Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 для улучшения функциональных свойств строительных материалов Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 C04B28/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может использоваться для восстановления функциональных свойств строительных материалов, в частности для восстановления бетонных, гипсовых, мраморных сооружений.

Бетон - это основной конструкционный строительный материал, различные виды которого используют для изготовления широкой номенклатуры изделий и конструкций. Значительное число современных исследований в области строительного материаловедения направлено на улучшение качества бетона. Основной целью таких работ является получение долговечного бетона, а также разработка и внедрение ресурсосберегающих технологий, что окажет положительное влияние, как на окружающую среду, так и на экономическую составляющую.

Инновационным направлением в разработке технологий улучшения качества строительных материалов и их восстановления является разработка природоподобной технологии, основанной на использовании биологического материала, в частности инактивированной микробной биомассы и продуктов их жизнедеятельности, а также живых микроорганизмов, обладающих способностью к внеклеточному индуцированному осаждению кальция.

Известна добавка в цементнобетонные смеси (а.с. №554237, С04В 13/24, опубл. 15.04.1977). В качестве добавки предложена биомасса микроорганизмов следующего состава, вес.%: белок 60, нуклеиновые кислоты 8, углеводы 12, липиды 7, зола 7, влага 6. Биомасса, взятая в количестве 0,25 в.ч. в составе бетонной смеси цемента, оказывает пластифицирующее действие на бетонные смеси, позволяет повысить прочность образцов на 14,3% и снизить расход цемента.

Также известна бетонная смесь (патент РФ №2133238, С04В 28/02, опубл. 20.07.1999), включающая цемент, заполнитель, белковосодержащую добавку и воду. В качестве белковосодержащей добавки используют продукт жизнедеятельности микроорганизмов, обработанный серной кислотой в соотношении 10:3, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Цемент 20,581-20,583, заполнитель 70,883-70,890, продукт жизнедеятельности микроорганизмов, обработанный серной кислотой в соотношении 10:3 (по сухому веществу) 0,002-0,01, вода остальное. Предлагаемая бетонная смесь позволяет улучшить прочностные характеристики готового бетона: прочность при сжатии - на 14,4%, прочность при изгибе - на 17,5%.

Недостатком известных биологических добавок является недостаточно высокий эффект в улучшении прочностных характеристик готовых изделий из бетона.

Наряду с применением белковосодержащих добавок и обработанной биомассы микроорганизмов известны способы повышения прочностных характеристик бетона за счет добавления в бетонные смеси живых микроорганизмов.

Известен способ получения добавки для бетонной смеси (патент РФ №2133239, С04В 28/02, опубл. 20.07.1999) путем культивирования на питательной среде микроорганизмов, В качестве микроорганизмов используют бактерии вида Leuconostos mesenteroides, культивирование осуществляют на синтетической питательной среде с добавкой кислоты в течение 24-48 ч при температуре 23-25°С в качалочном режиме. Недостатком данного способа является невысокий эффект в повышении прочности готового бетона (прочность при сжатии увеличилась на 3,1%). Кроме того, при превышении дозы добавки прочность бетона снижается.

Известна биодобавка для бетонной смеси (патент РФ №2488564, С04В 28/00, опубл. 27.07.2013), содержащая микроорганизм вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемый на синтетической питательной среде, и дополнительно микрокремнезем, при следующем соотношении компонентов, мас.%: микроорганизм вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемый на синтетической питательной среде 33-44 и микрокремнезем 56-67. Недостатком данного изобретения является отсутствие эффекта в повышении прочностных характеристик бетона от применения добавки, несмотря на то, что предлагаемый состав добавки позволяет сохранить его прочность.

Одним из перспективных путей улучшения функциональных свойств строительных материалов является использование процессов биоминерализации за счет способности определенных видов микроорганизмов к внеклеточному осаждению карбоната кальция. Процесс бактериальной минерализации в последние годы исследован как метод для защиты и укрепления разрушающихся строительных материалов. Особый интерес научного сообщества направлен на разработку новых самовосстанавливающихся материалов на основе бактерий, которые способны «залечивать» дефекты структуры бетона и восстанавливать его физико-механические свойства.

Наиболее близкой по достигаемому результату (прототипом) является добавка для строительных смесей (патент РФ №2515932, С04В 28/00, опубл. 20.05.2014), содержащая следующие компоненты, мас.%: микроорганизмы вида Leuconostoc mesenteroides, культивируемые на синтетической питательной среде 0,5-2,7; микрокварц 97,3-99,5. Предлагаемая добавка позволяет повысить прочность бетона при изгибе на 22,9%.

Недостатком известного способа является недостаточно высокий эффект в повышении прочности бетона при изгибе и отсутствие эффекта в повышении прочности при сжатии.

Кроме того, одной из проблем эксплуатации бетона является его склонность к растрескиванию - явление, которое препятствует целостности и прочности строительных материалов. Принято считать, что долговечность бетона зависит от характеристик его поровой структуры. Механизмы разрушения бетона часто зависят от способа проникновения потенциально агрессивного вещества в бетон, что может вызвать его повреждение. Проницаемость бетона зависит от пористости и связей между порами. Чем более открытая структура пор бетона, тем более уязвим материал, так как деградация бетона вызывается проникающими веществами. Поэтому качество бетона зависит не только от прочностных параметров (прочность при изгибе и сжатии), но и от пористости и водопроницаемости.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового микроорганизма - биологического агента для улучшения функциональных свойств строительных материалов.

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является повышение прочности строительных материалов при изгибе и сжатии, а также снижение их пористости и повышение водостойкости.

Указанный технический результат достигается использованием нового штамма бактерий Bacillus licheniformis, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-13559, для улучшения функциональных свойств строительных материалов из цемента и бетона и повышения эксплуатационной надежности конструкций на их основе.

Предлагаемый штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 характеризуется следующими свойствами:

- спорообразующие бактерии, обладающие высокой степенью выживаемости в споровой форме;

- способны гидролизовать (усваивать) широкий спектр углеводов, в том числе крахмал, глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, лактозу;

- обладают уреазной активностью (уреолитические свойства): способны гидролизовать мочевину;

- устойчивы к высоким значениям рН среды;

- способны к внеклеточному осаждению карбоната кальция.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что споры бактерий в составе бетонного материала активируются при попадании в структуру бетонной матрицы атмосферного кислорода и влаги. После активации в области вокруг бактериальной клетки в результате ее жизнедеятельности возникают условия для осаждения кальция, что приводит к повышению прочности, водостойкости и снижению пористости строительного материала.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 выделен из осадочных пород, ила и кристаллов соли соленого озера Эльтон (Россия, Волгоградская область) методом накопительных культур в ходе многократных пересевов.

Культурально-морфологические особенности штамма.

Обильный рост на богатых агаризованных питательных средах (LB, МПА). Штамм относится к факультативным анаэробам. Способен развиваться при температурах от 10°С до 50°С, при этом оптимальной температурой роста является 35-37°С. Обладает устойчивостью к лизоциму. Продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий рост грибков, стафилококков, стрептококков и синегнойной палочки. Гидролизует крахмал, казеин, глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, лактозу.

Рост на агаризованной питательной среде (LB, МПА): отдельные колонии округлые, плоские, с неровным волнистым краем; поверхность колонии шероховатая; структура мелкозернистая; цвет колоний светлый молочно-белый; консистенция колоний сухая, плотная, легко снимается бактериологической петлей.

Вегетативные клетки: палочкообразные, длина 2,5-3,5 мкм, толщина 0,5-0,8 мкм, взаимное расположение одиночное и/или в цепочку по 2-4 шт., окраска по Граму положительная.

Способен образовывать споры: споры эллиптические, преимущественно расположены центрально, не более одной в клетке-спорангии, без отчетливого утолщения спорангии.

Систематическое положение штамма подтверждено генетическим методом с помощью анализа 16S РНК.

Генетические манипуляции со штаммом не производились.

Область применения штамма: биотехнология, в частности восстановление функциональных свойств строительных материалов (биоминерализация, восстановление бетонных, гипсовых, мраморных сооружений).

Продукт, синтезируемый штаммом: фермент уреаза, вызывающий гидролиз мочевины, в процессе которого повышается рН среды. На среде богатой ионами кальция штамм осуществляет процесс биокальцинирования.

Способ определения активности штамма. Уреазную активность штамма определяют на агаризованной среде Кристенсена с добавлением индикатора (NaCl - 5,0 г/л; мочевина - 20,0 г/л; KH₂PO₄ - 0,6 г/л; K₂HPO₄ - 0,6 г/л; глюкоза - 1,0 г/л; пептон - 2,0 г/л; агар-агар - 1,5-2,0, мас. %; рН 6,6-6,8 ед.). Для получения индикаторной среды на 1 л добавляют 6,0 мл водного раствора фенолового красного (феноловый красный 0,2 мас. %). Мочевину и индикатор добавляют стерилизующей фильтрацией. Степень уреазной активности определяется интенсивностью окрашивания индикаторной среды: чем интенсивнее розово-красный цвет среды, тем интенсивнее уреазная активность штамма.

Способ и условия длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии. На агаризованных средах LB или Дика (пептон - 3,0 г/л; KH₂PO₄ - 0,6 г/л; K₂HPO₄ - 0,6 г/л; NaHCO₃ - 2,12 г/л; мочевина - 10,0 г/л; глюкоза - 2,0 г/л; рН 7,0-7,5 ед.; стерилизация при 121°С в течение 15-20 мин; мочевину добавляют стерилизующей фильтрацией) в чашках Петри или в микробиологических пробирках на скошенном агаре в холодильнике при температуре 4-6°С.

Способ и условия для размножения штамма: поверхностное культивирование на агаризованных средах LB и Дика в чашках Петри или в микробиологических пробирках на скошенном агаре при температуре 37°С. Глубинное периодическое культивирование на питательных средах LB или Дика в конических колбах Эрленмейера на 250 мл, с заполнением питательной средой до 50-100 мл, при температуре 35-37°С, при постоянном перемешивании/встряхивании 150-180 об/мин, в течение 2-4 суток.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии - не выявлены;

б) устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д. - устойчив к лизоциму;

в) плазмиды (подробное описание) - не выявлены;

г) профаги - не выявлены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Эффективность предлагаемого штамма подтверждается экспериментальными исследовании как при поверхностной обработке цементных образцов, так и при введении его в качестве добавки в строительную смесь, и описывается следующими примерами.

Пример 1

Для поверхностной обработки цементных образцов использовали суспензию штамма бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 в виде культуральной жидкости. Культуральную жидкость получали в процессе глубинного культивирования штамма на питательной среде следующего состава: пептон - 3,0 г/л; KH₂PO₄ - 0,6 г/л; K₂HPO₄ - 0,6 г/л; NaHCO₃ - 2,12 г/л; мочевина - 10,0 г/л; глюкоза - 2,0 г/л; рН 7,0-7,5 ед. Перед культивированием питательную среду стерилизовали при 121°С в течение 15-20 мин. Мочевину добавляли с простерилизованную среду методом стерилизующей фильтрации. Глубинное культивирование проводили в конических колбах объемом 750 мл, с заполнением питательной средой до 100-150 мл, при температуре 35-37°С, при постоянном перемешивании/встряхивании 150-180 об/мин, в течение 2 суток. Концентрация бактериальной суспензии, полученной таким образом, составляла 1,5 мас.% по сухому весу.

Предварительно для испытания были изготовлены цементные образцы в виде балочек размером 1×1×3 см. Для формования цементных образцов использовали портландцемент ЦЕМ I 42,5Н (ГОСТ 31108-2003) производства "Подольскцемент" при водоцементном соотношении В/Ц=0,31. Твердение образцов происходило на воздухе при нормальных условиях в течение 7 суток.

Полученные таким образом цементные образцы погружали в культуральную жидкость на 24 часа. После извлечения из жидкости образцы промывали водой и сушили в течение 3 часов при температуре 60°С.

Пример 2

Лиофильно высушенную биомассу бактериального штамма, полученную по примеру 1, в виде порошка соединяли с сухими компонентами строительной смеси в количестве 0,1 мас. %, а затем формовали цементные образцы, как описано в примере 1.

Пример 3

Формование цементных образцов осуществляли по примеру 2, но количество высушенной биомассы бактериального штамма составляло 0,5 мас.% к массе исходных сухих компонентов строительной смеси.

Пример 4

Формование цементных образцов осуществляли по примеру 2, но количество высушенной биомассы бактериального штамма составляло 1,0 мас. % к массе исходных сухих компонентов строительной смеси.

Далее у цементных образцов, полученных по примерам 1-4, определяли прочность при изгибе, прочность при сжатии, открытую пористость и водостойкость. Для сопоставления результатов испытаний также испытанию подвергали контрольную группу цементных образцов, необработанную и не содержащую в составе культуру бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559.

Полученные результаты приведены в таблице.

В результате проведенных испытаний установлено, что при добавлении бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 в строительную смесь в количестве от 0,5 до 1,0 мас.% увеличивается прочность цементных образцов при изгибе (на 20-23,1%) и сжатии (на 10,4-17,4%), снижается их пористость (на 29,6-37,0%) и повышается водостойкость (на 29,4-41,2%).

Обработка цементных образцов культурой бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 путем их погружения в культуральную жидкость позволяет улучшить функциональные свойства строительного материала:

- повышение прочности при изгибе на 24,9%;

- повышение прочности при сжатии на 16,5%;

- снижение пористости на 48,2%;

- повышение водостойкости на 52,9%.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ЛБТИ 030, обладающий способностью гидролизовать широкий спектр углеводов и высокой степенью выживаемости в споровой форме, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-13559. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559 может быть использован для восстановления функциональных свойств строительных материалов, в частности для восстановления бетонных, гипсовых, мраморных сооружений. Изобретение позволяет повысить прочность строительного материала при изгибе и при сжатии и их водостойкость, а также снизить пористость строительных материалов. 1 табл., 4 пр.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-13559, обладающий уреазной и кальцинирующей способностью, для улучшения функциональных свойств строительных материалов.