Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор Российский патент 2022 года по МПК A01H4/00 

Описание патента на изобретение RU2769815C1

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для снижения трудозатрат и себестоимости при производстве удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (B. oleracea L.) в культуре изолированных микроспор.

Известные способы получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор у капусты белокочанной (Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z, Romanian Biotechnological Letters, 2013, 18, pp. 8677-8684, DOI - нет). Использование питательной среды на этапе выделения, очистки и индукции эмбриогенеза делает технологию более дорогой.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому решению является технология производства эмбриоидов Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z. Выделение микроспор из пыльников проводят в охлажденной до 4°С питательной среде В5 (Gamborg et al., 1968) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры очищают фильтрованием через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратным центрифугированием суспензии микроспор при 4°С, 1000 оборотов/мин. в течение трех минут, заменяя питательную среду на свежую после каждого цикла. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендируют в 2 мл охлажденной до 4°С среды NLN-13 (Lichter, 1982) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. Плотность микроспор определяют в камере Фукса-Розенталя и средой NLN-13 с добавлением 130 г/л сахарозы и рН 5,8 доводят плотность микроспор в суспензии до 4×104 микроспор/мл. Суспензию микроспор разливают в чашки Петри диаметром 60 мм по 3 мл. Чашки Петри с суспензией микроспор инкубируют в темноте в течение 72 ч. при 32±0,1°С, или 24 ч. при 32±0,1°С, затем температуру снижают до 25±1°С и продолжают инкубировать в темноте до появления эмбриоидов.

Использование питательной среды NLN-13 для выделения и очистки микроспор делает технологию производства удвоенных гаплоидов более трудоемкой и дорогостоящей, так как используется холодная фильтр-стерилизация питательной среды. Выделение и очистка микроспор с использованием питательной среды В5 с добавлением маннитола менее трудоемко и менее затратно, чем использование среды NLN-13, так как для ее стерилизации используется автоклавирование и не требуется использование дорогостоящих одноразовых стерильных фильтров и шприцов. В среднем выделение и очистка микроспор одного образца с использованием питательной среды В5 (Gamborg et al., 1968) обходится в 33-35 рублей, с использованием питательной среды NLN-13 - 37-40 руб., с использованием 13%-ного раствора сахарозы - 13-15 руб., таким образом снижение себестоимости выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза может составить 60-65%.

Технический результат предлагаемого изобретения - снижение трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты при снижении себестоимости процесса с сохранением частоты эмбриогенеза микроспор на уровне стандартного протокола.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной выделение и очистку микроспор осуществляют в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, индукцию эмбриогенеза осуществляют в условиях инициирующего стресса в темноте при температуре 32,5±0,1°С, инкубируя микроспоры в течение 48 часов в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, после воздействия инициирующего стресса питательную среду заменяют на питательную среду NLN-13, рН 5,8, затем определяют плотность микроспор, доводят ее до 4×104 микроспор/мл и инкубируют в темноте до образования эмбриоидов при 25±1°С в климатической комнате.

В предложенном способе выделение, очистка микроспор и индукция эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной проводится в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, что снижает себестоимость данных этапов технологии на 70-75% и не оказывает негативного влияния на частоту эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной.

Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются выделение и очистка микроспор с использованием 13% раствора сахарозы, индукция эмбриогенеза в 13% растворе сахарозы в условиях стандартного инициирующего стресса в течение 48 часов при 32,5±0,5°С.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1

Микроспоры 7 генотипов капусты белокочанной выделяли в охлажденном до 4°С 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры фильтровали через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратно центрифугировали суспензию микроспор при 4°С, 800 об/мин в течение четырех минут, заменяя раствор сахарозы на свежий после каждого цикла центрифугирования. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендировали в пробирках объемом 15 мл в 10 мл 13% раствора сахарозы (рН 5,8) после чего инкубировали микроспоры в 13%) растворе сахарозы в темноте при температуре 32,5±0,5°С в течение 48 часов. После этого микроспоры в пробирках осаждали центрифугированием в течение 4 минут при 800 оборотов/мин., сливали надосадочную жидкость и добавляли 2 мл свежей питательной среды NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы (рН 5,8), в которой ресуспендировали микроспоры. С помощью камеры Фукса-Розенталя определяли плотность микроспор в суспензии и доводили плотность до 4×104 микроспор/мл, питательной средой NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы, рН 5,8. Далее суспензию микроспор разливали по чашкам Петри диаметром 60 мм по 3 мл в каждую, и инкубировали микроспоры в климатической комнате в темноте при 25±1°С до образования эмбриоидов.

Описанным выше способом были произведены эмбриоиды у следующих генотипов/образцов капусты белокочанной № 1 с, № 2 с, № 3 с, № 4 с и № 5 с.

В таблице 1 представлена частота эмбриогенеза микроспор (число эмбриоидов в 1 мл питательной среды) образцов капусты белокочанной (B. oleracea L.): 1) при использовании питательной среды В5 (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза микроспор в питательной среде NLN-13 (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час (контроль); 2) при использовании 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час.

По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет снизить затраты этапов выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза микроспор на 63% за счет замены дорогостоящих питательных сред 13%-ном раствором сахарозы.

Похожие патенты RU2769815C1

название год авторы номер документа
Способ получения растений-регенерантов Brassica oleracea L. in vitro 2021
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
RU2759735C1
Способ получения удвоенных гаплоидов моркови в культуре изолированных микроспор in vitro 2020
  • Воронина Анастасия Викторовна
  • Монахос Сократ Григорьевич
RU2750959C1
Способ получения растений-регенерантов рода Brassica in vitro 2020
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
RU2741647C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИЗ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ BRASSICA OLERACEA L. IN VITRO 2015
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Калашникова Елена Анатольевна
  • Соловьев Александр Александрович
RU2607007C1
Способ удвоения хромосомного набора гаплоидов рапса (Brassica napus L.) 2022
  • Вишнякова Анастасия Васильевна
  • Монахос Сократ Григорьевич
  • Александрова Анастасия Алексеевна
RU2808269C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГАПЛОИДНЫХ РАСТЕНИЙ ЯЧМЕНЯ ИЗ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МИКРОСПОР IN VITRO 2013
  • Тураев Алишер
  • Мишуткина Яна Владимировна
  • Нескородов Ярослав Борисович
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2557389C2
Способ изоляции микроспор для получения удвоенных гаплоидов семейства Brassicaceae в культуре микроспор in vitro 2022
  • Козарь Елена Викторовна
  • Домблидес Елена Алексеевна
RU2807444C1
Способ отбора дигаплоидных растений капусты белокочанной Brassica oleracea устойчивых к сосудистому бактериозу 2018
  • Зубко Ольга Николаевна
  • Монахос Григорий Федорович
  • Монахос Сократ Григорьевич
RU2709991C1
Способ культивирования растений in vitro разных таксономических групп 2023
  • Калашникова Елена Анатольевна
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Дудина Юлия Александровна
RU2804965C1
Способ получения асептических культур растительных эксплантов in vitro 2024
  • Калашникова Елена Анатольевна
  • Киракосян Рима Нориковна
  • Бокарев Григорий Вадимович
  • Кравченко Владимир Николаевич
  • Мазаев Юрий Васильевич
RU2826724C1

Реферат патента 2022 года Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использован для снижения трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты в культуре изолированных микроспор. Способ, характеризующийся тем, что выделение и очистку микроспор осуществляют с использованием 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8), инициирующий стресс оказывают инкубированием выделенных и очищенных микроспор в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) в темноте при температуре 32,5±0,1°С в течение 48 часов, после воздействия инициирующего стресса раствор сахарозы заменяют на питательную среду NLN-13 (рН 5,8), затем определяют плотность суспензии микроспор, доводят ее до 4×104 микроспор/мл и инкубируют до формирования эмбриоидов в климатической комнате. Изобретение позволяет снизить трудоемкость получения удвоенных гаплоидов капусты с сохранением частоты эмбриогенеза микроспор на уровне стандартного протокола. 1 табл.

Формула изобретения RU 2 769 815 C1

Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор, включающий выделение микроспор из пыльников, их очистку, определение плотности суспензии микроспор, доведение ее до 4×104 микроспор/мл, инициацию эмбриогенеза и последующее инкубирование в темноте до появления эмбриоидов, отличающийся тем, что выделение и очистку микроспор осуществляют в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, индукцию эмбриогенеза осуществляют в условиях инициирующего стресса в темноте при температуре 32,5±0,1°С, инкубируя микроспоры в течение 48 часов в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, после воздействия инициирующего стресса раствор сахарозы заменяют на питательную среду NLN-13, рН 5,8, определяют плотность микроспор, доводят ее до 4×104 микроспор/мл и инкубируют в темноте до образования эмбриоидов при 25±1°С в климатической комнате.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2769815C1

SU-XIA YUAN, et al., Effects of ph, MES, arabinogalactan-proteins on microspore cultures in white cabbage, Plant Cell Tiss Organ Cult (2012), 110:69-76, DOI: 10.1007.ы11240-012-0131-z
САВЕНКО Е.Г
и др
Метод культуры пыльников in vitro для создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной
Овощеводство
Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Приспособление для плетения проволочного каркаса для железобетонных пустотелых камней 1920
  • Кутузов И.Н.
SU44A1
ШМЫКОВА Н.А
и

RU 2 769 815 C1

Авторы

Вишнякова Анастасия Васильевна

Монахос Сократ Григорьевич

Синицина Анастасия Александровна

Даты

2022-04-06Публикация

2021-07-19Подача