корм для доращивания с добавлением BBSH 797 (2,2 * 10⁹ колониеобразующих единиц/кг корма, Группа B) в течение 42 дней. Статистически значимые различия (p <0,05) между двумя группами отмечены индексами (a, b).

[0019] Фиг. 3 Влияние BBSH 797 на соотношение лактулозы/рамнозы в моче поросят на доращивании через шесть часов после принятия раствора сахара (500 мг лактулозы на 1 кг массы тела, 100 мг рамнозы на 1 кг массы тела, День 43). Животные (n = 8) получали корм для доращивания (Группа A) или корм для доращивания с добавлением BBSH 797 (2,2 * 10⁹ колониеобразующих единиц/кг корма, Группа B) в течение 44 дней. Статистически значимые различия (p <0,05) между группами отмечены индексом (*).

[0020] Неожиданно было обнаружено, что микроорганизм класса Coriobacteriia, а именно, штамм DSM 11798, стимулирует здоровье ЖКТ у субъекта. Авторы настоящего изобретения разработали схему кормления, которая усиливает кишечный барьер у субъектов. Это достигается добавлением к корму указанного субъекта бактерии BBSH 797 (новый род семейства Eggerthellaceae) штамма 11798 (DSM 11798).

[0021] Добавление BBSH 797 к корму приводит к значительному увеличению количества гликолитохолевой и тауролитохолевой желчных кислот у поросят на доращивании. Данные желчные кислоты являются посредниками, запускающими каскады молекулярных механизмов, ведущих в итоге к значительному улучшению целостности ЖКТ у поросят на доращивании. Конкретнее, добавление BBSH 797 приводит к росту удельного содержания гликолитохолевой и тауролитохолевой кислот в плазме крови у поросят на доращивании. Это имеет биологическое значение, поскольку данные вещества являются сильными природными агонистами рецепторов TGR5 (Schaap et al. (2014) “Bile acid receptors as targets for drug development” Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 11(1):55-67; Kawamata et al. (2003) “A G protein-coupled receptor responsive to bile acids*” vol. 278, no. 11, pp. 9435-9440). Данные рецепторы располагаются в клеточных мембранах определенных видов эпителиальных клеток кишечника (L-клетки). После активации данные рецепторы запускают каскад, который в итоге ведет к высвобождению глюкагоноподобного пептида 2 (ГПП-2).

[0022] При этом экзогенный ГПП-2 может восстанавливать рост слизистой, межклеточный транспорт и экспрессию белков плотного контакта, регулирующих парацеллюлярную проницаемость. Дальнейшее постоянное введение ГПП-2 может увеличивать высоту ворсинок и глубину кишечных крипт в тонком и толстом кишечнике. Также было показано, что введение аналога ГПП-2 пролонгированного действия может повышать массу кишечника и активность ферментов. Некоторые из этих положительных эффектов ГПП-2 были получены у поросят раннего отъема (de Diego-Cabero et al. (2015) “Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.” BMC veterinary research 11:111). Аналогичным образом, Connor et al. (2016) обнаружили, что ГПП-2 инициирует разнообразные реакции в кишечнике, улучшая здоровье ЖКТ, что особенно заметно в усилении кишечного барьера (Connor et al. (2016) “Glucagon-like peptide 2 and its benefcial effects on gut function and health in production animals” Domestic Animal Endocrinology 56, S56-S65).

[0023] В последующих экспериментах авторы настоящего изобретения показали наличие корреляции между повышенной концентрацией гликолитохолевой и тауролитохолевой кислот и/или введением BBSH 797 и улучшением кишечного барьера. Целостность кишечного барьера оценивали методом анализа соотношения двух сахаров. В основе указанного анализа лежит одновременное введение лактулозы и рамнозы. Дисахарид лактулоза проникает в кровяное русло только парацеллюлярно сквозь узкие щели между отдельными клетками кишечного эпителия. В свою очередь, моносахарид рамноза попадает в тело как парацеллюлярно, так и трансцеллюлярно, через клетки кишечника. По мере ослабления кишечного барьера интерстициальное пространство становится все более и более проницаемым, в результате чего абсорбируются сравнительно большие количества дисахаридов. Как следствие, растет соотношение лактулозы/рамнозы в моче. Низкое соотношение лактулозы/рамнозы связывают с неповрежденным или усиленным кишечным барьером (Wijtten et al., (2011) “Intestinal barrier function and absorption in pigs after weaning: a review.” Br J Nutr 105:967-981). В разделе экспериментальных данных в настоящей заявке показано, что введение BBSH 797 в течение нескольких недель привело к значительному уменьшению соотношения лактулозы/рамнозы в моче. Это доказывает, что кишечный барьер усиливается при применении BBSH 797. Следовательно, здоровье ЖКТ стимулируется BBSH 797.

[0024] Кроме того, в экспериментах in vitro было неожиданно обнаружено, что BBSH 797 способен преобразовывать гликохенодезоксихолевую кислоту в хенодезоксихолевую. Согласно имеющимся в литературе данным, последняя может вызывать высвобождение ГПП-2. Как указывается в статье de Diego-Cabero, повышение уровня ГПП-2 ведет к улучшенной целостности кишечника (de Diego-Cabero et al. (2015) “Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.” BMC veterinary research 11:111).

[0025] Таким образом, настоящее изобретение относится к применению микроорганизма класса Coriobacteriia для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта.

[0026] В настоящем изобретении «микроорганизм класса Coriobacteriia» может быть любым микроорганизмом класса Coriobacteriia. Таксономия класса Coriobacteriia приводится по Gupta et al. (2013) “Molecular signatures for the class Coriobacteriia and its different clades; proposal for division of the class Coriobacteriia into the emended order Coriobacteriales, containing the emended family Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam. nov., and Eggerthellales ord. nov., containing the family Eggerthellaceae fam. nov.” Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63 (Pt 9), p.3379-3397, а также по данным сайта NCBI, посвященного таксономии (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi, онлайн-версия была доступна 15 октября 2017 г.) и сайта LPSN bacterioi.net (http://www.bacterio.net/eggerthella.html, онлайн-версия была доступна 15 октября 2017 г.).

[0027] В классе Coriobacteriia можно выделить в качестве примера порядки Coriobacteriales и Eggerthellales. Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм порядка Coriobacteriales или порядка Eggerthellales. Далее предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм порядка Coriobacteriales. Также предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм порядка Eggerthellales.

[0028] Микроорганизм порядка Coriobacteriales может включать любой микроорганизм порядка Coriobacteriales. В качестве примера в порядке Coriobacteriales можно выделить семейства Atopobiaceae, Coriobacteriaceae и неклассифицированные Coriobacteriales. Микроорганизм порядка Eggerthellales включать любой микроорганизм порядка Eggerthellales. В качестве примера в порядке Eggerthellales можно выделить семейства Eggerthellaceae и неклассифицированные Eggerthellales. Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм семейства Coriobacteriaceae. Также предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм семейства Eggerthellaceae.

[0029] В качестве примера в семействе Atopobiaceae можно выделить роды Atopobium, Libaniococcus, Olsenella и неклассифицированные Atopobiaceae. В качестве примера в семействе Eggerthellaceae можно выделить роды Adlercreutzia, Arabia, Asaccharobacter, Cryptobacterium, Denitrobacterium, Eggerthella, Enterorhabdus, Gordonibacter, Paraeggerthella. Phonicibacter, Raoultibacter, Slackia и неклассифицированные Eggerthellaceae. Настоящее изобретение предполагает, что микроорганизм согласно настоящему изобретению относится к роду неклассифицированные Eggerthellaceae. В качестве примера в семействе Coriobacteriaceae можно выделить роды Collinsella, Coriobacterium и неклассифицированные Chriobacteriales. Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм семейства Eggerthellaceae. Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм рода DSM11798.

[0030] Далее предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой микроорганизм штамма DSM11798, который в настоящей заявке также обозначается BBSH 797. Штамм DSM11798 был зарегистрирован в реестре DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Маршеродер Вег 1б, Д-38124 Брауншвейг, Германия, 17 сентября 1997 г.

[0031] Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой на 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 (16S РНК последовательность DSM11798) и/или SEQ ID NO: 2.

[0032] В настоящем изобретении термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «нуклеиновая кислота» включает в себя любую молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую нуклеотидную последовательность оснований, состоящую из пуриновых и пиримидиновых оснований, которые входят в состав указанной молекулы нуклеиновой кислоты и в которой указанные основания представляют первичную структуру молекулы нуклеиновой кислоты. Известно, что в последовательности нуклеиновых кислот могут включаться ДНК, кДНК, геномная ДНК, РНК, кодирующие и некодирующие цепи, а также неприродные и дериватизированные нуклеотидные основания. Полинуклеотид может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может быть немодифицированной РНК или ДНК или модифицированной РНК или ДНК. Термин «РНК» относится ко всем молекулам РНК. В качестве примеров молекул РНК можно привести информационную РНК (иРНК), транспортную РНК и рибосомальную РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть любой 16S рРНК.

[0033] ДНК и РНК могут быть различным образом модифицированы; таким образом, термин «молекулы нуклеиновых кислот» может охватывать формы, прошедшие химическую, ферментативную или метаболическую модификацию. «Модифицированные» основания, например, включают в себя тритилированные и необычные основания, такие как инозин. Модифицированные молекулы нуклеиновых кислот можно, например, применять для обнаружения молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящем изобретении.

[0034] В настоящем изобретении термин «идентичный» или «процент идентичности» по отношению к двум и более молекулам нуклеиновых кислот указывает на две или более последовательности, которые совпадают полностью или имеют определенный процент совпадающих нуклеотидов (например, не менее 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности) при сравнении и выравнивании для получения максимального соответствия в окне сравнения или над определенным участком и измерении с помощью существующего алгоритма сравнения последовательностей или при ручном выравнивании и визуальной оценке. Последовательности, имеющие, например, процент идентичности от 80% до 95% и более, считаются по существу идентичными. Это же определение относится к комплементарной последовательности, используемой в анализе. Известны способы определения процента идентичности между/среди последовательностей, применяя, например, алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245).

[0035] Кроме того, известны алгоритмы поиска локального выравнивания BLAST и BLAST 2.4 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). По умолчанию в программе BLASTN для работы с последовательностями нуклеиновых кислот задана длина слова (W) 28, порог ожидания 10 и параллельное сравнение обеих нитей. Кроме того, может применяться матрица замен BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915).

[0036] Например, BLAST2.4 (аббревиатура от англ. «средство поиска основного локального выравнивания») (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), можно применять для поиска локальных выравниваний последовательностей.

[0037] Известны способы получения микроорганизма, примененные в настоящем изобретении. Обычно это делается путем выделения микроорганизма согласно настоящему изобретению из какого-либо источника, например, DSM11799. Затем микроорганизм может быть выращен в культуре или ферментационном растворе. В альтернативном варианте источник, содержащий микроорганизм, может быть сразу выращен в культуре или ферментационном растворе. После выращивания микроорганизм может быть очищен. Также предполагается, что применяют культуру или ферментационный раствор, в котором был выращен микроорганизм.

[0038] Например, такой микроорганизм может быть получен, как описано в WO 99/35240. Согласно указанному описанию, штамм DSM 11798 может быть выделен из сокультуры DSM 11799. При этом штамм DSM11799 также был зарегистрирован в реестре DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH, Маршеродер Вег 1б, Д-38124 Брауншвейг, Германия, 17 сентября 1997 г.

[0039] Активная грамположительная бактерия BBSH 797 (DSM 11798) была первоначально (и неоднократно) выделена из содержимого нескольких бычьих рубцов в стандартных анаэробных условиях в присутствии антибиотиков, направленных против грамотрицательных бактерий. Способы выделения и получения представляющего интерес микроорганизма известны специалисту в данной области техники.

[0040] Далее предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению представляет собой анаэробную грамположительную бактерию. Дополнительно или в альтернативном варианте, микроорганизм согласно настоящему изобретению может иметь палочковидную форму. Дополнительно или в альтернативном варианте, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть неспорообразующим. Дополнительно или в альтернативном варианте, микроорганизм согласно настоящему изобретению может иметь длину от 0,1 до 3 мкм. Он может встречаться по одиночке, в парах или в более длинных цепях, в частности, длиной до приблизительно 150 мкм. Специалисту в данной области техники известны способы измерения таких параметров.

[0041] Дополнительно или в альтернативном варианте, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть способен преобразовывать G-CDCA в CDCA, как описано в другом месте настоящей заявки. Дополнительно или в альтернативном варианте, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть способен преобразовывать CDCA в LCA, как описано в другом месте настоящей заявки.

[0042] Микроорганизм согласно настоящему изобретению можно применять в виде «цельных» одноклеточных микроорганизмов, то есть визуально не поврежденных микроорганизмов. Также предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть жизнеспособным или живым микроорганизмом.

[0043] Также предполагается возможность применения препарата из микроорганизма. Это означает, что микроорганизмы могут не присутствовать в целом виде, но могут присутствовать в виде фрагментов клеток, или что присутствуют ДНК и/или 16S рРНК или особые ферменты микроорганизма.

[0044] Например, чтобы определить наличие BBSH 797 в композиции или применение BBSH 797 согласно настоящему изобретению, может быть проведен анализ последовательности 16S рРНК стандартными методами экстракции ДНК, ПЦР-амплификации участка ДНК, кодирующего 16S рРНК, и секвенирования ДНК ПЦР-ампликона.

[0045] Дополнительно или в альтернативном варианте, особенно в отношении таких композиций, как корм, для определения и идентификации BBSH 797 может применяться полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Таким образом, ДНК может быть экстрагирована и очищена из образцов/композиций стандартными способами. Анализ ПЦР-РВ может быть основан на поиске маркерных генов, например, последовательности гена 16S рРНК BBSH 797, как показано в последовательности SEQ ID NO: 1 (дополнительно или в альтернативном варианте также гена cpn60, как показано в SEQ ID NO: 2). Поскольку ген 16S рРНК содержит консервативные и вариабельные области, то для специфического обнаружения BBSH 797 можно в качестве цели для праймеров использовать вариабельные области, как описано Matsuki et al. 7220-7228, что обеспечивает специфическую амплификацию последовательности РНК BBSH 797 в образцах, например, корма (Matsuki et al. (2004) “Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces.” Applied and Environmental Microbiology 70(12): 7220-7228). Интенсивность флуоресцентного сигнала в реакции ПЦР-РВ пропорциональна количеству ПЦР-продукта и позволяет судить о наличии целевой последовательности в образце. Дополнительную информацию о специфичности ампликона дает анализ кривой плавления, основанный на различии характеристик плавления в зависимости от последовательности.

[0046] Таким образом, под термином «микроорганизм» также понимаются препараты микроорганизма. Настоящее изобретение предусматривает применение микроорганизма в виде препарата микроорганизма. В состав препарата могут входить другие молекулы и/ или белки и/или вещества, например, остатки буферного раствора, использованного для выделения и/или выращивания микроорганизма согласно настоящему изобретению.

[0047] Микроорганизм согласно настоящему изобретению можно обеспечивать в составе композиции. В принципе, микроорганизм можно обеспечивать в составе любой композиции, приемлемой с учетом вариантов и способов применения, предусмотренных настоящим изобретением.

[0048] Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению композиции, содержащей микроорганизм класса Coriobacteriia, для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта. К примерам композиций относятся пищевые композиции, кормовые композиции, жидкие композиции, например, для питья. Предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в составе пищевой и/или кормовой композиции. Микроорганизм согласно настоящему изобретению также может быть обеспечен в виде кормовой добавки или препарата кормовой добавки.

[0049] Таким образом, настоящее изобретение относится к применению микроорганизма класса Coriobacteriia для приготовления композиции для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта.

[0050] Способы приготовления пищевых и кормовых композиций известны специалисту в данной области техники, в том числе, описаны в WO 99/35240.

[0051] Например, культуру или ферментационный раствор, содержащий микроорганизм согласно настоящему изобретению, можно концентрировать путем центрифугирования или фильтрования и/или стабилизации, в частности, методами лиофилизации, сушки распылением или инкапсуляции. При этом, например, культуру или ферментационный раствор, содержащий микроорганизм согласно настоящему изобретению, можно концентрировать на первом этапе способом первичного удаления жидкости в центрифуге или путем фильтрации и/или проводя стабилизацию непосредственно в ферментационном растворе. Также предполагается наличие в описываемой композиции наполнителя, регулятора высвобождения и/или вещества-носителя, например, алюмосиликатов, диатомита, углеводородов, сахарных спиртов, крахмала, сухого молока и сыворотки, гидролизатов белков, дрожжей, муки из морских водорослей и/или поливинилполипирролидона (ПВПП). Также предполагается добавление дрожжей и/или муки из морских водорослей в качестве носителя. Также предполагается применение диатомита в качестве регулятора высвобождения. Добавление указанных носителей или наполнителей позволяет, например, на следующем этапе стабилизации, таком как путем лиофилизации, сушки распылением, инкапсуляции при гранулировании, получать твердый продукт, в котором культура микроорганизма согласно настоящему изобретению нанесена непосредственно на носитель. Микроорганизм или смешанная культура с ним может быть нанесена на вещество, имеющее большую площадь внутренней поверхности, например, на каолин, алюмосиликаты, цеолиты и т.п. В частности, микроорганизм может быть нанесен на дрожжи и/или муку из морских водорослей.

[0052] Дополнительно или в альтернативном варианте, в состав композиции может входить вещество-носитель вещество и/или наполнитель и/или регулятор высвобождения. Добавление веществ-носителей и наполнителей позволяет, при необходимости, физически связывать вредные субстанции, подлежащие разложению, которые могут содержаться в корме, тем самым выводя их из метаболизма. Для этого, в частности, в качестве вещества-носителя и/или наполнителя можно применять силикаты алюминия, диатомит, углеводороды, сахарные спирты, крахмал, сухое молоко и сыворотку, гидролизаты белков, дрожжи и/или поливинлполипирролидон.

[0053] В состав композиции согласно настоящему изобретению может входить лиофилизированный или высушенный распылением микроорганизм класса Coriobacteriia в количестве от 1 до 99% по массе, предпочтительно от 0,5 до 1% по массе и/или от 99 до 1% по массе вещества-носителя и/или вещества-наполнителя.

[0054] Композиция может быть кормовой добавкой. Кормовая добавка может применяться в количестве от 0,1 до 8,0 кг на 1000 кг композиции, например, кормовой или пищевой композиции, в частности, от 0,5 до 2,0 кг на 1000 кг композиции, например, кормовой или пищевой композиции.

[0055] В состав композиции может дополнительно или в альтернативном варианте входить один или более пробиотиков. В настоящем изобретении термин «пробиотики» относится к микроорганизмам, потребление которых, как считается, приносит пользу здоровью. Пробиотики должны быть живыми в момент введения. В принципе, допустимо применение любого пробиотика. Специалисту в данной области техники известны пробиотики, которые можно применять согласно настоящему изобретению.

[0056] Таким образом, в состав композиции может входить один или более микроорганизмов, отличных от микроорганизма согласно настоящему изобретению. В принципе, в состав композиции может быть включен любой подходящий микроорганизм. В качестве примера, можно привести микроорганизмы Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Listeria monocytogenes и виды родов Lactobacillus и Bifidobacterium, такие как Bifidobacterium bifidum, и микроорганизмы, обладающие эквивалентными биологическими функциями, рода Clostridium, например, Clostridium perfringens, и рода Eubacteria.

[0057] Композиция может дополнительно или в альтернативном варианте включать один или более пребиотиков. В настоящем изобретении термин «пребиотики» относится к пищевым ингредиентам, стимулирующим рост или активность полезных микроорганизмов (например, бактерий и грибов). Точнее, пребиотиком может быть селективно ферментированный ингредиент, обеспечивающий специфические благоприятные изменения как в составе, так и/или в активности кишечной микрофлоры. В принципе, допустимо применение любого пребиотика. Специалисту в данной области техники известны пребиотики, которые допустимо применять согласно настоящему изобретению.

[0058] Пребиотиками могут быть неперевариваемые волокна, проходящие передний отдел ЖКТ без изменений и стимулирующие рост или активность полезных бактерий, населяющих толстый кишечник, поскольку служат субстратом для их роста. В качестве источника пребиотиков в композицию можно добавлять пищевые продукты, среди прочего, гуммиарабик молотый, молотый сушеный корень цикория, молотый сушеный топинамбур, молотую сушеную ботву одуванчиков, молотый сушеный чеснок, молотый сушеный лук-порей, молотый сушеный лук, молотую спаржу, пшеничные отруби, цельнозерновую муку и молотый вареный банан. К пребиотикам могут также относиться волокна, описанные Slavin (2013) “Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Benefits” Nutrients. 5(4): 1417-1435. Галактоолисахариды также могут быть пребиотиками.

[0059] Таким образом, в состав композиции может дополнительно или в альтернативном варианте входить один или несколько источников галактоолигосахаридов. Например, композиция может быть дополнительно обогащена одним или несколькими из следующих веществ: жидкое молоко, сухое молоко в виде цельного сухого молока, обезжиренного сухого молока, обезжиренного сухого молока с добавлением жиров, сухой сыворотки, ферментированные молочные продукты, напитки, злаки, хлеб, кормовые и пищевые добавки, биологически активные добавки, животные корма, корма для птицы или любой другой продукт питания или напиток. Подробнее о галактоолигосахаридах и их получении описано, например, у Torres et al. (2010) “Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics” Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 9, Issue 5, p. 438-454.

[0060] Дополнительно или в альтернативном варианте в состав композиции может входить как минимум один компонент из группы витаминов, минералов, ферментов и веществ для нейтрализации микотоксинов. Ферменты могут относиться к группе протеаз, амилаз, целлюлаз или глюканаз, гидролаз, липолитических ферментов, маннозидаз, оксидаз, оксидоредуктаз, фитаз и ксиланаз, в том числе, в различных сочетаниях. Компоненты для нейтрализации микотоксинов могут относиться к детоксифицирующим микотоксины ферментам, таким как афлатоксин-оксидаза, эрготамин-гидролазы, эрготамин-амидазы, охратоксин-амидазы, фумонизин-карбоксилестеразы, фумонизин-аминотрансферазы, аминополиол-аминоксидазы, дезоксиниваленол-эпоксидгидролазы, зеараленон-гидролазы; или к детоксифицирующим микотоксин микроорганизмам; или к связывающим микотоксин компонентам, таким как клеточные стенки микроорганизмов или неорганические вещества, таким как бентонит. Также предполагается возможность включения в композиции бентонита и/или фумонизин-аминотрансферазы, например, EC 3.1.1.87.

[0061] Далее предполагается, что микроорганизм или композиция согласно настоящему изобретению может быть обеспечена в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70 или более дней. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в течение 42 или 44 дней. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может также быть обеспечен в течение 70, 60, 50, 45, 40 и менее дней.

[0062] Далее предполагается, что микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в дозировке 0,25*10⁹, 0,5*10⁹, 0,75*10⁹, 1,0*10⁹, 1,25*10⁹, 1,5*10⁹, 1,75*10⁹, 2,0*10⁹, 2,25*10⁹, 2,5*10⁹, 2,75*10⁹, 3,0*10⁹, 3,25*10⁹, 3,5*10⁹, 3,75*10⁹, 4,0*10⁹, 4,25*10⁹, 4,5*10⁹, 4,75*10⁹, 5,0*10⁹ и более колониеобразующих единиц на кг. Микроорганизм может быть обеспечен в такой дозировке в составе композиции, например, в кормовой и/или пищевой (композиции), которую может принять субъект. Например, микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в дозировке не менее 2,0*10⁸, 5,0*10⁸, 7,0*10⁸, 1,0*10⁹, 2,0*10⁹ или не менее 2,2*10⁹ колониеобразующих единиц на кг. Микроорганизм может быть обеспечен в такой дозировке в составе композиции, например, в кормовой и/или пищевой (композиции), которую может принять субъект. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может даваться в дозировке менее 5,0*10⁹, 4,5*10⁹, 4,0*10⁹, 3,5*10⁹, 3,0*10⁹, 2,5*10⁹, 2,0*10⁹, 1,5*10⁹ или менее колониеобразующих единиц на кг. Микроорганизм может быть обеспечен в такой дозировке в составе композиции, например, в кормовой и/или пищевой (композиции), которую может принять субъект. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в дозировке менее 5,0*10⁹, 4,5*10⁹, 4,0*10⁹, 3,5*10⁹, 3,0*10⁹, 2,5*10⁹, 2,0*10⁹, 1,5*10⁹, 1,0*10⁹, 9,0*10⁸, 8,0*10⁸, 7,0*10⁸, 6,0*10⁸, 5,0*10⁸, 4,0*10⁸, 3,0*10⁸, 2,0*10⁸, 1,0*10⁸ или менее колониеобразующих единиц на кг. Микроорганизм может быть обеспечен в такой дозировке в составе композиции, например, в кормовой и/или пищевой (композиции), которую может принять субъект. Микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть обеспечен в дозировке 7,0*10⁹-1,0*10⁸, 6,0*10⁹-2,0*10⁸, 5,0*10⁹-3,0*10⁸, 4,0*10⁹-5,0*10⁸, 3,0*10⁹-6,0*10⁸ или 2,5*10⁹-8,5*10⁸ колониеобразующих единиц на кг. Микроорганизм может быть обеспечен в такой дозировке в составе композиции, например, в кормовой и/или пищевой (композиции), которую может принять субъект.

[0063] Понятно, что при применении микроорганизма согласно настоящему изобретению в качестве кормовой добавки, количество колониеобразующих единиц в корме может значительно превышать количество колониеобразующих единиц в итоговой композиции, например, в (итоговой или кормовой) композиции, как описано в настоящей заявке.

[0064] В настоящем изобретении термин «колониеобразующая единица» или «КОЕ» относится к оценке числа жизнеспособных бактерий в образце. Под жизнеспособностью понимается способность к размножению делением в контролируемых условиях. Специалисту в данной области техники известны способы определения КОЕ.

[0065] Также настоящее изобретение предполагает, что микроорганизм согласно настоящему изобретению способен преобразовывать или преобразует гликохенодезоксихолевую кислоту (G-CDCA) в хенодезоксихолевую кислоту (CDCA).

[0066] Далее, настоящее изобретение предполагает, что микроорганизм согласно настоящему изобретению может повышать содержание у субъекта гликолитохолевой (GLCA) и/или тауролитохолевой (TLCA) кислоты, например, по сравнению с содержанием/концентрацией GLCA и/или TLCA до введения микроорганизма или в в сравнении с соответствующим контролем. Например, содержание гликолитохолевой (GLCA) и/или тауролитохолевой (TLCA) кислоты можно измерить по образцу, например, по образцу крови или плазмы, полученному от субъекта. Специалисту в данной области техники известны способы измерения присутствия GLCA и TLCA. Например, данные желчные кислоты можно измерять с помощью ВЭЖХ или готового набора ИФА.

[0067] Описываемый в настоящей заявке микроорганизм применяют для стимуляции здоровья ЖКТ у здорового субъекта.

[0068] В настоящем изобретении термин «здоровье ЖКТ» означает здоровое состояние желудочно-кишечного тракта. Для определения здоровья ЖКТ могут быть использованы любые маркеры, специфические характеристики, морфологические признаки и прочие аспекты. Подобные маркеры, специфические характеристики, морфологические признаки и прочие аспекты известны специалисту в данной области техники. В качестве примера можно привести способы, описанные среди прочего в Derikx et al. (2010) “Non-invasive markers of gut wall integrity in health and disease” World Journal of Gastrology 16(42):5272-5279.

[0069] Далее предполагается, что здоровье ЖКТ стимулируется, если повышается/стимулируется целостность кишечника. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению микроорганизма класса Coriobacteriia для стимуляции целостности кишечника у здорового субъекта.

[0070] В настоящем изобретении термин «целостность кишечника» означает целостность кишечного (эпителиального) барьера. Кишечный (эпителиальный) барьер поддерживает физиологические функции кишечника и служит первой линией защиты организма от потенциально вредных стрессогенных факторов окружающей среды, таких как бактерии и вирусы, а также природных антигенов и токсинов, содержащихся в пище. Физический кишечный барьер в первую очередь формируют эпителиальные клетки, связанные плотными контактами, которые формируют запирающую сеть между соседними эпителиальными клетками у поверхности просвета, препятствуя парацеллюлярному транспорту внутрикишечных антигенов. Разрушение в норме непроницаемого эпителиального барьера кишечника ведет к развитию синдрома «протекающего» кишечника или нарушению целостности кишечника. При разрыве плотных контактов между клетками кишечника могут образоваться условия для парацеллюлярной инфильтрации внутрикишечных антигенов, поэтому разрыв считается ключевым фактором патогенеза в появлении и развитии хронических воспалений в кишечнике, таких как воспалительное заболевание кишечника (IBD). Специалисту в данной области техники известны способы оценки целостности кишечника (барьерной функции кишечника), например, описанные Wang et al. (2015) “Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.” J Immunol Methods; 421: 44-53 or Grootjans et al. (2010) “Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut” World J Gastrointest Surg; 2(3): 61-69.

[0071] Например, о стимуляции целостности кишечника можно говорить, если соотношение лактулозы/рамнозы в моче, взятой через 6 часов после кормления субъекта лактулозой и рамнозой ниже, чем соотношение лактулозы/рамнозы в моче на момент кормления лактулозой и рамнозой. Как указывается в другом месте в настоящей заявке, субъект может быть здоровым субъектом.

[0072] Также можно говорить о стимуляции здоровья ЖКТ/целостности кишечника, если содержание гликолитохолевой и/или тауролитохолевой желчных кислот определенным образом повышается по сравнению с контролем. Например, таким повышением может быть рост, аналогичный росту, наблюдаемому при сравнении содержания гликолитохолевой и/или тауролитохолевой желчных кислот у субъектов, получающих микроорганизм согласно настоящему изобретению, с содержанием у субъектов, не получающими микроорганизм согласно настоящему изобретению. При таком сравнении концентрация гликолитохолевой и/или тауролитохолевой кислот выше у субъекта, получающего микроорганизм согласно настоящему изобретению. В альтернативном варианте или дополнительно, содержание гликолитохолевой и/или тауролитохолевой желчных кислот может быть выше у субъектов, получающих микроорганизм согласно настоящему изобретению, по сравнению с содержанием у субъектов до получения микроорганизма согласно настоящему изобретению. Таким образом, стимуляцией здоровья ЖКТ можно считать также рост концентрации гликолитохолевой и/или тауролитохолевой кислоты, как в последнем случае.

[0073] В настоящем изобретении термин «субъект» относится к любому субъекту, пригодному для целей настоящего изобретения. Субъект может быть позвоночным животным. Таким образом, субъект может быть млекопитающим, птицей, земноводным, пресмыкающимся или рыбой. Млекопитающие включают, без ограничения, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, человека, мышей и крыс. Млекопитающим может быть человек, собака, кошка, мышь, крыса и т.п. Субъект также может быть лошадью, коровой, свиньей, козой, курицей, овцой, ослом, кроликом, альпакой, ламой, гусем, быком, индюком и т.п. Субъект может быть человеком. Субъект может быть животным, предпочтительно, субъект может быть млекопитающим. Например, субъект может быть свиньей, предпочтительно, поросенком, предпочтительно, поросенком на доращивании.

[0074] Субъект может быть «здоровым субъектом». Здоровым субъектом может быть субъект, не страдающий никаким заболеванием или расстройством. Предпочтительно, в определение «здорового субъекта» включаются субъекты, не страдающие отравлением токсинами, присутствующими, например, в пище или корме. Предпочтительно, в определение «здорового субъекта» включаются субъекты, не пораженные вредной кишечной флорой. Еще предпочтительнее, к вредной кишечной флоре относится вредная бактериальная микрофлора. Например, здоровый субъект может иметь концентрацию желчных кислот, сопоставимую с концентрацией в контроле или с контрольным значением. Также здоровый субъект может иметь концентрацию одной или более желчных кислот, измеренную по образцу плазмы крови, сопоставимую с концентрацией желчных кислот в контрольном образце. В частности, концентрация желчных кислот GLCA и/или TLCA, измеренная по образцу плазмы крови (здорового) субъекта сопоставима (приблизительно та же) с концентрацией GLCA и/или TLCA в контрольном образце. Концентрация таких желчных кислот может измеряться по образцу плазмы крови, полученному от субъекта. Способы измерения желчных кислот известны специалисту в данной области техники и раскрыты в настоящем изобретении.

[0075] Субъект может быть также субъектом, пораженным болезнью или расстройством. К таким болезням или расстройствам, например, относятся болезни или расстройства, поражающие ЖКТ. Здоровый субъект может быть животным на доращивании.

[0076] В настоящем изобретении термин «контроль» относится к контролю любого вида, подходящему для способов/вариантов применения согласно настоящему изобретению. Например, контролем может выступать концентрация биомаркера/маркера, например, концентрация определенной желчной кислоты, описанной в настоящем изобретении, в контрольном образце. В альтернативном варианте или дополнительно, контролем может быть контрольное значение, определенное средствами и способами, известными специалисту в данной области техники.

[0077] Например, контрольным уровнем/концентрацией биомаркера/маркера (например, желчной кислоты), может быть значение концентрации маркера в образце, полученном от здорового субъекта, например, от животного, не пораженного заболеваниями ЖКТ или иными заболеваниями, как раскрыто в настоящей заявке. Таким образом, контрольный образец может, например, быть получен от здорового субъекта, например, от субъекта, такого как животное, не пораженное никаким заболеванием или расстройством, в частности, не имеющего заболеваний и расстройств, затрагивающих ЖКТ. Затем концентрация маркера, например, желчной кислоты, описанной в настоящем изобретении, измеренная в таком контрольном образце, используется в качестве контрольного значения для целей сравнения. Субъект, от которого может быть получен контрольный образец, может, например, иметь тот же возраст и/или массу и т.п., что и субъект, у которого был взят образец, или который подлежит тестированию. Например, контроль или контрольный образец может относиться к тому же типу, что и образец, полученный от субъекта.

[0078] В контроль для целей настоящего изобретения могут также входить здоровые (контрольные) субъекты, предпочтительно, субъекты, не имеющие заболеваний или расстройств, в частности, не имеющие заболеваний или расстройств, затрагивающих ЖКТ, или даже стандартный контроль, представляющий здоровую контрольную группу или, в целом, известные в уровне техники стандартные показатели заболевания ЖКТ. В идеале субъекты в контрольной группе не должны иметь сопутствующих заболеваний или расстройств, в частности, никаких заболеваний ЖКТ. Контрольной группой может быть группа из нескольких, например, из 3, предпочтительнее - из 5 и более, еще предпочтительнее из 10, 20, 30, 40 или 50 здоровых лиц, чье здоровье можно проверить известными способами, некоторые из которых обозначены в настоящем изобретении.

[0079] Контролем может также быть субъект на доращивании. Контролем также может быть субъект, не получающий микроорганизм согласно настоящему изобретению.

[0080] Настоящее изобретение также относится к способу производства хенодезоксихолевой кислоты (CDCA), включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с гликохенодезоксихолевой кислотой (G-CDCA);

с получением тем самым хенодезоксихолевой кислоты.

[0081] Дополнительно или в альтернативном варианте, настоящее изобретение также относится к способу производства хенодезоксихолевой кислоты (CDCA), включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с таурохенодезоксихолевой кислотой (T-CDCA);

с получением тем самым хенодезоксихолевой кислоты.

[0082] Микроорганизмы согласно настоящему изобретению способны выполнять этап деконъюгации, необходимый для преобразования T-CDCA/G-CDA в CDCA, как показано в разделе экспериментальных данных в настоящем изобретении.

[0083] В настоящей заявке «хенодезоксихолевая кислота» (также известная как хенодеоксихолевая кислота, хенохолевая кислота и 3α,7α-дигидрокси-5β-холан-24-овая кислота или CDCA) встречается в качестве желчной кислоты. Соли данной карбоновой кислоты называют хенодезоксихолатами. Хенодезоксихолевая кислота - одна из основных желчных кислот, производимых печенью. Она нерастворима в воде, но растворима в спирте и уксусной кислоте, точка плавления 165-167°C. Ферментативный процесс образования хенодезоксихолевой кислоты из холестерина в печени протекает в несколько этапов. Как и другие желчные кислоты, она может конъюгировать в печени с таурином или глицином с образованием таурохенодезоксихолевой (T-CDCA) и гликохенодезоксихолевой (G-CDCA) кислоты. В частности, конъюгаты формируются посредством C-₂₄ N-ациламидной связи, которая связывает желчную кислоту с ее аминным конъюгатом (глицином и таурином). Тем не менее, в зависимости от вида, связь может выполняться по C-₂₅ N-ациламидной связи, C-₂₆ N-ациламидной связи или C-₂₇ N-ациламидной связи.

[0084] Как правило, катализатором гидролиза C-₂₄ N-ациламидной связи в конъюгатах желчных кислотах выступают гидролазы солей желчных кислот (BSH). Большинство BSH действуют в отношении конъюгатов желчных кислот и с глицином, и с таурином, и несколько из них демонстрируют строгую специфичность. Гены BSH обнаружены в основных родах бактерий кишечной микрофлоры, и требуемый фермент можно выделить, например, из Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes и нескольких видов Lactobacillus и Bifidobacterium.

[0085] Следовательно, для подтверждения реализации способа согласно настоящему изобретению можно выполнить следующий тест. Сначала культуру микроорганизмов согласно настоящему изобретению и вторую культуру одного из видов бактерий, способных к такому преобразованию, например, Clostridium perfringens, приводят в контакт с T-CDCA и/или G-CDCA. Через некоторое время отбирают пробы супернатанта культуры, и проверяют на наличие CDCA. Если CDCA присутствует в обеих культурах, то это подтверждает реализацию способа согласно настоящему изобретению.

[0086] Способ может включать в себя приведение в контакт T-CDCA и/или G-CDCA с препаратом, содержащим микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, препарат может содержать только цитоплазматические компоненты микроорганизма согласно настоящему изобретению.

[0087] Также способ может также предусматривать дополнительный этап очистки хенодезоксихолевой кислоты.

[0088] Дополнительно, известны и приведены в разделе экспериментах данных в настоящем изобретении способы проведения таких реакций, подходящие буферные растворы и т.п. Далее предполагается, что для реализации способа применяется биореактор, например, биореатор большого объема.

[0089] Хенодезоксихолевая кислота, полученная согласно способу, раскрытому в настоящей заявке, может применяться для любых целей. Например, ее можно применять для растворения камней в желчном пузыре. Дополнительно или в альтернативном варианте, хенодезоксихолевая кислота, полученная способом, раскрытым в настоящей заявке, может применяться для лечения церебротендинального ксантоматоза, гепатита C и/или запоров.

[0090] Настоящее изобретение также относится к способу производства литохолевой (LCA) кислоты, включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с хенодезоксихолевой кислотой (CDCA);

с получением тем самым литохолевой кислоты.

[0091] В настоящем изобретении термин «литохолевая кислота», также известная как «3α-гидрокси-5β-холан-24-овая кислота» или «LCA», относится к желчной кислоте, которая действует как детергент для солюбилизации жиров перед абсорбцией. Известно, что LCA образуется из CDCA под действием, например, бактериальной 7α-дегидроксилазы. Известно, что штаммы Clostridium и Eubacteria способны выполнять такое 7-дегидроксилирование.

[0092] Например, в гепатоцитах первичные и вторичные желчные кислоты претерпевают конъюгацию с аминокислотами в положении C-₂₄ (или C-₂₅, C-₂₆ или C-₂₇) карбоновой кислоты на боковой цепи, и, соответственно, практически все желчные кислоты в желчном протоке находятся в конъюгированном с глицином виде. Под воздействием бактерий в толстом кишечнике возможно образование LCA из хенодезоксихолевой кислоты путем восстановления функциональной гидроксильной группы углерода-7 в кольце «B» стерана. Полученная LCA может конъюгировать с глицином с образованием G-LCA (или GLCA, как указано в настоящем изобретении). Полученная LCA может также конъюгировать с таурином с образованием T-LCA (или TLCA, как указано в настоящем изобретении).

[0093] При этом, согласно экспериментальным данным, приведенным в настоящей заявке, было отмечено повышение содержания гликолитохолевой и тауролитохолевой кислот in vivo. Поскольку в гепатоцитах происходит конъюгация литохолевой кислоты с глицином или таурином, ясно, что должно наблюдаться увеличение содержания и самой литохолевой кислоты. При этом в разделе экспериментальных данных в настоящем изобретении (например, на Фиг. 2) показано, что по результатам измерений уровень литохолевой кислоты оказался выше в группе B (получавшей микроорганизм согласно настоящему изобретению), чем в группе A (не получавшей микроорганизм согласно настоящему изобретению). Таким образом, в группе B отмечено незначительное, но тем не менее повышение LCA с 128,7 до 155,9 нМ (данные не представлены в разделе экспериментальных данных). Поскольку LCA образуется из CDCA, следовательно, должен наблюдаться и рост преобразования CDCA. Соответственно, вероятно, что микроорганизм согласно настоящему изобретению способен также преобразовывать CDCA в LCA.

[0094] Способ может включать в себя приведение в контакт CDCA с указанным в настоящей заявке препаратом, содержащим микроорганизм согласно настоящему изобретению. Например, препарат может содержать только цитоплазматические компоненты микроорганизма согласно настоящему изобретению.

[0095] Также способ может предусматривать дополнительный этап очистки LCA.

[0096] Дополнительно, способы проведения таких реакций, подходящие буферные растворы и т.п. известны специалисту в данной области техники и приведены в разделе экспериментальных данных в настоящей заявке. Далее предполагается, что для реализации способа применяется биореактор, например, биореактор большого объема.

[0097] Литохолевая кислота, полученная согласно способу, раскрытому в настоящей заявке, может применяться для любых целей. Например, LCA может применяться в терапии рака, например, рака толстой кишки, или в способе активации рецептора витамина D.

[0098] Специалисту в данной области техники известны способы подтверждения производства хенодезоксихолевой/литохолевой кислоты микроорганизмом согласно настоящему изобретению или применения T-CDCA и/или G-CDCA или LCA в качестве субстанции. Например, для этих целей доступны коммерческие наборы ИФА. Еще один способ приведен в разделе экспериментальных данных в настоящем изобретении. В альтернативном варианте, присутствие хенодезоксихолевой кислоты/LCA можно обнаружить известными специалисту в данной области техники методами хроматографии.

[0099] Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции здоровья ЖКТ у здорового субъекта, включающему

a) приведение в контакт субъекта с микроорганизмом класса Coriobacteriia.

[00100] Все сказанное о вариантах применения настоящего изобретения применимо к способам согласно настоящему изобретению с учетом необходимых поправок.

[00101] Настоящее изобретение также относится к микроорганизму класса Coriobacteriia для применения для стимуляции здоровья ЖКТ субъекта, предпочтительно, субъекта, пораженного болезнью или расстройством. Микроорганизм класса Coriobacteriia может также применяться для терапии субъекта, пораженного заболеванием или расстройством, как раскрыто в настоящем изобретении.

[00102] Микроорганизм класса Coriobacteriia может также применяться для приготовления композиции для терапии субъекта, пораженного заболеванием или расстройством, как раскрыто в настоящем изобретении. В состав композиции могут входить дополнительные ингредиенты, указанные в настоящем изобретении при описании композиции для стимуляции здоровья ЖКТ у здорового субъекта.

[00103] В настоящем изобретении термин «терапия» или «лечение» может относиться к введению микроорганизма согласно настоящему изобретению, предпочтительно, в виде лекарственного препарата, например, субъекту, страдающему заболеванием, поражающим ЖКТ, для целей улучшения состояния или снятия симптомов.

[00104] Субъект может быть поражен любым заболеванием, например, заболеванием ЖКТ. К примерам заболеваний относятся сепсис, диарея, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, ожирение, диабет, болезни печени, хронические заболевания сердца, целиакия и раковые заболевания.

[00105] Субъект может быть поражен заболеванием иммунной системы.

[00106] Настоящее изобретение также относится к способу производства хенодезоксихолевой кислоты (CDCA), включающему

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с таурохенодезоксихолевой и/или гликохенодезоксихолевой кислотой (G-CDCA);

с получением тем самым хенодезоксихолевой кислоты.

[00107] Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции здоровья ЖКТ у здорового субъекта, включающему

a) приведение в контакт субъекта с микроорганизмом класса Coriobacteriia.

[00108] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему микроорганизм согласно настоящему изобретению. В набор может также входить пребиотик и/или пробиотик. Например, в набор может входить хотя бы один микроорганизм, отличный от микроорганизма согласно настоящему изобретению. Например, микроорганизм, отличный от микроорганизма согласно настоящему изобретению, может быть выбран из рода Clostridium например, Clostridium perfringens, Eubacteria, Bacteroides fragilis, B. vulgatus, Listeria monocytogenes, Lactobacillus и Bifidobacterium.

****

[00109] Единственное число в настоящем изобретении подразумевает возможность множественного числа, если иное однозначно не указано в контексте. Так, например, указание на «реактив» подразумевает один или более различных реактивов, а указание на «способ» подразумевает соответствующие этапы и известные способы, которыми можно заменить указанные в настоящей заявке способы, в том числе, с внесением необходимых поправок.

[00110] Если не указано иное, то термин «по меньшей мере» перед перечислением необходимо понимать как указание на каждый из элементов в перечислении. Специалистом в данной области техники могут быть найдены или подтверждены посредством стандартных экспериментов множество эквивалентных конкретных вариантов реализации описываемого в настоящей заявки изобретения. Такие эквивалентные варианты считаются включенными в настоящее изобретение.

[00111] В настоящей заявке термин «и/или» охватывает значения «и», «или» и «все или любая комбинация элементов, связанных этим выражением».

[00112] Термин «менее чем» или «более чем» исключает указываемое число.

[00113] Например, «менее чем 20» указывает на значение, меньшее, чем указанное число. Аналогичным образом, «более чем» или «превышает» указывает на значение, большее или превышающее указанное число; например, «более чем 80%» указывает на значение, превышающее указанное 80%.

[00114] Если контекстом не предусмотрено иное, то в настоящей заявке и формуле, приводимой далее, термин «включать» и его производные «включающий», «включает» и др. необходимо понимать как указание на включение указываемой составной части или этапа или группы составных частей или этапов, но не исключение какой-либо иной составной части, группы составных частей или этапа. В настоящей заявке термин «включающий» может быть заменено термином «содержащий» или «вмещающий», а в некоторых случаях - «имеющий». В настоящей заявке термин «состоящий из» исключает любые не указанные элементы, этапы и ингредиенты.

[00115] Термин «включая» подразумевает «включая, без ограничения». «Включая» и «включая, без ограничения» взаимозаменяемы.

[00116] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, материалами, реактивами, веществами и т.п., приведенными в настоящей заявке, и которые могут как таковые изменяться. Терминология в настоящей заявке принята только для целей описания конкретных вариантов реализации, поэтому не рассчитана на ограничение сферы применения настоящего изобретения, которое определяется исключительно на основании формулы изобретения.

[00117] Все публикации, процитированные в тексте настоящей заявки (в том числе, все патенты, патентные заявки, научные публикации, инструкции и т.п.) выше и ниже, включены в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Ничто в настоящей заявке не является признанием того, что настоящее изобретение не имеет права датирования такого раскрытия задним числом в силу ранее сделанного изобретения. Если материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не соответствует настоящей заявке, приоритет в трактовании имеет настоящая заявка.

[00118] Содержание всех процитированных документов и патентной документации включено в настоящую заявку путем ссылки в полном объеме.

[00119] В настоящей заявке использованы следующие последовательности.

Последовательность
№ Описание последовательности Последовательность 1 Последовательность 16S РНК DSM11798 CCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGATAACCCGCCTCCGGGCGGTTATAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGACCAACCTACCTCCCACTCCGGGATAACCCAGGGAAACCTGCGCTAATACCGGATACTCCGGGGCCCCCGCATGGGGGCGCCGGGAAAGCCCCGACGGTGGGAGATGGGGTCGCGGCCTATTAGGTAGTCGGCGGGGTAACGGCCCACCGAGCCCGCGATAGGTAGCCGGGTTGAGAGACCGATCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGCGCAATGGGGGAAACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGCGGGACGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCAGCAGGGAAGAAGTTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCTCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGAGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGGCGCTTAAGCGGAATCTCTAATCTGAGGGCTCAACCCCCAGCCGGATTCCGAACTGGGCGCCTCGAGTTCGGTAGAGGAAGACGGAATTCCCAGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATTGGGAAGAACACCGATGGCGAAGGCAGTCTTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCTAGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCTAGCCGTAAACGATGGGCACTAGGTGTGGGGGGGAATGCCCCTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATGCAGGTGAAGCGGCGGAAACGCCGTGGCCGAGAGGAGCCTGCACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCGTATGTTGCCATCATTCAGTTGGGGACTCGTACGAGACTGCCGGCGTCAAGCCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCTTTATGCCCTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAACGGGCTGCGAGCCAGCGATGGCGAGCGAATCCCTCAAAACCGGTCCCAGTTCGGATCGGAGGCTGCAACCCGCCTCCGTGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACCCGAGTTGTCTGCACCCGAAGTCGACGGCCCAACCCGCGAGGGGGGAGTCGCCGAAGGTGTGGGGAGTAAGGGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCT 2 Ген cpn60 (альтернативное обозначение GroEL)
>fig|84107.3.peg.158 [Coriobacteriaceae] [Белок теплового шока 60 семейство шаперонов GroEL] atggcaaaagatatcaagttcgaagccgacgcgcgcagcgctcttgcggctggagtttcaaagctggccgacgccgttaaagtgacgcttggccccaagggtcgttacgtcgctctcgagaaatcctacggcgcccccaccatcaccaacgacggcgtcaccgttgccaaagaagtcgagctcgaggatccggtagagaacatgggcgcccagctcgtccgcgaggttgccgttaagaccaacgatgttgcgggcgacggcaccaccaccgcaacgctgctcgccgacgtcatcgtctccgagggtctgcgcaacgtcaccgcaggcgccgatgcgctcggcatccgccgcggcatccagaaggccaccgatgcggtggtcgaagagatcaagaacaccgcaaccgaggtttccggcaaagagcagatcgccaatgtcggcaccatttccgcaggcgatgccgagatcggcgagaagatcgccgaggccatggacgccgttggcaaagacggtgcgatttctgttgaggagagccagacgttcggtctcgagatggacatcgtcgagggcatgcagtacgagcgcggctacatctccccgtacatggcaaccgacatggagaagatggaagccgtcctcaaagatccctacatcctccttaccgaccagaaggtcaacaacatccaggacatggttccgctgcttgaagaggttatgaagtccggtcgtccgctgttcctcgtcgccgaagacgtcgagggcgaggcgctcgccaccatcctgctcaacaagctgcgcggcaccttcaactgcgtcgccatcaaggcccccggcttcggcgatcgtcgcaagcgcatcctcgaggacattgcggccgttaccggcgcgcaggtcatcgacaaggacttcggcatgaccatggccgatgccaccatcgatatgatgggccacgcgaagaccgtcaaggtcaccaaggacagcgcgctcatcgttgacggcgcaggcgataagaaggccatcgaggatcgcatccatcagatcaaggccgagctcgaccgcgtcgactccgacttcgatcgcgagaagctccaggagcgcttggccaagctctccggcggcgttgcggtgctcaaggtgggcgctgctaccgaatcggagctcaaggaaaagaagagccgcattgaagatgcgctgcaggcaacccgcgcagcggtcgaagagggcatcgttgccggcggcggcgtggcgcttgtgaacgctatccccgcactcgacaaggttgaagtcgccgacaaggacgaagaggtcggcgtgagcatcgtccgcaaggcgcttgaggctcccatgcgcgccattgctcaaaacgccggtttcgagggaagcgtcgttgtcgagcacgtgaagggcatgaaggtcggcgaaggcctgaactgcgctacgggcgagtatggcaacatgatcgagatgggcgtgaacgatccggtgaaggttacccgtacggcgctgcagtctgccgcttccgtgggtgcgctcatcctcatcaccgaagccacgatcaacgagatcccgaaagagggccccgacttgtctgcgctcgccggtgctggcggcatgggcgggatgatgtag

[00120] Экспериментальные данные ниже приведены исключительно в иллюстративных целях, чтобы помочь лучше понять настоящее изобретение и его преимущества. Приведенные экспериментальные данные никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00121] Пример 1: Деконъюгация G-CDCA штаммом BBSH 797

[00122] Буферные растворы, использованные в Примере:

минеральный раствор I: K₂HPO₄ (6 г/л), KH₂PO₄ (6 г/л), (NH₄)₂SO₄ (6 г/л), NaCl (12 г/л), долить дистиллированную H₂O до 1 л;

минеральный раствор II: MgSO₄×7 H₂O (2,5 г/л), долить дистиллированную H₂O до 1 л;

минеральный раствор III: CaCl₂×2 H₂O (3 г/л), H₂O долить дистиллированную H₂O до 1 л;

раствор витаминов: биотин (витамин H, 2 мг/л), фолиевая кислота (2 мг/л), пиридоксина гидрохлорид (витамин B6, 10 мг/л), тиамина гидрохлорид (витамин B1, 5 мг/л), рибофлавин (витамин B2, 5 мг/л), никотинамид (5 мг/л), D,L-пантотеновая кислота (5 мг/л), цианокобаламин (витамин B12, 0,1 мг/л), менадион (100 мг/л), филлохинон (витамин K1, 22 мг/л), p-аминобензойная кислота (5 мг/л), липоевая кислота (5 мг/л), долить дистиллированную H₂O до 1 л; хранить при температуре 4°C;

раствор микроэлементов (МЭ): ZnSO₄×7 H₂O (0,10 г/л), MnCl₂×7 H₂O (0,03 г/л), H₃BO₃ (0,30 г/л), CuCl₂×2 H₂O (0,01 г/л), CoCl₂×6 H₂O (0,20 г/л), NiCl₂×6 H₂O (0,02 г/л), Na₂MoO₄×2 H₂O (0,03 г/л), долить дистиллированную H₂O до 1 л; хранить при температуре 4°C;

раствор гемина (10 000 млн⁻¹): 1 г гемина растворяли в 50 мл 1 M раствора NaOH. Затем добавляли 50 мл EtOH (92,7 об.%). Хранили при температуре 4°C;

фосфатный буфер: 0,5 M буферного раствора KH₂PO₄ + 0,5 M Na₂HPO₄ × 2 H₂O, pH 6.9, стерилизующая фильтрация;

раствор цистеина-Na₂S (восстановитель): Раствор готовят в атмосфере N₂ в колбе Шотта с крышкой с диафрагмой. 0,5 г гидрохлорида цистеина растворяли в 18,2 мл кипяченой и насыщенной N₂ дистиллированной воды. Добавляли 1,8 мл 4 M NaOH (pH 10) и 0,5 г Na₂S. Свежеприготовленный раствор после стерилизующей фильтрации хранили при температуре 4°C;

буфер для разведения: Смешать по 75 мл минеральных растворов I, II и III, добавить 10 мл раствора витаминов, 0,5 мл раствора микроэлементов, 0,5 мл раствора гемина и 0,5 г цистеина-HCl; долить дистиллированной H₂O до 1 л. Полученный раствор с pH 6.8-6.9 (откорректировать раствором 4 M NaOH) автоклавировать в течение 15 минут при температуре 121°C, использовать свежим.

[00123] Оценку способности BBSH 797 деконъюгировать GCDCA до CDCA проводили в ходе инкубационных экспериментов. Для этого были подготовлены следующие три типа проб в трех повторностях:

Партия T, содержащая GCDCA и BBSH 797 (4.09E+6 КОЕ/мл)

Партия C1, содержащая только GCDCA, без BBSH 797

Партия C2, содержащая GCDCA и инактивированный BBSH 797 (4.09E+6 КОЕ/мл). Под «инактивированным BBSH 797» понимается нежизнеспособный BBSH 797.

Отбор проб выполняли в начале эксперимента (t=0) и через 48 часов инкубации.

[00124] Подробное описание процедуры

Для получения рабочего буфера для разведения, готовый буфер для разведения стерилизовали фильтрованием, добавили 2,5 об.% фосфатного буфера и 1 об.% восстановителя. По 18 мл рабочего буфера для разведения разлили в стерильные колбы Шотта по 25 мл для всех экспериментальных партий (партии T) и контрольных партий с инактивированным штаммом (партии C2). По 20 мл рабочего буфера для разведения разлили в стерильные колбы Шотта для отрицательного контроля (партии C1). Во все партии долили по 200 мкл раствора GCDCA до конечной концентрации 5 мкМ.

[00125] Культуру BBSH 797 выращивали из лиофилизата, инокулят BBSH 797 (4.09E+7 КОЕ/мл) был подготовлен в рабочем растворе для разведения. По 2 мл инокулята долили в партии T до получения объема 20 мл (без учета объема раствора GDCA) при плотности клеток 4.09E+6 КОЕ BBSH 797 на 1 мл. Часть инокулята BBSH 797 (4.09E+7 КОЕ/мл) инактивировали выдерживанием на водяной бане при температуре 90°C в течение 15 минут. По 2 мл инактивированного инокулята долили в партии C2 до получения объема 20 мл (без учета объема раствора GDCA) при плотности клеток, эквивалентной 4.09E+6 КОЭ инактивированного BBSH 797 на 1 мл.

[00126] В момент t=0 минут все партии гомогенизировали встряхиванием и отобрали пробы (пробы t0, 1 мл), которые сразу же выдержали при температуре 95°C в течение 5 минут и отправили на хранение при -20°C.

[00127] Далее все партии инкубировали при температуре 37°C в течение 48 часов. Через 48 часов все партии гомогенизировали встряхиванием и отобрали пробы (пробы t=48 ч, 1 мл), которые сразу же выдержали при температуре 95°C в течение 5 минут и отправили на хранение при -20°C. Перед количественным анализом на содержание GCDCA и CDCA все пробы размораживали и центрифугировали на скорости 16 600 x g в течение 10 минут. По 10 мкл из каждой из очищенных проб развели 990 мкл элюента для ВЭЖХ (20% ацетонитрила + 80% дист. H₂O), после чего определили количественное содержание GCDA и CDCA.

[00128] Полученные результаты представлены на Фигуре 1 в обобщенном виде. Как видно на Фиг. 1, в обеих контрольных партиях (C1 и C2) отсутствовало преобразование GCDCA в CDCA. Следовательно, деконъюгация GCDCA не происходит спонтанно (C1) или под действием инактивированного (мертвого) микроорганизма BBSH 797. В экспериментальных партиях (партии T) четко заметно, что живой микроорганизм очень быстро поглощает GCCA, поскольку уже в пробах t=0 отмечается значительное падение концентрации GCDCA в инкубационной среде (1,59 мкМ) по сравнению с аналогичными пробами C1 и C2. Более того, живой BBSH 797 деконъюгирует GCDCA и производит CDCA (0,02 мкМ CDCA при t=0 и 1,06 мкМ CDCA при t=48 ч). Причина, по которой в инкубационном буфере T-партий не обнаруживается больше GCDCA и CDCA, может быть в промежуточном накоплении обеих субстанций внутри микроорганизма.

[00129] Таким образом, преобразовывать GCDCA в CDCA способен только активный BBSH 797. На основании приведенных данных можно сделать вывод, что BBSH 797 способен к гидролизу C₂₄ N-ациламидной связи (и, возможно, также C₂₅ N-ациламидной связи, C₂₆ N-ациламидной связи и C₂₇ N-ациламидной связи) конъюгированных желчных кислот. Следовательно, можно предполагать, что BBSH 797 содержит один или более ферментов, способных выполнять такой гидролиз. Также можно предполагать, что и таурин-конъюгированная CDCA может подвергаться гидролизу в присутствии BBSH 797.

[00130] Резюмируя, эксперименты in vitro показали преобразование гликохенодезоксихолевой кислоты в хенодезоксихолевую кислоту. Согласно имеющимся в литературных источниках данным, последняя ведет к высвобождению ГПП-2, а следовательно, к улучшению целостности кишечника (Diego-Cabero et al., 2015). На основании результатов экспериментов in vitro, для оценки влияния BBSH 797 на кишечный барьер было проведено исследование in vivo на поросятах на доращивании.

[00131] ПРИМЕР 2: Опыты с кормлением

[00132] Экспериментальная модель:

В общей сложности 16 поросят (, возраст 4-5 недель, масса приблизительно 10 кг) разделили на две группы сразу после отъема. Группа A получала кормовую композицию (полноценный корм для поросят на доращивании), компоненты которой подобраны с учетом возраста животных. Животных из Группы B кормили тем же кормом для поросят на доращивании с добавлением BBSH 797 (конечная концентрация BBSH 797 в корме составила 2,2 * 10⁹ колониеобразующих единиц на килограмм кормовой композиции). В течение экспериментального периода длительностью 44 дня корм давали два раза в день. Поросята имели свободный доступ к питьевой воде, содержались в контролируемых условиях (пространство, температура, влажность, освещение) и имели специальные игрушки для обогащения среды. Ежедневно животных осматривали обученные сотрудники под контролем ветеринаров.

[00133] Отбор проб:

На 42 день у всех животных были взяты индивидуальные пробы крови из черепной полой вены (Primavette® EDTA, Kabe Laboratory GmbH, Нюмбрехт-Энсельрот, Германия). После центрифугирования (2,300хг, 10 мин.), по две аликвоты (100 мкл каждая) были помещены на сухой лед и отправлены в лабораторию Biocrates Life Sciences AG (Иннсбрук, Австрия). Там пробы хранили при температуре -80°C до определения концентрации желчных кислот.

[00134] На 42 и 43 дни поросят посадили в метаболические клетки. В оба эти дня, приблизительно в 9:00 утра все животные получали приблизительно по 15 мл агар-агара с лактулозой (500 мг/кг массы тела) и рамнозой (100 мг/кг массы тела). После этого отбирали мочу в течение каждого из трех временных периодов по отдельности: 0-2, 2-4 и 4-6 часов после введения раствора сахара. Вдобавок, пробу мочи отбирали непосредственно перед первым введением сахара (пустая проба). Пробы мочи хранили при температуре -20°C до анализа соотношения лактулозы/рамнозы.

[00135] Анализ проб:

[00136] Желчные кислоты измеряли с помощью серийных наборов для исследования желчных кислот (Biocrates Life Sciences AG, Иннсбрук, Австрия). Для этого пробы экстрагировали методом сухой капли и анализировали путем жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (Thermo Fischer Scientific TSQ, обратная ионизация электроспреем, режим селективной регистрации избранных реакций). В общей сложности была выполнена количественная оценка содержания 20 первичных и вторичных желчных кислот с помощью внешнего (7-точечная кривая калибровки) и внутреннего стандартов (10 стандартов с изотопными метками). Обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Thermo Fischer Scientic Xcalibur™ и Biocrates MetIDQ.

[00137] Результаты и обсуждение:

На 42 день в Группе B был отмечен значительный рост гликолитохолевой и тауролитохолевой кислот (Фигура 2). Они относятся к вторичным желчным кислотам и связаны с аминокислотой (глицином или таурином). В целом, преобразование первичных желчных кислот (холевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты) во вторичные (дезоксихолевая кислота, литохолевая кислота) происходит при участии кишечной микрофлоры. Так, ранее были описаны необходимые для этого процессы ферментативного метаболизма (деконъюгация, 7-гидроксилирование), протекающие в бактериях различных родов, таких как Bacteroides, Bifidobacterium или Clostridium (Gerard, 2014). Для штамма BBSH 797 (новый род в семействе Coriobacteriaceae, номер штамма DSM 11798) таких сведений пока нет.

[00138] Перед измерением соотношения лактулозы и рамнозы мочу разбавляли в несколько этапов метанолом в соотношении 1,6 * 10⁶. Затем содержание лактулозы и рамнозы определяли методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией. Работу выполняли на хроматографе Agilent 1290 Infinity I (Agilent Technologies, Соединенные Штаты) с подключенным масс-спектрометром Triple Quad 5500 (AB Sciex, Канада). Разделение аналитов выполняли на колонке Luna NH2 150 x 2,0 мм (Phenomenex, Соединенное Королевство, температура 30°C, скорость 0,250 мл/мин, элюирование градиентом ацетонитрила в течение 10 мин). Масс-спектрометр работал с обратной ионизацией электроспреем в режиме селективной регистрации избранных реакций (m/z 341 → m/z 161 и m/z 341 → m/z 101 для лактулозы; m/z 163 → m/z 59 и m/z 163 → m/z 103 для рамнозы). Данные были проанализированы с помощью программного комплекса Analyst Software (AB Sciex, Канада), соотношение лактулозы/рамнозы было рассчитано в MS-Excel (Microsoft, США).

[00139] Эксперимент продемонстрировал корреляцию между повышенной концентрацией желчных кислот и улучшением кишечного барьера. Целостность кишечного барьера оценивали методом анализа соотношения двух сахаров. В основе указанного анализа лежит одновременное введение лактулозы и рамнозы. Дисахарид лактулоза проникает в кровяное русло только парацеллюлярно сквозь узкие зазоры между отдельными клетками кишечного эпителия. В свою очередь моносахарид рамноза попадает в тело как парацеллюлярно, так и трансцеллюлярно, через клетки кишечника. По мере ослабления кишечного барьера интерстициальное пространство становится все более и более проницаемым, в результате чего абсорбируются сравнительно большие количества дисахаридов. Как следствие, растет соотношение лактулозы/рамнозы в моче. Пониженное соотношение лактулозы/рамнозы указывает на нетронутость или улучшение кишечного барьера (Wijtten et al., 2011 цитируется в настоящей заявке). Введение в течение нескольких недель в рамках настоящего эксперимента BBSH 797 привело к значительному уменьшению соотношения лактулозы/рамнозы в моче (p=0,0173, Фигура 3).

[00140]

[00141] ПРИМЕР 3: Влияние BBSH 797 на набор массы и коэффициент усвоения корма (КУК) у здоровых субъектов

[00142] Экспериментальная модель:

[00143] Поросят разных полов (генетический тип: O-HYB Fl [(Landrace x Large White) x Pietrain]) на доращивании в возрасте 4-10 недель пометили ушными бирками, взвесили по отдельности и разделили на группы контроля (CG), эксперимента (TG) и эксперимента с повышенной концентрацией (hTG). Животных отобрали из здорового стада. Животным из контрольной группы (CG) давали базовый корм без антибиотиков, кокцидиостатиков, пробиотиков, фитогенных добавок и органических кислот. Базовый корм, который животные получали с 1 по 14 день, содержал следующие ингредиенты, в мас.%: кукуруза, 30; ячмень, 32,9; подсолнечное масло, 0,6; картофельный белок, 7; кукуруза, приготовленная под давлением, 6; концентрат соевого белка, 5,7; пшеница, приготовленная под давлением, 4; декстроза, 4; лактоза, 3; ядро кокосового ореха, кокосовое масло, 2,5; монокальцийфосфат, 1,23; фосфат магния, 0,1; хлорид натрия, 0,43; витаминный комплекс, 0,1; микроэлементный комплекс, 0,15; L-лизин, 0,56; DL-метионин, 0,17; L-треонин, 0,16; L-триптофан, 0,08; подсластитель, 0,02. С 15 по 42 день базовый корм состоял из следующих ингредиентов, в масс. %: кукуруза, 40,7; ячмень, 35; соя 48%, 20; подсолнечное масло, 0,5; монокальцийфосфат, 0,94; карбонат кальция, 1,31; фосфат магния, 0,2; хлорид натрия, 0,46; витаминный комплекс, 0,1; микроэлементный комплекс, 0,15; L-лизин, 0,4; DL-метионин, 0,12; L-треонин, 0,12. Животным в группе эксперимента (TG) давали тот же базовый корм, что и контрольной группе, но с добавлением BBSH 797 (DSM 11798) в конечной концентрации 2,2 * 10⁹ КОЕ на кг корма. Животным в группе эксперимента с повышенной концентрацией (hTG) скармливали тот же базовый корм, что и контрольной группе, но с добавлением BBSH 797 (DSM 11798) в конечной концентрации 2,2 * 10¹¹ КОЕ на кг корма. Эксперимент длился 42 дня. В течение всего эксперимента животные получали корм в избытке. Также всегда была доступна свежая питьевая вода. Условия содержания регулировала и ежедневно регистрировала автоматизированная система в соответствии с заданными типовыми рекомендациями по содержанию поросят на доращивании. По утрам и во второй половине дня сотрудники фермы проверяли общее состояние животных и помещений, своевременную подачу воды и корма, поддержание параметров температуры и вентиляции. Дополнительно, животные регулярно проходили ветеринарный контроль состояния в течение всего срока эксперимента. В течение эксперимента точно измеряли потребление корма в каждом загоне. Массу поросят измеряли индивидуально на 1, 14 и 42 день. Среднесуточное потребление корма в каждом загоне определяли за период с 1 по 42 день, а также с 15 по 42 день. Значения среднего потребления корма и средней массы животных в загоне использовали для расчета среднего коэффициента перевода корма в массу (коэффициент усвоения корма, КУК).

Результаты:

[00144] В течение всего срока эксперимента ни одно животное не демонстрировало каких-либо видимых проблем со здоровьем или симптомов клинических заболеваний; ни одно животное не погибло. Благотворное влияние обогащения корма BBSH 797 на прирост массы показано в Таблице 1 ниже.

[00145]

Среднесуточный прирост массы (г) CG TG hTG День 1-42 470 492 487 День 15-42 581 614 594

Таблица 1: Влияние обогащения корма BBSH 797 на набор массы здоровыми животными.

Кроме того, было отмечено, что коэффициент преобразования корма в массу или коэффициент усвоения корма (КУК) лучше у животных, получавших базовый корм, обогащенный BBSH 797, чем у животных, получавших базовый корм без добавления BBSH 797. В период с 1 по 42 день КУК улучшился с 1,63 кг/кг у животных, получавших базовый корм, до 1,54 кг/кг у животных, получавших базовый корм, обогащенный BBSH 797. В период с 15 по 42 день КУК улучшился с 1,69 кг/кг у животных, получавших базовый корм, до 1,59 кг/кг у животных, получавших базовый корм, обогащенный BBSH 797. Как видно из приведенных экспериментальных данных, обогащение корма BBSH 797 стимулирует здоровье ЖКТ у здоровых животных, что ведет к улучшению набора массы и усвоения корма животными, получавшими корм с добавлением BBSH 797, без каких-либо отмеченных нежелательных эффектов.

Список литературы

Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402.

Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410.

Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300.

Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402.

Boesjes and Brufau (2014) “Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease” Current Medicinal Chemistry, 21, 2822-2829.

Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245.

Connor et al. (2016) “Glucagon-like peptide 2 and its benefcial effects on gut function and health in production animals” Domstic Aniaml Endocrinology 56 S56-S65).

de Diego-Cabero et al. (2015) “Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.” BMC veterinary research 11:111.

Derikx et al. (2010) “Non-invasive markers of gut wall integrity in health and disease” World Journal of Gastrology 16(42):5272-5279.

Grootjans et al. (2010) “Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut” World J Gastrointest Surg; 2(3): 61-69.

Gupta et al. (2013) “Molecular signatures for the class Coriobacteriia and its different clades; proposal for division of the class Coriobacteriia into the emended order Coriobacteriales, containing the emended family Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam. nov., and Eggerthellales ord. nov., containing the family Eggerthellaceae fam. nov.” Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63 (Pt 9), pp. 3379-3397.

Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915.

Hofmann et al. (1992) “A proposed nomenclature for bile acids” Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604.

Kawamata et al. (2003) “A G protein-coupled receptor responsive to bile acids*” vol. 278, no. 11, pp. 9435-9440.

Matsuki et al. (2004) Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces. Applied and Environmental Microbiology 70(12): 7220-7228).

Slavin (2013) “Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Benefits” Nutrients. 5(4): 1417-1435.

Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680.

Torres et al. (2010) “Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics” Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 9, Issue 5, p. 438-454.

Schaap et al. (2014) “Bile acid receptors as targets for drug development” Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 11(1):55-67.

Wang et al. (2015) “Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.” J Immunol Methods; 421: 44-53.

Wijtten et al., (2011) “Intestinal barrier function and absorption in pigs after weaning: a review.” Br J Nutr 105:967-981.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Erber AG

<120> ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИЙ КЛАССА CORIOBACTERIIA ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ

ЗДОРОВЬЯ ЖКТ

<130> ERB16157PCT

<160> 2

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 1477

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Последовательность 16S РНК DSM11798

<400> 1

cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggataacccg 60

cctccgggcg gttatagagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgaccaacc tacctcccac 120

tccgggataa cccagggaaa cctgcgctaa taccggatac tccggggccc ccgcatgggg 180

gcgccgggaa agccccgacg gtgggagatg gggtcgcggc ctattaggta gtcggcgggg 240

taacggccca ccgagcccgc gataggtagc cgggttgaga gaccgatcgg ccacattggg 300

actgagatac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaattttgc gcaatggggg 360

aaaccctgac gcagcaacgc cgcgtgcggg acgaaggcct tcgggttgta aaccgctttc 420

agcagggaag aagttgacgg tacctgcaga agaagctccg gctaactacg tgccagcagc 480

cgcggtaata cgtagggagc gagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgcgcgtagg 540

cgggcgctta agcggaatct ctaatctgag ggctcaaccc ccagccggat tccgaactgg 600

gcgcctcgag ttcggtagag gaagacggaa ttcccagtgt agcggtgaaa tgcgcagata 660

ttgggaagaa caccgatggc gaaggcagtc ttctgggccg taactgacgc tgaggtgcga 720

aagctagggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc tagccgtaaa cgatgggcac 780

taggtgtggg ggggaatgcc cctccgtgcc gcagctaacg cattaagtgc cccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag 900

catgtggctt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag ggcttgacat gcaggtgaag 960

cggcggaaac gccgtggccg agaggagcct gcacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctgtcgt atgttgccat 1080

cattcagttg gggactcgta cgagactgcc ggcgtcaagc cggaggaagg tggggacgac 1140

gtcaagtcat catgcccttt atgccctggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaac 1200

gggctgcgag ccagcgatgg cgagcgaatc cctcaaaacc ggtcccagtt cggatcggag 1260

gctgcaaccc gcctccgtga agtcggagtt gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acccgagttg tctgcacccg 1380

aagtcgacgg cccaacccgc gaggggggag tcgccgaagg tgtggggagt aaggggggtg 1440

aagtcgtaac aaggtagccg taccggaagg tgcggct 1477

<210> 2

<211> 1629

<212> ДНК

<213> Неизвестно

<220>

<223> Ген cpn60

<400> 2

atggcaaaag atatcaagtt cgaagccgac gcgcgcagcg ctcttgcggc tggagtttca 60

aagctggccg acgccgttaa agtgacgctt ggccccaagg gtcgttacgt cgctctcgag 120

aaatcctacg gcgcccccac catcaccaac gacggcgtca ccgttgccaa agaagtcgag 180

ctcgaggatc cggtagagaa catgggcgcc cagctcgtcc gcgaggttgc cgttaagacc 240

aacgatgttg cgggcgacgg caccaccacc gcaacgctgc tcgccgacgt catcgtctcc 300

gagggtctgc gcaacgtcac cgcaggcgcc gatgcgctcg gcatccgccg cggcatccag 360

aaggccaccg atgcggtggt cgaagagatc aagaacaccg caaccgaggt ttccggcaaa 420

gagcagatcg ccaatgtcgg caccatttcc gcaggcgatg ccgagatcgg cgagaagatc 480

gccgaggcca tggacgccgt tggcaaagac ggtgcgattt ctgttgagga gagccagacg 540

ttcggtctcg agatggacat cgtcgagggc atgcagtacg agcgcggcta catctccccg 600

tacatggcaa ccgacatgga gaagatggaa gccgtcctca aagatcccta catcctcctt 660

accgaccaga aggtcaacaa catccaggac atggttccgc tgcttgaaga ggttatgaag 720

tccggtcgtc cgctgttcct cgtcgccgaa gacgtcgagg gcgaggcgct cgccaccatc 780

ctgctcaaca agctgcgcgg caccttcaac tgcgtcgcca tcaaggcccc cggcttcggc 840

gatcgtcgca agcgcatcct cgaggacatt gcggccgtta ccggcgcgca ggtcatcgac 900

aaggacttcg gcatgaccat ggccgatgcc accatcgata tgatgggcca cgcgaagacc 960

gtcaaggtca ccaaggacag cgcgctcatc gttgacggcg caggcgataa gaaggccatc 1020

gaggatcgca tccatcagat caaggccgag ctcgaccgcg tcgactccga cttcgatcgc 1080

gagaagctcc aggagcgctt ggccaagctc tccggcggcg ttgcggtgct caaggtgggc 1140

gctgctaccg aatcggagct caaggaaaag aagagccgca ttgaagatgc gctgcaggca 1200

acccgcgcag cggtcgaaga gggcatcgtt gccggcggcg gcgtggcgct tgtgaacgct 1260

atccccgcac tcgacaaggt tgaagtcgcc gacaaggacg aagaggtcgg cgtgagcatc 1320

gtccgcaagg cgcttgaggc tcccatgcgc gccattgctc aaaacgccgg tttcgaggga 1380

agcgtcgttg tcgagcacgt gaagggcatg aaggtcggcg aaggcctgaa ctgcgctacg 1440

ggcgagtatg gcaacatgat cgagatgggc gtgaacgatc cggtgaaggt tacccgtacg 1500

gcgctgcagt ctgccgcttc cgtgggtgcg ctcatcctca tcaccgaagc cacgatcaac 1560

gagatcccga aagagggccc cgacttgtct gcgctcgccg gtgctggcgg catgggcggg 1620

atgatgtag 1629

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложено применение микроорганизма класса Coriobacteriia для стимулирования здоровья ЖКТ у здорового субъекта и способ in vitro производства хенодезоксихолевой кислоты, предусматривающий приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с гликохенодезоксихолевой кислотой. При этом указанный микроорганизм содержит молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, а микроорганизм, используемый в заявленном способе, представляет собой микроорганизм штамма DSM11798. Группа изобретений позволяет увеличить набор массы животных и коэффициент усвоения корма. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Применение микроорганизма класса Coriobacteriia для стимуляции целостности кишечника у здорового субъекта, при этом указанный микроорганизм способен преобразовывать гликохенодезоксихолевую кислоту (G-CDCA) в хенодезоксихолевую кислоту (CDCA), при этом указанный микроорганизм содержит молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный микроорганизм обеспечивают в составе композиции, предпочтительно, в составе пищевой и/или кормовой композиции.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанный микроорганизм обеспечивают в течение более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70 или более дней, предпочтительно, указанный микроорганизм обеспечивают в течение 42 или 44 дней.

4. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный микроорганизм обеспечивают в дозировке 0,25*10⁹, 0,5*10⁹, 0,75*10⁹, 1,0*10⁹, 1,25*10⁹, 1,5*10⁹, 1,75*10⁹, 2,0*10⁹, 2,25*10⁹, 2,5*10⁹, 2,75*10⁹, 3,0*10⁹, 3,25*10⁹, 3,5*10⁹, 3,75*10⁹, 1,0*10⁹, 1,25*10⁹, 1,5*10⁹, 1,75*10⁹, 4,0*10⁹ или более колониеобразующих единиц (КОЕ) на кг композиции, предпочтительно, указанный микроорганизм обеспечивают в дозировке не менее 2,2*10⁹ колониеобразующих единиц (КОЕ) на кг композиции.

5. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что микроорганизм представляет собой микроорганизм штамма DSM11798.

6. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный микроорганизм преобразует гликохенодезоксихолевую кислоту (G-CDCA) в хенодезоксихолевую кислоту (CDCA).

7. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный микроорганизм увеличивает содержание гликолитохолевой (GLCA) и/или тауролитохолевой (TLCA) жёлчных кислот в организме указанного субъекта по сравнению с содержанием GLCA и/или TLCA до введения указанного микроорганизма.

8. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что целостность кишечника стимулируется, когда соотношение лактулозы/рамнозы в моче, через 6 часов после употребления указанным субъектом лактулозы и рамнозы, ниже, чем соотношение лактулозы/рамнозы в моче в момент употребления лактулозы и рамнозы.

9. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный здоровый субъект представляет собой субъекта, не поражённого заболеванием или расстройством.

10. Применение по любому из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что указанный здоровый субъект характеризуется концентрацией жёлчных кислот, измеренной в образце плазмы, который был получен у указанного субъекта, которая сопоставима с концентрацией жёлчных кислот, присутствующих в контрольном образце.

11. Способ in vitro производства хенодезоксихолевой кислоты (CDCA), указанный способ включает:

a) приведение в контакт микроорганизма класса Coriobacteriia с гликохенодезоксихолевой кислотой (G-CDCA), при этом указанный микроорганизм содержит молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1;

с получением тем самым хенодезоксихолевой кислоты.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой микроорганизм штамма DSM11798.