ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ В ГЕНЕ BTPKD СОБАКИ ДОМАШНЕЙ (CANIS LUPUS FAMILIARIS), ВЫЗЫВАЮЩЕЙ ПОЛИКИСТОЗ ПОЧЕК Российский патент 2022 года по МПК G01N33/00 C12Q1/68 C12Q1/686 C12Q1/6844 C12Q1/6853 

Описание патента на изобретение RU2763933C1

Изобретение относится к области ветеринарной генетики и биотехнологии.

Известна мутация в гене BTPKD (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) собаки домашней (Canis lupus familiaris), вызывающая поликистоз почек.

Однако для детекции этой мутации необходимо создание тест-ситемы на определение собак-носителей данной мутации или собак, больных поликистозом.

Техническим результатом является обеспечение достоверной диагностики поликистоза почек у собак, вызванной мутацией в гене BTPKD.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления мутации в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак включающую амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из 1х буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида используют разработанные праймеры, Taqman зонды диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели, имеющими следующие последовательности:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2,

а также контрольные образцы на дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD.

В качестве контролей созданы две генетические конструкции - плазмиды, содержащие дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD. Положительный контроль для дикотипных диагностических систем получили путем амплификации фрагмента гена, полученный из ДНК здоровой собаки и его клонирования в вектор pJet1.2, мутантный вариант изготовили путем синтеза синтетической последовательности ДНК с последующим клонированием ее в вектор pJet1.2. ДНК гетерозиготы по мутации имитирована путем эквимолярного смешивания плазмид обоих типов после измерения их концентрации на электрофорезе в агарозном геле.

В качестве матрицы использовали 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (исходная плазмида 50 гн/мкл разбавлялась 1:10000) с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. «Преимущества клонирования ПЦР-продукта в вектор» заключается в устойчивом долговременном хранении контрольных матриц в виде плазмиды внутри бактериального штамма, с неограниченной возможностью копирования и наработки.

Реакционная смесь для ПЦР-РВ в варианте с «заглушками» разделена на два объема, каждый из которых содержит: Праймер прямой (F), Праймер обратный (R), Зонд, комплементарный одной из аллелей (wt - дикий тип, mut - мутантная аллель), Олигонуклеотид - заглушку, комплементарный другой аллели. В качестве контроля используют 2 вида матриц: для дикой аллели, для мутантной аллели. Детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Применение «заглушек» и раздельная детекция аллелей в двух независимых реакционных объемах дает возможность достижения наилучшего баланса между специфичностью и эффективностью системы и точной подстройки специфичности с помощью изменения соотношения концентраций зонда и «заглушки». Такая постановка ПЦР-РВ позволяет быстро установить в изучаемых образцах ДНК наличие трех вариантов генотипов, и, следовательно, выявить наличие или отсутствие мутантной аллели и определить наличие, отсутствие патологии или носительство.

Использование разных видов контроля в виде матриц, специфических праймеров, зондов и «звглушек» к разным вариантам генома (на мутантную и дикую аллели) позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке.

При конструировании праймеров, зондов и заглушек выполнены требования: высокая степень гомологии с исследуемыми вариантами мутации гена, отсутствие участков отжигающихся «сами на себя», отсутствие «шпилек», что подтверждено результататами програмной проверки специфичности связывания праймеров и гибридизационных зондов, программной проверки олигонуклеотидов на возможность образования шпилек и димеров.

Конструирование специфических праймеров, зондов и «заглушек» осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей, опубликованный на ресурсе GeneBank и подбора условий для проведения РВ-ПЦР с применением разработанных праймеров, зондов, несущих флуорохром и гаситель флуоресценции и «заглушек» комплементарных части амплифицируемого фрагмента.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательный уровень».

Сущность изобретения поясняется фиг. 1 «Результаты ПЦР-РВ для детекции мутантной аллели BTPKD (3:1)» и фиг. 2 «Результаты ПЦР-РВ для детекции дикотипной аллели BTPKD (3:1)», где представлен скриншот результатов ПЦР-РВ в виде графиков, отражающих варианты детекции дикотипной, мутантной аллели и варианта гетерозиготного генотипа.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления мутации в гене BTPKD у собак.

Исследование состоит из трех этапов:

1. Выделение ДНК из биоматериала (соскобов энетеробуккального эпителия).

2. Проведение ПЦР-РВ.

3. Интерпретация полученных результатов.

1. Для исследования у собак берут пробу энтеробуккального эпителия. Выделение тотальной ДНК собаки домашней производилось методом, с применением бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ).

Состав буфера: 1,4 М NaCl, 0,02 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,1М Трис - HCl с рН=8,0 (гидроксиметиламинометана гидрохлорид), дистиллированная вода.

Материал (соскоб буккального эпителия) переносили в пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, с добавлением 1 мл экстрагирующего буфера. После чего образец инкубировали на +56°C в течение 40 минут, с периодическим перемешиванием содержимого. После инкубации в пробирку добавляли 0,5 мл хлороформа, выдерживали 40 минут при комнатной температуре, содержимое пробирки постоянно перемешивали. Центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 2/3 объема изопропилового спирта, перемешивали. Далее выдерживали при комнатной температуре 30 минут для преципитации ДНК. Центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Супернатант сливали и промывали осадок 80% этанолом. Повторно центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. После удаления супернатанта, осадок нуклеиновой кислоты высушивали при комнатной температуре, затем растворяли его в 60 мкл стерильной деионизированной воды, хранили полученный образец ДНК при -20°C.

2. Апробацию диагностической системы производили в ПЦР-РВ анализаторе нуклеиновых кислот АНК-16 (Сертификат соответствия № РОСС RU.ME01. Н00423, Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Реакцию проводили в объеме 20 мкл. Амплификационная смесь содержит: 2 мкл 10 х буфер с сульфатом аммония для Taq-полимеразы, 0,125 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 0,25 мкМ праймер прямой, 0,25 мкМ праймер обратный, 0,125е.а/мкл Taq-полимераза, 2,5 мМ магния хлорид, 0,125 мкМ Taqman зонда диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели в объеме 0,250 мкМ. Все используемые реактивы производства ООО «Бигль», Россия. В качестве матрицы в смесь добавляли 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. После первоначальной денатурации при 94°C в течение 200 с 40 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация - 94°C, 18 с, отжиг праймеров - 60°C, 40 с, элонгация - 72°C, 40 с.

Тест-система позволяет специфически амплифицировать фрагмент гена BTPKD, для установления генотипа собаки в мультиплексной полимеразной цепной реакции.

Система состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР и комплекта контрольных образов.

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, включая пробирки с матрицами и отрицательным контролем. Во все пробирки вносят реакционную смесь и добавляют исследуемые образцы ДНК в количестве 1 мкл, в отдельные пробироки вносят 1 мкл матрицы - разбавленного раствора контрольной плазмиды с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена. В пробирку для отрицательного контроля вносят 1 мл дистиллированной воды.

3. Интерпретация результатов анализа.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала - анализируются с помощью программного обеспечения используемого генетического анализатора для проведения ПЦР-РВ АНК-16, согласно прилагаемой инструкции производителя.

В таблице 1 представлены данные, по которым можно установить существенную разницу в эффективности специфической и неспецифической реакции. Эффективность рассчитана ПО прибора АНК-16.

Таким образом, для выявления собак-носителей (генотип GA) мутации в гене BTPKD(SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A), а также животных, больных поликистозом (гнотип АА) можно использовать разработанную тест систему. При наличии генотипа дикого типа (GG), т.е. животное здоровое на графике фиг. 2 результат будет отображаться в виде графика wt/wt. Если собака является носителем мутантной аллели (генотип GA), то результат детекции будет соответствовать графику mut/wt, представленном на фиг. 1 и фиг. 2. При наличии мутации в гомозиготном состоянии (поликистоз, генотип АА), график будет соответствовать, представленному на фиг. 1 и фиг. 2 как mut/ mut.

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в ветеринарной генетике, а именно к средствам выявления носительства или диагностики заболевания поликистоз почек, вызванный мутацией в гене BTPKD у собак породы английский бультерьер, керн-терьер, вест-хайленд-вайт терьер или малинуа, что соответствует уровню «промышленная применимость».

Похожие патенты RU2763933C1

название год авторы номер документа
Способ детекции изолятов Mycobacterium tuberculosis Beijing 94-32-кластера в формате реального времени 2017
  • Мокроусов Игорь Владиславович
  • Вязовая Анна Александровна
  • Черняева Екатерина Николаевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Нарвская Ольга Викторовна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
RU2689800C1
СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛОКУСА PRL-RSAI С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 2022
  • Сабетова Ксения Дмитриевна
  • Чаицкий Алексей Александрович
  • Лемякин Александр Дмитриевич
  • Щеголев Павел Олегович
  • Кофиади Илья Андреевич
RU2807577C1
Способ детекции генотипа Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-кластер в формате реального времени 2021
  • Вязовая Анна Александровна
  • Синьков Вячеслав Владимирович
  • Пасечник Оксана Александровна
  • Бадлеева Мария Владимировна
  • Хромова Полина Андреевна
  • Ярусова Ирина Владимировна
  • Жданова Светлана Николаевна
  • Герасимова Алена Андреевна
  • Соловьева Наталья Сергеевна
  • Журавлев Вячеслав Юрьевич
  • Огарков Олег Борисович
  • Мокроусов Игорь Владиславович
RU2768021C1
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ЧЕТЫРЕХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ КАППА-КАЗЕИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 2017
  • Марзанова Саида Нурбиевна
  • Девришов Давудай Абдулсемедович
  • Алексеев Яков Игоревич
  • Коновалова Нина Валерьевна
  • Марзанов Нурбий Сафарбиевич
RU2691995C2
Способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома 2022
  • Васильев Филипп Филиппович
  • Максимова Надежда Романовна
  • Сухомясова Айталина Лукична
  • Новгородова Сайына Николаевна
  • Гуринова Елизавета Егоровна
  • Степанова Светлана Кимовна
RU2798695C1
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДВУХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ CVM И BLAD У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 2015
  • Марзанова Саида Нурбиевна
  • Девришов Давуд Абдулсемидович
  • Алексеев Яков Игоревич
  • Коновалова Нина Валерьевна
  • Марзанов Нурбий Сафарбиевич
RU2601151C2
НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЗОНДОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДВУХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ CVM И BLAD У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2015
  • Марзанова Саида Нурбиевна
  • Девришов Давуд Абдулсемидович
  • Алексеев Яков Игоревич
  • Коновалова Нина Валерьевна
  • Марзанов Нурбий Сафарбиевич
RU2577990C1
СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ДНК-ТЕСТИРОВАНИЯ НА НАЛИЧИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ Н63D И C282Y В ГЕНЕ HFE, СВЯЗАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМ ГЕМОХРОМАТОЗОМ 2006
  • Самоходская Лариса Михайловна
  • Ткачук Всеволод Арсеньевич
  • Бочков Валерий Николаевич
  • Балацкий Александр Владимирович
  • Макаревич Павел Игоревич
RU2304170C1
НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЗОНДОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ЧЕТЫРЕХ МУТАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ КАППА-КАЗЕИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 2017
  • Марзанова Саида Нурбиевна
  • Девришов Давудай Абдулсемедович
  • Алексеев Яков Игоревич
  • Коновалова Нина Валерьевна
  • Марзанов Нурбий Сафарбиевич
RU2646140C1
Набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека 2020
  • Дашинимаев Эрдэм Баирович
  • Артюхов Александр Сергеевич
  • Гольцова Александра Сергеевна
RU2748998C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 763 933 C1

Реферат патента 2022 года ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ В ГЕНЕ BTPKD СОБАКИ ДОМАШНЕЙ (CANIS LUPUS FAMILIARIS), ВЫЗЫВАЮЩЕЙ ПОЛИКИСТОЗ ПОЧЕК

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана тест-система для выявления мутации мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак. Тест-система включает в себя смесь для проведения полимеразной цепной реакции, с использованием разработанных праймеров, Taqman зондов диагностируемой аллели и олигонуклеотидов-«заглушек» для другой аллели, представленных ниже:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2.

Изобретение расширяет арсенал средств для выявлений мутаций, вызывающих поликистоз почек у собак. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 763 933 C1

Тест-система для выявления мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD (Bull Terriers Polycystic Kidney Disease), вызывающей поликистоз почек у собак, включающая амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из десятикратного (10х) буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида, а также разработанных праймеров, разработанных Taqman зондов диагностируемой аллели и разработанных олигонуклеотидов-«заглушек» для другой аллели, представленных ниже:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2763933C1

AU 2006320355 A1, 07.06.2007
WO 2020186154 A1, 17.09.2020
US 11013705 B2, 25.05.2021
PUYA GHARAHKHANI et al
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
PLoS ONE, 6(7), e22455
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ ФУМАРИЛАЦЕТОАЦЕТАТ ГИДРОЛАЗЫ И АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА ЧЕЛОВЕКА 2010
  • Захарова Екатерина Юрьевна
  • Байдакова Галина Викторовна
  • Воскобоева Елена Юрьевна
  • Панкратова Елизавета Владимировна
  • Степченко Александр Георгиевич
  • Фесенко Денис Олегович
  • Чудинов Александр Васильевич
  • Наседкина Татьяна Васильевна
  • Георгиева София Георгиевна
RU2458131C1

RU 2 763 933 C1

Авторы

Мукий Юлия Викторовна

Богомаз Денис Игоревич

Павлова Ольга Андреевна

Владимиров Иван Артемьевич

Даты

2022-01-11Публикация

2020-12-24Подача