СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ПОМОЩЬЮ АНТИСМЫСЛА Российский патент 2022 года по МПК C12N5/02 C12N5/10 C12N15/09 C12N15/11 C12N15/113 C12N15/52 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительным патентным заявкам США №62/469,003, поданной 9 марта 2017 г., и 62/629,972, поданной 13 февраля 2018 г., каждая из которых имеет название «Способы и композиции для лечения рака с помощью антисмысла», полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящее раскрытие относится к композициям и способам лечения рака с помощью антисмысловых нуклеиновых кислот, направленных против рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R). Настоящее раскрытие также относится к композициям и способам лечения рака путем лечения субъектов посредством по меньшей мере одной имплантируемой облученной биодиффузионной камеры (см. патент США №6,541,036 и PCT/US2016/026970, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки), содержащей опухолевые клетки и антисмысловую нуклеиновую кислоту, направленную против IGF-1R.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0003] Полное содержание текстового файла, поданного в электронном виде вместе с настоящим документом, включено посредством ссылки: копия перечня последовательности в машиночитаемом формате (наименование файла: IMVX_005_02WO_SeqList.txt, дата записи 8 марта 2018 г., размер файла 12 килобайт).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Несмотря на успехи в лечении рака, прогноз в отношении злокачественной глиомы, в частности, мультиформной глиобластомы, а также многих других форм рака остается неблагоприятным. Модификации стандартных видов лечения, такие как, например, химиотерапия, дистанционная лучевая терапия и брахитерапия, обеспечивают лишь незначительные повышения улучшения как выживаемости без прогрессирования, так и общей выживаемости. Иммунотерапевтические исследования, хоть теоретически и перспективные, не решили проблемы, созданные солидными опухолями. По оценкам Национального института рака, ежегодная заболеваемость глиомой составляет приблизительно 28000 случаев, которая увеличивается до более 50000, если включать пациентов с рецидивирующими глиомами. Поэтому в области техники существует необходимость в получении новых и улучшенных способов лечения рака и, в частности, рака головного мозга.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В настоящем раскрытии продемонстрировано, что антисмысловой олигодезоксинуклеотид (AS-ODN), нацеленный на рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R), эффективно стимулирует ответ у субъекта, который лечит рак, при использовании в терапевтических подходах, описанных в настоящем документе. В частных аспектах способы являются эффективными для лечения рака у пациента в виде части одной только вакцины на основе аутологичных раковых клеток или, необязательно, вместе с системным введением. В предпочтительных подходах способы, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают эффективное лечение рака в виде монотерапии; т.е. при отсутствии химиотерапии и при отсутствии лучевой терапии.

[0006] В вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает биодиффузионную камеру для имплантации субъекту, страдающему от опухоли, при этом биодиффузионная камера содержит облученные опухолевые клетки и облученный антисмысловой олигодезоксинуклеотид рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R AS ODN). В вариантах реализации опухолевые клетки удаляют из места резекции субъекта.

[0007] В вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает диффузионную камеру, содержащую облученный IGF-1R AS ODN и облученные, обогащенные адгезией, измельченные опухолевые клетки; причем биодиффузионная камера содержит мембрану, которая является непроницаемой для клеток и проницаемой для IGF-1R AS ODN.

[0008] В вариантах реализации опухолевые клетки удаляют из места резекции с помощью эндоскопического устройства. Еще в одних вариантах реализации опухолевые клетки удаляют из места резекции с помощью тканевого морцеллятора. В других вариантах реализации тканевый морцеллятор содержит высокоскоростную возвратно-поступательную внутреннюю канюлю внутри неподвижной внешней канюли. Внешняя канюля может содержать боковое отверстие, при этом также опухолевые клетки затягиваются в боковое отверстие электронно управляемым изменяемым всасыванием. В вариантах реализации тканевый морцеллятор не вырабатывает тепло в месте резекции. Еще в одних вариантах реализации опухолевые клетки обогащают для экспрессии нестина перед их помещением в биодиффузионную камеру. В некоторых вариантах реализации имплантация камеры ингибирует повторный рост опухоли у субъекта. В некоторых вариантах реализации имплантация камеры ингибирует повторный рост опухоли по меньшей мере в течение 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев или по меньшей мере 36 месяцев.

[0009] В дополнительных вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ приготовления биодиффузионной камеры для имплантации субъекту, страдающему от опухоли, включающий помещение опухолевых клеток в биодиффузионную камеру в присутствии IGF-1R AS ODN и облучение биодиффузионной камеры, причем опухолевые клетки удаляют из места резекции субъекта с помощью тканевого морцеллятора, который не вырабатывает тепло в месте резекции. Как правило, используют множество камер. Например, приблизительно 10 камер или приблизительно 20 камер. Преимущественно, оптимальный противоопухолевые ответ получают, когда количество клеток в камере составляет от приблизительно 750000 до приблизительно 1250000; например, приблизительно 1000000 на камеру, при этом имплантировано 20 камер.

[0010] В некоторых вариантах реализации тканевый морцеллятор представляет собой эндоскопическое устройство. Еще в одних вариантах реализации тканевый морцеллятор содержит высокоскоростную возвратно-поступательную внутреннюю канюлю внутри неподвижной внешней канюли. В дополнительных вариантах реализации внешняя канюля содержит боковое отверстие, и опухолевые клетки затягиваются в боковое отверстие электронно управляемым изменяемым всасыванием.

[0011] В вариантах реализации настоящее раскрытие обеспечивает способ лечения субъекта, страдающего от опухоли, включающий имплантацию одной или более биодиффузионных камер субъекту, причем одна или более биодиффузионных камер содержат облученные опухолевые клетки и облученный антисмысловой олигодезоксинуклеотид рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R AS ODN), причем опухолевые клетки удаляют из места резекции у субъекта с помощью тканевого морцеллятора, который не вырабатывает тепло в месте резекции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0012] На фиг. 1а-1g изображен пример биодиффузионной камеры. Фиг. 1а - составные части; фиг. 1b - камера в сборе; фиг. 1с - заглушка порта из РММА для герметизации камеры; фиг. 1d - микрофотоснимок мембраны Durapore из поливинилиденфторида; фиг. 1е - вид сверху и сбоку настоящей камеры; фиг. 1f и фиг. 1g - окрашенные ГЭ парафинированные части мембран Durapore после эксплантации; фиг. 1f - эксплантированная контрольная камера с натрий-фосфатным буфером из исследования на человеке 14379-101; фиг. 1g - эксплантированная камера с вакциной из исследования на человеке 14379-101.

[0013] На фиг. 2а-2с изображены метрики выживаемости субъектов в исследовании I фазы (IND 14379-101, NCT01550523). Фиг. 2а - общая выживаемость пациентов в исследовании; фиг. 2b - протокол выживаемости с двумя группами выживаемости. Девять пациентов умерло от прогрессирования заболевания, тогда как один умер от внутримозгового кровоизлияния, а два - от сепсиса. Общей выживаемостью по протоколу были 48,2 недели и 9,2 недели соответственно для более длинных (N=4) и более коротких (N=8) групп выживаемости (логранк = 0,014). Фиг. 2с - линейная регрессия, за исключением одного сугубо лимфопенического резкого отклонения и трех не связанных с заболеванием смертей, показала высокую корреляцию между выживаемостью по протоколу и количеством лимфоцитов при наборе (R²=0,8, р=0,0028).

[0014] На фиг. 3a-3d показаны радиографические ответы с соответствующими физиологическими измерениями. Фиг. 3а - примеры визуализации пациента из группы с короткой выживаемостью. Пациент TJ11: A-D; Пациент TJ10: Е-Н. А, Е: предоперационные Т1-гадолиний усиленные аксиальные изображения; G: Т1-гадолиний усиленное корональное изображение; С: предоперационное аксиальное FLAIR-изображение. В, D, F, Н: соответствующие постоперационные изображения по прошествии 3 месяцев. Фиг. 3b - примеры визуализации пациента из группы с более длинной выживаемостью. Пациент TJ06: A-D; Пациент TJ09: Е-Н. А, Е: предоперационные Т1-гадолиний усиленные аксиальные изображения; С, F: предоперационные аксиальные FLAIR-изображения. В, D, F, Н: соответствующие постоперационные изображения по прошествии 3 месяцев. Фиг. 3с - взаимосвязь между относительным церебральным объемом крови в опухоли и измеряемым коэффициентом диффузии в группе с более длинной выживаемостью; имеется высокая корреляция между ADC и rCBV (R²=0,96, р=0,0005). Фиг. 3d - взаимосвязь между относительным церебральным объемом крови в опухоли и измеряемым коэффициентом диффузии в группе с короткой выживаемостью.

[0015] На фиг. 4а-4с изображено исследование эксплантированных камер по группам выживаемости. Фиг. 4а - эксплантированные камеры были структурно интактными без жизнеспособных клеток. Внешние поверхности мембран из обеих камер С-р и C-v были покрыты клетками CD15+ и CD163+ при сильно повышенных количествах на мембранах C-v; фиг. 4 - анализ факторов в камерах между группами выживаемости выявил в камерах существенные подъемы VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, МСР-3 и MIP-1d в более длинной группе, тогда как количество растворимых маркеров рака были существенно подняты в короткой группе, в том числе NSE, остеонектин и YKL40. Смешанный дискриминантный анализ независимо идентифицировал эти отличия между группами; фиг. 4с - для обеих групп два хемокина, связанные с рекрутингом макрофага глиомы, были существенно ниже в C-v чем в других измеряемых источниках. Уровни как периостина, так и CCL2, были существенно ниже, чем значения в сыворотке или SN (супернатанте опухолевых клеток), предполагая удаление клеток, продуцирующих эти хемокины в камерах.

[0016] На фиг. 5а-5е изображены уровни РВМС и цитокинов после вакцинации. Последовательные измерения сдвигов иммунных эффекторных клеток и сдвигов цитокина/хемокина после вакцинации в постоперационный период; группа с более длинной выживаемостью (пациенты TJ03, TJ14, TJ06, TJ09); пример группы с короткой выживаемостью, пациент TJ13 (для всех остальных групп с короткой выживаемостью, см. фиг. 6). Строки: фиг. 5а - последовательные подсчеты РВМС после вакцинации; фиг. 5b - последовательные оценки процента РВМС субпопуляции после вакцинации; фиг. 5с - последовательные уровни CCL21 и CXCL12; фиг. 5d - взаимосвязь абсолютных количеств макрофагов CD14+CD16- с МСР-1 (CCL2); примечательна корреляция с уровнями макрофагов на фиг. 5b и пик CCL2 после операции. Уровни CCl2 оставались существенно выше в группе с короткой выживаемостью (см. фиг. 6); фиг. 5е - масштабированные сравнения гипотетических ответов цитокина ТН-1 после вакцинаций (TNF-α × 2; CXCL9 × 350; CXCL10 × 80). Следующие существенные корреляции были отмечены: пики TNF-α были высоко коррелированы с пиками CCL2 для обеих групп (R²=0,99, р=0,003). Имело место существенное немедленное периоперационное снижение клеток CD14+16- (р=0,008), которое не наблюдалось в короткой группе (р=0,78). Только для более длинной группы имела место существенная корреляция между CD4 и CXCL12 (R²=0,62, р<0,0001). Также высокая корреляция была отмечена между общим количеством моноцитов и уровнями моноцитов CD14+16- (фиг. 5В и 5D, R²=0,8, р<0,0001), а обратные взаимосвязи между количествами циркулирующих Т-клеток и моноцитов (R²=0,66, р<0,0001) были отмечены в группе с более продолжительной выживаемостью (фиг. 5) без существенных отличий в группе с короткой выживаемостью (см. фиг. 6).

[0017] На фиг. 6а-6е изображены уровни РВМС и цитокинов после вакцинации у пациентов из короткой группы (пациенты TJ01, TJ01, TJ07, TJ08, TJ10, TJ11, TJ12). Строки: фиг. 6а - последовательные количества РВМС после вакцинации; фиг. 6b. последовательные оценки процента РВМС субпопуляции после вакцинации (Т-клетки; В-клетки; моноциты); фиг. 6 с - последовательные уровни CCL21 и CXCL12; фиг. 6d - взаимосвязь абсолютных количеств макрофагов CD14+CD16- с МСР-1 (CCL2). Уровни CCl2 оставались существенно выше в группе с короткой выживаемостью по сравнению с группой с длинной выживаемостью. Фиг. 6е - масштабированные сравнения гипотетических ответов цитокина ТН-1 после вакцинаций (TNF-α × 2; CXCL9 × 350; CXCL10 × 80). Также показан IFN-g.

[0018] На фиг. 7a-7h показана потеря специфических, вызывающих опухоль популяций клеток-моноцитов после вакцинации. Существенная регрессия опухоли наблюдалась по прошествии 3-месячного периода. Фиг. 7а - монофазный тренд для клеток ТМЕ IGF-1R+ (одинарная шкала); в случаях совпадающих пар от первичного диагноза до вакцинации (N=5) не было существенного отличия; в совпадающих парах от вакцины до аутопсии (N=4) выявлено существенно снижение клеток IGF-1R+ (р=0,003). Фиг. 7b - положительные к IGF-1R клетки у двух пациентов с поддающимися оценке парафинированными частями от первичного диагноза до вакцины и аутопсии (пациенты TJ06 и TJ10). Фиг. 7с - двухфазный тренд для макрофагов ТМЕ CD163 М2 с существенным увеличением от диагноза до повторного проявления (пять полей 400х Aperio на фазу лечения на пациента; левый график, совпадающие пары *р<0,0001, N=6) с последующей существенной потерей от повторного проявления до аутопсии после вакцинации (правый график, совпадающие пары *р<0,0001, N=4). Фиг. 7d - клетки CD163+ у тех же двух пациентов с поддающимися оценке парафинированными частями от первичного диагноза до вакцины и аутопсии (пациенты TJ06 и TJ10); увеличение CD163 при вакцине по сравнению с повторным проявлением (совпадающие пары, р=0,052) с последующим существенным понижением макрофагов ТМЕ CD163 М2 при аутопсии по сравнению с вакциной (совпадающие пары, *р=0,001). Фиг. 7е - существенная корреляция в группе с короткой выживаемостью между периферийными моноцитами CD163 и уровнями CD163 ТАМ, задокументированными при хирургии (R²=0,80, р=0,02). Фиг. 7f - несущественная корреляция между периферийными и ТАМ CD163 клетками в более длинной группе. Фиг. 7g - микрофотоснимки флуоресценции с иммуногистохимического исследования парафинированных частей. А, С: Пациент TJ10 при второй хирургической резекции перед вакцинацией и В, D: при аутопсии; Е-Н: пробы аутопсии, полученные от пациентов с глиобластомой, которым провели повторную резекцию после стандартного лечения; I, J: не леченная, случайно обнаруженная после вскрытия глиобластома. Фиг. 7h - временная динамика для лечебного ответа у TJ06 от первичного диагноза до аутопсии. Двухфазное появление клеток CD163 в ТМЕ с увеличением после стандартного лечения и снижением после вакцинации до аутопсии. Потеря CD163 ТАМ связана с повышениями значений rCBV и ADC в опухоли. Пик уровней нитрата в сыворотке после каждой вакцинации и они связаны с сопутствующими повышениями rCBV/ADC

[0019] На фиг. 8a-8d изображена дифференциация незрелых моноцитов цитокинами или сывороткой от субъекта исследования. Фиг. 8а - апрегуляция IGF-1R после поляризации моноцитов М2-цитокинами. М1-макрофаги не апрегулируют IGF-1R, ***р=0,0004. Фиг. 8b - отличия в распределении поднабора моноцитов после лечения IGF-1R AS ODN в соответствии с протоколом поляризации макрофагов, описанным в материалах и способах. Проточная цитометрия выявила, что IGF-1R AS ODN селективно нацеливается на удаление М2-макрофагов. Фиг. 8с - сыворотка у пациента по протоколу дифференцирует незрелые моноциты в фенотип CD163+, который коэкспрессирует IGF-1R и PD-L1. IGF-1R AS ODN выполняет нокдаун этой популяции макрофагов дозозависимым образом в диапазоне свыше 100-кратной концентрации. Все значения являются средней интенсивностью флуоресценции. Дублирующие измерения для коинкубации сыворотки каждого пациента, сравнение средних значений. ***р<0,0001, **р=0,0001, *р=0,0002, ^♦♦♦р=0,0003, ^♦♦р=0,0009, ^♦р=0,009, Фиг. 8d - резюме средних значений на фиг. 8с.

[0020] На фиг. 9a-9d показано, что по сравнению со стандартным лечением при первом промежуточном анализе имели место существенные улучшения как в выживаемости без прогрессирования, так и в общей выживаемости. Фиг. 9а - выживаемость без прогрессирования (PFS) всей группы исследования по сравнению со стандартным лечением (SOC); пунктирные черные линии представляют собой доверительный интервал 95%; Фиг. 9b - общая выживаемость (OS). В обоих случаях SOC попадает ниже ДИ 95%, отражая существенное улучшение; Фиг. 9с - PFS по группам выживания при промежуточном анализе; Фиг. 9d - OS по группам выживания при промежуточном анализе.

[0021] На фиг. 10а-10d изображено резюме исследования фазы 1b и сравнение уровней интерферон-гамма с предыдущим исследованием и между группами в исследовании. Фиг. 10а - тренд повышения IFN-γ после вакцинации во впервые диагностированной группе для вакцины (р=0,06); Фиг. 10b - существенное повышения медианного IFN-γ во впервые диагностированной группе для вакцины (р=0,02); Фиг. 10с - существенные повышения уровней IFN-γ в 20 группах с камерами ***р<0,0001, **р<0,006, *р<0,02; Фиг. 10d - скорость диффузии меченого IGF-1R AS ODN из биодиффузионной камеры во времени.

[0022] На фиг. 11a-11j изображен эффект полностью укомплектованной биодиффузионной камеры (облучение и экзогенно добавленный AS ODN) на провоспалительную продукцию цитокинов в модели наивной мыши. Luminex-анализ содержимого эксплантированной камеры у мыши через 24 часа после имплантации, заполненной только клетками GL261; частичная комплектация с добавлением 2 мкг IGF-1R AS ODN, облучением клеток GL261 5 Гр рентгеновского излучения; или полностью укомплектованная аутовакцина (GL261, 2 мкг IGF-1R AS ODN и 5 Гр гамма-излучения). Фиг. 11 -. G-CSF GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0117; Фиг. 11b - IL-1а, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,008; Фиг. 11с - IL-1b, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0067; Фиг. 11d - IL-2, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0002; Фиг. 11е - IL-9, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0413; Фиг. 11f - IL-10, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0001; Фиг. 11g - IL-12(p40), GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,001; Фиг. 11h. IL-13, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0065; Фиг. 11i - IL-15, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0013; Фиг. 11j - М-CSF, GL261-AS-обл в сравнении с PBS р=0,007. Другие испытанные, но не показанные: IL-6, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0836; GM-CSF, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0854; lix, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0001; kc, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0112; TNF-a, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0082; VEGF, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0004; lif, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0140; IL-7, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0038; IL-12(p70) GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0120; IFN-γ, GL261-AS-обл в сравнении с GL261-обл р<0,0290.

[0023] На фиг. 12 показаны титрационные кривые для активации дендритных клеток (DC) мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от двух нормальных субъектов (темный и светлый) посредством IGF-1R AS ODN; NOBEL-антисмысла 750 мкг в сравнении с NOBEL-смыслом 75 мкг, 7,5 мкг, DWA-антисмысла 750 мкг, 7,5 мкг, контроля ***р<0,0009; NOBEL-антисмысла 75 мкг в сравнении с NOBEL-смыслом, DWA-антисмысла 7,5 мкг.

[0024] На фиг. 13а-13b изображен Т-клеточный ответ in vitro из содержимого полностью укомплектованной камеры с использованием Т-клеток, полученных от вакцинированных мышей. Фиг. 13а - провоспалительный Т-клеточный ответ с DC, примированными антигеном, извлеченным из камер; **р<0,01 для полной комплектации in vitro в сравнении с отсутствием антигена; *р<0,03 для полной комплектации в сравнении с экзосомами; Фиг. 13b - провоспалительный Т-клеточный ответ с DC, активированными антигеном, извлеченным из камер; **р<0,005 для полной комплектации в сравнении с отсутствием антигена; *р<0,007 для полной комплектации в сравнении с экзосомами.

[0025] На фиг. 14a-14d показаны схематические представления двухфазного ответа на титрование дозы NOBEL-антисмысла.

[0026] На фиг. 15А-15b изображена М2-поляризация аллогенных моноцитов от трех нормальных субъектов с инкубацией в течение ночи из сыворотки, полученной от шести разных пациентов с глиомой. Контроли не были инкубированы с сывороткой. Кривая 1000-кратного разбавления выявила снижение коэкспрессирующих М2-макрофагов на фиг. 15а - PDL-1 и фиг. 15b - CD163 от 100 пг NOBEL-антисмысла до существенного нокдауна при 1 мкг. Линия на каждом графике означает общее среднее. 1 мкг NOBEL в сравнении с отсутствием лечения ***р<0,0002.

[0027] На фиг. 16 изображено сравнение уровней цитокинов в эксплантированной камере с вакциной с эксплантированной камерой с контролем PBS. ***р, 0,005; ***р<0,01; ***р<0,02; **р<0,03; *р<0,05.

[0028] На фиг. 17 показана кривая доза-ответ, показывающая двухфазный ответ системного IGF-1R AS-ODN на ингибирование роста глиомной опухоли в боковой части живота. 10⁶ клеток GL261 были имплантированы в боковые части живота мышей C57BL/6 и через 20 дней перед периодом, когда обычно наблюдают подъем циркуляции CD163-положительных клеток, мышам было инъецировано интраперитонеально одна 0,75 мг (квадраты) или 0,075 мг (треугольники) доза NOBEL IGF-1R AS-ODN. Затем у мышей отслеживали развитие опухоли. Невакцинированные мыши (круги) были использованы в качестве контроля.

[0029] На фиг. 18 показаны данные проточной цитометрии, показывающие, что системное лечение IGF-1R AS-ODN ингибировало накопление циркулирующих М2-моноцитов. Данные выражены в виде гистограммы количеств клеток, экспрессирующих CD163 (правый пик), где одна линия, обозначенная «носитель», представляет собой мышей с имплантированной опухолью, которых лечили PBS (носителем), а другая линия, обозначенная «AS-ODN», представляет собой мышей с имплантатом, которых лечили NOBEL IGF-1R AS-ODN. К этим линиям приведены аннотации на фигуре.

[0030] На фиг. 19 показана частота возникновения опухолей у мышей, которым в боковые части живота имплантировали клетки глиомы, которых лечили NOBEL IGF-1R AS-ODN или PBS (носителем). Частота возникновения опухолей между группами с лечением и без лечения существенно отличалась (*=р<0,05).

[0031] На фиг. 20 показана частота возникновения опухолей у Tbet-дефицитных мышей, которым в боковые части живота имплантировали клетки глиомы, и которых лечили с NOBEL IGF-1R AS-ODN и без него. Частота возникновения опухолей между группами существенно отличалась (*=р<0,05).

[0032] На фиг. 21а, 21b и 21с показаны провоспалительные уровни цитокинов (пг/мл) в сыворотке пациента после вакцинации, накопленных из последовательных заборов крови с течением времени (дни 14-42 после хирургии). В сыворотке пациента наблюдалось существенное дозозависимое повышение провоспалительных цитокинов. На фиг. 21d, 21е и 21f изображена взаимосвязь (наилучшая полиномиальная аппроксимация) между выходом влажной массы опухолевой ткани и выходом цитокинов по субъектам. Выход влажной массы ткани в 3 грамма продуцировал наивысший выход цитокинов, когда после обработки клетки были распределены по 20 камерам.

[0033] На фиг. 22 показана схема примера полностью укомплектованной биодиффузионной камеры. Когда камера имплантирована пациенту, антисмысловые молекулы и опухолевые антигены диффундируют через пористые мембраны камеры, приводя к опухоль-специфическому иммунному ответу, пониженной М2-поляризации и снижению количества клеток М2+.

[0034] На фиг. 23 показана схема примера способа иммунизации. Если пациент не адекватно не отвечает на первый этап вакцинации, процедуру необязательно повторяют столько раз, сколько необходимо, иногда в комбинации с другими видами лечения.

[0035] На фиг. 24а и 24b показаны кривые Каплана-Мейера, иллюстрирующие медианную выживаемость без прогрессирования (P-FS) и медианную общую выживаемость (OS) в группе с назначенным лечением (N=30), соответственно, у пациентов-людей с опухолями головного мозга (промежуточный анализ показан на фиг. 9 выше). «Вакцинированную» группу лечат посредством 20 имплантированных камер и каждая камера содержит 2 мкг NOBEL. Группа «SoC» представлена с помощью прошлых данных (N=76). Данные показывают по существу повышенную выживаемость, как общую, так и без прогрессирования рака.

[0036] На фиг. 25а и 25b показаны кривые Каплана-Мейера, иллюстрирующие выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость, сравнивания один и тот же пол и медианный возраст в вакцинированных группах и группах стандартного лечения (SoC) соответственно. Данные показывают по существу повышенную выживаемость, как общую, так и без прогрессирования рака.

[0037] На фиг. 26а и 26b показаны кривые Каплана-Мейера, иллюстрирующие выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость, за исключением 5 пациентов, которые выбыли из лечения и которые умерли по другим причинам.

[0038] На фиг. 27а и 27b показаны кривые Каплана-Мейера, иллюстрирующие выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость, за исключением 9 пациентов, которые не завершили протокол стандартного лечения (SoC).

[0039] На фиг. 28а, 28b, 28с, 28d изображены ответы IFN-γ, вызванные на основе клеточного выхода в высоко вакцинированной группе. Данные показывают, что оптимальное высвобождение IFN-γ основано на количестве клеток в камере. Для фиг. 28а и 28b клеточный выход показан в миллионах клеток. IFN-γ показаны как средняя интенсивность флуоресценции (MFI). Эти данные представлены для 20-камерной группы, где каждая камера содержит 2 мкг NOBEL. Данные представлены в виде полиномиальной аппроксимации (кубической). На фиг. 28 и 20db представлена выборка данных с фиг. 28а и b, показывающая по существу линейную взаимосвязь между выходом количества клеток в сравнении со средним и пиковым ответом IFNγ, соответственно, вплоть до 20 миллионов клеток. Эти данные представлены здесь как пг/мл.

[0040] На фиг. 29а, 29b и 29с изображен IFN-γ Т-клеточный ответ в отношении состава камеры относительно прединкубации антисмысла IGF-1R перед инкапсуляцией. На фиг. 29а показан протокол для оценки Т-клеточного ответа на опухолевый антиген. Для фиг. 29b антиген был подготовлен, следуя клиническому подходу in-vivo в отношении камеры. Приблизительно 1 миллион ex-vivo опухолевых клеток GL261 были инъецированы в камеры только одни или с указанными концентрациями антисмысла и инкубированы в течение ночи в камере, которая была помещена в PBS). На следующий день содержимое камеры было извлечено и использовано для активации наивных дендритных клеток. Содержимое камеры, которое не было обработано антисмыслом в течение ночи, было добавлено к дендритным клеткам с указанными количествами NOBEL. Дендритные клетки также были оставлены наивными для контроля. После активации посредством антигена в течение ночи дендритные клетки были собраны и инкубированы в течение ночи с Т-клетками от иммунизированных животных в планшете для клеточных культур, покрытом антителом для обнаружения ELIPSPOT для цитокина IFNγ. После инкубации в течение ночи покрытый планшет был обработан и исследован для подсчета количества IFNγ-продуцирующих Т-клеток, которые ответили на каждый соответствующий антиген. Данные на фиг. 29b показывают, что опухолевые антигены были обнаружены в материалах, извлеченных из камер, содержащих клетки GL261 плюс антисмысл, но не в материалах из камер, культивированных с одними только клетками, даже если антисмысл был добавлен в материал, когда дендритные клетки (DC) были активированы. Данные иллюстрируют, что антисмысл в камерах с клетками глиомы требуется для продуцирования иммуностимулирующего опухолевого антигена. Для фиг. 29 с клетки GL261 были помещены в чаши петри и обработаны в течение ночи 4 мг NOBEL на 1 миллион клеток или оставлены необработанными. Клетки затем были собраны и помещены в камеры с пропорцией 1 миллион клеток и 2 мкг NOBEL на камеру. Камеры затем были инкубированы в течение ночи в PBS, и содержимое было извлечено на следующий день. Дендритные клетки затем были активированы содержимым камеры, и секреция IFNγ была измерена, как описано выше. Данные иллюстрируют, что обработка клеток GL261 в течение ночи антисмыслом увеличивает количество антигена, продуцируемого этими клетками, что обнаружено за счет увеличения количеств иммунных к опухоли Т-клеток, продуцирующих IFNγ.

[0041] На фиг. 30а, 30b, 30с и 30d проиллюстрированы уровни воздействия экспрессии нестина на эффективность в мышиной модели. На фиг. 30а показано, что высокий уровень нестина связан с улучшенной выживаемостью после лечения посредством антисмысла IGF-1R. Мышам в боковую часть живота были имплантированы камеры, содержащие клетки GL261, которые экспрессировали высокие или низкие уровни белка нестина, а также 4 мг антисмысла. Контрольная группа получила одни только клетки, экспрессирующие высокие уровни нестина, без добавления антисмысла. Камеры были оставлены в боковой части живота на 24 часа. Затем иммунному ответу позволяли развиться в течение нескольких недель, и мыши были спровоцированы интракраниально на день 35 после имплантации камеры. Иммунизированные мыши, а также не иммунизированные контроли, были отслежены на выживаемость после провокации. На фиг. 30b показано, что высокий уровень нестина связан с улучшенным показателем клинического заболевания. Данные показывают оцененную частоту заболевания, связанную с прогрессированием опухоли головного мозга, в ортотопической модели после вакцинации с полностью укомплектованной камерой по лечебным группам. На фиг. 30с и фиг. 30d показано повышенное продуцирование антитела против клеток GL261, связанное с высокими уровнями экспрессии нестина. На фиг. 30с показаны данные клеточного ELISA-анализа на день 28 после имплантации камеры/прединтракраниальной имплантации, выполненного на сыворотке от экспериментальных мышей, испытанной на реактивность антитела к клетке GL261; выделенная сыворотка из цельной крови, взятой у мышей. Сыворотка была испытана на полную реактивность IgG к клеткам GL261 с помощью ELISA-анализа. На фиг. 30d показаны данные клеточного ELISA со дня 35 после интракраниальной провокации/71 дня после удаления камеры, используя сыворотку от экспериментальных мышей, испытанную на реактивность антитела к клеткам GL261.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

[0042] Все термины, не определенные в настоящем документе, имеют их значения, общепринятые в области техники.

[0043] Как используется в настоящем документе, грамматические формы единственного числа включают единственное число и множественное число, если в контексте явным образом не указано обратное.

[0044] Как используется в настоящем документе, термин «примерно», указанный перед числовым значением, обозначает значение плюс или минус диапазон 10%. Например, «примерно 100» охватывает 90 и 110.

[0045] Как используется в настоящем документе, термин «аутологичный» означает клетки или ткани, полученные от того же индивидуума.

[0046] Как используется в настоящем документе, термин «вакцина на основе аутологичных раковых клеток» относится к терапевтическому средству, полученному частично путем выделения опухолевых клеток из индивидуума и обработки этих опухолевых клеток ex vivo. Клетки затем повторно вводятся индивидууму, из которого опухолевые клетки были выделены. В вариантах реализации вакцина на основе аутологичных раковых клеток может содержать дополнительные компоненты в дополнение к опухолевым клеткам, такие как буфер и/или антисмысловые нуклеиновые кислоты. В вариантах реализации «вакцина на основе аутологичных раковых клеток» может относиться к биодиффузионной камере, содержащей опухолевые клетки и один или более дополнительных компонентов. В некоторых аспектах «вакцина на основе аутологичных раковых клеток» может быть «полностью укомплектованной камерой», которая также называется в настоящем документе «полностью укомплектованной биодиффузионной камерой».

[0047] Как используется в настоящем документе, «полностью укомплектованная камера» или «полностью укомплектованная биодиффузионная камера» представляет собой биодиффузионную камеру, которая включает аутологичные опухолевые клетки и другие клетки, включенные в опухолевую микросреду (ТМЕ), которые могут или не могут быть обработаны перед инкапсуляцией в камеру посредством первого количества IGF-1R AS ODN. Клетки инкапсулируют экзогенным добавлением второго количества, например, по меньшей мере 2 мкг, IGF-1R AS ODN и камеру затем облучают 5 Гр гамма-излучения.

[0048] Как используется в настоящем документе, термин «малые молекулы» включает нуклеиновые кислоты, пептиды, белки и другие химические вещества (такие как, например, цитокины и гормоны роста, продуцируемые клетками), но не включает клетки, экзосомы или микровезикулы.

[0049] Термин «нацеленная на IGF-1R экспрессия» или «экспрессия нацелена на IGF-1R», используемый в настоящем документе, относится к введению антисмысловой нуклеиновой кислоты, которая имеет последовательность, разработанную для связывания с IGF-1R.

[0050] Как используется в настоящем документе, термин «системное введение» относится к достижению доставки вещества по всему телу субъекта. Типичные системные пути введения включают парентеральное введение, трансдермальное введение, интраперитонеальное введение, внутривенное введение, подкожное введение и внутримышечное введение.

[0051] Другие пути введения включают пероральное введение, назальное введение, местное введение, интраокулярное введение, трансбуккальное введение, сублингвальное введение, вагинальное введение, внутрипеченочное, интракардиальное, введение в поджелудочную железу, путем ингаляции и посредством имплантированного насоса.

Антисмысловые молекулы

[0052] Антисмысловые молекулы представляют собой нуклеиновые кислоты, которые функционируют путем связывания с целевой комплементарной последовательностью мРНК по правилам спаривания оснований Уотсона и Крика. Трансляция целевой мРНК ингибируется активным и/или пассивным механизмом, когда между комплементарными спиралями происходит гибридизация. В пассивном механизме гибридизация между мРНК и экзогенной нуклеотидной последовательностью приводит к образованию дуплекса, что не дает рибосомному комплексу прочесть сообщение. В активном механизме гибридизация промотирует связывание РНКазы Н, что разрушает РНК, но оставляет антисмысл интактным для гибридизации с другой комплементарной мишенью мРНК. Один из или оба механизма ингибируют трансляцию белка, вносящего вклад в или поддерживающего злокачественный фенотип. В качестве терапевтических агентов антисмысловые молекулы являются гораздо более селективными и, в результате, более эффективными и менее токсичными, чем традиционные лекарственные средства.

[0053] Способы и композиции, раскрытые в настоящем документе, включают применение антисмысловых молекул для лечения рака. Как правило, антисмысловая молекула представляет собой антисмысловой олигодезоксинуклеотид (AS-ODN). В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула содержит модифицированный фосфатный остов. В некоторых аспектах модификация фосфатного остова делает антисмысл более устойчивым к деградации нуклеазы. В некоторых вариантах воплощения модификацией является закрытый антисмысл. В других вариантах реализации модификацией является фосфотиоатная связь. В некоторых аспектах антисмысл содержит одну или более фосфотиоатных связей. В некоторых вариантах реализации фосфотиоатные связи стабилизируют антисмысловую молекулу путем предоставления устойчивости нуклеазы, тем самым увеличивая ее период полураспада. В некоторых вариантах реализации антисмысл может быть частично связан фосфотиоатной связью. Например, вплоть до примерно 1%, вплоть до примерно 3%, вплоть до примерно 5%, вплоть до примерно 10%, вплоть до примерно 20%, вплоть до примерно 30%, вплоть до примерно 40%, вплоть до примерно 50% вплоть до примерно 60%, вплоть до примерно 70%, вплоть до примерно 80%, вплоть до примерно 90%, вплоть до примерно 95% или вплоть до примерно 99% антисмысла может быть связано фосфотиоатной связью. В некоторых вариантах реализации антисмысл полностью связан фосфотиоатной связью. В других вариантах реализации фосфотиоатные связи могут чередоваться с фосфодиэфирными связями. В некоторых вариантах реализации антисмысл имеет по меньшей мере один концевой фосфотиоатный монофосфат.

[0054] В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула содержит один или более CpG мотивов. В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула не содержит CpG мотив. В некоторых аспектах один или более CpG мотивов метилированы. В других аспектах один или более CpG мотивов не метилированы. В некоторых вариантах реализации один или более неметилированных CpG мотивов вызывают врожденный иммунный ответ, когда антисмысловая молекула введена субъекту. В некоторых аспектах врожденный иммунный ответ опосредован связыванием антисмысловой молекулы, содержащей неметилированный CpG, с толл-подобными рецепторами (TLR).

[0055] В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула содержит по меньшей мере одну концевую модификацию или «кэп». Кэп может быть 5' и/или 3'-кэп структурой. Термины «кэп» или «концевой кэп» включают химические модификации на любом конце олигонуклеотида (в отношении концевых рибонуклеотидов) и в том числе модификации на связи между последними двумя нуклеотидами на конце 5' и последними двумя нуклеотидами на конце 3'. Кэп-структура может повышать устойчивость антисмысловой молекулы к экзонуклеазам без риска для молекулярных взаимодействий с целевой последовательностью или клеточным механизмом. Такие модификации могут быть выбраны исходя из их повышенной потентности in vitro или in vivo. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп) или может присутствовать на обоих концах. В некоторых вариантах реализации 5'- и/или 3'-кэп независимо выбран из фосфотиоатного монофосфата, остатка (группы) без основания, фосфотиоатной связи, 4'-тио нуклеотида, карбоциклического нуклеотида, фосфодитиоатной связи, инвертированного нуклеотида или инвертированной группы без основания (2'-3' или 3'-3'), фосфодитиоатного монофосфата и метилфосфонатной группы. Фосфотиоатная(ые) или фосфодитиоантная(ые) связь(и), будучи частью кэп-структуры, в целом находятся между двумя концевыми нуклеотидами на 5'-конце и двумя концевыми нуклеотидами на 3'-конце.

[0056] В предпочтительных вариантах реализации антисмысловая молекула нацелена на экспрессию рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R). IGF-1R представляет собой тирозинкиназный рецептор клеточной поверхности, который имеет 70% общей гомологии с инсулиновым рецептором. Когда он активирован своими лигандами (IGF-I, IGF-II и инсулином), он регулирует широкие клеточные функции, в том числе пролиферацию, трансформацию и клеточную выживаемость. IGF-1R не является абсолютным требованием для нормального роста, но является существенным для роста в независимых от прикрепления состояниях, которые могут происходить в злокачественных опухолях. Обзор роли IGF-1R в опухолях представлен у Baserga и др., Vitamins and Hormones, 53:65-98 (1997), полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

[0057] В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула представляет собой олигонуклеотид, направленный против ДНК или РНК фактора роста или рецептора фактора роста, такого как, например, IGF-1R.

[0058] В некоторых вариантах реализации антисмысл представляет собой дезоксинуклеотид, направленный против IGF-1R (IGF-1R AS ODN). Полноразмерная кодирующая последовательность IGF-1R представлена как SEQ ID NO: 19 (см., например, PCT/US2016/26970, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки).

[0059] В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные сигнальной последовательности IGF-1R, содержащей РНК или ДНК. Сигнальная последовательность IGF-1R представляет собой последовательность из 30 аминокислот. В других вариантах реализации антисмысловая молекула содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные частям сигнальной последовательности IGF-1R, содержащей РНК или ДНК. В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные кодонам 1-309 IGF-1R, содержащей РНК или ДНК. В других вариантах реализации антисмысловая молекула содержит нуклеотидные последовательности, комплементарные частям кодонов 1-309 IGF-1R, содержащей РНК или ДНК.

[0060] В некоторых вариантах реализации длина IGF-1R AS ODN составляет по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 25 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 30 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 35 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 40 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 45 нуклеотидов или по меньшей мере примерно 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации длина IGF-1R AS ODN составляет от примерно 15 нуклеотидов до примерно 22 нуклеотидов. В некоторых аспектах длина IGF-1R AS ODN составляет примерно 18 нуклеотидов.

[0061] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN образует вторичную структуру при 18°С, но не образует вторичную структуру при примерно 37°С. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN не образует вторичную структуру при примерно 18°С или при примерно 37°С. Еще в одних других вариантах реализации IGF-1R AS ODN не образует вторичную структуру при любой температуре. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN не образует вторичную структуру при 37°С. В частных вариантах реализации вторичная структура представляет собой структуру шпилечной петли.

[0062] В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее фрагмент. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN может иметь по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 1 или ее фрагментом. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN содержит одну или более фосфотиоатных связей.

[0063] В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN состоит из SEQ ID NO: 1. NOBEL представляет собой 18-мер олигодезоксинуклеотид с фосфотиоатным остовом и последовательностью, комплементарной кодонам 2-7 в гене IGF-1R. В результате, NOBEL представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, направленный против IGF-1R (IGF-1R AS ODN). Последовательность NOBEL, полученная в качестве комплементарной последовательности гена IGF-1R на 5'-конце, представляет собой

5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3'.

[0064] NOBEL имеет стойкий срок годности и является устойчивым к деградации нуклеазы вследствие его фосфотиоатного остова. Введение NOBEL может быть обеспечено любым из стандартных способов, связанных с введением олигодезоксинуклеотидов, известных специалисту в данной области техники. Преимущественно, AS ODN, раскрытые в настоящем документе, в том числе NOBEL, могут быть введены с малой/отсутствующей токсичностью. Даже при уровнях примерно 2 г/кг (масштабированные) на основе испытаний на мышах (40 мкг в хвостовую вену) не проявлялось проблем с токсичностью. NOBEL может быть произведен в соответствии с обычными процедурами, известными специалисту в данной области техники.

[0065] Антисмысловая молекула, например, последовательность NOBEL с SEQ ID NO: 1, может также содержать одну или более модификаций р-этокси остова, как раскрыто в патенте США №9,744,187, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации остов нуклеиновой кислоты антисмысловой молекулы содержит по меньшей мере одну связь р-этокси остова. Например, вплоть до примерно 1%, вплоть до примерно 3%, вплоть до примерно 5%, вплоть до примерно 10%, вплоть до примерно 20%, вплоть до примерно 30%, вплоть до примерно 40%, вплоть до примерно 50%, вплоть до примерно 60%, вплоть до примерно 70%, вплоть до примерно 80%, вплоть до примерно 90%, вплоть до примерно 95% или вплоть до примерно 99% антисмысловой молекулы может быть связано р-этокси связью. Остальные связи могут представлять собой фосфодиэфирные связи или фосфотиоатные связи или их комбинацию. В предпочтительном варианте реализации 50%-80% связей фосфатного остова в каждом олигонуклеотиде представляют собой связи р-этокси остова, причем 20%-50% связей фосфатного остова в каждом олигонуклеотиде представляют собой фосфодиэфирные связи остова.

[0066] Различные антисмысловые последовательности IGF-1R являются биоактивными в некоторых или всех мультимодальных эффектах последовательности NOBEL. 18-мер последовательность NOBEL обладает как активностью даунрегуляции рецептора IGF-1R, так и активностью TLR-агониста, и дополнительные эксперименты на мышах предполагают, что обе активности необходимы для противоопухолевой иммунной активности in vivo. Несмотря на то, что молекула AS ODN обладает противоопухолевой активностью, комплементарная смысловая последовательность не обладает, хотя также имеет мотив CpG.

В некоторых вариантах реализации последовательность антисмысла выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO 1-14, как показано в Таблице 1. В некоторых вариантах реализации антисмысл имеет 90% идентичности последовательности с одной или более из SEQ ID NO 1-14. В некоторых вариантах реализации антисмысл имеет 80% идентичности последовательности с одной или более из SEQ ID NO 1-14. В некоторых вариантах реализации антисмысл имеет 70% идентичности последовательности с одной или более из SEQ ID NO 1-14.

[0067] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN содержит нуклеотидную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 1-14 или их фрагменты. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN может иметь по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% или 100% идентичности с любой из SEQ ID NO: 1-14 или их фрагментами.

[0068] В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула даунрегулирует экспрессию генов ниже по пути IGF-1R в клетке. В некоторых аспектах нижележащий ген представляет собой гексокиназу (Hex II). В некоторых вариантах реализации антисмысловая молекула даунрегулирует экспрессию генов домашнего хозяйства в клетке. В некоторых вариантах реализации ген домашнего хозяйства представляет собой L13.

[0069] В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN является химически синтезированным. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN произведен посредством органического твердофазного синтеза. В некоторых аспектах синтез IGF-1R AS ODN осуществляется в синтезирующем устройстве, снабженном закрытым химическим колонным реактором, с использованием проточной технологии. В некоторых вариантах реализации каждая последовательность цикла синтеза на твердом носителе состоит из множества этапов, которые выполняются последовательно до тех пор, пока не будет получен полноразмерный IGF-1R AS ODN. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN хранится в жидкой форме. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN лиофилизуют перед хранением. В некоторых вариантах реализации лиофилизированный IGF-1R AS ODN растворяют в воде перед применением. В других вариантах реализации лиофилизированный IGF-1R AS ODN растворяют в органическом растворителе перед применением. Еще в одном другом варианте реализации лиофилизированный IGF-1R AS ODN находится в составе фармацевтической композиции. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция представляет собой жидкую фармацевтическую композицию. В других аспектах фармацевтическая композиция представляет собой твердую фармацевтическую композицию. Дополнительные антисмысловые нуклеиновые кислоты также описаны в публикации заявки в США №2017/0056430, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Вакцина на основе аутологичных раковых клеток введение

[0070] Иммунотерапия в настоящее время используется для нацеливания на гематологические злокачественные опухоли одним общим клеточным антигеном. К сожалению, солидные опухоли являются намного более сложными, представляя эпигенетическое прогрессирование генетических изменений злокачественного состояния с неидентифицируемым количеством специфических для опухоли мишеней. Что еще более проблематично, в диагностической группе рака WHO существуют маркированные вариации фенотипов опухоли. Вакцина на основе аутологичных клеток могла бы охватить все такие вариации и все такие мишени, а также представлять собой идеальную специфическую для субъекту иммунотерапию для видов рака с солидной опухолью. Однако вакцина на основе аутологичных раковых клеток не может быть получена из первичных культур клеток, поскольку последовательные пассажи изменяют фенотип опухоли, тем самым уменьшая ряд специфичных к опухоли антигенов. Это также будет требовать невозможной аттестации партии на каждом пассаже. Настоящее раскрытие устраняет эти проблемы путем посева недавно резецированных, измельченных опухолевых клеток и их повторной имплантации в течение 24 часов в качестве медленно высвобождающегося антигена, как показано на фиг. 22. В некоторых аспектах превосходные результаты, достигаемые настоящим изобретением, получают за счет обеспечения того, что надлежащее количество клеток присутствует в камере(ах), помимо других лекарственных средств, описанных в настоящем документе.

[0071] В прошлых исследованиях была разработана вакцина на основе аутологичных клеток за счет применения антигенпрезентирующих клеток вместо аутологичных опухолевых клеток. В этом подходе моноциты субъекта собирают при лейкаферезе плазмы перед лечением и дифференцируют на аутологичные дендритные клетки (DC) ex vivo. Дендритные клетки затем презентируются исходным лизатом опухоли субъекта индуцируя активацию/созревание DC, а в более позднее время созревшие дендритные клетки, теперь уже перекрестно примированные опухолевыми антигенами, инъецируют субъекту в виде DC-вакцины. Однако в ex vivo дифференциации отсутствует ряд ключевых стимулирующих компонентов, которые имеются только in vivo. В дополнение, дифференциация DC из гематопоэтических предшественников требует обширных манипуляций in vitro с трудоемкой обработкой клеток на дорогом оборудовании. Настоящее раскрытие устраняет данные проблемы путем обеспечения эндогенного процесса созревания DC, а также иммуномодуляторного и иммуностимулирующего антисмыслового олигодезоксинуклеотида (AS-ODN), который способствует развитию соответствующего иммунного ответа. Более конкретно, в настоящем раскрытии обеспечена биодиффузионная камера, содержащая диспергированные опухолевые клетки, полученные от пациента, и облученные антисмысловые молекулы, которая имплантирована пациенту на терапевтически эффективное время. Без ограничения какой-либо теорией, считается, что комбинация облученных опухолевых клеток, антисмысла и биодиффузионной камеры действует сообща для стимуляции локального иммунного ответа, а также усиливает ответ путем уменьшения или устранения М2-клеток, предотвращая ослабление иммунной системы.

[0072] Таким образом, в настоящем раскрытии показано, что облученная, имплантируемая биодиффузионная камера, содержащая недавно резекцированные опухолевые клетки и IGF-1R AS ODN, безопасным образом служит в качестве эффективной, специфической для субъекта вакцины на основе аутологичных клеток для иммунотерапии рака. В результате, применение заявленной имплантируемой биодиффузионной камеры для формирования иммунного ответа, который селективно нацелен на опухолевые клетки у субъекта, обеспечивает новый и существенный подход для лечения рака, в особенности, GBM.

Биодиффузионная камера

[0073] Пример диффузионной камеры содержит барабан камеры, имеющий два конца, первый конец и второй конец. В вариантах реализации биодиффузионная камера представляет собой небольшое кольцо, закрытое с одной стороны пористой проницаемой для клеток мембраной, такой как мембрана Duropore, производимая Millipore Corporation. Необязательно, один из концов может быть закрыт как часть корпуса камеры, оставляя только один конец открытым для герметизации с помощью пористой мембраны. Мембраны могут быть выполнены из пластика, тефлона, сложного полиэфира или любого инертного материала, который является крепким, гибким и способным выдерживать химическую обработку. Камера может быть изготовлена из любого вещества, такого как, без ограничения, пластик, тефлон, люцит, титан, плексиглас или любой инертный материал, который не является токсичным и хорошо переносится людьми. В дополнение, камеры должны выдерживать стерилизацию. В некоторых аспектах диффузионные камеры стерилизованы этиленоксидом перед применением. Другие подходящие камеры описаны в предварительной патентной заявке США №62/621,295, поданной 24 января 2018 г., патенте США №6,541,036, PCT/US16/26970 и патенте США №5,714,170, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

[0074] В некоторых вариантах реализации мембрана обеспечивает возможность прохождения малых молекул, но не обеспечивает возможность прохождения клеток (т.е. клетки не могут покинуть камеру или попасть в нее). В некоторых аспектах диаметр пор мембраны обеспечивает возможность диффузии нуклеиновых кислот и других химических веществ (таких как, например, цитокины, продуцируемые клетками) из камеры, не обеспечивает возможность прохождения клеток между камерой и субъектом, которому она имплантирована. Биодиффузионные камеры, полезные в настоящем раскрытии, включают любую камеру, которая не обеспечивает возможность прохождения клеток между камерой и субъектом, которому она имплантирована, однако при условии того, что камера позволяет взаимообмен и прохождение факторов между камерой и субъектом. Таким образом, в некоторых аспектах размер пор имеет отсечение, которое предотвращает прохождение материалов, объем которых превышает 100 мкм³, в и из камеры. В некоторых вариантах реализации поры мембраны имеют диаметр примерно 0,25 мкм или меньше. Например, поры могут иметь диаметр примерно 0,1 мкм (см. фиг. 1). В частных аспектах диапазон диаметра пор составляет от 0,1 мкм до 0,25 мкм. См. также Lange и др., J. Immunol., 1994, 153, 205-211 и Lanza и др., Transplantation, 1994, 57, 1371-1375, полное содержание каждого из которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Этот диаметр пор предотвращает прохождение клеток в и из камеры. В некоторых вариантах реализации диффузионные камеры изготовлены из 14 мм люцитовых колец с гидрофильными мембранами Durapore с размером пор 0,1 мкм (Millipore, Bedford, Mass.).

[0075] В некоторых вариантах реализации биодиффузионная камера содержит мембрану, которая обеспечивает возможность диффузии IGF-1R AS ODN из камеры. В некоторых вариантах реализации примерно 50% IGF-1R AS ODN диффундирует из камеры в течение примерно 12 часов, примерно 60% IGF-1R AS ODN диффундирует из камеры в течение примерно 24 часов, примерно 80% IGF-1R AS ODN диффундирует из камеры в течение примерно 48 часов и/или примерно 100% IGF-1R AS ODN диффундирует из камеры в течение примерно 50 часов.

[0076] В иллюстративном подходе для сборки биодиффузионной камеры первую пористую мембрану прикрепляют к одной стороне первой диффузионной камеры с помощью клея и давления для создания плотного уплотнения. Вторую пористую мембрану подобным образом прикрепляют ко второму кольцу диффузионной камеры. Мембраны могут быть закреплены на месте с помощью резиновых прокладок, которые также могут обеспечивать более плотное уплотнение. Кольца диффузионной камеры оставляют на ночь (минимум 8 часов) для высыхания. Затем первое кольцо диффузионной камеры и второе кольцо диффузионной камеры прикрепляют друг к другу с помощью клея и оставляют на ночь (минимум 8 часов) для высыхания. В предпочтительном варианте реализации процесс соединения первого кольца камеры и второго кольца камеры включает использование 2-дихлорэтана в качестве растворителя для облегчения адгезии между двумя кольцами. См., например, фиг. 22, на которой показаны две пористые мембраны. В альтернативном подходе камера может иметь только одну сторону, которая содержит пористую мембрану.

[0077] В барабанной части камеры выполнено одно или более отверстий (например, портов), которые могут закрываться крышкой, к которой имеется доступ снаружи тела субъекта, когда камера имплантирована, тем самым обеспечивая возможность повторного заполнения диффузионной камеры. Отверстия обеспечивают возможность многократного и последовательного отбора образцов содержимого без загрязнения и без нанесения субъекту вреда, тем самым существенно понижая количество процедур имплантации, выполняемых субъекту. Перед имплантацией пациенту одно или более отверстий могут быть герметизированы с помощью костного воска, заглушки порта или крышки, изготовленной, например, из РММА. Крышка может быть навинчиваемого типа из самоуплотняющейся резины и подогнанную под отверстие. В некоторых конфигурациях диффузионная камера может содержать два или более отверстий или портов для инъекции. Отбор проб содержимого камеры может выполняться путем доступа к отверстию путем удаления крышки снаружи тела субъекта и вставки обычной иглы и шприца. В некоторых вариантах реализации камера может дополнительно включать устройство для удаления. Такое устройство упрощает удаление камеры из пациента.

[0078] В вариантах реализации камера служит в качестве хранилища антигена, выполненного таким образом, что опухолевые антигены диффундируют из камеры с целью вызова терапевтического иммунного ответа хозяина. Экзогенный IGF-1R AS ODN и ex vivo облучение вызывают провоспалительный ответ. Этот состав связан с клиническими и радиографическими улучшениями, пролонгированной выживаемостью по протоколу и представляет собой новую вакцину на основе аутологичных клеток, которая включает экзогенный активный фармацевтический ингредиент (API) и облучение, которые интерпретируются нами как эффект, индуцирующий или усиливающий иммунитет к опухоли. Кроме того, добавление низкой концентрации IGF-1R AS ODN критически важно для провоспалительного ответа (фиг. 12).

[0079] В некоторых вариантах реализации в раскрытии представлена биодиффузионная камера для имплантации субъекту, страдающему от рака, содержащая: (а) опухолевые клетки; и (b) эффективное количество антисмысловой молекулы. В других вариантах реализации представлен способ лечения рака у субъекта, включающий: (а) получение биодиффузионной камеры, содержащей опухолевые клетки и эффективное количество антисмысловой нуклеиновой кислоты; (b) облучение биодиффузионной камеры и содержимого; и (с) имплантацию облученной биодиффузионной камеры субъекту на терапевтически эффективное время.

[0080] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN присутствует в биодиффузионной камере в количестве, находящемся в диапазоне от примерно 0,5 мкг до примерно 10 мкг. В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN присутствует в количестве, находящемся в диапазоне от примерно 1 мкг до примерно 5 мкг на камеру, или от примерно 2 мкг до 4 мкг на камеру. В частных аспектах IGF-1R AS ODN присутствует в количестве примерно 2 мкг на камеру. В частных аспектах IGF-1R AS ODN присутствует в количестве примерно 4 мкг на камеру. Не ограничиваясь теорией, считается, что эти уровни вызывают улучшенный Th1-ответ у субъекта, при этом предотвращая у субъекта М2-иммуностимулирующий ответ.

[0081] В некоторых вариантах реализации опухолевые клетки не обрабатывают с помощью IGF-1R AS ODN перед инкапсуляцией в камеру. Однако как правило, опухолевые клетки обрабатывают с помощью IGF-1R AS ODN перед инкапсуляцией в камеру. Время для обработки клеток перед инкапсуляцией может варьироваться. Например, опухолевые клетки могут быть обработаны ex vivo с помощью IGF-1R AS ODN непосредственно перед инкапсуляцией, в течение до примерно 4 часов, в течение до примерно 6 часов, в течение до примерно 8 часов, в течение до примерно 12 часов или в течение до примерно 18 часов. Как правило, опухолевая ткань может быть обработана ех vivo в течение от примерно 12 часов до примерно 18 часов перед инкапсуляцией. В целях удобства, клетки могут быть инкапсулированы после предварительной обработки, продолжающейся до длительности всей ночи. Не ограничиваясь теорией, считается, что обработка перед инкапсуляцией играет желаемую роль в стимуляции продукции опухолевого антигена.

[0082] Количество IGF-1R AS ODN, используемое для обработки перед инкапсуляцией, может находиться в диапазоне от примерно 1 мг до 8 мг на миллион клеток; например, от примерно 2 мг до примерно 6 мг на миллион клеток, от примерно 3 мг до примерно 5 мг на миллион клеток. Как правило, количество IGF-1R AS ODN, используемое для обработки перед инкапсуляцией, составляет примерно 4 мг на миллион клеток.

[0083] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN для ex vivo обработки опухолевых клеток используется в концентрации, находящейся в диапазоне от примерно по меньшей мере 2 мг/мл до по меньшей мере примерно 5 мг/мл. В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN используется в концентрации по меньшей мере 4 мг/мл. В конкретных вариантах реализации IGF-1R AS ODN используется в концентрации 4 мг/мл.

[0084] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток ex vivo, и IGF-1R AS ODN, присутствующий в камере, являются одинаковыми. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток ex vivo, и IGF-1R AS ODN, присутствующий в камере, отличаются. В некоторых вариантах реализации длина IGF-1R AS ODN, используемого для обработки опухолевых клеток ex vivo, составляет по меньшей мере примерно 5 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 25 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 30 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 35 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 40 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 45 нуклеотидов или по меньшей мере примерно 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации длина IGF-1R AS ODN, используемого для обработки опухолевых клеток ех vivo, составляет от примерно 15 нуклеотидов до примерно 22 нуклеотидов. В некоторых аспектах длина IGF-1R AS ODN, используемого для обработки опухолевых клеток, составляет примерно 18 нуклеотидов.

[0085] В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток ex vivo, образует вторичную структуру при 18°С, но не образует вторичную структуру при примерно 37°С. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток, не образует вторичную структуру при примерно 18°С или при примерно 37°С. Еще в одних других вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток ex vivo, не образует вторичную структуру при любой температуре. В других вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток ex vivo, не образует вторичную структуру при 37°С. В частных вариантах реализации вторичная структура представляет собой структуру шпилечной петли.

[0086] В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее фрагмент. В некоторых вариантах реализации IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток, может иметь по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 98% или 100% идентичности с SEQ ID NO: 1 или ее фрагментом. В некоторых аспектах IGF-1R AS ODN, используемый для обработки опухолевых клеток, представляет собой SEQ ID NO: 1.

[0087] После того, как опухолевые клетки обработаны AS-ODN в течение периода времени, AS-ODN удаляют и в камеру добавляют свежий AS-ODN, который затем облучают перед имплантацией субъекту. В некоторых аспектах биодиффузионную камеру обрабатывают гамма-излучением в дозе примерно 1 Гр, примерно 2 Gy, примерно 4 Гр, примерно 5 Гр, примерно 6 Гр, примерно 10 Гр или до примерно 15 Гр. В некоторых аспектах доза облучения составляет не более чем примерно 5 Гр. В других аспектах доза облучения составляет по меньшей мере примерно 5 Гр. В некоторых аспектах доза облучения составляет 5 Гр. В некоторых вариантах реализации биодиффузионная камера может быть облучена по меньшей мере один раз, по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза, по меньшей мере четыре раза или по меньшей мере пять раз. В некоторых вариантах реализации камеру облучают за менее чем примерно 24 часа до имплантации субъекту. В других вариантах реализации камеру облучают примерно за 24 часа до имплантации субъекту. Еще в других вариантах реализации камеру облучают по меньшей мере примерно за 24 часа до имплантации субъекту. Еще в одних других вариантах реализации камеру облучают не более чем примерно за 48 часа до имплантации субъекту. Еще в других вариантах реализации камеру облучают по меньшей мере примерно за 48 часа до имплантации субъекту.

[0088] Хотя опухолевые клетки, как правило, убивают перед имплантацией, например, излучением, клетки не обязательно должны быть убиты и действительно может быть преимущественным поддержание клеток в живом состоянии для способствования высвобождению антигена. Таким образом, в некоторых вариантах реализации клетки могут не подвергаться облучению перед имплантацией. Однако из соображений безопасности желательно предотвращать высвобождение живых опухолевых клеток в субъекта.

[0089] Опухолевые клетки могут быть помещены в диффузионную камеру в разных количествах. В некоторых вариантах реализации в каждую диффузионную камеру помещают от примерно 1×10⁴ до примерно 5×10⁶ опухолевых клеток. В других вариантах реализации в диффузионную камеру помещают от примерно 1×10⁵ до примерно 1,5×10⁶ опухолевых клеток. Еще в одних других вариантах реализации в диффузионную камеру, которая может быть использована в субъекте, помещают от примерно 5×10⁵ до 1×10⁶ опухолевых клеток. Нами было обнаружено, что количество опухолевых клеток может влиять на противоопухолевый ответ субъекта и что для повышения шанса на получение желаемых результатов должен быть выбран подходящий диапазон. На фиг. 28 показаны данные пациентов, которым имплантировали 20 камер, и показан клеточный выход (в миллионах клеток), соответствующий иммунному ответу. Противоопухолевый иммунный ответ является оптимальным в диапазоне от примерно 750000 до примерно 1250000 клеток в камере с пиком при примерно 1 миллионе клеток на камеру. Вводится множество камер, содержащих облученные опухолевые клетки, и для поддержания оптимального иммунного ответа количество клеток на камеру, предпочтительно, поддерживается в пределах упомянутого диапазона. Предпочтительно, опухолевые клетки являются интактными и не подвергаются аутолизу или иному повреждению как описано в настоящем документе.

[0090] В некоторых вариантах реализации может быть предпочтительно поддерживать отношение клеток к AS ODN в камере. Таким образом, в некоторых аспектах камеры могут содержать примерно 2 мкг AS ODN и между 750000 и 1250000 клеток, например, 1000000 клеток. Таким образом, отношение клеток к AS ODN может находиться в диапазоне от примерно 3,75×10⁵ до примерно 6,25×10⁵ на мкг AS OD, например, примерно 5,0×10⁵ клеток на мкг. Таким образом, у обычного пациента, получающему 20 камер, общая доза AS ODN составляет примерно 40 мкг.

[0091] Как правило, введение будет проводиться в камере, как описано в настоящем документе; однако в некоторых аспектах облученные клетки и IGF-1R AS ODN могут быть совместно введены субъекту, физически не находясь совместно в камере или другой емкости. В некоторых способах, использующих данный подход, облученные клетки IGF-1R AS ODN, таким образом, диспергируются, диффундируют или метаболизируются в теле, ограничиваясь физиологией субъекта. Таким образом, в некоторых аспектах, например, опухолевые клетки для применения могут быть приготовлены так, как описано в настоящем документе, для камеры и введены вместе с IGF-1R AS ODN, однако введение может быть не в физической емкости. Такое введение, как правило, является внутримышечным.

Подготовка опухолевой ткани для камеры

[0092] Опухолевые клетки для применения в аутологичном вакцинировании хирургически удаляют из субъекта. В вариантах реализации опухолевые клетки удаляют из пациента с помощью тканевого морцеллятора. В устройстве для экстрагирования, предпочтительно, скомбинирована высокоскоростная возвратно-поступательная внутренняя канюля внутри неподвижной внешней канюли и электронно управляемое изменяемое всасывание. Внешняя канюля имеет диаметр, составляющий 1,1 мм, 1,9 мм, 2,5 мм или 3,0 мм, и длину, составляющую 10 см, 13 см или 25 см. Инструмент также основан на боковом отверстии для резания и аспирации, расположенном на расстоянии 0,6 мм от тупого конца осушителя. Комбинация мягкого давления вперед отверстия на ткань, подлежащей удалению, и всасывания затягивает желаемую ткань в боковое отверстие, обеспечивая возможность управляемой и точной резекции ткани посредством возвратно-поступательного режущего действия внутренней канюли. Ключевым признаком является отсутствие вращающейся лопасти; это предотвращает затягивание ненужной ткани в отверстие. Примером подходящего устройства является аспиратор ткани Myriad® (NICO Corporation® Indianapolis, IN), минимально инвазивная хирургическая система, которая может быть использована для удаления мягких тканей с непосредственной, микроскопической или эндоскопической визуализацией. Срезанная ткань всасывается, собирается в камере для сбора и накапливается в стерильном уловителе ткани. Во время накопления ткани в стерильном уловителе ткани кровь удаляется из препарата. Предпочтительно, стерильный уловитель содержит чашу для сбора на дне уловителя и стержень, которая обеспечивает доступ к уловителю. Конструкция уловителя также может содержать внутреннюю ковшеобразную конструкцию, которая выполнена с возможностью удаления из уловителя для облегчения удаления ткани из уловителя.

[0093] Предпочтительно, морцеллятор не генерирует тепло в месте резекции или вдоль своего вала, и не требует ультразвуковой энергии для удаления ткани. Таким образом, в частных вариантах реализации опухолевая ткань представляет собой измельченную опухолевую ткань (т.е. срезанную опухолевую ткань, полученную путем бокового среза в отсутствии тепла, и, необязательно, в отсутствии ультразвуковой обработки). Преимущественно, извлеченная аспиратором и измельченная ткань имеет более высокую жизнеспособность, чем ткань, удаленная другими способами. Считается, что процесс извлечения сохраняет более высокую жизнеспособность опухолевой клетки частично ввиду ограниченного воздействия высоких температур на опухолевые клетки во время удаления. Например, в способах, представленных в настоящем документе, опухолевые клетки не подвергают воздействию температур выше 25°С во время удаления. Таким образом, клетки не подвергают воздействию температур выше температуры тела, т.е. примерно 37°С.

[0094] Количество опухолевой ткани, полученное от субъекта, может варьироваться. Предпочтительно, количество составляет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 грамма или по меньшей мере 4 грамма влажной опухолевой ткани, полученной от пациента. Ткань удаляют из стерильного уловителя ткани и дезагрегируют путем пипетирования с помощью стерильной пипетки для разрушения крупных фрагментов ткани. Дезагрегированную клеточную суспензию затем помещают на стерильные планшеты для культивирования ткани в среду, содержащую сыворотку, и инкубируют в инкубаторе для культивирования ткани. Этот этап помещения на планшет служит для обогащения желаемых функциональных клеток путем адгезии, а также помогает удалить посторонние продукты из препарата. Таким образом, опухолевые клетки, используемые в лечении, описанном в настоящем документе, предпочтительно, состоят по существу из или состоят из адгезивных клеток из опухолевой ткани.

[0095] По прошествии заранее определенного времени инкубации (например, 6, 12, 24 или 48 часов), клетки удаляют из планшетов. Клетки могут быть удалены путем соскабливания, химическими методами (например, EDTA) или путем ферментативной обработки (например, трипсином). Клетки помещают в одну или более диффузионных камер. В некоторых вариантах реализации клетки распределяют между 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более диффузионными камерами. Зачастую используют 20 камер. В некоторых вариантах реализации каждая диффузионная камера содержит одинаковое количество клеток. В некоторых вариантах реализации первая диффузионная камера содержит больше клеток, чем вторая камера.

[0096] В некоторых вариантах реализации клетки сортируют перед помещением в камеру. В некоторых вариантах реализации клетки обогащают путем выбора одного или более клеточных маркеров перед помещением в камеру. Выбор могут выполнять, например, с помощью сфер или с помощью технологий сортировки клеток, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации клетки, помещенные в камеру, обогащают одним или более маркерами.

[0097] В некоторых вариантах реализации имплантация биодиффузионной камеры на терапевтически эффективное время понижает или устраняет рецидив рака у субъекта. В некоторых аспектах имплантация биодиффузионной камеры вызывает снижение объема опухоли, связанной с раком у субъекта. Еще в одних других вариантах реализации имплантация биодиффузионной камеры на терапевтически эффективное время вызывает устранение опухоли у субъекта. В некоторых вариантах реализации имплантация камеры ингибирует повторный рост опухоли по меньшей мере в течение 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 36 месяцев или без ограничения по времени.

[0098] Биодиффузионная камера может быть имплантирована субъекту следующими неограничивающими способами: подкожно, интраперитонеально и интракраниально. В некоторых вариантах реализации диффузионная(ые) камера(ы) имплантируют в принимающем участке тела, имеющем хороший лимфатический отток и/или снабжение сосудами, таком как влагалище прямой мышцы живота. В других вариантах реализации повторно заполняемая камера может быть реализована так, что диффузионная камера может быть повторно использована для лечения и опорожнена после лечения. В некоторых вариантах реализации в одном субъекте может быть использовано множество диффузионных камер, предпочтительно, между 5 и 20.

[0099] В некоторых вариантах реализации субъекту имплантируют по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3, по меньшей мере примерно 4, по меньшей мере примерно 5, по меньшей мере примерно 10, по меньшей мере примерно 15, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 25, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 35, по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 45, или по меньшей мере примерно 50 камер. В некоторых вариантах реализации субъекту имплантируют 10-20 камер. Предпочтительно, субъекту имплантируют примерно 20 камер. В некоторых вариантах реализации опухолевые клетки распределяют поровну для всех камер.

[00100] Как правило, камеру удаляют по прошествии периода времени. Например, камера может быть имплантирована субъекту примерно на 24 часа, примерно 48 часов, примерно 72 часа или примерно 96 часов. Имплантация примерно на 48 часов связана с благоприятными терапевтическими результатами. Следовательно, предпочтительным временем имплантации является примерно 48 часов. В некоторых вариантах реализации процедуру вакцинации выполняют один раз на пациента. В других вариантах реализации процедуру вакцинации выполняют множество раз на пациента. В вариантах реализации процедуру вакцинации выполняют два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз или восемь раз одному пациенту. В вариантах реализации вакцинацию повторяют каждые 7, 14 или 28 дней, или каждые 1, 3 или 6 месяцев в течение заданного периода времени. Еще в одних вариантах реализации процедуру вакцинации повторяют периодически до тех пор, пока у пациента не будет рака.

[00101] Без ограничения теорией, считается, что имплантация биодиффузионной камеры вызывает устранение или снижение М2-клеток в или вблизи места имплантации так, что достигается иммунный ответ против опухолевых антигенов, диффундирующих из камеры. В некоторых аспектах устранение или снижение М2-клеток в месте имплантации приводит к улучшенной презентации аутологичных опухолевых антигенов антигенпрезентирующими клетками (АРС) Т-клеткам CD4, приводя к продуцированию интерферон-гамма (IFNγ) и вырабатыванию иммунитета к опухоли 1-го типа. В некоторых аспектах продуцирование IFNγ опухолевыми антиген-специфичными Т-клетками CD4 и анти-М2 эффектами IGF-1R AS ODN активируют противоопухолевый иммунитет 1-го типа и потерю противовоспалительных М2-клеток из циркуляции и микросреды опухоли, непрямым образом воздействуя на рост опухоли. В некоторых аспектах продуцирование IFNγ опухолевыми антиген-специфическими Т-клетками CD4 и анти-М2 эффектами IGF-1R AS ODN реализует опосредованное эффектором повреждение опухолевых клеток и микросреды опухоли (М2-клеток), а также инициирует более длительный процесс программирования Т-клеток памяти, распознающих опухолевые антигены. В некоторых вариантах реализации противоопухолевый адаптивный иммунный ответ поддерживает продолжительную регрессию опухоли.

[00102] Необязательно, клетки, введенные в камеру, могут быть обогащены некоторыми типами клеток. Нестин, цитоскелет-ассоциированный белок промежуточного филамента (IF) класса VI, традиционно был отмечен ввиду своей важности в качестве маркера нейрональных стволовых клеток. Нами было обнаружено, что в некоторых образцах опухоли головного мозга клетки, являющиеся позитивными в отношении нестина (нестин + клетки) обогащены по сравнению с доброкачественной тканью, и что эта связь соответствует улучшенному терапевтическому ответу. Таким образом, в некоторых аспектах опухоль субъекта может быть подвергнута биопсии для оценки степени экспрессии нестина и, следовательно, в некоторых аспектах клетки в камере обогащены нестин-положительными («+») клетками по сравнению с доброкачественной тканью. Без ограничения теорией, считается, что нестин обеспечивает маркер, связанный с подходящими антигенами, пригодными для продуцирования противоопухолевого иммунного ответа. Следовательно, клетки, имплантированные в камеру, могут быть обогащены нестин + клетками по сравнению с популяцией опухолевых клеток в целом при извлечении из субъекта. На фигуре 30 изображен усиленный иммунный ответ, полученный, когда образец опухоли, используемый для стимуляции ответа, обогащен нестином.

Системное введение

[0100] В качестве альтернативы или в дополнение к имплантации камер, IGF-1R AS ODN может быть введен системно. Таким образом, в вариантах реализации IGF-1R AS ODN представлен в фармацевтической композиции для системного введения. В дополнение к IGF-1R AS ODN, фармацевтическая композиция может содержать, например, соляной раствор (0,9% хлорида натрия). Композиция может содержать фосфолипиды. В некоторых аспектах фосфолипиды не имеют заряда или имеют нейтральный заряд при физиологическом рН. В некоторых аспектах фосфолипиды представляют собой нейтральные фосфолипиды. В некоторых аспектах нейтральные фосфолипиды представляют собой фосфатидилхолины. В некоторых аспектах нейтральные фосфолипиды представляют собой диолеоил фосфатидилхолина (DOPC). В некоторых аспектах фосфолипиды по существу не содержат холестерин.

[0101] В некоторых аспектах фосфолипиды и олигонуклеотиды присутствуют в молярном соотношении от примерно 5:1 до примерно 100:1 или при любом соотношении, которое может быть получено здесь. В различных аспектах фосфолипиды и олигонуклеотиды присутствуют при молярном соотношении примерно 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1. В некоторых аспектах олигонуклеотиды и фосфолипиды образуют комплекс олигонуклеотид-фосфолипид, такой как, например, липосомный комплекс. В некоторых аспектах по меньшей мере 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% липосом имеют диаметр менее чем 5 микрон. В различных аспектах композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, такое как, например, полисорбат 20. В некоторых аспектах по меньшей мере примерно 5% всего липосомного анстисмыслового лекарственного продукта состоит из поверхностно-активного вещества и по меньшей мере примерно 90% липосом имеют диаметр менее чем 5 микрон. В некоторых аспектах по меньшей мере примерно 15% всего липосомного анстисмыслового лекарственного продукта состоит из поверхностно-активного вещества и по меньшей мере примерно 90% липосом имеют диаметр менее чем 3 микрон. В некоторых аспектах совокупность олигонуклеотидов включена в совокупность липосом.

[0102] В некоторых аспектах фармацевтическая композиция представляет собой жидкую фармацевтическую композицию. В других аспектах фармацевтическая композиция представляет собой твердую фармацевтическую композицию.

[0103] Дозировки для системного введения антисмысла субъектам-людям может составлять примерно 0,025 г/кг, примерно 0,05 г/кг, примерно 0,1 г/кг, примерно 0,15 г/кг или примерно 0,2 г/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка для системного введения может составлять от 0,025 г/кг до 0,2 г/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка составляет 0,2 г/кг. В других вариантах реализации дозировка составляет от 0,004 г/кг до 0,01 г/кг. В других вариантах реализации дозировка составляет менее чем 0,01 г/кг. Еще в одних вариантах реализации дозировка не составляет от 0,01 г/кг до 0,02 г/кг. В некоторых аспектах антисмысл поставляют в виде лиофилизированного порошка и повторно суспендируют перед введением. Будучи повторно суспендированным концентрация антисмысла может составлять примерно 50 мг/мл, примерно 100 мг/мл, примерно 200 мг/мл, примерно 500 мг/мл, примерно 1000 мг/мл или диапазон между этими количествами.

[0104] В некоторых вариантах реализации AS ODN может быть введен системно перед операцией; например, перед хирургическим вмешательством для снижения нагрузки от опухоли. Например, AS ODN может быть введен за 24 часа, за 36 часов, за 48 часов или за 72 часа до хирургического вмешательства. В частных аспектах фармацевтическая композиция может быть введена за примерно от 48 до примерно 72 часов до хирургического вмешательства. Как правило, при таких обстоятельствах, введение выполняют с помощью внутривенного болюса.

Комбинированные терапии

[0105] Исторически, лечение рака включает подвергание субъектов облучению, химиотерапии или обеим процедурам. Такие подходы обладают документально подтвержденные проблемы. Однако преимущественно, способы имплантации камеры, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения субъекта, у которого рак, в качестве монотерапии. Таким образом, предпочтительно, чтобы способы, раскрытые в настоящем документе, не включали химиотерапию или лучевую терапию. Однако несмотря на превосходный эффект, достигаемый здесь подходами с монотерапией, при некоторых обстоятельствах может быть благоприятно комбинировать способы с камерой с другими видами терапии; например, лучевой терапией. В некоторых вариантах реализации лучевая терапия включает, но без ограничения, терапию внутренним источником излучения, дистанционную лучевую терапию и системную радиоизотопную терапию. В некоторых аспектах лучевая терапия представляет собой дистанционную лучевую терапию. В некоторых вариантах реализации дистанционная лучевая терапия включает, но без ограничения, терапию гамма-излучением, рентгенотерапию, лучевую терапию с модуляцией интенсивности (IMRT) и лучевую терапию, корректируемую по изображениям (IGRT). В некоторых вариантах реализации дистанционная лучевая терапия представляет собой терапию гамма-излучением. Излучение может применяться перед имплантацией камеры или после имплантации; например, в качестве резервной терапии. Как правило, такие подходы с резервной терапией не реализуют до тех пор, пока не определен рецидив рака.

[0106] Таким образом, в некоторых комбинированных подходах на одном и том же субъекте могут быть применены как способы с камерой, так и системные способы и композиции, описанные в настоящем документе, отдельно или в комбинации с облучением или химиотерапией. В комбинированных подходах, описанных в настоящем документе, имплантацию камеры, предпочтительно, применяют в качестве терапии первой линии. Применение имплантации камеры первой является предпочтительным, поскольку иммунная система субъекта может быть подавлена другими видами терапии, снижая терапевтическую положительный эффект от имплантации камеры.

[0107] Необязательно, перед имплантацией камеры может быть выполнено системное введение. Такой подход может быть применен для усиления иммунной системы субъекта в качестве подготовительного подхода. Подготовительный подход может быть особенно предпочтителен, когда предыдущая терапия привела к тому, что иммунная система субъекта нарушилась.

[0108] Когда системное введение применяют в комбинации, AS ODN может быть системно введен за по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 3 дня или по меньшей мере 1 день перед лечением пациента с помощью вакцины на основе аутологичных раковых клеток. В других вариантах реализации AS ODN может быть системно введен через по меньшей мере 1 день, по меньшей мере 3 дня, по меньшей мере 1 неделю или по меньшей мере 2 недели после лечения пациента с помощью вакцины на основе аутологичных раковых клеток, т.е. камеры.

[0109] Необязательно, субъекту может быть повторно вакцинирован камерами с помощью способов, описанных здесь, после первой вакцинации. Во второй или еще одной дополнительной вакцинации могут быть использованы опухолевые клетки, взятые у субъекта во время удаления ткани и сохраненные. Необязательно, во второй или еще одной дополнительной вакцинации может быть использована недавно извлеченная у субъекта и обработанная опухолевая ткань, как описано в настоящем документе. Любая опухоль, остающаяся у субъекта, может экспрессировать одни и те же антигены и, следовательно, действовать в качестве хранилища, обеспечивая повторную стимуляцию. Однако рецидивирующие опухоли могут вырабатывать новые антигены и, следовательно, обеспечивать дополнительные варианты для стимуляции противоопухолевого ответа. Последующая вакцинация может быть выполнена после завершения первого лечения и после рецидива опухоли или если у субъекта отсутствует ответ на первое лечение.

Субъекты для лечения с помощью IGF-1R AS ODN

[0110] Подходящими субъектами являются животные, у которых рак; как правило, субъектом является человек. Несмотря на то, что способы, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают положительный эффект, в частности, в случае рака головного мозга, такого как глиобластома, способы применимы в целом к раку. Соответственно, в раскрытии представлены способы лечения рака, включающего те виды, которые выбраны из группы, состоящей из: глиомы, астроцитомы, гепатокарциномы, рака молочной железы, плоскоклеточного рака головы и шеи, рака легких, почечно-клеточной карциномы, гепатоклеточной карциномы, рака желчного пузыря, классической лимфомы Ходжкина, рака пищевода, рака матки, рака прямой кишки, рака щитовидной железы, меланомы, колоректального рака, рака простаты, рака яичников и рака поджелудочной железы. В конкретных вариантах реализации рак представляет собой глиому. В некоторых аспектах глиома представляет собой рецидивирующую злокачественную глиому. В некоторых вариантах реализации рак представляет собой астроцитому. В некоторых вариантах реализации субъект, который является кандидатом для лечения, страдает от опухоли стадии II по WHO, стадии III по WHO или стадии IV по WHO. В некоторых аспектах опухоль представляет собой астроцитому. В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из астроцитомы стадии II, AIII (астроцитомы стадии III с мутацией IDH1 R132H), AIII-G (астроцитома стадии III с IDH1 дикого типа с характеристиками мультиформной глиобластомы) или астроцитомы стадии IV.

[0111] Астроцитома стадии IV является глиомой наивысшей стадии и является синонимом глиобластомы (GBM). При ежегодной частоте возникновения, составляющей 3 или 4 на 100000, GBM является наиболее частой злокачественной первичной опухолью головного мозга у взрослых. Стандартное лечение, как правило, представляющее собой комбинацию лучевой терапии и химиотерапии с использованием темозоломида, не дает хороших результатов и результаты у пациентов с GBM остаются плохими при медианном ожидании продолжительности жизни 15-17 месяцев. Преимущественно, способы, раскрытые в настоящем документе, могут быть применены для лечения впервые диагностированных типов рака головного мозга, а также могут быть применены для лечения рецидивирующей глиобластомы; например, у пациентов, которые ранее получали стандартное лечение. Таким образом, в некоторых аспектах субъектом может быть субъект с впервые диагностированной GBM или субъект с рецидивирующей GBM. Предпочтительно, субъект является лицом, которое ранее не получало какое-либо лечение с помощью терапевтических подходов, являющихся иммунносупрессивными. В частных аспектах подходящими являются субъекты возрастом более 18 лет и с индексом Карновского 60 или выше. Необязательно, субъекты не имеют двуполушарного заболевания и/или не имеют аутоиммунного заболевания.

[0112] Необязательно, субъект, который является кандидатом для лечения, может быть идентифицирован путем выполнения биопсии опухоли у субъекта. В некоторых вариантах реализации опухоли у субъекта анализируют на наличие моноцитов. В некоторых аспектах моноциты включают, но без ограничения, моноциты CD11b+, CD14+, CD15+, CD23+, CD64+, CD68+, CD163+, CD204+ или CD206+. Наличие моноцитов в опухолях может быть проанализировано с помощью иммуногистохимии. В некоторых вариантах реализации субъект, который является кандидатом для лечения, демонстрирует CD163+ М2 клетки больше чем примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45% или примерно 50% от общего количества одноядерных клеток периферической крови (РВМС) у субъекта. В некоторых аспектах субъект демонстрирует CD163+ М2 клетки больше чем примерно 20% от общего количества РВМС у субъекта.

[0113] Еще в одних других вариантах реализации субъекта, который является кандидатом для лечения, идентифицируют по наличию одного или более цитокинов в сыворотке субъекта. Эти цитокины включают, без ограничения, CXCL5, CXCL6, а также CXCL7, IL6, IL7, IL8, IL10, IL11, IFN-γ и HSP-70.

[0114] Еще в одних других вариантах реализации субъекта, который является кандидатом для лечения, идентифицируют по наличию одного или более факторов роста в сыворотке субъекта. Эти факторы роста включают, без ограничения, FGF-2, G-CSF, GM-CSF и M-CSF.

[0115] В некоторых вариантах реализации субъекта, который является кандидатом для лечения с использованием биодиффузной камеры, идентифицируют путем измерения уровней конкретного набора цитокинов. В некоторых вариантах реализации субъект имеет повышенные уровни этих цитокинов по сравнению со здоровым субъектом. Как используется в настоящем документе, термин «здоровый субъект» относится к субъекту, который не страдает от рака или любого другого заболевания, а также не нуждается в лечении с помощью биодиффузионной камеры.

[0116] В частных вариантах реализации цитокины могут быть добавлены в камеру для усиления противоопухолевого иммунного ответа. Например, цитокины, добавляемые в камеру, могут быть выбраны из группы, состоящей из CCL19, CCL20, CCL21 и CXCL12, а также их комбинаций.

[0117] В некоторых вариантах реализации циркулирующие моноциты CD14+ имеют повышенный уровень CD163 по сравнению со здоровым субъектом. В некоторых аспектах уровни CD163 в циркулирующих моноцитах CD14+ повышены по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 4 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 30 раз, по меньшей мере примерно в 40 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, по меньшей мере примерно в 60 раз, по меньшей мере примерно в 70 раз, по меньшей мере примерно в 80 раз, по меньшей мере примерно в 90 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению со здоровым субъектом. В частных вариантах реализации уровни CD163 на циркулирующих моноцитах CD14+ повышены примерно в 2 раза по сравнению со здоровым субъектом.

[0118] В других вариантах реализации субъект, который является кандидатом для лечения, имеет сыворотку, которая поляризует недифференцированные моноциты в М2-клетки. В некоторых аспектах инкубация сыворотки субъекта с недифференцированными моноцитами вызывает экспрессию одного или более маркеров клеточной поверхности на моноцитах, в том числе, но без ограничения, CD11b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 и/или CD206. В других аспектах инкубация сыворотки субъекта с недифференцированными моноцитами повышает экспрессию одного или более маркеров клеточной поверхности на моноцитах по сравнению с моноцитами, которые не инкубированы с сывороткой субъекта. В некоторых аспектах маркеры клеточной поверхности включают, но без ограничения, CD11b, CD14, CD15, CD23, CD64, CD68, CD163, CD204 и/или CD206. В некоторых аспектах уровни одного или более маркеров поверхности повышены в по меньшей мере примерно 1,3 раза, по меньшей мере примерно 1,5 раза, по меньшей мере примерно 1,8 раза, по меньшей мере примерно 2 раза, по меньшей мере примерно 3 раза, по меньшей мере примерно 4 раза, по меньшей мере примерно 5 раз, по меньшей мере примерно 10 раз, по меньшей мере примерно 20 раз, по меньшей мере примерно 30 раз, по меньшей мере примерно 40 раз, по меньшей мере примерно 50 раз, по меньшей мере примерно 60 раз, по меньшей мере примерно 70 раз, по меньшей мере примерно 80 раз, по меньшей мере примерно 90 раз или по меньшей мере примерно 100 раз по сравнению с недифференцированными моноцитами, которые не инкубированы с сывороткой субъекта. В частных вариантах реализации уровни одного или более маркеров поверхности повышены примерно в 2 раза по сравнению с недифференцированными моноцитами, которые не инкубированы с сывороткой субъекта. Моноциты, поляризованные сывороткой субъекта, могут быть измерены с помощью FACS.

Клетки-мишени

[0119] Без ограничения теорией, считается, что AS ODN снижает М2-клетки субъекта и/или ингибирует поляризацию клеток в М2-клетки путем даунрегуляции экспрессии IGF-1R. В некоторых вариантах реализации экспрессия IGF-1R в М2-клетках даунрегулируется по меньшей мере примерно на 1%, по меньшей мере примерно на 2%, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90% или по меньшей мере примерно на 95% по сравнению с клетками, которые не обработаны антисмыслом. Экспрессия IGF-1R в М2-клетках может быть измерена путем количественной ОТ-ПЦР.

[0120] В некоторых вариантах реализации экспрессия IGF-1R в М2-клетках остается даунрегулирован ной в субъекте в течение по меньшей мере примерно 1 дня, по меньшей мере примерно 2 дней, по меньшей мере примерно 3 дней, по меньшей мере примерно 4 дней, по меньшей мере примерно 5 дней, по меньшей мере примерно 6 дней, по меньшей мере примерно 7 дней, по меньшей мере примерно 8 дней, по меньшей мере примерно 9 дней, по меньшей мере примерно 10 дней, по меньшей мере примерно 11 дней, по меньшей мере примерно 12 дней, по меньшей мере примерно 13 дней, по меньшей мере примерно 14 дней, по меньшей мере примерно 3 недель, по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 5 недель или по меньшей мере примерно 6 недель после получения одной дозы антисмысла.

[0121] В некоторых аспектах даунрегуляция экспрессии IGF-1R в М2-клетках вызывает селективное снижение М2-клеток у субъекта по сравнению с клетками, которые не экспрессируют IGF-1R. В некоторых вариантах реализации клетки М2 в субъекте снижены на по меньшей мере примерно 2%, по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% по сравнению с субъектом, которого не лечат антисмыслом. В других вариантах реализации популяция М2-клеток устраняется. Например, после имплантации биодиффузионной камеры, популяция М2-клеток может составлять примерно 1%, примерно 2%, примерно 5% или примерно 10% от популяции перед имплантацией биодиффузионной камеры. М2-клетки в субъекте могут быть измерены с помощью FACS. В некоторых аспектах после лечения М2-клетки устранены, т.е. не обнаруживаются с помощью FACS. В других аспектах снижение М2-клеток может быть измерено с помощью косвенного анализа; например, сыворотка от субъекта может быть получена перед и после лечения для оценки ее способности поляризации М2-клеток. После лечения способами, раскрытыми в настоящем документе, способность сыворотки поляризовать М2-клетки снижена на примерно от 80% до примерно 100%, от примерно 20% до примерно 60% или от примерно 10% до примерно 50%.

[0122] В некоторых вариантах реализации нацеливание экспрессии IGF-1R в М2-клетках вызывает претерпевание клеточной гибели М2-клетой. В некоторых вариантах реализации клеточной гибелью является некроз. В других вариантах реализации клеточной гибелью является апоптоз. Для целей настоящего раскрытия апоптоз определен как запрограммированная клеточная гибель и включает, но без ограничения, регрессию первичных и метастатических опухолей. Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая является широко распространенным явлением, которое играет решающую роль в огромном количестве физиологических и патологических процессов. В отличие от него, некроз является случайной клеточной гибелью, которая является ответом клетки на широкий ряд вредоносных состояний и токсических веществ. Еще в одних других вариантах реализации нацеливание на экспрессию IGF-1R в М2-клетках вызывает претерпевание ареста клеточного цикла М2-клеткой.

НАБОРЫ

[0123] Приготовление готовой камеры требует множества компонентов и множества этапов. В других аспектах раскрытия предусмотрены наборы, содержащие компоненты для практической реализации способов, раскрытых в настоящем документе. В некоторых аспектах наборы содержат корпус камеры, который может быть выполнен в виде одной части или в виде двух половин. Также могут быть включены элементы для герметизации камеры, в том числе одна или более мембран, клей и растворители (например, спирт или 2-дихлорэтан). Необязательно, мембрана может быть приварена к камере путем звуковой сварки для обеспечения герметичности. Наборы включают антисмысловой ODN. Необязательно, ODN может быть разделен на две части - первую часть, предназначенную для обработки клеток после хирургического удаления из субъекта, и вторую часть, предназначенную для комбинации с клетками, когда введена субъекту. Другие необязательные предметы набора включают среду для культивирования клеток и антибиотики для предотвращения роста бактерий в этой среде.

[0124] Необязательно, камеры в наборе могут быть заранее соединены (например, с помощью нити) друг с другом с использованием проушины или другого устройства, прикрепленного к камере и выполненное с возможностью приема соединительного материала. Преимущественно, за счет предварительного соединения множества камер, желаемое количество камер может быть надежным образом введено и удалено хирургом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Вакцинация аутологичными опухолевыми клетками и IGF-1R AS ODN пациентов с рецидивирующей глиобластомой

Критерии и цель исследования

[0125] Для лечения было отобрано двенадцать субъектов после безуспешного стандартного лечения. Каждый пациент соответствовал следующим критериям: возраст > 18, индекс состояния по шкале Карновского 60 или лучше, а также отсутствие сопутствующих заболеваний, которые могли бы препятствовать плановой хирургической повторной резекции. Субъекты получали лечение путем имплантации десяти биодиффузионных камер, содержащих облученные аутологичные опухолевые клетки и IGF-1R AS ODN, на 24 часа во влагалище прямой мышцы живота с целью стимуляции иммунитета к опухоли. Пациентов подвергали мониторингу на безопасность, клинические и радиографические, а также иммунные ответы. Цели исследования включали оценку безопасности и радиографических ответов, а также поисковые исследовательские цели в отношении иммунной функции и ответа.

Экспериментальный протокол

[0126] Опухолевая ткань была удалена хирургическим путем у пациентов с помощью тканевого аспиратора (NICO Myriad®) и помещена в стерильные уловители ткани. Стерильные уловители ткани были перенесены в отведенное помещение BSL-2, где опухолевая ткань была обработана и помещена в биодиффузионные камеры. Биодиффузионные камеры были облучены перед имплантацией.

[0127] На следующий день после хирургического вмешательства для удаления опухолевой ткани субъектам были имплантированы десять облученных биодиффузионных камер во влагалище прямой мышцы живота. Через 24 часа они были удалены.

[0128] Биодиффузионные камеры содержали аутологичные опухолевые клетки, удаленные при хирургическом вмешательстве. Перед добавлением в биодиффузионные камеры клетки были подвержены предварительной обработке в течение ночи (прибл. 12-18 часов) первым количеством (4 мг/мл) 18-мер IGF-1R AS ODN с последовательностью 5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3' (NOBEL). На основе данных, демонстрирующих, что AS ODN обладает иммуномодуляторными свойствами, в камеры (C-v) было добавлено второе количество (2 мкг) экзогенного антисмысла NOBEL и камеры затем были облучены. Каждому пациенту были имплантированы десять камер. Также была имплантирована одиннадцатая контрольная камера, содержащая PBS (С-р).

Радиографические оценки

[0129] Последовательные оценки с визуализацией были проведены на сканерах Philips 1.5Т и 3Т MRI, а также сканере GE 1.5Т MRI. Обычные анатомические признаки MRI были оценены двумя нейрорадиологами у всех 12 пациентов. Также были использованы физиологические методы MRI взвешенной по динамической восприимчивости (DSC) MR-перфузии и диффузионно-тензорной визуализации (DTI) в 15 направлениях. Постобработка с помощью MR-перфузии и DTI была проведена на рабочей станции Nordic Ice (в. 2.3.14). rCBV был вычислен в привязке к контралатеральному нормальному белому веществу. Из данных DTI был вычислен усредненный коэффициент диффузии (средняя диффузионная способность).

Иммунологические оценки

[0130] За одну неделю до хирургического вмешательства был проведен лейкаферез плазмы для базовой оценки иммунной функции. Кровь была получена после операции в дни 7, 14, 28, 42, 56 и каждые 3 месяца после вакцинации. Сыворотка и клеточные фракции были разделены путем центрифугирования и клетки были обработаны буфером для лизиса эритроцитов. Лейкоциты были подвержены количественной оценке путем проточной цитометрии или сохранены в DMSO при -80°С. Образцы сыворотки также были сохранены при -80°С. Проточная цитометрия была проведена с помощью EasyCyte 8НТ (Millipore) и флуоресцентно-конъюгированного mAb, специфичного к CD4, CD8, CD11b, CD14, CD16, CD20, CD45, CD56, CD80, CD83 и CD 86 (все от BD Biosciences) и CD163 (R&D Systems) человека. Анализ после сбора был проведен с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc, Ashland, OR). Факторы сывороточного цитокина были подвержены количественной оценке с помощью массивов сфер Luminex (панели цитокинов/хемокинов человека I, II и III от Millipore) и мультиплексного анализа HCMBMAG/MILLIPLEX Mag Cancer (emdmillipore.com). Это включало 6 сывороточных маркеров для глиомы, связанной с функцией стволовых клеток, в том числе DKK-1, NSE, остеонектин, периостин, YKL-40 и TWEAK. Уровни нитратов в сыворотке были проанализированы по методу Грисса (Green L.C., и др., 1982, Anal Biochem 126:131-8). Стимуляция Т-клеток была выполнена с помощью форбол 12-миристата, 13-ацетата (РМА) и иономицина, как было описано ранее (Verbrugge, I., и др., 2012, Cancer Res, 72:3163-74).

[0131] Уровни цитокинов/хемокинов в супернатанте (SN) опухолевых клеток и содержимые эксплантированных камер были проанализированы с помощью наборов Luminex, как отмечено выше. Мембраны из соединенных попарно камер с вакциной и контрольных камер были заключены в парафин для стандартного иммуногистопатологического исследования.

[0132] Участки опухолевой ткани были оценены путем иммуногистохимического исследования на GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), IGF-1R, CD163, CD14, VWF (фактор фон Виллебранда), CD4 и CD8 или флуоресцентного иммуногистохимического исследования, адаптируя способ, описанный в Emoto, K., и др., 2005, Histochem Cytochem 53:1311-21). Иммуноположительные клетки были учтены количественно с помощью Aperio или качественно опытным невропатологом (LCK), используя обычную шкалу от 0 (без окрашивания) до 6 (сильное диффузное окрашивание), при интенсивности окрашивания, определяемой как низкая, средняя и сильная, и паттернах окрашивания, описанными как очаговые или диффузные. Патологоанатомическую аутопсию была ограничена исследованием головного мозга, и найденные показатели были сравнены с архивными парафиновыми блоками ранее подверженных или не подверженных лечению глиобластом, диагностированных при аутопсии. Как традиционная поляризация in vitro наивных моноцитов, так и смешанные эксперименты с вовлечением наивных моноцитов, совместно инкубированных с сывороткой, полученной от испытуемых субъектов при отборе, были выполнены так, как описано ранее (Harshyne, LA, и др., 2015, Neuro Oncol 18(2):206-15; Solinas, G., и др., 2010, J Immunol 185:642-52).

Статистический анализ

[0133] Уровень статистической значимости между количественными измерениями в различных образцах был определен с помощью непарного двустороннего t-критерия или t-критерия для связанных пар при р<0,05. Анализ выживаемости был выполнен путем анализа Каплана-Мейера, а значимость была установлена путем логранговых сравнений. Весь статистический анализ, включая смешанный дискриминантный анализ, был выполнен с помощью программного обеспечения JMP в. 11 (SAS, Северная Каролина).

Оценка безопасности и клиническое течение

[0134] Только одно серьезное нежелательное явление (SAE) было связано с протоколом (тромбоз бедренной вены после лейкафереза). Девять пациентов не выдержали прогрессирования опухоли, тогда как три пациента умерли по другим причинам. Было выполнено пять аутопсий.

[0135] Средняя общая выживаемость от первичного диагноза составила 91,4 недели (фиг. 2а), что является положительным по сравнению с другими исследованиями иммунотерапии рецидивирующей глиомы. Две существенно отличающихся группы выживания по протоколу, составляющих 48,2 и 10 недель, были идентифицированы как группы с более длинной и более короткой выживаемостью соответственно (фиг. 2b). За исключением одного резкого отклонения (пациент TJ03), нами была задокументирована существенная корреляция между выживаемостью по протоколу и степенью лимфопении при наборе (фиг. 2 с). Сравнение значений СВС при первичном диагнозе и при наборе по протоколу показало, что среднее число лимфоцитов значительно упало (65%) после стандартной терапии (N=8, р=0,012, парный t-критерий).

Рентгенографические ответы

[0136] Обычные признаки МРТ были оценены и ранжированы двумя нейрорадиологами (K.ST. и A.E.F.). В более длинной группе наблюдался уменьшенный размер усиления и FLAIR-области в месте первичной опухоли вместе с замедленным прогрессированием. Примеры анатомических ответов в обеих группах показаны на фиг. 3а и 3b. Физиологические МРТ измерения дополнили эти анатомические наблюдения. Последовательная DSC MR-перфузия была проведена 7 пациентам, в том числе 3 выжившим на длительный срок (пациенты TJ03, TJ06 и TJ09), у которых было парадоксальное увеличение относительного церебрального объема крови (rCBV) при клиническом улучшении; однако этот эффект был временным, и затем было более стойкое снижение rCBV. Последовательные DTI-данные с 15 направлениями включали двух выживших на длительный срок (пациенты TJ03 и TJ06), которые продемонстрировали значения увеличение измеряемого коэффициента диффузии (ADC) в полушарии, на которое было оказано воздействие, отражая потерю насыщенности опухоли клетками, связанную с регрессией заболевания. Нами была отмечена высокая корреляция между парадоксальным rCBV ответом и увеличением ADC, что не наблюдалось в короткой группе (фиг. 3с и 3d). Соответствующие уровни нитратов в сыворотке в более длинной группе отражали вероятность, что была инициирована воспалительная реакция (данные не показаны).

Исследование эксплантированных камер в сравнении с периоперационной сывороткой по группе выживания

[0137] Эксплантированные камеры были структурно интактными без жизнеспособных клеток. Внешние поверхности мембран из обеих камер С-р и C-v были покрыты клетками CD15+ и CD163+, но при ощутимо повышенных количествах на мембранах C-v (фиг. 4а).

[0138] Для группы всего исследования анализ растворимых содержимых камер выявил существенные повышения количества факторов роста и цитокинов/хемокинов над соответствующими периоперационными сывороточными уровнями, многие из которых надежно задокументированы в микросреде опухолевой глиомы (ТМЕ). Тридцать два из 78 испытанных цитокинов/хемокинов были существенно повышены по сравнению с сывороткой, и анализ связанных пар выявил существенные повышения цитокинов, как отмечено в таблице 3 ниже.

[0139] Эти подъемы были интерпретированы как цитокины/хемокины, продуцированные инкапсулированными опухолевыми клетками, или факторы, продуцированные локальным врожденным иммунным ответом, которые диффундировали в камеры.

[0140] Анализ факторов в камерах между группами выживаемости выявил в камерах существенные подъемы VEGF, PDGF-α, IL-11, CCL5, МСР-3 и MIP-1d в более длинной группе, тогда как количества растворимых маркеров рака были существенно подняты в короткой группе, в том числе NSE, остеонектин и YKL40. Смешанный дискриминантный анализ независимо идентифицировал эти отличия между группами (фиг. 4b).

[0141] Для обеих групп уровни периостина и CCL2 были существенно ниже в камерах (С-v), чем значения в сыворотке или SN, предполагая удаление клеток, продуцирующих эти хемокины в камерах (фиг. 4с).

Цитокины/хемокины сыворотки и РВМС после вакцинации по группе выживаемости

[0142] Уровни оцененных 24 и 78 цитокинов/хемокинов были значительно выше в сыворотке от более длинной группы по сравнению с короткой группой, как показано в таблице 4 ниже.

[0143] Пик сывороточного CCL2 имел место после хирургической операции, однако его не было при повторной операции у двух пациентов. Уровни CCL2 оставались существенно более высокими в течение постоперационного периода в короткой группе. Эти постоперационные пики были высоко коррелированы с пиками TNF-α (фиг. 5 и 6).

[0144] Фактические количества Т-клеток CD4 и CD8, а также количества дендритных клеток (DC), были существенно выше в более длинной группе, а периоперационные количества CD14+16- были существенно ниже по сравнению с короткой группой. Имела место существенная корреляция между CD4 и DC-клетками, а также между CD4 и CXCL12, только в более длинной группе. В день 14 РВМС у субъектов с более длинной выживаемостью проявил существенно более высокое продуцирование цитокина Th-1, в том числе IFNγ, после стимуляции РМА и иономицином, чем в короткой группе (данные не показаны). Согласованные изменения между циркулирующими уровнями Т-клеток, моноцитов и провоспалительных хемокинов/цитокинов после вакцинации наблюдались у трех из четырех субъектов. Наивысшая корреляция была отмечена между уровнями общего количества моноцитов и CD14+16- моноцитов (фиг. 5b и 5d). Обратная взаимосвязь между числами циркулирующих Т-клеток и моноцитов была также отмечена в более длинной группе (фиг. 5) без существенных отличий в короткой группе (фиг. 6). Предсказуемые и обоюдные взаимодействия между иммуносупрессивными и провоспалительными популяциями клеток, а также взаимосвязями моноцитов-хемокинов, предполагали большую иммунную приспособленность в более длинной группе.

Исследование парафинированных частей

[0145] Парафинированные части из хирургических вмешательств через аутопсии были доступны для анализа в четырех случаях, позволяя нам наблюдать за ТМЕ после вакцинации. Мы сравнили аутопсии с исследования с аутопсиями на пациентах с GBM, которым была проведена повторная операция и которые не лечились (фиг. 7). Иммуноокрашивания выявили существенное снижение IGF-IR-положительных клеток после вакцинации в совпадающих парах, что было подкреплено флуоресцентным иммуногистохимическим исследованием (фиг. 7а и 7g). Качественные сравнения с аутопсиями рецидивирующей или не леченной глиомы выявили изобилующие CD163 ТАМ и IGF-1R+ клетки в обеих, снижая любое сомнение в потере клеток в качестве артефакта от аутопсии (фиг. 7g).

[0146] CD163 ТАМ достигли своего пика при рецидивирующей в совпадающих сравнениях как при первичной хирургии, так и при аутопсии (фиг. 7с и 7g). Пациенты TJ06 и TJ10 поддержали эти тенденции с оцениваемыми образцами во всех фазах лечения (фиг. 7b и 7d). В случае TJ06 CD163 клетки упали после второй вакцинации и оставались при аутопсии. Это снижение обратно коррелировало со значениями rCBV и ADC, а также сывороточными уровнями нитрата, все из которых увеличились после каждой вакцины (см. фиг. 7f).

[0147] Исследуя связь с периферическими моноцитами, была отмечена сильная корреляция между периферическими CD163+ моноцитами и CD163 ТАМ (фиг. 7Е) в короткой группе, не наблюдавшаяся в более длинной группе (фиг. 7f).

[0148] Мы не наблюдали появления популяций Т-клеток в ТМЕ после вакцинации в любой из групп.

Коинкубация сыворотки субъекта с недифференцированными моноцитами

[0149] Для исследования происхождения циркулирующих CD163+ моноцитов у пациентов, нами сперва были поляризованы наивные моноциты с каноническими М1 и М2-цитокинами IFN-γ и IL-4 соответственно. Мы наблюдали апрегуляцию IGF-1R только при М2-поляризации (фиг. 8а). М2-поляризованная популяцию CD163+ была выборочно подвержена нокдауну при инкубации с IGF-1R AS ODN (фиг. 8b).

[0150] Затем мы коинкубировали наивные моноциты с сывороткой, полученной от всех испытуемых субъектов, и задокументировали появление CD163+ клеток, которые коэкспрессировали IGF-1R и PDL-1 (фиг. 8 с). При обработке IGF-1R AS ODN клетки, экспрессирующие IGF-1R, PD-L1 и CD163, были подвержены существенному нокдауну параллельным и дозозависимым образом (фиг. 8 с), что резюмировано на фиг. 8d. Обсуждение

[0151] Проверенное исследование вакцинации аутологичными клетками/вакцинации, основанной на камере мультиформной глиобластомы (GBM), не выявило каких-либо существенных проблем в отношении безопасности.

[0152] Мы идентифицировали две существенно разных группы выживаемости с разными ответами на этот подход вакцинации. См. фиг. 5 и 6. Субъекты из более длинной группы, как правило, проявляли повышенные уровни изотипов опухоль-специфического антитела и цитокинов/хемокинов, в целом связанных с иммунитетом Th1, в том числе IgG1, IgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19 и CCL21, после хирургии и вакцинации. Повышенные уровни этих цитокинов/хемокинов не наблюдались в короткой группе. Следовательно, уровни цитокинов/хемокинов, которые в целом связаны с иммунитетом Th1 (например, IgG1, IgG3, IL12, CXCL10, CXCL12, CCL7, CCL19, CCL21), могут быть оценены после хирургии/вакцинации для предсказания выживаемости и для информирования дополнительных стратегий лечения. Интересно, что CCL21 и CXCL12 действуют синергически с адъювантами CpG и усиливают способность к миграции и стимуляции Т-клеток у DC в подходе вакцинации. Также, отмеченные подъемы GM-CSF, IL-6, Flt-3L и SCF в более длинной группе могут усилить пролиферацию DC, а также могли внести вклад в существенное 76% повышение pDC после вакцинации. Существенные подъемы клеток CD4, а также корреляции между клетками CD4, pDC и цитокина CXCL12, также предполагают успешное индуцирование пролиферации Т-клеток, облегченное CXCL12 во время иммунного синапса.

[0153] Пациенты в группе с короткой выживаемостью, как правило, были подвержены более продолжительному курсу лечения перед вакцинацией, приводящему к лимфофении. Следовательно, вакцинация является наиболее эффективной при введении пациентам с нормальными уровнями лимфоцитов, т.е. нелимфофеническим пациентам. Индуцированная лечением лимфофения и более низкое соотношение CD4:CD8 также может быть приписано темозоламиду. (Стандарт лечения включал конформное облучение с сопутствующим темозоламидом с последующим поддержанием темозоламида, инициированным через 6 недель после хирургии.) Последствие более продолжительной общей выживаемости может включать хроническую подверженность воздействию опухолевых антигенов и продолжающимся ингибиторным сигналам глиомы, приводя к истощению Т-клеток. Подобным образом моноциты/макрофаги имели очевидное отсутствие способности к ответу только с умеренными колебаниями после вакцинации, но отчетливую корреляцию между периферическими клетками CD14+16- и ТАМ. ТАМ были связаны с продуцированием CCL2 и эта корреляция могла отражать амплификацию с обратной связью, способствуя росту опухоли. В поддержку этого повышенные уровни сывороточного CCL2 в короткой группе были связаны с профилем экспрессии мезенхимального гена и плохим прогнозом у пациентов с глиомой.

[0154] Эксплантированные камеры обеспечили уникальную оценку инкапсулированной ТМЕ и ее взаимодействия с первичным иммунным ответом. Подъемы цитокинов в камерах более длинной группы совместно указали на то, что вакцинации индуцировали ответ Th1, а сыворотка этой группе содержала изотипы опухоль-специфического антитела, связанные с Th1 иммунитетом. Смешанный дискриминантный анализ установил связи с продуцированием IFN-γ, TNF-α и IL12.

[0155] В отличие от этого, камеры короткой группы имели более существенные подъемы маркеров рака, отражая появление устойчивости, связанной со стволовыми клетками глиомы (GSC), после стандартной терапии. Одним заметным исключением были уровни периостина, которые были намного ниже во всех камерах по сравнению с парными значениями сыворотки. Популяции вызывающих опухоль клеток в глиоме включают ТАМ и GSC, при этом первые поддерживают последние в одной и той же периваскулярной нише (Zhou, W., и др., 2015, Nat Cell Biol 17:170-82) и оба представляют стратегические мишени для лечения. М2-макрофаги, рекрутированные GSC-секретирующим периостином, играют решающую роль в росте опухоли и их удаление может иметь терапевтическое преимущество. Снижение уровней периостина в камерах, содержащих обработанные опухолевые клетки, предполагает, что сами GSC, секретирующие этот фактор, являются мишенью для IGF-1R AS ODN.

[0156] Примечательно, несмотря на ранее имеющуюся иммуносупрессию (вследствие раннего лечения, в соответствии со стандартным лечением), нами были задокументированы радиографические и клинические улучшения, поддержанные провоспалительным ответом после вакцинации у 4 из 12 пациентов. Эти пациенты также имели существенное преимущество выживаемости по протоколу. После дальнейшего исследования этого отличия выживаемости нами был отмечен более высокий уровень иммунной приспособленности в более длинной группе.

[0157] Снижение IGF-1R после вакцинации было связано с протоколом более длительной выживаемости у некоторых субъектов. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, возможно, что популяции клеток IGF-1R+ подвергаются нокдауну как следствие иммунных механизмов типа 1, вызываемых у этих индивидуумов подходом вакцинации.

[0158] Как мы показали in vitro, IGF-1R AS ODN деактивирует клетки CD163⁺, содержащиеся в препарате вакцины, тем самым устраняя их иммуномодулирующие факторы и вызывая иммунитет типа 1. Более того, любой IGF-1R AS ODN, который диффундирует из камеры с вакциной, обладает подобным эффектом на М2-макрофаги, которых он достигает. Это представляет собой новую платформу, нацеленную на клетки, экспрессирующие разнообразие стимулирующих опухоль лигандов и факторов, включая PDL-1, другие иммуномодуляторные факторы, ангиогенные факторы, питательную поддержку и инвазивность опухоли.

[0159] Отличия в радиографических наблюдениях между группами пациентов с более длинной и короткой выживаемостью обеспечивают дополнительную поддержку для концепции того, что подход вакцинации влияет на более широкую ТМЕ глиомы. Более высокие значения rCBV, как правило, связанные с прогрессированием опухоли, и MR-перфузия, имеющая только временные увеличения в более длинной группе, это результат, который ранее не был описан. Измерения ADC дифференцировали прогрессирование опухоли (более низкие значения) от того, что мы интерпретировали в качестве потери клеток (более высокие значения). Поскольку данный подход вакцинации связан с потерей обоих популяций клеток IGF-1R и CD163+ ТАМ, возможно, что подъем значений ADC является отражением этого.

[0160] Резюмируя, нами был установлен профиль безопасности улучшенного комбинированного продукта вакцины против глиомы и задокументированы изменения в иммунных параметрах, связанные с клиническими и радиографическими улучшениями. С перспективой нокдауна конкретных клеточных популяций моноцитов, которые способствуют росту опухоли (например, клеток CD163+, которые коэкспрессируют IGF-1R), этот подход предлагает схему лечения, которая не приводит к ослаблению иммунитета.

Резюме результатов

[0161] Токсичности степени 3, связанные с лечением по протоколу, отсутствовали, а общая медианная выживаемость с первичного диагноза составляла 91,4 недели (фиг. 2а). Были идентифицированы две группы выживаемости по протоколу с медианной выживаемостью 48,2 («длинная») и 10 недель («короткая») (фиг. 2b). Субъекты с более длинной выживаемостью имели отображенные найденные показатели, в том числе временные подъемы церебрального объема крови (rCBV) и устоявшиеся подъемы значений измеряемого коэффициента диффузии (ADC), интерпретированные в качестве временной гиперемии и потери клеток. Терапия вакциной привела к устоявшейся потере вызывающих опухоль популяций клеток CD163+ М2 и IGF-1R+из микросреды опухоли (ТМЕ). Эксперименты in vitro были выполнены для исследования происхождения Т-клеток CD163+ и эти эксперименты подтвердили, что сыворотка субъектов дифференцировала незрелые моноциты в клетки CD163+ с апрегуляцией IGF-1R и PDL-1. Последующая инкубация с IGF-1R AS ODN привела к дозозависимому нокдауну этой М2-популяции, который имеет вовлеченность в иммуногенность инкапсулированной ТМЕ (микросреды опухоли), обработанной IGF-1R AS-ODN в камере с вакциной. Подход вакцинирования хорошо переносился при благоприятной медианной выживаемости.

Пример 2

Вакцинация субъектов, у которых впервые диагностирована глиобластома

[0162] Мы продемонстрировали биологическую эффективность протокола вакцинирования, включающий аутологичную клеточную вакцину, введенную в качестве части составного комбинированного продукта, включающего имплантированные биодиффузионные камеры, пациентам с рецидивирующими злокачественными глиомами, которым не помогло стандартное лечение.

[0163] В примере 2 описаны ответы на введение вакцины пациентам, у которых впервые диагностирована глиома, в том числе имплантацию 20 камер на 24 или 48 часов и 10 камер на 24 или 48 часов. В каждом случае 2 мкг NOBEL было добавлено в камеру перед облучением в каждом случае. По сравнению со стандартным лечением при первом промежуточном анализе имели место существенные улучшения как в выживаемости без прогрессирования, так и в общей выживаемости (фиг. 9). Это было наиболее заметно вследствие результатов групп с более высокой дозой после вакцинации. Сперва мы отметили существенно более высокие пиковые и средние уровни интерферон-гамма после вакцинации у пациентов, которым впервые поставлен диагноз, по сравнению с пациентами, прошедшими лечение при рецидиве. В исследовании, в которое набрали пациентов, у которых впервые диагностирована глиома, мы отметили ударные и существенные повышения IFN-γ при каждом повышении дозы вакцины при измерении совокупных измерений сыворотки. Более высокие уровни интерферон-гамма при более длительной имплантации условно коррелировали со скоростью, с которой антисмысл диффундирует из биодиффузионной камеры.

[0164] Эти данные, резюмированные на фиг. 10, демонстрируют, что аутологичная вакцина в виде камеры индуцирует противоопухолевые ответы у пациентов, у которых впервые диагностирована глиобластома. Нами также отмечено, что повышенные уровни IFNγ могут представлять собой ответы пациентов на опухолевые антигены и, если это так, они могут быть фактором, предсказывающим иммунитет против опухоли и улучшенные исходы. Наконец, более стойкий ответ, полученный у пациентов, у которых впервые диагностирована GBM, по сравнению с пациентами в рецидивами, иллюстрирует влияние иммунной системы субъекта и поддерживает вакцинацию пациентов в качестве терапии первой линии.

Пример 3

Полностью укомплектованные камеры имеют более высокую адъювантность

[0165] Полностью укомплектованная камера включает аутологичные опухолевые клетки и другие клетки, включенные в микросреду опухоли (ТМЕ), обработанные за 6 часов перед имплантацией 4 мг/мл IGF-1R AS ODN. Обработанную ТМЕ затем инкапсулирована с экзогенным добавлением по меньшей мере 2 мкг IGF-1R AS ODN и камера затем облучена 5 Гр гамма-излучения.

[0166] Мы увеличили количество камер, что означает, что доза IGF-1R AS ODN, полученная каждым пациентом, повышена по сравнению с предыдущими исследованиями. Например, увеличенное вдвое количество имплантированных камер привело к увеличению имплантированного антисмысла вдвое и способности диффундирования из камеры, что означает, что доза AS ODN составляла примерно 40 мкг, разделенная между 20 камерами.

[0167] Антисмысловая последовательность, в частности, ее палиндромный CpG-мотив, и непосредственная смесь с клетками глиомы in situ эффективным образом инициировали противоопухолевый иммунитет. Примечательно, что смысловая последовательность с таким же палиндромным CpG-мотивом является неэффективной в подходе вакцинирования. Дополнительно, антисмысловая последовательность должна быть непосредственно смешана с опухолевым инокулятом, чтобы увидеть удовлетворительный ответ. Доза IGF-1R AS ODN, которая будет ингибировать поляризацию М2-моноцитов, по меньшей на мере порядок величины ниже, чем доза, необходимая для даунрегуляции экспрессии IGF-1R.

[0168] На этапе доклинического моделирования на животных мы оценили эффективность различных антигенных препаратов при повторной стимуляции терапевтических IFN-γ-продуцирующих Т-клеток CD4 мышей С57 В6, которые отвергли сингенные клетки глиомы GL261, имплантированные в кору их головного мозга после вакцинации. Т-клетки CD4 были выделены из селезенок этих животных с помощью традиционных подходов и добавлены в полученные из костного мозга дендритные клетки от антиген-наивных мышей, которые были инкубированы с различными препаратами антигена GL261. Антигены, извлеченные из растворимой фракции полностью укомплектованной камеры с вакциной, в том числе аутологичными опухолевыми клетками, экзогенным антисмыслом и облучением, вызвали существенно повышенные количества IFN-γ-продуцирующих Т-клеток CD4, по сравнению с неполными составами.

[0169] Анализ камер, содержащих разные препараты GL261, имплантированных в боковые части животов мышей C57BL/6 на 24 часа, также предоставил свидетельства, что полностью укомплектованная камера является наиболее иммуногенной. Несмотря на то, что каждое из IGF-1R AS ODN и облучения по отдельности вызывает повышения цитокинов над контролем PBS, 16 из 32 цитокинов были существенно повышены по сравнению со всеми остальными переменными, в том числе одного только облучения, при комбинации с IGF-1R AS ODN. Среди них по меньшей мере 11 цитокинов связаны с воспалительным ответом, в том числе IL-1β, IL-6 и TNF-α, которые совместно продуцируются индуцированной облучением провоспалительной сетью цитокинов.

[0170] Провоспалительный ответ на полностью укомплектованные камеры был проверен в нашем втором исследовании на людях фазы 1 для пациентов с рецидивирующей глиобластомой. Мы отметили две явно разные группы выживаемости после вакцинации и установили связи между иммунной приспособленностью, провоспалительным ответом после вакцинации и более длинной группой (неопубликованные наблюдения). В частности, мы отметили повышенное соотношение CD4:CD8 после вакцинации в более длинной группе, которые мы интерпретировали в качестве локальной активации TLR9 DC, направляющей клетки CD4+ к фенотипу Th1, возможно, дополнительно усиленной облучением опухолевых клеток в камере.

Пример 4

Полностью укомплектованная камера у наивных мышей

[0171] У наивных мышей С57 В6 имплантация полностью укомплектованной камеры с вакциной была существенно более эффективной при вызове первичного иммунного ответа по сравнению с частично укомплектованными камерами. Мыши были вакцинированы одной камерой в боковую часть живота на 24 часа. Содержимое камеры варьировалось от отсутствия содержимого (PBS), частично укомплектованных камер (только клетки глиомы GL261, GL261 с AS ODN или GL261 и 5 Гр облучения) и полностью укомплектованных камер (GL261, AS ODN и облучение).

[0172] Как показано на фиг. 11, имело место большее продуцирование провоспалительных цитокинов у мышей, которым была имплантирована полностью укомплектованная камера с вакциной, по сравнению с мышами, которым были имплантированы частично укомплектованные камеры с вакциной (т.е. камеры с вакциной, содержащие опухолевые клетки, но не антисмысловые молекулы).

Пример 5

Дозозависимая активация дендритных клеток в нормальных образцах посредством IGF-1R AS ODN

[0173] РВМС от двух нормальных донорских источников были использованы для оценки дозозависимой активации DC антисмыслом NOBEL, а также последовательность, использованная ранее (DWA, два 18-мер кодона выше от последовательности NOBEL и описанная в Andrews и др. (2001) «Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotidedirected against the insulin-like growth factor type I receptor in malignant astrocytomas.» J Clin Oncol 19:2189-2200).

[0174] РВМС был инкубирован в течение ночи с антисмысловыми последовательностями, вместе со смысловой последовательностью к последовательности антисмысла NOBEL, затем проанализированы проточной цитометрией, гейтируя активированную CD123+, CD68+ популяцию DC. Как показано на фиг. 12, антисмысл NOBEL давал дозозависимую активацию DC, которая существенно отличалась от нестимулированных контролей или смысловой последовательности NOBEL, и являлся более эффективным, чем последовательность DWA. Эти данные иллюстрируют, что даже по сравнению с другим IGF-1 AS последовательность NOBEL является особенно эффективной.

Пример 6

Т-клеточный ответ in vitro из содержимого полностью укомплектованной камеры с использованием Т-клеток, полученных от вакцинированных мышей

[0175] Нами была выдвинута гипотеза, что с учетом небольшого размера пор диффузионной камеры (100 нм), экзосомы, вероятно, были источником опухолевого антигена, диффундирующего через мембрану камеры во время имплантации. Мыши С57 В6, вакцинированные инъекцией в боковую часть живота, которая включала клетки глиомы GL261 и IGF-1R AS ODN, были полностью защищены от последующей провокации интрапаренхиматозной опухоли головного мозга. Мы оценили терапевтическую иммунореактивность вакцинированной опухолевой Т-клетки, полученной от этих мышей, на содержимое полностью укомплектованной камеры с помощью анализов Elispot на IFNγ, используя следующие источники антигена: 1/ Центрифугированные супернатанты из камер, в которые были загружены клетки GL261 и IGF-1R AS ODN, облученные и имплантированные в боковую часть живота мыши на 24 часа; 21 Центрифугированные супернатанты из подобным образом приготовленных камер, инкубированных в изотопической среде PBS в течение ночи при 37°С; 3/ Экзосомы, приготовленные из клеток GL261. Эти препараты антигена были добавлены в дендритные клетки от опухолевого антигена наивных мышей и затем добавлены в Т-клетки CD4, выделенные из селезенок иммунных мышей GL261, или инкубированы в течение ночи перед добавлением к Т-клеткам для обеспечения возможности обработки и презентации антигена. После 24 часов сокультивирования антигена Т-клетки и дендритных клеток было оценено количество IFNγ-продуцирующих Т-клеток CD4 в анализе Elispot. Содержимое камеры было сравнено с экзосомами GL261 в различных разбавлениях. Результаты Elispot показали стойкий ответ IFN-γ только с содержимым камеры, полученным после 24-часовой инкубации PBS, проанализированным с помощью презентации антигена. Ни имплантированные камеры, ни анализы Elispot контроля, в которые были включены дендритные клетки без предварительной инкубации, не показали существенных отличий от экзосом. Эти данные показывают, что антигены, полученные из ТМЕ, не являются экзосомальными по природе, являются наиболее обильно продуцированными в облученных камерах, содержащих опухолевые клетки и IGF-1R AS ODN, что они расходуются во время имплантации, а также что они требуют презентации антигена со стороны DC. Результаты резюмированы на фиг. 13.

Пример 7

Ответ при двухфазной дозе на поляризацию М2-моноцита/макрофага

[0176] Для определения оптимальной дозы NOBEL IGF-1R AS-ODN для ингибирования М2-поляризации in vivo мышам C57BL/6 в боковую часть живота было инъецировано 10⁶ клеток GL261. Через 20 дней мышам была дана одна доза NOBEL IGF-1R AS-ODN в размере 0,75 или 0,075 мг интраперитонеально. Затем мыши наблюдались на развитие опухоли.

[0177] Титрование дозы антисмысла NOBEL на выработку М2 in vivo дало парадоксальный двухфазный ответ. Несмотря на то, что дозы на каждом экстремуме титрования для поиска дозы привели к нокдауну М2-моноцита, промежуточные дозы фактически стимулировали выработку М2-моноцита. В US 2017/0056430 было показано, что одна доза в размере 4 мг является высокоэффективной в подобных экспериментах. В настоящем эксперименте одна доза в размере 0,075 мг была высокоэффективной, тогда как промежуточная доза в размере 0,75 мг неожиданно была менее эффективной. (Фиг. 17). Не ограничиваясь, опираясь или привязываясь к какой-либо конкретной теории или механизму действия, мы выдвинули гипотезу, что двухфазный эффект может быть следствием иммуностимуляторных свойств последовательности NOBEL.

[0178] Эффективная доза для ингибирования поляризации моноцита посредством AS ODN является значительно более низкой, чем доза, необходимая для даунрегуляции трансляции IGF-1R в соответствии с правилами спаривания оснований по Уотсону-Крику. Примечательно, что дозы in vitro, эквивалентные дозе в размере 0,075 мг на мышь, не обладают эффектом в отношении клеток, которые уже экспрессируют IGF-1R. Эксперименты с титрованием in vitro на моноцитах человека выявляют существенное отличие в способности лечения IGF-1R AS-ODN к предотвращению поляризации по сравнению с воздействием фенотипа или функции поляризованных М2-моноцитов.

[0179] Как показано на фиг. 14, наиболее низкая доза достигает такой же эффективности, как и наивысшая доза, предполагая комплексную динамику между антисмыслом NOBEL и выработкой М2. Исходя из монофазного ответа на активацию DC, идеальной дозой для камеры была бы точка максимальной активации DC.

Пример 8

Кривая ответ-доза для ингибирования поляризации моноцита с помощью NOBEL

[0180] Мы провели титрование антисмысла NOBEL до уровней в совокупном диапазоне концентраций, который пригодным образом диффундировал бы локально из имплантированных камер.

[0181] Как показано на фиг. 15, аллогенные наивные моноциты из трех нормальных сборов РВМС были инкубированы в течение ночи с шестью разными сыворотками, полученными от пациентов с глиобластомой, в присутствии или отсутствии разных концентраций AS-ODN, специфического к IGF-1R (NOBEL). Каждая цветная точка представляет сыворотку от отдельного пациента с глиобластомой. Экспрессия маркеров, включающих CD163, была оценена путем проточной цитометрии. Уровни экспрессии CD163 представлены в виде среднего индекса флуоресценции клеток, окрашенных флуоресцентными конъюгированными CD163 антителами.

[0182] Сыворотка каждого пациента вызывала дифференциацию М0-моноцитов в фенотип CD163 М2 с апрегуляцией IGF-1R и PDL-1. МО-клетки, культивированные без сыворотки пациента (ctrl), сохраняли очень низкие уровни CD163, тогда как инкубация в течение ночи в сыворотке существенно индуцировала экспрессию этого М2-маркера (без обработки). Добавление AS-ODN, специфического к IGF-1R, в культуральную среду ингибировало поляризацию М0-М2, как указано повышенной экспрессией CD163 дозозависимым образом. Мы отметили понижающуюся тенденцию, начиная с 100 пг и достигающую существенного уровня ингибирования при 1 мкг. Эти данные подтверждают, что избыточный антисмысл, диффундирующий из камеры, может способствовать инициированию Th1-ответа на начальных стадиях врожденного иммунитета.

Пример 9

Предотвращение появления противовоспалительных М2-моноцитов у мышей, которым имплантировали клетки глиомы CL261

[0183] У мышей C57BL/6, которым имплантировали клетки глиомы GL261, развивались опухоли параллельно с повышенными количествами циркулирующих CD163, экспрессирующих М2-моноциты. Мы выдвинули гипотезу, что клетки глиомы продуцируют факторы, которые вызывают рекрутирование моноцитов и поляризацию в М2. Эти клетки затем инфильтруют опухолевые ткани, где их продукты способствуют прогрессированию опухоли. Системное лечение с помощью IGF-1R AS-ODN может предотвратить появление М2-клеток и тем самым препятствовать образованию опухоли.

[0184] Мышам C57BL/6 в боковую часть живота были имплантированы 10⁶ клеток GL261 и дана одна доза в размере 4 мг NOBEL IGF-1R AS-ODN интраперитонеально или внутривенно через 20 дней. Через 14 дней периферийную кровь была получена от животных и циркулирующие моноциты оценены путем проточной цитометрии на экспрессию CD163. На фиг. 18 показана гистограмма количеств клеток, экспрессирующих CD163 (правый пик), где линия, обозначенная «носителем», представляет мышей с имплантатом, которых лечили PBS носителем, а линия, обозначенная «AS-ODN», представляет мышей с имплантатом, которых лечили AS-ODN. Данные показывают, что клетки CD163+ существенно снижаются. Появление клеток, экспрессирующих CD204 или CD206, подобным образом было подавлено (данные не показаны). Периферическая кровь от нормальных мышей без имплантата не содержала клетки с высокими уровнями CD163, CD204 или CD206 (данные не показаны).

Пример 10

Системное лечение с помощью IGF-1R AS-ODN мышей, которым в боковую часть живота имплантированы клетки глиомы, предотвращает развитие опухолей.

[0185] Мышам C57BL/6 в боковую часть живота было имплантировано 10⁶ клеток GL261 и дана одна доза в размере 4 мг NOBEL IGF-1R AS-ODN интраперитонеально или внутривенно через 20 дней перед появлением циркулирующих CD163-положительных моноцитов. Другой группе мышей C57BL/6 был введен PBS в качестве контроля. У обеих групп мышей затем отслеживали развитие опухоли. Как показано на фиг. 19, частота опухолей между группами с лечением и без лечения существенно отличалась (*=р<0,05), при этом мыши, получавшие лечение NOBEL, с гораздо большей вероятностью оставались без опухоли.

Пример 11

Системное ингибирование IGF-1R AS-ODN роста глиомной опухоли в боковой части живота не зависит от иммунитета против опухоли.

[0186] Tbet представляет собой связанный с Т-клеткой фактор транскрипции, a Tbet-дефицитные мыши не имеют способности к установлению иммунитета против глиомы. Для исследования, является ли ингибирование IGF-1R AS-ODN роста глиомной опухоли в боковой части живота независимым от иммунитета против опухоли, Tbet-дефицитным мышам на фоне C57BL/6 были имплантированы в боковую часть живота 10⁶ клеток GL261 и дана одна доза в размере 4 мг NOBEL IGF-1R AS-ODN интраперитонеально или внутривенно через 20 дней. Затем у мышей отслеживали развитие опухоли.

[0187] Как показано на фиг. 20, частота опухолей между мышами, которых лечили посредством PBS, и мышами, которых лечили посредством NOBEL IGF-1R AS-ODN, существенно отличалась (*=р<0,05), несмотря на неспособность Tbet-дефицитных мышей устанавливать терапевтический иммунитет против глиомы.

Пример 12

Нацеливание на нестин+ стволовые клетки в камере с NOBEL

[0188] Мы показали, что стволовые клетки нестин+ могут быть подвергнуты нокдауну дозозависимым образом посредством антисмысла NOBEL in vitro, а также, что эти клетки удалены из ТМЕ после вакцины на основе аутологичных клеток (исследование 14379-101, неопубликованные наблюдения). Поскольку стволовые клетки являются частью опухолевой микросреды (ТМЕ) глиомы, их селективный нокдаун имеет явную терапевтическую выгоду. Имея морфологию, которая поддерживает эмбриональную радиальную глиальную клетку, эти клетки по своей структуре и длительным процессам могут служить в качестве каркасных, обеспечивая возможность распространения клеток глиомы по головному мозгу. Их удаление вместе с ТАМ CD163 может обратить инвазивную природу этих опухолей, а также рост самой опухоли. Будучи нацеливаемыми клетками в камере, антигены из этих клеток могут быть очень иммуногенными и специфическими к опухоли, поскольку они могут быть эмбриональными по происхождению. Нестин сначала экспрессируется в нейтральных предшественниках/стволовых клетках и расположен в цитоплазме в качестве промежуточного филамента типа IV. Он также был идентифицирован в качестве поверхностного белка и биомаркера для стволовых клеток глиомы. Поэтому представлялся бы возможным выбор по сферам и обогащение этой популяции, тем самым увеличивая провоспалительный титр камеры. См. Jin и др., «Cell surface Nestin is а biomarker for glioma stem cells,» Biochem Biophys Res Commun. 19 апр. 2013; 433(4):496-501

Пример 13

Влияние облучения на состав камеры

[0189] Во время приготовления полностью укомплектованной камеры аутологичные опухолевые клетки (т.е. недавно резецированная опухолевая ткань) высевают в свободной от сыворотки культуре, необязательно обработанной первым количеством IGF-1R AS ODN, а позже обрабатывают облучением ex vivo (фиг. 1f и 1g). Второе количество IGF-1R AS ODN добавляют в камеру перед облучением.

[0190] Поскольку аутологичная вакцинация включает облучение комбинированного продукта перед имплантацией в месте, удаленном от опухоли, а наши данные подтверждают иммунный ответ с регрессией опухоли, эти данные подтверждают новый абскопальный эффект. Как правило, абскопальные эффекты связаны с активацией иммунитета против опухоли после облучения in situ опухоли-мишени, что приводит к регрессии опухоли в местах, удаленных от облучения. В данном конкретном составе было показано, что добавление экзогенного антисмысла с CpG-мотивом в камеру и последующая обработка гамма-излучением апрегулируют гены, вовлеченные в активацию, пролиферацию и выживание Т-клеток памяти. Такой состав также предотвращает активацию генов, вовлеченных в выработку регуляторных Т-клеток и вызов иммунной толерантности. Кроме того, даунрегуляция IGF-1R радиосенсибилизирует клетки, которые сверхэкспрессируют этот поверхностный рецептор. Коинкубация с IGF-1R AS ODN также способствует апоптозу опухолевых клеток-мишеней (только in vivo) и связанных с опухолью М2-макрофагов. Облучение 5 Гр приводит к гибели всех инкапсулированных клеток и вызывает высвобождение эндогенных опасных сигналов, известных как связанные с опасностью/повреждением молекулярные паттерны (или DAMPS), которые усиливают презентацию опухолевых антигенов, высвобождаемых из умирающих опухолевых клеток.

Пример 14

Эксплантированная камера в качестве средства для идентификации провоспалительных агентов для будущих составов камеры

[0191] Эксплантированная биодиффузионная камера, извлеченная после ее применения в качестве устройства для медленно высвобождающегося антигена, также служит в качестве репозитория, документирующего первичный иммунный ответ, подтвержденный на доклинической мышиной модели и в исследовании на человеке. Характеристика содержимого камеры с соответствующей контрольной камерой PBS (пустой) обеспечивает понимание как иммунного ответа хозяина (прямой диффузии цитокинов/хемокинов выше пустого контроля), так и продуцирования цитокинов/хемокинов/DAMPS клетками внутри камеры (не регистрируемы в пустой камере). Постоянное присутствие ряда цитокинов информирует экзогенные добавления этих цитокинов в будущие составы. В качестве примеров, CCL21 и CXCL повышены в камерах с вакциной по сравнению с камерами с PBS, действуют синергически с адъювантами CpG и усиливают способность к миграции и стимуляции Т-клеток у DC в подходе вакцинации. См. фиг. 16 и 17. Экзогенное добавление этих цитокинов в состав камеры может усилить первичный Th1-ответ.

Пример 15

Оптимальное отношение клеток к IGF-1R AS ODN в камере приводит к более высоким значениям цитокинов

[0192] Пациенты были вакцинированы 20 камерами, каждая из которых содержала облученные опухолевые клетки и AS NOBEL ODN (2 мкг) на 48 часов. В каждом случае пациенты также получили обязательную стандартную терапию (SOC) в больнице Университета Томаса Джефферсона (TJUH). За пациентами следили для определения выживаемости без прогрессирования (P-FS) (т.е. тех пациентов, которые были живы и не демонстрировали развитие рака или ремиссию) и общей выживаемости (OS) в некоторые моменты времени. На фиг. 21А-с изображены ответы в некоторые моменты времени. На фиг. 24-27 изображены исходы пациентов и сравнение этих пациентов, получавших лечение («вакцинированных»), с прошлым стандартным лечением («SOC»). Для определения оптимального отношения клеток к IGF-1R AS ODN в камерах мы измерили уровни провоспалительных цитокинов в сыворотке пациента после вакцинации и сравнили эти уровни цитокинов с количеством клеток в опухолевой ткани, удаленной у каждого пациента.

[0193] Изначально, как показано на фиг. 21а-с, в сыворотке пациента наблюдалось существенное дозозависимое повышение провоспалительных цитокинов. Общие уровни IFN-γ были достаточно существенно повышены для группы с наибольшей дозой. Уровни IL12 и TNFa были также повышенными в этой группе.

[0194] Каждое из значений трех цитокинов от дней 14-42 для каждого пациента было накоплено и нанесено на график в зависимости от средних значений IFNγ, IL12 и TNFα. Два графика многочленов с одинаковой степенью аппроксимируют 4 и 5 показали пиковые значения провоспалительного цитокина (фиг. 21d-f).

[0195] На фиг. 24а и 24b показаны кривые Каплана-Мейера, изображающие выживаемость без прогрессирования и общую выживаемость при намерении лечить группу как целое. В числе вакцинированных пациентов более примерно 35% остались живы и не имели прогрессирования в течение 20 месяцев. В отличие от этого, менее 10% пациентов, получивших лечение SoC, продемонстрировали выживаемость без прогрессирования в течение 20 месяцев. Общая выживаемость была также сильно улучшена при примерно 40% выживших пациентов по истечении 25 месяцев, тогда как SoC-лечение демонстрирует выживаемость примерно 5% в этот момент времени. Фиг. 24b.

[0196] На фиг. 25а и 25b показаны данные выживаемости для пациентов с медианным возрастом 61,5 лет и сопоставлены таким, что количество пациентов женского/мужского пола составляет 12/18 в обеих группах. Снова, данные иллюстрируют существенно улучшенную выживаемость в разные моменты времени.

[0197] Во время исследования некоторые пациенты выбыли из протокола, а другие умерли по несвязанными причинам. На фиг. 26а и 26b показаны данные выживаемости при отсутствующих данных от пациентов из числа этих выбывших пациентов или где смерти были обусловлены другими причинами. Снова, показатели вакцинированных пациентов значительно лучше. Некоторые пациенты не могли завершить стандартное лечение. Данные за исключением этих пациентов показаны на фиг. 27а и 27b. Эти данные подтверждают, что подход вакцинации является эффективным без следования протоколу стандартного лечения.

[0198] На фиг. 28а и 28b изображен эффект дозирования количества клеток на ответ пациента. Уровни IFN-γ соответствуют ответу субъекта. Более высокие уровни IFN-γ связаны с улучшенным иммунным ответом пациента и, следовательно, противоопухолевым ответом. Здесь мы оптимизировали этот ответ путем определения корректного титрования клеток. Пиковый ответ составляет примерно отметке 20, т.е. 20 миллионов клеток, распределенных по 20 камерам. Таким образом, пиковый ответ составляет примерно 1 миллион клеток/камера, тогда как превосходный ответ получен при примерно от 15 до 25 миллионов клеток, каждый из которых распределен и имплантирован в 20 камер; т.е. в диапазоне от 750000 клеток до 1250000 клеток на камеру. Эти данные демонстрируют эффективность протокола оптимизированной вакцинации.

Пример 16

Усиленный противоопухолевый ответ, опосредованный вакцинацией популяцией клеток, обогащенных для экспрессии нестина

[0199] Продуцирование антигенов клетками глиомы, обработанными IGF-1R, в камерах были исследованы ex vivo с помощью иммунных к глиоме Т-клеток, выделенных от мышей C57BL/6, иммунизированных с помощью подхода с камерой и спровоцированных интракраниально конгенными клетками GL261 для обнаружения наличия антигена. Мыши, которые должны служить в качестве доноров иммунных Т-клеток, были иммунизированы следующим образом: Полностью укомплектованные камеры, заполненные клетками GL261 и антисмыслом, были имплантированы на 24 часа в боковую часть живота. Камеры только с клетками и без антисмысла также были имплантированы в качестве контролей для антисмысловой активности. У мышей была взята кровь в ходе эксперимента и сыворотка была испытана на реактивность антитела к клеткам GL261 (фигуры 30с, 30d). Через 35 дней после имплантации камеры мыши были интракраниально спровоцированы клетками GL261 стереотаксическим способом. Выживаемость и клинические признаки заболевания для отдельных групп мышей отслеживались в течение по меньшей мере 40 дней после провокации. Выживаемость и показатель клинического заболевания показаны на фигурах 30а и 30b, соответственно.

[0200] Т-клетки CD4+ были выделены из селезенок иммунизированных мышей с помощью магнитных сфер. Наивные дендритные клетки (DC), которые были использованы для презентации антигенов иммунным Т-клеткам CD4, были выделены из костного мозга аутологичных, неимунных мышей C57BL/6. DC активировались в течение ночи культурой с антигенами GL261, полученными из клеток GL261, культивированных в камерах в течение ночи в различных условиях, тем самым отображая то, что происходит в отношении продуцирования антигена, когда подобные камеры имплантированы субъекту. Камеры содержали только клетки GL261 или GL261 с 3 разными дозами антисмысла в натрий-фосфатном буфере (PBS). Антисмысл в разных дозах был добавлен в препараты антигена из клеток GL261, культивированных без антисмысла, для определения, ответственно ли содержание антисмысла или эффект антисмысла в камерах за оптимальное продуцирование антигена. Продуцирование IFNγ, которое считалось ключевой мерой иммунитета клетки против опухоли, было использовано для оценки стимулирующих эффектов различных препаратов антигена на активацию Т-клеток при конкретном количестве отвечающих клеток, количество которых подсчитано анализом ELISPOT, как изображено на фиг. 29а.

[0201] Для стимуляции выработки антигена мы следовали клиническому подходу с камерой in-vivo. Приблизительно 1 миллион ex-vivo опухолевых клеток GL261 было инъецировано в камеры отдельно или с обозначенными концентрациями антисмысла и инкубировано в течение ночи в камере, которая была помещена в PBS. На следующий день содержимое камеры было извлечено и использовано для активации наивных дендритных клеток. Содержимое камеры, которое не было обработано антисмыслом в течение ночи, было добавлено к дендритным клеткам с обозначенными количествами NOBEL. Дендритные клетки также были оставленными наивными для контроля. После активации антигеном в течение ночи дендритные клетки были собраны и инкубированы в течение ночи с Т-клетками от иммунизированных животных на планшете для клеточных культур, покрытом антителом ELIPSPOT для обнаружения цитокина IFNγ. После инкубации в течение ночи покрытый планшет был обработан и исследован для подсчета количества IFNγ-продуцирующих Т-клеток, которые ответили на каждый соответствующий антиген.

[0202] Как показано на фигуре 29b, опухолевые антигены были обнаружены в материалах, извлеченных из камер, содержащих клетки GL261 плюс антисмысл, но не в материалах из камер, культивированных с одними только клетками, даже если антисмысл был добавлен в материал, когда DC были активированы. Это демонстрирует, что присутствие антисмысла в камерах с клетками глиомы требуется для продуцирования иммунностимулирующего опухолевого антигена.

[0203] Для исследования влияния обработки в течение ночи антисмыслом мы также инкубировали клетки в течение ночи с 4 мг антисмысла перед добавлением клеток в камеры. Клетки GL261 были помещены в чаши Петри и обработаны в течение ночи 4 мг NOBEL на 1 миллион клеток или оставлены без обработки. Клетки затем были собраны и помещены в камеры в количестве 1 миллион клеток и 2 мкг NOBEL на камеру. Камеры затем были инкубированы в течение ночи в PBS и содержимое было извлечено на следующий день. Дендритные клетки затем были активированы содержимым камеры и была измерена секреция IFNγ, как описано выше.

[0204] Как показано на фигуре 29с, обработка клеток GL261 в течение ночи посредством антисмысла увеличивает количество антигена, продуцируемого этими клетками, что обнаруживается увеличением количеств иммунных к опухоли Т-клеток, продуцирующих IFNγ, когда DC были активированы клетками GL261, обработанными 4 мг антисмысла в течение ночи.

[0205] Для определения, связан ли поднабор опухолевых клеток глиомы, который экспрессирует нестин, с усиленной иммуногенностью, мыши были иммунизированы камерами с или без антисмысла IMV-001 (NOBEL), содержащего клетки GL261, выращенные в условиях, которые привели к более высоким уровням белка нестина по сравнению с пониженными. Была оценена длительная защита от последующей интракраниальной имплантации клеток глиомы GL261 (фигура 30а, 30b), а также продуцирование антитела GL261 (фигура 30с, 30d), мышами.

[0206] Камеры, содержащие клетки GL261 с высокими уровнями нестина и антисмысла, вызвали значительно лучшую иммунную защиту, чем камеры с подобными клетками без антисмысла или камеры с GL261 с низким содержанием нестина, вне зависимости, был ли включен антисмысл или нет. Помещенные в камеру клетки GL261, экспрессирующие высокие уровни нестина, также были превосходными в вызове продуцирования GL261-специфического антитела у мышей, чем те, которые содержали низкие уровни нестина. Однако в отношении продуцирования антитела, включение антисмысла оказывало минимальное воздействие.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0207] Полное содержание всех патентов и публикаций, на которые в данном документе сделана ссылка, включено в настоящий документ посредством ссылки.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ вакцинации субъекта с раком головного мозга, включающий: (i) получение жизнеспособной опухолевой ткани от субъекта, где опухолевую ткань хирургически удаляют из субъекта; (ii) сбор опухолевой ткани в стерильном уловителе; (iii) сбор адгезивных клеток из опухолевой ткани; (iv) инкапсуляцию собранных клеток в биодиффузионную камеру вместе с антисмысловым олигодезоксинуклеотидом рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R AS ODN), имеющим последовательность SEQ ID NO:1; (v) облучение камеры, и (vi) имплантацию камеры субъекту, при этом получают иммунный ответ против рака головного мозга, при этом субъект вакцинируют от 1 до 50 камерами на от 24 до 96 часов. Также представлена соответствующая биодиффузионная камера. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения рака.2 н. и 20 з.п. ф-лы, 98 ил., 4 табл., 16 пр.

1. Способ вакцинации субъекта с раком головного мозга, включающий:

(i) получение жизнеспособной опухолевой ткани от субъекта, где опухолевую ткань хирургически удаляют из субъекта;

(ii) сбор опухолевой ткани в стерильном уловителе;

(iii) сбор адгезивных клеток из опухолевой ткани;

(iv) инкапсуляцию собранных клеток в биодиффузионную камеру вместе с антисмысловым олигодезоксинуклеотидом рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R AS ODN), имеющим последовательность SEQ ID NO:1;

(v) облучение камеры; и

(vi) имплантацию камеры субъекту, при этом получают иммунный ответ против рака головного мозга,

при этом субъект вакцинируют от 1 до 50 камерами на от 24 до 96 часов.

2. Способ по п. 1, включающий этап обработки адгезивных клеток посредством IGF-1R AS ODN в течение до 18 часов перед инкапсуляцией.

3. Способ по п. 1, в котором субъекта вакцинируют 20 камерами примерно на 48 часов.

4. Способ по п. 1, в котором камера содержит от примерно 1 × 10⁴ до примерно 5 × 10⁶ опухолевых клеток.

5. Способ по п. 4, в котором камера содержит от примерно 1 × 10⁵ до примерно 1,5 × 10⁶ опухолевых клеток.

6. Способ по п. 5, в котором камера содержит примерно 10⁶ опухолевых клеток.

7. Способ по п. 1, в котором камера содержит от примерно 1 мкг до примерно 5 мкг IGF-1R AS ODN.

8. Способ п. 6, в котором камера содержит примерно 4 мкг IGF-1R AS ODN.

9. Способ по п. 1, в котором опухолевые клетки не подвергают воздействию температур выше температуры тела.

10. Способ по п. 1, в котором рак головного мозга выбран из астроцитомы стадии II, астроцитомы стадии AIII, астроцитомы стадии AIII-G и астроцитомы стадии IV (мультиформной глиобластомы).

11. Биодиффузионная камера для имплантации субъекту с раком головного мозга, содержащая:

(a) облученные опухолевые клетки, при этом опухолевые клетки содержат адгезивные клетки, полученные из опухолевой ткани субъекта, при этом опухолевая ткань хирургически удалена из субъекта; и

(b) облученный IGF-1R AS ODN, причем IGF-1R AS ODN имеет последовательность SEQ ID NO:1.

12. Биодиффузионная камера по п. 11, в которой опухолевые клетки предварительно инкубированы с антисмысловым олигодезоксинуклеотидом рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R AS ODN) перед инкапсуляцией внутрь камеры.

13. Биодиффузионная камера по п. 11, при этом камера содержит от примерно 1 мкг до примерно 5 мкг IGF-1R AS ODN.

14. Биодиффузионная камера по п. 13, при этом камера содержит примерно 4 мкг IGF-1R AS ODN.

15. Биодиффузионная камера по п. 11, при этом опухолевые клетки в камере обогащены нестин-положительными клетками по сравнению с опухолевой тканью, полученной от субъекта.

16. Биодиффузионная камера по п. 11, в которой опухолевые клетки содержат адгезивные клетки, полученные из опухолевой ткани субъекта с использованием тканевого морцеллятора, и где тканевый морцеллятор содержит высокоскоростную возвратно-поступательную внутреннюю канюлю внутри неподвижной внешней канюли.

17. Биодиффузионная камера по п. 11, в которой опухолевые клетки содержат адгезивные клетки, полученные из опухолевой ткани субъекта с использованием тканевого морцеллятора, и где тканевый морцеллятор не вырабатывает тепло, направленное на ткань, при получении ткани от субъекта.

18. Биодиффузионная камера по п. 11, при этом камера содержит от примерно 1 × 10⁴ до примерно 5 × 10⁶ опухолевых клеток.

19. Биодиффузионная камера по п. 18, при этом камера содержит от примерно 1 × 10⁵ до примерно 1,5 × 10⁶ опухолевых клеток.

20. Биодиффузионная камера по п. 19, при этом камера содержит примерно 10⁶ опухолевых клеток.

21. Биодиффузионная камера по п. 11, при этом отношение опухолевых клеток к AS ODN в камере составляет примерно 5,0 × 10⁵ клеток : 1 мкг.

22. Биодиффузионная камера по п. 16, в которой внешняя канюля содержит боковое отверстие, при этом опухолевые клетки затягиваются в боковое отверстие электронно управляемым изменяемым всасыванием.